KR20090125004A

KR20090125004A - 알도헥소오스 에피머라아제 및 이를 이용한 알도헥소오스 에피머의 효소적 제조 방법

Info

Publication number: KR20090125004A
Application number: KR1020090047618A
Authority: KR
Inventors: 김필; 엄태국
Original assignee: 주식회사 삼양제넥스
Priority date: 2008-05-30
Filing date: 2009-05-29
Publication date: 2009-12-03
Also published as: WO2009145576A2; KR101057873B1; WO2009145576A3

Abstract

본 발명은 알도헥소오스 에피머라아제, 이를 이용한 알도헥소오스 에피머의 효소적 제조 방법, 및 알도헥소오스 에피머라아제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

알도헥소오스, 알도헥소오스 에피머라아제, 알도헥소오스 에피머, 글루코스, 갈락토스, 분자진화

Description

알도헥소오스 에피머라아제 및 이를 이용한 알도헥소오스 에피머의 효소적 제조 방법{Aldohexose epimerase and method for the enzymatic preparation of an aldohexose epimer using the same}

본 발명은 알도헥소오스 에피머라아제, 이를 이용한 알도헥소오스 에피머의 효소적 제조 방법, 및 알도헥소오스 에피머라아제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 야생형 UDP-갈락토스 4-에피머라아제의 방향성 분자 진화에 의하여 얻어진 변이 알도헥소오스 에피머라아제와 같은 에피머라아제로 글루코스와 같은 알도헥소오스를 처리하여 알도헥소오스 에피머를 효소적으로 제조하는 방법 및 알도헥소오스 에피머라아제의 활성 측정에 의한 에피머라아제 효소의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

최근 국제유가의 급격한 상승 및 유류 자원의 고갈에 따라 유한한 화석원료를 보다 저렴하고 무한한 생물에너지로 대체사용하고자 하는 노력이 나타나고 있다. 특히 유럽을 중심으로 바이오디젤, 바이오에탄올에 대한 수요급증과 중국경제의 팽창에 따른 원재료 품귀현상, 전략적 비축유의 최고 30%를 바이오에탄올로 전환하려는 미국의 정책, 식량 및 에너지의 무기화 경쟁 등 복합적 원인으로 인해 전 반적인 곡물가격이 동반 상승하는 추세이다. 따라서, 글루코스 등 값싼 원재료로부터 갈락토스, 타가토스 등 상대적으로 부가가치가 높은 단당류를 생산할 수 있는 기술이 요구된다.

당류 전환 기술의 하나로서 현재 다양한 종류의 미생물로부터 유래된 당의 이성화 효소가 산업적으로 이용되기 위해 활발하게 연구되고 있다. 예를 들면, 고과당 시럽의 제조에 주로 이용되는 자일로스 이성화효소와 기능성 대체 감미료로 대두되고 있는 타가토스의 생산이 가능한 아라비노스 이성화효소가 대표적이다. 이와 같은 효소의 산업적 잠재력은 본래의 기질인 자일로스와 아라비노스 외에 다양한 종류의 당의 상호전환반응을 촉매할 수 있다는 것이다. 그러나, 오랜 기간에 걸친 자연 진화의 결과로서 효소가 갖는 일반적인 특성, 즉 제한된 기질특이성과 친화도, 최적조건 등은 효소의 산업적 활용이라는 측면에서 반드시 극복해야 할 문제점으로 알려져 있다.

천연에 존재하는 알도헥소오스 에피머라아제의 예로 대장균 유래 핵산 활성형 기질의 에피머화 효소인 UDP-갈락토스-4-에피머라아제(EC 5.1.3.2)를 들 수 있다. 상기 효소의 경우, 효소 활성에 직접 관여하는 촉매 부위는 UDP를 인식하는 공간을 가져서, UDP-갈락토스 또는 UDP-글루코스를 기질로 인식하고, 인식된 기질을 UDP-글루코스 또는 UDP-갈락토스로 전환시키는 에피머화 반응을 촉매한다. 이와 같은 천연의 알도헥소오스 에피머라아제는 UDP에 의해 활성화된 형태의 알도헥소오스인 UDP-알도헥소오스 만을 기질로 이용하므로, 이를 이용하여 알도헥소오스를 생산하기 위해서는 기질인 알도헥소오스를 UDP-활성형으로 전환시키는 단계와 에피머화 에 의한 생성물인 UDP-알도헥소오스를 다시 알도헥소오스로 전환시키는 단계가 부가적으로 요구된다는 단점이 있다.

따라서, UDP-활성형이 아닌 알도헥소오스 자체를 기질로 인식하여 에피머 알도헥소오스를 생산하는 에피머라아제 효소가 개발된다면, 상기한 부가적 단계를 획기적으로 줄임으로써 효율적이고 저렴하게 식품 및 의약품 원료로 사용되는 알오헥소오스를 얻을 수 있게 된다. 그러나, 현재까지 알도헥소오스 자체를 에피머화할 수 있는 에피머라아제 효소가 개발되지 못하고 있으며, 특히 글루코스로부터 고부가가치 당류인 타가토스의 원료가 되는 갈락토스 등을 효소적으로 제조하는 방법은 전혀 알려져 있지 않다.

본 발명은 글루코스와 같은 값싼 알도헥소오스 원료를 UDP-활성형 등으로 전환하는 단계를 거치지 않고 원료 자체를 에피머라아제 효소로 처리하여 갈락토스, 타가토스 등 상대적으로 부가가치가 높은 단당류로 전환할 수 있는 간단한 알도헥소오스 에피머의 효소적 제조 방법을 제공하기 위한 것이다.

또한, 본 발명은 UDP-갈락토스 4-에피머라아제를 방향성 분자 진화시킴으로써, UDP-활성형이 아닌 글루코스와 같은 알도헥소오스 자체를 기질로 인식하고 기질의 에피머화에 의해 보다 유용성이 높은 그의 에피머로 전환시킬 수 있는 신규한 알도헥소오스 에피머라아제를 제공하기 위한 것이다.

또한, 본 발명은 알도헥소오스 에피머라아제의 스크리닝 방법 및 이로부터 선별된 알도헥소오스 에피머라아제를 제공하기 위한 것이다.

본 명세서에서, "UDP-갈락토스 4-에피머라아제"는 UDP-갈락토스 또는 UDP-글루코스를 기질로 인식하여, 이들 간의 에피머화를 촉매하는 효소를 지칭하는 것으로 해석된다.

본 명세서에서, "알도헥소오스"는 글루코스, 알로스, 알트로스, 만노스, 굴로스, 이도스, 갈락토스, 탈로스와 같이 천연적으로 존재하거나 또는 합성된 모든 D-알도헥소오스 또는 L-알도헥소오스를 포함하는 것으로 해석된다.

본 명세서에서, "알도헥소오스 에피머라아제"는 글루코스, 알로스, 알트로 스, 만노스, 굴로스, 이도스, 갈락토스, 탈로스와 같은 알도헥소오스를 기질로 인식하여 임의의 탄소 위치에서 에피머화에 의해 그의 에피머형 알도헥소오스로 전환시킬 수 있는 효소로서 변이된 것 또는 천연적으로 존재하는 효소를 모두 포함하며, 알도헥소오스 3-에피머라아제, 알도헥소오스 4-에피머라아제 등을 포함하는 것으로 해석된다. 알도헥소오스 에피머라아제의 기질은 D-알도헥소오스 또는 L-알도헥소오스일 수 있다.

본 발명의 한 면은 알도헥소오스를 에피머라아제 효소로 처리하여 에피머화시킴으로써 알도헥소오스 에피머를 얻는 단계를 포함하는 알도헥소오스 에피머의 효소적 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 따르면, 에피머라아제 효소로 처리되는 알도헥소오스 기질은 글루코스, 알로스, 알트로스, 만노스, 굴로스, 이도스, 갈락토스 및 탈로스로 구성된 군으로부터 선택되는 D-알도헥소오스 또는 L-알도헥소오스이며, 바람직하기는 글루코스, 가장 바람직하기는 D-글루코스인 것이다.

본 발명에 따르면, 글루코스와 같은 알도헥소오스를 UDP-활성형으로 전환하지 않고 간단한 에피머라아제 효소 처리 공정에 의하여 갈락토스와 같은 고부가가치 단당류를 제조할 수 있다.

본 발명에 따르면, 알도헥소오스를 에피머라아제 효소로 처리하여 C-3 에피머화 또는 C-4 에피머화, 바람직하기는 C-4 에피머화시켜 알도헥소오스 에피머를 제조할 수 있다.

알도헥소오스 에피머의 효소적 제조 방법에 있어서, 에피머라아제 효소 처리 는 pH 7 내지 10 및 온도 30 내지 50℃, 바람직하게는 pH 8 내지 10 및 온도 35 내지 40℃에서 수행되며, 가장 바람직하게는 pH 8.6 및 온도 37℃에서 수행되는 것이다. 효소 처리시 pH가 7 보다 낮거나 10 보다 높으면 에피머라아제의 효소 변성이 유발되어 효소 활성이 낮아질 수 있다. 또한, 온도가 30℃보다 낮으면 효소의 활성도가 너무 낮아 공정이 비효율적인 문제가 있고, 50℃보다 높으면 효소의 단백질 구조가 급격히 변하여 효소활성을 거의 나타내지 못하는 문제가 있을 수 있다.

본 발명에 따른 에피머라아제 효소는 알도헥소오스를 그의 에피머로 전환할 수 있는 효소라면 특별히 제한되지 않으며, 천연적으로 존재하는 효소 또는 방향성 분자 진화에 의하여 변이된 효소를 모두 포함한다. 바람직하기는, 야생형 UDP-갈락토스 4-에피머라아제의 방향성 분자 진화에 의하여 얻어진 알도헥소오스 에피머라아제를 포함한다.

본 발명의 다른 한 면은 알도헥소오스의 에피머화, 바람직하기는 4번 탄소 위치에서 에피머화를 수행하는 알도헥소오스 에피머라아제를 제공하는 것이다.

본 발명에 따른 알도헥소오스 에피머라아제는 알도헥소오스의 에피머화를 수행하는 효소라면 특별히 제한되지 않으며, 천연적으로 존재하는 효소 또는 방향성 분자 진화에 의하여 변이된 효소를 포함한다. 바람직하기는, 야생형 UDP-갈락토스 4-에피머라아제의 방향성 분자 진화에 의하여 얻어진 알도헥소오스 에피머라아제, 보다 바람직하기는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 알도헥소오스 에피머라아제를 포함한다.

본 발명에 있어서, 야생형 UDP-갈락토스 4-에피머라아제의 방향성 분자 진화 방법은 특별히 제한되지는 않으며, 예를 들어 변이 유발 PCR(error-prone PCR), 화학물질 또는 UV와 같은 돌연변이 유발 물질로의 처리, 돌연변이 유발 숙주 세포의 이용, 또는 DNA 셔플링에 의한 것일 수 있다.

본 발명의 다른 한 면은 (a) 관심있는 미생물을 배양하고 용해시켜 미생물 세포 용해액을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 세포 용해액을 글루코스, NAD⁺, 및 β-갈락토스 디히드로게나아제를 포함하는 반응액과 반응시킨 후 생성된 NADH의 양을 측정하고, 이를 야생형 UDP-갈락토스 4-에피머라아제를 갖는 대조군 세포 용해액에 의해 생성된 NADH의 양과 비교하여 알도헥소오스 에피머라아제 활성을 갖는 미생물을 선발하고 이로부터 알도헥소오스 에피머라아제를 얻는 단계를 포함하는 알도헥소오스 에피머라아제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 알도헥소오스 에피머라아제의 스크리닝 방법에서, 단계 (a)는 관심있는 미생물의 세포 용해액을 수득하는 단계이다. 여기서 관심있는 미생물은 알도헥소오스 에피머라아제 활성을 가질 것으로 기대되는 미생물이라면 특별히 제한되지 않으며, 본 발명에 따라 변이된 UDP-갈락토스 4-에피머라아제 유전자가 도입된 미생물 또는 UDP-갈락토스 4-에피머라아제 유전자를 갖는 미생물을 변이시켜 얻어진 미생물일 수 있다. 변이된 UDP-갈락토스 4-에피머라아제를 코딩하는 유전자는 야생형 UDP-갈락토스 4-에피머라아제 유전자를 인공 돌연변이시켜 수득되는 것 또는 자연 돌연변이의 결과로 수득된 것일 수도 있다. 예를 들면, 야생형 UDP-갈락토스 4-에피머라아제 유전자를 주형으로 하여 변이 유발 PCR(error-prone PCR) 을 수행하거나 화학물질 또는 UV와 같은 돌연변이 유발 물질로 처리하거나 또는 DNA 셔플링(shuffling) 등에 의해 변이된 UDP-갈락토스 4-에피머라아제 유전자를 수득할 수 있다. 또한, 상기 변이된 UDP-갈락토스 4-에피머라아제 유전자는 인 비트로(in vitro)에서 수득된 후 형질전환 등의 통상적인 방법에 의해 미생물에 도입되거나 또는 야생형 유전자를 가진 미생물에 돌연변이 물질 처리 또는 상동 재조합과 같은 기법을 적용하여 미생물 세포 내에서 수득되는 것일 수 있다.

또한, 상기 변이된 UDP-갈락토스 4-에피머라아제 유전자는 단일 또는 복수 개의 변이 유전자의 형태로 미생물로 형질전환될 수 있다. 복수 개의 변이 유전자가 복수의 미생물에 도입되는 경우, 복수 개의 상이한 변이 유전자를 포함하는 미생물 집단이 형성될 수 있다. 상기 미생물은 원핵 세포 및 진핵 세포를 포함하며, 바람직하게는 원핵 세포이다. 상기 미생물의 일 예는 대장균이다.

본 발명의 한 구체예에서, 스크리닝 대상 미생물은 야생형 UDP-갈락토스 4-에피머라아제를 코딩하는 유전자를 주형으로 변이-유발 PCR을 수행하여 수득된 UDP-갈락토스 4-에피머라아제 변이체 유전자 라이브러리로 형질전환된 미생물, 바람직하게는 대장균일 수 있다.

이 때, UDP-갈락토스 에피머라아제 변이체 라이브러리는 야생형 UDP-갈락토스 4-에피머라아제의 변이체들로 구성된다. 상기 야생형 UDP-갈락토스 4-에피머라아제는 대장균 K-12 W3110으로부터 유래된 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.

야생형 UDP-갈락토스 4-에피머라아제(EC 5.1.3.2)는 도 1에 도시된 바와 같 이 활성 부위에 UDP를 수용하는 부분을 가지지만, 본 발명에 따라 방향성 분자진화에 의해 선별된 변이체는 UDP를 인식하는 부위를 갖지 않고 글루코스를 기질로 인식하여 이를 갈락토스로 전환시킨다.

본 발명에 따른 알도헥소오스 에피머라아제의 스크리닝 방법에서, 단계 (b)는 단계 (a)에서 얻어진 미생물 세포 용해액을 글루코스, NAD⁺, 및 β-갈락토스 디히드로게나아제를 포함하는 반응액에 첨가하여 반응시킨 후 생성된 NADH의 양을 측정하고 이를 야생형 UDP-갈락토스 4-에피머라아제를 갖는 대조군 세포의 용해액에 의한 반응에서 생성된 NADH의 양과 비교하여 알도헥소오스 4-에피머라아제 활성을 갖는 미생물을 선발하는 것이다. 상기 반응에서 스크리닝 대상 미생물 세포로부터 측정된 NADH의 양이 대조군 세포에 비해 증가된 경우, 그 미생물 시료는 알도헥소오스 에피머라아제 활성을 갖는 것으로 판단된다.

본 발명에 따르면, 알도헥소오스 에피머라아제의 활성은 글루코스, NAD⁺, 및 β-갈락토스 디히드로게나아제를 포함하는 반응액에 세포 용해액을 첨가하여, 글루코스의 갈락토스로의 전환 및 뒤이은 갈락토스의 탈수소화를 통해 생성된 NADH의 양을 측정하는 것으로 평가된다. 상기 NADH의 양은 340 nm에서의 흡광도를 통하여 측정될 수 있다. 또한, 알도헥소오스 에피머라아제의 공급원(source)으로 사용되는 세포 용해액의 제조 전 세포 농도를 600 nm에서의 흡광도 측정으로 결정하여, 단위 세포당 흡광도를 산출하여 비활성(specific activity)을 추정할 수 있다.

본 발명에 따른 방법에서, 미생물 세포로부터 측정된 알도헥소오스 에피머라 아제 활성을 야생형 UDP-갈락토스 4-에피머라아제를 갖는 대조군 미생물 세포로부터 측정된 알도헥소오스 에피머라아제 활성과 비교하여 대조군보다 높은 활성을 보이는 미생물 세포는 알도헥소오스 에피머라아제로 진화된 UDP-갈락토스 4-에피머라아제의 변이체를 갖는 것으로 선별된다. 이 때 알도헥소오스 에피머라아제 활성을 갖는 것으로 선별된 미생물을 배양하여 알도헥소오스 에피머라아제를 정제하거나, 또는 배양된 미생물 또는 배양된 미생물의 용해액을 직접 알도헥소오스 에피머라아제의 공급원으로 이용할 수도 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 수득된 알도헥소오스 에피머라아제를 제공한다.

본 발명의 한 구체예에서, 알도헥소오스 에피머라아제는 글루코스에 대해 특히 높은 기질 특이성을 갖는 글루코스 에피머라아제, 가장 바람직하기는 글루코스 4-에피머라아제일 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 알도헥소오스 에피머라아제는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 알도헥소오스 에피머라아제는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다.

서열번호 3으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 알도헥소오스 에피머라아제는 야생형 대장균 균주의 UDP-갈락토스 4-에피머라아제의 아미노산 서열(서열번호 1) 대비 1번 Met의 Val으로의 변이 및 313번 Arg의 Gly로의 변이를 포함하며, 서열번호 4의 염기 서열은 야생형 대장균 균주의 UDP-갈락토스 4 에피머라아제를 코딩하는 유전자의 염기 서열(서열번호 2) 대비 1번 A의 G로의 치환 및 937번 C의 G로 의 치환을 포함한다.

본 발명의 한 구체예에서, 알도헥소오스 에피머라아제는 UDP-갈락토스 4-에피머라아제의 분자 진화에 의해 수득되며, 글루코스로부터 갈락토스의 생성으로 평가된 활성이 야생형 UDP-갈락토스 4 에피머라아제의 0.02 mmole/분. mg 단백질 미만에 비해 높은 0.1 내지 1 mmole/분.mg 단백질인 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 알도헥소오스 에피머라아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 포함하는 DNA 작제물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파아지(phage) 입자, 또는 잠재적인 게놈 삽입물일 수 있다. 형질전환에 의해 적당한 숙주 내로 도입되면, 벡터는 숙주 게놈과 독립적으로 복제하고 기능하거나, 또는 게놈에 통합될 수 있다.

본 발명은 또한 알도헥소오스 에피머라아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 세균, 효모 및 균류(fungi)로 구성된 군으로부터 선택된 숙주 세포에 도입하여 수득되는 형질전환 미생물을 제공한다. 본 발명에서, 형질전환 미생물은 바람직하게는 형질전환 대장균일 수 있다.

본 발명은 또한, 알도헥소오스 에피머라아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 미생물을 배양하고, 상기 배양된 미생물 또는 배양액으로부터 알도헥소오스 에피머라아제를 분리하여 알도헥소오스 에피머라아제를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 스크리닝 방법에 의해 선별된 알도헥소오스 에피머라아제 또는 천연적으로 존재하는 효소 중 알도헥소오스를 에피머화할 수 있는 효소를 이용하여 알도헥소오스로부터 에피머화에 의해 그의 에피머형 알도헥소오스를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 알도헥소오스 생산방법에서, 알도헥소오스 에피머라아제는 분자 진화에 의해 알도헥소오스 에피머라아제 활성을 갖는 것으로 선별된 균주 배양으로부터 정제에 의해 분리된 형태 또는 상기 배양된 균주 또는 균주의 용해액의 형태일 수 있다.

본 발명에 따른 알도헥소오스 생산방법에서, 알도헥소오스 에피머라아제는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 알도헥소오스 생산방법에서, 알도헥소오스 에피머라아제에 의한 에피머화 반응은 pH 7 내지 10 및 온도 30 내지 50℃, 바람직하게는 pH 8 내지 10 및 온도 35 내지 40℃에서 수행되며, 가장 바람직하게는 pH 8.6 및 온도 37℃에서 수행될 수 있다.

일반적으로 갈락토스는 우유의 성분인 고가의 원료, 유당을 분해하여 제조된다. 이론적으로는 글루코스에 UDP를 붙여 UDP-갈락토스 에피머라아제를 이용하여 효소적으로 UDP-갈락토스를 만들고, UDP를 제거하는 방법으로 제조하는 것이 가능하다. 그러나, 이 방법은 UDP를 붙이고 다시 떼는 과정이 매우 번거롭고 고가의 UDP 사용이 공정비용을 증가시켜 현실적으로 실현하기 힘든 단점이 있다. 이와 같 이 알도헥소오스의 제조방법은 고가의 원료를 사용하거나 천연에 존재하는 효소가 인식할 수 있는 특정 변이형을 얻어야 하는 등 공정이 복잡하다는 문제가 있다. 따라서, 본 발명에서는 저렴한 알도헥소오스로부터 고부가가치의 에피머형 알도헥소오스를 생산하는 경제적인 방법, 예를 들어 글루코스로부터 갈락토스를 생산할 수 있는 효소적 방법을 제공함으로써, 저렴한 비용으로 고부가가치 당을 효율적으로 생산할 수 있게 하므로 산업적 유용성을 증대시키는 효과를 제공한다.

또한, 본 발명은 에피머형 알도헥소오스의 효소적 제법에 유용하게 사용될 수 있는 에피머라아제로서, 방향성 분자 진화에 의하여 변이된 알도헥소오스 에피머라아제를 제공한다. 또한, 본 발명은 알도헥소오스 에피머라아제를 스크리닝하는 방법을 제공하여, 산업적으로 유용한 알도헥소오스 에피머라아제를 효율적으로 선별할 수 있도록 한다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

실시예 1. UDP-갈락토스 4-에피머라아제(EC 5.1.3.2) 유전자의 변이체 라이브러리의 제조

대장균 K-12 W3110의 UDP-갈락토스 4-에피머라아제를 코딩하는 유전자 galE(서열번호 2)를 주형으로 서열번호 5 및 6의 프라이머 및 Random mutagenesis 키트(CloneTech Co.)를 이용하여 변이-유발 PCR을 수행하여 약 2.5 돌연변이/kb의 빈도로 돌연변이가 유도된 galE 유전자를 증폭시켰다. PCR 반응은 95℃에서 1분의 변성, 60℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 1분의 신장으로 구성된 사이클을 25회 수행하였다. 상기 PCR 산물을 제한효소 NcoI 및 XbaI으로 처리하고 이를 동일한 제한효소로 처리한 pTrc99A(GenBank U13872, AP Biotech. Co.)에 라이게이션시켜 재조합 벡터를 제조하였다.

상기 재조합 벡터를 형질전환을 위해 준비된 적격(competent) 대장균 DH5α와 혼합한 후, 전기천공장치(electroporator)(Gene Pulser, Bio-Rad)로 2.5 kV의 전압 하에 5초간 전류를 인가하여 상기 벡터가 도입된 형질전환 대장균을 제조하고 암피실린 20㎍/ml를 포함하는 LB 배지에 도말하여 형질전환된 대장균을 선별하였다. 이에 의해, 상기 재조합 벡터를 대장균 DH5α에 도입하여, 변이된 UDP-갈락토스 4-에피머라아제 유전자의 변이체로 구성된 유전자 라이브러리를 제조하였다.

실시예 2. 알도헥소오스 4-에피머라아제의 스크리닝

본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 제조된 UDP-갈락토스 4-에피머라아제 변이체 라이브러리로부터 알도헥소오스 4-에피머라아제를 탐색하기 위해 알도헥소오스 4-에피머라아제의 활성을 측정하여 스크리닝하였다.

알도헥소오스 4-에피머라아제 활성의 측정

실시예 1에서 제조된 라이브러리의 대장균 DH5α를 암피실린(20 ㎍/mL)을 포함하는 LB(Luria Bertani) 평판 배지에 도말하고 37℃에서 16시간 동안 배양하여 콜로니를 수득하였다. 수득된 콜로니를 마스터 플레이트(master plate)로 옮긴 후 하기와 같이 효소활성의 측정을 위해 이용하였다.

먼저, 96 웰 플레이트의 각 웰 당 암피실린 20 ㎍/mL 및 IPTG(Isopropyl-thiogalactoside) 0.1 mM을 포함하는 LB 배지를 50㎕ 첨가하고 각 콜로니를 접종하고 37℃ 인큐베이터에서 3시간 동안 배양한 후 600 nm에서 흡광도(A1)를 측정하였다. 그 후, 세포 용해 완충액(Triton-X 100 0.05 mM)을 10㎕ 첨가하고 37℃에서 15 내지 20분간 정치시켰다. 그 후, 완충액 A(10 mM 글루코스 20㎕ + 0.3 mM NAD⁺ 20㎕ + β-갈락토스 디히드로게나아제(0.35U) 1㎕ + Tris-HCl(50 mM, pH 8.6) 109㎕) 150 ㎕를 첨가한 후 340 nm에서 흡광도(A2)를 측정하였다. 상기 반응액을 37℃에서 20분간 반응시킨 후 다시 340 nm에서 흡광도(A3)를 측정하고, 이로부터 알도헥소오스 4-에피머라아제의 단위 시간당 세포당 활성을 (A3-A2)/A1/20분으로 계산하였다.

940개의 콜로니를 대상으로 상기와 같이 알도헥소오스 4-에피머라아제 활성을 측정하고, 이를 야생형 galE를 포함하는 대장균 DH5α로 구성된 대조군으로부터 수득된 활성과 비교하여 대조군보다 높은 활성을 보이는 클론을 선별하였다. 대조군인 야생형 galE에 의한 글루코스로부터 갈락토스로의 에피머화 반응의 활성, 즉, 알도헥소오스 4-에피머라아제의 활성은 0.02 mmole/분.mg 단백질 이하였고, 변이체 라이브러리에서 대조군보다 높은 활성을 보이는 32개의 클론을 선별하였다. 상기 선별된 클론에 의한 가장 높은 활성은 1 mmole 갈락토스/분.mg 단백질이었다.

실시예 3. 방향성 분자 진화에 의해 수득된 알도헥소오스 4-에피머라아제에 의한 글루코스의 갈락토스로의 전환

실시예 2에서 선별된 콜로니를 용해 완충액(Triton-X100 0.05mM)에 현탁시켜 정제되지 않은 효소를 포함하는 세포 용해액을 수득하였다. 상기 세포 용해액을 Tris-HCl(pH 8.6)에 담긴 30 mM 글루코스 용액에 10 %(v/v) 첨가하여 준비된 반응액을 1mL 용량의 바이알에 넣고 37℃에서 30분간 유지시켰다. 그 후, 상기 바이알을 얼음에 넣어 반응을 중단시켰다. 상기 반응액 10㎕를 시료로 Aminex-87P 컬럼(Bio-Rad)과 굴절률(RI) 검출기를 장착한 HPLC(Waters)에 주입하여 분석하였다. 상기 HPLC 분석에서 이동상인 증류수를 0.6 ml/분의 속도로 흘려주고 컬럼의 온도는 85℃로 유지시켜, 도 2와 같은 크로마토그램을 수득하였다.

도 2에 표시된 바와 같이, 상기 반응액의 시료에서 글루코스의 일부가 갈락토스로 전환된 피크가 검출된 반면, 야생형 UDP-갈락토스 4-에피머라아제를 갖는 균주의 용해액을 이용한 대조군에서는 갈락토스의 피크가 검출되지 않았다.

실시예 4. 선별된 알도헥소오스 4-에피머라아제의 특성파악

(1) 방향성 분자 진화에 의해 수득된 알도헥소오스 4-에피머라아제의 유전 정보 분석

실시예 2에서 선별된 클론들 중 가장 높은 활성을 보이는 3개를 선택하여 이들로부터 알도헥소오스 4-에피머라아제를 분리하여 염기 서열 및 아미노산 서열을 분석하였다. 그 결과 가장 높은 활성을 보이는 균주로부터 분리된 알도헥소오스 4-에피머라아제의 아미노산 서열 및 염기서열은 각각 서열번호 3 및 4로 확인되었다.

본 실시예에서 확인된 서열번호 3의 아미노산 서열은 야생형 대장균 균주의 UDP-갈락토스 4-에피머라아제의 아미노산 서열(서열번호 1) 대비 1번 Met의 Val으로의 변이 및 313번 Arg의 Gly로의 변이를 포함하며, 서열번호 4의 염기 서열은 야 생형 대장균 균주의 UDP-갈락토스 4 에피머라아제를 코딩하는 유전자의 염기 서열(서열번호 2) 대비 1번 A의 G로의 치환 및 937번 C의 G로의 치환을 포함했다.

(2) 최적 pH 결정

실시예 2에서 선별된 클론들 중 가장 높은 활성을 보이는 3개를 선택하여 알도헥소오스 4-에피머라아제의 활성을 위한 최적 pH를 확인하였다. 알도헥소오스 4-에피머라아제 활성의 측정은 pH에 따라 완충액을 달리한 것을 제외하고는 실시예 2에 기재된 방법으로 실시하였다. pH 7-8의 범위에서는 50 mM 인산염-NaOH 완충액, pH 8-9에서는 50 mM Tris-HCl, pH 9-10의 범위에서는 50 mM 붕산염-NaOH 완충액을 사용하였다. 구체적으로, 각각의 pH 완충액에 글루코스 50 mM 및 상기에서 선별된 클론으로부터 유래된 효소액 10%(v/v)를 첨가하여 반응액 1 ml를 준비하여 에피머화 반응을 유도한 후, 상기 반응액 중 100 ㎕를 900 ㎕의 pH 8.6 Tris-HCl 완충액, NAD⁺, 갈락토스 디히드로게나아제 1 유닛과 혼합하여 반응액에서 형성된 갈락토스의 양을 측정하였다.

그 결과, 도 3에 도시된 바와 같이, 클론 1(흑색 원)은 pH 8까지 활성이 급격히 상승하고 그 이후에는 낮은 기울기로 pH 증가에 따라 활성이 증가되는 양상을 보였고, 클론 2(네모) 및 클론 3(세모)은 전반적으로 클론 1보다 낮은 활성을 보이며 pH 8.6에서 최적 활성을 보였다.

(3) 최적 온도 결정

상기 (2)에서 가장 높은 활성을 보인 클론 1을 대상으로 효소 활성을 위한 최적 온도를 확인하였다. 알도헥소오스 4-에피머라아제 활성의 측정은 반응 온도를 30-50℃로 변화시킨 것을 제외하고는 상기 (2)에 기재된 방법으로 실시하였다. 도 4에 표시된 바와 같이, 최적 온도는 37℃였다.

도 1은 UDP-갈락토스 4-에피머라아제(에피머라아제 A)의 알도헥소오스 에피머라아제(에피머라아제 B)로의 진화를 개략적으로 도시한 도면이다.

도 2는 실시예에 따라 선별된 알도헥소오스 에피머라아제에 의한 글루코스로부터 갈락토스의 전환 효율을 보여주는 HPLC 결과이다. (a)는 글루코스와 갈락토스 표준의 HPLC 크로마토그램이고, (b)는 본 발명의 실시예에 따라 선별된 알도헥소오스 에피머라아제에 의한 반응액에서 검출된 갈락토스의 피크를 보여주는 HPLC 크로마토그램이다.

도 3은 본 발명의 실시예에 따라 선별된 알도헥소오스 에피머라아제의 pH에 따른 활성을 보여주는 그래프이다.

도 4는 본 발명의 실시예에 따라 선별된 알도헥소오스 에피머라아제의 온도에 따른 활성을 보여주는 그래프이다.

<110> Samyang Genex Corporation <120> Aldohexose epimerase and method for the enzymatic preparation of an aldohexose epimer using the same <130> SAMYGEN-200905 <150> KR2008-51104 <151> 2008-05-30 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 338 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Arg Val Leu Val Thr Gly Gly Ser Gly Tyr Ile Gly Ser His Thr 1 5 10 15 Cys Val Gln Leu Leu Gln Asn Gly His Asp Val Ile Ile Leu Asp Asn 20 25 30 Leu Cys Asn Ser Lys Arg Ser Val Leu Pro Val Ile Glu Arg Leu Gly 35 40 45 Gly Lys His Pro Thr Phe Val Glu Gly Asp Ile Arg Asn Glu Ala Leu 50 55 60 Met Thr Glu Ile Leu His Asp His Ala Ile Asp Thr Val Ile His Phe 65 70 75 80 Ala Gly Leu Lys Ala Val Gly Glu Ser Val Gln Lys Pro Leu Glu Tyr 85 90 95 Tyr Asp Asn Asn Val Asn Gly Thr Leu Arg Leu Ile Ser Ala Met Arg 100 105 110 Ala Ala Asn Val Lys Asn Phe Ile Phe Ser Ser Ser Ala Thr Val Tyr 115 120 125 Gly Asp Gln Pro Lys Ile Pro Tyr Val Glu Ser Phe Pro Thr Gly Thr 130 135 140 Pro Gln Ser Pro Tyr Gly Lys Ser Lys Leu Met Val Glu Gln Ile Leu 145 150 155 160 Thr Asp Leu Gln Lys Ala Gln Pro Asp Trp Ser Ile Ala Leu Leu Arg 165 170 175 Tyr Phe Asn Pro Val Gly Ala His Pro Ser Gly Asp Met Gly Glu Asp 180 185 190 Pro Gln Gly Ile Pro Asn Asn Leu Met Pro Tyr Ile Ala Gln Val Ala 195 200 205 Val Gly Arg Arg Asp Ser Leu Ala Ile Phe Gly Asn Asp Tyr Pro Thr 210 215 220 Glu Asp Gly Thr Gly Val Arg Asp Tyr Ile His Val Met Asp Leu Ala 225 230 235 240 Asp Gly His Val Val Ala Met Glu Lys Leu Ala Asn Lys Pro Gly Val 245 250 255 His Ile Tyr Asn Leu Gly Ala Gly Val Gly Asn Ser Val Leu Asp Val 260 265 270 Val Asn Ala Phe Ser Lys Ala Cys Gly Lys Pro Val Asn Tyr His Phe 275 280 285 Ala Pro Arg Arg Glu Gly Asp Leu Pro Ala Tyr Trp Ala Asp Ala Ser 290 295 300 Lys Ala Asp Arg Glu Leu Asn Trp Arg Val Thr Arg Thr Leu Asp Glu 305 310 315 320 Met Ala Gln Asp Thr Trp His Trp Gln Ser Arg His Pro Gln Gly Tyr 325 330 335 Pro Asp <210> 2 <211> 1017 <212> DNA <213> Escherichia coli W3110 <220> <221> gene <222> (1)..(1017) <223> galE <400> 2 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Asp Leu Gln Lys Ala Gln Pro Asp Trp Ser Ile Ala Leu Leu Arg 165 170 175 Tyr Phe Asn Pro Val Gly Ala His Pro Ser Gly Asp Met Gly Glu Asp 180 185 190 Pro Gln Gly Ile Pro Asn Asn Leu Met Pro Tyr Ile Ala Gln Val Ala 195 200 205 Val Gly Arg Arg Asp Ser Leu Ala Ile Phe Gly Asn Asp Tyr Pro Thr 210 215 220 Glu Asp Gly Thr Gly Val Arg Asp Tyr Ile His Val Met Asp Leu Ala 225 230 235 240 Asp Gly His Val Val Ala Met Glu Lys Leu Ala Asn Lys Pro Gly Val 245 250 255 His Ile Tyr Asn Leu Gly Ala Gly Val Gly Asn Ser Val Leu Asp Val 260 265 270 Val Asn Ala Phe Ser Lys Ala Cys Gly Lys Pro Val Asn Tyr His Phe 275 280 285 Ala Pro Arg Arg Glu Gly Asp Leu Pro Ala Tyr Trp Ala Asp Ala Ser 290 295 300 Lys Ala Asp Arg Glu Leu Asn Trp Gly Val Thr Arg Thr Leu Asp Glu 305 310 315 320 Met Ala Gln Asp Thr Trp His Trp Gln Ser Arg His Pro Gln Gly Tyr 325 330 335 Pro Asp <210> 4 <211> 1017 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1)..(1017) <223> glucose epimerase <400> 4 gtgagagttc tggttaccgg tggtagcggt 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Claims

알도헥소오스를 에피머라아제 효소로 처리하여 에피머화시킴으로써 알도헥소오스 에피머를 얻는 단계를 포함하는 알도헥소오스 에피머의 효소적 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 알도헥소오스는 글루코스, 알로스, 알트로스, 만노스, 굴로스, 이도스, 갈락토스 및 탈로스로 구성된 군으로부터 선택되는 알도헥소오스인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 알도헥소오스는 D-글루코스이고, 상기 알도헥소오스 에피머는 갈락토스인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 에피머화는 알도헥소오스의 C-4 에피머화인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 에피머라아제 효소 처리는 pH 7 내지 10 및 온도 30 내지 50℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 에피머라아제 효소는 야생형 UDP-갈락토스 4-에피머라아제의 방향성 분자 진화에 의하여 얻어진 알도헥 소오스 에피머라아제인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
알도헥소오스의 4번 탄소 위치에서 에피머화를 수행하는 알도헥소오스 에피머라아제.
제7항에 있어서, 상기 알도헥소오스 에피머라아제는 UDP-갈락토스 4-에피머라아제의 방향성 분자 진화에 의하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 알도헥소오스 에피머라아제.
제8항에 있어서, 상기 방향성 분자 진화는 변이 유발 PCR(error-prone PCR), 화학물질 또는 UV와 같은 돌연변이 유발 물질로의 처리, 돌연변이 유발 숙주 세포의 이용, 또는 DNA 셔플링에 의하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 알도헥소오스 에피머라아제.
제8항에 있어서, 상기 알도헥소오스 에피머라아제는 서열번호 3으로 나타나는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 알도헥소오스 에피머라아제.
제7항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 알도헥소오스는 글루코스, 알로스, 알트로스, 만노스, 굴로스, 이도스, 갈락토스 및 탈로스로 구성된 군으로부터 선택되는 알도헥소오스인 것을 특징으로 하는 알도헥소오스 에피머라아 제.
제7항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 알도헥소오스 에피머라아제는 D-글루코스를 갈락토스로 에피머화하는 것을 특징으로 하는 알도헥소오스 에피머라아제.
(a) 관심있는 미생물을 배양하고 용해시켜 미생물 세포 용해액을 수득하는 단계; 및

(b) 상기 세포 용해액을 글루코스, NAD⁺, 및 β-갈락토스 디히드로게나아제를 포함하는 반응액과 반응시킨 후 생성된 NADH의 양을 측정하고, 이를 야생형 UDP-갈락토스 4-에피머라아제를 갖는 대조군 세포 용해액에 의해 생성된 NADH의 양과 비교하여 알도헥소오스 에피머라아제 활성을 갖는 미생물을 선발하고 이로부터 알도헥소오스 에피머라아제를 얻는 단계:

를 포함하는 알도헥소오스 에피머라아제의 스크리닝 방법.
제13항에 있어서, 상기 관심있는 미생물은 변이된 UDP-갈락토스 4-에피머라아제 유전자가 도입된 미생물 또는 UDP-갈락토스 4-에피머라아제 유전자를 갖는 미생물을 변이시켜 얻어진 미생물인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제14항에 있어서, 상기 변이는 변이 유발 PCR(error-prone PCR), 화학물질 또는 UV와 같은 돌연변이 유발 물질로의 처리, 돌연변이 유발 숙주 세포의 이용, 또는 DNA 셔플링에 의한 변이인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제13항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법에 따라 스크리닝된 알도헥소오스 에피머라아제.