KR20090116979A - 애기장대 유래의 생체방어 기작 및 개화 조절에 관여하는단백질을 이용한 식물의 개화시기 조절 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 애기장대 유래의 생체방어 기작 및 개화 조절에 관여하는 단백질을 이용한 식물의 개화시기 조절 방법에 관한 것으로, 구체적으로 애기장대로부터 분리한 서열번호 1로 표시되는 TGA4/OBF4 단백질 및 이를 이용한 식물의 개화시기를 조절하는 방법에 관한 것이다. 보다 더 상세하게는, 본 발명의 TGA4/OBF4 단백질은 빛에 의한 개화시기 조절인자 CO 단백질과 결합하고 또한 FT 유전자의 프로모터 부위에 결합할 수 있으며, 이에 따라 TGA4/OBF4와 CO의 단백질-단백질 결합을 통해 FT 유전자의 전사를 조절함으로써 식물의 개화시기를 조절할 수 있다.

따라서 본 발명의 이러한 TGA4/OBF4 단백질의 특성을 이용하여 호르몬 또는 화학 물질에 의해 발현이 유도되는 시스템을 구축하면 환경 스트레스에 내성을 가짐은 물론 개화시기 조절을 통해 보다 능률적이고 경제적인 방법으로 수확량을 증가시킬 수 있다.

개화시기조절, 생체방어 기작, 개화조절 유전자, TGA4/OBF4

Description

애기장대 유래의 생체방어 기작 및 개화 조절에 관여하는 단백질을 이용한 식물의 개화시기 조절 방법{A method for the control of flowering time using an Arabidopsis protein that is involved in plant defense response and floral transition}

본 발명은 생체방어 기작 및 개화시기를 조절하는 전사인자에 관한 것으로, 보다 상세하게는 애기장대로부터 분리한 식물의 생체방어 및 개화 조절 TGA4/OBF4 (TGACG motif-binding factor 4/Ocs element-binding factor 4) DNA와 TGA4/OBF4 단백질을 이용하여 식물의 개화시기를 조절 하는 방법에 관한 것이다.

식물에 있어 개화시기(開花時期)는 식물체의 나이와 같은 유전적인 요인과 온도, 일장(photoperiod) 그리고 병충해의 침입과 같은 환경적인 요인에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있다.일반적으로는 밤낮(일장)의 길이에 의해 조절되는 개화 경로 (photoperiod), 일정기간 동안 저온에 노출되었을 때 개화 되는 경로(vernalization)와 환경적인 stress 즉 병충해의 침입 또는 UV (ultraviolet)와 같은 빛의 조사에 의해 생체방어 기작 (defense response)으로 유도되는 개화 등으로 구분되고 있으며, 이러한 개화 조절은 식물 생명주기의 전반에 걸쳐 조절는 것으로 보고되고 있다(Yarn Y.Levy & Caroline Dean(1998), Plant Cell, 10: 1973-1989; Martinez et al. (2004), Plant J., 37: 209-217).

농작물에 있어서의 생체방어 기작과 개화시기는 수확량의 결정에 있어서 아주 중요한 역할을 하는데, 이는 농작물이 병충해에 잘 견뎌내지 못하거나 개화시기가 잘못 조절되면 수확물의 양과 질에 나쁜 영향을 미치게 되어 상당한 경제적 손실을 초래하기 때문이다.

특히 개화시기 조절은 농작물의 질적인 부분에 있어 중요한데, 그 예로서 봄철의 무(radish)는 3-4월에 파종하여 5-6월에 수확하게 되는데 이 기간 동안에 기온이 10℃ 이하로 2주간 계속되면 꽃눈이 형성되어 꽃대가 올라오게 됨(춘화반응;vernalization)으로써 상품가치가 많이 떨어지게 된다. 그래서 많은 돈을 투자하여 난방 시설을 설치하는 등 농가에 많은 부담이 되고 있다.

이에 최근에는 유전공학의 기술을 이용하여, 개화시기가 지연된 표현형을 보이는 개화 돌연변이체로부터 변이를 유발하는 유전자를 분리하고, 적합한 유전자 조작의 과정을 거쳐서 농작물 육종에 적용하려는 연구들이 활발히 진행되고 있으며, 특히 유전정보가 거의 해독되어 알려진 애기장대(Arabidopsis thaliana)를 통해 개화시기를 조절하는 유전자들이 알려져 있다(대한민국 공개특허공보 제 2001-0029127호, 제 2003-0016892호).

식물은 병충해 침입 또는 강한 빛의 조사를 받으면 식물 호르몬인 SA(salicylic acid)가 개화 촉진 유전자인 FT(FLOWERING LOCUS T)의 발현을 증가시키고 개화 저해 유전자인 FLC(FLOWERING LOCUS C)의 발현을 감소시킴으로써 개화를 촉진시킨다는 것이 보고되었다(Martinez et al. (2004), Plant J., 37: 209-217). 이는 생체방어 기작과 개화 조절이 각각 독립적으로 작용하는 것이 아니라 특정 단백질들의 결합에 의해 함께 조절되어짐을 의미한다.

한편, 이미 알려진 TGA4/OBF4 단백질은 식물 호르몬인 SA에 의해 생체방어 기작에 중요한 역할을 하는 PR(pathogenesis-related) 유전자들의 발현을 조절하는 NPR1(non-expressor of PR genes 1)과 결합하는 것으로 알려져 있으나 식물에서 구체적인 기능은 밝혀져 있지 않다.

또한, 애기장대의 CO(CONSTANS) 유전자의 경우, CO 유전자는 전사 조절 인자로서 빛에 의한 개화 조절에 있어서 아주 중요한 역할을 하는 것으로 보고가 되어 있으나(Yarn Y.Levy & Caroline Dean(1998), Plant Cell, 10: 1973-1989), 분자적 수준에서 그 메커니즘은 정확히 알려진 것이 없다.

CO 단백질은 하위 유전자인 FT(FLOWERING LOCUS T)의 promoter 부위에 직접 결합하여 전사를 조절할 수 없기 때문에 FT promoter에 직접 붙을 수 있는 다른 단백질을 필요로 하지만 이 단백질에 대해서도 아직까지 보고된 바는 없다.

이와같은 사실은, CO 단백질이 식물의 개화시기를 조절하는 데 있어서, 여러개의 단백질들이 CO와 결합하여 CO의 기능을 촉진 또는 저해 시키는 복잡한 과정을 거쳐 관여하는 것으로 생각되어진다(Alon Samach & George, Coupl and BioEssays, 22:38-47:2000).

CO 유전자의 결손 또는 과발현을 통한 개화시기 조절은 CO에 의한 개화 지연 또는 촉진 효과가 너무 커 원하는 시기에 개화를 유도하거나 또는 정상적인 꽃의 모양과 정상적인 크기의 열매 발달을 유도시키지 못하는 단점이 생길 수 있다. 그러므로 적절한 개화시기의 조절을 위해서는 새로운 유전자 발굴 및 그 기능에 대한 연구가 필요하다.

이에 본 발명자들은 애기장대에서 TGA4/OBF4 단백질과 결합하는 전사 인자를 찾고자 연구를 수행한 결과, 개화시기 조절에 핵심적인 역할을 하는 CO 전사 인자를 분리하였고, 이를 통해 TGA4/OBF4가 생체방어 기작뿐만 아니라 식물의 개화시기 조절에도 중요한 역할을 한다는 것을, 상기 TGA4/OBF4 DNA를 이용한 형질전환체 제작 그리고 단백질 발현에 의한 FT promoter 부위 결합 확인을 통해 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래의 개화시기 조절 단백질인 TGA4/OBF4를 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 단백질을 이용하여 식물의 개화시기를 조절하는 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 식물의 개화 조절에 관여하는 단백질 TGA4/OBF4 (TGACG motif-binding factor 4/Ocs element-binding factor 4)를 제공한다.

또한 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물의 개화 조절 단백질인 CO (CONSTANS)를 분리하는 방법을 제공한다.

더 나아가 본 발명은 상기 식물의 개화 조절 DNA를 이용하여 식물체의 개화시기를 조절하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.

일반적으로 개화 식물에 있어서, 개화시기 조절은 식물체의 일생 통틀어 가장 중요한 일 중의 하나로, 식물체의 나이와 같은 유전적 요인과 밤낮의 길이, 온도 그리고 병충해의 침입과 같은 환경적인 요인에 의해 조절되는데 이는 식물체가 태어 날 때부터 가지고 있는 유전적인 특성 등에 따라 매우 많은 단백질들의 상호 결합과 신호의 전달에 의해 섬세하게 이루어진다. 개화가 빨리 시작되면 작물의 경우 씨앗이 적게 열리고 과실의 경우는 크기가 줄어들고 또한 그 맛도 떨어지게 되는 등의 좋지 못한 변화들이 생기게 된다. 또한 식물이 주위 환경으로부터 병충해의 침입 그리고 높은 빛의 조사와 같은 스트레스를 받게 되면 생체방어 기작이 작동되는데, 이때 식물은 개화를 촉진시켜 씨를 맺고 다음 세대로 전환하여 환경스트레스 조건으로부터 벗어나려고 한다. 이러한 메커니즘은 식물 호르몬인 SA에 의해 유도되는데 SA는 개화 촉진 인자인 FT의 발현을 증가시키고 개화 저해 인자인 FLC 의 발현을 감소시킴으로써 개화를 앞당긴다고 알려져 있으나 어떤 단백질들에 의해 수행되는지는 전혀 알려지지 않고 있다.

특히, TGA4/OBF4는 식물 호르몬인 SA에 의해 NPR1과 결합하여 생체방어 기작에 중요한 역할을 할 것으로 예측되고 있으나 지금까지 생체방어 기작에 관한 기능은 알려져 있지 않고 있다. 다만 TGA4/OBF4와 결합하는 단백질들이 식물의 발달 과정이나 꽃의 발달에 중요한 기능을 하는 것으로 보고되어 있다.

또한, 애기장대의 CO 유전자는 빛의 영향을 받아 개화시기를 조절하는 아주 중요한 핵심 유전자로 알려져 있다. 하지만 많은 노력에도 불구하고 어떤 작용 원리에 의하여 개화시기를 조절하는지는 거의 연구되어 있지 않다. 그리고, CO 유전자는 장일 조건하에서는 개화시기를 조절하는 역할뿐만 아니라, FT 또는 SOC1 유전자를 발현시켜 개화를 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 이러한 FT와 SOC1 유전자는 개화를 억제하는 FLC 유전자에 의해 발현이 억제되는데, FLC 유전자는 또한 춘화처리(vernalization : 4℃ 정도의 낮은 온도가 얼마간 지속 되는 것)에 의해 기능을 잃어버리는 것으로 알려져 있다.

이에, 본 발명은 TGA4/OBF4 단백질과 결합하는 전사 인자로써 CO를 분리하였고, TGA4/OBF4가 CO와 유사하게 빛에 의해 발현을 조절 받으며, CO와 CO의 하위 유전자인 FT가 발현되는 잎의 도관 조직에서 발현되는 것을 TGA4/OBF4 프로모터 형질전환체를 통해 확인하였다. 또한 TGA4/OBF4가 FT의 promoter 부위에 결합하여 FT 유전자의 전사를 조절하는 특성을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 제 1 견지에 의하면,

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 애기 장대 유래의 개화시기 조절에 관여하는 단백질 TGA4/OBF4를 제공한다.

또한 본 발명의 제 2 견지에 의하면,

본 발명은 상기 단백질 TGA4/OBF4를 이용하여 식물의 개화시기 조절인자 CO를 분리하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 분리방법은 ⅰ) 효모 투-하이브리드 시스템 (Yeast Two -hybrid System)을 사용하여 애기장대의 전사인자들 중에서 TGA4/OBF4와 결합하는 단백질을 코딩하는 유전자들을 분리하는 단계; 및 ⅱ) 염기서열 분석과 아마노산 서열 분석을 통해 상기 분리된 유전자가 CO 유전자임을 확인하는 단계;를 포함한다. 더욱 바랍직하게는 상기 ⅱ) 단계는 TGA4/OBF4와 특이적으로 결합하는 B-box zinc-finger 영역을 가짐을 확인함으로써 CO 유전자임을 확인할 수 있다.

또한 상기한 바와 같은 결과는 본 발명에서 분리한 TGA4/OBF4 단백질이 CO와 결합하여 직접적으로 FT 유전자의 발현을 조절 하여 개화시기를 조절하는 것으로 판단된다.

따라서 본 발명의 제 3 견지에 의하면,

본 발명은 상기 TGA4/OBF4 단백질과 개화시기 조절인자 CO의 결합을 이용하 여 식물체의 개화시기를 조절하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 결합에 의하여 직접적으로 FT (Flowering Locus T)유전자 발현을 조절함으로써 개화시기를 조절하는 것을 특징으로 한다. 더욱 바람직하게는, 상기 방법은 식물체의 형질전환, 호르몬 및 화학물질에 의해 식물체에 상기 TGA4/OBF4 단백질의 발현유도 또는 억제되는 시스템을 구축함으로써 이루어질 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따라 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

1. TGA4/OBF4와 결합하는 CO 단백질의 분리

본 발명의 첫 단계로 효모 투-하이브리드 시스템(Yeast Two-hybrid System)을 이용하여(Field & Song:1989), 약 1200개의 애기장대의 전사 인자 유전자들 중에서 TGA4/OBF4와 결합하는 단백질을 코딩하는 유전자를 분리하였다.

상기 유전자는 염기서열 분석과 아마노산 서열 분석을 통해 C2H2-type의 zinc-finger 영역을 가지고 있는 개화시기 조절 단백질인 CO 임을 확인하였다.

TGA4/OBF4와 유사한 단백질 구조를 가지는 TGA 멤버들과 CO 단백질간의 결합을 확인한 결과 CO 단백질이 TGA4/OBF4 에만 특이적으로 결합하는 것을 관찰하였다.

2. TGA4 / OBF4 단백질의 발현

(1) TGA4/OBF4 유전자의 GST 및 6xHis 융합 단백질 발현

pDEST15 벡터(Invitrogen, 미국)와 pDEST17 벡터 (Invitrogen, 미국)를 사용하여 GST(glutathion S transferase)와 6개의 Histidine 아미노산이 결합된 형태로 단백질을 발현시킨다. TGA4/OBF4 유전자가 삽입된 pDEST15 및 pDEST17 플라스미드는 대장균[E. coli AI-oneshot(Invitrogen, 미국)]에 형질전환시킨다.

형질전환된 대장균은 LB 액체 배지에서 O.D값이 0.8이 될 때까지 키운 후 0.2% 아라비노즈 {L-(+)-Arabinose}로 GST-TGA4/OBF4 및 6xHis-TGA4/OBF4 융합 단백질의 과발현을 유도한다.

발현된 GST-TGA4/OBF4 융합 단백질은 글루타치온 세파로즈 4B 아가로스 비드 (Glutathion Sepharose 4B agarose bead)를 이용하여 대장균으로부터 분리한 후 glutathione을 이용하여 GST-TGA4/OBF4 단백질을 순수 분리한다.

3. EMSA 실험을 통한 기능 분석

본 실험은 TGA4/OBF4 단백질이 전사 인자로서 애기장대내에서 CO 단백질의 하위 유전자인 FT의 promoter 부위에 결합하여 전사를 조절하는지를 밝히기 위해 실시하였다.

애기장대에서 개화시기를 조절하는 유전자로 알려진 FT의 promoter의 1.1 kb 부위를 5개의 조각으로 나눈 후 방사성동위원소로 표지하고 GST-TGA4/OBF4 융합 단백질과 반응시킨 다음, 폴리아크릴아미드 겔에 전기영동하여 EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay)를 실시한 다음, 방사 위치를 확인한다.

그 결과, TGA4/OBF4 단백질이 FT 유전자의 promoter 프로모터 부위에 결합함 을 알 수 있었다.

4. TGA4 / OBF4 의 발현 양상 분석

본 실험은 TGA4/OBF4 단백질이 FT 유전자의 전사를 조절하기 위해서 FT의 발현을 활성화시켜주는 CO와 함께 같은 시간대와 발현되어야 하는데 이를 확인하기 위해 야생형 애기장대를 장일, 단일 그리고 빛의 조사가 연속되는 조건에서 각각 키운 후 RNA를 추출하여 발현을 분석한 결과 TGA4/OBF4가 CO와 유사한 발현 양상을 보임을 확인하였다.

또한 CO와 FT는 잎의 도관조직에서 발현되는데 TGA4/OBF4 역시 도관조직에서 발현되는지를 확인하기 위해 TGA4/OBF4 유전자의 2.5 kb 크기의 프로모터 부위를 GUS(β-glucuronidase) 유전자와 접합시켜 야생형 애기장대에 형질전환 시킨 후 GUS 단백질의 기질인 X-Gluc (5-Bromo-4- chloro-3-indolyl β-D-glucuronide)을 이용하여 TGA4/OBF4가 CO 그리고 FT와 유사하게 잎의 도관조직에 발현되는 것을 관찰하였다.

따라서, 호르몬 및 화학 물질에 의해 TGA4/OBF4의 유도하는 시스템을 식물에 도입, 특정한 시기에 FT 유전자의 발현을 조절하여 개화를 조절하면 지금처럼 지구 온난화 등과 같은 급격한 기후 변화에 훌륭히 대처할 수 있을 것이다.

상기에서 설명한 바와 같이 본 발명에서, TGA4/OBF4 단백질은 빛에 의한 개 화시기 조절의 핵심적인 역할인 수행하는 CO 단백질과 결합하고 또한 FT 유전자의 프로모터 부위에 결합하는 것을 밝히고, 이는 환경 스트레스와 같은 조건에 의한 개화가 TGA4/OBF4와 CO의 단백질-단백질 결합을 통해 FT 유전자의 전사를 조절함으로써 수행되는 것임을 확인하였다. 따라서 이러한 TGA4/OBF4 단백질의 특성을 이용하여 호르몬 또는 화학 물질에 의해 발현이 유도되는 시스템을 구축하면 환경 스트레스에 내성을 가짐은 물론 개화시기 조절을 통해 보다 능률적이고 경제적인 방법으로 수확량을 증가시킬 수 있을 것이다.

특히, 일기나 기온과 같은 환경적 조건이 매년 변화하고, 봄과 가을이 점점 짧아지면서 농작물의 재배가 어려워지고 있는 이 때에 개화시기를 조절하여 질 좋은 다량의 농산물을 수확한다면 농가 수익은 물론 수출을 통한 외화 획득에도 크게 이바지 할 것으로 기대된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

< 실시예 1> 효모를 이용한 TGA4 / OBF4 결합 단백질의 분리

도 1-A에서와 같이 TGA4/OBF4 유전자를 pDEST32(Invitrogen, USA) 플라스미드 (plasmid)에 GAL4 DNA 결합 부위(DNA-biding domain ; BD)가 TGA4/OBF4 단백질의 N-말단 쪽으로 접합되게 실었고, 애기장대의 전사조절 인자 cDNA 라이브러리(library)를 pDEST22 (Invitrogen,미국)플라스미드에 GAL4 전사 활성화 부위(activation domain; AD) C-말단 쪽으로 접합되게 실었다. 먼저 pDEST32에 실려 있는 TGA4/OBF4를 리튬아세테이트 (LiAc) 방법에 의해 효모의 종류인 pJ69-4A 균주(Phil James et al., Genetics 1996, 144: 1425-1436)내에 도입한 후 루신(Leucine)이 결핍된 에스디(SD : synthetic dropout) 고체 한천 배지에서 3일간 배양하고 선별하였다.

여기서 자라난 효모를 루신이 결핍된 액체 배지에 배양하여 리튬아세테이트 방법으로 pDEST22에 실려져 있는 cDNA 라이브러리(library)를 도입시킨 후 루신(Leucine), 트립토판(Tryptophan), 히스티딘(Histidine) 그리고 아데닌(Adenine) 이 결핍된 에스디 고체 한천 배지에서 4일간 배양했다. TGA4/OBF4 단백질과 TGA4/OBF4 단백질과 결합하는 단백질들이 동시에 발현하고 있는 효모들은 이들 4가지 아미노산이 결핍된 배지에서 생존하므로 여기에 자라난 효모들 각각을 루신, 트립토판, 히스티딘 그리고 아데닌이 결핍된 에스디 액체 배지에서 2일간 선택 배양하였다.

1% 소디움두데실설페이트(SDS : Sodium Dodecyl Sulfate)와 100mM 염화나트륨(NaCl)이 포함된 용액과 유리구슬을 이용하여 효모 세포를 파괴하고 TGA4/OBF4와 결합하는 단백질을 암호(code)하는 유전자를 가지고 있는 플라스미드만 분리하여 염기서열을 결정하고 아미노산서열로 변환하여 기존에 그 기능이 알려진 단백질과의 아미노산서열 비교 분석하였다. 그 결과 분리된 이 유전자가 B-box zinc-finger 영역을 가지는 CO 전사 인자로 밝혀졌다.

그 후 TGA4/OBF4와 CO의 결합 관계를 검증하기 위해 TGA4/OBF4가 GAL4 DNA 결합 부위에 접합된 플라스미드(pDEST32-TGA4/OBF4)와 CO가 GAL4 활성화 부위에 접합된 플라스미드(pDEST22-bCIP1) 2개를 동시에 pJ69-4A 효모에 도입하여 루신, 트립토판, 히스티딘 그리고 아데닌이 결핍된 에스디 고체 배지에서 3일 그리고 액체 배지에서 2일간 배양한 후 액체 질소를 이용해 파쇄하고 o-nitrophenyl-β-D-galatopyranoside (ONPG)를 이용하여 β-galactosidase 의 활성을 측정한 결과 TGA4/OBF4가 CO와 결합함을 다시 확인할 수 있었다.

TGA4/OBF4 단백질은 bZIP 영역을 가지는 TGA 전사 조절 인자 그룹에 속해 있는데 그 단백질의 구조가 다른 TGA 단백질과 유사하기 때문에 TGA4와 CO간의 결합이 특이적인지를 확인하기 위해 TGA1, 2, 3, 5, 6 그리고 7 유전자를 pDEST32 벡터에 삽입 후 효모에 형질전환 하여 루신, 히스티틴, 아데닌이 결핍된 에스디 고체 배지에서 4일간 배양하였다. 자가활성을 가지는 TGA2를 제외한 나머지 5개의 TGA 유전자들 각각을 pDEST22-CO 플라스미드와 함께 효모에 도입하여 루신, 트립토판, 히스티딘 그리고 아데닌이 결핍된 에스디 고체 배지에서 4일간 배양하여 단백질-단백질 결합을 확인한 결과 도 1-B와 같이 CO가 TGA4/OBF4에만 특이적으로 결합하는 것을 밝혔다.

도 2에서와 같이 TGA4/OBF4와 결합하는 CO 단백질의 부위를 결정하기 위해 CO 단백질을 N-말단, 중간 그리고 C-말단 부위를 기준으로 하여 C-말단이 제거된 돌연변이 단백질, 중간 및 C-말단이 동시에 제거된 돌연변이 단백질 그리고 N-말단이 제거된 돌연변이 단백질을 제작하였다. 이를 위해 각각의 돌연변이 단백질을 암호화하는 CO 유전자 부위를 pDEST22 벡터에 삽입한 후 각각의 벡터들을 pDEST32-TGA4/OBF4 플라스미드와 함께 효모에 도입하여 루신, 트립토판, 히스티딘 그리고 아데닌이 결핍된 에스디 고체 배지에서 3일 그리고 액체 배지에서 2일간 배양한 후 o-nitrophenyl-β-D-galatopyranoside (ONPG)를 이용하여 β-galactosidase 의 활성을 측정한 결과 TGA4/OBF4가 CO의 zinc-finger 부위인 B-box에 결합하는 것을 확인하였다.

< 실시예 2> 대장균에서 발현된 TGA4 / OBF4 와 CO 단백질들을 이용하여 효모에서 관찰된 두 단백질간의 결합 확인

도 3에서와 같이 TGA4/OBF4와 CO 단백질들의 결합을 확인하기 위해 대장균으로부터 각각의 단백질을 획득한 후 GST pull-down 실험을 실시하였다.

CO 단백질을 획득하기 위해 CO의 N-말단에 GST를 접합시켜 글루타치온 세파로스 4B 아가로즈 비드(Glutathion Sepharose 4B agarose bead)를 이용해 GST-CO 단백질을 분리하였다.

이를 위해 도 2에서 사용된 정상적인 CO 단백질 그리고 돌연변이 CO 단백질들을 암호화하는 유전자들을 pDEST15 벡터(Invitrogen, 미국)에 삽입한 후 대장 균[E. coli BL21-AI oneshot 균주](Invitrogen, 미국)에 형질전환 시킨 다음, LB 액체 배지에서 O.D값이 0.8이 될 때까지 배양하고 0.2% 아라비노즈 {L-(+)-Arabinose}를 첨가하여 GST 융합 CO 단백질들의 과발현을 유도하였다.

위의 배양액으로부터 세포를 침전시켜 1X Co-IP 완충액 (100mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl, 0.5% NP-40, 1mM EDTA, 1mM DTT)에 부유 시킨 다음 초음파 균짖기(sonicator)를 이용해 세포를 파괴하여 GST 융합 CO 단백질들이 포함된 대장균의 단백질들을 추출하였다.

추출된 단백질들을 GST가 결합하는 글루타치온 세파로즈 4B 아가로즈 비드 (Glutathion Sepharose 4B agarose bead)를 이용하여 GST 융합 CO 단백질들만 분리한 후 쿠마시 염색을 통해 도 3-B와 같이 GST 융합 CO 단백질들을 확인하였다.

6xHis 융합 TGA4/OBF4 단백질들을 얻기 위해 TGA4/OBF4 유전자를 pDEST17 (Invitrogen, 미국) 벡터에 삽입한 후 대장균[E. coli BL21-AI oneshot 균주](Invitrogen, 미국)에 형질전환 시킨 다음, LB 액체 배지에서 O.D값이 0.8이 될 때까지 배양하고 0.2% 아라비노즈 {L-(+)-Arabinose}를 첨가하여 6xHis-TGA4/OBF4 단백질의 과 발현을 유도한다.

위의 배양액으로부터 세포를 침전시켜 Co-IP 완충액 (100mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl, 0.5% NP-40, 1mM EDTA, 1mM DTT)에 부유 시킨 다음 초음파 균짖기(sonicator)를 이용해 세포를 파괴하여 대장균 단백질을 추출하였고 western-blot을 통해 6xHis-TGA4/OBF4가 발현되어 있음을 확인하였다.

GST 융합 CO 단백질들과 6xHis-OBF4 단백질간의 결합을 확인하기 위해 GST 아가로즈 비드와 결합하고 있는 GST 융합 CO 단백질들과 6xHis-TGA4/OBF4가 포함되어 있는 대장균 단백질을 결합 완충액(50mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl, 0.5% NP-40, 10mM EDTA, 2mM　EGTA)에 넣고 4℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 GST 아가로즈 비드를 원심분리기를 이용하여 침전시킨다. GST 융합 CO 단백질들과 결합하지 않은 단백질들이 존재하는 상등액을 제거하고 GST 융합 CO 단백질들과 결합하는 단백질이 포함되어 있는 침전물을 SDS-gel에 전기영동한 후 6xHis 항체(Antibody)를 이용하여 6xHis-TGA4/OBF4 단백질의 존재 유무를 확인한 결과 도 2의 결과와 마찬가지로 효모에서 뿐만 아니라 대장균에서 발현된 TGA4/OBF4 단백질이 CO 단백질의 B-box zinc-finger 부위에 결합함을 알 수 있었다.

< 실시예 3> EMSA 를 통한 TGA4 / OBF4 단백질의 FT 프로모터 부위 결합 확인

실시예 2에서 보인 GST 융합 단백질 획득과정을 통해 GST-TGA4/OBF4 융합 단백질을 확보하였고 글루타치온(Glutathione)을 이용해 GST-TGA4/OBF4 단백질을 순수 분리하여 EMSA 실험을 수행하였다. 도 4-A와 같이 개화를 촉진하는 FT 유전자의 1.1 kb 프로모터 부위를 5개 부분으로 나눈 후 양쪽 말단을 방사성동위원소인 32-P로 표지하였다.

한편, GST-TGA4/OBF4 융합 단백질은 도 4-A에 표시된 양으로 젤 리타데이션완충액(Gel Retardation buffer)과 50mM KCl, 15% 글리세롤 및 2μg poly (dI-dC)를 넣고 5분간 혼합한 후, 상기 방사성동위원소로 표지되고 20kcpm의 활성을 가진 5개의 FT 프로모터 부위들을 GST-TGA4/OBF4 융합 단백질이 포함되어 있는 젤 리타데이션완충액에 혼합하고 20분간 반응을 시켰다.

그 후 0.5X TBE가 포함된 7.5%의 아크릴아미드겔에 1시간 30분 동안 전기영동 한 후 90 에서 겔을 완전히 말려서 X-ray 필름을 위에 놓고 12시간 동안 두었다가 현상을 하였다.

그 결과, 도 4-A에서 볼 수 있듯이 단백질을 넣지 않거나 GST 단백질만 넣고 실험한 것과 달리 GST-TGA4/OBF4 융합 단백질이 FT 유전자의 promoter 중에서 FT-D(-189/-482) 부위에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.

또한, GST-TGA4/OBF4 융합 단백질 양을 증가시켰을 때 FT-D 부위와의 결합이 더욱 증가하고, 과량의 방사성동위원소로 표지되지 않은 염기서열을 넣었을 때는 GST-TGA4/OBF4 융합 단백질과 방사성동위원소로 표지된 FT-D 부위간의 결합이 저해됨을 도 4-B의 실험을 통해 확인하였다.

< 실시예 4> 식물 생장조건에 따른 TGA4 / OBF4 발현 분석을 통한 CO 단백질과의 결합 및 FT 유전자의 전사 조절 역할 유추

CO 유전자의 발현은 하루를 주기로 반복적이고 생체시계의 의해 조절되며 장일 및 단일 조건에서 그 발현이 다름이 보고되었다. TGA4/OBF4가 CO와 결합하여 FT 유전자의 전사를 조절하기 위해서는 TGA4/OBF4가 CO와 유사한 시간대에 발현되어야 하는데 이를 확인하기 위해 도 5의 실험을 실시하였다.

TGA4/OBF4의 mRNA의 발현이 하루를 주기로 반복적인지를 확인하기 위해 야생형 애기장대를 장일조건 (낮 16시간/밤 8시간)과 단일조건 (낮 8시간/밤 16시간)에서 8-9일 (장일조건) 그리고 10-11일 (단일조건) 키운 후 4시간 간격으로 2일 동안 수확한 후 TRIzol (Invitrogen, 미국)을 이용하여 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA를 이용하여 reverse transcriptase의 활성에 의해 cDNA를 합성하고 PCR (polymerase chain reaction)을 통해 TGA4/OBF4의 발현을 CO와 비교하였다.

도 5-A 그리고 도 5-B에서 보듯이 TGA4/OBF4는 CO와 마찬가지로 하루를 주기로 반복적인 발현 양상을 나타내고 낮보다는 해질 무렵부터 늦은 밤까지 그 발현이 매우 높다는 것을 발견하였다. 이를 통해 TGA4/OBF4는 해질 무렵에 안정화 되어 CO와 결합하고 FT 유전자의 전사를 조절함을 유추할 수 있었다.

하루를 주기로 반복적인 TGA4/OBF4 발현이 생체시계에 의해 조절되는지 확인하기 위해 야생형 애기장대를 낮 12시간/밤 12시간 조건에서 7일간 키운 후 계속해서 빛이 조사되는 조건으로 옮겨서 4시간 간격으로 3일동안 식물을 수집하였다. TRIzol을 이용하여 RNA를 추출하고 reverse transcriptase를 이용해 cDNA를 합성한 후 PCR을 통해 그 발현을 분석한 결과 도 5-C에서 알 수 있듯이 TGA4/OBF4는 CO와 달리 빛만 계속 내리쬐는 조건에서는 하루를 주기로 반복적인 발현 양상을 보여주지 못했다. 따라서 TGA4/OBF4는 생체시계가 아닌 빛에 의해 조절됨을 알 수 있었다.

< 실시예 5> 식물의 조직 특이적인 TGA4 / OBF4 발현 분석을 통한 CO 단백질과의 결합 및 FT 유전자의 전사 조절 역할 유추

개화시기를 조절하는 CO 단백질은 잎의 도관조직(vascular tissue)에서 발현되어 FT 유전자의 전사를 조절하는 것으로 알려져 있다. TGA4/OBF4 단백질이 CO와 결합하여 FT의 전사를 조절하기 위해서는 잎의 도관조직에서 발현되어야 한다.

이를 확인하기 위해 먼저 야생형 애기장대를 각각의 조직별로 수집하여 실시예 4에서 보인바와 같이 RNA를 추출하고 cDNA를 합성한 후 PCR을 통해 TGA4/OBF4의 조직 특이적인 발현 양상을 분석하였다. 도 6-A에서 보듯이 TGA4/OBF4는 씨방(silique)을 제외한 잎이나 꽃과 같은 조직에서 발현됨을 확인하였다.

TGA4/OBF4가 CO 및 FT와 마찬가지로 잎의 도관조직에서 발현되는지를 살펴보기 위해 TGA4/OBF4 유전자의 5‘ UTR(untranslated region)을 포함하고 있는 2.5 kb 프로모터 부위를 GUS(β-glucuronidase) 유전자와 접합시켜 야생형 애기장대에 형질전환 시킨 후 GUS 단백질의 기질인 X-Gluc (5-Bromo-4- chloro-3-indolyl β-D-glucuronide)을 이용하여 TGA4/OBF4가 발현되는 부위를 관찰하였다. 도 6-B와 같이 TGA4/OBF4는 잎의 도관조직에서 매우 강하게 발현이 되었는데 특히 떡잎(cotyledon)이나 오래된 로젯잎(rosette leaf)에서는 잎 전체에 발현이 되는 것을 확인하였다.

상기에서 설명한 바와 같이, TGA4/OBF4 단백질의 생체방어 기작 및 개화시 기 조절 특성을 이용하여 농업적 이용 즉, 수확량 증대와 품질을 높이기 위해 농업경영자가 원하는 시기에 꽃이 피게 하는 품종 개발 또는 이 단백질을 투여하여 병충해에 강한 내성을 부여함과 동시에 개화를 조절하는 방법 등에 이용 가능하다

도 1은 애기장대에서 TGA4/OBF4(TGACG motif-binding factor 4/Ocs element-binding factor 4) 단백질과 결합하는 단백질을 찾기 위해 실행한 이스트 투 하이브리드(Yeast Two-hybrid) 실험에서 CO(CONSTANS)를 분리한 결과를 나타낸 것이다.

A : Yeast two-hybrid screen 실험 결과.

* 왼쪽 : 이스트 투 하이브리드 실험 결과를 나타내기 위해서 사용된 플라스미드(plasmid) 조합.

1 : Negative control

2 : Positive control

3 : TGA4/OBF4와 CO 사이의 단백질-단백질 결합

4 : TGA4/OBF4와 TGA4/OBF4와 결합하는 것으로 알려진 OBP3(OBF4-binding protein 3) 사이의 단백질-단백질 결합으로 postivie control로 사용됨.

* 중간: 이스트 투 하이브리드 실험 결과.

* 오른쪽: 아미노산의 결핍을 통해 밝혀진 단백질-단백질 결합을 확인하기 위한 β-galactosidase assay.

B : TGA 단백질들 중에서 TGA4/OBF4가 CO에 특이적으로 결합함을 밝히기 위한 실험.

트립토판(tryptophan; T)과 루신(Leucine; L)이 결핍된 에스디 고체배지에서 3일간 배양된 효모들을 트립토판, 루신, 히스티딘(Histidine; His, H) 그리고 아데닌(Adenine; A)이 결핍된 에스디 고체배지에 1/10씩 농도를 희석시켜가면서 떨 어뜨린 후 3일간 더 배양하였다.

도 2는 TGA4/OBF4 단백질이 CO 단백질의 어떤 부위에 결합하는지를 밝히기 위해 CO 단백질을 각각의 domain이 결핍된 돌연변이 형태로 만든 후 이스트 투 하이브리드 실험을 실시한 결과.

* 왼쪽 : 실험에 사용된 정상적인 TGA4/OBF4 및 CO 단백질과 돌연변이 CO 단백질들을 나타내는 모식도.

* 오른쪽 : 이스트 투 하이브리드 결과를 확인하기 위해 실시한 β-galactosidase assay.

도 3은 도 2에서 관찰된 효모에서 TGA4/OBF4와 CO 단백질들간의 결합을 대장균에서 발현시킨 GST(glutathione S-transferase) 융합 CO 단백질들과 6xHis-TGA4/OBF4 단백질을 이용하여 증명한 실험.

* 위쪽 : 6xHis-TGA4/OBF4 단백질의 존재 유무를 6xHis 항체(α-His)를 이용한 western blot을 통해 보여주는 실험.

* 아래쪽 : 이 실험에 사용된 단백질들의 양을 SDS-gel에 전기영동 후 쿠마시 염색(Coomassie staining)을 통해 보여주는 실험으로 기호 * 로 표시된 단백질 부위는 각 단백질의 전체길이를 의미하고 그 밑부분들은 전체길이의 단백질이 조금씩 분해되어 있는 형태를 나타냄.

도 4는 CO 단백질이 직접적으로 전사를 조절하는 FT(FLOWERING LOCUS T) 유전자의 프로모터(promoter)에 TGA4/OBF4가 결합함을 EMSA(electrophoretic mobility shift assay)를 통해 증명한 실험.

A : 1.1 kb 크기의 FT 프로모터중에서 TGA4/OBF4가 결합하는 부위를 찾기 위한 실험.

B : 도 4-A에서 밝혀진 TGA4/OBF4 결합 부위를 확인하기 위해 과량의 TGA4/OBF4 단백질과 방사성동위원소로 표지되지 않은 FT 프로모터 부위를 사용하여 EMSA를 수행한 결과.

도 5는 야생형 애기장대에서 TGA4/OBF4의 발현이 하루를 주기로 반복적이고 생체시계(circadian clock)에 의해 조절 받는지를 밝히기 위해 실시한 RT-PCR(reverse transcriptase-polymerase chain reaction) 실험 결과.

흰색 원 : TGA1/OBF4 mRNA, 검은색 원 : CO mRNA

A : 장일조건에서 자란 야생형 애기장대에서의 TGA4/OBF4와 CO의 발현이 하루를 주기로 반복적임을 증명한 실험.

B : 단일조건에서 자란 야생형 애기장대에서의 TGA4/OBF4와 CO의 발현이 하루를 주기로 반복적임을 증명한 실험.

C : 12시간 낯과 12시간 밤인 조건에서 7일간 그리고 지속적인 빛을 저리한 야생형 애기장대에서 TGA4/OBF4 발현이 CO와 달리 생체시계의 의해 조절되는 것이 아니라 빛에 의해 조절됨을 보여주는 실험.

도 6은 TGA4/OBF4가 CO 그리고 FT와 마찬가지로 잎의 도관조직(vascular tissue)에서 발현됨을 밝힌 실험이다.

A : TGA4/OBF4가 어떤 조직에서 발현되는지를 RT-PCR을 통해 밝힌 실험.

B : TGA4/OBF4가 잎의 도관조직에서 발현된다는 것을 pTGA4/OBF4:GUS 식물체를 GUS(β-glucuronidase) 염색을 통해 밝힌 실험.

a : 28일 자란 pTGA4/OBF4:GUS 식물체.

b : 20일 자란 pTGA4/OBF4:GUS 식물체의 shoot apical meristem 부위로 이 부분에서 TGA4/OBF4가 발현되지 않음을 알 수 있다.

c : 16일 자란 pTGA4/OBF4:GUS 식물체의 떡잎(cotyledon)과 첫 번째 로젯잎(rosette leaf) 사진으로 전체 잎의 도관조직에서 TGA4/OBF4의 발현을 관찰할 수 있다.

d : 30일 자란 pTGA4/OBF4:GUS 식물체의 로젯잎 사진으로 왼쪽에서 오른쪽 방향으로 어린잎에서 오래된 잎을 나열한 것이다. 잎이 성장할수록 TGA4/OBF4의 발현이 잎 전체의 도관조직에서 발견된다.

<도면의 주요부분에 관한 부호의 설명>

TGA4/OBF4: TGACG motif-binding factor 4/Ocs element-binding factor 4 단백질

CO: CONSTANS 유전자 또는 단백질

FT: Flowering Locus T 유전자

GST: GST 단백질

BD-OBF4: BD-TGA4/OBF4

GST-OBF4: GST-TGA4/OBF4

His-OBF4: 6xHis-TGA4/OBF4

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> A method for the control of flowering time using an Arabidopsis protein that is involved in plant defense response and floral transition <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 364 <212> PRT <213> TGA4/OBF4 amino acid sequences <400> 1 Met Asn Thr Thr Ser Thr His Phe Val Pro Pro Arg Arg Phe Glu Val 1 5 10 15 Tyr Glu Pro Leu Asn Gln Ile Gly Met Trp Glu Glu Ser Phe Lys Asn 20 25 30 Asn Gly Asp Met Tyr Thr Pro Gly Ser Ile Ile Ile Pro Thr Asn Glu 35 40 45 Lys Pro Asp Ser Leu Ser Glu Asp Thr Ser His Gly Thr Glu Gly Thr 50 55 60 Pro His Lys Phe Asp Gln Glu Ala Ser Thr Ser Arg His Pro Asp Lys 65 70 75 80 Ile Gln Arg Arg Leu Ala Gln Asn Arg Glu Ala Ala Arg Lys Ser Arg 85 90 95 Leu Arg Lys Lys Ala Tyr Val Gln Gln Leu Glu Thr Ser Arg Leu Lys 100 105 110 Leu Ile His Leu Glu Gln Glu Leu Asp Arg Ala Arg Gln Gln Gly Phe 115 120 125 Tyr Val Gly Asn Gly Val Asp Thr Asn Ala Leu Ser Phe Ser Asp Asn 130 135 140 Met Ser Ser Gly Ile Val Ala Phe Glu Met Glu Tyr Gly His Trp Val 145 150 155 160 Glu Glu Gln Asn Arg Gln Ile Cys Glu Leu Arg Thr Val Leu His Gly 165 170 175 Gln Val Ser Asp Ile Glu Leu Arg Ser Leu Val Glu Asn Ala Met Lys 180 185 190 His Tyr Phe Gln Leu Phe Arg Met Lys Ser Ala Ala Ala Lys Ile Asp 195 200 205 Val Phe Tyr Val Met Ser Gly Met Trp Lys Thr Ser Ala Glu Arg Phe 210 215 220 Phe Leu Trp Ile Gly Gly Phe Arg Pro Ser Glu Leu Leu Lys Val Leu 225 230 235 240 Leu Pro His Phe Asp Pro Leu Thr Asp Gln Gln Leu Leu Asp Val Cys 245 250 255 Asn Leu Arg Gln Ser Cys Gln Gln Ala Glu Asp Ala Leu Ser Gln Gly 260 265 270 Met Glu Lys Leu Gln His Thr Leu Ala Glu Ser Val Ala Ala Gly Lys 275 280 285 Leu Gly Glu Gly Ser Tyr Ile Pro Gln Met Thr Cys Ala Met Glu Arg 290 295 300 Leu Glu Ala Leu Val Ser Phe Val Asn Gln Ala Asp His Leu Arg His 305 310 315 320 Glu Thr Leu Gln Gln Met His Arg Ile Leu Thr Thr Arg Gln Ala Ala 325 330 335 Arg Gly Leu Leu Ala Leu Gly Glu Tyr Phe Gln Arg Leu Arg Ala Leu 340 345 350 Ser Ser Ser Trp Ala Ala Arg Gln Arg Glu Pro Thr 355 360 <210> 2 <211> 1095 <212> DNA <213> TGA4/OBF4 sequence <400> 2 atgaatacaa cctcgacaca ttttgttcca ccgagaaggt ttgaagttta cgagcctctc 60 aaccaaatcg gtatgtggga agaaagtttc aagaacaatg gagacatgta tacgcctggc 120 tctatcataa tcccgactaa cgaaaaacca gacagcttgt cagaggatac ttctcatggg 180 acagaaggaa ctcctcacaa gtttgaccaa gaggcttcca catctagaca tcctgataag 240 atacagagaa ggctagcaca gaatcgagag gcagctagga aaagtcgttt gcgcaagaaa 300 gcttatgttc agcagctaga gactagccgg ttaaagctaa ttcatttaga gcaagaactc 360 gatcgtgcta gacaacaggg tttctatgtg gggaacggag tagataccaa tgctcttagt 420 ttctcagata acatgagctc agggattgtt gcatttgaga tggaatatgg acattgggtg 480 gaagaacaga acaggcaaat atgtgaacta agaacggttt tacatggaca agttagtgat 540 atagagcttc gttctctagt cgagaatgcc atgaaacatt actttcaact cttccgaatg 600 aagtcagccg ctgcaaaaat cgatgttttc tatgtcatgt ccggaatgtg gaaaacttca 660 gcagagcggt ttttcttgtg gataggcgga tttagaccct cagagcttct caaggttctg 720 ttaccgcatt ttgatccttt gacggatcaa caacttttgg atgtatgtaa tctgaggcaa 780 tcatgtcaac aagcagaaga tgcgttatcc caaggtatgg agaaactgca acatacatta 840 gcagagagtg tagcagccgg gaaacttggt gaaggaagtt atattcctca aatgacttgt 900 gctatggaga gattggaggc tttggtcagc tttgtaaatc aagctgatca tctgagacat 960 gagacattgc aacagatgca tcggatctta accacgcgac aagcggctag aggtttgtta 1020 gcattagggg agtatttcca aaggcttcga gctttgagtt cgagttgggc ggctaggcaa 1080 cgtgaaccaa cgtaa 1095

Claims (7)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는, 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래의 식물의 생체방어 기작과 개화시기를 조절에 관여하는 TGA4/OBF4 (TGACG motif-binding factor 4/Ocs element-binding factor 4) 단백질.
2. 제 1 항의 단백질을 이용하여 식물의 개화시기 조절인자 CO(CONSTANS)의 분리하는 방법.
3. 제 2항에 있어서, 상기 방법은 ⅰ) 효모 투-하이브리드 시스템 (Yeast Two -hybrid System)을 사용하여 애기장대의 전사인자들 중에서 TGA4/OBF4와 결합하는 단백질을 코딩하는 유전자들을 분리하는 단계; 및

   ⅱ) 염기서열 분석과 아마노산 서열 분석을 통해 상기 분리된 유전자가 CO 유전자임을 확인하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 ⅱ) 단계는 TGA4/OBF4와 특이적으로 결합하는 B-box zinc-finger 영역을 가짐을 확인함으로써 CO 유전자임을 확인함을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항에 따른 TGA4/OBF4 단백질과 개화시기 조절인자 CO의 결합을 이용하 여 식물체의 개화시기를 조절하는 방법
6. 제 5 항에 있어서, 상기 결합에 의하여 직접적으로 FT (Flowering Locus T)유전자 발현을 조절함으로써 개화시기를 조절함을 특징으로 하는 방법.
7. 제 5 항에 있어서, 상기 방법은 식물체의 형질전환, 호르몬 및 화학물질에 의해 식물체에 상기 TGA4/OBF4 단백질의 발현유도 또는 억제되는 시스템을 구축하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.

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