KR20100016647A

KR20100016647A - 단백질-변형된 나노-액적, 조성물 및 제조 방법

Info

Publication number: KR20100016647A
Application number: KR1020097023988A
Authority: KR
Inventors: 토마스 지. 마손; 코니 비. 창
Original assignee: 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Priority date: 2007-04-18
Filing date: 2008-04-18
Publication date: 2010-02-12
Also published as: EP2146700A1; ZA200907263B; CA2683974A1; JP2010524945A; US20100172831A1; CN101677966A; AU2008241413A1; WO2008130624A1

Abstract

액체 재료를 포함하는 액적; 및 이 액적을 적어도 부분적으로 둘러싸도록 형성된 단백질 구조체를 포함하는 단백질-변형된 액적 (protein-modified droplet) 이 제공된다. 단백질 구조체는, 이 단백질 구조체의 형성 동안 적어도 액적의 영역에 친화성을 갖는 복수의 단백질 분자를 포함하고, 액적은 적어도 약 1 nm 그리고 약 1000 nm 미만의 최대 치수를 가진다. 수용액에 분산된 복수의 단백질-변형된 액적을 포함하는 조성물이 제공된다.

단백질-변형된 액적, 단백질 구조체, 단백질 분자, 캡시드 단백질

Description

단백질-변형된 나노-액적, 조성물 및 제조 방법{PROTEIN-MODIFIED NANO-DROPLETS, COMPOSITIONS AND METHODS OF PRODUCTION}

관련 출원에 대한 상호-참조

이 출원은 2007년 4월 18일 출원된 미국 가출원 제60/907,824호를 우선권 주장하며, 그 전체 내용이 본 명세서에 참조로서 통합되어 있다.

배경

1. 발명의 분야

이 출원은 나노액적 (nanodroplet) 에 관한 것이며, 보다 구체적으로, 단백질-변형된 나노액적 및 조성물, 그리고 제조 방법에 관한 것이다.

2. 관련 기술의 설명

이 명세서 내의 어디엔가 언급된 논문, 공개된 특허 출원 및 특허를 포함하는 모든 참조문헌의 내용은, 참조로서 본 명세서에 통합되어 있다.

순수 바이러스 캡시드 단백질 (pure viral capsid protein) 은, "캡시드화 (encapsidation)" 로서 알려진 프로세스를 통해 단백질 쉘 (protein shell) 로 나노스케일 오브젝트를 둘러쌈으로써, 나노스케일 오브젝트를 중심으로 자기 조립될 수 있다 (Bancroft, J. B.; Hiebert, E. Formation of an Infectious Nucleoprotein from Protein and Nucleic Acid Isolated from a Small Spherical Virus, Virology 1967, 32, 354-356; Bancroft, J. B.; Hills, G. J.; Markham, R. A Study of the Self-Assembly Process in a Small Spherical Virus. Formation of Organized Structures from Protein Subunits in Vitro. Virology 1967, 31, 354-379; Hiebert, E.; Bancroft, J. B.; Bracker, C. E. The Assembly in Vitro of Some Small Spherical Viruses, Hybrid Viruses, and Other Nucleoproteins, Virology 1968, 34, 492-508). (Douglas, T.; Strable, E.; Willits, D.; Aitouchen, A.; Libera, M.; Young, M. Protein Engineering of a Viral Cage for Constrained Nanomaterials Synthesis, Adv. Mater. 2002, 14, 415-418; Douglas, T.; Young, M. Host-Guest Encapsulation of Materials by Assembled Virus Protein Cages, Nature 1998, 393, 152-155; Douglas, T.; Young, M. Virus Particles as Templates for Materials Synthesis, Adv. Mater. 1999, 11, 679-681; Dragnea, B.; Chen, C; Kwak, E. S.; Stein, B.; Kao, C. C. Gold Nanoparticles as Spectroscopic Enhancers for in Vitro Studies on Single Viruses, J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 6374-6375).

바이러스 단백질을 발현함으로써, 캡시드화된 나노물질은 소망하는 바이러스 기능성, 세포 타겟팅을 위해 유용할 수 있는 특정 조직에 있어서의 우선적 국지화 (preferential localization) 를 잠재적으로 갖출 수 있다 (Uchida, M.; Klem, M. T.; Allen, M.; Suci, P.; Flenniken, M.; Gillitzer, E.; Varpness, Z.; Liepold, L. O.; Young, M.; Douglas, T. Biological Containers: Protein Cages as Multifunctional Nanoplatforms, Adv. Mater. 2007, 19, 1025-1042). 캡시드화의 고전적인 증명에서, 전염성 바이러스는 순수 캡시드 단백질과 순수 RNA 를 조합하 고 pH 및 이온 세기를 변화시키도록 투석함으로써 시험관내에서 (in vitro) 조립되었다 (Bancroft, J. B.; Hiebert, E. Virology 1967, 32, 354-356). 마찬가지로, 합성 폴리머 (Bancroft, J. B.; Hiebert, E.; Bracker, C. E. The Effects of Various Polyanions on Shell Formation of Some Spherical Viruses, Virology 1969, 39, 924-930), 파라폴리옥소메탈레이트 입자 (Douglas, T.; Young, M. Host-Guest Encapsulation of Materials by Assembled Virus Protein Cages, Nature 1998, 393, 152-155), 순금 나노결정 (Dragnea, B.; Chen, C; Kwak, E. S.; Stein, B.; Kao, C. C. Gold Nanoparticles as Spectroscopic Enhancers for in Vitro Studies on Single Viruses, J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 6374-6375; Chen, C; Daniel, M. C; Quinkert, Z. T.; De, M.; Stein, B.; Bowman, V. D.; Chipman, P. R.; Rotello, V. M.; Kao, C. C; Dragnea, B. Nanoparticle-Templated Assembly of Viral Protein Cages, Nano Lett. 2006, 6, 61 1-615; Sun, J.; DuFort, C; Daniel, M.-C; Murali, A.; Chen, C; Gopinath, K.; Stein, B.; De, M.; Rotello, V. M.; Holzenburg, A.; 등의 Core-Controlled Polymorphism in Virus-Like Particles, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 2007, 104, 1354-1359), 및 양자점 (quantum dot) (Dixit, S. K.; Goicochea, N. L.; Daniel, M.-C; Murali, A.; Bronstein, L.; De, M.; Stein, B.; Rotello, V. M.; Kao, C. C; Dragnea, B. Quantum Dot Encapsulation in Viral Capsids, Nano Lett. 2006, 6, 1993-1999) 은 자연 바이러스와 크기가 유사한 바이러스형 입자 (VLP; virus-like particle) 를 생성하기 위해 캡시드화되어 있었다. 이러한 작은 VLP 에 대해, 전자 현미경은, 5- 겹 (5-fold) 및 6-겹 (six-fole) 대칭을 갖는 "캡소머 (capsomer)" 또는 고리형 멀티머 (multimer) 를 돌출시키는 것 (Caspar, D. L.; Klug, A. Physical Principles in the Construction of Regular Viruses, Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1962, 27, 1-24) 을 포함하는, 20면체 (icosahedral) 바이러스의 정돈된 구조체 특징 내로 (Zandi, R.; Reguera, D.; Bruinsma, R. F.; Gelbart, W. M.; Rudnick, J. Origin of Icosahedral Symmetry in Viruses, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004, 101, 15556-15560), 미셀 (micelle) 형성을 암시하는 방식으로 개별 서브유닛으로부터 단백질 쉘이 조립된다는 것을 나타낸다 (McPherson, A. Micelle Formation and Crystallization as Paradigms for Virus Assembly, BioEssays 2005, 27, 447-458). 그러나, 종래의 캡시드화 재료 및 기술은 현재까지 실용성이 제한되고 있다. 따라서, 개선의 필요성이 남아 있다.

개요

본 발명의 실시형태에 따른 단백질-변형된 액적은, 액체 재료를 포함하는 액적, 및 이 액적을 적어도 부분적으로 둘러싸도록 형성된 단백질 구조체를 포함한다. 단백질 구조체는, 이 단백질 구조체의 형성 동안 적어도 액적의 영역에 친화성을 갖는 복수의 단백질 분자를 포함하고, 액적은 적어도 약 1 nm 그리고 약 1000 nm 미만의 최대 치수를 가진다. 본 발명의 실시형태에 따른 조성물은, 수용액에 분산된 본 발명의 실시형태에 따른 복수의 단백질-변형된 액적을 포함한다.

본 발명의 실시형태에 따른 단백질-변형된 액적을 제조하는 방법은, 제 1 비혼화성 액체 재료 및 제 2 비혼화성 액체 재료를 공급하는 단계; 제 1 비혼화성 액 체 재료 및 제 2 비혼화성 액체 재료 중 적어도 하나에 안정화제를 첨가하는 단계; 제 1 비혼화성 액체 재료 및 제 2 비혼화성 액체 재료를 에멀션화하여 안정화제에 의해 안정화되는 제 1 비혼화성 액체 재료 내의 제 2 비혼화성 액체 재료의 복수의 액적을 형성하는 단계로서, 복수의 액적의 각각의 액적은 적어도 약 1 nm 그리고 약 100 nm 미만의 최대 치수를 가지는, 복수의 액적을 형성하는 단계; 에멀션화 이전 또는 에멀션화 이후 중 적어도 하나에서 단백질 분자를 첨가하는 단계; 및 단백질 구조체가 복수의 액적 각각을 적어도 부분적으로 둘러싸도록 형성되게 하는 단계를 포함한다. 첨가되는 안정화제 및 단백질 분자는, 안정화제가 액적에 부착될 때 서로 상호 정전기적 인력을 가지는 종류이다.

도면의 간단한 설명

본 발명은 첨부 도면을 참조하여 다음 상세한 설명을 판독함으로써 보다 잘 이해될 것이다.

도 1 은 본 발명의 실시형태에 따라 동부 퇴록얼룩무늬 바이러스 (CCMV; Cowpea Chlorotic Mottle Virus) 로부터 정제된 캡시드 단백질에 의해 수중의 음이온성 소듐 도데실 술페이트 (SDS; sodium dodecyl sulfate) 계면활성제에 의해 안정화된 오일 액적의 캡시드화를 도시하는 개략도이다. 이것은 단백질-변형된 액적의 일 예이다. 투석을 이용하여 pH 및 이온 세기 I 를 조절함으로써, 벌크 용액 내의 캡시드 단백질은 나노에멀션 액적의 음으로 대전된 표면 주위에 농축 및 조립하도록 유도될 수 있다.

도 2 의 a 및 b 는 본 발명의 실시형태에 따라 음화로 착색된 TEM (negatively stained TEM) 에 의해 관찰되는 캡시드 단백질 구조체를 도시한다. 도 2 의 a 는 SDS-안정화된 나노에멀션과 정제된 CCMV 단백질을 혼합하고 투석한 후 NaCl 의 pH 및 이온 세기 I 의 함수로서 개별 나노스케일 액적을 도시한다. 버퍼는, RNA-재조립 (R) (pH = 7.2, I = 0.1 M); 육각형 시트 (H) (pH = 6.2, I = 0.1 M); 다이머 (D) (pH = 6.2, I = 1.0 M); 멀티-쉘 (M) (pH = 4.8, I = 0.1 M); 및 빈 쉘 (E) (pH = 4.8, I = 1.0 M) 이다. (상부 우측) : R 버퍼를 이용하여 투석 후 SDS 에 의해 안정화된 마이크로스케일 실리콘 오일 액적의 표면을 커버하는 FITC-라벨링된 CCMV 단백질 (그린) 의 형광 광학 현미경사진을 삽입한다. 도 2 의 b 는 M 버퍼를 이용하여 투석 후 관찰되는 1, 2 및 3 동심 단백질 쉘에 의해 캡시드화되는 나노액적을 도시한다. 스케일 바 = 20 nm (모든 이미지).

도 3 은 본 발명의 실시형태에 따라 RNA-조립 버퍼를 이용하여 투석 후 개별 캡시드화된 오일 나노액적의 단일 측 상에서, 액적 직경 (d : 이탤릭체 숫자) 의 함수로서 관찰되는 CCMV 단백질 구조체의 대표적인 예를 도시한다. 액적 표면 상의 단백질 구조체를 강화시키기 위해 TEM 이미지는 배경을 제외하고 푸리에 (Fourier) 필터링되었다. 완전 단백질 '캡소머' (화이트 고리) 는 자연 바이러스의 크기에 더 가까운 크기를 갖는 보다 작은 나노액적의 표면 상에서 더 자주 발견된다. 고리형 캡소머는 국지적으로 6-겹 배치로 정돈될 수 있다 (어두운 서클). 연장된 어두운 협곡부형 (trough-like) '반흔 (scar)' (어두운 서클), 결함있는 캡소머, 및 캡시드 단백질의 육각형 웹형 (web-like) 네트워크 (어두운 서클) 은 보다 큰 액적 상에서 더 자주 관찰된다. 정돈된 캡소머의 완전 20면체에 의해 캡시드화될 수 있는 나노액적의 예측 외부 직경 및 허용 삼각 분할수 T 는 보다 낮은 스케일로 도시되어 있다. 외부 직경 (nm) 은, CCMV, T = 3 바이러스에 대해 d = 28 nm 과 일치하는, d(T)

28(T/3)^1/2을 이용하여 추정된다.

도 4 의 a 내지 c 는 상이한 정도의 정돈 및 비정돈을 가지는 (도 3 에서 어두운 서클로부터 확대된) 나노액적의 표면 상에서 관찰되는 국지적 단백질 구조체를 도시한다. 도 4 의 a 는 대부분 보다 작은 액적 상에서 관찰되는 높은 정도의 정돈을 나타내는 6-겹 동위 캡소머 (six-fold coordinated capsomer) (중심에 있는 점) 를 도시한다 (좌측). 협곡부형 반흔의 예는, 돌출 화이트 영역에 의해 둘러싸인 기다란 어두운 영역 (화살표) 으로 이루어진다 (중간). 통상 보다 큰 액적 상에서 관찰되는 육각형 웹 구조체는 계면으로부터 돌출 단백질의 상호접속된 화이트 네트워크에 의해 둘러싸인 어두운 스폿 (점) 으로 이루어진다 (우측). 도 4의 b 는 각각, 육각형 캡소머 및 웹에 대한 어두운 영역들의 중심들 사이의 거리 (r) 에 대하여 확률 (p_c 및 p_w) 을 도시한다. 웹의 어두운 스폿들 사이의 평균 간격 (4.7 nm) 은 캡소머들의 중심들 사이의 거리 (9.5 nm) 의 대략 절반이다. 도 4 의 c 는 웹형 구조체 (우측) 가 평탄한 표면 상에 친밀한 (hand-in-glove) 단백질 다이머들 (상부 좌측) 의 육각형 캡소머들 (하부 좌측) 을 패킹함으로써 제작될 수 있다는 것을 도시한다. 낮은 단백질 밀도의 영역은 하나의 육각형 세포 내에 검은 점으로 마킹되어 있다.

상세한 설명

도면에 도시되는 본 발명의 실시형태를 서술하는데 있어서, 명료함을 위해 특정 전문용어가 채용된다. 그러나, 본 발명은 이렇게 선택된 특정 전문용어에 한정되도록 의도되지 않는다. 각각의 특정 엘리먼트는 유사한 목적을 달성하기 위해 유사한 방식으로 동작하는 모든 기술적 등가물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명의 몇몇 실시형태에 따르면, 본 발명은 단백질에 의해 커버되거나 및/또는 단백질에 의해 변형된 나노에멀션 액적을 생성하는 프로세스를 제공한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 단백질은 선택된 재료로 로딩될 수 있는 컨테이너 (container) 또는 캡슐 (capsule) 을 효과적으로 제공할 수 있다. 이러한 컨테이너는 본 발명의 몇몇 실시형태에 있어서 약물 전달 구조체를 제공할 수 있다. 그러나, 본 발명의 넓은 개념은 약물 전달에만 제한되지 않는다. 또한, 액체 액적을 내부에 함유하는 단백질 캡슐은 본 발명의 실시형태에 따른 단백질-변형된 액적의 단지 일 예이다. 예컨대, 단백질 캡슐은 선택된 재료로 로딩되는 나노 다공성 중합체 겔 입자를 함유할 수 있다.

자연 바이러스 내에, 바이러스의 바이러스 코트 단백질은 그것의 내부 콘텐츠, 자기-전파 및 게놈 생식 (genomic reproduction) 을 위해 필요한 핵산 RNA 또는 DNA를 보호하기 위한 배리어로서 기능한다. 바이러스는 특정 세포를 용이하게 침투하는 능력을 가지며, 그래서 본 발명의 몇몇 실시형태는 액적의 표면 상의 바이러스 코팅의 종류를 맞춤으로써 (tailoring) 어떤 세포에 특정 약물의 전달을 타겟팅하는 것을 포함할 수도 있다. 그리하여, 본 발명의 몇몇 실시형태는 자연 바이 러스의 몇몇 양태를 모방하는 캡슐을 제공할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 이것은, 세포 배리어를 침투하고 세포 내부에 콘텐츠를 전달할 수 있는 캡슐을 제공하는 것을 포함할 수도 있다.

일 실시형태에 있어서, 본 발명은 바이러스를 성장시키고, 그것을 해체 (disassembling) 하고, 그리고 유전 물질 (RNA 또는 DNA) 로부터 단백질을 분리하는 표준 방법을 통해 바이러스 캡시드 단백질을 획득하였다. 그러나, 본 발명의 보다 넓은 개념은 이러한 기술 및 이들 특정 단백질에만 한정되는 것은 아니다. 대안으로서, 캡시드 단백질은 바이러스 RNA 의 박테리아 발현을 통해 보다 많은 양으로 획득될 수 있다. 다음으로, 본 발명은 수중에서 소수성 오일의 마이크로스케일 에멀션 또는 나노스케일 에멀션 (나노에멀션) 을 제작하였다. 소수성 약물 분자가 오일 내에 용이하게 용해되고, 그럼에도 불구하고 오일은 에멀션이 오스트왈드 숙성 (Ostwald ripening) 을 통해 불안정화될 정도로 분자량이 너무 낮지는 않다. 약물 분자의 농도는 오일 내에서 고정되고, 그후 약물-적재된 오일이 다음 단계, 즉, 전단 에멀션화를 통한 수중 오일 (oil-in-water) 에멀션의 생성을 위한 피드 (feed) 로서 이용된다. 일 예에 있어서 나노에멀션을 제작하기 위해 이용되는 극도의 (extreme) 에멀션화 프로세스는 상업적 고압 미세유체 디바이스를 사용하는 것을 수반하였다. 초음파 디바이스 및 다른 방법이 또한 본 발명에 따라 이용될 수 있다.

액체로 구성되는 액적은 바이러스 단백질로 캡슐화되어, 본 발명의 다양한 실시형태에 따른 여러 상이한 방법을 통해 상이한 비혼화성 액체 내의 하나의 액체 의 바이러스 단백질-코팅된 액적의 분산액을 산출할 수 있다. 본 발명에 따른 몇몇 방법은, (1) 안정화제 (예컨대, 계면활성제, 입자 또는 폴리머) 의 종류 및 농도를 통해 액적 안정화도를 제어하고 또한 pH, 이온 함량 (예컨대, 염 또는 버퍼의 종류) 및 이온 세기 (예컨대, 염 또는 버퍼의 농도) 를 제어하면서 바이러스 캡시드 단백질의 수계 분산액에 원하는 종류의 오일을 첨가하고 그리고 보다 큰 액적을 보다 작은 액적으로 분해할 수 있는 흐름을 유도하는 기계적 전단 또는 다른 방식을 적용하는 것; (2) 적절한 pH, 이온 함량 및 이온 세기에서 바이러스 캡시드 단백질의 수계 분산액에 (전하 계면활성제, 입자 또는 폴리머에 의해 안정화된) 기존의 수중 오일 에멀션 또는 나노에멀션을 조합하고 그리고 액적을 분열시키지 않지만 대류 (convection) 에 의해 성분을 분포시키는 방식으로 혼합하는 것; 및 (3) 기존의 수중 오일 에멀션 또는 나노에멀션과 바이러스 캡시드 단백질의 수계 분산액을 조합한 후, 반투막을 이용하여 투석하여 액적의 표면 상으로 단백질의 흡착을 야기시키기 위해 pH, 이온 함량 및 이온 세기를 변화시키는 것을 포함한다.

액적의 액체 재료는, 오일, 실리콘 오일, 탄화수소 오일, 석유 오일, 연료 오일, 왁스, 지방 (fat), 플루오르화 오일, 비휘발성 오일, 휘발성 오일, 방향족 오일, 식물 재료로부터 유래된 오일, 동물 재료로부터 유래된 오일, 천연 소스로부터 유래된 오일, 증류된 오일, 추출된 오일, 쿠킹 오일, 식품 오일, 윤활제, 조성 중에 탄화수소가 우세한 반응성 재료, 에폭시 재료, 접착제 재료, 중합성 재료, 서모트로픽 액정, 리오트로픽 액정, 산성 오일, 염기성 오일, 중성 오일, 천연 오일, 폴리머 오일, 및 합성 오일 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

본 발명의 몇몇 실시형태에 따른 생물학적 활성제는, 약물 분자 (drug molecule), 항암 분자, 치료 분자 (therapeutic molecule), 호르몬 분자, 작동약 분자 (agonist molecule), 길항제 분자 (antagonist molecule), 방지제 분자, 억제제 분자, 증감제 분자, 항우울제 분자, 항바이러스 분자, 항곰팡이 분자, 항균 분자, 생체이용율 증강제 분자 (bioavailability enhancer molecule), 독소 분자, 염료 분자, 형광 분자, 생체분자 (biomolecule), 영양제, 비타민, 조미료, 효소, 나노입자, 및 이미징 콘트라스트 향상제 (imaging contrast enhancement agent) 를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.

보다 큰 액적을 보다 작은 액적으로 흐름-유도 파열시키는 것을 통해 에멀션 액적이 생성된 후에 후속 합체에 대항하여 에멀션 액적 안정성을 부여하기 위해 음으로 대전된 소듐 도데실 술페이트 (SDS) 와 같은 계면활성제가 첨가될 수 있다. 대안으로서, 약물 분자를 함유하는 오일에서 에멀션 또는 나노에멀션을 생성하기 위해 상업적 믹서, 블렌더, 콜로이드 밀 또는 흐름-포커싱 미세유체 디바이스가 사용될 수 있다. 기존의 극도의 흐름 방법은 약 5 내지 10 nm 반경까지 액적을 생성할 수 있으므로, 주어진 액적 내에 매우 작은 수의 약물 분자만이 있을 수도 있다. 이들 보다 작은 나노액적 자체는 구멍 (pore) 의 개선된 확산 및 침투를 통해 보다 용이하게 세포 막 및 장 막을 침투할 수 있고, 바이러스 코팅은 보다 작은 나노액적에게 세포의 흡수의 단백질 트리거를 통해 막을 가로지르는 강건성 및 활성 수단을 부여한다. 본 발명의 몇몇 실시형태에 있어서 액적이 많은 양으로 생성될 수 있기 때문에, 바이러스 단백질은 종종 제한 성분이 되고, 본 발명의 몇몇 실시형태에 서 단백질로 에멀션화하는 것이 행해질 수 있지만, 본 발명은 통상적으로 존재하는 단백질로 에멀션화하지 않는다. 그 대신에, 본 발명의 실시형태에 있어서, 본 발명은 액적을 획득하고, 액적을 희석하고, 계면활성제 농도를 고정시킨 후, 해체된 바이러스 캡시드 단백질을 첨가한다. 그후, 용액의 이온 세기 및/또는 pH 를 변화시킴으로써, 본 발명은 단백질을 액적 표면에 끌어당기게 하고, 액적에 대한 코팅을 조립할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명은 음이온성 계면활성제를 사용하여 액적을 안정화시키며, 이는 액적이 그 표면 상에서 음전하를 가지게 한다. 이는 또한 용액 내에서 음으로 대전되는 RNA 및 DNA 를 모방한다. 그후, 본 발명은 해체된 캡시드 단백질을 첨가하고, 용액의 이온 세기 및 pH 를 변화시켜 바이러스 쉘이 액적의 표면 상에 형성하도록 한다. 이 원리를 증명하기 위해, 본 발명은 식물 바이러스, CCMV 로부터 획득된 캡시드 단백질, 소듐 도데실술페이트 (SDS), 및 음이온성 계면활성제로 코팅된 실리콘 나노에멀션을 사용하여 나노액적의 제 1 바이러스 캡슐화 실험을 수행하였다. 그 예에서 오일에 특정 약물 분자가 첨가되지 않았다. 다른 예에 있어서, 본 발명은 본 발명의 나노액적에 형광 염료와 같은 다른 오일-가용성 분자를 첨가하였다. 본 발명의 투과형 전자 현미경 이미지는 액적의 표면 상에 바이러스 단백질의 성공적인 조립을 나타낸다. 본 발명은 빈 바이러스 쉘 없이 액적을 완전히 코팅하여 형성하기 위해 pH 및 이온 세기를 최적화할 수 있다. 이들 빈 쉘은 단백질을 낭비하므로, 통상 바람직하지 않다. 조성 및 조립의 특정 조건 하에서, 본 발명은 또한 여러 내부 액적이 그 액적 주위에 형성되는 단백질의 단일 외부 쉘 내에 둘러싸일 수 있다는 것을 관찰하였다. 전반적으로, 본 발명은 바이러스 단백질에 의해 코팅되는 매우 광범위한 크기의 에멀션 및 나노에멀션 액적을 생성하기 위해 이용될 수 있고 신속한 침투, 타겟팅 및 전달을 트리거하는 개선된 능력을 가질 수 있는 방법을 기재한다. 몇몇 실시형태에 있어서 액적의 크기 분포를 제어함으로써, 본 발명은 보다 큰 액적이 보다 작은 액적보다 더 느리게 침투할 것이기 때문에 약물의 방출을 제어할 수 있다. 대안으로서, 공지된 방법에 의해 합성되거나 또는 정제된 다른 단백질이 액적을 코팅하는데 사용될 수 있었다.

실시예 1

본 발명의 일 실시형태에 따른 예에 있어서, 본 발명은 정전기적 상호작용으로 인해 나노에멀션 액적의 표면에서 자기-조립하는, CCMV (Cowpea Chlorotic Mottle Virus) 로부터의 캡시드 단백질을 이용한다. 자연 바이러스에 있어서, 바이러스의 양으로 대전된 내부는 RNA 의 하나 이상의 음으로 대전된 다가 음이온 (polyanion) 과 상호작용한다. 나노에멀션 액적은 액적의 외부에 음으로 대전된 계면활성제 헤드 그룹을 가지기 때문에, 바이러스 단백질은 오일 액적의 외부 계면에서 조립한다.

캡시드 단백질을 획득하기 위한 절차:

본 발명은 CCMV 단백질의 정제를 위한 Rao 의 절차를 채택한다 (Choi, Y. G.; Rao, A. L. N., Molecular Studies on Bromovirus Capsid Protein: VII. Selective Packaging of BMV RNA4 by Specific n-Terminal Arginine Residues. Virology 2000, 275, 207-217). 본 발명은 먼저 현탁 버퍼 내의 4 ㎎/㎖ 이하의 농 도에서 야생형 (wild-type) CCMV 로 시작한다. CCMV 를 단백질 다이머 및 RNA 로 해리시키기 위해 24 시간 동안 해체 버퍼에 CCMV 를 투석한다. 해체된 CCMV 는 버퍼로부터 제거되고 (Eppendorf 원심분리기 580 4R) 14,000 rpm 에서 30 분간 원심분리되어 RNA 를 석출하였다. 상등액 (supernatant) 내의 단백질을 추출한 후, 상등액에 남아 있는 RNA 주위에서 조립하기 위해 24 시간 동안 RNA 조립 버퍼에 더욱 투석한다. 마지막으로, 상등액을 100,000 rpm 에서 1:40 시간 동안 원심분리하고 (Beckman TLA 110 UC), 순수한 CCMV 단백질을 함유하는 상등액의 상부 3/4 는 추가적인 연구를 위해 이용된다. 결과로서 생기는 단백질의 농도 및 순도는 UV-가시 분광법을 이용하여 측정된다. 모든 작업은 4 ℃ 에서 행해진다.

나노에멀션 액적을 제작하는 절차:

100 nm 미만의 직경을 갖는, 계면활성제에 의해 다른 비혼화성 액체상 (liquid phase) 에서 안정화된 하나의 액체상의 나노에멀션 액적은, 미세유체 주입 시스템으로 극도의 전단을 이용하여 생성되었다. 나노에멀션 액적의 크기는 사용되는 계면활성제의 양과 종류, 미세유체 시스템에 액체가 주입되는 압력, 및 액체의 점도에 의존된다. 그후 나노에멀션은 원심분리되고, 액적의 특정 크기 분포를 획득하기 위해 분별된다 (Mason, T. G., J. N. Wilking, K. K. Meleson, C. B. Chang, and S. M. Graves. 2006. Nanoemulsions: formation, structure, and physical properties, Journal of Physics: Condensed Matter 18: R635-R666; Meleson, K., S. Graves, and T. Mason. 2004. Formation of Concentrated Nanoemulsions by Extreme Shear. Soft Materials 2: 109-123). 본 발명은 통상적으로, 미세유체 디 바이스를 통해 제어될 수 있는 크기 및 다른 조성 파라미터를 갖는 수중 오일 나노에멀션 액적을 제작한다. 그리하여, 이 실시형태는 바이러스 캡시드 쉘 내부에 차례로 존재하는 액적 내부의 소수성 약물을 패키징하기 위한 것이다.

조립 조건 (바이러스 단백질과 나노에멀션 액적을 조합):

본 발명은 나노에멀션 액적 주위에서 바이러스 단백질을 조립하기 위해 다양한 조립 조건을 이용하였다. 나노에멀션 액적 및 바이러스 단백질이 투석되는 용액의 pH 및 이온 세기를 변화시킴으로써, 본 발명은 외부의 바이러스 단백질의 단일 코트, 이중 코트, 또는 다중 코트를 가지는 액적을 생성할 수 있다 (도 2 의 b 참조).

EM 이미지를 취하기 위한 절차:

400-메시 크기의 구리 그리드 (Ted Pella Inc., Redding, CA) 가 팔로도인 (parlodoin) 의 지지 필름을 이용하여 준비되었고, 그후 탄소-코팅되었다. 그리드는 샘플 증착 직전에 고압 교류를 이용하여 글로-방전된다. 샘플 퇴적 단계는, 1 분간 그리드 상으로 직접 샘플 5 pℓ 를 배치하는 단계, Whatman 4 필터지로 위킹 (wicking) 하는 단계, 1 분간 1% 우라닐 아세테이트로 즉시 착색하는 단계, 다시 위킹하는 단계, 그리고 공기-건조하는 단계로 이루어진다. 샘플을 75 kV 의 가속 전압에서 Hitachi H-700 전자 현미경으로 관찰하였다. 음화 (negative) 를 현상하고, 이미지 분석을 위해 Minolta Dimage Scan MultiPro 스캐너를 사용하여 스캐닝하였다.

결과의 논의:

본 발명의 몇몇 실시형태에 따라 바이러스 단백질에 의해 커버되는 액적을 제조하는 이 방법의 이점은, 바이러스 조립을 위한 템플릿 (template) 인, 나노에멀션의 크기를 미세-조정하는 능력을 포함할 수 있다. 그리하여, 본 발명은 이 단백질 컨테이너의 직경을 약 10 nm 로부터 100 nm (예컨대, 미크론의 1/10 미만) 로 변화시킬 수 있고, 미래의 어플리케이션을 위한 크기-특정 변형물을 허용한다. 액적의 표면 상으로의 바이러스 캡시드 단백질의 흡착은, 액적 크기에 의해서가 아니라, 액적의 표면 상의 계면활성제 및 오일에 대한 단백질의 친화성에 의해 제어될 수 있다. 따라서, 필요에 따라, 본 발명은 서브-미크론, 마이크로스케일, 그리고 휠씬 더 큰 바이러스로 캡슐화된 액적을 제작할 수 있다.

이 발명의 몇몇 실시형태는 섭취, 주사, 흡입, 또는 피부를 통해 유기체 (organism) 의 내부로 생물학적 활성 콘텐츠 (소수성 약물) 을 전달하기 위한 단백질-변형된 액적을 제조하는 방법을 제공할 수 있다. 방사성 종 또는 높은 원자번호 원소를 함유하는 분자가 암 치료 또는 이미징 개선을 위해 나노액적에 삽입될 수 있다. 그리하여, 이 발명의 몇몇 실시형태는 의학 이미징 및 약물 전달 양방에 있어서 잠재적인 어플리케이션을 가질 수 있다. 의학 이미징에 있어서, 일 어플리케이션은 세포 내부에서 수송의 경로를 추적하는데 있어서의 컨테이너의 용도일 수 있다. 약물 전달에 있어서, 일 어플리케이션은 나노에멀션에 캡슐화되고 후속하여 암을 치료하기 위해 암세포의 도입시에 전달되는 치료제의 용도일 수 있다.

실시예 2

이 예는 '나노에멀션' 또는 비압축성 구형 나노액적의 캡시드화이고, 나노에 멀션은 야생형 코어를 상당히 지나 연장되는 연속 범위의 크기를 가질 수 있고, 흡착된 음이온성 계면활성제 분자에 의해 안정화된다. 본 발명은 Caspar-Klug 계층구조에 의해 나타내지는 이상적 20면체의 별개의 크기 및 완전 대칭 없이 캡시드 단백질이 구형 쉘 내에 자기-조립하도록 강제할 수 있다는 것을 나타내고 (Caspar, D. L.; Klug, A., Physical Principles in the Construction of Regular Viruses. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1962, 27, 1-24), 이는 60 개의 단백질 중 특정 인티그럴 멀티플 (integral multiple) (예컨대, 1, 3, 4, 7,…) 을 요구한다. 소듐 도데실 술페이트 (SDS) 에 의해 안정화된 수중 실리콘 오일 (폴리-디메틸실록산) 나노에멀션은 고압 균질화에 의해 제조되고 (Meleson, K.; Graves, S.; Mason, T. G., Formation of Concentrated Nanoemulsions by Extreme Shear. Soft Materials 2004, 2, 109-123), CCMV (Cowpea Chlorotic Mottle Virus) 캡시드 단백질과 혼합되고 (Choi, Y. G.; Rao, A. L. N., Molecular Studies on Bromovirus Capsid Protein: VII. Selective Packaging of BMV RNA4 by Specific n-Terminal Arginine Residues. Virology 2000, 275, 207-217), 그리고 2가 양이온 농도를 감소시키기 위해 투석되어, 단백질이 자기-조립하도록 한다 (Adolph, K. W.; Butler, P. J. G., Reassembly of a Spherical Virus in Mild Conditions. Nature 1975, 255, 737-738). 광범위한 pH 및 이온 세기에 걸쳐, 재조립은 단일 단백질 쉘에 의해 코팅된 바이러스형 액적 (VLD; Virus-Like Droplet) 을 생성한다. 또한, 본 발명은 광범위한 pH 및 이온 세기를 조사하여 나노액적 주위에서 캡시드 단백질에 의해 형성된 동심 쉘의 수를 제어한다. 낮은 pH 및 이온 강도의 제한에 있어서, 빈 멀티-쉘 구조체가 형성되어 있는 경우 (Adolph, K. W.; Butler, P. J., Studies on the Assembly of a Spherical Plant Virus. I. States of Aggregation of the Isolated Protein. J. MoI. Biol. 1974, 88, 327-341), 액적은 2 개 이상의 단백질 쉘 내부에 캡시드화될 수 있다.

단일 쉘에 의해 코팅된 VLD 에 대해, 투과형 전자 현미경 (TEM) 은, 단백질이 정돈된 캡소머 내로 뿐만 아니라 다양한 다른 구조체 내로도 만곡된 표면 상에서 자기-조립되었다는 것을 나타낸다. 액적 표면 곡률이 감소됨에 따라, 정돈된 캡소머 구조체는 덜 우세하게 되고, 다른 단백질 구조체 (예컨대, 결함있는 캡소머, 육각형 웹, 및 협곡부형 반흔) 가 나타난다. 이들 구조체의 몇몇은, 만곡된 표면 상에서 단백질의 재밍 (jamming) (Liu, A. J.; Nagel, S. R., Jamming Is Not Just Cool Any More. Nature 1998, 396, 21-22) 으로 인해 나타나고, 고체 미시적 입자에 의해 안정화된 거시적 액적 상에서 발견된 결함을 암시한다 (Bausch, A. R.; Bowick, M. J.; Cacciuto, A.; Dinsmore, A. D.; Hsu, M. F.; Nelson, D. R.; Nikolaides, M. G.; Travesset, A.; Weitz, D. A., Grain Boundary Scars and Spherical Crystallography. Science 2003, 299, 1716-1718; Bowick, M.; Cacciuto, A.; Nelson, D. R.; Travesset, A., Crystalline Order on a Sphere and the Generalized Thomson Problem. Phys. Rev. Lett. 2002, 89, Art. No. 185502 pp. 1-4; Tarimala, S.; Dai, L. L., Structure of Microparticles in Solid-Stabilized Emulsions. Langmuir 2004, 20, 3492-3494). 그러나, 육각형 웹과 같은 다른 구조체는, 끌어당기는 (attractive) 단백질-단백질 및 단백질-표면 상호작용 과 연관된 특정 규칙으로부터 생긴다. 보다 큰 액적 상에서 정돈된 캡소머의 개체군 (population) 에 있어서의 전반적인 감소는, 보다 낮은 곡률을 갖는 비압축성 표면 상에서 단백질이 조립할 때 CCMV 의 캡시드에서의 단백질의 3 개의 상이한 배좌 (conformation) (Speir, J. A.; Munshi, S.; Wang, G.; Baker, T. S.; Johnson, J. E., Structures of the Native and Swollen Forms of Cowpea Chlorotic Mottle Virus Determined by X-Ray Crystallography and Cryo-Electron Microscopy. Structure 1995, 3, 63-78) 가 동일한 비율로 존재하지 않는다는 것을 의미한다. 그리하여, 표면 곡률은 단백질 배좌를 설정하는데 중요한 역할을 하고, 비압축성 오브젝트를 캡시드화하는 조립된 단백질의 구조체에 깊이 영향을 미친다.

방법

단백질 정제

Choi 및 Rao 의 절차 (Choi, Y. G.; Rao, A. L. N., Molecular Studies on Bromovirus Capsid Protein: VII. Selective Packaging of BMV RNA4 by Specific n-Terminal Arginine Residues) 에 따라, 본 발명은 CCMV 로부터 캡시드 단백질을 격리하고 정제한다. CCMV 는 단일 캡시드 단백질을 가지므로, 'CCMV 단백질' 에 대한 임의의 참조는 CCMV 의 단일 독특한 캡시드 단백질을 특정한다. 정제된 CCMV 는 해체 버퍼 (0.5 M CaCl₂, pH 7.5 에서의 50 mM 트리스-HCl, 1.0 mM EDTA, 1.0 mM DTT, 0.5 mM PMSF) 1.0 ℓ에 24 시간 동안 투석된다. 해리된 바이러스는 RNA 를 석출하기 위해 14,000 RPM 에서 30 분간 원심분리된다. 단백질 계면활성제가 추출되 고, RNA 재조립 버퍼 (50 mM NaCl, 50 mM 트리스-HCl, pH 7.2, 10 mM KCl, 5.0 mM MgCl₂, 1.0 mM DTT) 1.0 ℓ에 24 시간 동안 투석된다. 그후, 용액은 100,000 rpm 에서 100 분간 원심분리되고, 단백질 상등액이 추출된다. 단백질의 농도 및 순도는 UV-가시 분광법을 이용하여 측정되었다. 모든 작업은 4 ℃ 에서 행해졌다.

나노에멀션 준비 및 분별

나노에멀션은 고압 미세유체 디바이스 (Meleson, K.; Graves, S.; Mason, T. G., Formation of Concentrated Nanoemulsions by Extreme Shear. Soft Materials 2004, 2, 109-123) 에 의해 극도의 흐름을 이용하여 생성된다. 다분산 에멀션은 보다 양호한 액적 균일성을 달성하고 SDS 농도 C_SDS 를 설정하기 위해 초원심분리를 이용하여 크기-분별된다. 단백질과 혼합하고 투석하기 전에, 나노에멀션은 φ = 0.05, 및 임계 미셀 농도보다 충분히 작은 C_SDS = 1 mM SDS 를 가진다. PDMS 오일 (Gelest 에 의해 공급되는 10 cSt 점도) 은 낮은 증기압력을 가지므로 캡시드 단백질이 존재하지 않더라도, 이들 현미경 측정치의 시간 스케일에 걸쳐 증발하지 않는다.

투석 버퍼

RNA 해체 버퍼 (Adolph, K. W.; Butler, P. J., Assembly of a Spherical Plant Virus. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B 1976, 276, 113-122) : pH = 7.2, I = 0.10 M NaCl, 10 mM KCl, 5.0 mM MgCl₂, 및 1.0 mM DTT에서의 트리스-HCl 버퍼. 빈 쉘 버퍼 : pH = 4.8 및 I = 1.0 M NaCl에서의 50 mM 소듐 아세테이트 버퍼. 다 이머 버퍼 : pH = 6.2 및 I = 1.0 M NaCl에서의 50 mM 소듐 포스페이트 버퍼. 멀티-쉘 버퍼 : pH = 4.8 및 I = 0.1 M NaCl에서의 50 mM 소듐 아세테이트 버퍼. 육각형 시트 버퍼 : pH = 6.2 및 I = 0.1 M NaCl에서의 5O mM 소듐 포스페이트 버퍼. 마지막 4 개의 버퍼는 또한 1.0 mM EDTA 및 1.0 mM DTT 를 함유한다.

캡시드화 절차

스톡 나노에멀션 1.0 mM SDS 및 φ=0.015 의 분취량 10 ㎕ 를 정제된 CCMV 단백질 0.15 ㎍/㎖ 에 첨가하여 전체 반응 체적 200 ㎕ 를 얻었다. 혼합물을 24 시간 동안 4 ℃ 에서 적절한 버퍼 1.0 ℓ에 투석하였다. 희석 및 투석 후 SDS 농도는 대략 10^-5 M 이어서, 벌크 용액 내의 SDS-단백질 상호작용의 결합은 액적 안정성을 여전히 유지하면서 최소화된다. SDS 의 술페이트 헤드-그룹은 본 발명이 액세스하는 pH 의 전체 범위에 걸쳐 음으로 대전되어 유지된다. 희석 후, 오일-물 계면 상에서의 SDS 의 전하 밀도는 대략 -0.1e/nm² 으로 추정된다.

투과형 전자 현미경: 착색 및 분석

400 메시 크기 및 3.0 mm OD 의 Pelco 구리 그리드 (Ted Pella, Inc.) 를 파를로디온 (parlodion) 및 탄소의 박막으로 코팅한다. 이 그리드는 샘플 증착 직전에 고압 교류를 이용하여 글로-방전된다. 본 발명은 1 분간 그리드 상으로 직접 샘플 5 ㎕ 를 배치한 후, Whatman 4 필터지로 위킹하고, 1 분간 수중의 1% 우라닐 아세테이트 용액으로 착색한다. 샘플을 공기-건조하고, 75 kV 의 가속 전압에서 Hitachi H-7000 전자 현미경으로 관찰한다. 음화를 현상하고, 이미지 분석을 위해 Minolta Dimage Scan MultiPro 스캐너를 이용하여 스캐닝하였다. Adobe Photoshop 을 이용하여 강하게 번진 이미지를 공제함으로써 이미지 배경을 단조롭게 한다 (flatten). 화이트 외부 고리 및 캡소머의 어두운 오목부 (dimple) 의 크기에 대응하는, 어두운 중심을 가지는 상관 커널 (correlation kernel) 을 이용하여 상호-상관 푸리에 변환 이미지 분석을 적용한다.

형광 현미경

본 발명은 DMSO 1.0 ㎎/㎖ 내의 FITC 및 5(6)-FAM, SE 의 스톡 용액을 제작하였다. 5(6)-FAM, SE 스톡 용액의 분취량을 pH 7.2 에서 RNA 재조립 버퍼 내의 해리된 CCMV 단백질에 첨가한다. FITC 스톡 용액의 다른 분취량을 해리된 CCMV 단백질에 첨가하고, pH 8.2 에서 50mM 포스페이트 버퍼 내에서 평형시킨다. 단백질 및 염료를 혼합하고, 8 시간 후, FITC-라벨링된 단백질을 RNA 재조립 버퍼 내로 투석하고, pH 를 감소시킨다. 형광으로-라벨링된 단백질의 양방 세트를 전체 반응 체적 200 ㎕ 내의 φ=0.05 및 SDS 또는 CTAB (cetyl-trimethylammonium bromide) 중 어느 것의 1.0 mM 농도에서 마이크로스케일 에멀션 10 ㎕ 와 혼합하고, RNA 재조립 버퍼를 이용하여 투석한다. 형광 현미경사진은 액적의 에지에서의 강한 형광을 통해 액적 표면에 라벨링된 단백질의 존재를 나타낸다. 라벨링된 단백질의 부재시의 마이크로스케일 에멀션은 이런 형광을 나타내지 않는다. 따라서, 자연 바이러스보다 휠씬 더 큰 액적이 음이온성 계면활성제의 제 1 내부층 및 바이러스 단백질의 제 2 외부층으로 이루어지는 이층에 의해 코팅될 수 있다. 단백질의 흡착은 아마 액적 계면으로 그리고 액적 계면으로부터의 계면활성제의 평형 교환을 방지한다. 이런 단백질 흡착은 통상 단백질-변형된 액적을 둘러싸는 용액 내의 광범위한 이온 세기에 걸쳐 pH 의 중성 조건 및 산성 조건에 대해 비가역적이다. 조립 후, 용액 조건을 자연 비리온 (native virion) 의 해체를 야기할 영역으로 함으로써 단백질-변형된 액적이 해체될 수 있다.

결과 및 논의

음이온으로 안정화된 나노액적은, 캡시드 단백질이 조립될 수 있는 광범위한 곡률을 제공하는 비압축성 대전된 템플릿을 제공한다. 극도의 에멀션화를 통해, 본 발명은 CCMV 만큼 작을 수 있는 구형 액적 (내부 직경 21 nm 및 외부 직경 28 nm) 으로 구성된 수중 오일 나노에멀션을 제작한다 (Mason, T. G.; Wilking, J. N.; K. Meleson, K.; Chang, C. B.; Graves, S. M., Nanoemulsions: Formation, Structure, and Physical Properties. J. Phys.: Condens. Matter 2006, 18, R635-R666). 크림화 레이트 (creaming rate) 의 차이에 의존하여, 초원심분리 크기-분별법은 10 nm <

< 100 nm 사이의 액적 반경을 갖는 균일한 모델의 나노에멀션을 제공한다 (Meleson, K.; Graves, S.; Mason, T. G., Formation of Concentrated Nanoemulsions by Extreme Shear. Soft Materials 2004, 2, 109-123). 추가적으로, 액적 체적 분율 φ 및 계면활성제 농도 C_SDS 가 독립적으로 설정될 수 있다. 표면 장력을 극복하고 액적을 변형시키기 위해 필요한 응력에 대응하는 라플라스 압력은 통상 10 atm 이상이므로, 액적은 약한 (dilute) φ 에서 구형이다. 분자 확산을 통해 액적의 원치않는 성장으로 이어질 수 있는 오스트왈드 숙성 (Taylor, P., Ostwald Ripening in Emulsions: Estimation of Solution Thermodynamics of the Disperse Phase. Adv. Colloid Interface Sci. 2003, 106, 261-285) 을 방지하기 위해, 분산된 액체는 연속적인 액체상에서 매우 비가역적이도록 선택된다.

본 발명은 순수 해체된 CCMV 캡시드 단백질과 수중 오일 나노에멀션을 혼합하고 투석을 통해 버퍼의 pH 및 NaCl 이온 세기 (I) 를 변화시킴으로써 바이러스형 액적을 생성하여, 단백질이 액적 표면 상에서 조립되도록 한다 (도 1 참조). 음화로 착색된 VLD 의 투과형 전자 현미경 (TEM) 은, 개별 액적의 표면 상에, 고리형 캡소머를 포함하는, 정돈된 단백질 구조체 모두의 존재를 나타낸다. 구조체의 다양성 (diversity) 을 증명하기 위해, 본 발명은 단백질의 공지된 상 거동에 대응하는, 5 개의 상이한 버퍼 조건에서 SDS-코팅된 나노액적을 캡시드화하였다 (Adolph, K. W.; Butler, P. J., Studies on the Assembly of a Spherical Plant Virus. I. States of Aggregation of the Isolated Protein. J. Mol. Biol. 1974, 88, 327-341 ; Adolph, K. W.; Butler, P. J., Assembly of a Spherical Plant Virus. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B 1976, 276, 113-122; Bancroft, J. B.; Hills, G. J.; Markham, R., A Study of the Self-Assembly Process in a Small Spherical Virus. Formation of Organized Structures from Protein Subunits in Vitro. Virology 1967, 31, 354-379): 'RNA-재조립' (pH = 7.2, I = 0.1 M), '육각형 시트' (pH = 6.2, I = 0.1 M), '다이머' (pH = 6.2, I = 1.0 M), '멀티-쉘' (pH = 4.8, I = 0.1 M), 그리고 '빈 쉘' (pH = 4.8, I = 1.0 M). 본 발명은 도 2 의 a 에서 이들 버퍼에 대한 음화로 착색된 VLD 의 TEM 이미지를 나타낸다. 우라닐 아세테 이트 착색은 코팅된 액적의 코어 내로 침투하기 못하기 때문에, 단백질-코팅된 나노액적은 빈 캡시드 쉘로부터 구별될 수 있고, 그리하여 그들은 중심에서 두드러지게 더 밝게 보인다. 증발 프로세스 동안 물 접촉 라인이 희미해짐에 따라 착색의 트랩으로 인해 액적의 에지 주위에서의 보다 어두운 고리가 존재한다. 이런 착색 및 건조 프로세스는 각 액적의 표면의 하나의 절반만의 우수한 관찰을 제공하는 TEM 이미지를 산출한다. 이미지는 다른 하나의 절반 상에 단백질로부터의 중요한 신호를 함유하지 않기 때문에, 정돈된 구조체를 이용하는 재구성 방법에 의존하기 보다는 오히려, 개별 액적 상의 단백질 표면 구조를 식별하고 해석할 수 있다.

모든 5 개의 버퍼에 대해, CCMV 단백질은 나노액적의 크기에 상관없이 나노액적을 캡시드화한다 (도 2 의 a). 다이머 버퍼 및 RNA-재조립 버퍼는 빈 쉘 내로의 단백질의 임의의 손실 없이 효율적으로 VLD 를 생성한다. 멀티-쉘 버퍼에 대해, 본 발명은 단일-쉘, 이중-쉘 (우세함) 및 삼중-쉘로 코팅된 나노액적을 관찰한다. 빈 쉘 및 멀티-쉘 버퍼 조건에 대해, 액적을 코팅하기 위해 요구되는 것 이상의 약간 과잉의 단백질로 인해, 본 발명은 캡시드화된 액적 그리고 또한 빈 쉘을 관찰한다.

단백질이 건조 동안 액적 표면 상에 단순히 증착되지 않고, 용액 내에서 액적 주위에서 실제로 조립하는 것을 확인하기 위해, 본 발명은 RNA-조립 버퍼를 투석한 후 마이크로스케일 실리콘 오일 액적 상에 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) -라벨링된 CCMV 캡시드 단백질을 실험하였다. 강한 형광이 액적의 표면으로부터 발해지고 (도 2 의 a 삽입), 라벨링된 단백질로 코팅되어 있는 것을 나타낸 다. 반면에, 양이온성 CTAB (cetyl-trimethylammonium bromide) 계면활성제로 코팅된 액적이 FITC-라벨링된 CCMV 단백질과 혼합되고 동일한 방식으로 투석되는 경우, 표면 형광이 관찰되지 않으며, 이는 양이온성 계면활성제가 통상 이런 특정 단백질로 단백질-변형된 액적을 생성하는데 적합하지 않다는 것을 나타낸다.

본 발명은 또한 RNA-재조립 조건에 대해 상이한 곡률을 갖는 나노액적 상에서 단백질의 정돈 및 비정돈의 상대적 정도 및 구조체를 실험하였다 (도 3). 개별 VLD 의 표면 상의 구조체의 이미지를 개선시키기 위해, 본 발명은 배경을 제거한 후 푸리에 필터링을 이용하여 고주파 잡음을 감소시킨다. 본 발명은 밝은 고리를 둘러싸는 어두운 외부 협곡부 그리고 또한 내부 어두운 중심 스폿을 가지는 화이트 고리로서 완전 캡소머를 식별한다. 보다 밝은 영역은 표면으로부터 밖으로 돌출되는 보다 고밀도의 단백질을 나타내고, 보다 어두운 영역은 일반적으로 국지적 함몰부에 착색이 매우 높게 집중되는 보다 저밀도의 단백질을 나타낸다. 액적이 점차적으로 CCMV 보다 더 커지게 됨에 따라, 덜 만곡된 비압축성 표면 상에서 완전 캡소머가 덜 일반적이게 되고, 여러 다른 단백질 구조체가 관찰된다. 특히, 야생형 CCMV 상의 완전 20면체 정돈과 뚜렷하게 대조적으로, 불완전 캡소머, 선형 반흔형 결함, 및 육각형 웹형 구조체가 관찰된다. 에너지 최소화에 기초하여, 액적 크기가 허용 삼각 분할수 T 에 대응되는 경우에, 정돈된 캡소머에 의해 액적의 보다 큰 상대적 커버리지가 예상될 수도 있고 (Bruinsma, R. F.; Gelbart, W. M.; Reguera, D.; Rudnick, J.; Zandi, R., Viral Self-Assembly as a Thermodynamic Process. Phys. Rev. Lett. 2003, 90, Art. No. 248101 pp. 1-4; Zandi, R.; Reguera, D.; Bruinsma, R. F.; Gelbart, W. M.; Rudnick, J., Origin of Icosahedral Symmetry in Viruses. Proc. Nat. Acad. Sci. 2004, 101, 15556-15560) (도 3 - 하부 스케일 참조), 그럼에도 불구하고 이는 캡소머의 크기 및 구조체는 코어의 압축성의 정도 및 근본적인 곡률에 의해 영향받지 않을 것이라고 가정한다. 모든 버퍼 조건에서의 본 발명의 실험은 허용 T 에 대응하는 액적에 대해 보다 높은 정도의 캡소머 정돈을 나타내지 않지만, 이는 지금까지 조사한 것과 상이한 pH 및 I 에서 발생할 수도 있다.

자연 바이러스의 크기에 더 가까운 보다 작은 액적에 대해, 자연 바이러스에서 관찰될 수 있는 바와 같이, 본 발명은 캡소머의 국지적 육각형 패킹을 식별하였다 (도 4 의 a - 좌측). 우리가 중심 캡소머를 둘러싸는 6 개의 캡소머의 수많은 예를 발견하지만, CCMV 보다 현저하게 더 큰 액적에 대해서는 결함 없는 5-겹 동위 캡소머가 관찰되지 않았다. 이웃하는 6-겹 캡소머들 사이의 중심간 거리의 분포가 도 4 의 b 에 도시되고, 평균 거리 9.5 nm 는 자연 CCMV 로부터 공지된 것과 우수하게 일치한다 (Speir, J. A.; Munshi, S.; Wang, G.; Baker, T. S.; Johnson, J. E., Structures of the Native and Swollen Forms of Cowpea Chlorotic Mottle Virus Determined by X-Ray Crystallography and Cryo-Electron Microscopy. Structure 1995, 3, 63-78).

보다 큰 액적의 수에 대해, 본 발명은 단백질의 육각형 웹형 구조체를 관찰한다: '웹', 또는 상호연결된 화이트 경계에 의해 둘러싸인 어두운 점의 영역 (도 4 의 a - 우측). 캡소머의 어두운 외부 협곡부 특징이 없다. 이런 단백질 웹은 통 상 국지적 6-겹 육각형 정돈을 가지지만, 일반적으로 결함으로 인해 정돈되지 않을 수 있다. 가장 가까운-이웃 점들 간의 평균 거리는 단지 4.7 nm (캡소머들의 중심들 간 거리의 대략 절반) 이다 (도 4 의 b 참조). 이것은 더 크게 만곡된 압축성 표면 상에서 보다는 더 평탄한 비압축성 표면 상에서 상이한 방식으로 자기-조립하는 캡시드 단백질과 일치한다 (Bancroft, J. B.; Hills, G. J.; Markham, R., A Study of the Self-Assembly Process in a Small Spherical Virus. Formation of Organized Structures from Protein Subunits in Vitro. Virology 1967, 31, 354-379).

본 발명은, 단백질의 육각형 웹 구조체의 형성의 메커니즘이 보다 낮은 곡률의 비압축성 표면 상에서 자기-조립된 단백질 서브-유닛의 치밀한 패킹 및 근본적인 대칭을 고려함으로써 이해될 수 있다고 제안한다. CCMV 캡시드 단백질은 x-선 결정구조법에 의해 식별되었는 친밀한 다이머들의 육각형 캡소머들 내로 자기-조립하는 것이 공지되어 있다 (Tang, J.; Johnson, J. M.; Dryden, K. A.; Young, M. J.; Zlotnick, A.; Johnson, J. E., The Role of Subunit Hinges and Molecular 'Switches' in the Control of Viral Capsid Polymorphism. J. Struct. Biol. 2006, 154, 59-67; Adolph, K. W.; Butler, P. J., Studies on the Assembly of a Spherical Plant Virus. I. States of Aggregation of the Isolated Protein. J. MoI. Biol. 1974, 88, 327-341). 이들 다이머는 여러 버퍼 조건에서의 모노머에 대해 활력적으로 유리하고; 하나의 단백질의 돌출 아암은 그 파트너의 겹친 영역 내로 삽입되고 인력에 의해 유지되며, 또한 그 반대도 마찬가지이다. 6 개의 친밀한 다이머들이 함께 기어와 닮은 구조체 내의 6 개의 돌출 아암을 가지는 캡소머를 형성할 수 있다 (도 4 의 c - 하부 좌측). 이러한 캡소머 구조체는 또한 다이머의 랜덤 조립에 대해 활력적으로 유리하다. 다이머들의 이들 기어-유사 육각형 캡소머들이 자기-조립한 후에 치밀하게 패킹하여 평탄한 표면을 커버하는 경우, 그들은 이웃 캡소머들 사이의 중심간 거리의 절반에서 단백질이 감소되는 영역을 갖는 캡소머의 육각형 어레이를 생성할 수 있다. 이런 패킹된-기어 구조체는 관찰되는 웹의 외관 (단백질 밀도가 보다 낮은 어두운 스폿의 육각형 어레이 및 단백질 밀도가 보다 높은 밝은 웹의 상호연결된 육각형 네트워크) 을 제공할 것이다. 평탄한 표면 상의 단백질의 자기-조립에 대해, 접힌 캡시드 단백질 및 다이머가 오직 단일 배좌로 존재하고, 야생형 바이러스에 필적하는 보다 높은 곡률을 갖는 코어 구조체 상에서 5-겹 동위 캡소머를 조립하는데 요구되는 3 개의 공지된 배좌로 일그러지지 않는다는 것을 가정하는 것이 합리적이다.

정돈된 웹에 추가적으로, 본 발명은 또한 화이트 림 (rim) 에 의해 둘러싸인 어두운 협곡부인 기다란 단백질 반흔을 관찰한다 (도 4 의 a - 중간). 이들 단백질 반흔들은 만곡된 액체 액적의 표면 상에 단분산 (monodisperse) 고체 구의 패킹시에 발견되는 반흔 결함들 (Bausch, A. R.; Bowick, M. J.; Cacciuto, A.; Dinsmore, A. D.; Hsu, M. F.; Nelson, D. R.; Nikolaides, M. G.; Travesset, A.; Weitz, D. A., Grain Boundary Scars and Spherical Crystallography. Science 2003, 299, 1716-1718; Bowick, M.; Cacciuto, A.; Nelson, D. R.; Travesset, A., Crystalline Order on a Sphere and the Generalized Thomson Problem. Phys. Rev. Lett. 2002, 89, Art. No. 185502 pp. 1-4), '픽커링 에멀션 (Pickering emulsion)'의 제어된 다양성 (Tarimala, S.; Dai, L. L., Structure of Microparticles in Solid-Stabilized Emulsions. Langmuir 2004, 20, 3492-3494; Pickering, S. U., Emulsions. J. Chem. Soc. Trans. Lond. 1907, 91, 2001-2021 ; Subramaniam, A. B.; Abkarian, M.; Stone, H. A., Controlled Assembly of Jammed Colloidal Shells on Fluid Droplets. Nat. Mater. 2005, 4, 553-556) 에 대한 일부 유사점을 제공하며, 그럼에도 불구하고 캡시드 단백질 반흔들은 명백히 상이하다. 단백질 반흔은 완전 형성된 육각형 고리형 캡소머들 사이의 라인 결함으로 단순히 이루어지지 않으며; 그 대신에 단백질 반흔은 심지어 캡소머 유닛 자체보다 더 작은 스케일로 단백질의 비정돈을 나타낸다. 여러 메커니즘이 조합하여 반흔 결함 (일단 표면이 완전히 커버되면 단백질 재배향 및 재배열을 강력하게 금지하는 단백질의 표면 재밍, 및 20면체 구조체에 대한 허용 T-수치에 대응하는 것들에 비해 액적의 알맞지 않는 크기) 을 생성한다.

결과의 논의

다이머, 부분 캡소머, 및 완전 캡소머를 포함하는 다양한 단백질 구조체는, 평형하지 않은 유리 및 겔을 암시하는 방식으로 감소된 곡률을 가지는 비압축성 구형 표면 상에서 국지적으로 비정돈된 상태로 재밍될 수도 있다 (Liu, A. J.; Nagel, S. R., Jamming Is Not Just Cool Any More. Nature 1998, 396, 21-22). RNA 주위에서 형성할 때와 같이, 고 밀도로 흡착된 단백질은 가장 낮은-에너지 정돈된 상태 내로 재편성하고 배좌를 변화시키지 못할 수도 있기 때문에, 추가적인 결함은 발생될 수도 있다. 상대적 단백질 커버리지를 제어하고 캡시드화의 프로세스의 동력학을 실험하는 것은, 정돈되거나 정돈되지 않은 단백질 구조체가 VLD 의 표면 상에 어떻게 발생하는지에 대한 보다 큰 통찰력을 제공할 것이다. pH 및 이온 세기를 조절함으로써, 제어된 수의 캡시드 쉘을 갖는 합성 폴리머, 나노입자, 및 액적을 캡시드화하는 것이 가능할 수도 있다.

개별 캡시드화된 나노액적의 TEM 이미지를 해석함으로써, 본 발명은 액적의 표면 상에, 결함있는 캡소머, 육각형 웹, 및 반흔을 포함하는 갖가지 새로운 구조체를 나타내었다. 이들 구조체의 발견은 만곡된 표면 상의 단백질 배좌의 성질에 대한 중요한 새로운 통찰력을 제공한다. 게다가, 비압축성 대전된 템플릿 상의 표면 재밍으로 인해 캡시드화된 나노스케일 오브젝트 상에 비평형 단백질 구조체가 존재할 수 있고 그리고 완전 20면체 쉘의 열역학적 자기-조립의 픽쳐는 특정 제한 경우에 있어서만 정확할 수도 있다는 것을 나타낸다.

단백질-변형된 액적을 제작하는데 유용한 단백질은, 다음의 바이러스 패밀리의 멤버인 바이러스로부터 획득될 수도 있다: 아데노비리대 (Adenoviridae), 아넬로바이러스 (Anellovirus), 아레나비리대 (Arenaviridae), 아터리비리대 (Arteriviridae), 아스코비리대 (Ascoviridae), 아스파비리대 (Asfarviridae), 아스트로비리대 (Astroviridae), 아순비로이데 (Asunviroidae), 바쿠로비리대 (Baculoviridae), 바르나비리대 (Barnaviridae), 베니바이러스 (Benyvirus), 비르나비리대 (Birnaviridae), 보르나비리대 (Bornaviridae), 브로모비리대 (Bromoviridae), 분야비리대 (Bunyaviridae), 칼리시비리대 (Caliciviridae), 코울 리모비리대 (Caulimoviridae), 체라바이러스 (Cheravirus), 크리소비리대 (Chrysoviridae), 시르코비리대 (Circoviridae), 클로스테로비리데 (Closteroviridae), 코모비리대 (Comoviridae), 코로나비리대 (Coronaviridae), 코르티코비리대 (Corticoviridae), 사이스토비리대 (Cystoviridae), 델타바이러스 (Deltavirus), 디시스트로비리대 (Dicistroviridae), 엔도르나바이러스 (Endornavirus), 필로비리대 (Filoviridae), 플라비비리대 (Flaviviridae), 플렉시비리대 (Flexiviridae), 푸로바이러스 (Furovirus), 푸셀로비리대 (Fuselloviridae), 게미니비리대 (Geminiviridae), 굳타비리대 (Guttaviridae), 헤파드나비리대 (Hepadnaviridae), 헤페비리대 (Hepeviridae), 헤르페스비리대 (Herpesviridae), 호르데이바이러스 (Hordeivirus), 히포비리대 (Hypoviridae), 이플라바이러스 (Iflavirus), 이노비리대 (Inoviridae), 이리도비리대 (Iridoviridae), 레비비리대 (Leviviridae), 리포트릭스비리대 (Lipothrixviridae), 루테오비리대 (Luteoviridae), 마르나비리대 (Marnaviridae), 메타비리대 (Metaviridae), 미크로비리대 (Microviridae), 미미바이러스 (Mimivirus), 묘비리대 (Myoviridae), 나노비리대 (Nanoviridae), 나르나비리대 (Narnaviridae), 니마비리대 (Nimaviridae), 노다비리대 (Nodaviridae), 옵피오바이러스 (Ophiovirus), 오르토믹소비리대 (Orthomyxoviridae), 아우어미아바이러스 (Ourmiavirus), 파필로마비리대 (Papillomaviridae), 파라믹소비리대 (Paramyxoviridae), 파르티티비리대 (Partitiviridae), 파르보비리대 (Parvoviridae), 페클루바이러스 (Pecluvirus), 피코드나비리대 (Phycodnaviridae), 피코르나비리대 (Picornaviridae), 플라스마비리대 (Plasmaviridae), 포도비리대 (Podoviridae), 폴리드나비리대 (Polydnaviridae), 폴리오마비리대 (Polyomaviridae), 포스피비로이데 (Pospiviroidae), 포티비리대 (Potyviridae), 폭스비리대 (Poxviridae), 슈도비리대 (Pseudoviridae), 레오비리대 (Reoviridae), 레트로비리대 (Retroviridae), 랍도비리대 (Rhabdoviridae), 리지디오바이러스 (Rhizidiovirus), 로니비리대 (Roniviridae), 루디비리대 (Rudiviridae), 사드와바이러스 (Sadwavirus), 살터프로바이러스 (Salterprovirus), 세퀴비리대 (Sequiviridae), 시포비리대 (Siphoviridae), 소베모바이러스 (Sobemovirus), 텍티비리대 (Tectiviridae), 테누이바이러스 (Tenuivirus), 테트라비리대 (Tetraviridae), 토바모바이러스 (Tobamovirus), 토브라바이러스 (Tobravirus), 토가비리대 (Togaviridae), 톰버스비리대 (Tombusviridae), 토티비리대 (Totiviridae), 티모비리대 (Tymoviridae), 움브라바이러스 (Umbravirus), 및 바리코사바이러스 (Varicosavirus). 또한, 단백질-변형된 액적을 제작하는데 유용한 단백질은 이 리스트에 포함되지 않은 다른 바이러스 패밀리의 멤버로부터 그리고 또한 지금까지 발견되어 연구되는 바이러스 패밀리로부터 획득될 수도 있다.

바이러스로부터의 단백질 이외에, 박테리아, 곰팡이, 식물, 동물 및 스펀지 (sponge) 로부터 취해진 단백질은, 액적 표면과 그 단백질의 끌어당기는 상호작용에 의해 생성되는 방식으로 액적의 표면에 단백질을 근접하게 하는 방식으로 이러한 단백질이 효과적으로 격리, 분리 및 조작될 수 있다면, 단백질-변형된 액적을 제작하기 위해 이용될 수 있다.

단백질-변형된 액적을 제작하는데 유용한 단백질은 구조적 단백질, 비구조적 단백질, 코트 단백질, 캡시드 단백질, 코어 단백질, 엔벨로프 단백질 (envelope protein), 매트릭스 단백질, 트랜스막 단백질 (transmembrane protein), 막 연관 단백질, 비구조적 단백질, 뉴클리오캡시드 단백질 (necleocapsid protein), 필라멘터스 단백질 (filamentous protein), 캡핑 단백질 (capping protein), 가교결합 단백질, 당단백질 (glycoprotein) 및 모터 단백질 (motor protein) 을 포함하지만 이들에 한정되지 않는, 다양한 관능기를 가질 수도 있다.

본 발명이 제공한 단백질-변형된 액적의 예는, CCMV (Cowpea Chlorotic Mottle Virus), 식물 바이러스의 패밀리의 멤버, 브로모비리대로부터 정제된 단일 캡시드 단백질이다.

바이러스는 2 종류 이상의 캡시드 단백질을 가질 수 있다. 나타낸 특정 예에 있어서, 본 발명은 단백질 조립을 위한 템플릿으로서 다가 음이온성 유전 물질 대신에 다가 음이온성 액적을 치환하였고, 다양한 바이러스 캡시드 단백질이 대전된 액적의 표면에 효과적으로 끌어당겨질 수 있다. 그리하여, 2 개 이상의 캡시드 단백질을 갖는 바이러스에 대해, 적절한 화학량론비의 상이한 단백질 종류가 액적을 둘러싸고 및/또는 액적을 변형하기 위한 충분한 구조적 특징을 확실히 제공할 것이다. 게다가, 2 종류 이상의 캡시드 단백질을 자연적으로 생성하는 바이러스에 대해, 정제된 단일 종류의 캡시드 단백질도 액적을 둘러싸고 및/또는 액적을 변형시키는데 충분하다; 특정 바이러스로부터 존재하는 모든 상이한 종류의 캡시드 단백 질을 가질 필요는 없다. 주요 요건은, 단백질이 액적 표면과의 끌어당기는 상호작용을 경험하고 그후에 상기 액적 표면에 근접하게 유지되도록, 액적의 표면 상의 전하, 용액의 pH, 및 용액의 이온 조성과 이온 세기가 조절되어야 한다는 것이다.

일단 단백질 코팅이 액적 주위에 형성되면, 단백질층을 둘러싸는 지질 코팅 (lipid coating), 리포단백질 코팅 (lipo-protein coating), 또는 지질-단백질 코팅을 또한 형성함으로써, 둘러싸인 바이러스를 닮은 전체 구조체를 생성하는 특정 어플리케이션에 유리할 수 있다. 그리하여, 이 구조체는 내부 액적 코어, 코어에 통상 흡착되는 표면 활성제, 액적 코어를 표면 활성제로 둘러싸는 단백질의 층, 및 지질, 리포단백질 또는 지질-단백질의 층을 포함한다.

보다 높은 레벨의 유기체 내의 특정 조직 및 기관에 의해, 둘러싸인 층을 가지거나 둘러싸인 층을 가지지 않는, 특정 바이러스의 선택적인 흡수 및 국지화는 주지되어 있으며, 블랙웰 (Blackwell) 출판 (2004), E. K. Wagner 및 M.J. Hewlett 에 의한 "기본적인 바이러스학 (Basic Virology)" 제2판과 같은 저서에 서술되어 있다. 단백질-변형된 액적은 생물학적 유기체에 대해 유전 물질을 함유하는 비리온을 자연적으로 발생시키는 것과 동일 단백질 구조체를 제공하므로, 동일한 단백질을 발현하는 자연 비리온에 대해 발견되는 것과 동일한 조직 및 기관에서 단백질-변형된 액적의 우선적인 흡수 및 국지화가 발생할 것이다.

본 발명은 예로서 본 명세서에 설명된 발명의 특정 실시형태에 한정되지 않으며, 청구범위에 의해 정의된다. 이 발명의 일반적 개념 및 범위로부터 벗어나지 않는 한 본 명세서에 서술된 예에 대한 다양한 변형물 및 대안물이 가능하다는 것 을 당업자는 인식할 것이다.

Claims

액체 재료를 포함하는 액적 (droplet); 및

상기 액적을 적어도 부분적으로 둘러싸도록 형성된 단백질 구조체를 포함하고,

상기 단백질 구조체는, 상기 단백질 구조체의 형성 동안 적어도 상기 액적의 영역에 친화성을 갖는 복수의 단백질 분자를 포함하고,

상기 액적은 적어도 약 1 nm 그리고 약 1000 nm 미만의 최대 치수를 가지는, 단백질-변형된 액적 (protein-modified droplet).
제 1 항에 있어서,

상기 액적은 적어도 약 5 nm 그리고 약 100 nm 미만의 최대 치수를 가지는, 단백질-변형된 액적.
제 1 항에 있어서,

상기 단백질 구조체는 제 1 액체 재료의 코어 (core) 를 실질적으로 둘러싸는, 단백질-변형된 액적.
제 1 항에 있어서,

상기 액적의 상기 액체 재료는 소수성 재료를 포함하는, 단백질-변형된 액 적.
제 1 항에 있어서,

상기 액적의 상기 액체 재료는, 오일, 실리콘 오일, 탄화수소 오일, 석유 오일, 연료 오일, 왁스, 지방 (fat), 플루오르화 오일, 비휘발성 오일, 휘발성 오일, 방향족 오일, 식물 재료로부터 유래된 오일, 동물 재료로부터 유래된 오일, 천연 소스로부터 유래된 오일, 증류된 오일, 추출된 오일, 쿠킹 오일, 식품 오일, 윤활제, 조성 중에 탄화수소가 우세한 반응성 재료, 에폭시 재료, 접착제 재료, 중합성 재료, 서모트로픽 액정, 리오트로픽 액정, 산성 오일, 염기성 오일, 중성 오일, 천연 오일, 폴리머 오일, 및 합성 오일로 이루어진 재료들의 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 재료를 포함하는, 단백질-변형된 액적.
제 5 항에 있어서,

상기 액적의 상기 액체 재료는 상기 적어도 하나의 재료에 분산가능한 생물학적 활성제를 더 포함하는, 단백질-변형된 액적.
제 6 항에 있어서,

상기 생물학적 활성제는, 약물 분자 (drug molecule), 항암 분자, 치료 분자 (therapeutic molecule), 호르몬 분자, 작동약 분자 (agonist molecule), 길항제 분자 (antagonist molecule), 방지제 분자, 억제제 분자, 증감제 분자, 항우울제 분자, 항바이러스 분자, 항곰팡이 분자, 항균 분자, 생체이용율 증강제 분자 (bioavailability enhancer molecule), RNA-결합 분자, DNA-결합 분자, 독소 분자, 염료 분자, 형광 분자, 생체분자 (biomolecule), 영양제, 비타민, 조미료, 효소, 방사성 동위체 (radioactive isotope), 비방사성 동위체, 나노입자, 및 이미징 콘트라스트 향상제 (imaging contrast enhancement agent) 로 이루어진 재료들의 그룹으로부터 선택되는, 단백질-변형된 액적.
제 3 항에 있어서,

상기 단백질 구조체는 단백질 분자의 단층인, 단백질-변형된 액적.
제 3 항에 있어서,

상기 복수의 단백질 분자는 적어도 부분적으로 정돈된 단백질 구조체를 형성하는, 단백질-변형된 액적.
제 9 항에 있어서,

상기 복수의 단백질 분자는 단백질 다이머, 트라이머, 테트라머, 펜타머, 헥사머, 헵타머, 옥타머, 펜톤, 헥손, 섬유 (fiber), 웹형 (web-like) 구조체, 및 캡소머 (capsomer) 로 이루어진 서부구조체들의 그룹으로부터의 적어도 하나의 조립된 단백질 서브구조체를 함유하는, 단백질-변형된 액적.
제 3 항에 있어서,

상기 단백질 구조체는 복수의 단백질 층인, 단백질-변형된 액적.
제 1 항에 있어서,

상기 단백질 구조체를 형성하는 상기 복수의 단백질 분자는 복수의 자연 발생적 단백질 분자인, 단백질-변형된 액적.
제 12 항에 있어서,

상기 단백질 구조체는, 특정 종류의 서브세포 구조체, 특정 종류의 세포, 특정 생물학적 조직, 및 특정 생물학적 기관 중 적어도 하나 내부에 우선적으로 진입하고 농축하는 것으로 알려진 바이러스 캡시드 단백질 (virus capsid protein) 로부터 형성되는, 단백질-변형된 액적.
제 12 항에 있어서,

상기 복수의 자연 발생적 단백질 분자는 복수의 바이러스 캡시드 단백질 분자인, 단백질-변형된 액적.
제 1 항에 있어서,

상기 단백질 구조체를 형성하는 상기 복수의 단백질 분자는 복수의 합성 폴리펩티드 분자인, 단백질-변형된 액적.
제 1 항에 있어서,

상기 액적은 그 조성 중에 소수성 재료를 포함하는, 단백질-변형된 액적.
제 1 항에 있어서,

상기 액적은 상기 액체 재료 상에 흡착된 양친매성 표면 활성 분자를 포함하고, 상기 양친매성 표면 활성 분자는 상기 복수의 단백질 분자를 끌어당기기에 적합한 전하를 갖는, 단백질-변형된 액적.
제 17 항에 있어서,

상기 양친매성 표면 활성 분자는 음이온성 계면활성제 분자인, 단백질-변형된 액적.
제 1 항에 있어서,

상기 단백질 구조체에 부착된 항원 (antigen), 막 단백질 (membrane protein), 리포단백질 분자 (lipo-protein molecule), 및 지질 분자 (lipid molecule) 중 적어도 하나를 더 포함하는, 단백질-변형된 액적.
제 3 항에 있어서,

상기 단백질 구조체 상에 형성된 지질 막 (lipid membrane) 을 더 포함하는, 단백질-변형된 액적.
제 1 항에 있어서,

상기 단백질 구조체를 형성하는 상기 복수의 단백질 분자는 복수의 상이한 종류의 단백질 분자를 포함하는, 단백질-변형된 액적.
수용액에 분산된 복수의 단백질-변형된 액적 (protein-modified droplet) 을 포함하는 조성물로서,

상기 단백질-변형된 액적 각각은,

액체 재료를 포함하는 액적; 및

상기 액적을 적어도 부분적으로 둘러싸도록 형성된 단백질 구조체를 포함하고,

상기 단백질 구조체는, 상기 단백질 구조체의 형성 동안 적어도 상기 액적의 영역에 친화성을 갖는 복수의 단백질 분자를 포함하고,

상기 액적은 적어도 약 1 nm 그리고 약 100 nm 미만의 최대 치수를 가지는,수용액에 분산된 복수의 단백질-변형된 액적을 포함하는 조성물.
단백질-변형된 액적 (protein-modified droplet) 을 제조하는 방법으로서,

제 1 비혼화성 액체 재료 및 제 2 비혼화성 액체 재료를 공급하는 단계;

상기 제 1 비혼화성 액체 재료 및 상기 제 2 비혼화성 액체 재료 중 적어도 하나에 안정화제를 첨가하는 단계;

상기 제 1 비혼화성 액체 재료 및 상기 제 2 비혼화성 액체 재료를 에멀션화하여 상기 안정화제에 의해 안정화되는 상기 제 1 비혼화성 액체 재료 내의 상기 제 2 비혼화성 액체 재료의 복수의 액적을 형성하는 단계로서, 상기 복수의 액적의 각각의 액적은 적어도 약 1 nm 그리고 약 100 nm 미만의 최대 치수를 가지는, 상기 복수의 액적을 형성하는 단계;

상기 에멀션화 이전 그리고 상기 에멀션화 이후 중 적어도 하나에서 단백질 분자를 첨가하는 단계; 및

단백질 구조체가 상기 복수의 액적 각각을 적어도 부분적으로 둘러싸도록 형성되게 하는 단계를 포함하고,

첨가되는 상기 안정화제 및 상기 단백질 분자는, 상기 안정화제가 상기 액적에 부착될 때 서로 상호 정전기적 인력을 가지는 종류인, 단백질-변형된 액적의 제조 방법.
제 23 항에 있어서,

상기 단백질 구조체 각각은 대응하는 액적의 외부에 놓이는 외구조 (exostruction) 인, 단백질-변형된 액적의 제조 방법.
제 23 항에 있어서,

상기 복수의 단백질-변형된 액적이 형성된 상기 제 1 비혼화성 액체 재료를 증발시키는 단계를 더 포함하고,

상기 단백질 구조체는 상기 단백질-변형된 액적의 합체를 방지하는, 단백질-변형된 액적의 제조 방법.
제 23 항에 있어서,

투석, 적정, 혼합, 상기 제 1 비혼화성 액체 재료 내의 이온 농도의 변경, 상기 제 1 비혼화성 액체 재료의 pH 변경, 상기 제 1 비혼화성 액체 재료의 버퍼 종류 변경, 및 상기 제 1 비혼화성 액체 재료 내의 화학 반응 유발 중 적어도 하나를 포함하는, 단백질 분자가 상기 제 1 비혼화성 액체 재료 내에 집합하도록 하는 단계를 더 포함하는, 단백질-변형된 액적의 제조 방법.