KR101439761B1 - 가뭄 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 식물의 신규 전사조절인자 ａｎａｃ０９６ - Google Patents

가뭄 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 식물의 신규 전사조절인자 ａｎａｃ０９６ Download PDF

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Abstract

본 발명은 가뭄 스트레스에 의해 유도되는 식물의 전사조절인자 ANAC096, 상기 전사조절인자를 암호화하는 유전자 및 상기 유전자를 이용하여 식물의 스트레스 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 애기장대 (Arabidopsis thaliana)로부터 분리된 상기 ANAC096는 NAC 모티프를 갖는 폴리펩타이드로서 식물의 스트레스 반응에 관련된 유전자들의 전사를 활성화하는 전사 조절 인자로 작용하므로, ANAC096 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드로 식물체를 형질전환하여 상기 유전자를 과발현시킴으로써 가뭄 스트레스에 대한 저항성이 증진된 식물체를 생산할 수 있으며, 이를 통해 식물의 생산성을 향상시킬 수 있다.

Description

가뭄 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 식물의 신규 전사조절인자 ＡＮＡＣ０９６{NEW TRANSCRIPTION FACTOR ANAC096 IMPROVING THE RESISTANCE TO THE DROUGHT STRESS IN PLANTS}
본 발명은 가뭄 스트레스에 의해 유도되는 식물의 전사조절인자 ANAC096, 상기 전사조절인자를 암호화하는 유전자 및 상기 유전자를 이용하여 식물의 스트레스 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.
식물은 성장동안 다양한 환경적 스트레스에 노출된다. 이들 환경요인중, 특히 가뭄이나 고염 스트레스는 심각한 손상을 야기할 수 있다. 이들 스트레스를 극복하기 위하여, 식물은 다양한 환경 스트레스에 따라 생리적 조건을 바꾸는 분자 메커니즘을 발달시켜왔다. 식물의 스트레스 반응에서의 초기기작은 스트레스의 "인지(perception)"이며, 이는 신호전달을 야기시켜 다운스트림 스트레스 반응성 유전자(downstream stress response genes)의 발현을 활성화 또는 억제한다(Thomashow, 1999; Bray, 2002; Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki, 2000; Zhu, 2001).
따라서, 비생물적 스트레스(abiotic stress) 환경하에서, 이들 스트레스 반응성 유전자의 발현을 조절하는 메커니즘은 비생물적 스트레스 반응의 핵심이 된다. 식물체는 다양한 환경적 요인에 대처하기 위하여, 전사조절인자(TF)를 포함한 여러 형태의 신호전달인자(signaling component)가 생리적 적응을 위하여 특정 신호경로를 구성하도록 빠르게 반응하여야 한다.
식물성장 호르몬인 앱식산(ABA)은 비생물적 스트레스의 적응에 중요한 역할을 한다. 수많은 탈수 스트레스-유도성 유전자가 ABA에 의해 조절된다(Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki, 1996, 2000; Rock 2000). 많은 ABA-유도성 유전자는 " ABA-responsive element(ABRE)"라고 하는 ABA-반응성 시스-활성인자를 갖는데, 이는 프로모터 영역에서 핵산서열 PyACGTGGC을 포함한다(Yamaguchi-Shinozaki et al., 1990). ABRE는 전사조절인자 AREB/ABF에 의해 인식되며, 이 전사조절인자는 식물과 동물 모두에 고도로 보존된 기본 루이신 지퍼(basic leucine zipper) 구조를 갖는다(Choi et al., 2000; Yuichi et al., 2000; Newman and Keating, 2003; Correa et al., 2008). ABA-의존성 경로 이외에, ABA-비의존성 경로 역시 탈수 스트레스 반응에 작동한다. ABA-비의존성 경로에 속하는 유전자는 dehydration-responsive element/C-repeat (DRE/CRT)라고 하는 다른 시스-작용 인자를 함유하는데, 이 인자는 DREB/CBF 패밀리 멤버에 의해 인식된다(Gutterson and Reuber, 2004; Agarwal et al., 2006).
종래, 다른 전사조절인자에 의해 매개되는 개개의 경로는 원래 별개로 여겨져 왔으나, 최근의 연구에 의하면 예상보다 더 복잡한 비생물적 스트레스 경로를 보여주고 있다. 예를 들면, 어떤 타입의 전사조절인자는 직접적인 상호작용에 의해 전사 활성에 복합적으로 작용하였다(Lee et al., 2010).
고도로 보존된 DNA-결합 도메인과 다양한 C-말단 도메인을 갖는 식물특이적 NAC 모티브 함유 전사조절인자는, 식물 생장, 노화, 옥신반응, 생물학적 및 비생물학적 스트레스 반응과 같은 일련의 생리반응에서 매우 중요한 역할을 한다(Aida et al., 1997; Olsen et al., 2005; Lu et al., 2007; Kim et al., 2009; Jensen et al., 2010; Hao et al., 2011; Nakashima et al., 2012; Puranik et al., 2012; Sun et al., 2012).
애기장대(Arabidopsis) 게놈은 NAC 모티브 함유 전사인사를 인코딩하는 유전자를 100개 이상 가지며(Jensen et al., 2010), 이 유전자는 계통분석에 따라 10개의 주요 그룹으로 분류할 수 있다. 지금까지, ANAC019, ANAC055 및 ANAC072 와 같이 그룹III에 속하는 몇몇 NAC 모티브 함유 전사조절인자가 비생물학적 스트레스 반응에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다(Duval et al., 2002; Tran et al., 2004; Lu et al., 2007; Jensen et al., 2010). 애기장대에서 이들 전사조절인자의 이소성 발현(ectopic expression)은 탈수 스트레스와 ABA-과민감성 표현형에 대한 저항성을 증가시켰다. 따라서, 이들은 비생물학적 스트레스 또는 ABA 시그널링의 양성 조절자로 작용함을 알 수 있다. 그러나, TaNAC8 및 SiNAC와 같은 일부 NAC 모티브 함유 전사조절인자는 비생물학적 스트레스에 의해 전사 억제자로 작용하고, 탈수 스트레스 반응에 대한 ABA-비의존성 경로에 관여한다(Hao et al., 2011; Liu et al., 2011).
이와 같이, 종래, 다양한 NAC 모티브 함유 단백질을 이용하여 광범위한 연구가 행해져 왔으나, 특이적인 생리 역할 및 명확한 분자 메커니즘은 아직 밝혀진 바 없다.
이에, 본 발명자는 유전자 스크리닝, 세포생화학 어세이법 등을 결합하여, NAC (NAM, ATAF1/2 and CUC2) 모티브를 갖는 식물 특이적인 신규의 전사조절인자인 ANAC096를 발견하고, 이들의 과발현에 의해 식물체의 가뭄 스트레스에 대한 저항성이 향상됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 가뭄 스트레스에 의해 발현이 유도되고, 각종 스트레스 반응 유전자들의 발현을 유도하는 활성을 가진 새로운 식물 전사조절인자를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 전사조절인자를 암호화하는 유전자 및 상기 유전자를 포함하는 식물세포 발현벡터를 제공하는 것이다.
또다른 본 발명의 목적은 상기 전사조절인자 유전자로 식물체를 형질전환시킴으로써 식물체의 가뭄 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 전사활성인자 ANAC096를 제공한다.
본 발명의 일 구체예로, 전사활성인자 ANAC096는 애기장대(Arabidopsis thaliana)로부터 분리된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구체예로, 전사활성인자 ANAC096는 NAC 모티프를 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명은, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 전사활성인자 ANAC096를 암호화하는 유전자를 제공한다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
본 발명은, 상기 유전자를 포함하는 식물세포 발현벡터를 제공한다.
본 발명은, 상기 발현벡터로 식물체를 형질전환하여 전사활성인자 ANAC096을 과발현시킴으로써 식물체의 가뭄 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 방법을 제공한다.
본 발명은, 상기 방법에 의해 가뭄 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.
애기장대 (Arabidopsis thaliana)로부터 분리된 본 발명의 ANAC096는 NAC 모티프를 갖는 폴리펩타이드로서 식물의 스트레스 반응에 관련된 유전자들의 전사를 활성화하는 전사 조절 인자로 작용하므로, ANAC096 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드로 식물체를 형질전환하여 상기 유전자를 과발현시킴으로써 가뭄 스트레스에 대한 저항성이 증진된 식물체를 생산할 수 있으며, 이를 통해 식물의 생산성을 향상시킬 수 있다.
도 1은, 발아 및 발아후 동안 ABA 과반응성 표현형을 보이는 anac096 mutant를 스크리닝한 결과이다.
도 2는, anac096 mutants 및 ANAC096OX 형질전환 식물의 표현형을 나타내는 결과이다.
도 3은, ANAC096 가 기공폐쇄, 수분손실 조절, 및 탈수 스트레스 반응에 관여함을 보여주는 결과이다.
도 4는, ABA 또는 삼투 스트레스에 의해서는 유도되나 추위에는 유도되지 않는 ANAC096 가 ABA-유도성 유전자의 발현에 중요한 역할을 함을 보여주는 결과이다.
도 5는, ANAC096 가 ABA-비의존성이 아닌 ABA-의존성에 의해 조절되는 유전자의 서브셋의 발현을 조절함을 보여주는 결과이다.
도 6은, ANAC096가 RD29A 프로모터 내의 consensus core cis-acting element에 결합하여 전사를 활성화시킴을 보여주는 결과이다.
본 발명의 신규 전사조절인자 ANAC096는 가뭄이나 삼투 스트레스(osmotic stress)시 ABA-의존성 시그널링을 매개한다. anac096 돌연변이체는 발아(germination) 및 발아후(post-germination) 성장 조건하에서, 앱식산(abscisic acid, ABA)에 대한 저민감성 표현형을 보였다. 본 발명자들은 신규 NAC 전사조절인자인 ANAC096이 건조 스트레스 적응에서 ABA 의존적 신호전달에 필수적인 순방향 조절자임을 밝혔다. 이러한 사실은 anac096 기능결손 돌연변이체가 발아와 발아후 성장에서 외부 ABA 저민감성과 탈수 스트레스에 민감성을 나타내는 반면, ANAC096OX 과발현 유전자변형 식물체는 외부 ABA에 대한 고민감성과 탈수 스트레스 저항성을 보이는 결과로 뒷받침된다.
본 발명자는 anac096 돌연변이체가 기공폐쇄를 지연시켜 수분손실을 증가시키지만, ANAC096를 과발현하는 형질전환식물에서는 반대로 기공폐쇄를 유도하여 수분증발을 억제함을 발견하였다.
분자수준에서, ANAC096는, 프로모터 영역내의 고도로 보존된 NAC 인식서열(NACRS)을 인식함으로써, RD29A, RD22, NCED3 및 OST1를 포함한 ABA-의존성 유전자들의 서브셋(subset)의 전사를 활성화시키는 반면, ERD1, ADH1, COR15A 및 CBF2 와 같은 ABA-비의존성 유전자의 전사는 활성화시키는 못한다. 이들 결과에 기초하여, 본 발명자는 비생물적 스트레스하에서 신규의 NAC 모티브 함유 전사조절인자에 의해 매개되는 초기 전사 재프로그래밍에 있어서의 복합 기작을 밝혀내었다.
ABA-매개성 가뭄(탈수) 스트레스 반응과 관련된 분자 메커니즘을 밝히기 위하여, 본 발명자는 활성-태그 돌연변이체(activation-tagged mutants) 풀로부터 ABA-과민감성 표현형을 보이는 신규의 돌연변이체를 스크리닝하였다. 이들중, 유전자에 T-DNA가 삽입된 기능 손실 돌연변이체(loss-of-function mutant)중 하나가 NAC 모티브 함유 단백질인 ANAC096를 인코딩함을 발견하였다. 본 발명자는 ANAC096가 ABA-유도성 유전자 및/또는 가뭄(탈수) 스트레스-유도성 유전자의 서브셋의 전사를 활성화함으로써, 가뭄(탈수) 스트레스 반응시 ABA-의존성 시그널링의 양성 조절자로서 작용함을 밝혔다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 일례일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 한정된 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 형질전환 식물체의 제조
1-1. 시료 애기장대의 재배
본 발명의 실험에서 사용한 모든 애기장대는 23℃ 배양실안에서 MS 플레이트 (plate) 또는 70% 상대습도와 16시간 명조건/8시간 암조건의 주기로 조절되는 온실에서 재배하였다. RNA 추출을 위하여 식물은 수거후 바로 액체질소에 얼렸다.
ABA 처리를 위하여, 1주일간 MS 액체 배지에서 자란 식물에 100 mM ABA를 가하였다. 발아율을 결정하기 위하여, 1% 수크로스와 각기 다른 농도의 ABA를 함유하는 half-strength MS 배지에 멸균 종자를 플랜팅하였다.
발아는 어린뿌리의 돌출(radicle protrusion)과 떡잎의 녹변화(greening of expanded cotyledons)에 기초하여 스코어링하였다. 성장 측정을 위하여, 2% 수크로스 함유 MS 아가 플레이트상에서 자란 5일령의 묘목을 125 mM NaCl 보충 1/2 MS 플레이트에 옮겼다. 뿌리성장은, 이식한지 9일된후 측정하였다. 식물성장에 대한 통계분석은, 5개의 독립한 실험으로 수행하였으며, 30개의 묘목을 유사한 결과로 측정하였다. P 값은 Student t-test를 이용하여 계산하였다.
1-2. T-DNA가 삽입된 변이 식물체의 스크리닝
0.5 mM ABA로 처리된 MS 플레이트상에서 녹색자엽을 보이는 형질전환 애기장대 식물을 활성 표지된 형질전환 풀(activation-tagged transgenic pool)로부터 분리하였다. 활성 표지 선별법(activation tagging screening)은 Cauliflower 모자이크 바이러스의 35S 프로모터 인핸서(enhancer) 서열이 비교적 멀리 떨어져 있는 상태에서도 주변의 유전자의 전사를 활성화시킬 수 있다는 점을 이용하여 기능 획득 돌연변이체를 얻는 방법이다. 먼저 이 인핸서 서열을 애기장대 게놈에 무작위로 도입시킨 후 주위의 유전자의 전사를 활성화시키고, 그 후 기능 획득 표현형을 보이는 식물체를 선별하고 게놈 DNA를 회수하여 전사 활성화된 유전자를 클로닝하는 방법이다.
실제 돌연변이체는 다음 세대에서 확인하였다. T-DNA 삽입부위를 결정하기 위하여, 플라스미드 회수법(plasmid rescue method)을 이용하여, 후보 변이 식물체 유래의 게놈 DNA로부터 플랭킹 영역을 포함하여 T-DNA를 분리하였다. T-DNA 삽입 부위의 플랭킹 영역의 서열정보는 핵산서열분석으로 얻었다.
1-3. 플라즈미드의 제조
ANAC096 유전자에 특이적인 프라이머 ANAC096F(XbaI) 및 ANAC096F(BamHI)를 이용하여 PCR함으로써 cDNA 라이브러리로부터 ANAC096 cDNA를 분리하였다. 얻어진 PCR 산물을, CsVMV 프로모터를 함유하는 식물 binary pCsV1300 벡터(Invitrogen)의 XbaI 및 BamHI 부위에 삽입하였다.
pTA-ANAC096을 제조하기 위하여, PCR 산물을 binary pTA7002 벡터의 XhoI 및 SpeI 부위에 삽입하였다. GAL4-ANAC096F, GAL4-ANAC096N 및 GAL4-ANAC096C을 제조하기 위하여, 프라이머쌍 GAL4F/GAL4R, GAL4NF/GAL4NR, GAL4CF/GAL4CR 각각을 사용하여 PCR로 전장 ANAC096 단백질, 이것의 N-말단 영역, C-말단 영역을 암호화하는 DNA 단편을 제조하였다.
이들 단편을 NdeI 및 PstI 부위를 통해 pGBKT7 벡터에 삽입한 후, RD29A-100을 함유하는 DNA 단편을 프라이머쌍 RD29ApF/RD29ApR을 사용하여 증폭하였다. 처음, 두번째, 또는 이 둘다에서 각각 AAAA 치환을 갖는 3개의 치환 돌연변이체 RD29A-50 (Full) RD29A-50[1A] (1A), RD29A-50[2A] (2A) 및 RD29A-50[1A/2A] (1A/2A)를 PCR로 증폭시켰다. 사용한 프라이머쌍은, RD29A-50[1A]에 대하여 RD29A-50[1A]F/RD29A-50[1A]R, RD29A-50[2A]에 대하여 RD29A-50[2A]F/RD29A-50[2A]R, RD29A-50[1A/2A]에 대하여 RD29A-50[1A]F/RD29A-50[1A]R, RD29A-50[2A]F/RD29A-50[2A]R 이다. GST-ANAC096을 제조하기 위하여, 프라이머쌍 GST-ANAC096F/GST-ANAC096R을 이용하여 PCR로 ANAC096 단편을 만든후, 이 PCR 산물을 BamHI 및 SalI 부위를 통하여 pGEX-5X에 연결하였다. ANAC096 p :GUS 구조물을 제조하기 위하여, ANAC096의 프로모터 영역을 함유하는 3.0 kb 단편을 프라이머쌍 ANAC096pF/ ANAC096pR을 이용하여 PCR로 증폭한 후, 이 PCR 산물을 BamHI 및 NcoI 부위를 통하여 binary 벡터 pCAMBIA3301(Invitrogen)에 삽입하였다. 사용한 프라이머쌍의 염기서열은 하기 [표 1]에 나타낸 바와 같다.
프라이머 명칭 염기서열 (5' --> 3')
ANAC096RTF ATGGGAAGTTCATGTTTACCTCCAG
ANAC096RTR GGAGAAATCTGAGTAACCGAATA
ANAC096F(XbaI) GCTCTAGAATGGGAAGTTCATGTTTACCTCCAG
ANAC096R(BamHI) CGGGATCCGGAGAAATCTGAGTAACCGAATA
ANAC096F(SalI) ACGCGTCGACATGGGAAGTTCATGTTTACCTCCAG
ANAC096R(SpeI) GGACTAGTGGAGAAATCTGAGTAACCGAATA
GAL4F GGCATTCCATATGATGGGAAGTTCATGTTACCTCCA
GAL4R GGCATTCCATATGAATACGAAAATCCGAAA
GAL4NF GGCATTCCATATGATGGGAAGTTCATGTTACCTCCA
GAL4NR CGGCTGCAGCTAGGAGAAATCTGAGTAACCGAA
GAL4CF GGCATTCCATATGAATACGAAAATCCGAAA
GAL4CR CGGCTGCAGCTAAATTTTTCGATCTTTTCCGGTT
RD29ApF GCTCTAGAAAAATGACCACATGATGGGCCAATAG
RD29ApR ACGCGTCGACGAGTAAAACAGAGGAGGGTCTCACT
RD29A-50[1A]F ATGACTTTGAAAACACACCACG
RD29A-50[1A]R CGTGGTGTGTTTTCAAAGTCAT
RD29A-50[2A]F ACGCTTCATAAAAGTCCCTTTA
RD29A-50[2A]R TAAAGGGACTTTTATGAAGCGT
GST-ANAC096F CGGATCCCCATGGGAAGTTCATGTTTACCTCC
GST-ANAC096R CTGGTCGACTCAAGTTTTGATCTCATTCTTCATAGC
ANAC096pF GCTCTAGAATTCTCACTCTACCAAAATAATAAGGT
ANAC096pR CATGCCATGGTTGCAACAACAAAGTAGAATACGATG
ANAC096F AGGCCGTGCCCCGTTA
ANAC096R ATCGCATAGTCGATATTCATGCAT
ACT2F TATGAATTACCCGATGGGCAAG
ACT2R TGGAACAAGACTTCTGGGCAT
RD29AF GATATCGACAAGGATGTGCCG
RD29AR GTATCCAGGTCTTCCCTTCGC
ERD1F GCAGCAGGCGACGATGA
ERD1R TGCAACGGCTGCAATATCA
ADH1F CCATGACAAGCCAATTCAACA
ADH1R TCCTGTCCACCCCACCAT
COR15AF TGTCAGAGTCGGCCAGAAAAC
COR15AR TTAGCGGCGTAGATCAACGA
NCED3F GCTGCGGTTTCTGGGAGAT
NCED3R TTGAGAAGACGATAATGGCGG
RD22F TTGGAGTCGATGGTCGACTTT
RD22R CACCTCAGTGGAAACAGCCC
OST1F TTTCGAGCGAATCTGCAATG
OST1R AGAAAAACCTCGCCTCGTCT
CBF2F GCTCTCCGTGGCAGATCTG
CBF2R CCGCCAAGCCGAGTCA
18SRNAF AAATATCTGC　CGCGTTATCA　
18SRNAR ACAACTTTTGAGAAGATATC
1-4. 형질전환 식물체의 제조
바이너리 구조물인 pCAMBIA-ANAC096 p :GUS, pTA-ANAC096, 및 pCSV1300-ANAC096 을 야생형 식물에 형질전환시켰다. 형질전환된 식물을 하이그로마이신(hygromycin)(25 mg/ℓ) 처리된 MS 플레이트상에서 스크리닝하였다.
실시예 2. ABA 저민감성 변이체 선발
식물체에서 탈수 스트레스 반응의 기작을 확인하기 위해, 활성-태그 돌연변이군에서, 0.5 mM ABA처리시 떡잎의 녹변화 (cotyledon greening)가 일어나는 반응을 이용하여 새로운 ABA 저민감성 변이체를 선발하였다. 선별된 10개 후보 변이체 중, ANAC096 이라는 NAC 부위 단백질을 코딩하는 At5g46590 유전자의 3번 exon에 T-DNA가 삽입된 변이체를 anac096-1 이라 명명하였다 (도 1A 참조).
NAC 부위 단백질은 삼투압 스트레스 반응을 포함한 다양한 세포내 과정에 중요한 역할을 하는, 고도로 보존된 식물 특이적 DNA 결합 부위를 함유하는 것으로 잘 알려져 있다. anac096-1 돌연변이체의 외부 ABA에 대한 감소된 민감성은 ABA 존재시 발아과정 시험을 통해 확인하였다 (도 2A 및 2C 참조). 상기 돌연변이체가 활성-태그 돌연변이군에서 선별되었음에도 불구하고, RT-PCR 분석 결과 At5g46590 유전자의 RNA 발현이 완전히 상실되었음을 확인하였다 (도 1C 참조).
이러한 결과는 anac096-1의 감소된 ABA 민감성은 At5g46590의 과발현이 아닌, 기능 상실로 기인한 것임을 나타낸다. 이를 확인하기 위해, anac096-2로 명명한 또 다른 별개의 ANAC096의 T-DNA 삽입 돌연변이체인 SALK_078797C 식물체를 ABRC 스톡센터에서 얻었다. 두 돌연변이체 모두에서 RT-PCR 확인 결과 ANAC096는 전사되지 않았다 (도 1B 및 1C 참조). anac096-1과 유사하게 새로운 돌연이체 anac096-2도 발아 과정동안 외부 ABA에 감소된 민감성을 보였다 (도 2A 및 2C 참조). 더불어, 두 돌연변이체 모두 뿌리 생장과 식물체 무게를 측정하였을 때 발아후 성장동안 외부 ABA에 대해 덜 민감한 것으로 나타났다 (도 2D 내지 2G 참조). 이 결과는 ANAC096이 ABA 매개 반응에 순방향으로 관여한다는 것을 나타내고 있다.
이 두 돌연변이체들의 표현형이 같은 유전자위치, ANAC096의 변이로 인한 것임을 재확인하기위해, anac096-1과 anac096-2의 교배 1세대 자손의 ABA 민감성을 조사하였다. 위 결과와 일치하게도 교배 1세대 자손 또한 외부 ABA에 감소된 민감성을 보였다 (도 2A 및 2C 참조). 이들 결과는 돌연변이체의 표현형이 ANAC096의 돌연변이로 인한 것임을 강하게 뒷받침하는 것이다.
ANAC096이 ABA 매개 과정에 관여하고 있음을 독립적으로 증명하기 위해, CsVMV 프로모터 조절 하에 ANAC096이 과발현되는 유전자변형 식물체를 생성하여 외부 ABA에 대한 이 식물체의 민감성을 조사하였다(도 1D 참조). 돌연변이 식물체와 달리, 두 종류의 ANAC096 과발현 식물체(ANAC096OX plants)들은 발아시 (도 2B 및 2C)와 발아 후 성장(도 2D)에서 외부 ABA에 대한 증가된 민감성을 보여, ANAC096이 ABA 매개 반응에 관여함이 확인되었다. ANAC096 과발현 유전자변형 식물체들에서의 ANAC096 발현은 RT-PCR로 검증되었다 (도 1D 참조).
실시예 3. 기공 개도 및 수분손실 측정
비생물적 스트레스에 대한 ABA 매개 반응시 ANAC096의 생리학적 기능을 확인하기 위해, 탈수 스트레스 하에서의 돌연변이체의 표현형을 조사하였다.
3-1. 기공 개도 측정
고수준의 ABA가 기공폐쇄를 유도하는 것이 알려져 있음을 이용하여 anac096 돌연변이체의 ABA 매개 기공 개도(stomatal aperture)를 시험하였다.
anac096-1, anac096-2과 야생형 식물체의 표피 껍질을 완충용액(10 mM Mes-Tris (pH 6.15), 50 mM CaCl2, 10 mM KCl)에 띄운 후 완전한 기공 열림 유도를 위해 3시간동안 빛에 노출하였다(150 mmol m-2 sec-1). 그 후, 추가적으로 1시간 동안 ABA (1.0 mM) 처리하여 기공폐쇄를 유도하여 기공 개도를 측정하였다.
그 결과, 야생형보다 anac096 돌연변이 식물체의 기공 구멍 크기가 더 큰 것으로 미루어, anac096 돌연변이 식물체는 ABA 매개 기공폐쇄에 결함을 지니고 있음이 드러났다 (도 3A 및 3B 참조).
3-2. 수분손실 측정
이 ABA 매개 기공폐쇄에서의 결함을 통해 anac096 돌연변이 식물체가 더 높은 수준의 수분이 손실될 가능성이 있다는 것을 유추할 수 있다. 이를 확인하기 위해, anac096 돌연변이 식물체와 야생형 식물체의 대기에 노출된 부분을 절제한 뒤 시간당 수분 손실을 측정하였다. 수분손실은, 2주동안 MS 플레이트상에서 자란 식물체 기부(aerial part)를 절취하여, 벤치(40% 상대습도)에 두어 무게를 잼으로써 측정하였다.
그 결과, 실제로 anac096 돌연변이 식물체는 야생형 식물체보다 빠르게 수분이 손실되고 있음이 나타났다(도 3C 참조). 수분 손실 조절에서의 ANAC096의 역할을 뒷받침하는 다른 증거를 얻기 위해 ANAC096 과발현 유전자변형 식물체의 수분 손실 정도 또한 측정하였다. 위와 동일한 조건 하에서 ANAC096 과발현 유전자변형 식물체가 야생형 식물체보다 더 늦게 수분 손실을 보임으로써 ANAC096이 수분 손실 조절과 관련있음을 확인하였다.
ANAC096의 탈수 스트레스 반응시의 역할을 보다 자세히 규명하기 위해, anac096 돌연변이 식물체, ANAC096 과발현 유전자변형 식물체, 야생종 식물체를 2 주간 정상 조건에서 생육한 뒤 10 일간 물을 주지 않는 탈수 스트레스에 노출시켰다. 3일간의 수분 공급 후 생존율을 측정한 결과, anac096 돌연변이 식물체가 야생종 식물체보다 탈수스트레스에 더 민감하였다. 반면, ANAC096 과발현 유전자변형 식물체는 탈수 스트레스에 더 저항성을 나타냄으로써 (도 3D 및 3E 참조), ANAC096이 탈수 스트레스 반응에서 순방향으로 작용함을 강하게 보여주고 있다.
실시예 4. 정량 qRT-PCR 분석
ANAC096의 전사가 ABA와 건조 스트레스에 의해 조절될 수 있다는 가능성을 검증하기 위해, 정량적 RT-PCR을 이용하여, 여러 다른 종류의 스트레스와 ABA 처리 조건에서의 ANAC096의 ANAC096의 발현 양상을 조사하였다.
이때, 정량적 RT-PCR은, RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)을 사용하여 식물조직에서 전체 RNA를 준비하여, TURBO DNase (Ambion)로 처리하였다. High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (AB)를 사용하여 전체 RNA를 역전사하여 cDNA를 제조하였다. 전사체 수준을 측정하기 위하여 SYBR Green Kit을 이용하여 qRT-PCR를 수행하였다. ACT2 를 내부 대조군으로 하였으며, 이때 사용한 프라이머의 염기서열은 상기 [표 1]에 나타낸 바와 같다. cDNA 10ng, 각 프라이머 0.5mM, Taq 폴리머라제 1U을 함유하는 20ml 반응액을 PCR하였다. PCR 증폭은, 94℃에서 4분간 변성후, 94℃에서 15초, 55℃에서 30초, 72℃에서 60초를 30사이클 수행하였다.
그 결과, ABA 처리시, 정량적 RT-PCR로 측정하였을 때 ANAC096의 전사 레벨은 1시간 후 4배 이상 급격히 증가하였다(도 4A 참조). 유사하게 탈수와 삼투압 스트레스 또한 ANAC096의 발현을 빠르게 유도하였으나, 이러한 현상은 저온 스트레스시 나타나지 않는 결과를 보임으로써 ANAC096의 발현이 탈수 스트레스와 삼투압 스트레스 조건 하에서 ABA 의존적 방식으로 조절됨을 의미한다 (도 4A 참조).
ANAC096의 기능 손실이 ABA 반응에 있어서 유전자 발현 양상에 영향을 미치는지를 확인하기 위해 돌연변이체와 야생형 식물체에 100 mM ABA를 처리하고, 대표적으로 ABA에 의해 발현이 유도된다고 알려진 RD29A, RD29B과 COR47 의 발현 정도를 정량적 RT-PCR(qRT-PCR)로 확인하였다.
그 결과, 야생형 식물체에 비해 돌연변이 식물체에서의 이들 전사체의 발현 유도 양상이 현저하게 손상되는 것으로 나타나, ANAC096이 이들 유전자들의 효과적 신호 전달에 필수적인 요소임이 확인되었다(도 4B 참조).
ANAC096가 매개하는 ABA 신호전달과 탈수 스트레스 신호전달의 기전을 규명하기 위해, ANAC096가 직접적으로 조절하는 유전자를 확인하고자 하였다. ANAC096의 이소성 발현(ectopic expression)이 매개하는 ABA 신호전달의 부가적인 효과를 최소화하기 위해, 덱사메타손 유도 프로모터(dexamethasone (Dex)-inducible promoter) 하에 ANAC096의 발현이 조절되는 유전자 변형 식물체를 생성하였다. 덱사메타손과 사이크로헥사마이드(Cyclohexamide, CHX)를 동시에 1시간 동안 처리할 경우, ANAC096의 전사는 급속히 유도되었다. 다른 삼투압 반응 유전자의 전사도 정량적 RT-PCT을 통해 확인하였다. ABA 처리 뿐만 아니라 탈수 스트레스에도 강하게 유도되는 ABA 의존적인 유전자를 포함한 몇몇 마커 유전자, NCED3, RD22, RD29A 및 OST1, 그리고 약하게 반응하거나 전혀 반응하지 않는 ABA-비의존적인 유전자인 ADH1, COR15A, ERD1 및 CBF2의 전사를 확인하였다.
그 결과, 이들 유전자 중에서 CED3, RD22, RD29A 및 OST1의 전사 수준이 현저하게 증가한 반면에(도 5A 참조), ADH1, COR15A, ERD1, 및 CBF2의 전사는 대조군의 비해 다소 증가하거나 증가하지 않는 결과를 나타내었다(도 5B 참조). 이러한 결과들은 ANAC096가 ABA에 의존적인 삼투압스트레스 반응 유전자들의 전사에 직접적으로 연관되어 있음을 보여준다.
실시예 5. EMSA(electrophoresis mobility shift assay)
NAC 전사조절인자는 NAC 인지 서열(NAC recognition sequences, NACRS)로 알려진, 공통 시스-작용 배열(consensus cis-acting elements)인 CGT(G/A) 와 CACG를 인지하는 것으로 알려져 있다. ANAC096이 이 공통 모티프에 보존적으로 인지하는 활성을 갖는지 확인하기 위해 ANAC096의 발현을 가장 크게 유도하는 RD29A 프로모터를 사용하였다. 서열확인 결과, RD29A는 프로모터의 -99bp에서 -50bp 사이에 두 개의 NACRS를 포함하고 있는 것으로 확인되었고(도 6A 참조), 이들 중 하나는 잘 알려진 ABRE 안에 위치하는 것으로 나타났다.
ANAC096이 이들 배열에 결합하는지 확인하기 위해, RD29A는 프로모터의 -99bp에서 -50bp 부위의 50bp의 DNA 단편을 이용하여 EMSA(electrophoresis mobility shift assay)를 수행하였다. 이때, EMSA는 융합 단백질인 GST-ANAC096를 E. coli BL21 DE3에 형질전환후, 1mM의 이소프로필β-D-1-티오갈락토피라노시드 존재하 16℃에서 밤새 배양하여, 글루타티온-아가로스 비즈를 사용하여 재조합 융합단백질을 정제하여 공지의 방법으로 수행하였다. GST-ANAC096N (1ug)를 0.02 pmol의 32P-표지 프로브 RD29A-50 (Full), RD29A-50[1A] (1A), RD29A-50[2A] (2A), RD29A-50[1A/2A] (1A/2A))와 배양하고(총 20ul), 이 반응혼합물을 6% 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동하여 X-ray 필름에 블랏팅하였다.
그 결과, GST가 아닌 GST-ANAC096N에서만 서서히 이동하는 밴드가 나타나는 결과를 보여, ANAC096N가 NACRS를 포함하는 RD29A 프로모터 단편과 결합하는 것을 확인할 수 있었다(도 6B 참조). 두 결합위치(CGT(G/A) 와 CACG)를 동시에 또는 하나씩 AAAA로 변이시킨 경우에도 GST-ANAC096N는 여전히 단일변이를 포함하는 DNA 단편에 결합하였으나, 두 위치 동시에 변이를 갖는 단편에는 결합하지 않는 것으로 나타나, ANAC096는 두 개의 NACRS를 특이적으로 이용하여 RD29A 프로모터를 인지한다는 것을 알 수 있었다(도 6B 참조).
실시예 6. 원형질체에서의 발현
다음으로, 이들 NACRS가 ANAC096을 매개로하는 전사활성에 필요한 요소인지 조사하였다. RD29A의 -99에서 -50 bp 프로모터 부위(RD29A50 p )를 루시퍼라제(LUC) 유전자와 결합시킨 키메라 RD29A50 p :LUC를 생성하여 이를 리포터 유전자로 사용하였다(도 6C 참조). 앞서 EMSA 실험에 사용된 세 종류의 RD29A50 p 돌연변이체 또한 포함되었다. RD29A50 p :LUC의 야생형 혹은 돌연변이체들은 PEG 매개 형질전환법에 따라 UBQ10 프로모터로 조절되는 b-글루쿠로니다제(b-glucuronidase, GUS) 키메라, UBQ10 p :GUS와 함께 유도성 ANAC096 유전자변형 식물체의 원형질체에 형질도입하였다. UBQ10 p :GUS는 형질도입효율 확인을 위해 사용되었다(도 6C 참조).
형질도입된 원형질체는 24 시간 배양 후 1시간 동안 30mM Dex를 처리하였다. LUC 전사 수준은 정량적 RT-PCR로 확인하였다. 탈수 스트레스 신호전달의 활성을 통한 리포터 유전자 전사에 대한 이차적인 효과를 최소화하기 위해 ANAC096의 발현을 1시간 동안 유도하였다. 원형질체 전체 RNA를 정량적 RT-PCR을 위해 추출하였고 분석을 위해 LUC의 전사 수준을 GUS로 보정하였다.
그 결과, 야생종 RD29A50 p 원형질체에서 LUC 전사 수준은 대조군에 비해 2.5 배 증가하였다(도 6D 참조). 반면 두 종류의 단일변이체들은 LUC 발현의 미미한 증가만을 보였으며, 두 위치에서의 단일변이체 모두를 지닌 경우에는 전혀 증가하지 않는 것으로 나타나 적어도 NACRS의 한 쌍이 RD29A 프로모터의 유의한 활성에 필요하다는 것이 확인되었다. 또한 C-말단이 절단된 ANAC096은 온전한 RD29A50 p :LUC 발현 유도가 이루어지지 않는 것으로 미루어볼 때, 전사 활성에 있어서 C-말단의 중요성이 드러났다(도 6D 참조).
위 결과들을 고려할 때, ANAC096이 RD29A 프로모터 내의 보존된 NACRS을 인지함으로써 전사를 활성화시킨다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 7. yeast one-hybrid 기법
NAC 전사조절인자 구성원들은 고도 보존된 N-말단 DNA 결합 부위와 전사 활성 혹은 억제 기능을 가진 C-말단 가변성 부위를 지니고 있다. ANAC096이 삼투압 스트레스로 유도되는 일부 유전자들의 전사를 활성시킨다는 사실은 ANAC096의 C-말단 부위가 전사 활성인자로 작용할 가능성을 의미한다.
이를 확인하기 위해, yeast one-hybrid 기법을 이용하였다. GAL4의 DNA 결합 부위와 ANAC096의 전체, N-말단 또는 C-말단을 각각 연결한 GAL4-ANAC096F, GAL4-ANAC096N, 또는 GAL4-ANAC096C를 제작하였다(도 6E 참조). 이들을 리포터 유전자인 GAL4 p ::His와 함께 효모(AH109)에 형질 도입하여 His 결핍 배지에서 형질 도입된 효모의 성장을 확인하였다.
그 결과, GAL4-ANAC096F 또는 GAL4-ANAC096C이 형질 도입된 효모에서 정상적으로 성장하는 결과를 나타내는 것으로 보아, ANAC096이 C-말단 부위를 이용하여 전사 활성인자로 작용한다는 것을 알 수 있었다(도 6F 참조).
<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> NEW TRANSCRIPTION FACTOR ANAC096 IMPROVING THE RESISTANCE TO THE DROUGHT STRESS IN PLANTS <130> PB13-11246 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 292 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 Met Gly Ser Ser Cys Leu Pro Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Thr Asp 1 5 10 15 Glu Glu Leu Ile Glu Tyr Tyr Leu Lys Arg Lys Val Glu Gly Leu Glu 20 25 30 Ile Glu Leu Glu Val Ile Pro Val Ile Asp Leu Tyr Ser Phe Asp Pro 35 40 45 Trp Glu Leu Pro Asp Lys Ser Phe Leu Pro Asn Arg Asp Met Glu Trp 50 55 60 Tyr Phe Phe Cys Ser Arg Asp Lys Lys Tyr Pro Asn Gly Phe Arg Thr 65 70 75 80 Asn Arg Gly Thr Lys Ala Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Lys Asp Arg 85 90 95 Lys Ile Thr Ser Arg Ser Ser Ser Ile Ile Gly Tyr Arg Lys Thr Leu 100 105 110 Val Phe Tyr Lys Gly Arg Ala Pro Leu Gly Asp Arg Ser Asn Trp Ile 115 120 125 Met His Glu Tyr Arg Leu Cys Asp Asp Asp Thr Ser Gln Gly Ser Gln 130 135 140 Asn Leu Lys Gly Ala Phe Val Leu Cys Arg Val Ala Met Lys Asn Glu 145 150 155 160 Ile Lys Thr Asn Thr Lys Ile Arg Lys Ile Pro Ser Glu Gln Thr Ile 165 170 175 Gly Ser Gly Glu Ser Ser Gly Leu Ser Ser Arg Val Thr Ser Pro Ser 180 185 190 Arg Asp Glu Thr Met Pro Phe His Ser Phe Ala Asn Pro Val Ser Thr 195 200 205 Glu Thr Asp Ser Ser Asn Ile Trp Ile Ser Pro Glu Phe Ile Leu Asp 210 215 220 Ser Ser Lys Asp Tyr Pro Gln Ile Gln Asp Val Ala Ser Gln Cys Phe 225 230 235 240 Gln Gln Asp Phe Asp Phe Pro Ile Ile Gly Asn Gln Asn Met Glu Phe 245 250 255 Pro Ala Ser Thr Ser Leu Asp Gln Asn Met Asp Glu Phe Met Gln Asn 260 265 270 Gly Tyr Trp Thr Asn Tyr Gly Tyr Asp Gln Thr Gly Leu Phe Gly Tyr 275 280 285 Ser Asp Phe Ser 290 <210> 2 <211> 879 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 atgggaagtt catgtttacc tccagggttc cggtttcatc ctacggatga agaactcatc 60 gaatattact tgaaaagaaa agtcgaaggt ctcgagattg agcttgaagt cattcccgtc 120 atcgatcttt atagtttcga tccttgggag ttaccagaca agtcgtttct cccaaaccgg 180 gacatggaat ggtacttctt ctgctcaagg gacaaaaaat atcctaatgg ttttcgtaca 240 aatcgaggaa caaaggctgg ttattggaaa gcaaccggaa aagatcgaaa aattacttct 300 cgttcatctt ctataattgg ttatagaaaa actctagttt tctacaaagg ccgtgccccg 360 ttaggcgata gaagcaattg gatcatgcat gaatatcgac tatgcgatga tgatacatca 420 caaggatcac aaaatttaaa gggagctttt gtgttatgtc gtgttgctat gaagaatgag 480 atcaaaacta atacgaaaat ccgaaaaatt ccaagcgagc aaacaatcgg atcaggagaa 540 agctcgggtt tatcaagccg agtaacgtct cctagtcgcg atgaaacaat gccgtttcac 600 tcatttgcca atcctgtatc tactgaaact gattcttcca acatttggat ttcacctgaa 660 ttcatcctcg attcttcaaa ggactatcct caaatccaag atgtcgcatc tcagtgcttc 720 caacaagact ttgattttcc gatcatcggt aaccaaaaca tggagtttcc agcgagtaca 780 agcttagatc agaacatgga tgagtttatg caaaacggtt attggacaaa ttatggatac 840 gatcaaaccg gtttattcgg ttactcagat ttctcctag 879

Claims (8)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 전사활성인자 ANAC096를 암호화하는 유전자를 포함하는 식물세포 발현벡터로 식물체를 형질전환시킨 후, 상기 ANAC096를 과발현시킴으로써 식물체의 가뭄 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 ANAC096는 애기장대(Arabidopsis thaliana)로부터 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 ANAC096는 NAC 모티프를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 1 항의 방법에 의해 가뭄 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체.
KR1020130036489A 2013-04-03 2013-04-03 가뭄 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 식물의 신규 전사조절인자 ａｎａｃ０９６ KR101439761B1 (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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PNAS, 103권, 35호, 12987-12992쪽(2006.08.29.) *

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