KR20090050600A - 케이쥐알케이알 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를포함하는 화장품 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 KGRKR 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 피부의 기저막세포의 증식 능력을 유지시키는 피부 노화방지제 및/또는 피부주름 개선제에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 피부의 기저막세포의 증식능력을 유지시켜 피부의 노화방지 및/또는 피부주름 개선의 효과를 나타내는 KGRKR 아미노산 서열을 갖는 펩티드 및 생리학적으로 허용되는 화장품 기제를 포함하는 화장품 조성물에 대한 것이다.

노화방지제

Description

케이쥐알케이알 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 포함하는 화장품 조성물 {COSMETIC COMPOSITION COMPRISING PEPTIDE COMPRISING KGRKR AMINO ACID SEQUENCE}

본 발명은 KGRKR 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 피부의 기저막세포의 증식능력을 유지시키는 피부 노화방지제 및/또는 피부주름 개선제에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 피부의 기저막세포의 증식능력을 유지시켜 피부의 노화방지 및/또는 피부주름 개선의 효과를 나타내는 KGRKR 아미노산 서열을 갖는 펩티드 및 생리학적으로 허용되는 화장품 기제를 포함하는 화장품 조성물에 대한 것이다.

피부는 최상부의 표피와 표피 아래층에 존재하는 진피로 이루어져 있으며, 표피는 각질형성세포가 대부분을 차지하는 중층 편평상피로 진피로부터 기저층, 유극층, 과립층, 각질층 순의 4층으로 이루어져 있다. 기저층에서 각질형성세포의 분열이 일어난 후 각질형성세포는 피부의 표면으로 이동하면서 여러 단계의 분화과정을 거치게 된다.

피부의 노화의 원인 중에 하나로 산소에서 유래되는 과산화물 음이온 라디 칼(superoxide anion radical), 히드록시 라디칼(hydroxy radical), 일중항 산소(singlet oxygen) 및 과산화수소(H₂O₂) 등의 활성산소에 의해 야기되는 자유 라디칼(free radical) 반응은 지질을 포함한 세포의 주요 거대 분자를 파괴시키며, 이들은 반응성이 강하고 세포 구성물질이나 세포막과 반응하여 이상대사를 초래한다고 알려져 있다.

이 같은 비정상적인 대사나 물리, 화학적인 외부자극에 대한 노출은 산화와 항산화의 불균형을 야기해 과산화나 생체 내 방어기구의 무기력화를 일으키고 단백질의 산화 및 변성 등을 초래하며 세포의 기능을 손상시키며, 결국 탄력 감소, 주름, 기미 및 주근깨 생성 등으로 특징 지워지는 피부 노화가 가속화된다(J. Soc.,Cosmet.Sci.Kor., 23, pp75-132, 1997).

피부노화 메커니즘을 살펴보면, 먼저 자외선이나 외부환경적 요인에 의해 활성산소나 자유 라디칼이 생성되며, 생성된 활성산소나, 자유 라디칼에 의해 세포막이 공격을 당하게 되어 피부는 염증(inflammation)이 일어나며, 염증화된 (inflammated) 조직은 생리학적 진행 메카니즘에 의해 단백질이나 유전자 물질 등을 파괴하고 피부주름 등을 형성하는 피부노화가 일어난다(대한민국 공개특허 제10-2007-0070659호).

또한, 외부자극의 축적 및 노화가 진행됨에 따라 피부에는 주름이 생기게 되며 심각한 피부고민을 유발하게 된다. 피부주름을 제거하기 위하여 보톡스 주입 등의 외과적 시술이 시행되고 있으나 비용이나 환자의 고통면에서도 바람직하지 않 으며, 또 레티놀 및 그 유도체 등이 화장품의 형태로 널리 사용되고 있으나 안정성 면에서 많은 문제를 야기해 왔다(대한민국 공개특허 제10-2005-0035482호).

이러한 피부에 대하여 화상, 피부궤양 등의 피부이식의 사용을 위해서 인공피부가 개발되었다. 현재 개발되어 있는 인공피부 모델 배양방법 가운데 대표적인 예는 섬유모세포가 포함된 콜라겐 기질 위에서 인체 각질형성세포를 삼차원적으로 배양하는 방법(living skin equivalent, LSE)이다(Bell E et al, J Invest Dermatol.1983;81:2s-10s). 인공피부 배양방법이 발전함에 따라 인공피부는 형태학적으로 인체 피부와 매우 유사할 뿐만 아니라 생화학적으로, 그리고 기능적으로 인체피부와 상당히 유사해 졌다 (Asselineau D et al, J Invest Dermatol.1986;86: 181-186; Ponec M. Toxicol in Vitro. 1991;5: 597-606 ; Ponec M et al, J Invest Dermatol. 1997;109: 348-355).

인공피부의 배양 및 피부노화와 관련하여 성장인자가 널리 쓰이는데, 성장 인자는 특정 표적 세포군의 광범위한 생물학적 반응, 즉 DNA 합성, 세포 분열, 특이한 유전체의 발현 등을 일으키는 폴리펩티드이다. 다수의 상이한 성장 인자군은 전이 성장 인자 베타군(TGF-βs), 상피 성장 인자와 전이 성장 인자 알파군(the TGF-αs), 혈소판 유래 성장 인자(PDGFs), 섬유원 세포 성장 인자군 FGFs) 그리고 인슐린 유사 성장 인자-I과 인슐린 유사 성장 인자-II를 포함하는 인슐린 유사 성장 인자군(IGFs)으로 정의된다.

인슐린유사 성장인자는 인슐린과 유사한 활성을 가지며, 신경 조직 세포의 분열을 발생하게 하는 물질이다. 대부분의 모든 인슐린 유사 성장 인자는 인슐린 유사 성장 인자-I, 인슐린 유사 결합 단백질-3, 산 분해성 서브유닛(ALS)으로 명명된 좀 더 넓은 범위의 단백질 서브유닛으로 이루어진 비공유결합적 복합체를 형성하여 체내를 순환하며, 따라서, 유리된 인슐린 유사 성장 인자-I은 거의 발견되지 아니한다. 삼원 복합체는 몰랄 농도가 각각 같은 세 종류의 성분으로 구성된다. 비록 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질-3이 인슐린 유사 성장 인자가 없이도 쥐의 산 분해성 서브유닛와 결합할 수 있다는 몇몇 보고가 있지만(Lee et al., Endocrinology 136:4982-4989, 1995), 산 분해성 서브유닛은 인슐린 유사 성장 인자와 직접 결합하지 않고 인슐린 유사 성장 인자/인슐린 유사 성장 인자결합 단백질-3 복합체에 결합하여서만 나타난다(Baxter et al., J. Biol. Chem 264(20):11843-11848, 1989).

인슐린 유사 성장 인자/인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질-3/산 분해성 서브유닛의 삼원소 복합체의 분자량은 약 150kDa이다. 이 삼원소 복합체는 "유리 인슐린 유사 성장 인자 농도의 급속한 변화를 차단하는 인슐린 유사 성장 인자-I과 인슐린 유사 성장 인자-II의 저장소나 완충용액"(Blum et al.(1991), " 혈장내의 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질-3의 수준을 나타내는 임상적 지표", MODERN CONCEPTS OF INSULINE-LIKE GROWTH FACTORS, pp. 381-393, E.M. Spencer, ed., Elsevier, New York)으로 작용한다고 여겨진다. 순환계에는 초과량의 결합하지 않은 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질-3은 존재하지 않는 반면 초과량의 유리 산분해성 서브유닛은 상당량 존재한다(Baxter, J.Clin. Endocrinol. Metab. 67:265-272, 1988).

인슐린유사 성장인자 결합 단백질(insulin like growth factor-binding protein, IGFBP)은 6가지 종류가 있으며 인슐린유사 성장인자(insulin like growth factor)와 결합한다(Firth SM and Baxter RC. Cellular actions of the insulin-like growth factor binding proteins. Endocrine Reviews 23(6):824-54, 2002/ Sitar T, Popowicz GM, Siwanowicz I, Huber R, Holak TA. Structural basis for the inhibition of insulin-like growth factors by insulin-like growth factor-binding proteins. PNAS 103(35):13028-33). 이 가운데 IGFBP-3와 IGF-1 수용체가 피부의 기저층과 증식층에서 발현됨으로 IGFBP-3가 표피에서 중요한 작용을 하는 것으로 알려져 있다 (EdmondsonSR, Thumiger SP, Kaur P et al. Insulin-like growth factor binding protein-3 (IGFBP-3) localizes to and modulates proliferative epidermal keratinocytes in vivo. Br J Dermatol 152(2): 225-30, 2005).

IGFBP는 IGF의 생체활성, 분포 등을 조절하는데 IGF와의 결합은 N- 및 C-말단의 양쪽 끝에 위치하는 것으로 알려져 있으며, 이 부분이 분해되면(proteolytic cleavage) 결합능력이 낮은 N- 및 C- 말단 조각을 만들어 IGF 수용체와 경쟁하지 못한다는 사실이 알려져 있다(Bunn RC, Fowlkes JL. Insulin-like growth factor binding protein proteolysis. Trends Endocrinol Metab 14(4):176-81, 2003). 그러나 최근 연구에 의하면 분해된 N- 및 C-말단 조각이 여전히 IGF의 작용을 억제하며 때로는 전혀 새로운 작용을 함이 보고되고 있다(J. Biol. Chem., Vol. 279, Issue 51, 53232-53240, December 17, 2004).

KGRKR은 Lys-Gly-Arg-Lys-Arg의 염기서열 구조를 갖는 IGFBP-3의 C-말단부로 단독 효능은 알려진 바 없다. 대한민국 공개특허 제2003-0063344호의 청구항 제17항에서 아미노산 서열 KGRKR을 갖는 것을 특징으로 분리된 단백질 복합제(발명의 명칭: 성장인자 복합체)를 제시하고 있지만 이는 헤파린결합도메인(HBD)과 비트로넥틴의 복합체를 제시하며 이 가운데 HBD의 특성을 제한하는 제시이며 근원적으로는 대한민국 공개특허 제2003-0063344호의 청구항 제1항에 기재되어 있듯이 성장인자 결합단백질과 비트로넥틴을 포함하는 분리된 단백질 복합체를 제공하는 것이다. 결론적으로 본 발명에서 제시한 바와 같이 KGRKR이 단독으로 피부세포 증식능력을 연장시킨다는 효과를 규명하고 있지 아니하다.

본 발명자들은 KGRKR 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 피부 노화방지제 및/또는 피부주름 개선제에 있어서, IGFBP-3의 C-말단부 펩티드인 KGRKR의 효능이 밝혀지지 아니하였음에 착안하여, 피부세포의 증식능력을 연장시킴으로써 피부 노화방지 및/또는 피부주름 개선의 효과를 구체적으로 확인함으로써, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 기본적인 목적은 KGRKR 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하여 피부의 분화를 향상시키고 기저막 형성을 촉진시키는 피부 노화방지제를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 또 다른 목적은 KGRKR 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함 하는 것을 특징으로 하는 피부 노화방지의 효과를 갖는 화장품 조성물 제공에 있다.

또한 본 발명의 또 다른 목적은 KGRKR 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부주름 개선제를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 또 다른 목적은 KGRKR 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부주름 개선의 효과를 갖는 화장품 조성물 제공에 있다.

전술한 본 발명의 기본적인 목적은 KGRKR 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 노화방지제를 제공함으로써 달성될 수 있다.

노화방지제는 피부의 노화를 방지하기 위한 기능성 화장품으로, 기능성 화장품이란 피부에서 생화학적 또는 물리적인 효능 및 효과를 나타내는 화장품을 말한다.

인체의 피부는 외부 환경에 직접적으로 노출되는 부위로서, 과도한 자외선이나 오염 물질 등에 노출되면 활성산소나 자유 라디칼이 생성되며, 생성된 활성산소나 자유 라디칼에 피부 자극 및 염증 반응이 유발된다. 이러한 원인들에 의해 생성된 피부 트러블은 미관상 문제가 될 뿐만 아니라, 염증 반응 과정에서 생성되는 물질들이 부수적으로 피부의 색소 침착을 일으키고, 피부 탄력 섬유의 붕괴를 촉진시켜 피부주름의 증가에까지 영향을 미치고, 피부 노화에까지 이르는 것으로 알려져 있다.

피부는 최상부의 표피와 표피 아래층에 존재하는 진피로 이루어져 있으며, 표피는 각질형성세포가 대부분을 차지하는 중층 편평상피로 진피위로 기저층, 유극층, 과립층, 각질층 순의 4층으로 이루어져 있다. 기저층에서 각질형성세포의 분열이 일어난 후 각질형성세포는 피부의 표면으로 이동하면서 여러 단계의 분화과정을 거치게 된다.

KGRKR은 IGFBP-3의 C-말단부이고, KGRKR 아미노산 서열을 갖는 펩티드는 기저층 세포들의 증식능력을 오래 지속시켜 피부노화를 방지하는 효과가 있다.

전술한 본 발명의 또 다른 목적은 KGRKR 아미노산 서열을 갖는 펩티드 및 생리학적으로 허용되는 화장품 기제를 포함하는 피부 노화방지 효과가 있는 화장품 조성물을 제공함으로써 달성될 수 있다.

본 발명의 피부 노화방지 화장품 조성물은 KGRKR 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 전체 조성물에 대하여 0.001 내지 30 중량%로 함유하는 것이 바람직하다. 상기 함량범위는 상기 펩티드 화합물의 세포증식 효능을 고려하고, 그 함량이 0.001 중량% 미만일 경우에는 피부 노화방지 효과가 미미하다는 점과, 30 중량%를 초과할 경우에는 사용량에 따른 효과가 미미하다는 점을 고려한 것이다.

또한, 본 발명의 화장품 조성물은 그 제형이 특별히 한정되는 것은 아니며, 제조하고자 하는 제형에 따라 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 피부 화장품 배합 성분을 포함할 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 피부 노화방지 화장품 조성물은 화장수(스킨), 유액, 크림, 팩, 미용액 등의 제형으로 제조할 수 있으며, 제조하고자 하는 제형에 따라 추가로 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 선택하여 적정량으로 첨가할 수 있으며, 그 제형 및 첨가성분이 상기 내용에 한정되는 것은 아니다.

전술한 본 발명의 기본적인 목적은 KGRKR 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 피부주름 방지제를 제공함으로써 달성될 수 있다. 피부주름 개선제는 피부주름을 예방 또는 완화시키는 효과를 갖는 기능성 화장품이다. KGRKR은 IGFBP-3의 C-말단부이고, KGRKR 아미노산 서열을 갖는 펩티드는 기저층 세포들의 증식능력을 오래 지속시켜 피부주름 개선하는 효과가 있다.

전술한 본 발명의 또 다른 목적은 KGRKR 아미노산 서열을 갖는 펩티드 및 생리학적으로 허용되는 화장품 기제를 포함하는 피부주름 개선 효과가 있는 화장품 조성물을 제공함으로써 달성될 수 있다.

본 발명의 피부주름 개선 화장품 조성물은 KGRKR 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 전체 조성물에 대하여 0.001 내지 30 중량%로 함유하는 것이 바람직하다. 상기 함량범위는 상기 펩티드 화합물의 세포증식 효능을 고려하고, 그 함량이 0.001 중량% 미만일 경우에는 피부주름 개선 효과가 미미하다는 점과, 30 중량%를 초과할 경우에는 사용량에 따른 효과가 미미하다는 점을 고려한 것이다.

또한, 본 발명의 화장품 조성물은 그 제형이 특별히 한정되는 것은 아니며, 제조하고자 하는 제형에 따라 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 피부 화장품 배합 성분을 포함할 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 피부주름 개선 화장품 조성물은 화장수(스킨), 유액, 크림, 팩, 미용액 등의 제형으로 제조할 수 있으며, 제조하고자 하는 제형에 따라 추가로 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 선택하여 적정량으로 첨가할 수 있으며, 그 제형 및 첨가성분이 상기 내용에 한정되는 것은 아니다.

첫째, 상기와 같이, 본 발명의 KGRKR을 첨가하여 배양하면 피부세포의 증식능력이 오래 유지된다. 따라서 본 발명의 KGRKR은 피부도포시 피부세포의 증식능력을 오래 보존함으로써 피부의 노화방지의 효과를 갖는다.

둘째, 피부주름 개선의 효과를 갖는다.

다음의 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 다음의 실시예에 대한 설명은 본 발명의 구체적인 실시 태양을 특정하여 설명하고자 하는 것일 뿐이며, 본 발명의 권리 범위를 이들 실시예에 기재된 내용으로 한정하거나 제한해석하고자 의도하는 것은 아니다.

본 발명에서, KGRKR 펩티드를 첨가하면 기저층 세포들의 증식능력이 오래 지속된다는 사실을 확인하기 위한 목적으로, 인공피부를 배양한다. 섬유모세포가 포함된 콜라겐으로 구성된 진피 대응물 위에 각질형성세포를 배양하여 수득한 인공피부는, 형태학상으로 인체 피부의 표피와 매우 유사하게 기저층, 유극층, 과립층, 각질층을 갖는 중층의 표피이다. 이를 위하여 피부조직으로부터 섬유모세포 및 각질형성세포를 분리하여 배양하고, 콜라겐 기질에 섬유모세포를 첨가하여 진피 대용 물을 제조하고, 상기 진피 대용물 상에 각질형성세포를 접종하고 배양하는 단계를 포함한다. 상기 섬유모세포 및 각질형성세포는 인간을 포함하는 포유류의 피부 조직으로부터 분리 및 배양한 것이 바람직하다.

실시예 1. 섬유아세포와 각질형성세포의 배양

각질형성세포와 섬유아세포는 어린아이의 포경수술을 통하여 얻어진 포피에서 분리하였다. 피부조직에서 잔여 피하지방을 제거 후 잘게 절개하여 서몰리신(thermolysin) 용액에서 37℃에서 1시간 반응시킨다. 반응시킨 조직을 핀셋을 이용하여 표피와 진피로 분리하여 각각을 트립신용액에 담아 37℃에서 15분 반응 후 단일 세포로 분리되도록 진탕한다. 배양은 '레인왈드 및 그린(Rheinwald and Green (Cell, 1975))'의 방법을 따라 수행하였다. 분리한 각질형성세포는 각질형성세포 성장 배지(KGM, Clonetics, San Diego, CA, USA)에서 배양하였고, 섬유모세포는 10% 소의 혈청이 포함된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco, N.Y., USA)에서 배양하였다. 각질형성세포 및 섬유아세포 배양시, 배양 온도는 37℃, 배양 기간은 7 내지 10일로 하였다.

실시예 2. 섬유모세포의 증식 실험

KGRKR을 사용하여 세포증식효과를 실험하였다.　 세포증식 효능의 확인은 MTT 분석법을 이용하였다.　 증식기의 섬유모세포를 웰 당 8000 개로 96웰 플레이트에 접종하여 200 ㎕ DMEM 배지에서 24 시간 동안 배양하였다.　 도 4에 따르면, IGF 및 IGFBP-3 단독 처리는 별 효과가 없었지만, IGFBP-3 및 KGRKR을 8시간 동안 전처치(pre-incubation)하고 IGF를 처리한 결과 대조군에 비하여 섬유모세포의 증식이 크게 증가한 것을 알 수 있었으며, 특히 KGRKR의 효과가 더 좋았다. 결과는 디메틸설폭사이드 용액을 웰에 넣고 용해시켜, ELISA 판독기를 사용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

실시예 3. 진피 대용물의 제조

진피보형물은 쥐꼬리로부터 분리 채취한 콜라겐 10 g을 4℃의 1/1000 빙초산(glacial acetic acid) 용액 1000 mL에 48시간 동안 교반하여 녹인 I형 콜라겐 용액과 10 x DMEM과 완충액(0.05 N NaOH, 0.26 mM NaHCO₃, 및 200 mM HEPES)을 8:1:1 (부피비)로 혼합하여, 콜라겐 기질을 제조하였다. 이와 같이 얻어진 콜라겐 기질 3.5 mL를 밀리셀(millicell)에 나누어 넣고, 각 밀리셀 당 섬유아세포 5x10⁵ 개를 첨가하여 혼합하였다. 그리고 나서, 상기 혼합액을 30 mm의 밀리셀에 3.5 ml씩 넣어 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 굳히는 과정으로 진피 대용물을 제조하였다.

실시예 4. 인공피부의 구축

상기 실시예 3에서 제조된 진피 대용물 6 cm² 위에 1x10⁶ 개의 각질형성세포를 접종하고, 1일간 배지를 침지시켜 배양한 다음 다시 12일간 공기에 노출시켜 배 양하였다. 이때, 배양 온도는 37 ℃로 하였다. 상기 배지는 5 % FBS, 0.4 mg/ml 하이드로코르티손, 1 mM 이소프로테레놀, 25 mg/ml 아스코르빈산 및 5 mg/ml 인슐린이 포함된 DMEM 배지와, 함스 영양 혼합물 F12(Ham's nutrient mixture F12)을 3:1의 비율로 혼합한 혼합 용액을 사용하였다.

1일간 침지 배양시에는 저농도 EGF (Epidermal Growth Factor, Invitrogen, carlsbad, CA, 1 ng/ml)를 첨가하였고, 12일간의 공기 노출 배양시에는 고농도 EGF(10 ng/ml)를 첨가하였다. 배지는 일주일에 3회 교환하였고, 상기 실험은 동일조건으로 최소 2번 반복 실시하였다. 이러한 기본 조건에 아스코르빈산(ascorbic acid, 25ug/ml, Sigma, St Louis, USA)가 첨가되었으며 그 외 실험조건에는 rh-IGFBP-3 (200 ng/ml, #675-B3, R&D Systems, MN, USA), KGRKR (30 mg/ml, Thermo Electron GmbH, Germany)을 각각의 조건에 맞도록 첨가하였다. 배양 후, 얻어진 조직을 카르노이스 용액(Carnoy's solution, ethanol/ chloroform/ acetic acid 6:3:1)으로 고정시키고, 파라핀 블록으로 제조하여, 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다(Sigma chemical, St. Louis, USA). 상기 염색 결과를 도 1에 나타내었다.

실시예 5. 면역조직화학 염색

면역조직화학 염색의 일차항체로서 PCNA, p63, 인볼루크린(involucrin), 필라그린(filaggrin, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)에 대한 항체를 이용하였다. 면역조직화학 염색은 아비딘-비오틴-퍼옥시다아제 복합 기법 (avidin-biotin-peroxidase complex techniques)을 사용하여 수행하였다. 2주 간 배양 시킨 후 시행한 면역조직화학염색에서 PCNA와 p63의 발현양상을 비교해 보았다. 면역조직화학염색에 사용한 PCNA는 증식하는 세포에서 발현하는 특성이 있으며 p63는 표피세포에서 줄기세포 표지자로 알려져 있다.

도 1과 같이, 다른 모델에 비하여 KGRKR을 사용한 인공피부에서 PCNA와 p63 양성세포가 많이 발견되어 KGRKR은 기저층 세포의 증식능력을 오래 유지시켜 준다는 사실을 알 수 있었다. 이러한 현상을 명확히 확인하기 위하여 인공피부를 추가적으로 2주, 6주 간 더 배양하였다. 일반적으로 인공피부는 과증식상태에 있어 오래 배양이 어려운 것으로 알려져 있다. 추가 배양결과 배양 후, 특히 8주 후에 KGRKR을 첨가한 모델의 표피가 상대적으로 두꺼웠으며 PCNA와 p63의 발현도 강하게 나타났다.

이러한 현상의 원인을 분석하기 위하여 세포고사를 확인하였다. 세포고사는 아포태그 키트(Apoptag kit, Chemicon, USA)를 사용하였으며 4주 간 배양한 결과에는 큰 차이가 없었으나 8주 간 배양한 결과에는 큰 차이가 있었다. 대조군 모델 및 IGFBP-3 처리 모델은 세포고사가 많이 관찰되었지만 KGRKR 모델에서는 세포고사가 적게 관찰되어 KGRKR이 기저층 세포의 증식능력을 오래 보존시켜 준다는 사실을 다시 한번 확인할 수 있었다.

결론적으로 KGRKR을 피부에 도포하면 피부세포를 젊게 오래 유지할 수 있어 노화방지 효과가 있음을 알 수 있었다.

실시예 6. KGRKR 을 포함한 화장품 조성

KGRKR을 포함한 화장품 조성물을 제시한다. 그러나, 본 발명의 조성물이 하기의 제형예에 한정되는 것은 아니다.

[표 1] 실시예 6-1. 크림

성분	중량%
펜타펩티드(KGRKR)	0.1
부틸렌글리콜	6.0
글리세린	3.0
미네랄오일	5.0
소듐히아루로네이트	0.5
폴리솔베이트(polysorbate)	1.5
스쿠알렌	1.0
비스왁스	1.0
향료	0.1
정제수	to 100

[표 2] 실시예 6-2. 로션

성분	중량%
펜타펩티드(KGRKR)	0.1
세토스테아릴알코올	2.5
스테아린산	1.7
마이크로크리스탈린납	0.8
부틸렌글리콜	3.0
글리세린	5.0
에틸렌디아민테트라초산디나트륨	0.01
향료	0.1
이미졸리디닐우레아	0.2
정제수	to 100

실시예 7. 주름개선효과

(시험 1) 패널 테스트(Panel test)에 의한 관능 검사

35 내지 50세 연령의 여성 10명을 대상으로 안면의 한쪽에는 실시예 6-1을 다른 쪽에는 유효성분이 없는 제품을 4주간 아침 및 저녁으로 사용하게 한 후, 주름방지에 있어서 현저한 효과가 있는 경우 5점으로, 전혀 효과 없는 경우를 0점으로 하여 6단계로 평가하게 하고 평균을 내었다.　 또한 총 15명을 대상으로 사용감 을 확인하였다.

[표 3] 주름개선효과

시료명	비교제품	실시예 6-1
주름개선효과 (N=10)	1.3	4.5

[표 4] 사용감

구분	보습력	흡수력	유분감	트러블
결과 (N = 15)	9명 좋다 5명 보통 1명 나쁘다	7명 좋다 6명 보통 2명 나쁘다	6명 좋다 8명 보통	14명 없다 1명 있다

이상의 실험결과에서, 본 발명의 KGRKR 펩티드를 함유하는 화장품 조성물은 주름개선효과가 아주 우수하였으며 사용감도 좋은 편이었다.

(시험 2) 기계적 계측에 의한 주름개선효과

시험 1과 같은 대상자에서 눈꼬리부위의 주름을 레플리카(replica)로 떠서 비시오메타 시스템(Visiometer system; C+K사)으로 피부주름을 측정하여 비교하였다. 피부측정은 24℃ 온도, 상대습도 40%의 항온 항습실에서 시행하였다. 계산 결과, 비교제품을 사용한 부위의 피부주름은 3±5%(평균±표준편차)의 감소를 보인 반면, 실시예 6-1을 사용한 부위의 피부주름은 22±10%의 감소치를 보여 우수한 피부주름 개선효과를 객관적으로 확인할 수 있었다.

도 1은 섬유모세포(Fb)를 포함하는 인공피부(control)에 IGFBP-3를 추가로 처리한 인공피부(IGFBP-3) 및 본 발명의 KGRKR을 첨가하여 배양한 인공피부(KGRKR)를 비교하여 헤마톡실린과 에오신으로 염색한 모습과 면역조직화학염색결과를 보여주는 사진이다.

도 2는 배양한 인공피부를 4주와 8주간 장기 배양하여 표피의 두께, 증식표지자인 PCNA, p63를 염색하고 비교한 결과를 보여주는 사진이다.

도 3은 배양한 인공피부에서 세포고사를 관찰하기 위하여 아포태그(Apotag)방법으로 염색하고 결과를 보여주는 사진이다.

도 4는 KGRKR을 사용한 세포증식효과 실험의 결과이다.

<110> WELSKIN CO., LTD <120> COSMETIC COMPOSITION COMPRISING PEPTIDE COMPRISING KGRKR AMINO ACID SEQUENCE <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Lys Gly Arg Lys Arg 1 5

Claims (8)

1. KGRKR 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 피부 노화방지제.
2. KGRKR 아미노산 서열을 갖는 펩티드 및 생리학적으로 허용되는 화장품 기제를 포함하는 피부 노화방지 화장품 조성물.
3. 제2항의 피부 노화방지 화장품 조성물에 있어서, 상기 KGRKR 아미노산 서열을 갖는 펩티드가 0.001 중량% 내지 30 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 피부 노화방지 화장품 조성물.
4. 제2항에 피부 노화방지 화장품 조성물에 있어서, 상기 조성물이 화장수, 유액, 크림, 팩 및 미용액으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형인 것임을 특징으로 하는 피부 노화방지 화장품 조성물.
5. KGRKR 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 피부주름 개선제.
6. KGRKR 아미노산 서열을 갖는 펩티드 및 생리학적으로 허용되는 화장품 기제를 포함하는 피부주름 개선 화장품 조성물.
7. 제6항의 피부주름 개선 화장품 조성물에 있어서, 상기 KGRKR 아미노산 서열을 갖는 펩티드가 0.001 중량% 내지 30 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 피부주름 개선 화장품 조성물.
8. 제6항의 피부주름 개선 화장품 조성물에 있어서, 상기 조성물이 화장수, 유액, 크림, 팩 및 미용액으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형인 것임을 특징으로 하는 피부주름 개선 화장품 조성물.

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