WO2006100060A2 - Kolloidale nanokomposite aus lbl-partikeln, lipiden und biologischen komponenten sowie verfahren zur herstllung derselben - Google Patents

Kolloidale nanokomposite aus lbl-partikeln, lipiden und biologischen komponenten sowie verfahren zur herstllung derselben Download PDF

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WO2006100060A2
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particles
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virus
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Edwin Donath
Lars Töllner
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Capsulution Nanoscience Ag
Universität Leipzig
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Definitions

  • Colloidal nanocomposite particles, lipids and biological components for use in medicine and molecular biology and their preparation
  • the invention relates to colloidal nanocomposite particles consisting of particles, lipids and biological components intended for use in medicine and molecular biology.
  • Such particles are used, for example, for uptake into biological cells, for vaccination, for the cellular reproduction / multiplication of surface constituents of these templates in the cells and / or for the modification of the surface of named templates by material products of cells, tissues and biological fluids for monitoring and Diagnostics, used.
  • the layer-by-layer technology is used.
  • Colloids can be coated with the layer-by-layer process, or LbL technology for short, and subsequently produced by means of core dissolution capsules 1 ' 2 .
  • a coating material a wide variety of polyelectrolyte or macroionic substances are available. These include biological macromolecules, such as nucleic acids, peptides, proteins, carbohydrates, glycoproteins, lipid layers 3 ' 4 . This allows genetic material to be applied to colloids 5 . Enzymes, receptors, recognition elements, and many other biological functionalities can be used to biologically functionalize the multilayers on colloids and capsules. In principle, it is possible to integrate several functions into the multilayers by using different materials for different layers 6 .
  • a major drawback is also that significant amounts of substance are needed because the adsorbing component must be offered in bulk in large excess to prevent aggregation and deposit a layer. However, for very many applications, a few biomolecules would be sufficient at the particle or capsule surface.
  • WO 2004/047977 discloses a method for modifying coated template particles which are provided as microparticles.
  • the cores or capsules are gradually coated with polyelectrolytes having different charges.
  • Such particles are coated with components of biogenic or biotechnological origin.
  • the particles modified in this way have the disadvantage that the applied components are not necessarily in their natural molecular environment, so that their actual function is not or only to a limited extent.
  • EP 1 064 087 mentions the formation of lipid layers on polyelectrolyte shells of capsules for changing the permeability of the polyelectrolyte sheath.
  • the object of the invention is to construct colloidal nanocomposite particles or microparticles for use in medicine and molecular biology, in which the function of the biomolecules is not restricted by the connection with the nanocomposite particle.
  • Nanokompositp Microparticles and a method for their preparation will be presented.
  • colloidal nanocomposite particles or microparticles have a core or a capsule with a shell or shell layer of polyelectrolytes and / or nanoparticles applied thereto on the layer-by-layer technology and a lipid layer located thereon.
  • the lipid layer contains viruses, virosomes or virus-like particles as integrative components.
  • the microparticles or nanocomposite particles may have a core of colloidal size which is completely surrounded by a cladding layer which has a plurality of layers of alternatingly charged polyelectrolytes and / or alternately charged nanoparticles and has been built up on the core.
  • a bi- or multilamellar lipid layer is applied, which completely surrounds the cladding layer and in which viruses, virosomes or virus-like particles are integrated or fused with it.
  • the microparticles generally have a three-component particle shell, namely the coating layer of polyelectrolytes and / or nanoparticles, a lipid layer surrounding the coating layer and virus components integrated into the lipid layer.
  • microcapsules have a cavity on, which is surrounded by a cladding layer, wherein the cladding layer comprises a plurality of layers of alternately charged polyelectrolytes and / or alternately charged nanoparticles.
  • the cladding layer is surrounded by a bi- or multilamellar lipid layer into which viruses, virosomes or virus-like particles are integrated into or merged with the lipid layer.
  • the microcapsules can be made from the microparticles by dissolving the core. The core can be dissolved after completion of the coating layer or only after integration of the virus components.
  • composite templates of colloidal size for uptake into biological cells, for cellular reproduction / multiplication of surface constituents of these templates in the cells and / or - for the modification of the surface named template by the material products of these in cell-triggered cell activities, such as transcription, translation, virus synthesis, provided that the template by the layer-by-layer technology to core / shell particles (especially microparticles) were constructed, which consist of a core of colloidal size, one on this Core polyelectrolyte multilayer of a bi- or multi-lamellar lipid layer built up on this polyelectrolyte multilayer, and a functional viral and / or other genetic and / or protein function incorporated into or fused with this lipid layer, which acts on the cell uptake and as T emplat acts for the cell genome, ie acting on the genome, inducing protein synthesis or modifying genetic functions, the template / cell modified template (especially microparticles) as well as the material products produced by them in the cells, such
  • the core can be dissolved out after production of the coating layer or only at a later time, for example after application of the lipid layer.
  • templates are suitable, especially those that can be resolved without destroying the shell and lipid layer.
  • examples are inorganic templates such as silica particles and organic templates such as melamine formaldehyde particles.
  • the coupling between molecular biology and LbL technology is realized by the use of viruses, virus components and virus particles, which almost in terms of their genome and their associated on their surface biological function can be modifiable or constructed as desired by genetic engineering.
  • the biological process of virus membrane fusion is used, in which the viruses, virus components and virus particles are combined with the particle or capsule surface via a lipid layer.
  • This requires a compositionally suitable lipid layer as a substrate for virus fusion on a substrate consisting of a polyelectrolyte multilayer or a multilayer of polyelectrolytes and / or nanoparticles.
  • This lipid layer is modeled on the endosome or cell membrane, depending on the type of virus to be used, with additional consideration of the interaction with the polyelectrolyte multilayer carrier.
  • All viruses can be used as viruses which enter the cell via the mechanism of membrane fusion or are released from the endosome into the cytoplasm. These viruses have specific fusion proteins on their outer surface. These include z. B. Rötelvirus, influenza, HIV, VSV and nuclear polyhedrosis virus (baculovirus).
  • all lipid-enveloped viruses whose infection mechanism proceeds via receptor-mediated endocytosis and subsequent fusion with the endosomal membrane under acidic conditions can be used for fusion with the lipid layer.
  • the fusion takes place under very specific pH and solution conditions, which should be specifically defined for the respective virus in a manner known per se and in particular should correspond to its physiological optimum.
  • the composition of the lipid layer on the particles is crucial for the success and success of the fusion process.
  • the lipid layer is present in particular in the form of a double membrane, ie a double lipid layer, as is known from biological membranes. It is also possible to use multiple double lipid layers.
  • a double lipid layer a membrane is provided which is modeled on a natural cell membrane and with which the membrane of the viruses can easily fuse.
  • the lipid layer should be in a liquid phase. This can be done by appropriate choice of used lipids and in particular by using mixed lipids, ie a mixture of at least two different lipids can be achieved. When selecting the lipids, care should also be taken to ensure that they are even able to adsorb the virus so that membrane fusion can subsequently take place.
  • the core or template For the preparation of the microparticles is initially assumed by a core or template in a suitable size.
  • the core or template is subsequently encased in a multilayer of polyelectrolytes and / or nanoparticles, i.
  • the resulting coating layer has several layers. Possibly.
  • further components for example fluorescence markers, can be incorporated into the cladding layer or are coupled to polyelectrolytes.
  • particles coated with polyelectrolytes or nanoparticles are formed, which are also referred to as LbL particles or LbL particles (LbL layer-by-layer) in order to illustrate the multi-layered nature of the cladding layer.
  • polyelectrolytes or nanoparticles are applied alternately, which adsorb by electrostatic interaction to the already deposited polyelectrolytes or nanoparticles and thereby reload the surface.
  • the polyelectrolyte multilayer serves as a carrier for the lipid layer and on the other hand it constitutes a buffer layer between the lipid layer and the solid core, so that the lipid layer has a certain distance from the surface of the solid core. This ensures that viral proteins and other membrane components can be incorporated into the lipid layer without being hindered by the solid support.
  • proteins that partially protrude beyond the lipid layer / membrane would thus interact with the solid support (e.g., via van der Waalshe or electrostatic forces) and therefore could not be properly incorporated or their native function obstructed.
  • the polyelectrolytes do not hinder the incorporation of membrane-derived proteins or only very little.
  • the lipid layer is then applied to the LbL particles, for example by means of vesicles. This results in lipid-coated LbL particles, with the membrane of which subsequently fuses the viral membrane and thereby the viral Membrane proteins are incorporated into the membrane of LbL particles with natural orientation. This creates the microparticles.
  • the template or cores may be solid, for example, colloidal silica particles, or even be liquid, for example, dispersed in aqueous medium, poorly water-soluble droplets, such as oils or pharmaceutical agents.
  • microparticles or templates can be used for different purposes. For example, they can be called
  • Vehicle for intracellular uptake colloidal display systems with one or more colocalized genetic components and / or with one or more co-localized protein or peptide functions, genetic vector or
  • Modifiers of cell metabolism e.g. Interactions with the cellular RNA components
  • biochips two-dimensional arrays
  • bioarrays or in microfluidic devices as a bead Array for flow cytometry, in human, plant, animal and bacterial cells as well as in fungal cells for the production of novel genetic combinations by co-
  • microparticles and templates can be used in particular in connection with baculoviruses or genetically modified baculoviruses and other members of the class of lipid-enveloped viruses, as well as with virus hybrids generated by pseudotyping.
  • Silica particles coated with PAH / PSS (5 layers), PAH / PSS + PC / PS, PAH / PSS + PC / PS + rubella-like particles, PAH / PSS + PC / PS + baculovirus, PAH / PSS + PC / PS + baculoviruses. Clockwise order starting at A.
  • FIG. 2 Flow cytometric data of immunofluorescence of silica particles with PAH / PSS + PC / PS + baculoviruses showing the following epitopes of the viral surface: b: wild type gp64 (2), c: Frg # 10 of HIV-1 gp120 (fluorescence microscopy
  • Controls (b: PAH / PSS + PS / PC; c: PAH / PSS + PS / PC + baculovirus (wild type))
  • FIG. 3 Flow cytometric measurements of 3 ⁇ m silica particles with
  • FIG. 4 Replication of baculoviruses in SF9 cells.
  • the genome contains a gfp (Green Fluorescence Protein) expression cassette as a marker for a viral
  • 2A, 3A - Supernatant controls to rule out contamination of supernatants with free viruses responsible for the infection.
  • FIG. 5 shows immunofluorescence on influenza A PR8-fused lipid-coated LbL colloids.
  • FIG. 6 shows a bead array (field).
  • FIG. 7 shows the titration of the array from FIG. 6.
  • Figure 8 illustrates the durability of the bead array.
  • FIG. 9 shows a 3 ⁇ m colloid (five polyelectrolyte layers (PAH / PSS)) coated with vesicles of pure PS.
  • Figure 10 shows results of a bleaching experiment.
  • Figure 11 shows a Z-direction scan of a 20 ⁇ m LbL colloid coated with vesicles of pure PC (1% PE-Rhodamine was used as the fluorescence probe).
  • FIG. 12 shows the kinetics of the fusion of influenza A RP8 viruses with lipid-coated LbL colloids measured in a flow cytometer.
  • FIG. 13 shows results of bleaching experiments with labeled viruses using lipid-coated LbL colloids were fused according to the above procedure.
  • FIG. 14 shows the basic structure of microparticles and corresponding transmission electron micrographs.
  • Figure 1 shows in several steps the basic structure of a microparticle (LbL colloid), which has been equipped via the virus fusion with baculoviruses. Clockwise starting at 10 o'clock, a sequence of transmission electron micrographs of sections of a silica particle with the diameter of 500 nm can be seen:
  • Rubella-like particles were fused with the lipid layer. These are to be identified as small surveys. Rubella-like particles are understood to mean red cell virus envelopes obtained from cell cultures of genetically engineered cells, which contain all components of the virus besides the genome of the virus.
  • Baculoviruses are rod-shaped relatively large viruses that play a major role in virology and molecular biology as "tools.” They can be propagated in insect cell cultures.
  • Section a shows a silica particle coated with a polyelectrolyte shell 12.
  • the lipid membrane 14 can be seen on the LBL particle.
  • Rubella-like particles 16 are fused in section c with the lipid membrane 14.
  • e baculoviruses 18 fused with the lipid membrane 14 can be seen.
  • FIG. 2 shows that the viral epitopes on the microparticles (colloids) are immunologically accessible and can be qualitatively detected by fluorescence microscopy and quantitatively by flow cytometry. Flow cytometry quantifies the intensity and distribution of immunofluorescence.
  • a Baculowild surface protein, gp64 (baculovirus membrane fusion protein) and an HIV-1 gp120 epitope engineered therefrom were prepared by immunofluorescence with appropriate primary antibodies, as well as FITC-labeled secondary anti-mouse conjugates.
  • the HIV epitope was selected by screening from a baculobib library (Baculolibrary) representing fragments of HIV-1 gp120 in the surface display.
  • the specific detection of the epitopes on the microparticles is shown in Fig. 2.
  • the maximums of the fluorescence distribution curves are increased by an order of magnitude compared to the background fluorescence (Curves 2).
  • the confocal image indicates the discrete distribution of epitopes, which can be explained by the location of the baculoviruses on the colloid composite.
  • FSC-H forward scatter
  • FITC green channel FL1-H
  • Part b shows the specific binding of an antibody to gp64 (B12D5), the membrane fusion protein of baculovirus (curve 2: PAH / PSS + PS / PC + baculovirus (wild-type), curve 1: PAH / PSS + PS / PC as control).
  • Figure c shows the specific binding of an antibody (ARP360) to HIV-1 gp120, a coat protein of HIV-1, colloids with baculoviruses containing the antibody-binding fragment (Frg # 10) of HIV-1 gp120 as a genetically engineered fusion protein on gp64 , the membrane fusion protein of baculovirus, on their surface.
  • Microparticles show that it is possible in this way a
  • the surface of the microparticles colocalized contains both the functional peptide, in this case an antibody-binding epitope of HIV-1 gp120 HIV gp120, as well as the associated genome inside the particles-established viruses.
  • the functional peptide in this case an antibody-binding epitope of HIV-1 gp120 HIV gp120
  • the associated genome inside the particles-established viruses for the first time, it has succeeded in establishing a display system on colloidal particles. With the multifunctionality and the easy handling of the microparticles there are completely new possibilities of use in molecular biology and medicine.
  • the antibody-binding HIV-1 gp120 fragment was prepared by binding the anti-HIV-gp120 antibody ARP360 to the presented epitope on infected SF9 cells from a library of 50 overlapping HIV PCR fragments so incorporated into the viral genome in that they are presented on the fusion protein of Baculo, selected by means of FACS, cloned and duplicated.
  • any desired peptide in the display system can thus be selected on the basis of the function and is then available for the amplification of the selected viral clone in its host cells by equipping the particle surface via the viruses. In this way, it is easy to prepare large particle libraries which can be used combinatorially 9 '10 .
  • the advantage of using the viruses, virus components and virus particles is precisely that there is no loss of functionality. If one were to bind the peptides themselves to the particles, it would lead to fundamental difficulties, as has already been explained above.
  • Streptag is a molecular peptide-based mimicry of biotin and is easily detected by the binding of fluorescently labeled streptavidin. It represents a universal docking port for streptaviding coupled functions, thus providing the starting point for further, now ligand-controlled, particle surface engineering.
  • the mixture FIG. 3, the mixture (FIG.
  • FITC channel FL1-H green channel
  • FL3-H red fluorescence channel
  • viruses that have been deposited on the surface of the colloidal microparticles via fusion to the lipid layer, which in turn is adsorbed on a polyelectrolyte multilayer, have their biological function in terms of specific uptake into cells and even subsequent propagation in them Cells obtained after release into the cytoplasm, provided that the composition of the layer structure is designed appropriately.
  • FIG. 4 shows this extremely remarkable and unexpected result.
  • baculoviruses were fused on the silica particles (lipid-coated LBL silica particles) having a gfp expression cassette as a marker in the genome, fused on the surface of LBL particles coated with lipid (PS / PC) and with baculoviruses, SF9.
  • the gfp plasmid is replicated together with the entire genome, and the synthesis of the viral building blocks in the cells up to the release of the viruses is then observable. On the basis of the green fluorescence, the process can be easily detected.
  • FIG. 1 silica particles having a gfp expression cassette as a marker in the genome
  • the reason for the retardation is the necessary detachment of the virus particles, the defoliation of the particles, possibly also the degradation of the layers by cellular processes. It is conceivable to combine different types of viruses on the particles. In this way, new viruses could be efficiently and quickly created, which in turn could be used as optimized carriers.
  • Silica particles with a size of 3 ⁇ m in diameter are washed several times in Aqua Bidest.
  • Poly (allylamine hydrochloride) (PAH) and poly (styrenesulfonate Na-salt) (PSS) of average molecular weight, approximately 70,000, are dissolved in a concentration of 1 mg / ml in 0.5 M NaCl.
  • the silica particles are adsorbed for 20 minutes at room temperature starting with the PAH solution. The particle concentration is 3%.
  • By centrifuging three times in 0.1 M NaCl is removed in the supernatant PAH before adsorbing PSS analog. The procedure is repeated until a total of 5 layers have been applied, with the last layer being PAH.
  • 75% phosphatidylserine and 25% phosphatidylcholine are taken up in chloroform at 20 mg / ml, deposited on the walls of the vessel in a rotary evaporator and then taken up in 0.1 M NaCl by hydration.
  • This solution is extruded cyclically at 30 ° C. in the extruder at a pore width of 50 nm until a clear solution of unilamellar small vesicles has been formed.
  • 1 ml vesicle solution of the lipid concentration of 6 mg / ml is added and incubated in the thermomixer at 37 ° C for 30 min.
  • SF9 cells from Spodoptera frugiperda are kept in an EPL-41 medium from Sigma.
  • colloidal nanocomposites consisting of LBL particles, lipids and influenza viruses type A / Singapore (H2N2) or A / PR8 (H1 N1).
  • Silica particles with a size of 3 ⁇ m in diameter are washed several times in Aqua Bidest.
  • Poly (allylamine hydrochloride) (PAH) and poly (styrenesulfonate Na-SaIz) (PSS) of average molecular weight, approximately 70,000, are dissolved in a concentration of 1 mg / ml in 0.5 M NaCl.
  • the silica particles are adsorbed for 20 minutes at room temperature starting with the PAH solution. The particle concentration is 5%.
  • PAH poly (styrenesulfonate Na-SaIz)
  • L-.alpha.-phosphatidylserine and 25% L-.alpha.-phosphatidylcholine are taken up in chloroform at 20 mg / ml, deposited on the walls of the vessel in a rotary evaporator and then taken up in 0.1 M NaCl by hydration.
  • This solution is extruded cyclically at 30 ° C. in the extruder at a pore width of 50 nm until a clear solution of unilamellar small vesicles has been formed.
  • the virus concentration is adjusted so that 1 .mu.l of particle solution 0.75 ug virus protein is added.
  • colloidal nanocomposites consisting of LBL particles, lipids applied thereto, and fused but inactivated influenza viruses of types A / Singapore (H2N2) or A / PR8 (H1 N1).
  • H2N2N2N2N2N2N2N2 or A / PR8 H1 N1
  • the presence of these viruses is confocal detected by immunofluorescence measurements with polyclonal rabbit antisera and secondary FITC-labeled anti-rabbit antibodies.
  • the result (on the example of influenza PR8) is shown in FIG.
  • FIG. 5 shows immunofluorescence on influenza PR8-fused lipid-coated LbL particles (microparticles).
  • the microparticles (colloids) were incubated with a polyclonal serum against influenza PR8 and subsequently with a secondary fluorescent labeled antibody as described in the text and washed.
  • the picture taken by means of a confocal laser scanning microscope, shows two colloids in the transmission image (left), one coated with influenza A (left), the other without viral coating (right). In the right picture (fluorescence, green channel) it can be clearly seen that only the sphere coated with influenza A was stained by the antibodies.
  • microparticles consisting of LBL particles, lipids and either influenza virus type A / Singapore (H2N2) or A / PR8 (H1N1), or Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (NPV or baculovirus ) of wild-type or nuclear polyhedrosis viruses containing a 17aa epitope of the HIV-1 gp 120 protein on an additional copy of the gp 64 envelope protein.
  • 17aa means that the epitope consists of 17 amino acids to which the antibody binds.
  • polyelectrolyte layers are assembled before the application of the lipid layer.
  • polyelectrolyte layers contain one (in the case of the Baculovirus with engineered HIV-1 gp120 epitope), two (in the case of influenza A PR8), four (in the case of NPV wild type), or seven layers (in the case of influenza A Singapore) from rhodamine-labeled PAH.
  • the flow cytometer analyzes 10 3 particles in 300 ⁇ l PBS.
  • the specific detection of the respective antibodies shown in FIG. 6 is obtained.
  • this suspension-based array can also be used for quantitative measurements of the antibody concentration in the sample.
  • FIG. 6 shows a bead array (field): various viruses were assembled on four colloidal populations of different color (see text above) and incubated with different antibody conjugates and measured in the flow cytometer.
  • ARP 360 anti HIV gp120 antibody
  • B12D5 anti gp64
  • anti PR8 anti PR8
  • polyclonal serum polyclonal serum
  • anti-Sg polyclonal serum
  • red channel rhodamine
  • FITC green channel
  • the four partial figures 6a to 6d show the specific binding of the antibodies to the respective viral surfaces, (a: only population 4 (baculovirus with HIV fragment), b: population 2 and 4 (baculoviruses), c and d: by the use of polyclonal Sera show a signal to both influenza A subtypes, but this is much stronger against the viral surface of each virus and allows them to differentiate between the two different influenza subtypes
  • 1 refers to influenza A Singapore (H2N2)
  • FIG. 7 shows the titration of the array: Y axis: geometric mean of the fluorescence intensity (green channel); X-axis: Dilution factor of the added primary antibody.
  • Y axis geometric mean of the fluorescence intensity (green channel);
  • X-axis Dilution factor of the added primary antibody.
  • Antibody concentrations over a relatively wide range with a sensitivity equivalent to that of ELISA assays are measured simultaneously in a sample over several epitopes.
  • the suspension-based array can be stored for several weeks at 4 ° C. Over this period, only a small loss of activity, as shown in Figure 8 by the example of the detection of anti-PR8 antibodies as a function of storage occurs.
  • No10 stands for LbL particles coated with baculoviruses with engineered HIV-1 gp120 fragment, PR8 for influenza A (H1 N1), NPV for wild-type baculoviruses and Sg for influenza A Singapore (H2N2).
  • Figure 8 illustrates the durability of the bead array: The stored at 4 ° C in the refrigerator array was examined by incubation with polyclonal serum against influenza PR8 for durability. Even after 5 weeks of storage, it can be seen that the characteristics of the signal obtained are still broadly similar to those of the freshly prepared array. Despite a small decrease in the signal, the large signal-to-noise ratio is maintained.
  • No10 stands for LbL particles coated with baculoviruses with HIV-1 gp120 fragment, PR8 for influenza A (H1 N1), NPV for wild-type baculoviruses and Sg for influenza A Singapore (H2N2).
  • geoMFI means the geometric mean of the fluorescence intensity (geometric mean fluorescence intensity).
  • Preparation of a lipid layer on an LBL particle suitable for fusion with influenza A viruses, rubella-like particles and viral pseudotypes (chimeras) consisting of the capsid protein of Simian Virus 40 and the membrane protein of Vesicular Stomatitis Virus (hereinafter SIV / VSV-G) has suitable properties.
  • the virus In order for the virus fusion to proceed successfully, a) the virus must be adsorbed to the applied lipid layer and b) the fusion process must be able to proceed thereafter.
  • the lipid layer has very specific properties. It is therefore preferred for the viruses mentioned that acid-reacting lipids are present in sufficient concentration.
  • PS phosphatidylserine
  • this substance and a few other acidic lipids allow the adsorption of the viruses mentioned in sufficient quantity. It is furthermore advantageous if the lipid layer is present at least in the form of a so-called double membrane, which is continuous.
  • the liposomes used for the application of the lipid layer also spread after their adsorption onto the polyelectrolyte shell (for example LBL particles) and the individual lipid layers of the individual liposomes can connect to one another.
  • the lipid layer should in particular be mobile, i. H. it must be in a liquid phase and the interaction with the LBL pad should not be too great. If one uses z. B. pure PS, although one obtains a strong adsorption but not sufficient spreading, as shown in Figure 9 can be seen.
  • FIG. 9 shows a TEM image (transmission electron microscope) of a 3 ⁇ m-sized colloid (five polyelectrolyte layers (PAH / PSS)) coated with vesicles of pure PS.
  • the PS liposomes are not capable of on the colloidal surface to spread.
  • Figure 10 shows results of a bleaching experiment: the recovery of fluorescence (by diffusion of a lipid layer incorporated fluorescent lipid into the laser-bleached area) can be tracked over time. As a control serves a point opposite the bleaching point.
  • the viral proteins that have been incorporated into the membrane by fusion can not move, they are anchored by interactions with the LBL pad. This ensures the stability of the system. If the mobility of the lipids is too low (this is the case, for example, if the PS concentration falls below the ratio 1: 3), on the one hand adsorption and fusion of the viruses are impaired or prevented, and on the other hand a homogeneous membrane can no longer form because the individual membranes of the vesicles can not sufficiently interconnect. This is shown in FIG. One recognizes areas in which the lipid coating of the particles is insufficient, or is absent. At these points can then z. B. bind the antibodies nonspecifically. These particles would also be ill-suited for diagnostic and other purposes.
  • the fluidity and homogeneity of the lipid layer is the prerequisite for the LBL pad to be completely covered. This is necessary to prevent unwanted accumulation of molecules from the environment avoid. This is to be expected with biological molecules, since they would interact as polyelectrolytes with the strongly charged substrates.
  • the lipid layer also has a significant protective effect in this sense.
  • FIG. 11 shows a Z-direction scan of a 20 .mu.m LbL particle (LbL colloid) coated with vesicles of pure PC (1% PE-rhodamine was used as fluorescence probe).
  • FIG. 11 shows large inhomogeneities in the lipid coating and also the absence thereof in some areas.
  • the fusion of virions with lipid-coated LbL particles can be demonstrated by incorporation of fluorescent lipids into the membrane of the virion.
  • a fluorescent lipid probe octadecyl-rhodamine B; R18
  • the viral particle shows only weak red fluorescence the fluorescence of the label is quenched.
  • FIG. 12 shows the kinetics of the fusion of influenza A viruses with lipid-coated LbL particles, measured in a flow cytometer.
  • Triangle 5 represents the geometric mean fluorescence of lipid-coated LbL particles (colloids). These lipid-coated LbL particles were incubated with R18-stained influenza A viruses at neutral pH for 10 minutes, washed once in PBS and remeasured (Triangle 6). The increase in fluorescence indicates the adherence of the viruses to the colloids. By incubation in acid buffer (citrate / phosphate pH4.5), the fusion of the viruses with the membrane of the LbL particles is induced, as can be recognized by the steep rise of curve 1.
  • Curve 2 is a comparison measurement with viruses labeled at the amino groups of the viral coat proteins, in which the rhodamine dye used was covalently attached to the amino groups (-NH2) of the viral proteins and is not quenched.
  • Bleaching experiments on virus-fused colloids may also demonstrate fusion.
  • the R18 originally derived from the viruses, can laterally move in the lipid layer, as can be seen from FIG. Due to the very small diameter of the viruses (about 50nm), this can only happen if a fusion of the membrane of the virus with the membrane of the LbL particle has occurred.
  • the same experiments were performed with viruses covalently labeled on the amino groups of the viral coat proteins. The viral envelope proteins are unable to move laterally in the membrane.
  • Figure 13 shows results of bleaching experiments with labeled viruses fused to lipid-coated LbL particles according to the above procedure.
  • influenza A viruses were used, which were covalently stained with rhodamine dye on the viral proteins. There is no diffusion of dye molecules in the membrane detectable.
  • the right panel shows the lateral mobility of the R18 label, which was originally inserted into the viral membrane. This can only be explained by fusion of the viral membrane with the membrane of the LbL particle.

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Abstract

Es werden Mikropartikel vorgeschlagen, die einen Kern von kolloidaler Größe, eine den Kern umgebende Hüllschicht, die mehrere Schichten alternierend geladener Polyelektrolyte und/oder alternierend geladener Nanopartikel aufweist, eine die Hüllschicht umgebende bi- oder multilamellare Lipidschicht, und Viren, Virosomen oder virenähnliche Partikel, welche in die Lipidschicht integriert oder mit dieser verschmolzen sind, aufweisen.

Description

Beschreibung
Kolloidale Nanokomposite aus LBL-Partikeln, Lipiden und biologischen Komponenten sowie Verfahren zur Herstellung derselben
Kolloidale Nanokompositpartikel aus Partikeln, Lipiden und biologischen Komponenten zur Verwendung in Medizin und Molekularbiologie und deren Herstellung
Die Erfindung betrifft kolloidale Nanokompositpartikel, die aus Partikeln, Lipiden und biologischen Komponenten bestehen und zur Verwendung in Medizin und Molekularbiologie vorgesehen sind. Derartige Partikel werden beispielsweise für die Aufnahme in biologische Zellen, für Vakzinierung, für die zelluläre Reproduktion/Multiplikation von Oberflächenbestandteilen dieser Template in den Zellen und/oder für die Modifikation der Oberfläche benannter Template durch stoffliche Produkte von Zellen, Geweben und biologischen Fluiden für Monitoring und Diagnostik, eingesetzt. Zur Herstellung derartiger Partikel wird die Layer-by-Layer- Technologie eingesetzt.
Mit der Layer-by-Layer-Verfahren, kurz LbL-Technologie, können Kolloide beschichtet werden und nachfolgend durch Kernauflösung Kapseln hergestellt werden1'2. Als Beschichtungsmaterial steht eine große Vielfalt von Substanzen mit Polyelektrolyt- oder Makroionencharakter zur Verfügung. Darunter finden sich biologische Makromoleküle, wie Nukleinsäuren, Peptide, Proteine, Kohlehydrate, Glykoproteine, Lipidschichten3'4. Damit kann genetisches Material auf Kolloide aufgebracht werden5. Enzyme, Rezeptoren, Erkennungselemente, und viele andere biologische Funktionalitäten können verwendet werden, um die Multischichten auf Kolloiden und Kapseln biologisch zu funktionalisieren. Prinzipiell ist es möglich mehrere Funktionen in die Multischichten zu integrieren, indem man für verschiedene Schichten unterschiedliche Materialien verwendet6.
Dieses Verfahren , so vielseitig es sich auch darstellt, ist allein jedoch nicht geeignet, komplexe biologische Funktionen, auch mehrere Funktionen auf Kolloide und Kapseln aufzubringen. Es ist nicht möglich, beliebige Funktionen durch Beschichtung zu etablieren, weil die naturgemäß starke Wechselwirkung, die Voraussetzung für den Schichtaufbau mit Adsorption ist, dazu führt, dass die Funktion der Biomoleküle nicht oder nur eingeschränkt erhalten bleibt, da deren räumliche Struktur durch die Wechselwirkung mit den Schichten nachhaltig gestört wird. Die „richtige" Topologie der Biopolymere ist jedoch zwingend notwendig für deren Funktion. Somit lassen sich in der Regel nur vergleichsweise einfache Nanokompositteilchen mit diesem Verfahren herstellen, die im wesentlichen Nettopositiv- oder Nettonegativgeladene Biomakromoleküle als Schichtmaterial enthalten. Viele Proteine lassen z. B. keinen Schichtaufbau zu, weil sie unter pH-Bedingungen, die für ihre Funktion essentiell sind, neutral sind. Es ist schwer möglich, mehr als eine biologische Funktion in der obersten Schicht einzubauen, weil beim Anbieten von verschieden stark adsorbierenden Polyelektrolyten Konkurrenzprozesse die Ausbildung einer Schicht im gewünschten Mischungsverhältnis der Komponenten verhindert.
Ein großer Nachteil ist weiterhin, dass erhebliche Substanzmengen benötigt werden, weil die adsorbierende Komponente im Volumen in großem Überschuss angeboten werden muss, um Aggregation zu verhindern und eine Schicht zu deponieren. Für sehr viele Anwendungen wären jedoch einige wenige Biomoleküle an der Teilchen- oder Kapseloberfläche ausreichend.
Aus der WO 2004/047977 ist eine Methode zur Modifizierung beschichteter Templatpartikel bekannt, die als Mikropartikeln bereitgestellt werden. Hierbei werden die Kerne bzw. Kapseln schrittweise mit Polyelektrolyten beschichtet, die unterschiedliche Ladungen aufweisen. Derartige Partikel werden mit Komponenten biogener oder biotechnologischer Herkunft beschichtet. Die derart modifizierten Partikel haben den Nachteil, dass die aufgebrachten Komponenten sich nicht notwendigerweise in ihrer natürlichen molekularen Umgebung befinden, damit ihre eigentliche Funktion nicht oder nur eingeschränkt gegeben ist. Mit der in der WO 2004/047977 beschriebenen Methode ist es zudem nicht möglich, solche biologischen oder biotechnologischen Komponenten auf Kerne und Kapseln aufzubringen, die nur in einer Lipidmembran in der entsprechenden Ausrichtung ihre Funktion aufrechterhalten. Dazu gehören die Mehrzahl aller Transport-, Erkennungs- und energiekonvertierenden Proteine.
EP 1 064 087 erwähnt die Bildung von Lipidschichten auf Polyelektrolythüllen von Kapseln zur Veränderung der Permeabilität der Polyelektrolythülle.
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, kolloidale Nanokompositpartikel bzw. Mikropartikel zur Verwendung in Medizin und Molekularbiologie aufzubauen, bei denen die Funktion der Biomoleküle nicht durch die Verbindung mit dem Nanokompositpartikel eingeschränkt wird. Insbesondere soll es auch möglich sein, membrangebundene biologische Funktionen und auch mehr als eine biologische Funktion einzubauen. Neben der Beschreibung solcher Nanokompositpartikel bzw. Mikropartikel soll auch ein Verfahren zu deren Herstellung dargestellt werden.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung weisen kolloidale Nanokompositpartikel bzw. Mikropartikel einen Kern oder eine Kapsel mit einer nach dem Layer-by-Layer- Technologie darauf aufgebrachten Hülle oder Hüllschicht aus Polyelektrolyten und/oder Nanopartikeln sowie einer darauf befindlichen Lipidschicht auf. Erfindungsgemäß enthält die Lipidschicht Viren, Virosomen oder virenähnliche Partikel als integrative Bestandteile. Durch die Kombination der modernen Molekularbiologie mit der LbL-Technologie eröffnen sich völlig neue Möglichkeiten.
Die Mikropartikel bzw. Nanokompositpartikel können einen Kern von kolloidaler Größe aufweisen, der von einer Hüllschicht vollständig umgeben ist, die mehrere Schichten alternierend geladener Polyelektrolyte und/oder alternierend geladener Nanopartikel aufweist und auf dem Kern aufgebaut wurde. Auf die Hüllschicht ist eine bi- oder multilamellare Lipidschicht aufgebracht, welche die Hüllschicht vollständig umgibt und in welche Viren, Virosomen oder virenähnliche Partikel integriert oder mit dieser verschmolzen sind. Die Mikropartikel weisen demnach allgemein eine dreikomponentige Partikelhülle auf und zwar die Hüllschicht aus Polyelektrolyten und/oder Nanopartikel, eine die Hüllschicht umgebende Lipidschicht und in die Lipidschicht integrierte Virusbestandteile.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung weisen Mikrokapseln einen Hohlraum auf, der von einer Hüllschicht umgeben ist, wobei die Hüllschicht mehrere Schichten alternierend geladener Polyelektrolyte und/oder alternierend geladener Nanopartikel aufweist. Die Hüllschicht ist von einer bi- oder multilamellare Lipidschicht umgeben, in welche Viren, Virosomen oder virenähnliche Partikel in die Lipidschicht integriert oder mit dieser verschmolzen sind. Die Mikrokapseln können beispielsweise aus den Mikropartikeln durch Auflösen des Kerns hergestellt werden. Der Kern kann bereits nach Fertigstellung der Hüllschicht oder erst nach Integration der Virusbestandteile aufgelöst werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung werden zusammengesetzte Template kolloidaler Größe für die Aufnahme in biologische Zellen, für die zellulare Reproduktion/Multiplikation von Oberflächenbestandteilen dieser Template in den Zellen und/oder - für die Modifikation der Oberfläche benannter Template durch die stofflichen Produkte der von diesen in den Zellen ausgelösten Zellaktivitäten, wie z.B. Transkription, Translation, Virussynthese, bereitgestellt, wobei die Template durch die Layer-by-Layer Technologie zu Kern/Schale Partikeln (insbesondere Mikropartikel) aufgebaut wurden, die bestehen aus einem Kern von kolloidaler Größe, einer auf diesen Kern aufgebauten Polyelektrolytmultischicht einer auf diese Polyelektrolytmultischicht aufgebauten bi- oder multi- lamellaren Lipidschicht, und - einer in diese Lipidschicht eingebaute oder mit ihr fusionierte funktionsfähige virale und/oder andere genetische und/oder Protein- Funktion, die auf die Zellaufnahme einwirkt und als Templat für das Zellgenom fungiert, d.h. auf das Genom einwirkt, Proteinsynthese induziert oder genetische Funktionen modifiziert, wobei die Template/ zellular modifizierten Template (insbesondere Mikropartikel) sowie die durch sie in den Zellen verursachten stofflichen Produkte, wie Proteine, Viren, gewonnen und weiteren Anwendungen zugeführt werden können. Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung lassen sich Mikropartikeln und/oder Mikrokapseln mit folgenden Schritten herstellen: Bereitstellen eines Kerns kolloidaler Größe;
Aufbringen einer Hüllschicht auf den Kern durch Aufbringen mehrerer alternierend geladener Schichten aus Polyelektrolyten und/oder
Nanopartikeln;
Aufbringen einer bi- oder multilamellaren Lipidschicht auf die Hüllschicht; und Integrieren oder Verschmelzen von Viren, Virosomen oder virenähnlichen Partikel mit der Lipidschicht durch Membranfusion der Viren, Virosomen oder virenähnlichen Partikel mit der Lipidschicht.
Zur Fertigstellung von Mikrokapseln kann der Kern nach Herstellung der Hüllschicht oder erst zu einem späteren Zeitpunkt, beispielsweise nach Aufbringen der Lipidschicht, herausgelöst werden.
Als Kern eignen sich verschiedene Template, insbesondere solche, die sich ohne Zerstörung der Hüll- und Lipidschicht auflösen lassen. Beispiele sind anorganische Template wie Silicapartikel und organische Template wie Melaminformaldehydpartikel.
Weitere Einzelheiten zur Bildung der Hüllschicht aus Polyelektrolyten sowie zum Herauslösen des Kerns können der EP 1 064 087 entnommen werden, deren Offenbarungsgehalt hiermit vollständig aufgenommen wird.
Eine große Vielfalt von biologischen Funktionen steht damit zur Verfügung, um Kolloide und Kapseln als Bionanokomposite herzustellen. Das erschließt prinzipiell neue, insbesondere medizinische, diagnostische, molekularbiologische, biotechnologische Anwendungsfelder für LbL Kolloide und Kapseln, die mit der bisherigen Technologie nicht zugänglich sind.
Die Kopplung zwischen Molekularbiologie und LbL-Technologie realisiert sich durch die Nutzung von Viren, Virenkomponenten und Virenpartikeln, die bezüglich ihres Genoms und ihrer an ihrer Oberfläche dazugehörigen biologischen Funktion nahezu beliebig durch genetisches Engineering modifizierbar bzw. aufbaubar sind. Damit die gewünschten Funktionen der Viren, Virenkomponenten und Virenpartikeln erhalten bleiben, wird der biologische Vorgang der Virus-Membranfusion genutzt, bei dem die Viren, Virenkomponenten und Virenpartikel mit der Teilchen- bzw. Kapseloberfläche über eine Lipidschicht vereint werden. Das erfordert eine bezüglich ihrer Zusammensetzung geeignete Lipidschicht als Substrat für die Virusfusion auf einer Unterlage bestehend aus einer Polyelektrolytmultischicht oder einer Multischicht aus Polyelektrolyten und/oder Nanopartikeln. Diese Lipidschicht wird dem Endosom oder der Zellmembran nachempfunden, je nach Art des zu verwendenden Virus unter zusätzlicher Berücksichtigung der Wechselwirkung mit dem Polyelektrolytmultischichtträger. Als Viren können alle jene Verwendung finden, die über den Mechanismus der Membranfusion in die Zelle gelangen, bzw. aus dem Endosom in das Zytoplasma freigesetzt werden. Diese Viren besitzen spezielle Fusionsproteine an ihrer äußeren Oberfläche. Dazu gehören z. B. Rötelvirus, Influenza, HIV, VSV und Nuclear Polyhedrosis Virus (Baculovirus). Insbesondere alle lipidbehüllten Viren, deren Infektionsmechanismus über rezeptorvermittelte Endozytose und nachfolgender Verschmelzung mit derendosomalen Membran unter sauren Bedingungen verläuft, können zur Fusion mit der Lipidschicht verwendet werden. Die Fusion erfolgt unter ganz bestimmten pH - und Lösungsbedingungen, die für den jeweiligen Virus in an sich bekannter Weise spezifisch festzulegen sind und insbesondere seinem physiologischen Optimum entsprechen sollte. Die Zusammensetzung der Lipidschicht auf den Teilchen ist ganz entscheidend für das Ablaufen und Gelingen des Fusionsprozesses.
Die Lipidschicht liegt insbesondere in Form einer Doppelmembran vor, d.h. einer Doppellipidschicht, wie sie von biologischen Membranen bekannt ist. Es ist auch möglich, mehrere Doppellipidschichten zu verwenden. Durch Verwendung einer Doppellipidschicht wird eine Membran bereitgestellt, die einer natürlichen Zellmembran nachempfunden ist und mit welcher die Membran der Viren leicht verschmelzen kann. Um die Verschmelzung von Virenmembran und Lipidschicht der Mikropartikel bzw. Mikrokapseln zu erleichtern und insbesondere eine vollständige Integration der Virenmembran in die Lipidschicht zu erreichen, sollte die Lipidschicht in einer flüssigen Phase vorliegen. Dies kann durch geeignete Wahl der verwendeten Lipide und insbesondere durch Verwendung von Mischlipiden, d.h. einer Mischung aus mindestens zwei verschiedenen Lipiden, erreicht werden. Bei der Auswahl der Lipide sollte auch darauf geachtet werden, dass diese eine Adsorption der Viren überhaupt ermöglichen, damit nachfolgend die Membranfusion erfolgen kann.
Zur Herstellung der Mikropartikel wird zunächst von einem Kern oder Templat in geeigneter Größe ausgegangen. Der Kern bzw. das Templat wird nachfolgend mit einer Mehrfachschicht aus Polyelektrolyten und/oder Nanopartikeln umhüllt, d.h. die dabei entstehende Hüllschicht weist mehrere Schichten auf. Ggf. können in die Hüllschicht weitere Komponenten, beispielsweise Fluoreszenzmarker, eingebaut werden bzw. sind an Polyelektrolyte gekoppelt. Im Ergebnis entstehen mit Polyelektrolyten bzw. Nanopartikel beschichtete Partikel, die auch als LbL-Partikel bzw. LbL-Teilchen bezeichnet werden (LbL- Layer-by-Layer), um die Mehrlagigkeit der Hüllschicht zu verdeutlichen. Es werden dazu abwechselnd jeweils entgegengeladene Polyelektrolyte bzw. Nanopartikel aufgebracht, die durch elektrostatische Wechselwirkung an die bereits abgeschiedenen Polyelektrolyte bzw. Nanopartikel adsorbieren und die Oberfläche dabei umladen. Die Polyelektrolytmultischicht dient einerseits als Träger für die Lipidschicht und zum anderen stellt sie eine Pufferschicht zwischen der Lipidschicht und dem festen Kern dar, so dass die Lipidschicht einen gewissen Abstand zur Oberfläche des festen Kerns aufweist. Dadurch wird sichergestellt, dass sich in die Lipidschicht virale Proteine und andere Membranbestandteile einbauen können, ohne durch die feste Unterlage daran gehindert zu werden. Insbesondere Proteine, die teilweise über die Lipidschicht/Membran hinausragen würden so mit der festen Unterlage wechselwirken (z.B. über van der Waalssche oder elektrostatische Kräfte) und könnten daher nicht richtig eingebaut bzw. deren native Funktion könnte behindert werden. Die Polyelektrolyte behindern einen Einbau von membranstämmigen Proteinen dagegen nicht oder nur sehr wenig.
Auf die LbL-Partikel wird dann die Lipidschicht, beispielsweise mittels Vesikel, aufgebracht. Dadurch entstehen lipidbeschichtete LbL-Partikel, mit deren Membran nachfolgend die Virenmembran verschmilzt und dadurch die viralen Membranproteine in die Membran der LbL-Partikel mit natürlicher Orientierung eingebaut werden. Dadurch entstehen die Mikropartikel.
Durch Entfernen des Kerns bzw. des Templates entstehen Mikrokapseln. Die Template bzw. Kerne können fest sein, beispielsweise kolloidale Silicapartikel, oder auch flüssig sein, beispielsweise in wässriges Medium dispergierte, schwer wasserlösliche Tröpfchen, beispielsweise Öle oder pharmazeutische Wirkstoffe.
Die Mikropartikel bzw. Template können für verschiedene Zwecke eingesetzt werden. So können sie beispielsweise als
Vehikel für die intrazelluläre Aufnahme, kolloidale Displaysysteme mit einer oder mehreren kolokalisierten genetischen Komponenten und/oder mit einer oder mehreren co- lokalisierten Protein- oder Peptidfunktionen, genetischer Vektor oder
Modifikatoren des Zellstoffwechsels, wie z.B. Wechselwirkungen mit den zellulären RNA-Komponenten
verwendet werden. Außerdem können sie
für die Diagnostik, beispielsweise in Medizin und Biologie, für die Vaccinierung bei Mensch und Tier, zum Aufbau von kombinatorischen Bibliotheken für die Genomik und Proteomik, auf Biochips (zwei-dimensionale Arrays), Bioarrays oder in mikrofluidischen Vorrichtungen (microfluidic devices), als Bead Array für die Flowzytometrie, in menschlichen, pflanzlichen, tierischen und bakteriellen Zellen sowie in Pilzzellen zur Herstellung von neuartigen genetischen Kombinationen durch Co-
Beladung und Co-Synthese/Infektion von zwei oder mehreren viralen
Spezies, oder in diagnostischen Kits und diagnostischen Automaten
verwendet werden.
Die Mikropartikel und Template können insbesondere Im Zusammenhang mit Baculoviren oder gentechnisch veränderten Baculoviren und weiteren Vertreter der Klasse lipidumhüllter Viren, sowie auch mit durch Pseudotyping erzeugten Virenhybriden verwendet werden.
Die Erfindung soll nachfolgend anhand von in Figuren dargestellten Ausführungsbeispielen näher erläutert werden. Dabei zeigen:
Figur 1 Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen von 500 nm
Silicateilchen, die mit PAH/PSS (5 Schichten), PAH/PSS + PC/PS, PAH/PSS + PC/PS + Rubella-like-Partikel, PAH/PSS + PC/PS+Baculoviren, PAH/PSS + PC/PS+Baculoviren ausgerüstet worden sind. Reihenfolge im Uhrzeigersinn bei A beginnend.
Figur 2 Flowzytometrische Daten der Immunfluoreszenz von Silicapartikeln mit PAH/PSS+PC/PS+Baculoviren die folgende Epitope der viralen Oberfläche zeigen: b: Wildtyp gp64 (2), c: Frg#10 von HIV-1-gp120 (fluoreszenzmikroskopische
Aufnahme), c: Frg#10 von HIV-1-gp120 (2). a: Flowzytometrische Rohdaten R1 =
Einzelpartikel, R2 Aggregate. In die Auswertung werden nur Einzelpartikel einbezogen. Verteilungen 1 : Kontrollen (b: PAH/PSS+PS/PC; c: PAH/PSS+PS/PC+Baculovirus (Wildtyp))
Figur 3 Flowzytometrische Messungen von 3 μm großen Silicapartikeln mit
PAH/PSS + PC/PS+Baculoviren. a: Baculoviren mit streptag Epitop, c: Baculoviren mit antikörperbindendem HIV-gp41-Epitop, b: Mischung aus a und c. Zum Nachweis der Fluoreszenz wurde in A quantumred-markiertes Streptavidin verwendet. Das engineerte H IV-gp41 -Epitop wird mit dem monoklonalen, gegen dieses Epitop gerichteten Antikörper 3D6 und einem FITC-gelabelten sekundären antihuman- Antikörper detektiert. Figur 4 Replikation von Baculoviren in SF9 - Zellen. Das Genom enthält eine gfp (Green Fluorescence Protein) Expressionskassette als Marker für eine virale
Infektion der Zellen. Anhand der aufkommenden Fluoreszenz der Zellen im FACS wird die Replikation der Viren verfolgt. Unten links: Grün fluoreszierende SF9 - Zelle mit Silicapartikel, rechts Durchlichtaufnahme. Oben: 1 - nicht infizierte SF9 - Zellen,
2B - SF9 - Zellen infiziert mit PAH/PSS + PC/PS + gfp-Baculo, 3B - SF9 - Zellen infiziert mit Protamin/Dextransulfat + PC/PS + gfp-Baculo, 4 - mit freien Baculoviren infizierte SF9 - Zellen. 2A, 3A - Kontrollen der Überstände, um auszuschließen, dass Kontaminationen der Überstände mit freien Viren für die Infektion verantwortlich war.
Figur 5 zeigt Immunfluoreszenz an mit Influenza A PR8 fusionierten lipidbeschichteten LbL Kolloiden.
Figur 6 zeigt ein Bead Array (Feld).
Figur 7 zeigt die Titration des Arrays aus Figur 6.
Figur 8 veranschaulicht die Haltbarkeit des Bead Array.
Figur 9 zeigt ein 3μm grosses Kolloid (fünf Polyelektrolytschichten (PAH/PSS)), beschichtet mit Vesikeln aus reinem PS.
Figur 10 zeigt Ergebnisse eines bleaching Experiments.
Figur 11 zeigt einen Scan in Z-Richtung eines 20μm großen LbL-Kolloids, das mit Vesikeln aus reinem PC beschichtet wurde (als Fluoreszenz-Sonde wurde 1 % PE-Rhodamin verwendet).
Figur 12 zeigt die Kinetik der Fusion von Influenza A RP8 Viren mit lipidbeschichteten LbL-Kolloiden, gemessen in einem Flow Cytometer.
Figur 13 zeigt Ergebnisse von Bleichexperimenten mit gelabelten Viren, die mit lipidbeschichteten LbL-Kolloiden nach obiger Prozedur fusioniert wurden.
Figur 14 zeigt den prinzipiellen Aufbau von Mikropartikeln sowie entsprechende transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen.
Figur 1 zeigt in mehreren Schritten den prinzipiellen Aufbau eines Mikropartikels (LbL-Kolloids), das über die Virusfusion mit Baculoviren ausgerüstet worden ist. Im Uhrzeigersinn beginnend mit 10 Uhr sieht man eine Sequenz transmissionselektronenmikroskopischer Bilder von Anschnitten eines Silicateilchens mit dem Durchmesser von 500 nm:
A) Silicateilchen beschichtet mit 5 PAH/PSS Schichten, charakteristische glatte Oberfläche ist gut sichtbar.
B) zusätzliche Phosphatidylcholin - Phosphatidylserin Lipidschicht als Bilayer auf der PAH/PSS Unterlage.
C) Rubella-like -Partikel wurden mit der Lipidschicht fusioniert. Diese sind als kleine Erhebungen zu identifizieren. Unter Rubella-like-Partikel versteht man aus Zellkulturen von genetisch engineerten Zellen gewonnene Rötelvirenhüllen, die außer dem Genom des Virus sämtliche Komponenten des Virus enthalten.
D und E) In verschiedener Position fusionierte Baculoviren. Baculoviren sind stäbchenförmige relativ große Viren, die in Virologie und Molekularbiologie als „Werkzeuge" eine große Rolle spielen. Sie können in Insektenzellkulturen vermehrt werden.
Deutlicher ist dies noch in Figur 14 dargestellt. In Ausschnitt a ist ein mit einer Polyelektrolythülle 12 beschichtetes Silicateilchen dargestellt. In Ausschnitt b ist die Lipidmembran 14 auf dem LBL-Partikel erkennbar. Rubella-ähnliche Partikel 16 sind in Ausschnitt c mit der Lipidmembran 14 fusioniert. In Ausschnitt d und e sind mit der Lipidmembran 14 fusionierte Baculoviren 18 erkennbar. Figur 2 zeigt, dass die viralen Epitope auf den Mikropartikeln (Kolloiden) immunologisch zugänglich sind und qualitativ mit Fluoreszenzmikroskopie und quantitativ mittels Flowzytometrie nachgewiesen werden können. Mit Hilfe von Flowzytometrie wird die Intensität und Verteilung der Immunfluoreszenz quantifiziert. Im gegebenen Fall wurde ein Oberflächenprotein des Baculowildtyps, gp64 (Membranfusionsprotein des Baculovirus) und ein darauf engineertes HIV-1-gp120 Epitop (Frg#10) durch Immunfluoreszenz mit entsprechenden primären Antikörpern, sowie FITC-gelabelten sekundären Antimauskonjugaten dargestellt. Das HIV Epitop wurde durch Screening aus einer Baculobibliothek (Baculolibrary) selektiert, die Fragmente von HIV-1-gp120 im Surface Display darstellt.
Der spezifische Nachweis der Epitope auf den Mikropartikeln (kolloidalen Biokompositen) ist aus Abb. 2 ersichtlich. Die Maxima der Verteilungskurven der Fluoreszenz sind um eine Größenordnung gegenüber der Hintergrundfluoreszenz erhöht (Kurven 2). Das konfokale Bild deutet die diskrete Verteilung der Epitope an, die mit der Lage der Baculoviren auf dem kolloiden Komposit erklärt werden kann. In A ist die Verteilung der Vorwärtsstreuung FSC-H (forward scatter) gegen den grünen Kanal FL1-H (FITC) aufgetragen. Region R1 umfasst Einzelpartikel und Region R2 Partikelaggregate. Teilfigur b zeigt die spezifische Bindung eines Antikörpers gegen gp64 (B12D5), dem Membranfusionsprotein des Baculovirus (Kurve 2: PAH/PSS+PS/PC+Baculovirus (Wildtyp); Kurve 1: PAH/PSS+PS/PC als Kontrolle). Teilfigur c zeigt die spezifische Bindung eines Antikörpers (ARP360) gegen HIV-1-gp120, ein Hüllprotein von HIV-1 , Kolloiden mit Baculoviren, die das antikörperbindende Fragment (Frg#10) von HIV-1-gp120 als gentechnisch engineertes Fusionsprotein auf gp64, dem Membranfusionsprotein des Baculovirus, an ihrer Oberfläche präsentieren. (Kurve 1 : PAH/PSS+PS/PC+Baculoviren (Wildtyp) als Kontrolle; Kurve 2: PAH/PSS+PS/PC+Baculoviren mit engineertem Frg#10 (HIV- 1-gp120 Epitop) in ihrer Hülle).
Der Nachweis des HIV Epitopes am Fusionsprotein des Baculovirus auf den
Mikropartikeln (Kolloiden) zeigt, dass es möglich ist, auf diesem Wege eine
Verbindung zwischen einer virusbasierten kombinatorischen
Oberflächendisplaystrategie7'8 und dem Engineering von kolloidalen Partikeloberflächen zu legen. In der Tat enthält die Oberfläche der Mikropartikel kolokalisiert sowohl das funktionelle Peptid, in diesem Falle ein antikörperbindendes Epitop von HIV-1-gp120 HIV gp120, als auch das zugehörige Genom im Inneren der auf den Partikeln etablierten Viren. Zum ersten Mal ist es damit gelungen, ein Displaysystem auf kolloidalen Partikeln zu etablieren. Mit der Multifunktionalität und dem einfachen Handling der Mikropartikel ergeben sich hier ganz neue Nutzungsmöglichkeiten in Molekularbiologe und Medizin. Im vorliegenden Beispiel wurde das antikörperbindende HIV-1-gp120 Fragment über die Bindung des anti- HIV-gp120 Antikörpers ARP360 an das präsentierte Epitop an infizierten SF9 Zellen aus einer Bibliothek von 50 überlappenden HIV-PCR-Fragmenten, die in das Virusgenom so eingebaut wurden, dass sie am Fusionsprotein von Baculo präsentiert werden, mittels FACS selektiert, geklont und vervielfältigt. Prinzipiell lässt sich somit jedes gewünschte Peptid im Displaysysten an Hand der Funktion selektieren und steht dann nach entsprechender Vervielfältigung des selektierten viralen Klons in seinen Wirtszellen der Ausrüstung der Partikeloberfläche über die Viren zur Verfügung. Auf diese Weise können leicht große Partikelbibliotheken hergestellt werden, die kombinatorisch einsetzbar sind9'10. Der Vorteil der Verwendung der Viren, Virenkomponenten und Virenpartikel besteht gerade darin, dass kein Verlust der Funktionalität eintritt. Würde man die Peptide selbst an die Partikel binden, käme es zu prinzipiellen Schwierigkeiten, wie bereits weiter oben erläutert worden ist.
Der Vorteil dieser Strategie zeigt sich in Figur 3. Hier wurden Baculoviren, die streptag an ihrer Oberfläche aufweisen, und Baculoviren mit einem antikörperbindenden Fragment von HIV-gp41 , jeweils separat (rein) oder beide zusammen auf 3 μm große Partikel entsprechend dem vorgeschlagenen Verfahren aufgebracht. Streptag ist eine molekulare peptidbasierte Mimikry von Biotin und wird mit der Bindung von fluoreszenzgelabeltem Streptavidin leicht nachgewiesen. Es stellt einen universellen Dockingport für streptavidingekoppelte Funktionen dar, ist somit Ausgangspunkt für weiteres, nunmehr ligandkontrolliertes Engineering der Partikeloberfläche. Wie aus Figur 3 zu entnehmen ist, weist die Mischung (Figur 3a) beide Funktionen (streptag und HIV-gp41 Epitop) jeweils in halber Menge gegenüber den Partikeln, die entweder nur mit streptag (Figur 3a) oder nur mit HIV-gp41 (Figur 3c) ausgerüstet wurden, auf. Natürlich können mehr als zwei Funktionen aufgebracht werden, indem entweder Viren mit mehreren Epitopen verwendet und/oder mehrere (im vorliegenden Beispiel nur zwei) Viren mit jeweils einem Epitop assembliert werden. Der FITC-Kanal FL1-H (grüner Kanal) wurde zur Antikörperdetektion und der zweite Rotfluoreszenzkanal FL3-H zurstreptag Detektion verwendet. Der zweite Rotkanal FL3-H detektiert im Vergleich zum ersten Rotkanal FL2-H im langwelligeren Bereich.
Es konnte gezeigt werden, dass Viren, die auf der Oberfläche der kolloidalen Mikropartikel über Fusion an die Lipidschicht, die ihrerseits auf eine Polyelektrolytmultischicht adsorbiert ist, aufgebracht worden sind, ihre biologische Funktion im Sinne der spezifischen Aufnahme in Zellen und sogar der nachfolgenden Vermehrung in diesen Zellen nach Freisetzung in das Zytoplasma erhalten, sofern die Komposition des Schichtaufbaus geeignet gestaltet ist.
In Figur 4 ist dieses äußerst bemerkenswerte und nicht zu erwartende Ergebnis dargestellt. Hier wurden Baculoviren auf den Silicapartikeln (mit Lipid beschichtete LBL-Silicapartikel), die eine gfp Expressionskassette als Marker im Genom besitzen, fusioniert auf der der Oberfläche von LBL-Partikeln, beschichtet mit Lipid (PS/PC) und mit Baculoviren fusioniert, SF9 - Zellen angeboten. Sie werden aufgenommen und im Inneren der Zellen prozessiert. Das gfp Plasmid wird zusammen mit dem gesamten Genom repliziert, und die Synthese der viralen Bausteine in den Zellen bis hin zur Freisetzung der Viren ist dann beobachtbar. An Hand der grünen Fluoreszenz lässt sich der Prozess leicht nachweisen. In Figur 4 sieht man links unten die grüne Fluoreszenz einer infizierten SF9 Zelle (hervorgerufen durch die Produktion des als Marker verwendeten GFP (green fluorescence protein)), die gleichzeitig ein Partikel im unteren rechten Zytoplasmabereich enthält. Um sicherzustellen, dass keine in der Lösung eventuell vorhandenen Virenpartikel die Transfektion induzieren, wurden die Überstände der letzten Waschungen (2a und 3a) den Zellen angeboten. Eine Virussynthese ist nicht nachweisbar. Somit ist davon auszugehen, dass ausschließlich über immobilisierte Viren die Baculovirusinfektion induziert worden ist. Bemerkenswert ist, dass die Natur der Polyelektrolytmultischicht die Intensität und den Ablauf der Fusion steuert. Während in 2B nur eine Infektionsrate von 2,3 % aller Zellen nach 72 h durch virusbeschichtete Partikel, die als Hüllschicht die sehr stabile Schichtkombination PAH/PSS aufweisen, erzielt werden konnte, steigt diese Rate auf 18,9 % bei einer Hüllschicht aus einer biologisch abbaubarem Protamin/Dextransulfat Hüllschichtkombination (3b). Native freie Viren (4) zeigen Raten von 64,6 %. Bemerkenswert ist, dass der Infektions- und Replikationsprozess bei den virusengineerten Partikeln deutlich verzögert ist. Während bei nativen, freien Viren normalerweise die lag-Phase nach Inokulation etwa 12 h beträgt, kann diese auf mehrere Tage bei Verwendung der virusbeschichteten Partikel ansteigen. Deshalb ist ein quantitativer Vergleich der Effizienz nicht sehr aussagekräftig, weil die Replikation der Viren in den Zellen bei kurzer lag-Phase natürlich zu einer Selbstverstärkung führt. Ursache für die Retardation ist die notwendige Ablösung der Virenpartikel, die Defoliation der Teilchen, möglicherweise auch der Abbau der Schichten durch zelluläre Prozesse. Denkbar ist, verschiedene Virenarten auf den Teilchen zu kombinieren. Damit ließen sich effizient und schnell gezielt neue Viren schaffen, die ihrerseits als optimierte Träger dann Verwendung finden können.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von konkreten Beispielen weiter erläutert.
Beispiel 1
Herstellung eines Mikropartikels, das einen streptag und gleichzeitig ein antikörperbindendes Epitop von HIV gp41 an der Templatoberfläche an fusionierten Baculoviren präsentiert.
Ausführung:
Silicapartikel einer Größe von 3 μm im Durchmesser werden mehrfach in Aqua Bidest gewaschen. Poly(allylamin hydrochlorid) (PAH) und Poly(styrensulfonat Na- Salz) (PSS) mittleren Molekurgewichtes, ca. 70 000, werden in einer Konzentration von 1 mg/ ml in 0,5 M NaCI gelöst. Die Silicapartikel werden beginnend mit der PAH-Lösung für 20 min bei Raumtemperatur durch Adsorption beschichtet. Die Teilchenkonzentration beträgt dabei 3 %. Durch dreimalige Zentrifugation in 0,1 M NaCI wird PAH im Überstand entfernt, bevor analog PSS adsorbiert wird. Die Prozedur wird wiederholt bis insgesamt 5 Schichten aufgetragen worden sind, wobei die letzte Schicht PAH ist. 75 % Phosphatidylserin und 25 % Phosphatidylcholin werden in Chloroform mit 20 mg/ml aufgenommen, im Rotationsverdampfer an den Wänden des Gefäßes abgeschieden und anschließend in 0,1 M NaCI durch Hydratation aufgenommen. Diese Lösung wird bei 300C im Extruder bei einer Porenweite von 50 nm so lange zyklisch extrudiert, bis eine klare Lösung von unilamellaren kleinen Vesikeln entstanden ist. Auf 1 ml 5% v/v beschichtete Silicapartikel werden 1 ml Vesikellösung der Lipidkonzentration von 6 mg/ml gegeben und im Thermomixer bei 37°C 30 min inkubiert. Danach folgen 4 Waschungen in 0,1 M NaCI. Im Ergebnis erhält man lipidbeschichtete Silicapartikel. Diese werden nun bei pH = 4,5 in 0,2 M Phosphat/O, 1 M Zitratpuffer mit einer 1 :1 Mischung aus Baculovirenkonstrukten mit streptag und HIV gp41 Epitop an ihrer Oberfläche bei 37°C für dreißig Minuten inkubiert. Für 8 μg Proteingehalt der Virensuspension werden 10 μl 5% v/v lipidbeschichtete Partikel verwendet. Die Baculoviren werden aus Suspensionen durch Ultrazentrifugation an einer 25% Saccharosestufe von Verunreinigungen und Zellbestandteilen getrennt. Nach der durch den niedrigen pH-Wert induzierten Virus-Lipidfusion wird dreimal in PBS, pH 7,2 gewaschen. Im Ergebnis erhält man die in Abb. 3, unter B dargestellte Partikelpräparation, die in etwa zu gleichen Teilen streptag und das HIVgp41 Epitop enthält.
Beispiel 2
Aufnahme der Mikropartikel in SF9 Zellen
SF9 Zellen aus Spodoptera frugiperda werden in einem EPL-41 Medium von Sigma gehalten. Eine analog zu Beispiel 1 vorbereite Mikropartikelpräparation jedoch mit dem Unterschied, dass an Stelle von PAH/PSS eine Protamin/Dextransulfatmultischicht verwendet wird, wird zu den Zellen in einer Konzentration von 5 Partikeln/Zelle dazugegeben und für 72 Stunden inkubiert. Die Zellen nehmen innerhalb von wenigen Stunden die Partikel auf, erste Anzeichen der Virusvermehrung in einzelnen Zellen können nach 48 Stunden nachgewiesen werden. Nach 72 Stunden sind etwa 20 % der Zellen infiziert worden.
Beispiel 3
Herstellung von kolloiden Nanokompositen bestehend aus LBL-Partikeln, Lipiden und Influenzaviren der Typen A/Singapur (H2N2) oder A/PR8 (H1 N1).
Ausführung:
Silicapartikel einer Größe von 3 μm im Durchmesser werden mehrfach in Aqua Bidest gewaschen. Poly(allylamin hydrochlorid) (PAH) und Poly(styrensulfonat Na- SaIz) (PSS) mittleren Molekurgewichtes, ca. 70 000, werden in einer Konzentration von 1 mg/ ml in 0,5 M NaCI gelöst. Die Silicapartikel werden beginnend mit der PAH-Lösung für 20 min bei Raumtemperatur durch Adsorption beschichtet. Die Teilchenkonzentration beträgt dabei 5 %. Durch dreimalige Zentrifugation in 0,1 M NaCI wird PAH im Überstand entfernt, bevor analog PSS adsorbiert wird. Die Prozedur wird wiederholt bis insgesamt 5 Schichten aufgetragen worden sind, wobei die letzte Schicht PAH ist. 75 % L-α-Phosphatidylserin und 25 % L-α- Phosphatidylcholin werden in Chloroform mit 20 mg/ml aufgenommen, im Rotationsverdampfer an den Wänden des Gefäßes abgeschieden und anschließend in 0,1 M NaCI durch Hydratation aufgenommen. Diese Lösung wird bei 300C im Extruder bei einer Porenweite von 50 nm so lange zyklisch extrudiert, bis eine klare Lösung von unilamellaren kleinen Vesikeln entstanden ist. Auf 1 ml 5% v/v beschichtete Silicapartikel werden 1 ml Vesikellösung der Lipidkonzentration von 6 mg/ml gegeben und im Thermomixer bei 37°C 30 min unter Schütteln inkubiert. Danach folgen 3 Waschungen in 0,1 M NaCI. Im Ergebnis erhält man lipidbeschichtete Silicapartikel. Diese werden nun bei pH = 4,5 in 0,2 M Phosphat/0,1 M Zitratpuffer mit einer konzentrierten Viruslösung bei 37°C für zehn Minuten inkubiert. Im Falle der Verwendung pathogener Viren wie z.B. Influenza A werden diese zuvor mittels UV-Bestrahlung inaktiviert. Die Virenkonzentration wird dabei so eingestellt, dass je 1 μl Teilchenlösung 0,75 μg Virusprotein zugegeben wird. Nach der durch den niedrigen pH-Wert induzierten Virusadsorption und anschließenden Virus-Lipidfusion wird dreimal in PBS, pH 7,2 gewaschen. Im Ergebnis erhält man kolloidale Nanokomposite (Mikropartikel) bestehend aus LBL-Partikeln, darauf aufgebrachten Lipiden und darin fusionierten, aber inaktivierten Influenzaviren der Typen A/Singapur (H2N2) oderA/PR8 (H1 N1). Die Präsenz dieser Viren wird durch Immunfluoreszenzmessungen mit polyklonalen Kaninchenantiseren und sekundären mit FITC gelabelten Anti-Kaninchenantikörpern konfokal nachgewiesen. Das Ergebnis (am Beispiel von Influenza PR8) ist in Figur 5 dargestellt.
Figur 5 zeigt Immunfluoreszenz an mit Influenza PR8 fusionierten lipidbeschichteten LbL-Partikeln (Mikropartikel). Die Mikropartikel (Kolloide) wurden mit einem polyklonalen Serum gegen Influenza PR8 und nachfolgend mit einem sekundären fluoreszenzgelabelten Antikörper wie im Text beschrieben inkubiert und gewaschen. Das Bild, aufgenommen mittels eines konfokalen Laser Scanning Mikroskops zeigt im Transmissionsbild (links) zwei Kolloide, eines mit Influenza A beschichtet (links), das andere ohne virale Beschichtung (rechts). Im rechten Bild (Fluoreszenz; grüner Kanal) ist eindeutig zu erkennen, dass nur die mit Influenza A beschichtete Kugel durch die Antikörper angefärbt wurde.
Beispiel 4
Herstellung eines suspensionsbasierten „bead arrays" zur parallelen flowzytometrischen Diagnostik von Antikörpern gegen HIV und Influenza.
Ausführung:
Gemäß den Ausführungen in Beispiel 1 und Beispiel 3 werden Mikropartikel (kolloidale Nanokomposite) bestehend aus LBL-Partikeln, Lipiden und entweder Influenzaviren der Typen A/Singapur (H2N2) oderA/PR8 (H1 N1 ), oder Autographa californica Nuklearpolyhedrosis Viren (NPV oder Baculovirus) vom Wildtyp oder Nuklearpolyhedrosisviren, die ein 17aa Epitop des HIV-1 gp 120 Proteins an einer zusätzlichen Kopie des Hüllproteins gp 64 enthalten, hergestellt. 17aa bedeutet, dass das Epitop aus 17 Aminosäuren besteht, an die der Antiköper bindet. Im Unterschied zu den Beispielen 1 und 3 werden jedoch nicht 5 sondern 13 Polyelektrolytschichten vor dem Aufbringen der Lipidschicht assembliert. Diese Polyelektrolytschichten enthalten an Stelle des normalen PAH eine (im Fall des Baculovirus mit engineertem HIV-1-gp120 Epitop), zwei (im Fall von Influenza A PR8), vier (im Fall von NPV Wildtyp), oder sieben Schichten (im Fall von Influenza A Singapur) aus rhodamingelabeltem PAH. Diese vier Kompositpopulationen werden danach in einer 2% Paraformaldehydlösung für 10 min auf Eis fixiert, zu gleichen Teilen gemischt, in vier Teile zu je etwa 104 beads geteilt und jeweils 30 min in 50μl PBS/2,5 % hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum mit einem der genannten Antikörper inkubiert (B12D5 gegen gp 64 des NPV-Virus, mab ARP360 gegen HIV-1 gp120, polyklonale Antikörper aus Kaninchen gegen Influenza A PR8, bzw. Influenza A Singapur). Danach werden die Teilchen durch Zentrifugation bei 2000g abzentrifugiert und einmal in PBS gewaschen. Dann folgt eine Inkubation in PBS über 30 min mit einer hundertfach verdünnten Lösung der passenden FITC - Antimaus- bzw. Antikaninchen Konjugate. Im Flowzytometer werden jeweils 103 Teilchen in 300 μl PBS analysiert. Man erhält den in Figur 6 dargestellten, spezifischen Nachweis der jeweiligen Antikörper. Durch Titration der zugegebenen Antikörper kann gezeigt werden, dass mithilfe dieses suspensionsbasierten Arrays auch quantitative Messungen der in der Probe befindlichen Antikörperkonzentration durchgeführt werden können.
Figur 6 zeigt ein Bead Array (Feld): auf vier farblich unterschiedlichen kolloidalen Populationen wurden verschiedene Viren assembliert (siehe obigen Text) und mit unterschiedlichen Antikörperkonjugaten inkubiert und im Flow Zytometer gemessen. a) ARP 360 (anti HIV gp120 Antikörper); b) B12D5 (anti gp64); c) anti PR8
(polyklonales Serum); d) anti Sg (polyklonales Serum); (der rote Kanal (Rhodamin) erlaubt die Unterscheidung der verschiedenen kolloidalen Populationen, der grüne Kanal (FITC) zeigt die Bindung eines Antikörpers an ein kolloidales Komposit).
Die vier Teilfiguren 6a bis 6d zeigen die spezifische Bindung der Antikörper an die jeweiligen viralen Oberflächen, (a: nur Population 4 (Baculovirus mit HIV-Fragment); b: Population 2 und 4 (Baculoviren); c und d: durch die Verwendung polyklonaler Seren zeigen beide Influenza A Subtypen ein Signal, dieses ist jedoch gegen die virale Oberfläche des jeweiligen Virus um einiges stärker und erlaubt ein Unterscheiden der zwei verschiedenen Influenza Subtypen. In den Teilfiguren 6a bis 6d bezieht sich 1 jeweils auf mit Influenza A Singapur (H2N2), 2 auf mit Baculoviren vom Wildtyp, 3 auf mit Influenza A RP8 (H 1 N1) und 4 auf mit Baculoviren mit HIV-1- gp120 Fragment fusionierte lipidbeschichtete LbL-Partikel.
Figur 7 zeigt die Titration des Arrays: Y-Achse: geometrische Mittel der Fluoreszenzintensität (grüner Kanal); X-Achse: Verdünnungsfaktor der zugegebenen primären Antikörper. Man sieht die spezifische Bindung der jeweiligen Antikörper an die Mikropartikel (kolloidalen Komposite). Dadurch können
Antikörperkonzentrationen über einen relativ grossen Bereich mit einer Sensitivität, die dem von ELISA-Tests entspricht, in einer Probe simultan auf mehrere Epitope hin gemessen werden.
Das suspensionsbasierte Array kann über mehrere Wochen bei 4° C gelagert werden. Über diesen Zeitraum tritt nur ein geringer Verlust der Aktivität, wie in Figur 8 am Beispiel des Nachweises der anti-PR8 Antikörper als Funktion der Lagerung gezeigt, auf. No10 steht hier für mit Baculoviren mit engineertem HIV-1-gp120 Fragment beschichtete LbL-Partikel, PR8 für Influenza A (H1 N1 ), NPV für Wildtyp Baculoviren und Sg für Influenza A Singapur (H2N2).
Figur 8 veranschaulicht die Haltbarkeit des Bead Array: Der bei 4°C im Kühlschrank gelagerte Array wurde mittels Inkubation mit polyklonalem Serum gegen Influenza PR8 auf Haltbarkeit hin untersucht. Selbst nach 5-wöchiger Lagerung zeigt sich, dass die Charakteristika des erhaltenen Signals immer noch jenen des frisch hergestellten Arrays weitgehend entsprechen. Trotz einer kleinen Abnahme des Signals bleibt das große Signal/Rausch- Verhältnis erhalten. No10 steht hier für mit Baculoviren mit HIV-1-gp120 Fragment beschichtete LbL-Partikel, PR8 für Influenza A (H1 N1), NPV für Wildtyp Baculoviren und Sg für Influenza A Singapur (H2N2). geoMFI bedeutet das geometrische Mittel der Fluoreszenzintensität (geometric mean fluorescence intensity).
Beispiel 5
Herstellung einer Lipidschicht auf einem LBL-Teilchen, die für die Fusion mit Influenza A Viren, Rubella - like -Particles und virale Pseudotypen (Chimären) bestehend aus dem Kapsidprotein des Simian Virus 40 und dem Membranprotein von Vesikular Stomatitis Virus (im Nachfolgenden SIV/VSV-G) geeignete Eigenschaften aufweist.
Damit die Virusfusion erfolgreich verläuft, muss a) eine Adsorption des Virus an die aufgebrachte Lipidschicht erfolgen und b) der Fusionsprozess muss danach ablaufen können. Damit die Bedingung a) und die Bedingung b) erfüllt sind, ist es von Vorteil, dass die Lipidschicht ganz bestimmte Eigenschaften aufweist. Für die genannten Viren wird daher bevorzugt, dass sauer reagierende Lipide in ausreichender Konzentration vorhanden sind. Bevorzugt verwenden wir Phosphatidylserin (PS). Insbesondere diese Substanz und einige wenige andere saure Lipide ermöglichen die Adsorption der genannten Viren in ausreichender Menge. Es ist weiterhin von Vorteil, wenn die Lipidschicht zumindest in Form einer sogenannte Doppelmembran, die kontinuierlich ist, vorliegt. Das ist insbesondere dann der Fall, wenn beispielsweise die für das Aufbringen der Lipidschicht verwendeten Liposomen nach deren Adsorption an die Polyelektrolythülle (beispielsweise LBL - Partikel) auch spreiten und die individuellen Lipidschichten der einzelnen Liposomen sich miteinander verbinden können. Damit das der Fall ist, sollte die Lipidschicht insbesondere beweglich sein, d. h. sie muss sich in einer flüssigen Phase befinden, und die Wechselwirkung mit der LBL-Unterlage sollte nicht zu groß sein. Verwendet man z. B. reines PS, erhält man zwar eine starke Adsorption aber keine ausreichende Spreitung, wie aus Figur 9 ersichtlich ist. Die Fusion der Viren mit dieser Lipidschicht ist zwar möglich, jedoch werden die Viren nicht eigentlich in die Lipidschicht integriert, die sich auf dem LBL-Partikel befindet, sondern befinden sich in den adsorbierten Vesikeln. Das hat den entscheidenden Nachteil, dass die Integration der Viren und viralen Partikel nicht stabil ist, weil deren Bindung an die Polyelektrolythülle (LBL-Unterlage) durch die Lipidschicht bei der Fusion so nicht erreicht werden kann. Ein solches System wäre für die praktische Nutzung wenig geeignet.
Figur 9 zeigt ein TEM-BiId (Transmissionselektronenmikroskop) eines 3μm grosses Kolloid (fünf Polyelektrolytschichten (PAH/PSS)), beschichtet mit Vesikeln aus reinem PS. Die PS-Liposomen sind nicht in der Lage auf der kolloidalen Oberfläche zu spreiten.
Verwendet man jedoch eine Mischung aus PS und Phosphatidylcholin (Lecithin) für die Herstellung der Liposomen (Mischungsverhältnis: 3:1 , 1 :1 , 1 : 3) erfolgt eine Spreitung der Vesikel, und eine Doppelschicht, in der sich die Lipide bewegen können, wird ausgebildet. Eine solche Schicht ist für das Verfahren von Vorteil. Die Beweglichkeit der Lipide (Fluidität der Membran) kann mit einem Photobleachingexperiment nachgewiesen werden. Dabei wird durch einen starken Laserimpuls die Fluoreszenz eines Lipids, das mit einem Fluoreszenzlabel gekoppelt ist, in einem kleinen Areal zerstört und man verfolgt die Wiederbelebung der Fluoreszenz an dieser Stelle. Das ist nur möglich, wenn Lipide durch Diffusion aus den unbeeinträchtigten Membranbereichen in das gebleichte Areal einwandern können. Das ist in Figur 10 dargestellt.
Figur 10 zeigt Ergebnisse eines bleaching Experiments: Die Erholung der Fluoreszenz (durch Diffusion eines in die Lipidschicht eingebauten fluoreszenten Lipids in das mit einem Laser ausgebleichte Areal) kann über die Zeit verfolgt werden. Als Kontrolle dient ein Punkt gegenüber dem Bleichpunkt.
Die viralen Proteine, die durch Fusion in die Membran eingebracht worden sind, können sich jedoch nicht bewegen, sie sind durch Wechselwirkungen mit der LBL- Unterlage verankert. Dadurch ist die Stabilität des Systems gewährleistet. Ist die Beweglichkeit der Lipide zu gering (das ist gegeben, wenn die PS- Konzentration beispielsweise unter das Verhältnis 1 :3 sinkt), werden einerseits Adsorption und Fusion der Viren beeinträchtigt bzw. verhindert, und andererseits kann sich keine homogene Membran mehr ausbilden, weil die individuellen Membranen der Vesikel sich nicht ausreichend miteinander verbinden können. Das in Figur 11 dargestellt. Man erkennt Bereiche, in denen die Lipidbeschichtung der Teilchen ungenügend ist, bzw. fehlt. An diesen Stellen können sich dann z. B. die Antikörper unspezifisch binden. Diese Teilchen wären für diagnostische und andere Zwecke ebenfalls wenig geeignet. Die Fluidität und Homogenität der Lipidschicht ist die Voraussetzung dafür, dass die LBL-Unterlage vollständig abgedeckt ist. Das ist notwendig um unerwünschte Anlagerungen von Molekülen aus der Umgebung zu vermeiden. Das ist bei biologischen Molekülen zu erwarten, da sie als Polyelektrolyte mit den stark geladenen Unterlagen in Wechselwirkung treten würden. Der Lipidschicht kommt in diesem Sinne auch eine bedeutende Schutzwirkung zu.
Figur 11 zeigt einen Scan in Z-Richtung eines 20μm großen LbL-Partikel (LbL- Kolloid), das mit Vesikeln aus reinem PC beschichtet wurde (als Fluoreszenz-Sonde wurde 1 % PE-Rhodamin verwendet). In Figur 11 zeigen sich grosse Inhomogenitäten in der Lipidbeschichtung und auch das Fehlen derselben in manchen Bereichen.
Beispiel 6
Fusion von adsorbierten Influenza A Viren mit LBL-Partikeln, auf denen eine Lipidschicht mit den Eigenschaften, die in Beispiel 5 erläutert wurden, aufgebracht wurde. (Anmerkung: diese Ergebnisse sind in Analogie mit allen anderen bisher genannten Viren)
Die Fusion von Virionen mit lipidbeschichteten LbL-Partikel (LbL Kolloiden) kann durch Einbau fluoreszenter Lipide in die Membran des Virions gezeigt werden. Durch Inkorporation einer fluoreszenten Lipidsonde (Oktadecyl-Rhodamin B; R18) in die Lipidschicht des Virus (durch schlichte Inkubation der beiden Komponenten und nachfolgender chromatographischer Reinigung) in einer hohen Konzentration (bis 10%) zeigt das virale Partikel nur eine schwache rote Fluoreszenz, da die Fluoreszenz des Labels gequencht wird. Wenn das Virion mit der Membran des lipidbeschichteten LbL-Kolloids fusioniert, vermischen sich die beiden Lipidschichten und die Konzentration des R18 nimmt ab, was in einem starken Anstieg der Fluoreszenz resultiert.
In Figur 12 wurden mit R18 angefärbte Influenza A Viren in PBS-Puffer neutralen pH 's mit lipidbeschichteten LbL-Partikel (hergestellt nach obiger Prozedur) für 10 min. inkubiert. In dieser Zeit adsorbieren die Virenpartikel an die lipidbeschichteten LbL-Partikel (Kolloide), was sich durch einen leichten Anstieg der Fluoreszenz der lipidbeschichteten LbL-Partikel (Kolloide) bemerkbar macht (Dreiecke 5 und 6). Durch Zugabe des sauren Phosphat/Zitrat-Puffers wird die Fusion der Adsorbierten Viren mit der Lipidschicht der Partikel (Kolloid) induziert. Die virale Membran vermischt sich mit der Membran des Partikels und durch die daraus resultierende Verdünnung des gequenchten R18-Labels steigt die Fluoreszenz stark an (Kurve 1 ).
Figur 12 zeigt die Kinetik der Fusion von Influenza A Viren mit lipidbeschichteten LbL-Partikel, gemessen in einem Flow Cytometer. Das Dreieck 5 stellt den geometrischen Mittelwert der Fluoreszenz von Lipidbeschichteten LbL-Partikeln (Kolloiden) dar. Diese lipidbeschichteten LbL-Partikel wurden mit R18-gefärbten Influenza A Viren bei neutralem pH für 10 Minuten inkubiert, ein mal in PBS gewaschen und wieder gemessen (Dreieck 6). Die Zunahme der Fluoreszenz zeigt das Adherieren der Viren an die Kolloide. Durch Inkubation in saurem Puffer (Zitrat/Phosphat pH4.5) wird die Fusion der Viren mit der Membran der LbL-Partikel induziert, wie an dem steilen Anstieg der Kurve 1 zu erkennen. Die Kurve 2 ist eine Vergleichsmessung mit an den Aminogruppen der viralen Hüllproteine gelabelten Viren, bei denen der verwendete Rhodamin-Farbstoff kovalent an die Aminogruppen (-NH2) der viralen Proteine angebracht wurde und nicht gequenscht ist.
Durch Bleichexperimente an mit Viren fusionierten Kolloiden kann die Fusion ebenfalls gezeigt werden. Das ursprünglich von den Viren stammende R18 kann sich in der Lipidschicht lateral bewegen, wie aus Figur 13 zu ersehen ist. Durch den sehr kleinen Durchmesser der Viren (ca. 50nm) kann dies nur geschehen, wenn eine Verschmelzung der Membran des Virus mit der Membran des LbL-Partikels erfolgt ist. Um zu zeigen, dass die Beweglichkeit der R18-Sonde nicht von einer etwaigen Beweglichkeit der fusionierten Virionen herrührt, wurden die selben Experimente mit an den Aminogruppen der viralen Hüllproteine kovalent gelabelten Viren durchgeführt. Die viralen Hüllproteine sind nicht in der Lage, sich in der Membran lateral zu bewegen.
Figur 13 zeigt Ergebnisse von Bleichexperimenten mit gelabelten Viren, die mit lipidbeschichteten LbL-Partikel nach obiger Prozedur fusioniert wurden. Im linken Bild wurden Influenza A Viren verwendet, die kovalent mit Rhodamin-Farbstoff an den viralen Proteinen gefärbt wurden. Es ist keine Diffusion der Farbstoffmoleküle in der Membran nachweisbar. Im rechten Bild ist die laterale Beweglichkeit des R18- Labels, der ursprünglich in die virale Membran insertiert wurde, zu sehen. Dies kann nur durch Fusion der viralen Membran mit der Membran des LbL-Partikels erklärt werden.
Literatur
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Claims

Patentansprüche
1. Mikropartikel aufweisend: einen Kern von kolloidaler Größe, - eine Hüllschicht auf dem Kern aus mehreren Schichten alternierend geladener Polyelektrolyte, eine bi- oder multilamellare Lipidschicht auf der Hüllschicht, und Viren, Virosomen oder virenähnliche Partikel, welche in die Lipidschicht integriert oder mit dieser verschmolzen sind.
2. Mikrokapseln aufweisend: eine einen Hohlraum umgebende Hüllschicht aus mehreren Schichten alternierend geladener Polyelektrolyte, eine bi- oder multilamellare Lipidschicht auf der Hüllschicht, und - Viren, Virosomen oder virenähnliche Partikel, welche in die
Lipidschicht integriert oder mit dieser verschmolzen sind.
3. Mikropartikel oder Mikrokapseln nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Viren, Virosomen oder virenähnliche Partikel lipidumhüllte Viren sowie mit durch Pseudotyping erzeugten Virenhybriden sind.
4. Mikropartikel oder Mikrokapseln nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Viren, Virosomen oder virenähnliche Partikel alle lipidbehüllten Viren sind, deren Infektionsmechanismus und nachfolgender Verschmelzung mit der endosomalen Membran unter sauren Bedingungen verläuft.
5. Mikropartikel oder Mikrokapseln nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Viren, Virosomen oder virenähnliche Partikel Nuclearpolyhydrosisviren (NPV), Influenzaviren, Rubellaviren, Vesicularstomatitisviren (VSV) oder Rubelle-ähnliche-Teilchen (Rubella-like- Particles) sind
6. Verfahren zur Herstellung von Mikropartikeln oder Mikrokapseln aufweisend die Schritte:
Bereitstellen eines Kerns kolloidaler Größe;
Aufbringen einer Hüllschicht auf den Kern durch Aufbringen mehrerer alternierend geladener Schichten aus Polyelektrolyten und/oder Nanopartikeln;
Aufbringen einer bi- oder multilamellaren Lipidschicht auf die Hüllschicht; und Integrieren oder Verschmelzen von Viren, Virosomen oder virenähnlichen Partikeln mit der Lipidschicht durch Membranfusion der Viren, Virosomen oder virenähnliche Partikel mit der Lipidschicht.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Membranfusion der Viren, Virosomen oder virenähnlichen Partikeln durch pH- Sprung, Änderung der lonenzusammensetzung und Temperatur und/oder durch fusionsfördernde Substanzen, wie Lysolipide und membranaktive Stoffe ausgelöst wird.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder7, dadurch gekennzeichnet, dass als Viren, Virosomen oder virenähnliche Partikel lipidumhüllte Viren sowie mit durch Pseudotyping erzeugten Virenhybriden verwendet werden.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass als Viren, Virosomen oder virenähnliche Partikel alle lipidbehüllten Viren verwendet werden, deren Infektionsmechanismus und nachfolgender Verschmelzung mit der endosomalen Membran unter sauren Bedingungen verläuft.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Integration oder Verschmelzung der Viren mit der Lipidschicht unter sauren Bedingungen erfolgt.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Kern herausgelöst und dadurch die Mikrokapseln fertiggestellt werden.
12. Verwendung der in einem der Ansprüche 1 bis 5 beschriebenen Mikropartikel oder Mikrokapseln oder der nach einem der Ansprüche 6 bis 1 1 hergestellten Mikropartikel oder Mikrokapseln als Vehikel für die intrazelluläre Aufnahme.
13. Verwendung der in einem der Ansprüche 1 bis 5 beschriebenen Mikropartikel oder Mikrokapseln oder der nach einem der Ansprüche 6 bis 11 hergestellten Mikropartikel oder Mikrokapseln als genetischer Vektor.
14. Verwendung der in einem der Ansprüche 1 bis 5 beschriebenen Mikropartikel oder Mikrokapseln oder der nach einem der Ansprüche 6 bis 11 hergestellten
Mikropartikel oder Mikrokapseln als Modifikatoren des Zellstoffwechsels, wie z.B. Wechselwirkungen mit den zellulären RNA-Komponenten
15. Verwendung der in einem der Ansprüche 1 bis 5 beschriebenen Mikropartikel oder Mikrokapseln oder der nach einem der Ansprüche 6 bis 11 hergestellten
Mikropartikel oder Mikrokapseln für die Diagnostik.
16. Verwendung der in einem der Ansprüche 1 bis 5 beschriebenen Mikropartikel oder Mikrokapseln oder der nach einem der Ansprüche 6 bis 11 hergestellten Mikropartikel oder Mikrokapseln für die Vaccinierung bei Mensch und Tier.
17. Verwendung der in einem der Ansprüche 1 bis 5 beschriebenen Mikropartikel oder Mikrokapseln oder der nach einem der Ansprüche 6 bis 11 hergestellten Mikropartikel oder Mikrokapseln zum Aufbau von kombinatorischen Bibliotheken für die Genomik und Proteomik.
18. Verwendung der in einem der Ansprüche 1 bis 5 beschriebenen Mikropartikel oder Mikrokapseln oder der nach einem der Ansprüche 6 bis 11 hergestellten Mikropartikel oder Mikrokapseln in diagnostischen Kits und diagnostischen Automaten.
19. Verwendung der in einem der Ansprüche 1 bis 5 beschriebenen Mikropartikel oder Mikrokapseln oder der nach einem der Ansprüche 6 bis 11 hergestellten M ikro partikel oder Mikrokapseln als kolloidale Displaysysteme mit einer oder mehreren co-lokalisierten genetischen Komponenten und/oder mit einer oder mehreren co-lokalisierten Protein- oder Peptidfunktionen.
20. Verwendung der in einem der Ansprüche 1 bis 5 beschriebenen Mikropartikel oder Mikrokapseln oder der nach einem der Ansprüche 6 bis 11 hergestellten Mikropartikel oder Mikrokapseln auf Biochips und Bioarrays.
21. Verwendung der in einem der Ansprüche 1 bis 5 beschriebenen Mikropartikel oder Mikrokapseln oder der nach einem der Ansprüche 6 bis 11 hergestellten Mikropartikel oder Mikrokapseln zur Herstellung von genetischen Kombinationen durch Co-Beladung und Co-Synthese/Infektion von zwei oder mehreren viralen Spezies.
22. Verwendung der in einem der Ansprüche 1 bis 5 beschriebenen Mikropartikel oder Mikrokapseln oder der nach einem der Ansprüche 6 bis 11 hergestellten Mikropartikel oder Mikrokapseln in menschlichen, pflanzlichen, tierischen und bakteriellen Zellen sowie in Pilzzellen.
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