KR20100025070A

KR20100025070A - 키메린을 함유하는 지방세포 분화 억제 및 지방세포 내의 지질체 수준 감소용 조성물

Info

Publication number: KR20100025070A
Application number: KR1020080083683A
Authority: KR
Inventors: 최현; 노민수; 김한곤
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2008-08-27
Filing date: 2008-08-27
Publication date: 2010-03-09
Also published as: KR101559068B1

Abstract

본 발명은 지방세포 분화와 성장을 억제하는 키메린(Chemerin, TIG2, RARRES2) 또는 키메린의 발현을 조절하는 사이토카인을 유효성분으로 하는 지방세포 분화 또는 성장억제용 조성물 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 상기 키메린을 유효성분으로 하는 약학조성물, 건강식품 조성물 및 화장료 조성물로서 비만증, 지방종(lipoma), 동맥경화증, 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 과식증, 순환기계 질환 또는 허혈성 심질환을 예방 또는 치료에 유용할 뿐만 아니라, 미용 또는 성형 목적의 지방조직 감소에 유용하게 적용될 수 있다.

키메린, 동맥경화증, 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 과식증, 순환기계 질환 또는 허혈성 심질환

Description

키메린을 함유하는 지방세포 분화 억제 및 지방세포 내의 지질체 수준 감소용 조성물{Composition for inhibiting the differentiation of adipocyte and lowering levels of lipid droplet in adipocyte}

본 발명은 지방세포 분화를 억제하고 지방세포 성장을 억제 시켜주는 키메린을 유효성분으로 하는 약학 조성물, 건강식품 조성물 및 화장료 조성물에 관한 것이다.

키메린은 16KDa의 화학유인물질(chemoattractant)로서 숙주의 생존을 위한 방어과정에서 전구체 형태로 분비(Prochemerin)되고, 세린형단백분해효소(serine protease)에 의해 카복시말단(Carboxy-terminal)이 잘리면서 활성화 되어 선천면역과 적응면역에서 중요한 역할이 공지되어 있다.

상기 키메린은 건선 또는 여드름 치료제로 쓰이고 있으며, 최근에 개발된 합성 레티노이드(retinoid)인 건선의 치료 및 일부 여드름에 사용된 보고가 있는 타자로텐(tazarotene)에 의해 그 발현이 증가됨이 보고되어진바 있어, 키메린을 타자로텐 유도 유전자 2(tazarotene induced gene 2 , TIG2) 또는 레티노익산 수용체 반응체 2(Retinoic acid receptor responder 2 , RARRES2)라고도 한다.

또한, 상기 키메린은 난소암의 복수(ovarian cancer ascites)와 류마티스 관절염의 활액(Rheumatoid arthritis synovial fluids)의 염증내 체액에서 처음 발견되었으며, 지방조직에서 높은 발현을 보이나 그 역할이 명확하지 않다.

키메린 수용체(Chemerin receptor, cmklr1, ChemR23)는 G 단백질 커플링 수용체(Orphan G-protein coupled receptor)로써, Gi 단백질이 붙으면서 칼슘분비와 스트레스 인산화 단백질(extracellular signal-regulated kinase 1/2, ERK1/2)의 인산화를 유도한다.

상기 키메린의 발현은 생쥐유래의 3T3-L1 전지방세포(pre-adipocyte)에서는 발현수준이 매우 낮은 농도로 존재하나, 지방분화과정에서는 그 발현과 분비가 크게 증가하는 것으로 알려져 있다. 또한, 3T3-L1 전지방세포에서 키메린 또는 키메린 수용체의 발현을 스몰 헤어핀 알엔에이(small hairpin RNA , shRNA) 시스템을 이용하여 발현을 줄였을 때, 지방세포로 분화가 되지 않았고, 지방분화에 관련된 유전자들의 발현 감소가 공지된바 있다(Kerry et al., Chemerin, a novel adipokine that regulates adipogenesis and adipocyte metabolism. JBC 282: 28175-28188, 2007).

상기 키메린은 비만인 ob/ob mouse 모델의 백색지방조직과 마른 ob/ob mouse 모델의 백색지방조직과는 유전적으로 발현양이 별 차이는 없었으나, 지방 모래쥐(P. obesus

그러나, 이러한 발견들은 다양한 동물 model에서의 키메린 및 키메린 수용체의 연구 결과들은 서로 반대되는 보고들이 있어 의학적으로 그 중요성이 아직 명확 하지는 않다(Ormond et al., The rapidly expanding family of adipokines. Cell Metabolism 6: 159-161, 2007).

지방세포의 키메린 및 키메린 수용체의 생성을 조절하는 매커니즘이 아직 정확하게 밝혀져 있지는 않으며, 지방세포와 상호작용하는 여러 세포들 중 특히 염증과 면역에 관여하는 면역세포들과 사이토카인의 분비를 통해 서로 영향을 주고 받음으로서 키메린이 조절될 가능성은 있으나, 이에 대한 구체적 연구와 보고는 없다. (Ormond et al., The rapidly expanding family of adipokines. Cell Metabolism 6: 159-161, 2007).

다양한 질환들이 비정상적인 지방세포 분화 또는 지방세포 내의 지질체 함량과 관련되어 있는 것으로 추정되기 때문에, 지방세포 분화 및 지방세포 내의 지질체 함량에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 이러한 연구에 있어서 전지방세포(pre-adipocyte) 뿐만 아니라 사람의 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells)를 이용하고 있으며 특히, 사람의 중간엽줄기세포는 피하 조직 등에서 채취한 지방전구세포를 완전한 지방세포로 분화시키는 방법과 거의 유사한 방법을 이용하여 지방세포로 분화시킬 수 있기 때문에(Xu et al., The use of small interfering RNAs to inhibit adipocyte differentiation in human preadipocytes and fetal-femor-derived mesenchymal cells. Exp. Cell Res. 312: 1856-1864, 2006), 지방세포 분화 연구에 널리 이용되고 있다(Pittenger et al., Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 284: 143-146, 1999).

이처럼 지방세포로 분화될 수 있는 사람의 중간엽줄기세포는 신체의 대부분 의 조직에 분포되어 있으며, 지방세포뿐만 아니라 연골세포, 뼈세포 등의 다른 유형의 세포로도 분화될 수 있다고 공지되어 있다(Meirelles et al., Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J. Cell Sci. 119: 2204-2213, 2006).

상기 사람의 중간엽줄기세포는 그것이 어느 조직으로부터 유래한 것인지에 따라 그 성질 또는 특성에 있어서 미세한 차이가 있지만, 일반적으로 유사한 성질 또는 특성을 가진 것으로 공지되어 있다(Sakaguchi et al., Comparison of human stem cells derived from various mesenchymal tissues. Arthritis Rheumat., 52: 2521-2529. 2005).

상기 다양한 질환들의 발병과 관련되어 있는 것으로 추측되는 지방세포 분화 또는 지방세포 내의 지질체 수준을 조절하기 위해 전구지방세포 또는 사람의 중간엽줄기세포를 사용한 연구가 꾸준히 진행되고 있음에 불구하고, 지방세포 분화 또는 지방세포 내의 지질체 수준을 효과적으로 조절할 수 있는 인자 또는 물질이 당분야에서 여전히 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 사람의 중간엽줄기세포가 지방세포로 분화하는 과정에서 키메린의 변동을 확인한 결과, 기존의 생쥐 유래성세포에서 키메린의 변동과는 다른 특성을 발견하였다. 사람의 중간엽줄기세포가 지방세포로 분화되는 과정에서는 키메린과 키메린수용체 발현이 감소하며, 또한 키메린 단백질 자체를 중간엽줄기세포에 처리하였을 때, 농도 의존적으로 지방분화가 억제됨을 확인하였다. 또한, 면역세포에 의해 분비되는 다양한 사이토카인에 의해 키메린의 양이 조절되며, 이를 통해 지방분화도 조절될 수 있음을 확인하므로써, 본 발명을 완성하였다.

이에 본 발명의 목적은 키메린 또는 키메린 발현을 조절하는 사이토카인을 유효성분으로 하는 지방세포 분화 또는 성장억제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 키메린 또는 키메린 발현을 조절하는 사이토카인을 유효성분으로 하는 비만증, 지방종(lipoma), 동맥경화증, 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 과식증, 순환기계 질환 또는 허혈성 심질환 치료 또는 예방용 약학조성물, 건강식품 조성물 및 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 키메린을 유효성분으로 하는 지방세포 분화 또는 성장억제용 조성물에 관한 것이다.

보다 상세하게는 인간 중간엽줄기세포의 분화과정에서 키메린과 키메린 수용체의 발현이 감소하며, 지방의 분화과정에서 키메린으로 처리하였을 때 지방세포 분화를 억제시키는 것을 특징으로 하는 지방세포 분화 또는 성장억제용 조성물에 관한 것이다.

본 발명자들은 키메린에 의해 지방세포 분화가 억제될 때 지방세포 분화와 관련된 표지마커 유전자의 발현이 감소된다는 것을 확인하였다. 즉, 지방산 결합 단백질 4(FABP4), 아디포넥틴(adiponectin), γ 타입의 퍼옥시좀 증식-활성화 수용체 (peroxisome proliferators-activated receptor gamma, PPARγ)의 전사 수준이 감소된다는 것을 확인하였다. 또한, 면역세포에서 분비되는 사이토카인 IL-4(Interleukin-4), IL-6(Interleukin-6), IL-17(Interleukin-17), IFN-r(Interferon-gamma)에 의해 지방세포에서의 키메린 및 키메린 수용체의 발현이 조절됨을 통해 지방분화가 조절될 수 있음을 확인하였다.

이에 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

사람 중간엽줄기세포(human bone marrow mesenchymal stem cells, hBM-MSCs)는 상용적으로 확보된 것으로 권장하는 방법으로 배양하여 줄기세포를 지방세포로 분화시켰으며, 실험군의 경우는 지방세포 분화 유도시에 키메린을 배지에 첨가하여 사람 중간엽줄기세포가 지방세포 분화를 시작한 지 15일 후, 세포 배양액을 제거하고 세포를 고정시킨 다음 염색을 통하여 지방세포 내의 지질체 및 세포핵을 쉽게 구분시킨 후 현미경으로 지방세포를 관찰한 결과, 상기 키메린은 사람 중간엽줄기세포의 세포 사멸을 유도하지 않으면서 지방세포의 분화를 억제하는 것을 확인 할 수 있고 결과는 도 1에 나타내었다. A:사람 중간엽줄기세포(대조군),B:키메린 첨가 없이 지방세포 분화를 유도한 사람 중간엽줄기세포, C:키메린 첨가 후 지방세포 분화를 유도한 사람 중간엽줄기세포.

상기 키메린의 지방세포 분화 억제효과를 정량적으로 알아보기 위하여 상기 동일한 유도방법으로 분화된 지방세포에 키메린의 농도별로 처리하여 지방세포 분화정도를 조사한 결과, 사람 중간엽줄기세포의 지방세포 분화는 키메린의 농도가 높은 실험군에서 지방세포 분화억제 효과가 더 높은 것을 확인할 수 있었으며, 이 결과로부터, 키메린이 사람 중간엽줄기세포의 지방세포 분화를 용량 의존적으로 억 제한다는 것을 확인할 수 있다.

상기 동일한 방법으로 사람 중간엽줄기세포의 지방세포 분화 유도를 위해 키메린을 처리한 후, 세포 내의 RNA를 분리하고, 분리된 RNA를 키아젠사의 RNA키트(Qiagen RNeasy kit, Qiagen, Valencia, CA)로 정제한 후, 인비트로젠사의 역전사키트(Superscript Reverse Transcriptase (RT) II kit, Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하여 이를 실시간 역전사중합효소연쇄반응(real time-reverse transcription polymerase chain reaction, Q-RT-PCR)를 통하여 키메린에 의한 지방세포 관련 표지마커 유전자들의 발현을 조사한 결과, 사람 중간엽줄기세포의 지방세포 분화 억제 및 분화된 지방세포 내의 지질체 수준 감소 시, 아디포넥틴, FABP4, PPARγ, 키메린 수용체의 표지마커 유전자의 발현이 감소되는 것을 확인할 수 있으며 그 결과는 하기 도3에 나타내었다. A:사람 중간엽줄기세포(대조군), B:키메린 첨가 없이 지방세포 분화를 유도한 사람 중간엽줄기세포, C:키메린 10ng/ml 첨가 후 지방세포 분화를 유도한 사람 중간엽줄기세포, D:키메린 100ng/ml 첨가 후 지방세포 분화를 유도한 사람 중간엽줄기세포.

또한, 상기 키메린 및 키메린 수용체의 발현을 사람 중간엽줄기세포의 지방분화과정에서 조사하기 위해 상기 동일한 처리 조건에서 사람 중간엽줄기세포에 키메린을 처리하여 지방세포로의 분화를 유도한 후, 상기와 동일한 방법을 이용하여 RNA를 분리 후 cDNA를 합성하여 이를 실시간 역전사중합효소연쇄반응으로 키메린, 키메린 수용체의 발현을 조사한 결과, 키메린 뿐만 아니라 키메린 수용체의 발현양이 감소되는 것을 확인 할 수 있으며, 그 결과는 하기 도 4에 나타내었다.

지방세포와 상호작용하는 면역세포에 의해 분비되는 사이토카인 IL-17에 의해 키메린 및 키메린의 발현양이 조절됨으로써, 지방분화관련 단백질의 발현 또한 조절될 수 있음을 확인하기 위해, 상기 동일한 처리 조건에서 사람 중간엽줄기세포에 키메린을 처리하여 지방세포로의 분화를 유도한 후, 상기와 동일한 방법을 이용하여 RNA를 분리 후 cDNA를 합성하여 이를 실시간 역전사중합효소연쇄반응으로 키메린, 키메린 수용체의 발현 및 FABP4, 아디포넥틴의 발현을 조사한 결과, 지방분화와 함께 감소했던 키메린과 키메린 수용체 중, IL-17을 처리했을 때, 키메린의 발현양을 증가시켰고, 키메린 수용체의 발현양은 더 감소시켰으며, 이로 인해, 지방분화에 관련된 단백질인 FABP4, 아디포넥틴의 발현이 감소되는 것을 확인 할 수 있으며, 그 결과는 하기 도 5에 나타내었다.

이에 본 발명은 키메린 또는 키메린의 발현을 조절하는 사이토카인을 유효성분으로 함유하는 비만증, 지방종(lipoma), 동맥경화증, 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 과식증, 순환기계 질환 또는 허혈성 심질환의 치료 또는 예방용 약학조성물, 건강식품 조성물을 제공한다.

또한, 키메린의 발현양을 조절하는 방법 및 발현양 조절정도를 측정하여 비만제어 후보물질의 스크리닝 방법을 제공하며, 키메린의 발현을 측정하므로써, 국소비만 및 비만을 진단할 수 있는 방법을 제공한다.

본 발명의 약학 조성물 또는 건강식품 조성물에 있어서, 키메린은 포유동물 보다 바람직하게는 인간으로부터 유래된 것이며, 재조합 기법에 의해 제조된 재조합 키메린이거나 정제된 천연 키메린일 수 있다.

상기 키메린은 전장(full-length) 키메린 또는 이의 단편 형태로 사용될 수 있으며, 전장 키메린 형태로 사용되는 것이 바람직하다.

본 발명의 약학조성물은 키메린을 유효성분으로 전체 약학 조성물 중 0.00001 내지 15 중량%로 함유되며, 이렇게 제조된 약학조성물은 1회 당 0.00001㎎/㎏ 내지 400㎎/㎏ 의 유효함량으로 사용하고, 활성 성분의 실제 투여량은 증상의 중증도, 선택된 투여 경로, 대상의 연령, 성별, 체중 및 건강상태 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며 따라서, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염, 완충제 등의 약제학적 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있다.

경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경질 및 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제 등의 약제 학적 첨가제를 함유할 수 있다. 정제는 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다.

본 발명에 따른 상기 키메린을 유효성분으로 함유하는 비만증, 지방종(lipoma), 동맥경화증, 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 과식증, 순환기계 질환 또는 허혈성 심질환의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 건강식품 조성물은 키메린을 유효성분으로 전체 건강식품 조성물에 중 0.00001 내지 10 중량%로 함유되는 것으로 식품 제형으로는 포도당, 구연산, 액상 올리고당, 옥수수 시럽(corn syrup), 대두 레시틴, 버터, 식물성 경화류, 탈지우유, 설탕, 마가린, 식염, 전분, 밀가루, 물엿, 맥아당, 중조 및 당 에스테르 등의 통상적으로 사용되는 성분들을 이용하여 드링크제, 캬라멜, 쵸콜릿, 다이어트바 제형 또는 과자류인 건강식품으로 제형화 될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 키메린을 유효성분으로 함유하는 비만 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 화장료 조성물은 키메린을 유효성분으로 전체 화장료 조성물 중 0.00001 내지 10 중량%로 함유되는 것으로 화장료 조성물의 제형은 특별히 제한되지 않으며, 목적하는 바에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화장료 조성물은 마사지크림, 바디로션, 바디크림, 바디오일 및 바디에센스로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 키메린을 유효성분으로 함유하는 지방세포 분화 또는 성장억제용 조성물은 지방세포의 비대, 과활성화 및 지방세포의 이상증식의 원인으로 유발되는 비만증, 지방종(lipoma), 동맥경화증, 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 과식증, 순환기계 질환 또는 허혈성 심질환을 치료 또는 예방을 위한 약학조성물, 건강식품 조성물 및 화장료 조성물로 유용하게 적용할 수 있다.

또한 사이토카인을 통해 키메린 및 키메린 수용체의 발현을 조절하여 지방분화를 억제효과를 얻을 수 있으며, 키메린 및 수용체의 발현 정도를 측정하여 국소비만, 비만여부를 효율적으로 검색하여(screening) 비만연구 및 진단 방법으로 이용할 수 있다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에서 당업자에게는 명백한 것이다.

[ 실시예 ] 인간의 골수 중간엽 줄기세포의 지방세포 분화에 대한 키메린의 효과

인간의 골수 중간엽줄기세포(human bone marrow mesenchymal stem cells, hBM-MSCs)는 론자사(Lonza, Inc. Walkersville, MD, USA)에서 구입하여 론자사의 지침서에 따라 배양하였다. 지방세포 분화는 인도메타신(indomethacin)을 사용하여 론자사에서 권장하는 방법을 사용하여 분화하였으며 구체적으로, 중간엽줄기세포를 배양한 무처리구(A), 중간엽줄기세포의 배양액에 인슐린 1μg/ml, 덱사메타손(Dexamethasone, DEXA) 1μM, 이소부틸메틸잔틴(isobutylmethylxanthine, IBMX) 0.5mM을 넣고 배양하여 줄기세포를 지방세포로 분화시켰으며(B), 실험군의 경우, 지방세포 분화 유도시에 키메린 100ng/ml을 배지에 더 첨가하였다(C). 키메린은 알엔디시스템스사(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)에서 구입하여 제조사의 지침서에 따라 용액으로 조제한 후 멸균하여 사용하였다.

중간엽줄기세포의 지방세포 분화를 시작한 지 15일 후, 세포 배양액을 제거하고, 10ml의 인산염 완충액(Phosphate Buffered Saline, PBS)으로 세포를 세척한 후, 10% 포르말린/PBS 용액 0.2ml/cm2을 사용하여 세포를 10분간 고정시켰다. 고정된 세포를 60% 이소프로판올 용액 0.5ml/cm2로 1회 세척하고, 오일레드오(Oil Red O)를 60% 이소프로판올에 녹인 염색액 0.2ml/ cm2로 10분간 지방세포 내의 지질체를 염색하였다. 이어서, 헤마톡실린(hematoxylin)으로 재염색을 행하여 세포핵을 쉽게 구분되도록 한 후 현미경으로 관찰하였고 그 관찰 결과 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 키메린은 중간엽줄기세포의 세포 사멸을 유도하지 않으면서 지방세포의 분화를 억제하였다.

[ 실시예 2] 키메린의 인간의 중간엽줄기세포의 지방세포 분화 억제 효과의 정량적 측정

실시예 1에서와 같이 중간엽줄기세포로부터 지방세포의 분화를 유도하되, 4개의 군으로 나누어 A군에는 아무런 유도 인자도 처리하지 않고(대조군), B 군에는 인슐린 1μg/ml, DEXA 1μM 및 IBMX 0.5mM(IDX)을 처리하였고, C 군은 IBMX 0.5mM(IDX), 키메린 10nM를 처리하였으며, D 군은 IBMX 0.5mM(IDX), 키메린 100ng/ml로 처리하였다.

지방세포 분화 정도를 측정하기 위해, 실시예 1에서와 같이 지방세포를 오일레드오로 염색한 후, 염색된 오일레드오를 100% 이소프로판올 용액으로 용출시킨 후 500 나노미터(nm)의 파장에서 흡광도를 측정하여 도 2에 나타내었다.

도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, IBMX(IDX)에 의해 지방세포로의 분화를 유도한 경우, 중간엽줄기세포의 지방세포 분화가 키메린이 처리되지 않은 대조군(도 2의 B)에 비해 100ng/ml의 키메린이 처리된 실험군(D)에서 38%, 10ng/ml의 키메린이 처리된 실험군(C)에서 31% 정도 감소하였다. 이 결과로부터, 키메린이 인간의 골수 중간엽줄기세포의 지방세포 분화를 용량 의존적으로 억제한다는 것을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 3] 지방세포와 관련된 표지마커 유전자들의 발현 수준에 대한 키메린의 효과

실시예 1에서 확인된 바와 같이, 키메린에 의해 인간의 골수 중간엽줄기세포의 지방분화가 억제되었을 때 지방세포 관련 유전자들의 발현 패턴의 변화를 조사하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다

구체적으로, 상기 실시예 1의 단계에서 기재된 방법과 동일한 방법으로 지방세포로의 분화를 유도한 인간의 골수 중간엽줄기세포에 키메린을 10ng/ml 또는 100ng/ml 농도로 15일간 처리한 후, 트리졸 시약(Trizol reagent, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 세포 내의 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 키아젠사의 RNA 키트(Qiagen RNeasy kit, Qiagen, Valencia, CA)로 한번 더 정제한 후, 애질런트사의 바이오어낼라이저 2100 모델 기기(Agilent 2100 BioAnalyzer, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 RNA의 질(quality)을 확인하였다. 인비트로젠사의 역전사키트(Superscript Reverse Transcriptase (RT) II kit, Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하였고, 이를 실시간역전사중합효소연쇄반응(real time-reverse transcription polymerase chain reaction, Q-RT-PCR)으로 정량적으로 분석하였다. 중간엽줄기세포의 지방세포 분화 억제와 분화된 지방세포 내의 지질체 수준 감소 시, 하기 지방세포 관련 표지마커 유전자인 아디포넥틴(Hs00605917_m1), FABP4(Hs00609791_m1), PPARγ(Hs00233423_m1), 키메린 수용체(Hs03063327_m1)의 발현 패턴 변화를 어플라이드바이오시스템사의택맨유전자발현시스템(TaqMan gene expression assay kit, AppliedBiosystems,FosterCity,CA)을 이용하여 평가하였다.

10ng/ml 또는 100ng/ml의 키메린으로 처리하였을 때, 지방세포 관련 유전자인 아디포넥틴, FABP4 및 PPARγ전사 수준이 키메린의 양에 의존적으로 감소하였으며 그 결과는 하기 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타낸 결과로부터, 키메린이 지방세포 관련 유전자들이 관여하는 세포 내 특정 기전을 조절하여 지방 세포 분화를 억제하고 분화된 지방세포 내의 지질체 수준을 감소시킴을 확인하였다.

[ 실시예 4]지방조직분화과정의 키메린 및 키메린 수용체의 발현변화

인간의 골수 중간엽줄기세포의 지방분화과정에서 키메린 및 키메린 수용체의 발현 패턴의 변화를 조사하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 실시예 1의 단계에서 기재된 방법과 동일한 방법으로 인간의 골수 중간엽줄기세포를 15일간 지방세포로의 분화를 유도한 후(키메린 없이 지방분화시켜,키메린 양의 변화를 보는것입니다), 트리졸 시약(Trizol reagent, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 세포 내의 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 키아젠사의 RNA 키트(Qiagen RNeasy kit, Qiagen, Valencia, CA)로 한번 더 정제한 후, 애질런트사의 바이오어낼라이저 2100 모델 기기(Agilent 2100 BioAnalyzer, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 RNA의 질(quality)을 확인하였다. 인비트로젠사의 역전사키트(Superscript Reverse Transcriptase(RT)II kit, Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하였고, 이를 실시간역전사중합효소연쇄반응(real time-reverse transcription polymerase chain reaction, Q-RT-PCR)으로 정량적으로 분석하였다. 중간엽줄기세포의 지방세포 분화 과정에서 키메린 및 키메린 수용체 유전자의 발현 패턴 변화를 어플라이드바이오시스템사의 택맨유전자발현시스템(TaqMan gene expression assay kit, AppliedBiosystems, FosterCity,CA)을 이용하여 키메린(Hs00161209_g1), 키메린 수용체(Hs03063327_m1)의 발현양을 조사 하였다.

인간의 골수 중간엽줄기세포를 IBMX(IDX)로 15일간 지방세포로 분화시켰을 때, 키메린 뿐만 아니라 키메린 수용체의 전사 수준이 감소하였으며, 그 결과는 하기 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타낸 결과로부터, 인간의 골수 중간엽줄기세포에서 키메린과 키메린 수용체의 발현양 조절이 지방세포로의 분화에서 중요한 현상임 을 확인 할 수 있었다.

[ 실시예 5] 지방조직분화과정에서의 키메린 및 키메린 수용체의 발현 변화에 대한 사이토카인의 효과

인간의 골수 중간엽줄기세포의 지방분화과정에서 사이토카인에 의해 키메린 및 키메린 수용체의 발현 패턴의 변화를 조사하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1의 단계에서 기재된 방법과 동일한 방법에 트로글리타존(Troglitazone)1μM을 더하여 지방세포로의 분화를 유도한 인간의 골수 중간엽줄기세포에 IL-4, IL-6, IL-17 50ng/ml 또는 IFN-r 200units/ml 농도로 15일간 처리한 후, 트리졸 시약(Trizol reagent, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 세포 내의 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 키아젠사의 RNA 키트(Qiagen RNeasy kit, Qiagen, Valencia, CA)로 한번 더 정제한 후, 애질런트사의 바이오어낼라이저 2100 모델 기기(Agilent 2100 BioAnalyzer, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 RNA의 질(quality)을 확인하였다. 인비트로젠사의 역전사키트(Superscript Reverse Transcriptase(RT)II kit, Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하였고, 이를 실시간역전사중합효소연쇄반응(real time-reverse transcription polymerase chain reaction, Q-RT-PCR)으로 정량적으로 분석하였다. 중간엽줄기세포의 지방세포 분화 과정에서 키메린 및 키메린 수용체 유전자의 발현 패턴 변화를 어플라이드바이오시스템사의 택맨유전자발현시스템(TaqMan gene expression assay kit, AppliedBiosystems,FosterCity,CA)을 이용하여 키메린(Hs00161209_g1), 키메린 수용체(Hs03063327_m1)의 발현양을 조사 하였다.

도 4 의 결과와 마찬가지로, 인간의 골수 중간엽줄기세포를 IBMX(IDX)로 15일간 지방세포로 분화시켰을 때, 키메린 뿐만 아니라 키메린 수용체의 전사 수준이 감소하였으나, 인간의 골수 중간엽줄기세포를 사이토카인을 처리하여 IBMX(IDX)로 15일간 지방세포로 분화시켰을 때에는, 키메린의 경우 IL-17처리시 다시 크게 증가되었고, 키메린 수용체는 더 크게 감소되어, 그 결과를 하기 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타낸 결과로부터, 인간의 골수 중간엽줄기세포에서 각종 사이토카인의 조절에 따라 키메린과 키메린 수용체의 발현양이 조절되므로써 지방세포로의 분화에서 중요한 현상임을 확인 할 수 있었다. 또한, IL-17과 IFN-r를 처리하였을 때, 지방세포 관련 유전자인 아디포넥틴, FABP4의 전사 수준이 감소하였으며 그 결과는 하기 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타낸 결과로부터, IL-17등의 사이토카인이 키메린의 발현을 조절하여, 지방세포 관련 유전자들이 관여하는 세포 내 특정 기전을 이용해 지방 세포 분화를 억제함을 확인하였다.

[약학 조성물 제형예 1]정제

키메린 80㎎, 갈락토올리고당 200㎎, 유당 60㎎ 및 맥아당 140㎎을 혼합하고 유동층 건조기를 이용하여 과립화 한 후 당 에스테르(sugar ester) 6㎎을 첨가하여 타정기로 타정하였다. 내용물의 최종 중량은 600㎎으로 한다.

[건강 식품조성물 제형예 2] 드링크제

키메린 80㎎, 포도당 10㎎, 구연산 0.6g 및 액상 올리고당 25g 을 혼합한 후 정제수 300㎖를 가하여 각 병에 200㎖씩 되게 충진하였다. 병에 충진한 후 130℃에서 4 ~ 5초간 살균하여 음료를 제조하였다.

[ 화장료 조성물 제형예 3] 마사지크림

키메린을 유효성분으로 함유하는 마사지크림 제형을 통상적인 방법에 따라 마사지크림을 제조하였다(중량%).

도 1은 사람 중간엽줄기세포인 대조구와 키메린을 100ng/ml의 농도로 처리한 실험구의 지방세포에서 키메린의 지방세포 분화 억제능을 관찰한 결과이다.

도 2는 사람 중간엽줄기세포의 지방세포 분화에서 대조구와 키메린 10ng/ml, 100ng/ml의 농도로 처리한 실험구의 지방세포 분화 정도를 측정한 결과이다.

도 3은 사람 중간엽줄기세포인 대조구와 키메린을 100ng/ml의 농도로 처리한 후 표지마커 아디포넥틴, FABP4, PPARγ, 키메린 수용체의 표지마커 유전자에 대한 역전사 중합 효소 연쇄반응의 결과이다.

도 4는 사람 중간엽줄기세포를 지방세포로 분화시키는 과정에서의 키메린 및 키메린 수용체에 대한 역전사 중합 효소 연쇄반응의 결과이다.

도 5 는 사람 중간엽줄기세포를 지방세포로 분화시키는 과정 분화에서 대조구와 IL-4, 6, 17 50ng/ml, IFNr 200units/ml의 농도로 처리한 실험구의 키메린 및 키메린 수용체, 아디포넥틴, FABP4에 대한 역전사 중합 효소 연쇄반응의 결과이다.

Claims

키메린(chemerin) 을 함유하는 지방세포 분화 또는 성장억제용 조성물.
제 1항에 있어서,

상기 지방세포는 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)인 것을 특징으로 하는 지방세포 분화 또는 성장억제용 조성물.
제 2항에 있어서,

상기 중간엽줄기세포는 인간의 중간엽줄기세포인 것을 특징으로 하는 지방세포 분화 또는 성장억제용 조성물.
제 3항에 있어서,

상기 인간의 중간엽줄기세포는 인간 골수의 중간엽줄기세포인 것을 특징으로 하는 지방세포 분화 또는 성장억제용 조성물.
제 1항 내지 제 4항에서 선택되는 어느 한 항에 있어서,

상기 지방세포 분화 또는 성장억제용 조성물은 지방세포의 비대, 과활성화 및 지방세포의 이상증식 중 어느 하나 이상의 원인으로 유발되는 질환을 치료 및 예방하는 것을 특징으로 하는 지방세포의 분화 또는 성장억제용 조성물.
키메린을 유효성분으로 함유하는 비만증, 지방종(lipoma), 동맥경화증, 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 과식증, 순환기계 질환 또는 허혈성 심질환의 치료 또는 예방용 약학조성물.
제 6항에 있어서,

상기 키메린의 함량은 전체 약학 조성물 중 0.00001 내지 15 중량%로 함유되는 약학 조성물.
제 6항에 있어서,

상기 약학 조성물은 경구 투여용 제제 또는 주사제로 제형화되는 약학 조성물.
제 8항에 있어서,

상기 경구 투여용 제제는 캅셀제, 정제, 현탁제, 시럽제 또는 산제에서 선택되는 제제인 약학 조성물.
키메린을 유효성분으로 함유하는 비만증, 지방종(lipoma), 동맥경화증, 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 과식증, 순환기계 질환 또는 허혈성 심질환의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.
제 10항에 있어서,

상기 키메린의 함량은 전체 건강식품 조성물 중 0.00001 내지 10 중량%로 함유되는 건강식품 조성물.
제 10항에 있어서,

상기 키메린을 유효성분으로 함유하는 건강식품의 제형이 드링크제, 캬라멜, 쵸콜릿, 다이어트바 제형 또는 과자류로 선택 되어지는 건강식품 조성물.
키메린을 유효성분으로 함유하는 비만 개선용 화장료 조성물.
제 13항에 있어서,

상기 키메린의 함량은 전체 화장료 조성물 중 0.00001 내지 10 중량%로 함유되는 화장료 조성물.
제 13항에 있어서,

상기 화장료 조성물은 마사지크림, 바디로션, 바디크림, 바디오일 및 바디에센스로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형으로 이루어지는 화장료 조성물.
키메린의 발현을 타게트로 하는 비만억제제 개발을 위한 물질의 스크리닝 방법
제 16항에 있어서,

상기 물질은 아디포넥틴 또는 FABP4의 전사수준을 감소시키는 것을 특징으로 하는 물질의 스크리닝 방법.
제 17항에 있어서,

상기 물질은 혈구생성과정촉진 사이토카인(hematopoeitin family), 인터페론(interferon family), 케모카인(chemokine family) 및 종양괴사 사이토카인(tumor necrosis family)로부터 선택된 1종 이상의 사이토카인을 함유하는 것을 특징으로 하는 물질의 스크리닝 방법.