KR20090063987A - 신규의 스트렙토마이세스(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ)속균주 및 이를 포함하는 식물 병원균 방제용 조성물 - Google Patents

신규의 스트렙토마이세스(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ)속균주 및 이를 포함하는 식물 병원균 방제용 조성물 Download PDF

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Abstract

잿빛 곰팡이병, 잿빛 썩음병, 검은별 무늬병, 고추 탄저병, 오이 탄저병 등을 유발하는 식물병원균에 항균활성을 갖는 신규의 스트렙토마이세스( Streptomyces )속 균주 및 이를 포함하는 식물 병원균 방제용 조성물이 개시된다. 본 발명에 따른 신규의 스트렙토마이세스( Streptomyces )속의 KM-8 및 이를 함유하는 식물 병원균 방제용 조성물은 광범위한 식물 병원균에 대하여 우수한 항균활성을 갖으면서도 저독성이고, 환경에 부작용을 일으키지 않는 장점이 있다.
식물병원균, 스트렙토마이세스, 방선균

Description

신규의 스트렙토마이세스(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ)속 균주 및 이를 포함하는 식물 병원균 방제용 조성물{New Strain of Streptomyces sp. and Composition for Control Plant Pathogen including the same}
본 발명은 식물병원균에 항균활성을 갖는 신규의 스트렙토마이세스( Streptomyces )속 균주 및 이를 포함하는 식물 병원균 방제용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 잿빛 곰팡이병, 잿빛 썩음병, 검은별 무늬병, 고추 탄저병, 오이 탄저병 등을 유발하는 식물병원균에 항균활성을 갖는 신규의 스트렙토마이세스( Streptomyces )속 균주 및 이를 포함하는 식물 병원균 방제용 조성물에 관한 것이다.
농업용 약제로 주로 이용되고 있는 유기합성계 농약은 적은 양으로도 효과가 좋고, 가격이 저렴하여, 농가 소득증대에 크나큰 역할을 하여왔다. 그러나 기존에 사용되어왔던 많은 유기합성계 농약은 암 유발 가능성 또는 잔류독성 규제방침에 따라 그 사용이 점차 제한되고 있으며, 식물병원균의 유기합성계 농약에 대한 저항 성 증가, 토양의 산성화, 생태계 파괴 등의 극심한 부작용을 가져왔다. 최근에는 이들 환경오염과 잔류독성에 대한 대처방안으로 새로운 농약 및 비료의 연구개발과 함께 분해가 잘되고 독성이 약한 천연 미생물제제의 연구가 활발히 이루어지고 있다.
미생물을 이용한 생물방제로는 토양미생물로부터 생산된 항생물질 또는 독소를 이용하여 병원균이나 해충을 방제하는 미생물농약 또는 미생물자체의 길항작용을 이용하여 병원균의 감염으로부터 식물을 보호하고 간접적으로 식물생육을 촉진하는 미생물비료 등이 있다. 길항미생물을 이용한 생물방제법으로는 식물병원성 진균의 세포벽 구성성분인 키틴(chitin), β-1,3-glucan, 만난(mannan) 등의 세포벽성분을 분해할 수 있는 키티나제(chitinase), 글루칸아제(glucanase), 만난아제(mannase) 등의 가수분해효소를 이용하는 기작 및 길항미생물이 특이적 대사산물인 항생물질을 분비하여 식물성병원균의 생육을 직접 억제하는 항생기작이 있다.
농업용 항균성 항생물질의 개발은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp .) 균주의 대사산물에서 카스가마이신(kasugamycin) 및 블라스티딘 S(blastidin S, Nucleoside계)를 분리하여 실용화되었고, 이외 폴리옥신(polyoxin), 발리다마이신(validamycin), 싸이클로헥사미드(cyclohexamide), 그리세오펄빈(griseofulvin) 등이 실용화되어 독성이 강한 일부 유기합성계 농약을 대체하고 있다.
또한 특정세균을 이용한 생물학적 해충방제 기술이 발전하면서, 농작물, 산림 및 인간의 건강 보호를 위해 미생물 살충제가 기존의 화학 합성농약을 대신하여 사용되고 있고, 이에 대한 연구도 활발히 진행되고 있고 있으나, 아직까지는 그 결 과가 만족스럽지 못한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 종래기술의 문제점을 해결하고자 예의 노력한 결과, 국내와 환경이 다른 국외토양으로부터 분리한 길항미생물들이 식물병원균에 대하여 우수한 항균활성을 갖고, 또한 이들을 혼합하여 사용할 경우 항균활성이 상승하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국 본 발명의 목적은, 식물 병원균에 대하여 항균활성을 갖는 신규의 스트렙토마이세스( Streptomyces )속 균주를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 신규의 스트렙토마이세스( Streptomyces )속 균주를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 병원균 방제용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 식물 병원균에 대하여 우수한 항균활성을 갖으면서도 저독성이고, 환경에 부작용을 일으키지 않는 친환경적 식물 병원균 방제용 조성물을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물 병원균에 대하여 항균활성을 갖는 신규의 스트렙토마이세스( Streptomyces )속의 KM-8(KCTC11244BP)를 제공한다.
본 발명은 또한, 스트렙토마이세스( Streptomyces )속의 KM-8(KCTC11244BP) 또는 그 배양액을 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 병원균 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명에 의하면, 신규의 스트렙토마이세스( Streptomyces )속의 KM-8(KCTC11244BP) 및 이를 함유하는 식물 병원균 방제용 조성물은 광범위한 식물 병원균에 대하여 우수한 항균활성을 갖으면서도 저독성이고, 환경에 부작용을 일으키지 않는 장점이 있다.
본 발명은 일 관점에서, 식물 병원균에 대하여 항균활성을 갖는 신규의 스트렙토마이세스( Streptomyces )속의 KM-8(KCTC11244BP)에 관한 것이다. 상기 스트렙토마이세스는 방선균이라고도 불린다.
상기 식물 병원균은 잿빛곰팡이병을 유발하는 보티리스 시네리아( Botrytis cinerea ), 잿빛썩음병을 유발하는 보티리스 액크라다 프레세니우스( Botrytis aclada Fresenius ), 검은별무늬병을 유발하는 클래도스포리움 큐쿠메리넘( Cladosporium cucumerinum ), 고추 탄저병을 유발하는 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스( Colletotrichum gloeosporioides ), 오이 탄저병을 유발하는 콜레토트리쿰 오르비쿨라레( Colletotrichum orbiculare ), 덩굴마름병을 유발하는 디디멜라 브리오니애( Didymella bryoniae ), 줄기마름병을 유발하는 푸사리움 옥시스포럼( Fusarium oxysporum ), 붉은 곰팡이병을 유발하는 푸사리움 그라미네아럼( Fusarium graminearum ), 검은점뿌리썩음병을 유발하는 모노스포라스커스 카노발 러스( Monosporascus cannonballus ), 잎집무늬마름병을 유발하는 라이족토니아 솔라니( Rhizoctonia solani ), 고추균핵병을 유발하는 쉴레로티니아 쉴레로티오럼( Sclerotinia sclerotiorum ) 등을 예시할 수 있다.
본 발명에 따른 식물 병원균에 대하여 항균활성을 갖는 스트렙토마이세스( Streptomyces )속의 KM-8(KCTC11244BP)의 분리 및 동정방법은 다음과 같다. 먼저, 토양에서 채취한 시료를 적절히 희석한 후, 이를 배지에 도말하고, 배양시켜 콜로니를 형성시킨 후, 세균류, 곰팡이류, 방선균류를 분리하였다. 분리된 균주 중 식물병원균에 대하여 우수한 항균활성을 갖는 균주의 형태를 현미경으로 관찰한 결과, 스트렙토마이세스( Streptomyces )속의 KM-8은 Streptomyces sp., I3-16은 Aspergillus terreus 와 유사하였다. 상기 배지로는 NA 배지, YM 배지, ISP No.2 배지 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 스트렙토마이세스( Streptomyces )속의 KM-8의 식물 병원균에 대하여 항균활성은 통상적인 한천 확산(agar diffusion)법으로 확인할 수 있다. 한천 확산법은 검사하려는 균주가 접종된 한천 배지에 항균활성물질을 올려놓은 후, 저해환을 통하여 항균활성을 측정하는 방법이다.
본 발명에 따른 스트렙토마이세스( Streptomyces )속의 KM-8(KCTC11244BP)는 셀룰라제(cellulase) 및 키티나제(chitinase) 생성능이 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 다른 관점에서 스트렙토마이세스( Streptomyces )속의 KM-8(KCTC11244BP), 상기 KM-8 배양액, 상기 KM-8 배양액의 용매추출물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 것을 포함하는 식물 병원균 방제용 조성물에 관한 것이다.
상기 스트렙토마이세스속의 KM-8 배양액은 0.4% yeast extract, 1% malt extract 및 0.4% dextrose를 포함하는 ISP No. 2 배지에서 pH 6 내지 8, 바람직하게는 pH 8의 조건으로 배양된 KM-8 균주를 함유하는 것을 특징으로 한다. 상기 ISP No.2 배지에 1.5% agar가 더욱 첨가될 경우, 통상의 고체배지가 될 수 있다.
또한, 상기 KM-8(KCTC11244BP) 배양액의 용매추출물은 상기 KM-8(KCTC11244BP) 배양액을 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 에틸 에테르(ethyl ether), 헥산(hexane), 클로로포름(chloroform), 부탄올(butanol) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 용매로 추출한 것이다.
상기 식물 병원균 방제용 조성물은 아스퍼질러스 속( Aspergillus spp.) 균주, 바람직하게는 아스퍼질러스 속( Aspergillus spp.) I3-16를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 아스퍼질러스 속( Aspergillus spp.) 균주는 오이 탄저병을 유발하는 콜레토트리쿰 오르비쿨라레( Colletotrichum o rbiculare )에 대하여 항균활성을 갖는 것을 특징으로 한다.
상기 스트렙토마이세스( Streptomyces )속의 KM-8(KCTC11244BP) 및 아스퍼질러스 속( Aspergillus spp.) 균주를 포함하는 식물 병원균 방제용 조성물은 잿빛곰팡 이병을 유발하는 보티리스 시네리아( Botrytis cinerea ), 잿빛썩음병을 유발하는 보티리스 액크라다 프레세니우스( Botrytis aclada Fresenius ), 검은별무늬병을 유발하는 클래도스포리움 큐쿠메리넘( Cladosporium cucumerinum ), 고추 탄저병을 유발하는 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스( Colletotrichum gloeosporioides ), 오이 탄저병을 유발하는 콜레토트리쿰 오르비쿨라레( Colletotrichum orbiculare ), 덩굴마름병을 유발하는 디디멜라 브리오니애( Didymella bryoniae ), 줄기마름병을 유발하는 푸사리움 옥시스포럼( Fusarium oxysporum ), 붉은 곰팡이병을 유발하는 푸사리움 그라미네아럼( Fusarium graminearum ), 검은점뿌리썩음병을 유발하는 모노스포라스커스 카노발러스( Monosporascus cannonballus ), 잎집무늬마름병을 유발하는 라이족토니아 솔라니( Rhizoctonia solani ), 고추균핵병을 유발하는 쉴레로티니아 쉴레로티오럼( Sclerotinia sclerotiorum ) 등에 대하여 향상된 항균활성을 갖는다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 하기 실시예들은 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
사용된 병원균
본 발명의 실시예에서 사용된 식물병원성 곰팡이는 농촌진흥청 농업생명공학 연구원 한국농업미생물보존센터(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에서 분양받은 8속 20균주로서, 하기 표 1에 나타내었다.
Plant Germs
Botrytis cinerea KACC 40573
Botrytis cineara KACC 40854
Botrytis cinerea KACC 40963
Botrytis cinerea KACC 40965
Botrytis cinerea KACC 41008
Botrytis cinerea KACC 41022
Botrytis cinerea KACC 41029
Botrytis aclada Fresenius KACC 41297
Cladosporium cucumerinum KACC 40576
Colletotrichum gloeosporioides KACC 40804
Colletotrichum orbiculare KACC 40808
Didymella bryoniae KACC 40669
Fusarium oxysporum KACC 40037
Fusarium oxysporum KACC 40052
Fusarium graminearum KACC 41040
Monosporascus cannonballus KACC 40940
Rhizoctonia solani KACC 40101
Rhizoctonia solani KACC 40113
Rhizoctonia solani KACC 40142
Sclerotinia sclerotiorum KACC 41065
[실시예 1] 식물병원균에 항균활성을 갖는 균주의 분리 및 동정
가. 균주의 분리
토양시료는 이태리, 프랑스, 스위스, 지리산 등 국내외 토양 15종류를 사용하였으며, 시료 1 g을 증류수 9 ㎖에 현탁하여 102, 103으로 희석한 후 NA 배지(0.3% beef extract, 0.5% peptone, 1.5% agar), YM 배지(0.3% yeast extract, 0.3% malt extract, 0.5% peptone, 1% glucose, 1.5% agar), ISP No.2 배지(0.4% yeast extract, 1% malt extract, 0.4% dextrose , 1.5% agar)에 각각 100 ㎕씩 도말하여 ISP No.2 배지와 YM 배지는 28℃, NA 배지는 37℃에 배양하였다. 도말한 평판배지에서 세균류, 곰팡이류, 방선균류를 선별하여 사면배지에 순수 분리하고 4℃에 보관하여 4주마다 계대하여 사용하였다.
나. 균주의 선발 및 동정
토양시료에서 분리한 400여 균주를 대상으로 PDA배지에서 표 1의 식물병원성 곰팡이에 대한 항균활성을 다음과 같이 측정하였다. 먼저, 400여 균주들을 아가 플러그(agar plug)법(Park, J. H. and H. S. Kim (2002). Screening of New lovastatin-producing strains from soil, J. Inst. Nat. Sci. 21. 71-77.)을 이용하여 균종에 따라 1~3일 배양한 후, ethyl acetate 3㎖를 첨가하여 30℃에서 2시간동안 shaking하여 추출하였다. 각 추출액 1㎖를 effendorf-tube에 담아 24시간동안 100㎕까지 농축한 후, agar diffusion법으로 항균 활성을 확인하였다. 가장 우수하고, 광범위한 항균 활성을 나타내는 균주를 KM-8과 I3-16이라 각각 명명하였다. 도 1의 (a)에 나타난 바와 같이, KM-8균주는 ISP No.2 배지에 배양시 하얀색의 포자를 빠르게 형성하고 영양균사 및 기중균사를 생성하는 방선균임을 현미경을 통하여 확인하였다. KM-8 균주는 Sclerotinia sclerotiorum KACC 41065에 대하여 가장 높은 항균 활성을 나타내었다. 또한, 도 1의 (b)에 나타난 바와 같이, 공시균 I3-16은 Aspergillus spp.로 간주되며, 멜론 탄저병균인 Colletotrichum orbiculare KACC 40808에만 특이적인 저해(결과 미게재)를 보였다. KM-8은 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2007년 11월 02일 자로 기탁(KCTC11244BP)되었다.
[실시예 2] 항균성 물질 생산을 위한 배양조건
가. 최적 배지의 선정
배지 종류에 따른 항균성 물질의 생산력을 검토하기 위하여 A6(1% soy bean meal, 1% glucose, 0.5% NaCl, 1% CaCO3), ISP No. 2, LB(1% peptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl ), YM(0.3% yeast extract , 0.3% malt extract, 0.5% peptone, 1% glucose), PDB배지를 제조하고, pH를 7.0으로 조정한 후, 121℃, 15분간 가압 멸균하였다. 각각의 배지에 분리균주 KM-8(KCTC11244BP)을 한 백금이 접종한 후, 28℃, 160rpm에서 7일간 배양하면서 1일, 3일, 5일, 7일째 배양액의 Sclerotinia sclerotiorum(KACC 41065)에 대한 항균 활성을 확인하고, 그 결과를 표 2에 나타내었다.
Figure 112007090261661-PAT00001
a)-, +는 저해환(inhibitory zone, Φmm)을 의미함, - : Unclear zone, + : 6-10 ㎜, ++ : 10-12 ㎜, +++ : 12-14 ㎜, ++++ : 14-16 ㎜, +++++: above 16 ㎜.
상기 표 2로부터, KM-8(KCTC11244BP)은 ISP No.2 배지에서 3일간 배양, LB배지에서 5일간 배양된 경우 Sclerotinia sclerotiorum(KACC 41065)에 대한 항균 활성이 가장 우수함을 알 수 있었다.
나. 최적 배지의 탄소원 , 질소원 및 pH 확인
항균 활성물질의 생산능이 우수한 ISP No. 2를 기본배지로 하여 탄소원으로 black sugar, dextrose, glycerol, lactose, soluble starch를 각각 1% (w/v) 첨가하여 배양하였으며, 질소원의 경우 최적 탄소원이 첨가된 배지에 유기 질소원으로 peptone, Bacto soytone, yeast extract, malt extract를 사용하였으며, 무기질소원으로는 NaNO3, NH4Cl, (NH4)2SO4를 각각 1% (w/v) 첨가하여 배양하였다. 항균 활성은 3일간 배양된 KM-8(KCTC11244BP) 배양액을 14,000rpm, 10분간 4℃에서 원심분리하여 균체를 침전시키고 공시균주 Sclerotinia sclerotiorum (KACC 41065)를 미리 배양한 PDA plate에 상등액 20㎕를 분주한 paper disc(Φ 6㎜, Whatman Co.)를 얹고, 24℃에서 3일간 배양하면서 항균 활성을 관찰하였다. 관찰 결과, 기본배지 조성의 0.4% dextrose에서 항균 활성이 가장 우수하였으므로, 탄소원의 종류는 항균성 물질 생산에 큰 영향이 없다고 사료되었다(결과 미게재). 또한, 질소원의 경우, 무기질소원에 비해 유기질소원을 사용한 경우에 항균활성이 양호하였으며, yeast extract 및 malt extract를 질소원으로 사용할 경우 비교적 양호한 항균활성(결과 미게재)을 나타내었다.
또한 pH에 의한 항균 활성물질 생산능을 검토하기 위해 ISP No. 2배지의 초발 pH를 각각 5, 6, 7, 8, 9로 조정하고, KM-8(KCTC11244BP)를 3일간 배양시킨 후, 배양액을 14,000rpm, 10분간 4℃에서 원심분리하여 균체를 침전시키고, 공시균주 Sclerotinia sclerotiorum (KACC 41065)를 미리 배양한 PDA plate에 상등액 20㎕를 분주한 paper disc(Φ 6㎜, Whatman Co.)를 얹고, 24℃에서 3일간 배양하면서 pH에 따른 항균 활성을 관찰하였고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
Figure 112007090261661-PAT00002
a)-, + 저해환(inhibitory zone, Φ㎜)을 의미함, - : Unclear zone, + : 6-10 ㎜, ++ : 10-12 ㎜, +++ : 12-14 ㎜, ++++ : 14-16 ㎜, +++++ : above 16 ㎜.
상기 표 3으로부터, 배양 3일째부터 pH가 8인 경우, 항균 활성이 가장 우수함을 확인하였다. 즉, 항균 활성물질의 생산에는 pH가 중요한 영향을 주는 인자로 작용함을 알 수 있었다.
[실시예 3] 항균성 chitinase 및 cellulase 생산성 및 활성도 조사
가. Chitinase 측정용 colloidal chitin 제조
키티나제의 활성을 측정하기 위한 콜로이달 키틴(colloidal chitin)을 제조하기 위하여 crab shell chitin(sigma co.) 100g을 4℃ HCl원액(35% 이상) 2ℓ에 혼탁한 후 4℃에서 24시간 교반하면서 처리하였다. 다음으로 교반액을 여과지(whatman paper No. 1)로 여과하여 액상을 추출한 후, 추출된 액상에 4℃ 증류수를 4ℓ 첨가하여 추출액에 녹아있는 콜로이달 키틴(colloidal chitin)을 침전시켰다. 콜로이달 키틴이 완전히 침전되면, 상등액이 pH 5.0 이상이 될 때까지 세척한 후, 5N NaOH로 중화시키고, 원심분리하여 상등액을 제거시켰다. 침전물은 60℃에서 24시간 건조하여 콜로이달 키틴을 제조하였고, 이를 0.05M phosphate buffer(pH 7.5)에 혼탁하여 효소반응 기질로 이용하였다(Joo, G. J., J. H. Kim, and S. J. Kang (2002). Isolation and Antifungal Activity of Bacillus ehimensis YJ-37 as Antagonistic against Vegetables Damping-off Fungi, Korean Journal of Life Science. 12. 200~207.).
나. 키티나제 및 셀룰라제 활성 측정
KM-8(KCTC11244BP)의 진균세포벽 가수분해효소 생산능을 조사하기 위하여 cellulase 생산능은 nutrient agar에 1% carboxyl methyl cellulose(CMC)를 함유한 CMC-NA배지와 DCAB배지(detecting cellulolytic activity of bacteria; 0.1% NaNO3, 0.1% K2HPO4, 0.05% KCl, 0.05% MgSO4.7H2O, 0.005% yeast extract, 0.5% CMC , 1.5% agar)를 이용하였고 chitinase 생산능은 nutrient agar에 1% chitin(Sigma Co.)을 함유한 chitin-NA 배지와 CMM배지(chitin-minimal 배지; 0.7% K2HPO4, 0.2% KH2PO4, 0.1% (NH4)2SO4, 0.05% sodium citrate, 0.01% MgSO4.7H2O, 0.1% chitin, 1.5% agar (pH 7.0))를 이용하였다.
KM-8(KCTC11244BP)균주를 각 plate에 획선으로 접종한 후, 3일간 28℃에서 배양하여 plate상에서 0.1% congo red를 배양 배지 위에 부어 30분간 방치한 후 버리고, 1M NaCl을 다시 부어 5분 동안 방치한 후, 콜로니(colony) 주위에 형성된 환을 관찰하였다(도 2 참조). Chitinase의 활성은 colloidal chitin을 기질로 하여, 효소 반응 후 생성되는 환원당을 DNS방법으로 540nm에서 흡광도를 측정하였다(Lee, J. T., D. H Kim, J. H Do, and S. D. Kim (1998). Purification and Characterization of Chitinase from Antagonistic Bacteria Pseudomonas sp. 3098. Kor. J. Appl. Microbial. Biotechnol. 26. 515-522).
도 2에 나타난 바와 같이, KM-8(KCTC11244BP)균주는 CMC-NA배지와 DCAB배지, CMM배지, Chitin-NA 배지 모두에서 노란색의 환이 형성된 것으로 보아 extra-cellulase와 extra-chitinase를 생성한다는 것을 확인할 수 있었다.
또한 도 3에 나타난 바와 같이, chitinase 활성은 1일째 배양액에서 가장 높게 측정되어 포자발아단계에서 생산되는 것으로 추정되었다.
[실시예 4] KM -8 배양액의 용매추출물 역가 검정
KM-8(KCTC11244BP)균주의 배양액을 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 에틸 에테르(ethyl ether), 헥산(hexane), 클로로포름(chloroform) 및 부탄올(butanol)로 각각 추출한 후, 시험균을 대상으로 항균 활성을 검토하였다. 즉, KM-8균주를 생산 최적배지인 pH 8의 ISP No.2 배지에 접종하여 28℃, 160 rpm에서 7일간 배양하면서 1, 3, 5, 7일째 배양액을 sampling하고 2배량의 상기 유기용매로 각각 추출하여 Na2SO4로 탈수시킨 다음 evaporator(EYELA Co.)로 감압 농축시키고, 소량의 추출용매에 용해시켜 사용하였다. 각 추출액 20㎕(1mg/ml)를 paper disc에 분주하여 건조 후, 하기 표 4에 기재된 식물병원균을 24시간 배양한 plate에 얹어 24℃에서 3일 배양하며 inhibitory zone의 생성을 관찰하였다.
Figure 112007090261661-PAT00003
a) -, +: 저해환(inhibitory zone, Φ㎜)을 의미함, - : Unclear zone, +: 6-10 ㎜, ++: 10-12 ㎜, +++: 12-14 ㎜, ++++: 14-16 ㎜, +++++: above 16 ㎜.
1) ; 배양시간(일)
표 4로부터, 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 추출물에서 배양 7일째 14균주에서, 에틸 에테르(ethyl ether) 추출물은 10균주에서 식물 병원균의 저해효과를 나타내었으며, 특히 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 추출물의 항균 활성이 우수함을 알 수 있었다. 그러나 헥산(hexane), 클로로포름(chloroform) 및 부탄올(butanol) 추출물은 항균효과를 보이지 않거나 아주 미약하였다(결과 미게재).
[실시예 5] KM -8 배양액의 용매추출물 혼합사용에 대한 항균활성 평가
균주 배양액의 용매추출물의 혼합사용에 따른 항균력 상승효과를 검토하기위해 KM-8 배양액의 용매추출물과 멜론 탄저병균인 Colletotrichum orbiculare KACC 40808에만 특이적인 저해를 보이는 곰팡이 분리균주인 I3-16 배양액의 에틸 아세테이트(ethyl acetate)와 에틸 에테르(ethyl ether) 용매추출물을 사용하였다. 각 배양액의 용매추출물을 10㎕(1mg/ml)씩 혼합하여 총 20㎕를 paper disc에 분주하여 저해효과의 상승을 비교하고, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다. 시험균으로는 KM-8과 I3-16이 항균 활성을 보이지 않거나 활성이 미약한 시험균을 대상으로 수행하였다.
Figure 112007090261661-PAT00004
a) -, + 저해환(inhibitory zone, Φ㎜)을 의미함, - : Unclear zone, + : 6-10 ㎜, ++ : 10-12 ㎜, +++ : 12-14 ㎜, ++++ : 14-16 ㎜, +++++ : above 16 ㎜.
1) 대조구, 5일간 배양된 KM-8 배양액의 에틸 아세테이트 추출물,
2) 5일간 배양된 I3-16 배양액의 에틸 아세테이트 추출물,
3) 5일간 배양된 I3-16 배양액의 에틸 에테르 추출물.
표 5로부터, 5일간 배양된 KM-8 배양액의 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 추출물과 5일간 배양된 I3-16 배양액의 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 추출물 또는 에틸 에테르(ethyl ether)추출물을 각각 1/2농도씩 혼합한 배양액 용매추출물은 Monosporascus cannonballus KACC 40940, Botrytis aclada Fresenius KACC 41297, Cladosporium cucumerinum KACC 40576에서 항균 활성이 증가되거나 항균 활성이 있다는 사실을 확인하였다.
[실시예 6] KM -8 배양액의 식물병원균에 대한 생육 저해도 측정
KM-8 균주를 배양한 생균을 직접 사용하는 방제용 spray로서 응용 가능성을 검토하기 위하여, KM-8균주를 액체 배양한 후, 식물병원균 20여 균주를 생육시킨 plate에 각각의 agar piece를 얹고 24시간 배양한 다음, 식물병원균이 접종된 위치로부터 약 30㎜ 이격된 공간에 KM-8 배양액을 획선 접종한 후 5일간 배양하여 시험균에 대한 생육저해정도를 조사하였다.
도 4로부터, KM-8 균주 배양액은 배양액 용매추출물의 항균활성(표 4)과는 달리 푸사리움(Fusarium)속 식물병원균을 포함한 16개 균주에 대하여 뚜렷한 길항효과를 보임을 확인하였으며, 이외의 4개 균주에도 초기에는 저해를 보였으나 배양시간이 경과함에 따라 기균사로 덮여지게 되어 항균효과가 미약한 사실을 확인하였다(결과 미게재). 이들 결과로부터 KM-8 균주 배양액은 다양한 식물병원균 방제를 위한 길항 미생물제재로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
도 1의 (a)는 ISP No.2 배지에서 5일간 배양한 KM-8 균주를 현미경(×400)으로 관찰한 사진이고, (b)는 PDA배지에서 5일간 배양한 I3-16 균주를 현미경(×1000)으로 관찰한 사진이다.
도 2는 셀룰로스(cellulose) 또는 키틴(chitin)을 함유하는 각각의 배지에서 KM-8 균주에서 생성되는 가수분해 효소(hydrolysis enzymes)의 활성을 확인한 사진으로서, (a)는 CMC-NA 배지, (b)는 DCAB 배지, (c)는 CMM 배지, (d)는 Chitin-NA 배지이다.
도 3은 KM-8 균주 배양액의 키티나제 활성(Chitinase activity)을 측정한 그래프이다.
도 4는 다양한 식물병원균의 균사체 생육을 저해하는 KM-8 균주의 길항작용을 보여주는 사진으로서, 식물병원균이 ⒜는 Monosporascus cannonballus KACC 40940, ⒝는 Botrytis cinerea KACC 41029, ⒞는 Botrytis cinerea KACC 40963, ⒟는 Botrytis aclada Fresenius KACC 41297, ⒠는 Botrytis cinerea KACC 41022, ⒡는 Fusarium graminearum KACC 41040, ⒢는 Phytophthora capsici KACC 40476, ⒣는 Cladosporium cucumerinum KACC 40576, ⒤는 Fusarium oxysporum KACC 40902, ⒥는 Rhizoctonia solani KACC 40113, ⒦는 Botrytis cinerea KACC 40965, ⒧은 Fusarium oxysporum KACC 40052, ⒨은 Didymella bryoniae KACC 40669, ⒩은 Botrytis cineara KACC 40854, ⒪는 Botytis fabae KACC 40962, ⒫는 Sclerotinia sclerotiorum KACC 41065이다.

Claims (9)

  1. 식물 병원균에 대하여 항균활성을 갖는 신규의 스트렙토마이세스( Streptomyces )속의 KM-8(KCTC11244BP).
  2. 제1항에 있어서, 상기 식물 병원균은 잿빛곰팡이병을 유발하는 보티리스 시네리아( Botrytis cinerea ), 잿빛썩음병을 유발하는 보티리스 액크라다 프레세니우스( Botrytis aclada Fresenius ), 검은별무늬병을 유발하는 클래도스포리움 큐쿠메리넘( Cladosporium cucumerinum ), 고추 탄저병을 유발하는 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스( Colletotrichum gloeosporioides ), 오이 탄저병을 유발하는 콜레토트리쿰 오르비쿨라레( Colletotrichum orbiculare ), 덩굴마름병을 유발하는 디디멜라 브리오니애( Didymella bryoniae ), 줄기마름병을 유발하는 푸사리움 옥시스포럼( Fusarium oxysporum ), 붉은 곰팡이병을 유발하는 푸사리움 그라미네아럼( Fusarium graminearum ), 검은점뿌리썩음병을 유발하는 모노스포라스커스 카노발러스( Monosporascus cannonballus ), 잎집무늬마름병을 유발하는 라이족토니아 솔라니( Rhizoctonia solani ), 고추균핵병을 유발하는 쉴레로티니아 쉴레로티오럼( Sclerotinia sclerotiorum )으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 스트렙토마이세스( Streptomyces )속의 KM-8(KCTC11244BP).
  3. 제1항에 있어서, 상기 스트렙토마이세스(Streptomyces)속의 KM-8은 셀룰라제(cellulase) 및 키티나제(chitinase) 생성능이 있는 것을 특징으로 하는 것인 스트렙토마이세스( Streptomyces )속의 KM-8(KCTC11244BP).
  4. 스트렙토마이세스( Streptomyces )속의 KM-8(KCTC11244BP), 상기 KM-8 배양액, 상기 KM-8 배양액의 용매추출물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 것을 포함하는 식물 병원균 방제용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 스트렙토마이세스속의 KM-8 배양액은 0.4% yeast extract, 1% malt extract 및 0.4% dextrose를 포함하는 ISP No. 2 배지에서 pH 6 내지 8의 조건으로 배양된 KM-8 균주를 함유하는 것을 특징으로 하는 식물 병원균 방제용 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 KM-8(KCTC11244BP) 배양액의 용매추출물은 상기 KM-8 배양액을 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 에틸 에테르(ethyl ether), 헥산(hexane), 클로로포름(chloroform), 부탄올(butanol) 및 이들의 혼합물로 이루어 진 군에서 선택되는 용매로 추출한 것을 특징으로 하는 식물 병원균 방제용 조성물.
  7. 제4항에 있어서, 아스퍼질러스 속( Aspergillus spp.) 균주를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 병원균 방제용 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 아스퍼질러스 속( Aspergillus spp.) 균주는 아스퍼질러스 속( Aspergillus spp.) I3-16인 것을 특징으로 하는 식물 병원균 방제용 조성물.
  9. 제4항에 있어서, 상기 식물 병원균은 잿빛곰팡이병을 유발하는 보티리스 시네리아( Botrytis cinerea ), 잿빛썩음병을 유발하는 보티리스 액크라다 프레세니우스( Botrytis aclada Fresenius ), 검은별무늬병을 유발하는 클래도스포리움 큐쿠메리넘( Cladosporium cucumerinum ), 고추 탄저병을 유발하는 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스( Colletotrichum gloeosporioides ), 오이 탄저병을 유발하는 콜레토트리쿰 오르비쿨라레( Colletotrichum orbiculare ), 덩굴마름병을 유발하는 디디멜라 브리오니애( Didymella bryoniae ), 줄기마름병을 유발하는 푸사리움 옥시스포 럼( Fusarium oxysporum ), 붉은 곰팡이병을 유발하는 푸사리움 그라미네아럼( Fusarium graminearum ), 검은점뿌리썩음병을 유발하는 모노스포라스커스 카노발러스( Monosporascus cannonballus ), 잎집무늬마름병을 유발하는 라이족토니아 솔라니( Rhizoctonia solani ), 고추균핵병을 유발하는 쉴레로티니아 쉴레로티오럼( Sclerotinia sclerotiorum )으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 식물 병원균 방제용 조성물.
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