KR20090088342A - ＣＴＬＡ-4-ＧｎＲＨ 또는 ＧＭ－ＣＳＦ-ＧｎＲＨ 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하는 동물의 면역거세용 백신 - Google Patents

ＣＴＬＡ-4-ＧｎＲＨ 또는 ＧＭ－ＣＳＦ-ＧｎＲＨ 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하는 동물의 면역거세용 백신 Download PDF

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Abstract

본 발명은 CTLA-4-GnRH 또는 GM-CSF-GnRH 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하는 동물의 면역거세용 백신에 관한 것으로, 상세하게는 본 발명의 CTLA-4-GnRH 또는 GM-CSF-GnRH 재조합 단백질은 기존에 알려진 면역거세백신보다 우수한 항원성을 갖고 있어 GnRH에 대한 탁월한 항체형성효과 및 이에 따른 동물의 성성숙 억제효과를 나타내므로, 동물의 성성숙을 예방 및 억제하기 위한 면역거세용 백신으로 유용하게 이용될 수 있다.
CTLA-4-GnRH 재조합 단백질, GM-CSF-GnRH 재조합 단백질, 동물의 면역거세용 백신

Description

ＣＴＬＡ-4-ＧｎＲＨ 또는 ＧＭ－ＣＳＦ-ＧｎＲＨ 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하는 동물의 면역거세용 백신{A vaccine for animal immunocastration comprising CTLA-4-GnRH or GM-CSF-GnRH recombinant protein as an active ingredient}
본 발명은 CTLA-4-GnRH 또는 GM-CSF-GnRH 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하는 동물의 면역거세용 백신에 관한 것이다.
[문헌 1] Thun R et al., Castration in male pigs: Techniques and animal welfare issues. Journal of Physiology and Pharmacology, 57, pp.189-194, 2006
[문헌 2] Tao MH et al., Idiotype/granulocyte-macrophage colony-stimulating factor fusion protein as a vaccine for B-cell lymphoma. Nature, 362, pp.755-758, 1993
[문헌 3] Huang TH et al., Enhanced antitumor immunity by fusion of CTLA-4 to a self tumor antigen. Blood, 96, pp.3663-3670, 2000
거세란 동물의 생식선을 제거하여 생식기능을 없애는 것으로, 수컷의 경우 고환을, 암컷의 경우는 난소를 제거함으로써 성선호르몬의 분비가 단절되어 생식 불능이 되고 제 2차 성징이 나타나지 않거나 퇴화되는 현상이 일어난다.
거세는 의학, 생물학, 축산학에서 연구 및 이용가치의 증대를 목적으로 행해지며, 자세히 살펴보면 다음과 같다. 첫째, 의학, 생물학에서 거세는 생리학적인 존재외의, 주로 성 호르몬의 결핍으로 일어나는 생리적, 병리적인 여러 장애의 원인을 구명하기 위하여 행해지고, 또한 생명에 위험을 미치는 질병이 생식선에 발생하거나 악질의 유전형질이 뚜렷할 때 그 원인을 제거하기 위하여 실행된다. 둘째, 축산에서 거세는 동물의 질병 치료뿐만 아니라 그 이용가치를 높이기 위해서 실행되고, 주로 수컷에만 행해지데, 이것은 난소를 제거하는 수술이 지극히 어려울 뿐만 아니라 그 효과도 적기 때문이다. 거세를 당한 수컷동물의 경우 성질이 온순해져 사육이 쉽고, 교미능력의 상실로 인해 자웅의 혼용사육이 가능하며, 근육 섬유가 가늘고 부드러워져서 암컷처럼 육질이 좋아지고 뼈가 가늘게 되어 살이 붙어 있는 비율이 높아진다. 또한 웅취의 발생을 감소시켜 수컷의 냄새를 줄여준다(Thun R et al., Castration in male pigs: Techniques and animal welfare issues. Journal of Physiology and Pharmacology, 57, pp.189-194, 2006).
거세방법으로는 외과적인 수술로 좌절식, 정계 결사식, 염전식, 피고결사식, 결단식, 부분거세, 무혈거세식 등이 있으며, 이외에 생식선에 민감한 방사선을 일 정량 이상 조사하여 그 능력을 상실하게 하는 방법도 있다. 그러나 물리적 거세는 동물에게 매우 심각한 고통 및 스트레스를 발생시키기 때문에 동물복지 차원에서 문제가 되고 있고, 스위스, 노르웨이, 벨기에, 네덜란드 등의 유럽국가의 경우 약 2009년 정도에 동물의 물리적 거세를 금지하기로 결정하였으며, 우리나라에서도 이와 유사한 조치를 검토하고 있다(Thun R et al., Castration in male pigs: Techniques and animal welfare issues. Journal of Physiology and Pharmacology, 57, pp.189-194, 2006).
따라서 최근에는 외과적 거세의 문제점을 해결하기 방법으로 면역적 거세(immunocastration)방법이 활발히 연구되고 있다. 면역적 거세방법은 대부분 GnRH(gonadotropin-releasing hormon)에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 백신을 이용하여 실시하는데, 그 이유는 시상하부에서 분비되는 GnRH(gonadotropin-releasing hormone)가 뇌하수체의 여포자극호르몬방출호르몬(FSH)과 황체형성호르몬(LH) 분비를 자극하기 때문이다. FSH는 여포의 성숙, 에스트로겐의 분비 및 정자형성을 촉진시키고, LH는 생식기관의 발달, 테스토스테론의 분비 및 배란을 촉진시킨다. 또한 LH와 FSH는 수컷동물의 정소에서 안드로스테논(Androstenone) 분비를 촉진시키고, 안드로스테논이 지방조직에 축적되어 웅취를 발생시키며, 그로인해 고기의 질을 저하시킨다(Thun R et al., Castration in male pigs: Techniques and animal welfare issues. Journal of Physiology and Pharmacology, 57, pp.189-194, 2006).
현재까지 개발된 면역거세 백신으로는 Improvac(Pfizer Inc.)이 있으나, 강 력한 면역반응을 유도하지 못하는 단점을 갖고 있다.
GM-CSF(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor)는 자가유래 과립세포-대식세포 집락자극인자로, 백혈구 생성을 촉진시키며, CTLA-4(Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4)는 T 림프구의 공동 자극 수용체(co-stimulatory receptor)로 작용하는 물질이다. GM-CSF 및 CTLA-4는 항원단백질과 융합된 형태로 동물에 투여될 경우에 강력한 면역반응을 유도시키며 항체형성을 촉진하는 것으로 보고되어져 있다(Tao MH et al., Idiotype/granulocyte-macrophage colony-stimulating factor fusion protein as a vaccine for B-cell lymphoma. Nature, 362, pp.755-758, 1993; Huang TH et al., Enhanced antitumor immunity by fusion of CTLA-4 to a self tumor antigen. Blood, 96, pp.3663-3670, 2000).
이에 따라, 본 발명자들은 기존의 면역거세백신 보다 강력한 면역반응을 유도하는 백신을 개발하고자 연구하던 중, 본 발명의 CLTA-4-GnRH 또는 GM-CSF-GnRH 재조합 단백질이 기존에 알려진 면역거세백신보다 우수한 항원성을 갖고 있어 GnRH에 대한 탁월한 항체형성효과 및 이에 따른 강력한 동물의 성성숙 억제효과를 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 목적을 수행하기 위하여, 본 발명은 CTLA-4-GnRH 또는 GM-CSF-GnRH 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하는 동물의 면역거세용 백신을 제공한다.
또한, 본 발명은 CTLA-4-GnRH 또는 GM-CSF-GnRH 재조합 단백질을 이용한 동 물의 면역거세용 백신을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 CTLA-4-GnRH 또는 GM-CSF-GnRH 재조합 단백질을 이용한 동물의 면역거세용 백신을 유효성분으로 함유하는 수의학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 백신을 이용한 동물의 면역거세 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 백신을 이용한 동물의 피임방법을 제공한다.
본원에서 정의되는 "CTLA, GM-CSF 및 GnRH 유전자"는 개, 소, 사람, 토끼, 염소, 양, 산양, 쥐, 말, 사슴, 원숭이, 호랑이, 늑대, 여우, 사자, 하이에나, 들개, 치타, 표범, 재규어, 코끼리, 물소, 살쾡이, 고슴도치, 두더지, 돼지, 다람쥐, 청설모, 오소리, 너구리, 오리너구리, 나무늘보, 반달곰, 흰곰, 불곰, 팬더, 날다람쥐, 침팬지, 고릴라, 오랑우탄, 노루, 코뿔소, 담비, 수달, 바다표범, 물개, 물곰, 바다코끼리, 고래 또는 돌고래, 바람직하게는 개, 소, 사람, 토끼, 염소, 양, 쥐, 말, 사슴, 살쾡이 또는 돼지, 보다 바람직하게는 돼지로부터 유래된 것을 특징으로 한다.
본원에서 정의되는 "재조합 단백질"은 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열군으로부터 선택된 하나 이상의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본원에서 정의되는 "재조합 단백질"은 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열군으로부터 선택된 하나 이상의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본원에서 정의되는 "재조합 단백질"은 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본원에서 정의되는 "재조합 단백질"은 서열번호 10의 아미노산서열을 포함함 을 특징으로 한다.
본원에서 정의되는 재조합 단백질은 서열번호 9의 염기서열(GnRH)이 약 1 내지 20회, 바람직하게는 약 3 내지 6회 반복되는 것을 특징으로 한다.
본원에서 정의되는 재조합 단백질은 서열번호 10의 아미노산서열(GnRH)이 약 1 내지 20회, 바람직하게는 약 3 내지 6회 반복되는 것을 특징으로 한다.
본원에서 정의되는 백신은 모든 포유동물, 바람직하게는 소, 돼지, 개, 고양이, 염소, 양, 말, 토끼 또는 쥐에 투여될 수 있음을 특징으로 한다.
본 발명의 백신을 유효성분으로 함유하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 백신을 함유하는 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 백신을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 백신을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제 제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골(macrogol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 백신을 포함하는 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 백신을 포함하는 조성물은 1일 0.0001 내지 100㎎/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10㎎/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 백신을 포함하는 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 백신 자체는 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
또한, 본 발명은 CTLA-4-GnRH 또는 GM-CSF-GnRH 재조합 단백질을 이용한 동물의 면역거세용 백신을 유효성분으로 함유하는 수의학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 백신을 유효성분으로 함유하는 수의학적 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본원에서 정의되는 백신은 조성물 총 중량 중 0.1-50 중량% 인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 백신을 유효성분으로 함유하는 수의학적 조성물에 포함될 수 있는 부형제 및 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 세탄올, 스테아릴알콜, 유동파라핀, 솔비탄모노스테아레이트, 폴리소르베이 트 60, 메칠파라벤, 프로필파라벤 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 백신을 유효성분으로 함유하는 수의학적 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향신료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있는데, 본 발명에 의한 수의학적 조성물은 동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있고, 제형은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 좌제, 멸균 주사용액, 멸균 외용제 등의 형태일 수 있다.
본 발명의 백신을 유효성분으로 함유하는 수의학적 조성물은 동물의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 100 mg/㎏의 양을 1일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 백신의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 CLTA-4-GnRH 또는 GM-CSF-GnRH 재조합 단백질은 기존에 알려진 면역거세백신보다 우수한 항원성을 갖고 있어 GnRH에 대한 탁월한 항체형성효과 및 이에 따른 강력한 동물의 성성숙 억제효과를 나타내므로, 동물의 성성숙을 예방 및 억제하기 위한 면역거세용 백신으로 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 참고예, 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 참고예, 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 참고예, 실시예, 참고예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
참고예 1. 재료 준비
CTLA-4 유전자, GM-CSF 유전자 및 GnRH 유전자는 돼지로부터 유래한 것을 사용하였으며, swCTLA-4 F Bam HI, swCTLA-4 R Bgl II, swGM-CSF F Bam HI, swGM-CSF R Bgl II, swGnRH 백본 I, swGnRH 백본 II, swGnRH back I F Bgl II 및 swGnRH back I R Kpn I는 Bioneer(Korea)에서 구입하여 사용하였고, SG 13009 대장균은 Qiagen(USA, #34210)에서 구입하여 사용하였다. 또한, TA 클로닝벡터는 Real Biotech Corporation에서, pQE40 벡터는 Qiagen에서 각각 구입하여 사용하였다.
실시예 1. swf(swine full) CTLA-4 및 swf(swine full)GM-CSF 전체 유전자를 TA 클로닝 벡터내로 서브클로닝
돼지의 CTLA-4 전체 유전자를 클로닝하기 위해 돼지의 혈액을 채취한 후 말초혈액단핵세포(PBMC)를 분리하였고, 분리된 PBMC를 콘카나발린 A(Concanavalin A, Sigma)를 이용하여 2일간 자극한 후 mRNA를 분리하였다. 분리된 mRNA를 역전사(reverse transcription)과정을 거쳐서 cDNA로 제작하였다. 제작된 cDNA를 기질로 사용하여 PCR을 수행하였다. 돼지의 CTLA-4 전체 유자를 클로닝하기 위해 GenBank에 등록된 유전자(AF281633)를 참고로 다음과 같은 프라이머를 제조하였다(Bioneer). swfCTLA-4 정방향 프라이머(swfCTLA-4 forward primer; 서열번호 1참조): 5'-ATG GCT TGC TCT GGA TTC CAG A-3', swfCTLA-4 역방향 프라이머(swfCTLA-4 reverse primer; 서열번호 2참조): 5'-TCA ATT GAT GGG AAT AAA ATA AGG-3'. 이러한 프라이머를 통해 증폭된 유전자는 672 bp이다. 증폭된 swfCTLA-4 유전자를 TA 클로닝벡터(Invitrogen) 내로 클로닝을 하였다(이하, 이를 'swfCTLA-4/TA'라 명명함).
또한, 돼지의 GM-CSF 전체 유전자를 클로닝하기 위해 돼지의 혈액을 채취한 후 PBMC를 분리하였고, 분리된 PBMC를 콘카나발린 A(Concanavalin A, Sigma)를 이용하여 2일간 자극한 후 mRNA를 분리하였다. 분리된 mRNA를 역전사(reverse transcription)과정을 거쳐서 cDNA로 제작하였다. 제작된 cDNA를 기질로 사용하여 PCR을 수행하였다. 돼지의 GM-CSF 전체 유전자를 클로닝하기 위해 GenBank에 등록된 유전자 (AY116504)를 참고로 다음과 같은 프라이머를 제조하였다. swfGM-CSF 정방향 프라이머(swfGM-CSF forward primer; 서열번호 3참조): 5'-ATG TGG CTG CAG AAC CTG CTT C-3', swfGM-CSF 역방향 프라이머(swfGM-CSF reverse primer; 서열번호 4 참조): 5'-TTA CTT TTT GAC TGG CCC CCA G-3'. 이러한 프라이머를 통해 증폭된 유전자는 435 bp이다. 증폭된 swfGM-CSF 유전자를 TA 클로닝벡터(Invitrogen) 내로 클로닝을 하였다(이하, 이를 'swfGM-CSF/TA'라 명명함).
돼지의 CTLA-4 및 GM-CSF 유전자가 클로닝되었을 것으로 추정한 클론의 플라스미드 DNA를 추출한 후, DNA sequencing을 통하여 클로닝된 유전자가 swfCTLA-4 및 swfGM-CSF 임을 확인하였다.
실시예 2. swCTLA-4 전체 유전자중 external domain만을 TA 클로닝 벡터내로 클로닝
상기 실시예 1을 통해 제조한 swfCTLA-4/TA 클로닝 벡터 내에 있는 돼지의 CTLA-4 전체 유전자 중 external domain만을 증폭시키기 위해서 하기 표 1에 기재된 swCTLA-4-F Bam HI 프라이머와 swCTLA-4 R Bgl II 를 이용하여 하기와 같이 클로닝을 수행하였다.
유전자 프라이머 서열 (Primer Sequence)
swCTLA-4 F Bam HI : 서열번호 5 5'-CGCGGATCC BamHI ATGGCTTGCTCTGGATTCCAGA-3'(1-21bp)
swCTLA-4 R Bgl II : 서열번호 6 5'-GGAAGATCT BglII ATCAGAATCTGGGCATGGTTCTG-3(466-483b)
PCR은 TGradient(Biometra, Germany)을 사용하여 하기 표 2에 나타나는 바와 같이 PCR 반응액의 조성물을 총 50μl부피로 하여 실시하였다. PCR 증폭의 초기 변성단계는 95℃에서 5분 동안 실시하였고, 증폭단계는 95℃(변성)에서 1분, 55℃(결합)에서 30초, 72℃(신장)에서 45초를 1사이클로 하여 30사이클로 실시하였으며, 최종 신장단계는 72℃에서 7분 동안 수행하였다. 이후 증폭된 PCR 산물인 swCTLA-4유전자(크기; 501bp)를 Gel SV 키트(Genall, #102-150)를 사용하여 정제하였고, 이 정제된 swCTLA-4를 인서트(insert)로 사용하여 클로닝 벡터인 TA 플라스미드내로 삽입하였다. 이후 상기 방법을 통해 제조된 swCTLA-4/TA 재조합플라스미드를 열 충격 방법(heat shock method)을 이용하여 DH5a 세포 내로 형질 전환시킨 후 형질 전환된 대장균을 LB 배지 상에 도말하여 37℃에서 16시간 동안 배양기에서 배양하였다. 그 후 PCR 산물인 swCTLA-4유전자가 삽입된 TA 플라스미드를 포함하고 있는 콜로니를 조사하였다. 이때, DH5a 대장균 내에 존재하는 TA 플라스미드는 플라스미드 SV 미니 키트(Genall, #101-150)를 이용하여 정제하였고, swCTLA-4유전자가 TA 플라스미드에 삽입되어 있는지 확인하기 위해서 TA 플라스미드의 제한효소 부분 중 swCTLA-4유전자의 주변에 위치한 Hind III를 이용하여 절단하였으며, swCTLA-4 유전자는 약 501bp 부근에서 특이 밴드로 관찰되었다. 상기 방법을 통해 swCTLA-4/TA 재조합 플라스미드를 획득할 수 있었다.
재료 용량
DW 39.5ul
dNTP 2.5Mmol (Fermentas) 2ul
정방향 프라이머 1ul
역방향 프라이머 1ul
swCTLA-4/TA 클로닝 벡터 1ul
버퍼 10X 5ul
Easy A Pfu e효소(Stratagene) 0.5ul(2.5 unit)
실시예 3.swGM-CSF 전체 유전자중 신호 펩타이드 부분을 제외한 나머지 유전자만을 TA 클로닝 벡터내로 클로닝
상기 실시예 1을 통해 제조한 swGM-CSF/TA 재조합플라스미드 내에 있는 돼지의 GM-CSF 전체 유전자중 신호 펩타이드 부분을 제외한 나머지 유전자만을 증폭시키기 위해서 하기 표 3에 나타난 swGM-CSF F Bam HI 프라이머와 swGM-CSF R Bgl II 를 이용하여 하기와 같이 클로닝을 수행하였다.
유전자 프라이머 서열 (Primer Sequence)
swGM-CSF F Bam HI : 서열번호 7 5'-CGCGGATCC BamHI GCTCCCACCCGCCCACCCAG-3'(52-71bp)
swGM-CSF R Bgl II : 서열번호 8 5'-GGAAGATCT BglII CTTTTTGACTGGCCCCCAGCAG-3(414-432bp)
주형으로 실시예 1에서 제조한 swGM-CSF/TA 재조합 플라스미드 DNA를 사용 및 프라이머로 swGM-CSF F Bam HI 프라이머와 swGM-CSF R Bgl II를 사용한 것만을 제외하고는 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 클로닝을 수행하였고, PCR의 산물인 swGM-CSF유전자가 삽입된 TA 플라스미드를 포함하고 있는 콜로니를 조사하였다. 이때, DH5a 대장균 내에 존재하는 TA 플라스미드는 플라스미드 SV 미니 키트(Genall, #101-150) 키트를 이용하여 정제하였고, swGM-CSF유전자가 TA 플라스미드에 삽입되어 있는지 확인하기 위해서 TA 플라스미드의 제한효소 부분 중 swGM-CSF유전자의 주변에 위치한 Hind III를 이용하여 절단하였으며, swGM-CSF유전자는 약 399bp 부근에서 특이 밴드로 관찰되었다. 상기 방법을 통해 swGM-CSF/TA 재조합플라스미드를 획득할 수 있었다.
실시예 4. sw(swine)GnRH 3 카피(copy)의 클로닝
swGnRH는 10개의 아미노산으로 구성되어 있으며 DNA 염기서열은 하기 표 4에 나타냈다.
하기 표 5에 기재된 swGnRH 3 카피 유전자의 5말단에 Bgl II 및 3 말단에 Eco RI 제한효소 사이트를 포함하고 있는 백본 I 올리고머(backbone I oligomer)유전자 또는 swGnRH 3 copy 유전자의 5말단에 Eco RI 및 3말단에 Hind III 제한효소 사이트를 포함하고 있는 백본 II 올리고머(backbone II oligomer)를 증폭시키기 위해서 하기 표 5에 기재된 swGnRH back I F Bgl II 프라이머, swGnRH back I R Kpn I, swGnRH back II F Kpn I 및 swGnRH back II R Hind III를 이용하여 하기와 같이 클로닝을 수행하였다.
swGnRH 서열
유전자 : 서열번호 9 5-GAA CAT TGG TCA TAT GGA CTA CGG CCG GGA-3
단백질(decapeptide) : 서열번호 10 Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly
유전자 염기서열
swGnRH 백본 I 올리고머 : 서열번호 11 5'-GGAAGATCT BglII GAACATTGGTCATATGGACTACGGCCGGGA GAA CAT TGG TCA TAT GGA CTA CGG CCG GGA GAA CAT TGG TCA TAT GGA CTA CGG CCG GGA GAATTCCGG EcoRI -3'
swGnRH 백본 II 올리고머 : 서열번호 12 5'-CCGGAATTC EcoRI GAACATTGGTCATATGGACTACGGCCGGGAGAACATTGGTCATATGGACTACGGCCGGGAGAACATTGGTCATATGGACTACGGCCGGGAAAGCTTGGG HindIII -3'
유전자 프라이머 서열 (Primer Sequence)
swGnRH back I F Bgl II : 서열번호 13 5'-GGAAGATCT BglII GAACATTGGTC-3'
swGnRH back I R Kpn I : 서열번호 14 5'-CGGGGTACC KpnI TCCCGGCCGTA-3'
swGnRH back II F Kpn I : 서열번호 15 5'-CGGGGTACC KpnI GAACAtTGGTCATATGGACTAC-3'
swGnRH back II R Hind III : 서열번호 16 5'-CCCAAGCTT HindIII TCCCGGCC-3'
1차 PCR은 TGradient(Biometra, Germany)을 사용하여 하기 표 6에 나타나는 바와 같이 PCR 반응액의 조성물을 총 50μl부피로 하여 실시하였다. PCR 증폭의 변성단계는 95℃에서 5분 동안 실시하였고, 결합단계는 55℃에서 30동안 실시하였으며, 신장단계는 72℃에서 30분 동안 수행하였다. 이후 증폭된 각각의 PCR 산물, 즉 swGnRH 백본 I 올리고머 유전자 및 swGnRH 백본 II 올리고머를 이용하여 증폭된 유전자를 Gel SV 키트(Genall 사, #102-150)를 사용하여 정제하였고, 정제된 swGnRH 백본 I 올리고머 유전자 및 swGnRH 백본 II 올리고머 유전자를 2차 PCR의 주형으로 사용하였다. 2차 PCR은 하기 표 7에 나타나는 바와 같이 PCR 반응액의 조성물을 총 50μl부피로 하여 실시하였다. PCR 증폭의 초기 변성단계는 95℃에서 5분 동안 실시하였고, 증폭 단계는 95℃(변성)에서 1분, 55℃(결합)에서 30초, 72℃(신장)에서 45초를 1사이클로 하여 30사이클로 실시하였으며, 최종 신장단계는 72℃에서 10분 동안 수행하였다. 이후 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 클로닝을 수행하였고, PCR의 산물인 swGnRH 백본 I 올리고머 유전자 또는 swGnRH 백본 II 올리고머 유전자를 통해 증폭된 유전자가 삽입된 TA 플라스미드를 포함하고 있는 콜로니를 조사하였다(이하, swGnRH 백본 I 올리고머 유전자 및 swGnRH 백본 II 올리고머 유전자를 swGnRH 3 카피(copy)유전자라 명명함). 이때, DH5a 대장균 내에 존재하는 TA 플라스미드는 Plasmid SV mini 키트를 이용하여 정제하였고, swGnRH 3 카피(copy)유전자가 TA 플라스미드에 삽입되어 있는지 확인하기 위해서 TA 플라스미드의 제한효소 부분 중 swGnRH 3 카피(copy)유전자의 주변에 위치한 Hind III를 이용하여 절단하였으며, swGnRH 3 카피(copy)유전자는 약 110bp 부근에서 특이 밴드로 관찰되었다. 상기 방법을 통해 swGnRH 3 카피(copy)/TA 재조합플라스미드를 획득할 수 있다.
재료 용량
증류수 35.5ul
dNTP 2.5Mmol (Fermentas) 2ul
swGnRH/TA back I R Kpn I 또는 swGnRH/TA back II R Hind III (20pM) 1ul
swGnRH/TA 백본 I 또는 swGnRH/TA 백본 II 올리고머 (20pM) 5ul
버퍼 10X 5ul
Taq 합성효소(Supertherm) 0.5ul(2.5 unit)
재료 용량
증류수 35.5ul
dNTP 2.5Mmol (Fermentas) 2ul
swGnRH/TA back I F Bgl II 또는 swGnRH/TA back II F Kpn I (20pM) 1ul
swGnRH/TA back I R Kpn I 또는 swGnRH/TA back II R Hind III (20pM) 1ul
swGnRH/TA 백본 I 또는 swGnRH/TA 백본 II 올리고머의 1차 PCR 산물 5ul
버퍼 10X 5ul
Taq 합성효소(Supertherm) 0.5ul(2.5 unit)
실시예 5. swGnRH 3 카피(copy) 백신제조
swGnRH 유전자를 3 카피(copy)를 포함하는 pQE40 벡터를 만들기 위해서 QIAexpressionist(Qiagen) 프로토콜에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
단백질 발현 벡터인 pQE40 플라스미드 DNA를 추출한 후 Bgl II(Takara, #Cal:1021A) 및 Kpn I(Takara, #Cal:1068A) 제한효소를 이용하여 절단하였다. 이후 상기의 방법으로 절단된 플라스미드 DNA는 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 확인하였고, Gel SV 키트를 사용하여 정제하였다.
한편, 상기 실시예 4에서 제조한 swGnRH 3카피(copy)/TA 플라스미드 DNA를 Bgl II(Takara, #Cal:1021A) 및 Kpn I(Takara, #Cal:1068A) 제한효소를 이용하여 절단하였다. 이후 상기의 방법으로 절단된 인서트(insert) DNA 즉, swGnRH 3 카피(copy)는 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 확인하였고, 겔(Gel) SV 키트를 사용하여 정제하였다.
상기 방법을 통해 제조된 pQE40 플라스미드 DNA와 swGnRH 3 카피(copy) DNA를 핵산결합효소인 T4 리가아제(New England Biolabs, #M0202S)를 이용하여 결합시킨 후, 이 재조합플라스미드를 SG 13009 대장균(Qiagen, #34210) 내로 열 충격 방법(heat shock method)을 이용하여 형질전환하였다. 그 후 형질전환된 대장균을 LB 배지상에 도말하여 37℃에서 16 시간 동안 배양기에서 배양하였다. 이후 swGnRH 3 카피(copy) DNA가 삽입된 pQE40 플라스미드를 포함하고 있는 콜로니를 조사하였다. 이때, SG 13009 대장균 내에 존재하는 pQE40 플라스미드는 Plasmid SV mini 키트를 이용하여 정제하였고, swGnRH 3 카피(copy) DNA가 pQE40 플라스미드에 삽입되어 있는지 확인하기 위해서 DNA sequencing을 통해 swGnRH 3 카피(copy) DNA 염기서열을 확인하였다. 상기 방법을 통해 swGnRH 3 카피(copy) 유전자가 삽입된 재조합 pQE40 플라스미드를 획득할 수 있었다(이하, 이를 'pGnRH3'이라 명명함).
실시예 6. swGnRH 6 카피(copy) 백신제조
swGnRH 유전자를 6 카피(copy)를 포함하는 pQE40벡터를 만들기 위해서 하기와 같은 실험을 수행하였다.
상기 실시예 5에서 획득한 pGnRH3 플라스미드 DNA를 Kpn I(Takara, #Cal:1068A) 및 Hind III(Takara, #Cal:1060A) 제한효소를 이용하여 절단하였다. 그 후 절단된 pGnRH3 플라스미드 DNA는 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 확인하였고, 겔(Gel) SV 키트를 사용하여 정제하였다.
한편, 상기 실시예 4에서 제조한 swGnRH 3 카피(copy)/TA 재조합플라스미드 DNA를 Kpn I(Takara, #Cal:1068A) 및 Hind III(Takara, #Cal:1060A) 제한효소를 이용하여 절단하였다. 그 후 절단된 인서트(insert) DNA 즉, swGnRH 3 카피(copy) DNA는 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 확인하였고, 겔(Gel) SV 키트를 사용하여 정제하였다.
상기 방법을 통해 제조된 pGnRH3 플라스미드 DNA와 swGnRH 3 카피(copy) DNA를 실시예 5와 동일한 방법으로 클로닝하였다. 그 후 swGnRH 3카피(copy) DNA가 삽입된 pGnRH3 플라스미드를 포함하고 있는 콜로니를 조사하였다. 이때, SG 13009 대장균 내에 존재하는 pGnRH3 플라스미드는 플라스미드 SV 미니 키트를 이용하여 정제하였고, swGnRH 3 카피(copy) DNA가 pGnRH3 플라스미드에 삽입되어 있는지 확인하기 위해서 DNA sequencing을 통해 swGnRH 6 카피(copy) DNA 염기서열을 확인하였다. 상기 방법을 통해 swGnRH 3 카피(copy) 유전자가 추가로 삽입된 재조합 pGnRH6 플라스미드를 획득할 수 있었다(이하, 이를 'pGnRH6'이라 명명함).
단백질 발현을 위해 pGnRH6 플라스미드를 함유한 대장균 콜로니를 10ml의 LB 배지(broth)에 접종한 후 16시간 동안 37℃에서 진탕 배양을 하였다. 그중 2.5ml을 취하여 50ml의 LB 배지(broth)에 접종한 후 약 1시간 동안 37℃에서 진탕배양을 한 후 1mM의 IPTG를 첨가하였다. 이후 4-5시간을 추가로 배양한 후 대장균을 원심분리를 통해 수거하였다. 수거된 대장균 펠렛을 5ml의 세포 용해완충액(lysis buffer)에 혼합(resuspension)한 후 10초씩 6회에 걸쳐 초음파 분해(sonication)을 실시하였다. 이후 세포 용해물(clell lysate)를 원심분리하여 상층액 및 침전물을 회수하였다. 회수된 상층액 및 침전물을 SDS-PAGE를 통해 단백질을 크기별로 분리하였으며 쿠마시(Coomassie) 염색을 통해 단백질 밴드를 확인하였다. 또한 단백질을 Ni-NTA 컬럼(Qiagen)을 이용하여 정제하였다. 또한 1차 항체인 G8294 (Anti-Gonadotropin releasing hormone, Developed in rabbit, affinity isolated antibody, Sigma)와 2차 항체인 anti-rabbit IgG-HRP를 이용하여 특수단백질 검출 검사(western blot)를 실시하여 정제된 단백질이 swGnRH임을 증명하였다.
실시예 7. swCTLA-4-GnRH 3 카피(copy) 백신제조
swCTLA-4 유전자가 결합된 swGnRH 3 카피(copy) 유전자를 포함하는 pQE40벡터를 만들기 위해서 하기와 같은 실험을 수행하였다.
단백질 발현 벡터인 pQE40 플라스미드 DNA를 추출한 후 Bam HI(Takara, #1010A) 및 Bgl II(Takara, #1021A) 제한효소를 이용하여 절단하였다. 그 후 절단된 pQE40 플라스미드 DNA는 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 확인하였고, Gel SV 키트를 사용하여 정제하였다.
한편, 상기 실시예 2에서 제조한 swCTLA-4/TA 재조합플라스미드 DNA를 Bam HI(Takara, #1010A) 및 Bgl II(Takara, # 021A ) 제한효소를 이용하여 절단하였다. 이 후 절단된 인서트(insert) DNA 즉, swCTLA-4 DNA는 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 확인하였고, 겔(Gel) SV 키트를 사용하여 정제하였다.
상기 방법을 통해 제조된 pQE40 플라스미드 DNA와 swCTLA-4 DNA를 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 클로닝하였다. 그 후 swCTLA-4 DNA가 삽입된 pQE40 플라스미드를 포함하고 있는 콜로니를 조사하였다. 이때, SG 13009 대장균 내에 존재하는 pQE40 플라스미드는 플라스미드 SV 미니 키트를 이용하여 정제하였고, swCTLA-4 DNA가 pQE40 플라스미드에 삽입되어 있는지 확인하기 위해서 DNA sequencing 방법을 통해 swCTLA-4 DNA 염기서열을 확인하였다. 상기 방법을 통해 swCTLA-4 DNA가 삽입된 재조합 pQE40 플라스미드를 획득할 수 있었다(이하, 이를 'pswCTLA-4'라 명명함).
이후, 상기 방법을 통해 제조된 pswCTLA-4 플라스미드 DNA를 Bgl II(Takara) 및 Kpn I(Takara)제한효소를 이용하여 절단하였다. 그 후 절단된 pswCTLA-4 플라스미드 DNA는 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 확인하였고, 겔(Gel) SV 키트를 사용하여 정제하였다.
한편, 상기 실시예 4에서 제조한 swGnRH 3카피(copy)/TA 재조합 플라스미드 DNA를 Bgl II(Takara) 및 Kpn I(Takara) 제한효소를 이용하여 절단하였다. 이후 절단된 인서트(insert) DNA 즉, swGnRH 3카피(copy) DNA는 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 확인하였고, 겔(Gel) SV 키트를 사용하여 정제하였다.
상기 방법을 통해 제조된 pswCTLA-4 플라스미드 DNA와 swGnRH 3카피(copy) DNA를 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 클로닝을 수행하였다. 그 후 swGnRH 3카피(copy) DNA가 삽입된 pswCTLA-4 플라스미드를 포함하고 있는 콜로니를 조사하였다. 이때, SG 13009 대장균 내에 존재하는 pswCTLA-4 플라스미드는 플라스미드 SV 미니 키트를 이용하여 정제하였고, swGnRH 3카피(copy) DNA가 pswCTLA-4 플라스미드에 삽입되어 있는지 확인하기 위해서 DNA sequencing 을 통해 swCTLA-4 및 swGnRH 3 카피(copy) 유전자를 확인하였다. 상기 방법을 통해 swGnRH 3카피(copy) DNA가 삽입된 재조합 pswCTLA-4 플라스미드를 획득할 수 있었다(이하, 이를 'pswCTLA-4-GnRH 3'라 명명함).
실시예 8. swCTLA-4-GnRH 6 카피(copy) 백신제조
swCTLA-4 유전자가 결합된 swGnRH 6 카피(copy) 유전자를 포함하는 pQE40벡터를 만들기 위해서 하기와 같은 실험을 수행하였다.
상기 실시예 7에서 제조한 pswCTLA-4-GnRH 3 재조합 플라스미드 DNA를 Kpn I(Takara, #1068A) 및 Hind III(Takara, #1060A) 제한효소를 이용하여 절단하였다. 그 후 절단된 pswCTLA-4-GnRH 3 재조합 플라스미드 DNA는 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 확인하였고, 겔(Gel) SV mini 키트를 사용하여 정제하였다.
한편, 상기 실시예 4에서 제조한 swGnRH 3카피(copy)/TA 재조합 플라스미드 DNA를 Kpn I(Takara, #1068A) 및 Hind III(Takara, #1060A) 제한효소를 이용하여 절단하였다. 이 후 절단된 인서트(insert) DNA 즉, swGnRH 3 카피(copy) 유전자는 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 확인하였고, 겔(Gel) SV mini 키트를 사용하여 정제하였다.
상기 방법을 통해 제조한 pswCTLA-4-GnRH 3 재조합 플라스미드와 swGnRH 3 카피(copy) DNA를 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 클로닝을 수행하였다. 그 후 swGnRH 3카피(copy) DNA가 삽입된 pswCTLA-4-GnRH 3 재조합 플라스미드를 포함하고 있는 콜로니를 조사하였다. 이때, SG 13009 대장균 내에 존재하는 pswCTLA-4-GnRH 3 재조합 플라스미드는 플라스미드 SV 미니 키트를 이용하여 정제하였고, swGnRH 3카피(copy) DNA가 pswCTLA-4-GnRH 3 재조합 플라스미드 DNA에 삽입되어 있는지 확인하기 위해서 DNA sequencing을 실시하여 swCTLA-4 및 swGnRH 6 카피(copy) 유전자를 확인하였다. 상기 방법을 통해 swGnRH 3카피(copy) DNA가 삽입된 pswCTLA-4-GnRH 3 재조합 플라스미드 DNA를 획득할 수 있었다(이하, 이를 'pswCTLA-4-GnRH 6'라 명명함).
단백질 발현을 위해 pswCTLA-4-GnRH6 플라스미드를 함유한 대장균 콜로니를 10ml의 LB 배지(broth)에 접종한 후 16시간 동안 37℃에서 진탕 배양을 하였다. 그중 2.5ml을 취하여 50ml의 LB 배지(broth)에 접종한 후 약 1시간 동안 37℃에서 진탕배양을 한 후 1mM의 IPTG를 첨가하였다. 이후 4-5시간을 추가로 배양한 후 대장균을 원심분리를 통해 수거하였다. 수거된 대장균 펠렛을 5ml의 세포용해완충액(lysis buffer)에 혼합(resuspension)한 후, 10초씩 6회에 걸쳐 초음파 부해(sonication)을 실시하였다. 이후 세포 용해물(clell lysate)을 원심분리하여 상층액 및 침전물을 회수하였다. 회수된 상층액 및 침전물을 SDS-PAGE를 통해 단백질을 크기별로 분리하였으며 쿠마시(Coomassie) 염색을 통해 단백질 밴드를 확인하였다. 또한 단백질을 Ni-NTA 컬럼(Qiagen)을 이용하여 정제하였다. 또한 정제된 단백질을 1차 항체인 마우스 anti-human CD152 (BD Pharmingen)(이 항체는 human CTLA-4(CD152) 및 swine CTLA-4(CD152)를 동시에 인식하는 항체임)와 2차 항체인 anti-mouse IgG-HRP를 이용하여 특수단백질 검출 검사(Western blot)을 실시하여 정제된 단백질이 swCTLA-4와 융합된 단백질임을 증명하였다. 또한 1차 항체인 G8294(Anti-Gonadotropin releasing hormone, Developed in rabbit, affinity isolated antibody, Sigma)와 2차 항체인 anti-rabbit IgG-HRP를 이용하여 특수단백질 검출 검사(Western blot)을 실시하여 정제된 단백질이 swGnRH와 융합된 단백질임을 증명하였다.
실시예 9. swGM-CSF-GnRH 3 카피(copy) 백신제조
swGM-CSF 유전자가 결합된 swGnRH 3 카피(copy) 유전자를 포함하는 pQE40벡터를 만들기 위해서 하기와 같은 실험을 수행하였다.
단백질 발현 벡터인 pQE40 플라스미드 DNA를 추출한 후 Bam HI(Takara, #Cal:1010A) 및 Bgl II(Takara, #Cal:1021A) 제한효소를 이용하여 절단하였다. 이 후 절단된 pQE40 플라스미드 DNA는 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 확인하였고, 겔(gel) SV 키트를 사용하여 정제하였다.
한편, 상기 실시예 3에서 제조한 swGM-CSF/TA 재조합 플라스미드 DNA를 Bam HI(Takara, #Cal:1010A) 및 Bgl II(Takara, #Cal:1021A) 제한효소를 이용하여 절단하였다. 그 후 절단된 인서트(insert) DNA 즉, swGM-CSF DNA는 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 확인하였고, 겔(gel) SV 키트를 사용하여 정제하였다.
상기 방법을 통해 제조한 pQE40 플라스미드 DNA와 swGM-CSF DNA를 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 클로닝을 수행하였다. 그 후 swGM-CSF DNA가 삽입된 pQE40 플라스미드를 포함하고 있는 콜로니를 조사하였다. 이때, SG 13009 대장균 내에 존재하는 pQE40 플라스미드는 플라스미드 SV 미니 키트를 이용하여 정제하였고, swGM-CSF DNA가 pQE40 플라스미드에 삽입되어 있는지 확인하기 위해서 DNA sequencing 방법을 통해 swGM-CSF 유전자를 확인하였다. 상기 방법을 통해 swGM-CSF DNA가 삽입된 재조합 pQE40 플라스미드를 획득할 수 있었다(이하, 이를'pswGM-CSF'라 명명함).
이후, 상기 방법을 통해 제조한 pswGM-CSF 플라스미드 DNA를 Bgl II(Takara, #Cal:1021A) 및 Kpn I(Takara, #Cal:1068A)제한효소를 이용하여 절단하였다. 그 후 절단된 pswGM-CSF 플라스미드 DNA는 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 확인하였고, 겔(Gel) SV 키트를 사용하여 정제하였다.
한편, 상기 실시예 4에서 제조한 swGnRH 3 카피(copy)/TA 재조합 플라스미드 DNA를 Bgl II(Takara, #Cal:1021A) 및 Kpn I(Takara, #Cal:1068A) 제한효소를 이용하여 절단하였다. 이후 상기의 방법으로 절단된 인서트(insert) DNA 즉, swGnRH 3카피(copy) DNA는 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 확인하였고, 겔(Gel) SV 키트를 사용하여 정제하였다.
상기 방법을 통해 획득한 pswGM-CSF 플라스미드 DNA와 swGnRH 3 카피(copy) DNA를 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 클로닝을 수행하였다. 그 후 swGnRH 3카피(copy) DNA가 삽입된 pswGM-CSF 플라스미드를 포함하고 있는 콜로니를 조사하였다. 이때, SG 13009 대장균 내에 존재하는 pswGM-CSF 플라스미드는 플라스미드 SV 미니 키트를 이용하여 정제하였고, swGnRH 3카피(copy) DNA가 pswGM-CSF 플라스미드에 삽입되어 있는지 확인하기 위해서 DNA sequencing을 실시하여 swGM-CSF 및 GnRH 3 copy 유전자를 확인하였다. 상기 방법을 통해 swGnRH 3카피(copy) DNA가 삽입된 재조합 pswGM-CSF 플라스미드를 획득할 수 있었다(이하, 이를 'pswGM-CSF-GnRH 3'라 명명함).
실시예 10. swGM-CSF-GnRH 6 카피(copy) 백신제조
swGM-CSF 유전자가 결합된 swGnRH 6 카피(copy) 유전자를 포함하는 pQE40벡터를 만들기 위해서 하기와 같은 실험을 수행하였다.
상기 실시예 8에서 획득한 pswCTLA-4-GnRH 6 플라스미드 DNA를 Bam HI(Takara, #Cal:1010A) 및 Bgl II(Takara, #Cal:1021A) 제한효소를 이용하여 swCTLA-4 유전자를 제거하였다. 그 후 절단된 pswGnRH 6 플라스미드 DNA는 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 확인하였고, 겔(Gel) SV 키트를 사용하여 정제하였다.
한편, 상기 실시예 3에서 제조한 GM-CSF/TA 재조합 플라스미드 DNA를 Bam HI(Takara, #Cal:1010A) 및 Bgl II(Takara, #Cal:1021A) 제한효소를 이용하여 절단하였다. 그 후 절단된 인서트(insert) DNA 즉, swGM-CSF 유전자는 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 확인하였고, 겔(Gel) SV 키트를 사용하여 정제하였다.
상기 방법을 통해 제조한 pswGnRH 6 플라스미드 DNA와 swGM-CSF DNA를 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 클로닝을 수행하였다. 그 후 swGM-CSF DNA가 삽입된 pswGnRH 6 플라스미드 DNA를 포함하고 있는 콜로니를 조사하였다. 이때, SG 13009 대장균 내에 존재하는 pswGnRH 6 플라스미드 DNA는 플라스미드 SV 미니 키트를 이용하여 정제하였고, swGM-CSF DNA가 pswGnRH 6 플라스미드 DNA에 삽입되어 있는지 확인하기 위해서 DNA sequencing을 실시하여 swGM-CSF 및 GnRH 6 copy 유전자를 확인하였다. 상기 방법을 통해 swGM-CSF DNA가 삽입된 pswGnRH 6 플라스미드 DNA를 획득할 수 있었다(이하 이를pswGM-CSF-GnRH 6'라 명명함).
단백질 발현을 위해 pswGM-CSF-4-GnRH6 플라스미드를 함유한 대장균 콜로니를 10ml의 LB broth에 접종한 후 16시간 동안 37℃에서 진탕 배양을 하였다. 그중 2.5ml을 취하여 50ml의 LB broth에 접종한 후 약 1시간 동안 37℃에서 진탕배양을 한 후 1mM의 IPTG를 첨가하였다. 이후 4-5시간을 추가로 배양한 후 대장균을 원심분리를 통해 수거하였다. 수거된 대장균 펠렛을 5ml의 세포용해완충액(lysis buffer)에 혼합(resuspension)한 후 10초씩 6회에 걸쳐 초음파 분해(sonication)를 실시하였다. 이후 세포 용해물(clell lysate)을 원심분리하여 상층액 및 침전물을 회수하였다. 회수된 상층액 및 침전물을 SDS-PAGE를 통해 단백질을 크기별로 분리하였으며 쿠마시(Coomassie) 염색을 통해 단백질 밴드를 확인하였다. 또한 단백질을 Ni-NTA 컬럼(Qiagen)을 이용하여 정제하였다. 또한 정제된 단백질을 1차 항체인 MAB711(mouse IgG, R&D system)과 2차 항체인 anti-mouse IgG-HRP를 이용하여 특수 단백질 검출검사(Western blot)을 실시하여 정제된 단백질이 swGM-CSF와 융합된 단백질임을 증명하였다. 또한 1차 항체인 G8294(Anti-Gonadotropin releasing hormone, Developed in rabbit, affinity isolated antibody, Sigma)와 2차 항체인 anti-rabbit IgG-HRP를 이용하여 특수 단백질 검출검사(Western blot)을 실시하여 정제된 단백질이 swGnRH와 융합된 단백질임을 증명하였다.
실험예 1. CTLA-4-GnRH 및 GM-CSF-GnRH 백신의 거세 효과
상기 실시예에서 수득한 CTLA-4-GnRH 및 GM-CSF-GnRH의 생체 내(in vivo) 거세 효과를 확인하기 위하여 하기와 같은 방법으로 실험하였다.
1-1. 거세백신을 투여한 돼지의 고환 크기 및 무게 측정
실험동물은 70일령의 수퇘지 4마리를 사용하였다. 각각의 백신은 이근부에 근육주사로 투여하였고, 1차 접종 후 21일 후에 2차로 동량의 백신을 투여하였으며, 2차 접종 후 31일 후에 돼지를 도축한 다음, 고환을 적출하여 크기 및 무게를 측정하였다. 모든 돼지로부터 1차 및 2차 백신 투여 전과 도축 전에 혈액을 채취하였다. 각각의 돼지에 투여한 백신의 조성은 하기 표 8에 나타내었다.
1번 돼지에는 상기 실시예 10에서 수득한 pswGM-CSF-GnRH6 재조합 단백질 400㎍(2ml)을 백신으로 투여하였으며, 2번 돼지에는 실시예 8에서 수득한 pswCTLA-4-GnRH6 재조합 단백질 200㎍(1ml)과 실시예 10에서 수득한 pswGM-CSF-GnRH6 재조합 단백질 200㎍(1ml)을 혼합하여 혼합백신으로 투여하였고, 3번 돼지에는 Improvac 백신((주)화이자) 400㎍(2ml)을 투여하여 양성대조군으로 사용하였으며, 4번 돼지에는 백신을 접종하지 않아 음성대조군으로 사용하였다.
실험군 백신 조성
1번 돼지 pswGM-CSF-GnRH6 400㎍(2ml)
2번 돼지 pswCTLA-4-GnRH6 200㎍(1ml) + pswGM-CSF-GnRH6 200㎍(1ml)
3번 돼지(양성대조군) Improvac 백신((주)화이자) 400㎍(2ml)
4번 돼지(음성대조군) 어떠한 처리도 하지 않음
실험결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 육안으로 관찰하였을 경우, 본 발명의 백신을 투여한 1번 돼지 및 2번 돼지의 고환 크기는 음성대조군(4) 돼지의 고환 크기보다 매우 위축되어있음을 확인할 수 있었으며, 이는 양성대조군으로 사용한 Improvac 백신을 투여한 돼지의 고환 크기와 비슷한 수준임을 확인할 수 있었다. 또한, 도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 백신을 투여한 1번 돼지 및 2번 돼지의 고환 무게는 각각 40g 과 55g으로 음성대조군 돼지(155g)보다 약 3배 정도 적은 것을 확인할 수 있었으며, 이는 양성대조군으로 사용한 Improvac 백신을 투여한 돼지의 고환 무게(65g)보다도 적으므로 본 발명의 거세백신의 효과가 현저하게 뛰어남을 확인할 수 있었다.
1-2. 거세백신을 투여한 돼지의 고환 조직검사
고환 조직의 위축 및 퇴화 정도를 측정하기 위하여, 상기 실험예 1-1에서 적출한 돼지의 고환을 포르말린으로 고정한 후 헤마톡실린(Hematoxylin) 및 에오신(Eosine) 염색법을 통하여 염색한 후, 현미경으로 정세관, 정모세포, 정자세포의 형성, 테스토스테론(testosterone)을 분비하는 Leydig 세포 등을 관찰하였다.
실험결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 백신을 투여하지 않은 음성대조군의 돼지 고환 조직에서는 정상적인 정자 생성(spermatogenesis) 발달 과정에서 볼 수 있는 정세관(seminiferous tubule, ST)이 관찰되었으며, 이들 정세관을 구성하는 정조세포(spermatogonia), 일차정모세포(primary spermatocyte), 정자세포(spermatid) 및 발달 단계에 있는 정자(developing spermatozoa) 등 다양한 정상 형태의 정세관 구성세포를 관찰할 수 있었다.
또한, 도 4에 나타난 바와 같이, 실시예 10에서 수득한 pswGM-CSF-GnRH6 백신을 투여한 돼지(1번 돼지) 고환 조직에서는 정세관의 위축, 테스토스테론을 생성하는 간질세포인 Leydig cell의 감소, 정조세포 및 정모세포의 현저한 감소 등을 확인할 수 있었다. 따라서 전반적으로 고환의 퇴화가 골고루 진행되어 거세효과가 확실한 것으로 판단할 수 있었다.
또한, 도 5에 나타난 바와 같이, 실시예 8에서 수득한 pswCTLA-4-GnRH6과 실시예 10에서 수득한 pswGM-CSF-GnRH6의 혼합백신을 투여한 돼지(2번 돼지) 고환 조직에서도 정세관의 발달을 관찰할 수 없었으며, 이로 인해 전반적인 고환의 위축이 유발된 것으로 판단되었고, 정세관을 구성하는 정조세포, 정모세포의 수도 현저히 감소하였음을 확인할 수 있었다. 그러나 정세관을 지지하는 Leydig cell의 완벽한 감소는 관찰되지 않아, 혼합백신을 투여한 돼지에서 조직학적 측면의 거세효과는 충분히 확인되었으나, 완벽한 거세효과를 나타내지는 않았다고 판단할 수 있었다.
또한, 도 6에 나타난 바와 같이, Improvac 백신((주)화이자)을 투여한 양성대조군 돼지(3번 돼지) 고환 조직은 전반적인 고환의 퇴화가 진행되어 충분한 거세효과가 있는 것으로 판단할 수 있었다.
1-3. 거세백신을 투여한 돼지에서 테스토스테론(Testosterone) 측정
혈청 내에 존재하는 웅성호르몬인 테스토스테론의 농도를 Testosterone Enzyme Immunoassay Kit(Assay Designs, Inc., USA)를 이용하여 측정하였다. 측정방법은 회사에서 제시하는 프로토콜을 준수하여 수행하였다.
실험결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 테스토스테론의 양이 모든 돼지에서 음성대조군 돼지보다 적은 것을 확인할 수 있었다. 특히, 실시예 10에서 수득한 pswGM-CSF-GnRH6 백신을 투여한 돼지(1번 돼지)의 도축 전 테스토스테론 양(0.172 ng/ml)은 음성대조군 돼지(4번 돼지)의 도축 전 테스토스테론 양(0.595 ng/ml)에 비해 약 3배 이상 적은 것을 확인할 수 있었으며, 실시예 8에서 수득한 pswCTLA-4-GnRH6과 실시예 10에서 수득한 pswGM-CSF-GnRH6의 혼합백신을 투여한 돼지(2번 돼지)의 도축 전 테스토스테론 양(0.476 ng/ml)은 음성대조군에 비해 적었으나 큰 차이를 나타내지는 않았다. 그러나 이 수치는 현재 상품화되어 판매되고 있는 Improvac 백신((주)화이자)을 투여한 양성대조군 돼지의 도축 전 테스토스테론 양(1.248 ng/ml)보다도 현저하게 적은 수치임을 확인할 수 있었다.
하기에 본 발명의 조성물을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 주사제제의 제조
실시예 7의 pswCTLA-4-GnRH3 ............100 ㎎
소디움 메타비설파이트................. .3.0 ㎎
메틸파라벤..............................0.8 ㎎
프로필파라벤............................0.1 ㎎
주사용 멸균증류수........................적량
상기의 성분을 혼합하고 통상의 방법으로 최종 부피가 2㎖이 되도록 제조한 후, 2㎖용량의 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조한다.
제제예 2. 환제의 제조
실시예 8의 pswCTLA-4-GnRH6 ..........120㎎
옥수수 전분..........................100㎎
멸균증류수.............................적량
상기의 성분을 혼합하고, 통상의 환제 제조방법으로 0.3cm 지름으로 제환하여 환제를 제조한다.
제제예 3. 정제의 제조
실시예 9의 pswGM-CSF-GnRH3............200 ㎎
유당..................................100 ㎎
전분..................................100 ㎎
스테아린산 마그네슘.....................적량
통상의 정제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 4. 캡슐제의 제조
실시예 10의 pswGM-CSF-GnRH6 .........100 ㎎
유당.................................50 ㎎
전분.................................50 ㎎
탈크..................................2 ㎎
스테아린산마그네슘....................적량
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
실시예 7의 pswCTLA-4-GnRH3 .........1000 ㎎
설탕....................................20 g
이성화당............... ................20 g
레몬향 .................................적량
정제수를 가하여 전체 1000㎖로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조한다.
도 1은 거세백신을 투여한 돼지의 고환 크기를 나타낸 도이고,
도 2는 거세백신을 투여한 돼지의 고환 무게를 나타낸 도이며,
도 3은 백신을 투여하지 않은 음성대조군 돼지(4번 돼지) 고환의 조직검사 결과도이고((A)저배율, (B)고배율),
도 4는 실시예 10에서 수득한 pswGM-CSF-GnRH6 백신을 투여한 돼지(1번 돼지) 고환의 조직검사 결과도이며((A)저배율, (B)고배율),
도 5는 실시예 8에서 수득한 pswCTLA-4-GnRH6과 실시예 10에서 수득한 pswGM-CSF-GnRH6의 혼합백신을 투여한 돼지(2번 돼지) 고환의 조직검사 결과도이고((A)저배율, (B)고배율),
도 6은 Improvac 백신((주)화이자)을 투여한 양성대조군 돼지(3번 돼지) 고환의 고직검사 결과도이며((A)저배율, (B)고배율),
도 7은 거세백신을 투여한 돼지의 테스토스테론 생성 측정 결과도이다.
<110> kbnp, Inc. <120> A vaccine for animal immunocastration comprising CTLA-4-GnRH or GM-CSF-GnRH recombinant protein as an active ingredient <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> swfCTLA-4 Forward primer <400> 1 atggcttgct ctggattcca ga 22 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> swfCTLA-4 Reverse primer <400> 2 tcaattgatg ggaataaaat aagg 24 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> swfGM-CSF Forward primer <400> 3 atgtggctgc agaacctgct tc 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> swfGM-CSF Reverse primer <400> 4 ttactttttg actggccccc ag 22 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> swCTLA-4 F Bam HI <400> 5 cgcggatcca tggcttgctc tggattccag a 31 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> swCTLA-4 R Bgl II <400> 6 ggaagatcta tcagaatctg ggcatggttc tg 32 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> swGM-CSF F Bam HI <400> 7 cgcggatccg ctcccacccg cccacccag 29 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> swGM-CSF R Bgl II <400> 8 ggaagatctc tttttgactg gcccccagca g 31 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> swGnRH <400> 9 gaacattggt catatggact acggccggga 30 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> swGnRH <400> 10 Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 1 5 10 <210> 11 <211> 108 <212> DNA <213> swGnRH backbone I oligomer <400> 11 ggaagatctg aacattggtc atatggacta cggccgggag aacattggtc atatggacta 60 cggccgggag aacattggtc atatggacta cggccgggag aattccgg 108 <210> 12 <211> 108 <212> DNA <213> swGnRH backbone II oligomer <400> 12 ccggaattcg aacattggtc atatggacta cggccgggag aacattggtc atatggacta 60 cggccgggag aacattggtc atatggacta cggccgggaa agcttggg 108 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> swGnRH back I F Bgl II <400> 13 ggaagatctg aacattggtc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> swGnRH back I R Kpn I <400> 14 cggggtacct cccggccgta 20 <210> 15 <211> 31 <212> DNA <213> swGnRH back II F Kpn I <400> 15 cggggtaccg aacattggtc atatggacta c 31 <210> 16 <211> 17 <212> DNA <213> swGnRH back II R Hind III <400> 16 cccaagcttt cccggcc 17

Claims (12)

  1. CTLA-4-GnRH 또는 GM-CSF-GnRH 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하는 동물의 면역거세용 백신.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 CTLA, GM-CSF 및 GnRH 유전자는 개, 소, 사람, 토끼, 염소, 양, 산양, 쥐, 말, 사슴, 원숭이, 호랑이, 늑대, 여우, 사자, 하이에나, 들개, 치타, 표범, 재규어, 코끼리, 물소, 살쾡이, 고슴도치, 두더지, 돼지, 다람쥐, 청설모, 오소리, 너구리, 오리너구리, 나무늘보, 반달곰, 흰곰, 불곰, 팬더, 날다람쥐, 침팬지, 고릴라, 오랑우탄, 노루, 코뿔소, 담비, 수달, 바다표범, 물개, 물곰, 바다코끼리, 고래 또는 돌고래로부터 유래된 것을 특징으로 하는 동물의 면역거세용 백신.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열군으로부터 선택된 하나 이상의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 동물의 면역거세용 백신.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열군으로부터 선택된 하나 이상의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 동물의 면역거세용 백신.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 동물의 면역거세용 백신.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 서열번호 10의 아미노산서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 동물의 면역거세용 백신.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 서열번호 9의 염기서열(GnRH)이 약 1 내지 20회 반복되는 것을 특징으로 하는 동물의 면역거세용 백신.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 서열번호 10의 아미노산서열(GnRH)이 약 1 내지 20회 반복되는 것을 특징하는 동물의 면역거세용 백신.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 백신은 포유동물에 투여될 수 있음을 특징으로 하는 동물의 면역거세용 백신.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 포유동물은 소, 돼지, 개, 고양이, 염소, 양, 말, 토끼 또는 쥐인 것을 특징으로 하는 동물의 면역거세용 백신.
  11. CTLA-4-GnRH 또는 GM-CSF-GnRH 재조합 단백질을 이용한 동물의 면역거세용 백신을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물.
  12. CTLA-4-GnRH 또는 GM-CSF-GnRH 재조합 단백질을 이용한 동물의 면역거세용 백신을 유효성분으로 함유하는 수의학적 조성물.
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