KR20090121320A - 렌티바이러스 벡터의 제조 - Google Patents

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KR20090121320A
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한나 피. 레쉬
카리 제이. 아이렌네
셉포 윌라-헤르투아라
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아크 테라퓨틱스 리미티드
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Abstract

본 발명은 각각의 렌티바이러스 전달 구조체, gag, pol, 외피 단백질 및 rev를 동일하거나 다른 바쿨로바이러스에 클로닝하고, 그리고 생산자 세포를 바쿨로바이러스로 또는 각각의 바쿨로바이러스로 형질도입하는 것을 포함하는, 렌티바이러스 벡터를 생성하는 방법에 관한 것이다.
렌티바이러스, 바쿨로바이러스, 형질도입, 벡터

Description

렌티바이러스 벡터의 제조{PRODUCTION OF LENTIVIRAL VECTORS}
본 발명은 렌티바이러스 벡터의 제조 방법에 관한 것이다.
제1형 인간 면역결핍 바이러스 (Human Immunodeficiency Virus I)와 같은 렌티바이러스는 분할 및 비-분할 세포의 게놈으로 형질을 도입하고 통합하는 능력으로 인해 유전자 치료를 위한 유망한 도구이다. 그러나, 대규모 임상적 사용을 위한 복제-결핍 렌티바이러스 벡터의 제조는 도전중이다. 렌티바이러스 벡터는 보통 몇몇 다른 플라스미드 구조체로 293T 인간 배아 신장 세포를 공동형질감염시키는 것에 의해 제조된다. 제1 임상적 렌티바이러스 벡터 제조는 두-플라스미드 시스템을 기반으로 한다 (Lu et al., 2004). 상기 시스템의 안정성을 더욱 개선하기 위하여, 렌티바이러스 게놈은 4개의 플라스미드로 분리될 수 있다. 상기 플라스미드는 자가-불활성화 전달 벡터; gag-pol을 함유하는 패키징 플라스미드; rev 플라스미드; 및 일반적으로 수포성 구내염 바이러스 당단백질 G (VSV-G)를 코드화하는 외피 당단백질 플라스미드이다. 렌티바이러스 제조를 증가시키기 위하여, 부착 세포의 성장이 세포 공장으로 변화되어 왔다. 렌티바이러스 벡터는 또한 무-혈청 조건에서 3-L 생물반응기를 사용하여 부유물 배지에서 일시적으로 제조되어 왔다.
바이러스 제조를 위한 일시적 형질감염 시스템은 문제점이 있을 수 있고 시 간-소비적일 수 있으므로, 안정한 대-규모 제조 시스템을 개발하기 위한 많은 시도가 이루어져 왔다. 그러나, 렌티바이러스 프로테아제 및 융합생성 외피 단백질, VSV-G의 독성은 구조적인 벡터 제조를 막았다. 한 제조 방법은 테트라사이클린- 또는 엑디손-유도성 프로모터 시스템에 의해 제어되는, 유도성 패키징 세포주를 사용한다. 다른 제조 방법은 독성 VSV-G 단백질을 약한 독성 당단백질로 치환하는 것을 포함한다.
렌티바이러스 벡터는 또한 다양한 바이러스 표면 단백질에 의해 슈도타입화될 수 있다. 가장 통상적으로 수포성 구내염 바이러스의 외피 당단백질 G (VSV-G)가 사용된다. 게다가, 감마-레트로바이러스 (예를 들면, 고양이 내인성 레트로바이러스 RD114 env, 변형된 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스 GalV, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 MLV), 알파바이러스, 리싸바이러스 또는 바쿨로바이러스의 것과 같은 다양한 다른 외피 당단백질이 렌티바이러스 벡터를 슈도타입화하는 것으로 보여지고 있다.
슈도타입화는 렌티바이러스의 형질도입 범위를 넓히므로, 장-기간 형질전환유전자 발현이 많은 다른 세포 및 조직에서 달성되어 왔다 (Delenda, 2004). 슈도타입화는 또한 부서지기 쉬운 렌티바이러스를 강화시키고 초원심분리에 의해 고 역가로 농축시킬 수 있다.
바쿨로바이러스는 유전자 전달 적용에 몇몇 이점을 가진다. 그들은 큰 삽입 능력 (> 100 kb)을 가지며, 심지어 무-혈청 조건 하에 대규모 부유물 세포 배지에서도 대부분의 포유류 세포주를 형질도입시킬 수 있다 (Scott et al., 2007). 게다 가, 바쿨로바이러스는 대-규모 및 고 역가로 제조하기 쉽고, 그리고 그들은 그들이 포유류 세포에서 복제될 수 없는 것과 같은 극히 드문 안정성 문제가 존재한다. 세포 독성은 높은 감염 중복도 (MOI)를 가지면서도, 매우 희박하게 검출된다.
바쿨로바이러스는 곤충 세포에서의 대-규모 단백질 제조 및 간염 VLP와 같은 바이러스-유사 입자 (VLP)의 제조에 사용되어 왔다. 무손상 바이러스는 또한 하이브리드 바쿨로바이러스를 사용하여 제조되어 왔다. 포유류 세포에서의 재조합 인플루엔자 바이러스, 아데노바이러스 (Cheshenko et al, 2001) 및 AAV (Auang et al, 2007)의 바쿨로바이러스-매개 제조가 또한 기술되어 왔다.
발명의 요약
본 발명에 따르면 렌티바이러스 벡터의 생성 방법은 각각의 렌티바이러스 전달 구조체, gag, pol, 외피 단백질 및 rev를 각각 동일하거나 다른 바쿨로바이러스에 클로닝하고, 그리고 생산자 세포를 바쿨로바이러스로 또는 각각의 바쿨로바이러스로 형질도입하는 것을 포함한다.
바람직한 구현예의 설명
본 발명의 방법을 수행하기 위하여, 바쿨로바이러스(들)은 렌티바이러스 전달 구조체, gag, pol, 적합한 외피 단백질 및 rev을 포함하여야 한다.
용어 "렌티바이러스 전달 구조체"는 당업계에 있는 당업자들에게 알려져 있을 것이다. 렌티바이러스 전달 구조체는 렌티바이러스 RNA 게놈/렌티바이러스 벡터 RNA 및 형질전환유전자 카세트의 공급원이다. 렌티바이러스 전달 구조체의 한 예는 LV1-GFP이다. 렌티바이러스 전달 구조체의 제조 방법은 또한 당업계에 있는 당업자들에게 알려져 있을 것이다.
용어 "외피 단백질"은 당업계에 있는 당업자들에게 알려져 있을 것이다. 외피 단백질은 바이러스의 핵산을 보호하는 단백질이다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 외피 단백질의 예는 VSV-G이다.
용어 "생산자 세포"는 당업계에 있는 당업자들에게 알려져 있을 것이다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 생산자 세포의 예는 293T, HepG2, CHO, BHK, Sf9, Sf21, 293, BTI-Tn 5 B 1-4, COS, NIH/3T3, Vero, NSO 또는 PerC6 세포이다. 그 다음, 생산된 세포는 부착물로서 또는 부유물에서 배양될 수 있다.
바람직하기는, 본 발명에 따른 기능적 렌티바이러스의 제조에 필요한 모든 요소들은 세개의 다른 바쿨로바이러스에 클로닝된다. 더 바람직하기는, 그들은 두개의 다른 바쿨로바이러스에 클로닝되고, 가장 바람직하기는 그들은 하나의 단일 바쿨로바이러스에 클로닝된다. 이것은 BAC-전달, BAC-gag-pol, BAC-VSVg 및 BAC-rev의 특징들을 단일 바쿨로바이러스에 결합하는 것에 의해 달성될 수 있다.
오토그라파 캘리포니카 핵다각체 바이러스 (AcMNPV)로부터 유래된, 네개의 재조합 바쿨로바이러스 BAC-전달, BAC-gag-pol, BAC-VSVg 및 BAC-rev가 건설되었다. 그들은 포유류 세포에서 렌티바이러스 벡터 발생에 요구되는 모든 요소들을 코드화한다. 상기의 바쿨로바이러스로 293T 세포를 형질도입하는 것에 의해, 기능적 렌키바이러스는 제조된다.
바쿨로바이러스 기술은 바쿨로바이러스의 생성, 농축의 용이성, 무-혈청 조건에서 부유물 포유류 세포의 형질도입의 효율성 및 안정성 때문에, 대규모로 바이러스를 생성하기에 매력적인 선택이다. 렌티바이러스 벡터는 또한 바이러스 단백질을 바쿨로바이러스 단백질에 융합 (그러나, 이에 한정되지는 않는다)하는 것에 의해, 바이러스 단백질 rev, tat, net, vit 또는 vpu를 코드화하거나 나타내는 바쿨로바이러스로 제조될 수 있다. 바쿨로바이러스 단백질은 또한 주요 외피 단백질 gp64 또는 캡시드 단백질, vp39 및 p24일 수 있다.
생성된 렌티바이러스는 이종 단백질 또는 VSV-g, gp64, 아비딘, 스트렙트아비딘 또는 비오틴과 같은 다른 리간드로 슈도타입화될 수 있다.
하기의 실시예는 본 발명을 예증한다.
하기의 도면은 본 발명의 구현예를 도시한다.
도 1은 골격도이고 클로닝된 바쿨로바이러스 공여 플라스미드, BAC-전달, BAC-gag-pol, BAC-VSVg 및 BAC-rev를 나타낸다.
도 2는 바쿨로바이러스-매개 렌티바이러스 제조의 골격도를 나타낸다.
재료 및 방법
바쿨로바이러스의 제조를 위한 플라스미드의 클로닝
포유류 세포에서 3rd 세대 렌티바이러스 벡터의 제조를 위한 모든 필요한 요소들을 바쿨로바이러스 공여 벡터 pFastBac1에 서브클로닝하여 오토그라파 캘리포 니카 핵다각체 바이러스 (AcMNPV)로부터 유도된, 4개의 재조합 바쿨로바이러스, BAC-전달, BAC-gag-pol, BAC-VSVg 및 BAC-rev를 건설하였다 (도 1). 우선, 다중 클로닝 사이트 (PmlI/NheI/PstI/SalI/AflII/PacI/SpeI/MluI/PmeI//EcoRI/ApaI/SwaI/AscI)를 함유하는 폴리링커를 pFastBac1의 고유한 AvrII 사이트에 클로닝하였다. 폴리링커의 염기서열은 5'CACGTGGCTAGCCTGCAGGTCGACCTTAAGTTAATTAAACTAGTACGCGTGTTTAAACGAATTCGGGCCCATTTAAATGGCGCGCC-3' (SEQ ID No: 1) 이었다. 공여 백터는 또한 편리한 바쿨로바이러스 역가 측정을 위한 다각체 프로모터의 제어 하에 적색 형광 단백질 마커 유전자 (DsRed)를 함유하였다.
3번째-세대 자가-불활성화 렌티바이러스 전달 구조체를 생성하기 위하여, 플라스미드 LV-hPGK-ΔNGFP-WPRE-SIN의 (LV1-GFP) ΔNGFP를 GFP에 의해 치환하였다 (Makinen, 2006). 이 구조체에서, GFP 마커 유전자는 포스로글라이세레이트 키나제 (PGK) 프로모터에 의해 작동된다. pBAC-전달 벡터를 두 단계에서 LV1-GFP의 관련 염기서열을 pFastBac1 공여 벡터 폴리링커로 서브클로닝하는 것에 의해 건설하였다. 염기서열의 제1부분을 클로닝하기 위하여, LV1-GFP을 BsrBI 및 AscI로 절단하고, 공여 벡터 폴리링커의 SwaI/AscI-사이트에 서브클로닝하였다. 염기서열의 제2부분을 AscI 및 AvrII로 LV1-GFP를 절단하고 상기 단편을 변형된 pFastBac1-플라스미드의 AscI 및 AvrII 사이트에 삽입하는 것에 의해 클로닝하였다.
CMV 프로모터에 의해 작동되는 gag 및 pol을 발현하는 패키징 구조체 (pBAC- gag-pol)을 ApaLI 절단에 의해 플라스미드 pMDLg/pRRE (Follenzi 및 Naldini, 2002)로부터 작동시키고 공여 벡터의 SmiI-사이트에 서브클로닝하였다. 연결하기 전에, ApaLI 말단을 T4 DNA 폴리머라제로 블런트하였다 (Finnzymes, Helsinki, Finland).
플라스미드 pCMV-VSVG의 VSV-G 외피 구조체를 두 단계로 pFastBac1 벡터에 서브클로닝하였다. 우선, pCMV-VSVG를 NotI로 절단하고, 그리고 EcoRI로 연결하기 전에 T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 블런트하였다. 이 단편을 폴리링커의 SmiI/EcoRI-사이트에 서브클로닝하였다. 염기서열의 제2부분을 EcoRI를 사용하여 pCMV-VSVG로부터 절단하고, 폴리링커 EcoRI 사이트로 서브클로닝하였다.
정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 플라스미드 pRSV-REV (Dull et al, 1998)의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 Rev cDNA를 생성하였다. 정방향 프라이머는 5' CGAAGGAATTC GTCGCCACC ATG GCAGGAAGAAGCGGA -3' (SEQ ID No: 2)이었다. rev 유전자의 뉴클레오티드 1-18의 염기서열은 두껍게 표시하였고, Kozak 보존 염기서열은 이탈릭체로 표시하였고, 그리고 EcoRI 부위는 밑줄을 그었다. 역방향 프라이머는 5' AGCTAGCTAGC GTATTCTCCTGACTCCAATATTGT -3' (SEQ ID No: 3)이었다. rev 유전자의 뉴클레오티드 349-325의 염기서열은 두껍게 표시하였고, Nhel 부위는 밑줄을 그었다. 증폭된 PCR 생성물을 EcoRI 및 NheI로 절단하고, Wizard Clean up 키트 (Promega, Madison, Wl, USA)를 사용하여 증폭시키고, 그리고 pBAC-rev를 형성하기 위하여 pFastBac1 폴리링커의 EcoRI/NheI-사이트에 서브클로닝하였다. Rev cDNA는 NruI/EcoRI 단편으로서 이전에 pcDNA3 벡터 (Invitrogen)로부터 pFastBacl 폴리링 커의 Swal/EcoRI-사이트로 서브클로닝하였던 CMV 프로모터의 제어 하에 있었다.
렌티바이러스의 제조
293T 세포를 형질도입전에 24 시간 배양하였다. 상기 세포를 10% 소 태아 혈청 (FBS)가 보충된 Dulbecco의 개질된 이글 배지 (DMEM) 또는 RPMI 1640에서 배양하였다. 무-혈청에서 또는 DMEM 또는 RPMI가 보충된 혈청에서 감염 중복도(MOI)를 세포 당 50 내지 1000 pfu로 변화 주면서 형질도입을 수행하였다. 37℃에서 무-혈청 배지에서 또는 DMEM 또는 RPMI가 보충된 혈청에서 4시간 동안 배양한 후, 상기 세포를 세정하고 배지를 바꾸었다. 렌티바이러스를 함유하는 세포 상청액을 형질도입 48 시간 후에 수거하여 10분 동안 실온의 1500 rpm에서 원심분리하였다.
대조로서, 각각의 세개의 바쿨로바이러스 (BAC-gag-pol, BAC-Rev 또는 BAC-VSVg)가 없는 배치를 제조하였다. 또한, 293T 세포에서 통상적인 네개의 플라스미드 일시적 형질감염 방법으로 렌티바이러스를 제조하였다 (Follenzi 및 Naldini, 2002). 플레이트 바닥에 세포 부착성을 개선하기 위하여, 제조사의 사용지시에 따라, 플레이트를 폴리-L-리신으로 코팅하였다.
렌티바이러스의 정량화
HeLa 세포를 형질도입할 수 있는 바이러스 입자의 수를 분석하여 렌티바이러스의 형질변환 단위 (TU/ml)를 측정하였다. 첫날에, 한 HeLa 세포를 각 웰 당 1 × 105의 6-웰 플레이트에 또는 5 × 103 세포의 96-웰 플레이트에 뿌렸다. 둘째 날에 일련의 희석으로 렌티바이러스 형질도입을 수행하였다. 5일째, 세포를 형광 현미경 으로 관찰하고 유세포분석기로 분석하여, 렌티바이러스를 발현하는 GFP에 의해 형질도입된 세포의 퍼센트를 나타내었다. Follenzi 및 Naldini, 2002에 기술되어 있는 바와 같이 역가를 계산하였다.
형질전환유전자의 장기간 발현
HeLa 세포 (5 × 103)를 96 웰 플레이트에 뿌리고, 다음날 바쿨로바이러스-생성된 렌티바이러스로 형질도입시키고, 그리고 상기 세포를 6주까지 배양하였다. GFP 발현을 매주 유세포 분석기로 관찰하였다. 추가적 대조로서, Hela 세포를 또한 GFP를 발현하는 바쿨로바이러스 BAC-전달로 형질도입시키고, 상기 발현을 마찬가지의 방법으로 관찰하였다.
p24 농도의 측정
렌티바이러스 캡시드 단백질 p24 (pg/ml)의 양을 p24 ELISA 키트 (NEN™ Life Science Products HIV-1 p24 ELISA)로 측정하였다. 복제 가능 렌티바이러스 (RCL)를 세포 배양 상청액으로부터 p24 ELISA 측정에 의해 시험하였다. HeLa 세포를 렌티바이러스로 형질도입시키고, 그리고 형질도입 효능을 유세포 분석기로 관찰하였다. 상기 세포를 4주 동안 배양하고, 상청액을 수거하여 상청액에 있는 p24의 농도를 RCL의 마커로서 반복적으로 측정하였다. 이를 수거한 상청액으로 나이브 (naive) HeLa 세포를 형질도입하는 것에 의해 추가로 확인하고, 그리고 GFP 발현을 형광 현미경 및 유세포 분석기로 관찰하였다.
통계적 분석
GraphPadPrism 4 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)로 통계적 분석을 수행하였다.
결과
바쿨로바이러스의 건설
중요한 3rd 세대 요소들을 4개의 바쿨로바이러스에 클로닝하였다. 바쿨로바이러스 플라스미드 구조체를 제한 분석으로 확인하고 4개의 바쿨로바이러스를 곤충 세포에서 발생시켰다. 바쿨로바이러스 생성의 일관성을 관찰하기 위하여, 바쿨로바이러스의 주요 외피 단백질에 대한 항-gp64으로, 각 배치에서 면역블롯 분석을 수행하였다. 바쿨로바이러스를 농축시키기 위한 종말 점 역가 측정 (IU/ml)을 곤충 세포에서 수행하였다. 고 역가 (>1010 IU/ml)를 모든 생성된 바이러스를 위해 측정하였고 렌티바이러스 제조시 MOI를 제어하기 위하여 사용하였다.
렌티바이러스의 제조
4개의 바쿨로바이러스로 293T 세포를 형질도입하는 것에 의해 렌티바이러스를 제조하였다. 다른 배지와 배양 시간을 사용하여 형질도입을 수행하였다. 형광 현미경에 의해 형질도입 후 20시간이 지난 다음 형질도입 효능을 관찰하였다. 상청액을 함유하는 렌티바이러스를 형질도입 후 48시간이 지난 다음 수거하고, 형질도입 단위 (TU/ml)로서 HeLa 세포에서 역가를 측정하였다.
무-혈청 조건에서 4시간 동안 형질도입을 수행할 때, MOI 500에서 4개의 바쿨로바이러스는 각각 평균 6.0 × 105 TU/ml를 갖는 렌티바이러스 역가를 산출하였 다. MOI 750에서 바쿨로바이러스 농도는 평균 1.2 × 106 TU/ml를 갖는 고 렌티바이러스 역가를 생성하였다. 고 바쿨로나이러스 농도 (각각 MOI 1000에서 4개의 바쿨로바이러스)가 사용될 때 역가의 감소가 관찰되었다. 바쿨로바이러스 형질도입이 밤새 수행될 때, MOI 250에서 4개의 바쿨로바이러스는 평균 2.5 × 106 TU/ml를 갖는 최고 역가를 산출하였다. 형질도입에 RPMI 배지가 사용될 때, 최고 역가는 MOI 50에서 이미 평균 5.9 × 105 TU/ml이었다. 역가는 통상적인 4개의 플라스미드 형질도입 방법 (Follenzi 및 Naldini, 2002)으로 제조된 것과 유사하였다.
플라스미드의 다른 비율은 플라스미드 형질감염의 역가에 영향을 미칠 수 있다. 통상적으로 플라스미드로 사용되는 것처럼, 바쿨로바이러스의 같은 비율이 사용될 때, 렌티바이러스 역가는 예상한 것보다 0.64배 낮았다. 더 높은 렌티바이러스 역가가 얻어질 수 있는 경우를 알기 위하여, BAC-전달 바이러스를 두배 하였다. 그러나, 동일한 투여량의 바쿨로바이러스로 생성된 것에 비해, 역가에서는 상당한 차이가 없었다. 두배의 BAC-전달 양으로 얻어진 역가는 평균 1.4 × 106 TU/ml이었다.
음성 대조로서, 동시에 바쿨로바이러스 (BAC-gag-pol, BAC-Rev 또는 BAC-VSVg)중 하나를 생략하면서, 렌티바이러스 생성을 수행하였다. HeLa 세포를 형질도입하기 위하여 수거된 배지를 사용하였고, 형질도입 후 4일이 지난 다음 유세포 분석기로 GFP 양성 세포 (%)의 수를 분석하였다. GFP 양성 세포는 이러한 시험으로 측정할 수 없었다.
렌티바이러스의 생물학적 역가 (TU/ml)와 함께 종종 사용되는 적정 방법은 ELISA에 의해 p24 농도 (pg/ml)를 측정하였다. 배지에 있는 p24 농도는 대표 바이러스 제제의 수치와 상응하는 191 ± 105 ng/ml이었다. 그러나, p24 농도는 생물학적 활성 입자를 분리하지 않았다. 감염성 입자와 p24의 비율을 비교하기 위하여, 이러한 매개 변수 모두를 바쿨로바이러스의 다른 양 또는 비율로 제조된 몇몇 제제로부터 측정하였다. 결과는 우수한 TU/p24 비율을 나타내었다.
형질전환유전자 발현의 특징화
수거된 렌티바이러스 배지에 있는 잔여 바쿨로바이러스를 종말 점 적량화에 의해 측정하였고, 상기 역가는 293T 세포 형질도입을 위해 사용된 투여량의 0.1-0.5%이었다. 형질전환유전자 발현이 잔여 바쿨로바이러스가 아닌, 제조된 렌티바이러스에서 비롯되었는지를 확인하기 위하여, 293T 세포를 BAC-전달 바쿨로바이러스 만으로 형질도입하였다. 그 다음, HeLa 세포를 렌티바이러스 제조와 마찬가지의 방법으로 수거된 배지로 형질도입하고 형질도입 후 4일이 지난 다음 GFP 양성 세포를 유세포 분석기로 분석하였다. GFP 양성 세포를 검출할 수 없었다.
바쿨로바이러스 벡터는 척추동물 세포에서 복제되지 않고 그들은 숙주 게놈에 통합될 수 없다. 이러한 벡터의 유전자 발현은 일시적이고 일반적으로 2주가 걸린다. 그러나, 통합된 렌티바이러스의 형질전환유전자 발현은 형질전환유전자 발현의 억제 (silencing)가 발생하지 않는다면, 상대적으로 안정하다. 바쿨로바이러스-생성된 렌티바이러스 형질도입은 후기 형질도입 후 43일이 지난 다음에도 여전히 관찰될 수 있는 유효한 GFP 발현을 이끈다 (도 5A). 매일 HeLa 세포에서 형광 현미경에 의해 발현을 관찰하였고, 후기 형질도입 후 17일이 지난 다음 MOI 100 및 1000 (각각 3일 동안 18.7±1.9% 및 11.5±0.4 %)에서 3개의 바쿨로바이러스-매개 GFP 발현이 감소하였다.
복제-가능 렌티바이러스
복제-가능 렌티바이러스 (RCL)를 p24 ELISA 분석에 의해 시험하였다. HeLa 세포를 배지를 함유하는 렌티바이러스로 형질도입하였다. 형질도입 효능을 유세포 분석기로 확인하였다. 4주 동안 세포를 배양하고, 상청액에 있는 p24의 농도를 반복 측정하였다. p24의 증가하는 농도는 진행하는 바이러스 복제를 나타내지만, 그러한 증가가 검출되지는 않았다. 2.5주 후에 형질도입된 HeLa 세포에서 수거된 배지를 나이브 HeLa 세포를 형질도입하는데 추가로 사용하였으나, GFP 발현이 형광현미경뿐 아니라 유세포 분석기로도 검출되지 않았다.
요약하면, 하이브리드 바쿨로바이러스를 사용하여 기능적 렌티바이러스의 성공적인 발생이 증명되었다. 바쿨로바이러스에 의해 제조된 렌티바이러스 역가는 통상적인 4개의 플라스미드 형질감염 방법을 사용하여 제조된 것과 유사하였다.
바쿨로바이러스의 최적의 투여량과 확장된 형질도입 시간이 사용될 때 우수한 렌티바이러스 역가가 획득되었다. 높은 투여량의 바쿨로바이러스가 사용될 때 렌티바이러스 역가의 증가 및 세포 죽음이 관찰되었다. 이것은 세포 생성의 VSV-G 독성에 의한 것일 수 있다. 바쿨로바이러스를 발현하는 VSV-G를 생략할 때 문제가 관찰되지 않았고, 바쿨로바이러스 입자의 전체 개수가 일정하게 유지되었다. DMEM 배지를 RPMI1640로 치환하는 것에 의해, 최저 바쿨로바이러스 투여량 (MOI 50)은 최고의 렌티바이러스 역가를 생성하였다. 이것은 형질도입 배지가 척추동물 세포에서 바쿨로바이러스-매개 유전자 발현에 영향을 미친다는 사실과 상통한다. 발생된 렌티바이러스의 기능성을 확인하기 위하여, HeLa 세포를 형질도입하여 유지시키고 GFP 발현을 6주 동안 관찰하였다. 그러나, 대조 바쿨로바이러스로, GFP 발현은 17일 안에 감소하였다. 렌티바이러스 발생이 BAC-gag-pol, BAC-Rev 또는 BAC-VSVg를 생략하는 것에 의해 수행되면, 렌티바이러스가 생성되지 않았다.
바쿨로바이러스가 안전하더라도, 바쿨로바이러스를 갖는 렌티바이러스 제조의 오염은 바람직하지 않다. 렌티바이러스 제제에 있는 잔여 바쿨로바이러스의 양은 293T 세포가 바쿨로바이러스 형질도입 후 한번만 세정되는 단순한 렌티바이러스 제조 프로토콜에서 사용되는 바쿨로바이러스 투여량의 0.1-0.5% 뿐이었다. 잔여 바쿨로바이러스는 단순히 추가적 세정 단계(들)을 부가하거나 적당한 하류 정제 도식을 사용하여 추가적으로 감소될 수 있다.
렌티바이러스 벡터의 사용과 관련된 주요 관심 중 하나는 병원성 인간 바이러스의 발생 가능성이다. 이를 피하기 위하여, 재조합에 의한 RCL 형성의 위험을 최소화하기 위하여, 렌티바이러스 게놈을 4개의 다른 생성 플라스미드로 분리하였다. RCL은 바쿨로바이러스-발생 렌티바이러스 제제을 검출하지 않았다. p24 수치는 배양을 연장시킨 후에도 증가하지 않았고, GFP 발현은 형질도입 후 2.5주가 지난 다음에도 검출되지 않았다.
임상 연구를 위한 바이러스 생성의 확장성은 부착 세포에서 다르게 유지된 다. 따라서, 부유물 세포 배지로의 렌티바이러스 생성의 적합성은 유리할 것이다. 무-혈청 조건에서 HEK293 세포를 적응시킨 부유물에서의 예비 결과는 매우 유효한 바쿨로바이러스 형질도입 효능을 나타낸다 (95.1% GFP 양성 세포).
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Claims (6)

  1. 렌티바이러스 벡터를 생성하는 방법으로, 상기 방법은 각각의 렌티바이러스 전달 구조체, gag, pol, 외피 단백질 및 rev를 각각 동일하거나 다른 바쿨로바이러스에 클로닝하고, 그리고 생산자 세포를 바쿨로바이러스로 또는 각각의 바쿨로바이러스로 형질도입하는 것을 포함하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 외피 단백질이 VSV-G인 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 렌티바이러스 전달 구조체, gag, pol, VSV-G 및 rev가 각각 BAC-전달, BAC-gag-pol, BAC- VSVg 및 BAC-rev로 클로닝되는 것인 방법
  4. 제1항에 있어서, 상기 렌티바이러스 전달 구조체, gag, pol, 외피 단백질 및 rev가 각각 동일한 바쿨로바이러스로 클로닝되는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생산자 세포는 293T, HepG2, CHO, BHK, Sf9, Sf21, 293, BTI-Tn 5 B 1-4, COS, NIH/3T3, Vero, NSO 또는 PerC6 세포인 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 렌티바이러스 전달 구조체 가 3-세대 렌티바이러스 전달 구조체인 것인 방법.
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