KR20090132506A

KR20090132506A - 골형성촉진용 합성펩타이드, 상기 합성 펩타이드를 포함하는 약학조성물 및 배지조성물

Info

Publication number: KR20090132506A
Application number: KR1020090052004A
Authority: KR
Inventors: 윤택림; 김형근; 김지현
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2008-06-20
Filing date: 2009-06-11
Publication date: 2009-12-30
Also published as: EP2303911A4; WO2009154330A1; EP2303911B1; EP2303911A1; KR100987731B1

Abstract

본 발명은 유효한 기능성을 갖는 펩타이드에 관한 것으로 보다 구체적으로는 BMP(Bone Morphogenetic Protein)-7에서 유래하는 15개의 아미노산 서열로 이루어진 골형성촉진용 합성펩타이드, 상기 합성 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약학조성물 및 배지조성물에 관한 것이다.

본 발명의 골형성촉진용 합성 펩타이드는 골아 세포의 분화를 촉진하는데 현저한 효과가 있어 상기 합성 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 약학조성물은 골다공증, 골결손질환 및/또는 골관절염의 치료에 우수한 효과가 있다.

BMP-7, 합성펩타이드, 골아세포분화, 골형성

Description

골형성촉진용 합성펩타이드, 상기 합성 펩타이드를 포함하는 약학조성물 및 배지조성물{OSTEOGENIC SYNTHETIC PEPTIDES, PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS COMPRISING THE SAME, AND MEDIUM CONTAINING THE SAME}

본 발명은 유효한 기능성을 갖는 펩타이드에 관한 것으로 보다 구체적으로는 BMP(Bone Morphogenetic Protein)-7에서 유래하는 15개의 아미노산서열로 이루어진 합성펩타이드, 상기 합성 펩타이드를 포함하는 약학조성물 및 배지조성물에 관한 것이다.

골다공증(osteoporosis)은 골 조직의 석회가 감소되어 뼈의 골밀질이 엷어지고 그로 인해 골수강이 넓어지는 증세로서, 증세가 진전됨에 따라 뼈가 약해지기 때문에 작은 충격에도 골절되기 쉽다.

뼈의 건강상태를 결정하는 골량은 유전적 요인, 영양 섭취, 호르몬의 변화, 운동 및 생활 습관의 차이 등 여러 가지 요인들에 의해 영향을 받는데, 특히 노령, 운동 부족, 저체중, 흡연, 저칼슘 식이, 폐경 또는 난소 절제 등이 골다공증의 원인으로 알려져 있다.

개인차는 있지만 백인보다는 흑인이 골 재흡수 수준(bone resorption level) 이 낮아 골량이 더 높으며, 일반적으로 14 내지 18세에 골량이 가장 높고 노후에는 1년에 약 1%씩 감소한다. 특히, 여성의 경우 30세 이후부터 골 감소가 지속적으로 진행되며, 폐경기에 이르면 호르몬 변화에 의해 골 감소가 급격히 진행된다. 즉, 폐경기에 이르면 에스트로젠 농도가 급속히 감소하는데, 이때 B-임파구(B-lymphocyte)가 다량 생성되어 골수(bone marrow)에 B 세포 전구체(pre-B cell)가 축적되고, 이로 인하여 IL-6의 양이 증가하여 파골 세포의 활성을 증가시키므로 결국 골량이 감소하게 되는 것이다.

상기한 바와 같이 골다공증은 정도에 차이는 있으나 노년층, 특히 폐경기 이후의 여성에게 있어서는 피할 수 없는 증상으로, 선진국에서는 인구가 노령화됨에 따라 골다공증 및 그 치료제에 대한 관심이 점차 증가되고 있다.

또한, 뼈와 관련된 질환으로는 골다공증 이외에도 골관절염(osteoarthritis) 및 골결손질환 등이 있는데, 골관절염은 관절의 연골이 손상되면서 국소적으로 퇴행성 변화가 나타나는 질환으로 퇴행성관절염이라고도 한다. 크게 두 가지 원인이 있는데 관절의 연골이나 뼈는 정상적인데 비해 관절에 과도한 부하가 걸려 관절 조직이 손상을 받거나, 부하는 정상적인데 비해 관절의 연골이나 뼈가 약한 경우이다.

골결손 질환은 인체의 여러 부위에서 나타날 수 있는데, 그 주된 원인으로 골질 손실을 동반한 급성 외상, 수술 중 조직제거로 인한 골손실을 동반한 급성외상, 골 절제(boneresection)를 수반한 만성 감염, 분절성 골결손을 동반한 만성 불유합 등을 들 수 있다.

실제로, 이와 같은 골질환 치료와 관련되어 전세계적으로 약 1,300억 달러 이상의 시장이 형성되어 있으며 그 규모는 향후 계속적으로 증가할 것으로 예상되기 때문에 세계적인 각 연구 기관과 제약회사에서는 골질환 치료제 개발에 많은 투자를 하고 있다.

특히 골다공증을 예로 들어 살펴보면 현재 골다공증 치료제로 사용되고 있는 물질로는 에스트로겐(estrogen), 앤드로제닉 아나볼릭 스테로이드(androgenic anabolic steroid), 칼슘 제제, 인산염, 불소 제제, 이프리플라본(Ipriflavone), 비타민 D3 등이 있고, 1995년 미국 머크사에서는 아미노비스포스포네이트(aminobisphosphonate)를, 1997년 미국 릴리사 (Lilly Co.)에서는 선택적인 에스트로젠 수용체 조절기(selective estrogen receptor modulator, SERM)로서의 역할을 하는 라록시펜(raloxifene)을 골다공증 치료제로 개발한 바 있다.

한편, 골다공증 치료제로서 골흡수 억제제인 에스트로겐이 가장 널리 사용되고 있으나, 에스트로겐의 상용이 자궁내막암, 유방암의 발생빈도를 증가시키고, 혈전증, 담석증, 고혈압, 부종, 유방통 등을 유발시킬 수 있으며, 폐경 후 에스트로겐과 프로게스테론을 동시 투여한 여성을 추적 관찰한 결과, 유방암, 뇌졸중, 폐색전 등의 발생률이 높다는 것이 증명되었다.

이외에도 비스포스포네이트 제제(알렌드로네이트, 에티드로네이트), 비타민 D 제제, 칼시토닌 제제 또는 칼슘 제제 등이 골다공증 치료제로서 사용되나, 비스포스포네이트 제제는 흡수율이 떨어지며 복용방법이 까다롭고 식도염을 유발시키며,

비타민 D 제제는 고가이며 효과가 확실하지 않고, 칼시토닌 제제는 고가이며 투여방법이 용이하지 않으며, 칼슘제제는 부작용은 적지만 치료보다는 예방효과에 국한되는 단점이 있다.

더욱이, 골다공증은 약물의 단기 투여만으로는 치료할 수 없으며 약물의 장기 투여가 필수적이다. 따라서, 약물을 장기 투여할 때에도 상기와 같은 부작용이 없고 기존의 치료물질을 대체할 수 있을 만큼 우수한 약효를 갖는 새로운 물질의 개발이 요구되고 있다.

하지만, 현재 국내의 경우 골다공증에 대한 인식이 얼마 되지 않아 예방과 치료가 제대로 되고 있지 않을뿐더러 특히 약물 남용에 의한 이차성 골다공증이 심각한 양상을 보이고 있으며, 아직 이에 대한 결과가 많지 않아 국내와는 상황이 다른 서구 유럽의 치료 조건에 맞추어 치료를 하는 상태이므로, 국내 실정에 맞는 정확한 골다공증에 대한 연구와 국내 골다공증 환자에 맞는 치료제의 개발이 필요한 실정이다.

이러한 상황은 골관절염이나 골결손질환의 경우도 대동소이한 상태이다.

상기와 같은 종래 기술의 제반 단점과 문제점을 해결하기 위하여 연구 노력한 결과 본 발명자들은 골아세포분화를 촉진하는 펩타이드를 합성함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 저렴한 비용으로 합성가능하고, 골아 세포 분화 또는 골형성을 촉진하는 BMP-7에서 유래하는 15개의 아미노산 서열로 이루어진 합성펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 골형성촉진용 합성펩타이드를 유효성분으로 포함하여 부작용이 없고 약효가 우수하면서도 생산단가가 상대적으로 낮은 골다공증, 골관절염, 및/또는 골결손질환의 치료에 유효한 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 골형성촉진용 합성펩타이드를 포함하여 골아세포분화 또는 골형성 속도를 실험자의 의도에 따라 조절할 수 있는 골아세포 분화배지조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적들은 이상에서 언급한 목적들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 BMP-7에 존재하는 15개의 아미노산 서열로 이루어져 골아세포분화 또는 골형성을 촉진하는 골형성촉진용 합성펩타이드 로서, 상기 펩타이드는 하기 서열번호 1인 폴리펩타이드 또는 그의 상동체인 것을 특징으로 하는 골형성촉진용 합성펩타이드.

<서열번호1>

Val-Glu-His-Asp-Lys-Glu-Phe-Phe-His-Pro-Arg-Tyr-His-His-Arg

바람직한 실시예에 있어서, 골아세포분화 또는 골형성을 촉진하기 위한 상기 합성 펩타이드의 첨가함량은 0.1 내지 2 ㎍/㎖이다.

또한, 본 발명은 제 1 항 또는 제 2 항 중 어느 한 항의 골형성촉진용 합성펩타이드 또는 그의 무독성염과 제약상 또는 수의학상 허용가능한 액체 또는 고체 담체를 포함하는 약학조성물을 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 합성펩타이드 또는 그의 무독성염은 골다공증, 골관절염 및 골결손질환 치료를 위한 유효성분으로 작용한다.

또한, 본 발명은 제 1 항 또는 제 2 항의 골형성촉진용 합성펩타이드 또는 그의 무독성염과 배지 제조시 허용가능한 액체 또는 고체 담체를 포함하는 골아세포배지조성물을 제공한다.

본 발명은 다음과 같은 우수한 효과를 가진다.

먼저, 본 발명의 골형성촉진용 합성펩타이드는 골아세포가 분화될 때 골아세포의 분화를 촉진시켜 빠른 골형성을 유도하게 되므로 골아세포 분화 또는 골형성속도를 촉진시킬 필요가 있는 다양한 분야에서 응용될 수 있다.

또한, 본 발명의 골형성촉진용 합성 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약학조성물은 골다공증, 골관절염, 및/또는 골결손질환 치료시 기존의 치료물질에 비해 부작용이 없고 기존의 치료물질을 대체할 수 있을 만큼 우수한 약효 즉 골아세포 분화 촉진효과를 통한 빠른 골형성효과를 가질 뿐만 아니라, 생산단가가 상대적으로 낮으므로 경제성면에서도 우수한 효과를 가진다.

또한 본 발명의 골형성촉진용 합성펩타이드가 포함된 배지조성물은 골아세포분화 속도를 실험자가 조절할 수 있게 되므로 다양한 실험조건을 구현하여 실험할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어는 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어를 선택하였으나, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있는데 이 경우에는 단순한 용어의 명칭이 아닌 발명의 상세한 설명 부분에 기재되거나 사용된 의미를 고려하여 그 의미가 파악되어야 할 것이다.

이하, 첨부한 도면에 도시된 바람직한 실시예들을 참조하여 본 발명의 기술적 구성을 상세하게 설명한다.

그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수도 있다.

현재, 뼈 형태 발생 활성은 TGF(형질 전환 성장 인자)-β 수퍼패밀리에 속하는 뼈 형태 발생 인자 BMP에 대해서 보고되어 있다(Science 150, 893-897, 1965; Science 242; 1528-1534, 1988). 알려진 BMP종은 BMP-1 내지 BMP-14이다. 이 중, BMP-2 내지 BMP-14는 뼈 형태 발생 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. BMP-2 내지 BMP-14의 BMP는 여러 가지 뼈 기능 장애 및 뼈 질환의 치료적 처치에 효과적인 것으로 여겨지고 있지만, 이들은 자연계에 극소량으로 존재한다. 따라서, 이러한 처치에 이용되는 BMP-2 내지 BMP-14를 입수가능하게 다량으로 얻는 데는 재조합 단백질의 제조를 필요로 한다. 재조합 단백질의 제조는 일반적으로 저분자량 화합물에 비해 비용이 많이 소요된다. 다른 한편, 그의 단백질적 특성 때문에 물성 및 투여의 면에서 의약으로서는 많은 제약이 있다. 이러한 점들을 고려할 때, 상기 BMP 단백질과 동일한 활성을 갖는 저분자량 유기 화합물이 만일 존재한다면, 그것은 매우 유망한 의약이 될 것이다.

본 발명자들은 이러한 점에 착안하여 BMP-7에 존재하는 아미노산서열들을 연구한 결과 BMP-7에 존재하는 15개의 아미노산으로 이루어진 하기와 같은 서열을 갖는 펩타이드가 인간 BMP-7 (골형성 인자)의 발현을 유발시키는 활성을 가지고, 또한 인간 BMP-7과 동일한 효능을 가져서 매우 높은 유용성을 갖는 것을 발견하여 bone forming peptiede 2 (BFP 2)로 명명하였다.

<서열번호1>

Val-Glu-His-Asp-Lys-Glu-Phe-Phe-His-Pro-Arg-Tyr-His-His-Arg

상기 BFP 2는 BMP-7에서 유래하는 15개의 아미노산으로 이루어진 서열의 펩타이드로서, 공지된 펩타이드합성방법을 통해 인위적으로 합성이 가능하다.

또한, 후술하는 실험예들에 의해 명백해지겠지만 골아세포 분화배지를 사용 하여 골아세포(정확하게는 마우스 중간엽 줄기세포)의 분화를 유도하였을 때, 일반적인 골아세포 분화배지만을 이용하여 분화할 때보다 본 발명의 BFP 2를 처리하였을 때, 더 강하게 골아세포가 분화됨을 확인할 수 있었다.

따라서, 상기 BFP 2를 포함하는 본 발명의 BMP-7에 존재하는 15개의 아미노산으로 이루어진 골형성촉진용 합성펩타이드는 골아세포가 분화될 때 골아세포의 분화를 촉진시켜 분화능을 향상시키게 되므로 골형성 촉진효능을 가지고 있는 것을 알 수 있다.

이를 통해 본 발명의 골형성촉진용 합성펩타이드가 탁월한 골아세포 분화의 유도 활성을 나타내는 것을 알 수 있으므로 골다공증, 골관절염 또는 골결손질환 등을 포함하는 골질환으로 인해 골손실이 있는 경우, 본 발명의 합성펩타이드 또는 그의 무독성염을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 골결손 부위에 채워 넣거나 투여하게 되면 골다공증, 골결손질환 및/또는 골관절염을 치료할 수 있는 효능이 있다는 것을 알 수 있다.

이하에서는 본 발명의 BMP-7 유래 15개의 아미노산 서열을 갖는 골형성촉진용 합성펩타이드 중 바람직한 실시예로서 BFP 2의 골아세포 분화 유도 활성에 대해 실험예 및 도면을 참조하여 보다 구체적으로 살펴보기로 한다.

도 1 내지 도 3은 본 발명의 BFP 2의 아미노산 서열의 순서, BFP 2의 구조 그리고 BFP 2의 세포독성을 각각 나타낸 것이다.

이때, 도 1에 도시된 바와 같은 서열 정보 즉 서열번호1을 갖는 BFP 2는 각각 BMP-7의 전체 아미노산서열 중 일부와 동일한 것으로 공지된 펩타이드 합성방법 을 이용하여 하기 서열번호1과 같은 15개의 아미노산 서열을 갖도록 합성된 것이다.

<서열번호1>

Val-Glu-His-Asp-Lys-Glu-Phe-Phe-His-Pro-Arg-Tyr-His-His-Arg

(V-E-H-D-K-E-F-F-H-P-R-Y-H-H-R)

도 2에 도시된 바와 같이 상기 합성된 BFP 2의 구조를 상용프로그램을 사용하여 확인한 결과, 도 1에서와 같은 서열을 갖는 알파-헬릭스 구조를 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

또한 이때 합성된 BFP 2의 세포에 대한 독성을 조사하기 위하여 실험에 사용된 농도 범위내에서 세포독성 실험을 MTT방법을 이용하여 수행한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 세포독성이 나타나지 않음을 확인할 수 있었다.

실험예 1

BFP 2의 골아세포분화 활성을 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

1. 골아세포 및 골아세포분화배지의 준비

10% FBS가 첨가된 DMEM에 1 × 10⁴개의 중간엽 줄기세포(Balb/c mouse bone marrow stromal cell로부터 클론됨)가 들어가도록 분주한 후, 약 3일 동안 약 37℃의 온도를 유지하는 5%의 이산화탄소가 함유된 대기속에서 배양하여 본 실험에 사 용되는 골아세포로서 상기 중간엽 줄기세포가 준비되었다.

골아세포 분화 배지(osteogenic differentiation medium: 이하"ODM")는, 50㎍/㎖ 아스코르브산, 10^-8M 덱사메타손 및 10mM 베타-글리셀로포스페이트 등이 첨가된 DMEM으로 이루어진다.

2. 미네랄리제이션의 측정

상기 중간엽줄기세포가 골아세포로 분화가 이루어지면 칼슘이 축적 되는데, 이때 칼슘이온의 축적 정도는 골아세포의 분화정도를 의미하고, 칼슘이온의 축적정도는 알리자린 염색을 통하여 붉은색으로 염색이 되는 정도를 관찰하면 확인할 수 있는 점에 착안하여 알리자린 레드 염색을 통하여 미네랄리제이션을 측정하였다. 즉 골아세포로 분화가 촉진될수록 알리자린 레드에 의해 염색되는 부분이 많이 이루어지기 때문이다.

따라서 골아세포 분화배지에 알리자린 레드를 넣고 BFP 2를 처리한 후 알리자린 레드의 염색정도를 보고 골아세포 분화 정도를 확인할 수 있다.

보다 구체적으로 살펴보면, 상기 골아세포 분화 배지에 준비된 골아세포 즉 중간엽 줄기세포를 옮겨서 3일 동안 배양한 후, BFP 2를 0.1㎍/㎖, 1㎍/㎖, 2 ㎍/㎖씩 첨가하여 2일 동안 더 배양하였다.

그 후, 배양된 상기 중간엽 줄기세포를 얼음에 냉각시킨 70% 에탄올로 한 시간 동안 고정하고, 알리자린 레드-s(alinzarin red-s)용액으로 약 10분 동안 염색하여 칼슘의 침착정도로 무기질화를 확인하여 그 결과를 도 4에 나타내었다.

본 발명의 BMP-7로부터 유래된 골형성촉진용 합성펩타이드인 BFP2에 의한 골아세포분화를 통해 축적되는 미네랄리제이션을 측정하는 알리자린 레드 염색을 통하여 확인한 결과 사진인 도4로부터, 1㎍/㎖의 BFP 2가 들어간 세포에서 가장 강하게 염색되는 것을 확인할 수 있었고, BMP-7을 이용하여 골아세포 분화를 확인한 결과와 비교해 보면, 본 발명의 BFP 2보다 약하게 염색됨을 확인할 수 있었다. 따라서, BFP 2가 BMP-7에 비해 골아세포 분화를 촉진하는 것을 알 수 있다.

실험예 2

골아세포 특정 유전자인 알칼라인포스파타아제가 본 발명의 골형성촉진용 합성펩타이드 BFP 2에 의해 발현되는 정도를 측정하는 실험을 수행하였고 그 결과를 도 5에 도시하였다.

즉, 골아세포로 분화가 이루어지게 되면, 골아세포 특정 유전자가 발현이 나타나는데, 특히 역전사유전자증폭(RT-PCR)을 이용하여 골아세포 특정 유전자인 알칼리포스파타아제의 발현을 측정하였는데, 알칼라인포스파타아제가 1㎍/㎖ 농도에서 강하게 발현됨을 확인할 수 있었다.

실험예 3

본 발명의 BFP 2가 골아세포분화 활성에 어떤 영향을 주는지 확인하기 위해 골아세포 특정 유전자인 오스테오칼신, 알칼라인포스파타아제 및 렁스-2가 BFP 2에 의해 발현되는 정도를 항체를 이용하여 형광현미경 분석하고 그 결과사진을 도 6, 도 7, 도 8에 각각 나타내었다.

즉, 골아세포로 분화가 이루어지게 되면 골아세포 특정 단백질이 발현이 나타나는데, 이러한 단백질의 발현을 이들 단백질에 대한 항체를 세포에 반응시켜 결합한 정도를 형광현미경을 이용하여 확인한 결과, 골아 세포에서 분비되는 골기질 물질로 각각의 활성정도는 골아세포 증식의 판정요소로 그 농도가 증가하면 골아 세포의 성장 및 분화가 활발함을 알려주는 오스테오칼신의 경우 BFP 2를 1㎍/㎖ 첨가하였을 때 골아세포 분화배지(ODM)를 넣은 것과 BMMP-7을 넣는 것 보다 더 강하게 녹색(도면에서는 밝은 부분으로 표현됨)으로 발현됨을 확인할 수 있었다.

여기서 PI는 살아있는 세포의 핵을 염색을 하는 경우로 각각의 세포가 살아 있음을 확인할 수 있고, 목적 단백질인 오스테오칼신의 경우 녹색의 형광항체를 이용하여 세포에서 발현되는 것을 보이는 것이다. 그리고 merge는 세포의 핵이 염색된 것과 목적 단백질의 발현을 중첩시킴으로서 같은 세포에서 목적 단백질이 발현되는 것을 보이는 것이다.

알칼라인포스파타아제(alkaline phosphatase)는 골형성의 지표가 되는 효소로써 골아 세포의 분화 중기에 생성되는데, 알칼라인포스파타아제 역시 BFP 2 1㎍/㎖에서 발현이 강하게 나타남을 확인할 수 있었다.

렁스-2(Runx-2)는 골아세포에서 골아세포 특정 단백질을 생산하는데 중요한 작용을 하는 전사조절인자로서, 골아세포 분화에 중요한 역할을 수행한다. 이러한 렁스-2 역시 BFP 2의 1㎍/㎖에서 발현이 강하게 나타남을 확인할 수 있었다.

실험예 4

중간엽 줄기세포는 골, 연골, 지방조직, 근육, 건, 인대, 신경조직 및 혈관으로 분화될 수 있도록 다양한 표면 단백질을 포함하고 있다. 본 실험에서는 다양한 표면 단백질 중 상기 중간엽 줄기세포가 골아 세포로 분화되면서 나타나는 특정 표면 단백질 CD44, CD51, CD47, CD45의 발현정도를 FACS분석을 통해 측정하여 본 발명의 BFP 2가 어떠한 영향을 주는지 확인하였고 그 결과를 도 9에 나타내었다.

BFP 2에 의한 골아세포 분화에 관련된 세포표면마커의 발현을 FACS분석을 통하여 조사한 결과(회색화살표-ODM 단독; 검정색화살표-ODM+BFP 2)인 도 9로부터, 중간엽 줄기세포에서 발현되는 세포표면마커인 CD44가 BFP 2를 골아세포 분화배지에를 첨가하면 골아세포로 분화되는 과정 중에서 강하게 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 골아세포 분화배지와 BFP 2를 1㎍/㎖ 넣어 주었을때 CD44의 발현이 보다 강하게 나타내는 것을 확인하였다.

한편, 골아세포 분화에서 발현되는 CD51의 발현도 역시 골아세포 분화배지를 단독으로 넣었을 때보다 BFP 2를 함께 넣었을 때 더 강한 발현을 확인할 수 있었다.

CD45는 조혈계줄기세포의 표면인자로서 본 실험에 사용된 세포가 조혈계에서 유래하지 않음을 보여주기 위하여 사용하였다. 도 9에서 CD45의 발현이 없음을 확인할 수 있었고, 이는 본 실험에 사용한 세포가 조혈계 유래 줄기세포가 아님을 확인할 수 있다.

실험예 5

BFP 2에 의한 세포표면마커 CD44의 발현을 형광현미경을 통하여 관찰한 후 그 결과를 도 10에 나타내었다.

즉, 세포분화에서 세포가 살아있음을 확인하기 위하여 핵에 염색을 하여 파란색을 나타내는 DAPI 염색과 CD44에 결합하여 붉은색을 나타내는 CD44 항체를 이용하여 형광현미경하에서 관찰한 결과이다.

일단 핵이 파란색으로 염색되는 것을 관찰할 수 있었고, CD44의 염색이 붉게 나타나는 것을 관찰되었으며 이 염색을 겹쳐 확인한 결과, 세포에서 CD44가 발현된다는 것을 알 수 있었다. 그리고 골아세포 분화배지를 단독으로 처리한 것보다, 골아세포 분화배지에 BFP 2를 넣어 주었을 때 강하게 CD44가 발현됨을 알 수 있었다. 또한, BMP-7을 BFP 2와 같은 농도를 사용하여 형광현미경하에서 관찰하였는데, BFP 2 보다 약하게 염색되었음을 확인할 수 있었다.

실험예 6

BFP 2를 이용한 골아세포 분화에서 발현되는 골아세포 특정 효소인 알칼라인포스파타아제(ALP)와 칼슘의 농도를 상업적으로 판매하는 진단킷트를 이용하여 확인하고, 그 결과를 도 11에 도시하였다.

도 11로부터 BFP 2가 1㎍/㎖의 농도일 때 유의적인 증가를 보이는 것을 관찰할 수 있었다.

실험예 7

중간엽줄기세포가 골아세포로 분화가 이루어지면서 세포의 이동을 확인하기 위하여 BFP 2 각각에 대해 화학주성(chemotaxis)실험법을 수행하고 그 결과그래프를 도 12에 나타내었다.

즉 중간엽줄기세포 각각의 분화배지에 분화인자(BMP-7, BFP 2)를 처리한 후 세포의 이동을 확인한 결과, 도 12에 도시된 바와 같이 BFP 2가 BMP-7 보다 더 많이 세포가 이동됨을 관찰하였다. 이 결과를 통해 본 발명의 BFP 2가 골결손 등의 질환에서 골아세포의 이동을 상처부위로 빠르게 할 수 있다는 것을 확인할 수 있다.

실험예 8

BFP 2가 생체내의 골세포 형성을 촉진하는지 여부를 확인하기 위하여, 마우스를 이용하여 동물실험을 수행하였다(n=6). 먼저 중간엽줄기세포의 분화를 유도하기 위하여 ODM을 3일에 걸쳐 두 번 처리하고, 두 번째 ODM을 첨가할 때 BMP-7 및 BFP 2를 처리한 후, 24시간이 지난 후에 세포를 수집하여 같은 수의 세포수를 측정한 후 마우스 등 부분에 콜라겐을 지지체로 이용하여 이식하였다. 이식 후 4주와 8주에 X-ray를 이용하여 골 형성을 비교하였고 그 결과사진을 도 13에 나타내었다. 특히, 8주차의 조직을 절취하여 디칼시피케이션을 한 후, hematoxylin & eosin 염색을 통하여 골 조직의 형성을 관찰하고, 그 결과 사진을 도 14에 나타내었다.

도 13에 도시된 바와 같이, 4주차에 BFP 2의 처리부위에서 골이 형성되는 것 을 X-ray 상에서 관찰할 수 있었다. 그리고 8주차 결과사진은 골형성이 BFP 2의 처리부위에서 BMP-7의 처리부위 보다 더욱 강하게 이루어짐을 보여주고 있다.

또한, 도 14에 도시된 바와 같이, 대조군인 BMP7를 처리한 결과와 비교하여 볼 때 본 발명의 골형성촉진용펩타이드인 BFP 2에 의한 골 형성 또한 매우 잘 이루어졌음을 확인할 수 있다.

이러한 실험결과들로부터 본 발명의 골형성촉진용 합성펩타이드인 BFP 2가 종래에 골아세포분화를 촉진하는 것으로 알려진 BMP-7보다 더 골아세포 분화 촉진에 중요한 영향을 미치게 되므로 BMP-7과 동일하거나 그 이상의 골형성 강도를 가지고 더 넓은 범위에서 빠른 골형성을 유도할 수 있는 것을 분명히 알 수 있다.

따라서, 본 발명은 골형성촉진용 합성펩타이드 또는 그의 무독성염과 제약상 또는 수의학상 허용가능한 액체 또는 고체 담체를 포함하는 약학조성물을 제공할 수 있다. 여기서, 제약상 또는 수의학상 허용가능한 액체 또는 고체 담체는 제한되지 않고 공지된 것을 모두 사용할 수 있으므로 상세한 설명은 생략하기로 한다.

특히, BFP 2를 생체에 투여했을 때 골형성이 촉진되는 것을 보여주는 실험예 8의 결과는 BFP 2를 포함하는 본 발명의 골형성촉진용 합성펩타이드 또는 그의 무독성염이 유효성분으로 포함된 약학조성물을 골다공증 및/또는 골관절염이 발생한 골수부위에 투여하게 되면 골수의 골아세포 분화를 촉진하여 골형성을 촉진할 수 있음을 분명히 보여준다. 그 결과 본 발명의 약학조성물은 유효한 골다공증 및/또 는 골관절염치료제로 작용할 수 있다.

또한, 동일하게 BFP 2을 포함하는 본 발명의 골형성촉진용 합성펩타이드 또는 그의 무독성염이 유효성분으로 포함된 약학조성물을 골결손질환의 골결손 부위에 채워넣거나 투여하게 되면 골형성촉진을 통해 골수복을 효과적으로 수행할 수 있다.

한편, 구체적인 실시예로 제시하지는 않지만 BFP 2를 포함하는 본 발명의 골형성촉진용 합성펩타이드를 골아세포분화배지조성물에 첨가하게 되면 골아세포를 이용하는 실험시 실험자가 실험속도를 조절할 수 있어 용이하게 실험을 수행할 수 있는 것은 당연하다할 것이다.

본 발명은 이상에서 살펴본 바와 같이 바람직한 실시 예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시 예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.

도 1은 본 발명의 골형성촉진용 합성펩타이드인 BFP 2의 아미노산서열정보이다.

도 2는 BFP 2의 구조도이다.

도 3은 BFP 2의 세포독성결과 그래프이다.

도 4는 BFP 2에 의한 골아세포분화를 통해 축적되는 미네랄리제이션을 측정하는 알리자린 레드 염색을 통하여 확인한 결과 사진이다.

도 5는 BFP 2에 의한 골아세포 특정 유전자 알칼라인포스파타아제(ALP)의 발현을 확인한 사진이다.

도 6은 BFP 2에 의한 골아세포 특정 유전자인 오스테오칼신의 발현을 형광현미경을 이용하여 측정한 결과사진이다.

도 7은 BFP 2에 의한 골아세포 특정 유전자인 알칼라인포스파타아제(ALP)의 발현을 형광현미경을 이용하여 측정한 결과사진이다.

도 8은 BFP 2에 의한 골아세포 특정 유전자인 렁스-2의 발현을 형광현미경을 이용하여 측정한 결과사진이다.

도 9는 BFP 2에 의한 골아세포 분화에 관련된 세포표면마커의 발현을 FACS분석을 통하여 조사한 결과이다(회색화살표-ODM 단독; 검정색화살표-ODM+합성펩타이드).

도 10은 BFP 2에 의한 세포표면마커 CD44의 발현을 형광현미경을 통하여 관찰한 결과사진이다.

도 11은 BFP 2에 의한 골아세포 특정 효소인 알칼라인 포스파타아제(ALP)와 칼슘의 농도를 상업적으로 판매하는 진단킷트를 이용하여 확인한 결과그래프이다.

도 12는 중간엽줄기세포가 골아세포로 분화가 이루어지면서 세포의 이동을 확인하기 위하여 BFP 2에 대해 화학주성(chemotaxis)실험법을 수행한 결과그래프이다.

도 13은 BFP 2의 골세포 형성을 확인하기 위하여, 마우스를 이용하여 동물실험을 수행한 결과사진이다.

도 14는 BFP 2의 골세포 형성을 확인하기 위한 동물 실험에서 8주차의 조직을 절취하여 hematoxylin & eosin 염색을 통하여 골 조직의 형성을 관찰한 결과 사진이다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY et al <120> OSTEOGENIC SYNTHETIC PEPTIDES, PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS COMPRISING THE SAME, AND MEDIUM CONTAINING THE SAME <130> DPP-2009-0115-KR <150> KR10-2008-0058551 <151> 2008-06-20 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bone forming peptide 2(BFP2) is derived from BMP-7 <400> 1 Val Glu His Asp Lys Glu Phe Phe His Pro Arg Tyr His His Arg 1 5 10 15

Claims

BMP-7에 존재하는 15개의 아미노산 서열로 이루어져 골아세포분화 또는 골형성을 촉진하는 골형성촉진용 합성펩타이드로서,

상기 펩타이드는 하기 서열번호 1인 폴리펩타이드 또는 그의 상동체인 것을 특징으로 하는 골형성촉진용 합성펩타이드.

<서열번호1>

Val-Glu-His-Asp-Lys-Glu-Phe-Phe-His-Pro-Arg-Tyr-His-His-Arg
제 1 항에 있어서,

골아세포분화 또는 골형성을 촉진하기 위한 상기 합성 펩타이드의 첨가함량은 0.1 내지 2 ㎍/㎖인 것을 특징으로 하는 골형성촉진용 합성펩타이드.
제 1 항 또는 제 2 항의 골형성촉진용 합성펩타이드 또는 그의 무독성염과 제약상 또는 수의학상 허용가능한 액체 또는 고체 담체를 포함하는 약학조성물.
제 4 항에 있어서,

상기 합성펩타이드 또는 그의 무독성염은 골다공증, 골관절염 및 골결손질환 치료를 위한 유효성분으로 작용하는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
제 1 항 또는 제 2 항 중 어느 한 항의 골형성촉진용 합성펩타이드 또는 그의 무독성염과 배지 제조시 허용가능한 액체 또는 고체 담체를 포함하는 골아세포배지조성물.