CN112321687B - 一种仿病毒蛋白笼颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种仿病毒蛋白笼颗粒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种仿病毒蛋白笼颗粒及其制备方法和应用。具体地，本发明提供一种基于纳米气泡的仿病毒蛋白笼颗粒的制备方法，所述方法包括以下步骤：S1：制备体相纳米气泡溶液；S2：将病毒解组装成寡聚体，用组装缓冲液稀释寡聚体，纯化寡聚体，并确定寡聚体浓度；S3：向寡聚体中加入体相纳米气泡溶液并混匀，使仿病毒蛋白笼自组装发生，随后离心纯化，即得到自组装的仿病毒蛋白笼颗粒。所述仿病毒蛋白笼颗粒的制备方法具有以下优点：可调控性强，没有侵入性，制备条件温和，且自组装过程具有可逆性。

Description

一种仿病毒蛋白笼颗粒及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种基于纳米气泡的仿病毒蛋白笼颗粒的制备方法及由其制备的仿病毒蛋白笼颗粒及应用。
背景技术
仿病毒蛋白笼颗粒简称蛋白纳米笼，是由一种或几种蛋白亚基自组装形成的形状、粒径高度均一的中空球状复合体。粒径在10-1000纳米之间，例如仿病毒纳米颗粒(virus-like nanoparticles)、胶囊蛋白(encapsulin)、铁蛋白(ferritin)、伴侣蛋白(chaperonin)等。这些蛋白笼结构具有分布广、种类多、生物相容性好、结构高度有序、单分散、组装解组装过程可人为调控等特点。常用的制备方法是通过带负电的外源物质诱导蛋白分子自组装的模板法和通过调节溶液pH实现蛋白笼亚基的组装和解组装的免模板法。
中空仿病毒蛋白纳米笼具有高负载性，在药物释放、水裂解、传感、催化等领域具有广泛的应用与研究价值。对球形中空仿病毒蛋白纳米笼进行表面功能化修饰，可以实现蛋白纳米笼的多种用途，如增强其靶向性。对于球形中空仿病毒蛋白笼的组装，模板法是最常用的方法。制备过程常以交联或者聚合的方式固定壳结构，经溶剂溶解除去模板后得到中空纳米球体，这种方法简单高效、纳米粒子的结构可调控性强，但制备的中空纳米球体通常缺乏规整的表面纳米结构。另外一种是免模板法。免模板法通常依靠目标材料的自组装实现，无需额外的模板，是组装空心结构最简单、方便的方法。在常规的组装过程中，蛋白分子必须在极端的pH条件下进行解组装，并在另一极端pH条件下重新实现自组装。例如，豇豆褪绿斑驳病毒蛋白在pH＝7.5的情况下，蛋白亚基发生解组装，而当溶液pH值降低到4.8及以下时，解聚的亚基才可以重新自组装恢复成笼状结构。这一pH值跳跃的过程仅部分可逆，进而导致蛋白分子重组可能不完全。极端的组装条件给后续功能化修饰带来挑战或直接导致功能化修饰失败。由于功能化修饰成功与否对后续传感、递送、治疗等应用的靶向性至关重要。因此，亟需研发一种无需外源物质、且在中性pH条件下就可以同时实现病毒蛋白的解组装与重组的方法。
发明内容
本发明的技术目的是提供一种基于纳米气泡的仿病毒蛋白笼颗粒的制备方法，所述方法无需外源物质即可制备仿病毒蛋白笼颗粒。
本发明的另一技术目的是提供由上述方法制备的仿病毒蛋白笼颗粒。
本发明的再一技术目的是提供所述仿病毒蛋白笼颗粒的用途。
一方面，本发明提供一种基于纳米气泡的仿病毒蛋白笼颗粒的制备方法，所述方法包括以下步骤：
S1：制备体相纳米气泡溶液；
S2：将病毒解组装成寡聚体，用组装缓冲液稀释寡聚体，纯化寡聚体，并确定寡聚体浓度；
S3：向寡聚体中加入体相纳米气泡溶液并混匀，使仿病毒蛋白笼自组装发生，随后离心纯化，即得到自组装的仿病毒蛋白笼颗粒。
在具体实施方式中，所述步骤S1包括以下步骤：
S11：利用电解水的方法制备体相纳米气泡溶液，制备的体相纳米气泡溶液为包含氢气纳米气泡和氧气纳米气泡的混合溶液；以及
S12：用0.45μm的过滤膜过滤后，备用。
在具体实施方式中，在步骤S11中制备的纳米气泡溶液的氧气的过饱和率为110％-130％，纳米气泡在溶液中的浓度为107-108个/mL，纳米气泡的zeta电位为小于等于-15mV。
在具体实施方式中，在步骤S2中，所述组装缓冲液为pH为7.5的Tris缓冲液，所述病毒可选自豇豆花叶病毒、烟草花叶病病毒，所述寡聚体浓度为1～5mg/mL，优选3mg/mL。
在具体实施方式中，所述步骤S3包括：
S31：向经过纯化的蛋白悬液，加入两倍体积的纳米气泡溶液。混合溶液先机械摇晃1min，然后置于恒温摇床上过夜，诱导衣壳蛋白自组装形成仿病毒蛋白笼，离心过滤以便对形成的仿病毒蛋白笼浓缩收集。
在具体实施方式中，在所述步骤S3中，在产物制备之后，进一步包括通过动态光散射(DLS)、透射电子显微镜(TEM)或原子力显微镜(AFM)对产物进行表征。
在具体实施方式中，在所述步骤S2和S3中，所述寡聚体纯化及仿病毒蛋白笼颗粒自组装过程均可在4℃环境下进行。
另一方面，本发明提供根据上述方法制备的仿病毒蛋白笼颗粒。
再一方面，本发明提供所述仿病毒蛋白笼颗粒在制备用于生物传感、药物靶向递送、疾病治疗的试剂中的用途。
有益效果
本发明具有以下有益效果：
1、本发明利用病毒蛋白的解组装与重组装的可控性，尤其是体相纳米气泡溶液的气体过饱和率、纳米气泡表面zeta电位和寡聚体临界组装浓度，可以通过增加气体过饱和率、增强气泡表面电势和提高寡聚体蛋白浓度来灵活控制仿病毒蛋白笼的组装，可调控性强。
2、本发明通过纳米气泡来诱导蛋白自组装制备仿病毒蛋白笼。与传统的外源模板物质驱动制备法相比，纳米气泡没有侵入性，且纳米气泡可以随时间自然消散，但仍然可以成功诱导蛋白自组装制备中空的仿病毒蛋白笼。同时本发明适用于不同种类(例如豇豆花叶病毒、烟草花叶病病毒)的病毒蛋白笼。
3、针对球形中空蛋白笼的制备，相比于利用环境pH改变诱导寡聚体自组装的方法，纳米气泡驱动寡聚体自组装的方法，在中性pH下进行，条件温和，从而保证蛋白笼表面功能化修饰的稳定性和活性，进一步提高蛋白笼后续传感、治疗等应用的靶向性。
4、本发明利用纳米气泡驱动蛋白自组装制备仿病毒蛋白笼具有可逆性，因时间过长或者外部环境因素导致的蛋白笼解组装，可以重新加入纳米气泡溶液，实现半破损状蛋白笼的重组装。
综上，纳米气泡是直径在1μm以下的气泡，已被证实可以在固液界面和体相中稳定存在。本发明人在长期实践过程中发现：体相纳米气泡本身具有带负电的属性，且不受盐浓度影响。利用纳米气泡，可以驱动植物病毒蛋白自组装，生成仿病毒蛋白笼。
附图说明
图1示出利用本发明的方法制备的仿病毒蛋白笼颗粒的动态光散射(DLS)测试结果，(a)：纳米气泡+寡聚体的DLS测试结果，(b)：未电解的NaCl盐溶液+寡聚体的DLS测试结果。
图2示出利用本发明的方法制备的仿病毒蛋白笼颗粒的原子力显微镜(AFM)测试结果(A)及前述A图中直线标记处，对所形成的仿病毒纳米颗粒的高度(粒径)的分析结果(B)。
图3示出利用本发明的方法制备的仿病毒蛋白笼颗粒的透射电子显微镜(TEM)测试结果。
图4示出利用具有不同zeta电位(-13mV以及-20mV)的纳米气泡溶液，制备仿病毒蛋白笼颗粒的DLS测试情况。
图5示出在不同寡聚体浓度(1～5mg/ml)下，利用本发明的方法制备仿病毒蛋白笼颗粒的DLS测试情况。
图6示出纳米气泡驱动仿病毒蛋白笼颗粒自组装的可逆性，(a)：经纳米气泡组装一周后的仿病毒蛋白笼颗粒部分分解并包含游离先兆蛋白，(b)：向部分分解的仿病毒蛋白笼颗粒中添加新鲜制备的纳米气泡溶液，纳米颗粒重新组装。
具体实施方式
以下通过具体实施例来详细描述本发明的技术方案，然而这些实施例并不用于限制本发明的范围，本发明的范围以权利要求中限定的为准，并包括本领域的技术人员可以进行的其他等同、变化或替换形式。
在本申请中，体相纳米气泡是指在溶液中形成，不需要任何依附界面的，直径小于1μm的气泡。
下文中使用的仪器如下：
DLS：英国Malvern Instruments；型号为Zetasizer Nano ZS；
AFM:Asylum Research；型号为Cypher；
TEM：Phillips CM300ST-FEG。
实施例1解组装天然CCMV病毒并纯化衣壳蛋白
从新鲜的被感染的豇豆植株上收集1mL天然豇豆褪绿斑驳病毒(CCMV病毒)于病毒缓冲溶液(0.1M乙酸钠，1mM乙二胺四乙酸二钠，1mM叠氮化钠，pH 5.0)，迅速置于温度恒定为4.0℃的冰箱中储存，得到CCMV悬浊液。配制RNA缓冲液(50mM Tris，500mM CaCl2，1mM二硫苏糖醇，pH 7.5)。将得到的CCMV悬浊液先在200mL RNA缓冲液中透析2h，再在800mL缓冲液中透析过夜，4℃条件下进行。待观察到白色絮状物时，转入离心管中，40000rpm/min离心2h，提取上清液，去除含有RNA的白色絮状沉淀物。上清液(～1mL)在330mL RNA缓冲溶液中透析，每3个小时换一次缓冲溶液，共透析6h；紧接着在330mL缓冲液中透析过夜。将上述透析纯化过的上清液置于紫外分光光度计中，检测其在280nm波长下的紫外吸收光谱，确定衣壳蛋白的浓度。最后置于4℃，50mM Tris缓冲溶液(300mM NaCl，5mM MgCl2，pH 7.2)中透析。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)检测纯化效果。
实施例2:纳米气泡的制备和性能表征
采用自制纳米气泡发生装置，利用电解水的方法来制备体相纳米气泡。用去离子水(电导率18.4MΩ·cm，25℃)配置10mM氯化钠溶液。用真空泵将该溶液以500mL/min的流速流入正在电解水(电解电压24V，电流3A)的电极槽中。电解水在阳极产生氧气，阴极产生氢气，产生的气体同时溶解于氯化钠溶液中，使溶液处于过饱和状态，产生体相纳米气泡。通过产生气体的量来控制溶液的过饱和率，同时进一步控制纳米气泡的表面电位。用氧气测量仪(Fibox 3trace 3)测得氧气的过饱和度为110％-130％。
先用0.45μm的针头式过滤器过滤制备的纳米气泡溶液。接着采用动态光散射(DLS)、电泳光散射、Nanosight NTA纳米颗粒跟踪分析仪等手段来分别表征所制备的体相纳米气泡的粒径、Zeta电位和气泡密度。
体相纳米气泡是在溶液中形成，不需要任何依附界面的，直径小于1μm的气泡。所制备的体相纳米气泡的粒径为200nm左右(峰值200nm,半峰全宽FWHM 100-500nm)，Zeta电位为-20±3mV，以及气泡密度为108个/mL。
实施例3:纳米气泡诱导衣壳蛋白自组装
在4℃条件下，向200μL经过纯化的CCMV衣壳蛋白悬液中，快速加入400μL纳米气泡溶液。混合溶液先轻轻机械摇晃1min，然后置于4℃恒温摇床上过夜，诱导衣壳蛋白自组装形成仿病毒蛋白笼，通过离心过滤对形成的仿病毒蛋白笼浓缩收集。所制备的仿病毒蛋白笼颗粒的DLS、AFM及TEM测试结果分别参见图1、图2和图3。
实验例4：纳米气泡的zeta电位对纳米气泡诱导仿病毒蛋白笼颗粒自组装的影响
在4℃条件下，向200μL经过纯化的CCMV衣壳蛋白悬液中，快速加入400μL具有不同zeta电位纳米气泡溶液(-13mV和-20mV)。混合溶液先轻轻机械摇晃1min，然后置于4℃恒温摇床上过夜，离心过滤对形成的产物浓缩收集。最后用DLS测量所收集产物的粒径。
结果如图4所示。当纳米气泡zeta电位为-13mV时，大部分寡聚体保留在解组装状态。而当纳米气泡zeta电位为-20mV时，大部分寡聚体组装形成粒径为30nm的仿病毒蛋白笼颗粒。
实验例5：寡聚体浓度对纳米气泡诱导仿病毒蛋白笼颗粒自组装的影响
在4℃条件下，配置一系列浓度的CCMV蛋白悬浊液：1mg/mL，2mg/mL，3mg/mL，4mg/mL，5mg/mL。取200μL上述CCMV衣壳蛋白悬液，快速加入400μL纳米气泡溶液。混合溶液先轻轻机械摇晃1min，然后置于4℃恒温摇床上过夜，诱导衣壳蛋白自组装形成仿病毒蛋白笼，通过离心过滤对形成的仿病毒蛋白笼浓缩收集。最后用DLS测量所收集产物的粒径。
结果如图5所示。仿病毒蛋白笼颗粒的尺寸随着寡聚体蛋白浓度的升高而增大。寡聚体浓度在1mg/mL至5mg/mL范围内最有利于自组装。寡聚体浓度低于1mg/mL，由于寡聚体蛋白浓度过低，不能够发生自组装。寡聚体浓度高于5mg/mL，形成的仿病毒蛋白笼颗粒尺寸不再进一步增加。
实施例6：纳米气泡诱导仿病毒蛋白笼颗粒自组装的可逆性
仿病毒蛋白笼颗粒溶液在形成一周以后，部分蛋白笼颗粒开始变得不稳定。粒径分析结果表明溶液中出现解组装的粒径在10nm以下的寡聚体(参见图6(a))。当向该溶液中加入额外的400μL纳米气泡溶液，解组装的寡聚体重新组装回完整的仿病毒蛋白笼颗粒，如图6(b)所示。这证明了采用纳米气泡诱导仿病毒蛋白笼颗粒的自组装是可逆的。

Claims (7)

1.一种基于纳米气泡的仿病毒蛋白笼颗粒的制备方法，所述方法包括以下步骤：
S1：利用电解水的方法制备包含氢气纳米气泡和氧气纳米气泡的体相纳米气泡溶液；
S2：将豇豆褪绿斑驳病毒解组装成寡聚体，用组装缓冲液稀释寡聚体，纯化寡聚体，并确定寡聚体浓度；
S3：向寡聚体中加入所述体相纳米气泡溶液并混匀，使仿病毒蛋白笼自组装发生，随后离心纯化，即得到自组装的仿病毒蛋白笼颗粒，
其中，所述步骤S3包括：
S31：向经过纯化的蛋白悬液，加入两倍体积的纳米气泡溶液，混合溶液先机械摇晃，然后置于恒温摇床上过夜，诱导衣壳蛋白自组装形成仿病毒蛋白笼，离心过滤以便对形成的仿病毒蛋白笼浓缩收集。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤S1进一步包括将所得体相纳米气泡溶液用0.45μm的过滤膜过滤后，备用。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤S1中制备的体相纳米气泡溶液的氧气过饱和率为110％-130％，纳米气泡在溶液中的浓度为107-108个/mL，纳米气泡的zeta电位为小于等于-15mV。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤S2中，所述组装缓冲液为pH为7.5的Tris缓冲液，所述寡聚体浓度为1～5mg/mL。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述寡聚体浓度为3mg/mL。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤S3中，在产物制备之后，进一步包括通过动态光散射、透射电子显微镜或原子力显微镜对产物进行表征。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤S2和S3中，所述寡聚体纯化及仿病毒蛋白笼颗粒自组装过程在4℃环境下进行。
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