KR20090093302A

KR20090093302A - 리카린 이를 함유하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용약학적 조성물

Info

Publication number: KR20090093302A
Application number: KR1020080018756A
Authority: KR
Inventors: 황재관; 이해지; 권송희; 심재석
Original assignee: 황재관
Priority date: 2008-02-29
Filing date: 2008-02-29
Publication date: 2009-09-02
Also published as: KR100964906B1

Abstract

본 발명은 리그난계 화합물을 함유하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 리카린 이(Licarin E) 또는 육두구 가종피(aril of nutmeg) 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물에 관한 것이다.

기 화학식 Ⅰ의 리카린 이는 염증 매개 인자인 iNOS, COX-2, TNF-α 및 IκBα의 생성 또는 발현을 저해시킴으로써 항염증 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명의 리카린 이 또는 육두구 가종피 추출물을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 약학적 조성물은 염증성 질환의 치료 또는 예방에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

리카린 이를 함유하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for treating or preventing an inflammatory disease comprising licarin E}

본 발명은 리카린 이(Licarin E)를 함유하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 리카린 이 또는 육두구 가종피(aril of nutmeg) 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물에 관한 것이다.

[화학식 Ⅰ]

염증 반응이란 조직(세포)의 손상이나 외부감염원에 감염되었을 때 발생하며 국소 혈관과 체액 중 각종 염증 매개인자 및 면역세포가 관련되어 효소 활성화, 염증 매개물질 분비, 체액 침윤, 세포이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종 발열 통증 등 외적 증상을 나타낸다. 또한 그 결과에 따라 급성 염증과 육아종(granuloma 염증), 류마티스 관절염, 골 관절염 등의 만성염증의 증상으로 나타난다(Goodwin J.S. et al., J. Clin . Immunol ., 9: 295-314, 1989).

혈액응고와 염증에 중요한 영향을 미치는 효소 가운데 사이클로옥시게나제(cyclooxygenase, 이하 'COX'라 함)가 중요한 작용을 하는데, COX는 프로스타글란딘(prostaglandin)과 트롬복산(thromboxane)이란 두 가지 주요 산물을 생성한다. 프로스타글란딘은 매우 다양한 생리활성을 갖는 불포화지방산으로 염증 및 통증 전달, 혈관확장, 체온조절, 위액분비 촉진 등 우리 몸에서 국소적 호르몬 또는 세포기능 조절인자로 작용한다(Marnett, L.J. et al., J. Biol . Chem ., 274: 22903-22906, 1999). COX-1은 위장관 보호, 신장의 혈류조절 및 혈소판 응집과 같은 정상적인 생리적 반응을 유지함으로서 세포의 항상성 유지에 중요한 역할을 한다. 한편, 외부자극에 의해 염증이 유발되어 전달되는 과정에서는 유도성 동종효소인 COX-2가 일시적으로 발현되어 염증이 일어나는 곳에서 프로스타글란딘을 과량 방출 하게 된다. 프로스타글란딘은 염증의 주요 증상인 홍반, 부종 및 통증을 일으키고, 내인성 염증매개물질인 히스타민 등의 작용을 증가시키는 활성이 있으므로 염증부위에서 프로스타글란딘의 생성억제는 염증치료에 많은 도움을 줄 수 있다.

현재 상업적으로 사용되는 비스테로이드 소염제(Non-steroidal anti-inflammatory drugs; NSAIDs)인 아스피린(aspirin), 인도메타신(indomethacin), 나프록센(naproxen), 이부프로펜(ibuprofen) 등은 COX-2 효소의 활성을 억제하여 프로스타글란딘 생성을 저해함으로써 항염효과를 나타낸다(Meade E.A. et al., J. Biol . Chem., 268: 6610, 1993). 그러나 이들 NSAID 약물들은 염증자극에 의해 일시적으로 발현되는 COX-2뿐만 아니라 위장관, 신장 혈소판의 정상기능을 유지하는데 중요한 역할을 하는 COX-1도 억제함으로써 위장관 출혈, 신장 기능부전 등의 심각한 부작용을 초래하는 문제점이 있다(Surh Y.J. et al., Mutation Research 480-481: 243-268, 2001). 따라서 부작용을 최소화하면서 항염증 작용을 제공하는 물질을 천연물로부터 발굴하는 것은 산업적으로 매우 중요하다.

육두구(nutmeg)는 열대지방에서 재배되는 다년생 식물인 미리스티카 프라그란스(Myristica fragrans)의 열매로서 오래전부터 향신료로 이용되어 왔다. 육두구 가종피(aril)는 헬리코박터 파일로리 균의 성장 억제 활성(In Vivo., 17;541-4, 2003), 간의 해독작용 기작의 활성화(Food Chem . Toxicol., 31;517-21, 1993), 피부 사마귀의 화학적 예방작용(Cancer Lett., 56;59-63, 1991) 등이 보고되었다.

리카린 이는 육두구 가종피에서 발견되는 대표적인 리그난(lignan)계 화합물로서 항염증활성에 대해서는 지금까지 전혀 보고된 바 없다.

이에, 본 발명자는 항염증활성을 가지는 천연물 유래 화합물을 찾고자 장기간 탐색한 결과, 육두구 가종피 추출물로부터 분리정제된 리카린 이가 탁월한 항염증활성을 보이는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 육두구 가종피 추출물로부터 분리정제된 리카린 이의 신규한 용도를 제공하는 것이다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 리카린 이는 염증 매개 인자인 iNOS, COX-2, TNF-α 및 IκBα의 생성 또는 발현을 저해시킴으로써 염증 반응을 억제하는 효과가 있다. 따라서 본 발명의 리카린 이 또는 육두구 가종피 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 염증성 질환의 치료 또는 예방에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 육두구 가종피(aril of nutmeg)로부터 리카린 이(Licarin E)를 분리하는 공정도이다.

도 2는 본 발명의 리카린 이의 ¹H-NMR 스펙트럼이다.

도 3은 본 발명의 리카린 이의 ¹³C-NMR스펙트럼이다.

도 4는 본 발명의 리카린 이의 DEPT 스펙트럼이다.

도 5는 본 발명의 리카린 이의 FAB-Mass 스펙트럼이다.

도 6은 본 발명의 리카린 이의 iNOS 생성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.

도 7은 본 발명의 리카린 이의 COX-2 발현 억제 효과를 나타낸 그래프이다.

도 8은 본 발명의 리카린 이의 TNF-α발현 억제 효과를 나타낸 그래프이다.

도 9는 본 발명의 리카린 이의 IκBα발현 억제 효과를 나타낸 그래프이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 리카린 이 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식 Ⅰ]

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 육두구 가종피 추출물로부터 분리정제된 리카린 이의 신규한 용도를 제공하는 데 그 특징이 있다.

본 발명에 따른 리카린 이는 하기의 화학식 Ⅰ로 표시된다.

[화학식 Ⅰ]

본 발명에 따른 리카린 이는 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

본 발명의 리카린 이는 종래의 물질을 추출하고 분리하는 방법을 이용하여 식물 또는 식물의 일부로부터 수득될 수 있다. 줄기, 뿌리 또는 잎은 목적하는 추출물을 획득하기 위하여 적절히 탈수하여 침연(macerated)하거나 단지 탈수하고, 목적하는 추출물은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 알려진 정제 방법을 이용하여 정제된다. 또한 상기 화학식 Ⅰ로 표시되는 리카린 이에 상응하는 합성 화합물 또는 이들의 유도체는 일반적으로 구매 가능한 물질이거나, 공지의 합성 방법을 이용하여 화학적으로 제조될 수 있다.

상기 화학식 Ⅰ로 표시되는 본 발명의 리카린 이는 육두구 가종피로부터 분리정제될 수 있다. 상기 육두구는 미리스티카 프그란스(Myristica fragrans)의 성숙한 과실 또는 과실 속에 있는 종자를 말한다. 또한 본 발명의 리카린 이는 육두구 종자를 압착하여 얻은 오일로부터 분리정제될 수 있다.

본 발명의 리카린 이의 분리를 위한 추출 용매로는 물 또는 C1-C6의 유기용매를 사용할 수 있다. 바람직하게는 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane), 시클로헥산(cyclohexane), 석유에테르(petroleum ether) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는 에탄올 또는 헥산을 사용할 수 있다. 육두구 가종피 추출물로부터 본 발명의 리카린 이의 분리 및 정제는 실리카겔(silica gel)이나 활성 알루미나(alumina)등의 각종 합성수지를 충진한 컬럼 크로마토그라피(column chromatography) 및 고속액체크로마토그라피(HPLC) 등을 단독으로 혹은 병행하여 사용할 수 있다. 그러나 유효성분의 추출 및 분리정제 방법은 반드시 상기한 방법에 한정되는 것은 아니다.

이와 같이 본 발명의 리카린 이는 순수하게 분리정제된 화합물의 형태로 사용될 수 있으며, 또한 이를 함유하는 추출물의 형태로도 사용될 수 있다. 예컨대, 상기 기재한 바와 같은 미리스티카 프라그란스의 종자, 과실 또는 가종피 추출물이나 미리스티카 프라그란스의 종자를 압착하여 얻은 오일의 형태로 사용될 수도 있다. 상기 추출물은 상기한 바와 같이 미리스티카 프라그란스을 물 또는 C1-C6의 유기용매로 추출하여 얻을 수 있다. 바람직하게는 미리스티카 프라그란스의 종자 또는 가종피일 수 있다.

본 발명의 리카린 이는 다양한 염증 반응을 매개하는 물질들을 억제하여 항염증 활성을 가진다.

NO는 신경전달, 혈관의 이관 및 세포 매개성 면역반응에 관여하는 물질로서, NOS(nitric oxide synthase)에 의해 L-arginine으로부터 생성된다(Nathan and Xie, 1994; Alderton et al., 2001). 특히 대식세포가 IFN-γ 또는 LPS(lipopolysaccaride)에 의해 자극되면 iNOS(inducible nitric oxide synthase)가 발현되고, 상기 iNOS에 의해서 많은 양의 NO가 생성된다. 본 발명의 리카린 이는 대식세포에서 NO 생성에 관여하는 iNOS의 발현을 농도 의존적으로 억제하는 것으로 나타났다(도 6 참조).

또한 COX-2는 체내의 염증반응에 관여하는 물질로서 염증성 PG를 생산한다. COX-2는 세균류에 의해 분비되는 내독소인 LPS와 염증성 사이토카인류인 IL-1, TNF-α, IFN-γ 등에 의해 발현이 유도된다. 본 발명의 리카린 이는 COX-2의 발현을 농도 의존적으로 억제하는 효과가 있다(도 7 참조).

종양괴사인자인 TNF-α(tumor necrosis factor α)는 그람 음성 박테리아와 다른 감염성 미생물에 대한 급성 염증반응의 주된 매개 인자이다. LPS에 의해 자극된 대식세포는 TNF-α의 합성을 증가시킨다. TNF-α의 생물학적 작용은 저농도에서 백혈구와 내피세포에 작용하여 급성염증을 유도한다. 중간 농도에서는 염증의 전신적 반응을 매개하고 고농도에서는 패혈증(sepsis) 쇼크의 병리학적 이상으로 사망을 초래한다. 또한 TNF-α는 PG의 합성을 증가하여 열을 생성하고, 트롬보모둘린(trombomodulin)의 발현을 억제하여 혈관성 플러깅(vascular plugging)을 초래한다(Abbas and Lichtman, "Cellular and Molecular Immunology"the fifth edition. pp. 247-253, 2003). 본 발명의 리카린 이는 대식세포와 인간 단핵구 세포에서 TNF-α의 생성을 억제하는 효과가 있다(도 8 참조).

iNOS 및 COX-2의 발현은 복잡한 세포전달과정을 통하여 이루어지고, 외부의 신호를 세포 안으로 전달하는 다양한 효소들(kinase)이 관여하게 되는데 그중 nuclear factor-kappa B(NF-κB)가 iNOS 및 COX-2의 발현에 주된 영향을 미친다. LPS나 TNF-α의 자극으로 타이로신(tyrosine)이나 세린/트레오닌(serine/threonine) kinase가 인산화 및 활성화 되고 세포질에 존재하는 NF-κB 복합체의 억제 구성요소인 inhibitor-kappa B(IκB)가 IκB kinase에 의하여 인산화 및 활성화되어 단백 분해됨으로서 NF-κB가 활성화 된다. 본 발명의 리카린 이는 NF-κB의 생성에 영향을 미치는 IκBα의 인산화를 억제하는 효과가 있다(도 9 참조).

또한 본 발명의 리카린 이를 TPA(12-O-tetradecanoylphorbol-13- acetate) 처리로 부종을 유발시킨 래트의 귀에 국소도포한 결과, 농도 의존적으로 부종 생성율이 억제되었으며, 현재 상업적인 항염증제로 사용되는 인도메타신보다 높은 부종 억제율을 보였다(표 2 참조). 또한, 리카린 이를 함유하는 크림을 제조한 후 이를 래트의 귀에 국소도포한 결과, 부종 생성율이 크게 억제되었다(표 4 참조).

한편, 본 발명자들은 육두구 가종피 에탄올 추출물을 TPA 처리로 부종을 유발시킨 래트의 귀에 국소도포한 결과, 농도 의존적으로 부종 생성율이 억제됨을 확인할 수 있었다(표 5 참조).

이러한 결과들은 본 발명의 리카린 이가 COX-2 뿐 아니라 염증 반응을 매개하는 다양한 인자들을 억제하여 탁월한 항염증 작용을 나타내는 것을 의미한다. 또한 육두구 가종피 추출물 자체로도 동일한 항염증 효과를 얻을 수 있음을 나타내는 것이다. 이와 같은 화학식 Ⅰ로 표시되는 본 발명의 리카린 이 및 육두구 가종피 추출물의 항염증 활성에 대해서는 본 발명에서 처음으로 규명한 것이다.

현재 상업적으로 사용되는 비스테로이드 소염제들이 대부분 COX-2 효소의 활성을 억제하여 항염증효과를 나타냄을 볼 때, 본 발명의 리카린 이는 종래 항염증제보다 더욱 우수한 효과를 가지는 항염증제로서 사용될 수 있음을 알 수 있다.

따라서 본 발명은 상기 화학식 Ⅰ로 표시되는 리카린 이, 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 육두구 가종피 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 육두구 가종피 추출물의 제조는 위에서 기재한 바와 같다.

본 발명의 조성물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 일반적인 의약품의 형태로 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 리카린 이 또는 육두구 가종피 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 연고제, 크림제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 화학식 Ⅰ의 리카린 이 또는 육두구 가종피 추출물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화한다. 투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배로, 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 바람직하기로는 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다.

본 발명의 화학식 Ⅰ로 표시되는 리카린 이 또는 육두구 가종피 추출물의 유효용량은 1회 복용량이 0.1 - 50 mg/kg이고, 바람직하기로는 1 - 10 mg/kg이며, 하루 1 - 3 회 투여될 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

본 발명의 리카린 이를 래트에 경구 투여시의 독성 실험을 수행한 결과, 경구 독성시험에 의한 50 % 치사량 (LD₅₀)은 2,000 mg/kg 이상인 것으로 나타났다.

특히, 본 발명의 리카린 이 또는 육두구 가종피 추출물을 함유하는 약학적 조성물은 피부 도포용 의약품 즉 연고, 크림의 형태로 제제화될 수 있으며, 제제물 총 중량에 대하여 0.001 - 10.0 중량%, 바람직하게는 0.005 - 5.0 중량%의 범위 내에서 제형에 따라 적절하게 배합될 수 있다. 0.005 중량% 미만으로 첨가하는 경우에는 항염증 활성이 낮아지고, 10.0 중량%를 초과하여 첨가하는 경우에는 첨가량만 많아질 뿐 항염증 활성에 있어서 큰 차이가 없기 때문이다.

본 발명의 약학적 조성물이 적용될 수 있는 염증성 질환은 NO, iNOS, COX-2, PGE₂, TNF-α, IκBα 등과 같이 일련의 염증 반응을 일으키는 다양한 자극 요인들로 인하여 유발된 염증을 동반하는 질환을 말한다. 상기 염증성 질환에는 부종 등과 같은 일반적인 염증 증상을 포함하여 염증성 장 질환, 복막염, 골수염, 봉소염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 알러지성 비염, 낭포성 섬유증, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 급성 세기관지염, 만성 세기관지염, 골관절염, 통풍, 척추관절병증, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 건선성 관절병증, 장질환 척추염, 연소자성 관절병증, 연소자성 강직성 척추염, 반응성 관절병증, 감염성 관절염, 후-감염성 관절염, 임균성 관절염, 결핵성 관절염, 바이러스성 관절염, 진균성 관절염, 매독성 관절염, 라임 병, '혈관염 증후군'과 관련된 관절염, 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게닉 육아종증, 류마티스성 다발성근육통, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염(테니스 엘보), 신경병증성 관절 질환(neuropathic joint disease; 또는 'charcot joint'이라고도 함), 출혈성 관절증(hemarthrosic), 헤노흐-쉔라인 자반병, 비후성 골관절병증, 다중심성 세망조직구종, 척추측만증(scoliosis), 혈색소증, 혈색소병증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, 가족성 지중해열(familial Mediterranean fever), 베하트 병, 전신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 급성 호흡곤란 증후군, 다발성 장기부전, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 급성 폐손상(acute lung injury) 및 기관지 폐 형성장애(broncho-pulmonary dysplasia) 등을 포함하며, 이에 제한되지는 않는다. 또한 급만성 습진, 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 지루성 피부염, 박탈 피부염, 일광 피부염, 건선 등 염증성 피부질환도 포함된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 또한 하기 실시예 및 실험예들에서 특별히 부피%임을 명시하지 않은 %는 중량%를 나타낸다. 또한 모든 활성 분석은 모두 3회 이상 반복 수행하였으며 그 결과는 평균값과 표준편차로 표시하였다. 또한 통계분석은 Students's t-test를 이용하여 수행하였으며, p 값은 <0.01이하인 경우에 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다.

< 실시예 1>

육두구 가종피로부터 리카린 이의 분리 및 정제

<1-1> 리카린 이의 분리 및 정제

건조 분쇄한 육두구 가종피 100 g(건조중량)에 95 부피% 에탄올 400 ㎖을 가하여 상온에서 이틀 동안 방치하였다. 상기 용액을 와트만(Whatman) 여과지 제 2번을 이용하여 여과하였다. 상기 과정을 2회 반복하였다. 에탄올 여과액을 진공농축하고 동결건조하여 육두구 가종피의 에탄올 조추출물(26.61 g)을 제조하였다. 에탄올 조추출물을 에틸아세테이트, 부탄올, 물로 차례로 분획하여 에틸아세테이트 분획물(18.44 g)을 얻었다. 에틸아세테이트 분획물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Merck Kieselgel 66; 70-230 mesh)를 이용하여 클로로포름과 에틸아세테이트를 9:1(v/v)의 비율로 혼합한 용매로 용출시켜, 분획물 Ⅱ(3.04 g)를 얻었다. 진공회전농축기로 용매를 완전히 제거하여 육두구 가종피의 조추출물을 제조하였다. 이후, 분획물 Ⅱ를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Merck Kieselgel 66; 70-230 mesh)를 이용하여 클로로포름과 헥산과 에틸아세테이트와 아세톤을 15:10:0.1:0.1(v/v/v/v)의 비율로 혼합한 용매로 용출시켜, 분획물 Ⅱ-B를 얻었다. 분획물 Ⅲ-B를 preparative HPLC를 이용하여 100% 메탄올로 용출시켜 단일물질 분획 Ⅱ-B-2(0.016 g)를 얻었다. 이와 같은 분리 공정도를 도 1에 나타내었다.

<1-2> 구조 분석

상기 분리된 단일물질 Ⅲ-B-2의 구조를 결정하기 위하여 ¹H-NMR 스펙트럼과 ¹³C-NMR 스펙트럼을 각각 600MHz 와 150MHz(용매: DMSO)에서 측정하였고, DEPT 스펙트럼을 측정하였으며 그 결과를 도 2, 도 3 및 도 4에 각각 나타내었다. ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR의 결과를 종합적으로 분석하여 표 1에 나타내었다.

<1-3> 질량 분석

상기 분리된 단일물질의 질량 분석을 위해 측정한 FAB/MS의 결과를 도 5에 나타내었다. 본 화합물은 FAB/MS에서 [M]⁺가 m/z 324에서 관측되어 분자량이 324로 판명되었고, 분자식은 C₂₀H₂₀O₄이었다.

이상의 ¹H-NMR, ¹³C-NMR, DEPT 및 FAB/MS에 대한 결과와 기존에 발표된 연구보고(Harvey D. J., J. Chromatogr., 110: 91-102, 1975)를 비교 분석하여 동정한 결과, 분리된 단일 물질은 하기 화학식 1로 표시되는 리카린 이(Licarin E)인 것으로 확인되었다.

[화학식 1]

< 실시예 2>

본 발명의 리그난계 화합물의 iNOS 억제 효과 조사

LPS로 대식세포를 자극하면 iNOS가 과량 발현되면서 많은 양의 NO를 생성하게 된다. 따라서 상기 실시예 1에서 제조된 본 발명의 리카린 이가 iNOS 발현에 미치는 영향을 측정하였다.

본 발명의 리카린 이와 LPS가 처리된 RAW 264.7 세포를 용해한 후 브래드포드 방법으로 단백질을 정량하였다. 단백질 10 ㎍을 10% SDS-PAGE로 분리한 후, 상기 분리된 단백질을 전이 용액(transfer solution; 20% methanol, 25mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3)을 이용하여 니트로셀룰로스 막에 옮겼다(Hall, Methods Mol . Biol ., 261: 167-174, 2004). SDS-폴리아크릴아미드 겔과 니트로셀룰로스 막을 밀착시킨 후, 미니-겔 트랜스퍼 키트에 장착하였다. 이후, 샘플을 로딩하고, 100V에서 1시간동안 전이시켰다. 이후, TBST(tris buffered saline tween-20) 용액으로 1회 세척하고, 상기 막을 건조된 여과지에 옮겨 상온에서 건조시켰다. 비 특이적인 반응을 제거하기 위해서 5% 비지방 스킴 밀크(skim milk)가 함유된 TBST로 4℃에서 24시간 이상 충분히 흔들며 방치시켰다. 이후, TBST 용액으로 3회 세척하고 항-iNOS 항체(1:2,000)(Calbiochem 사)를 주입하여 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 다시 TBST 용액으로 막을 3회에 걸쳐 10분씩 세척하였다. HRP(Horse radish peroxidase)가 부착된 항-래빗 IgG-HRP(1:2,000)(Calbiochem사)를 주입하고, 1시간 동안 쉐이커(shaker) 위에서 반응시켰다. 이후 상기 막을 다시 TBST 용액으로 3회 세척한 후, ECL(enhanced chemiluminescence) 용액에 담가 1분간 흔들어 주면서 고루 적셨다. 상기 ECL 용액의 제조는 용액 A(luminol과 enhancer를 포함)와 용액 B(hydrogen peroxide를 포함)를 동량으로 혼합한 후 1분간 잘 흔들어서 제조한 것이다. 상기 ECL 용액으로부터 상기 막을 꺼내어 물기를 제거한 후, 암실에서 엑스레이 필름으로 스캔하였다.

그 결과, 도 6에서 보는 바와 같이, 본 발명의 리카린 이는 대식세포에서 iNOS의 발현을 억제하였으며, 25 μM에서 억제효과가 현저한 것으로 확인되었다(P<0.01).

< 실시예 3>

본 발명의 리카린 이의 COX -2 억제 효과 조사

본 발명자들은 PGE₂ 생성에 직접적으로 영향을 미치는 COX-2의 발현을 웨스턴 블럿 분석을 이용하여 조사하였다. 1차 항체로서 항-COX-2 항체(1:2,000)(Calbiochem사)를, 2차 항체로서 항-염소 IgG-HRP(1:2,000)(Calbiochem사)를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 2에 기재된 방법과 동일한 방법으로 수행하였다.

그 결과, 도 7에서 보는 바와 같이, 본 발명의 리카린 이는 COX-2 단백질의 발현을 농도 의존적으로 억제함을 확인할 수 있었다. 특히, 25 μM의 농도에서 현저하게 발현양이 감소되었다.

< 실시예 4>

본 발명의 리카린 이의 TNF -α 억제 효과 조사

먼저 1×10⁶ cell/㎖의 RAW264.7 세포를 96-well 조직 배양 플레이트에 접종하고 5시간 상온에서 방치하였다. 이후, 본 발명의 리카린 이를 10 μM의 농도로 각각 첨가하여 2시간 동안 전처리하였다. 음성 대조군에는 아무 것도 처리하지 않았으며, 양성 대조군에는 트로글리타존(troglitazone, Sigma사)을 처리하였다. 이후, 1 ㎍/㎖의 LPS를 처리하여 18시간 배양하였다. 대식세포에서의 TNF-α 유전자(gene) 발현양을 리얼타임 PCR(real time-PCR) 방법을 이용하여 정량하였다.

그 결과, 도 8에서 보는 바와 같이, 본 발명의 리카린 이 10 μM를 처리했을 때 TNF-α의 생성이 유의적으로 감소하는 경향을 나타내었다(P<0.01).

< 실시예 5>

본발명의 리카린 이의 IκBα 인산화 억제활성 조사

본 발명자들은 iNOS 및 COX-2의 발현을 촉진시키는 NF-κB의 활성화에 관여하는 IκBα의 인산화 활성 억제를 웨스턴 블럿 분석을 이용하여 조사하였다. 1차 항체로서 항-IκBα 항체(1:2,000)(Calbiochem사)를, 2차 항체로서 항-염소 IgG-HRP(1:2,000)(Calbiochem사)를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 2에 기재된 방법과 동일한 방법으로 수행하였다.

그 결과, 도 9에서 보는 바와 같이, 본 발명의 리카린 이는 IκBα 단백질의 인산화 발현을 농도 의존적으로 억제함을 확인할 수 있었다. 특히, 25 μM의 농도에서 현저하게 발현양이 감소되었다.

< 실시예 6>

동물 모델을 이용한 본 발명의 리카린 이의 항염증 활성 조사

상기 실시예 1에서 분리정제한 리카린 이의 항염증 활성을 동물 실험을 통하여 확인하였다. 상기 항염증 활성은 래트(rat)에 대한 부종억제 실험을 통하여 측정하였다. 실험동물은 5주령의 Wistar 래트(대한바이오링크, 한국)를 이용하였다. 사료는 표준 펠렛 형태의 쥐 사료(제일제당)를 공급하였으며, 사료와 물은 자유 급식시켰다. 래트는 12시간의 형광등 일조, 25± 2℃ 및 습도 60± 10%의 조건하에서 사육하였다. 기염제로서 TPA(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate; Sigma사)는 아세톤에 200 ㎍/mL가 되도록 용해하였다. 래트 귀의 부종은 TPA 용액을 국소적으로 귀의 바깥 면과 안쪽 면에 각각 10 ㎕/ear가 되도록 가하여 유도하였다(4 ㎍/ear). 상기 실시예 1에서 순수 정제한 리카린 이와 대조물질로서 비스테로이드 소염제인 인도메타신은 아세톤에 녹여 20, 200, 2000 ㎍/ear가 되도록 하였다. 리카린 이와 인도메타신은 TPA 처리후 30분 후에 래트의 귀에 각각 국소 도포하였다. 대조군에는 아세톤을 국소 도포하였다. 래트 귀의 두께는 각 물질을 처리한 후 8시간 후에 캘리퍼(calliper)를 이용하여 측정하였다. 귀 두께의 증가는 시료를 처리하지 않은 군과 비교하였으며, 부종억제율을 산출함으로써 염증억제 효과를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

^* p<0.01

상기 표 2에서 보는 바와 같이, 본 발명의 리카린 이는 TPA로 유발되는 래트의 부종을 농도 의존적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다(통계학적 유의성 p<0.01). 본 발명의 리카린 이와 인도메타신의 ID₅₀ 값은 각각 117.4 ㎍/ear과 160.5 ㎍/ear로서, 본 발명의 리카린 이가 종래 소염제로서 사용되고 있는 인도메타신보다 더 높은 부종억제효과를 나타내었다.

< 실시예 7>

본 발명의 리카린 이 함유 크림의 제조 및 이의 항염증 활성 조사

<7-1> 크림의 제조

본 발명의 리카린 이를 이용하여 하기 표 3에 기재된 다양한 조성을 지니는 크림을 각각 제조하였다. 먼저 하기 표 3에서 B로 표시된 물질들을 75~80℃에서 녹였다. 또한 하기 표 3에서 C로 표시된 물질 중 세틸 알코올과 보존료를 같은 온도에서 녹였다. 상기 C 물질들을 상기 B 물질들에 유화시켰다. 이후, 하기 표 3에서 A로 표시된 본 발명의 리카린 이를 5.0, 0.5, 0.05, 0.005%의 농도로 각각 넣어 혼합하였다. 마지막으로 향료를 넣고 정제수로 정량을 맞추어 크림을 제조하였다.

<7-2> 항염증 활성 조사

상기 실시예 <7-1>에서 제조된 리카린 이 함유 크림의 항염증 활성은 래트에 대한 부종억제 실험을 통하여 측정하였다. 부종 억제 실험은 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 실시하였다. 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.

시료	1	2	3	4
리카린 이 함유량	0.005%	0.05%	0.5%	5%
부종억제율(%)	12.4	43.1	61.7	85.6

상기 표 4의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명의 리카린 이 함유 크림이 크림 내 함유된 리카린 이의 농도에 의존적으로 TPA로 유발되는 래트의 부종을 억제하는 것을 알 수 있다.

< 실시예 8>

육두구 가종피 에탄올 추출물의 항염증 활성 조사

<8-1> 에탄올 추출물 제조

건조 분쇄한 육두구 가종피 100 g(건조중량)에 95 부피% 에탄올 400 ㎖을 가하여 상온에서 이틀 동안 방치하였다. 상기 용액을 와트만(Whatman) 여과지 제2번을 이용하여 여과하였다. 상기 과정을 2회 반복하였다. 에탄올 여과액을 진공농축하고 동결건조하여 에탄올 조추출물(26.61 g)을 제조하였다.

<8-2> 동물 모델을 이용한 육두구 가종피 추출물의 항염증 활성 조사

상기 실시예 <8-1>에서 제조한 육두구 가종피 에탄올 추출물의 항염증 활성을 동물 실험을 통하여 확인하였다. 상기 항염증 활성은 상기 실시예 6과 동일한 방법에 따라 래트에 대한 부종억제 실험으로 측정하였다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

^* p<0.01

상기 표 5에서 보는 바와 같이, 본 발명의 육두구 가종피의 에탄올 조추출물은 TPA로 유발되는 래트의 부종을 농도 의존적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다(통계학적 유의성 p<0.01).

< 제조예 1>

본 발명에 따른 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 함유하는 약제의 제조

<1-1> 정제의 제조

본 발명의 리카린 이 또는 육두구 가종피 추출물 25㎎을 부형제 직타용 락토오스 26㎎과 아비셀(미결정 셀룰로오스) 3.5㎎, 붕해 보조제인 나트륨 전분 글리코네이트 1.5㎎, 그리고 결합제인 직타용 L-HPC(low-hydrosyprophylcellulose) 8㎎과 함께 U형 혼합기에 넣고 20분간 혼합하였다. 혼합이 완료된 후 활탁제로서 마그네슘 스테아레이트 1㎎을 추가로 첨가하고 3분간 혼합하였다. 정량 시험과 항습도 시험을 거쳐 타정하고 필름 코팅하여 정제를 제조하였다.

<1-2> 시럽제의 제조

본 발명의 리카린 이 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분 2%(W/V)로 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조하였다: 본 발명의 리카린 이와 산부가염 2g, 사카린 0.8g 및 당 25.4g을 온수 80g에 용해시켰다. 상기 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린 8.0g, 향미료 0.04g, 에탄올 4.0g, 소르브산 0.4g 및 적량의 증류수를 혼합하였다. 상기 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖가 되도록 하였다.

<1-3> 캡슐제의 제조

본 발명의 리카린 이 또는 육두구 가종피 추출물 50㎎, 유당 50㎎, 전분 46.5㎎, 탈크 1㎎ 및 적량의 스테아린산 마그네슘을 혼합하고 이를 경질 젤라틴 캡슐에 충진함으로써 캡슐제를 제조하였다.

<1-4> 주사액제의 제조

유효성분 10㎎을 함유하는 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다: 본 발명의 리카린 이와 염산염 1g, 염화나트륨 0.6g 및 아스코르브산 0.1g을 증류수에 용해시켜서 100㎖를 제조하였다. 상기 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.

< 적용예 1>

위염증성 소화기질환

위염증은 여러 가지 외부요인의 작용과 불규칙한 식습관이 관여하지만 헬리코박터 파이로이균이 주원인균으로 밝혀졌다. 헬리코박터 파이로이균은 위궤양, 위염뿐만 아니라 더 나아가 위암에도 영향을 끼친다. 헬리코박터 파이로이균이 증식하는 과정에서 COX-2(cyclooxygenase-2)라는 효소가 동시에 증가한다(Nam N.T. et al ., Clin . Cancer Res . 10(23): 8105-8113, 2004). 헬리코박터가 감염되면 위 점막세포가 암세포로 진행되도록 증식하는데, COX-2 억제제는 위 점막세포가 암세포로 성장/증식하는 것을 저지하며 정상조직에서 암 조직으로 바뀌는 것을 억제하는 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. COX-2 억제제를 투여한 군이 투여하지 않은 군에 비해 아폽토시스(apoptosis)라는 방법으로 암조직을 사멸하는 효과가 탁월한 것으로 나타났다(Nam N.T. et al ., Clin . Cancer Res . 10(23): 8105-8113, 2004). 따라서 본 발명의 리카린 이의 COX-2 억제효과는 위암을 조기에 예방할 수 있는 위염증치료에 도움을 주므로 충분한 치료 효과를 갖는다는 것을 제시해 준다.

< 적용예 2>

관절염

관절염은 자가면역 이상이 원인이지만 병이 진행되면서 관절 사이의 활액강에 생긴 만성 염증이 혈관신생을 유도하여 연골이 파괴된다. 관절염에는 감염성 관절염, 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 대퇴골두 무혈성 괴사, 강직성 척추염, 선천성 기형에 의한 관절염 등 여러 종류가 있으나 원인을 불문하고 병이 진행하는 과정에서 활액강에 생긴 만성염증이 혈관신생을 유도한다고 알려져 있으며 새로운 모세혈관이 관절을 침습하여 연골이 손상되는 것이 특징이다(Kocb A. E. et al ., Arth. Rheum., 29:471-479, 1986; Stupack D. G. et al ., J. Med . Biol . Rcs., 32:578-281, 1999; Koch A. E., Arthritis Rheum., 41:951-962, 1998). 이때, 종류에 따라 염증반응이 일차적, 이차적으로 생겨 연골을 파괴하여 병의 진행에 중요한 역할을 하며, 관절 내로의 신생 혈관의 형성이 중요한 병리기전으로 작용한다고 보고되고 있다(Colville-Nash, P.R. et al ., Ann . Rheum . Dis ., 51, 919-925, 1992; Eisenstein, R., Pharmacol . Ther ., 49:1-19, 1991). 관절염의 치료는 원인에 따른 치료보다는 통증을 억제하는 것과 염증 현상을 억제하여 관절이나 근육 등의 파괴속도를 최대한 늦추고 기능 소실을 최소화하는 것을 우선으로 한다. 따라서 본 발명의 리카린 이 또는 육두구 가종피 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 조성물은 관절염의 진행 방지와 치료에 대단히 효과적이다.

Claims

하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 리카린 이 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.

[화학식 Ⅰ]
육두구 가종피(aril of nutmeg) 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 염증성 질환은 염증성 장 질환, 복막염, 골수염, 봉소염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 알러지성 비염, 낭포성 섬유증, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 급성 세기관지염, 만성 세기관지염, 골관절염, 통풍, 척추관절병증, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 건선성 관절병증, 장질환 척추염, 연소자성 관절병증, 연소자성 강직성 척추염, 반응성 관절병증, 감염성 관절염, 후-감염성 관절염, 임균성 관절염, 결핵성 관절염, 바이러스성 관절염, 진균성 관절염, 매독성 관절염, 라임 병, '혈관염 증후군'과 관련된 관절염, 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게닉 육아종증, 류마티스성 다발성근육통, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염(테니스 엘보), 신경병증성 관절 질환(neuropathic joint disease), 출혈성 관절증(hemarthrosic), 헤노흐-쉔라인 자반병, 비후성 골관절병증, 다중심성 세망조직구종, 척추측만증(scoliosis), 혈색소증, 혈색소병증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, 가족성 지중해열, 베하트 병, 전신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 급성 호흡곤란 증후군, 다발성 장기부전, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 급성 폐손상(acute lung injury), 기관지 폐 형성장애(broncho- pulmonary dysplasia) 및 염증성 피부질환으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 리카린 이가 NO(nitric oxide), iNOS(inducible nitric oxide synthase), PGE2(Prostaglandin E2), COX-2(cyclooxygenase-2), TNF-α(tumor necrosis factor α) 및 IκBα(inhibitor kappa Bα)의 생성 또는 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 또는 제2항의 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 함유하는 소염제.