KR20090047448A - 암 질환 변경 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 스크리닝 파라다임을 이용하여 환자 암 질환 변형 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 종국에 암 세포 세포독성을 이용한 항-암 항체를 분리함으로써 공정은 치료 및 진단 목적의 항-암 항체를 생산하는 것이 가능하다. 항체를 암의 단계 결정 및 진단에 도움이 되도록 이용할 수 있고, 원발성 종양 예를 들면, 전립선 또는 유방암 종양 및 종양 전이를 치료하는데 이용할 수도 있다. 항-암 항체는 독소, 효소, 방사능활성 화합물들 및 조혈성 세포에 콘쥬게이트시킬 수도 있다.

Description

암 질환 변경 항체{CANCEROUS DISEASE MODIFYING ANTIBODIES}

본 발명은 암 질환 변경 항체(CDMAB)의 분리 및 생산, 그리고 선택적으로 하나 또는 그 이상의 화학치료제와 복합하여 치료 및 진단 과정에서 이들 CDMAB의 이용에 관계한다. 본 발명은 또한 본원의 CDMAB을 이용하는 결합 검사에 추가적으로 관련된다.

암이 있는 각 개체는 독특하며, 개인의 성향에 따라 다른 암과는 구별되는 암을 가진다. 이와 같은 사실에도 불구하고, 현재 요법은 동일 단계에 동일 타입의 암을 가진 모든 환자를 동일한 방법으로 처리한다. 이들 환자의 최소 30%는 제1차 요법에서 실패할 것이고, 추가 처리 과정을 받아야 하며, 치료 실패, 전이 및 극단적으로 사망하게 되는 가능성이 증가된다. 처리에 우위적인 방법은 특정 개인에 대해 치료법을 맞추는 것일 것이다. 환자에 맞춤이 되는 유일한 현재 치료는 외과술이다. 화학요법 및 방사능 요법은 환자에 맞출 수 없고, 외과술 자체도 대부분의 경우 치료에 부적합하다.

단클론 항체의 도입으로, 환자에 맞춤 요법을 위한 방법 개발 가능성이 좀더현실적으로 되었는데, 그 이유는 각 항체가 단일 에피토프로 향하기 때문이다. 또한, 특정 개인의 종양을 독특하게 규정하는 에피토프 무리로 향하는 항체 복합물을 만드는 것도 가능하다.

암과 정상세포간에 유의적인 차이는 암세포에는 형질변환된 세포에 특이적인 항원이 포함되어 있다는 것을 인지하면, 과학단체들은 이들 암 항원에 특이적으로 결합함으로써 형질변환된 세포만을 특이적으로 표적하는 단클론 항체를 고안할 수 있어, 단클론 항체가 암 세포를 제거하는 “기적의 탄환”으로 기능을 할 수 있을 것이라고 믿음을 가지고 있었다. 그러나, 모든 암의 경우에 하나의 단클론 항체가 작용할 수 없으며, 한 종류로 단클론 항체가 표적화된 암 치료에 이용될 수 있을 것이라고 널리 인식되고 있다. 본 발명에 따른 분리된 단클론 항체은 암 질환 과정을 환자에게 유익한 방법, 예를 들면, 종양 유해물질을 감소시키는 방향으로 변형시키는 것으로 보였는데, 이는 암질환 변경 항체 (CDMAB) 또는 "항-암" 항체라고 다양하게 불릴 수 있을 것이다.

현재, 암 환자가 선택할 수 있는 치료는 몇 가지 되지 않는다. 암 치료법에 조직화된 방법이 세계적으로 생존 및 사망률에 개선을 가져왔다. 그러나, 특정 개인에게 이와 같은 개선된 통계학적 수치가 이들의 개인 상태에 개선과 반드시 연관되지는 않는다.

따라서, 의사가 동일한 집단에서 다른 환자와는 독립되는 각 종양을 치료할 수 있는 방법이 있다면, 이는 한 개인에 맞는 맞춤 치료의 독특한 방법을 허용하는 것이 될 수 있을 것이다. 이상적으로, 이와 같은 과정의 치료는 치유률을 증가시키고, 더 나은 결과를 만들고, 오랫동안 절실히 필요한 것을 만족시킬 것이다.

역사적으로, 다클론 항체를 이용한 사람 암 치료에서 제한된 성공을 보여주 었다. 임파종 및 백혈병은 사람 혈장으로 치료하였으나 연장된 완화 또는 반응은 드물었다. 또한, 재생성이 부족하였고, 화학요법과 비교하여 추가적인 이익도 없었다. 충실성 종양 예를 들면, 유방암, 흑색종, 및 신장 세포 암종은 사람 혈액, 침팬지 혈청, 사람 혈장, 말 혈청으로 치료하였으나 예측불가하며 효과적인 결과는 없었다.

충실성 종양에 대한 단클론 항체를 이용한 많은 임상적 시도가 있었다. 1980년대에 사람 유방암에 대한 최소 4가지 임상 시도가 있었는데, 조직 선택성에 근거한 또는 특이적 항원에 대한 항체를 이용하여 최소 47명의 환자중에 한명만이 반응하였다. 1998년까지 시스플라틴과 복합한 인화 항-Her2 항체를 이용한 성공적인 시도이외에는 없었다. 이와 같은 임상 시도에서, 37명의 환자에서 반응을 평가하였는데, 약 1/4이 부분적인 반응을 보였고, 추가 1/2은 미미한 또는 안정적인 질환 진행을 보였다.

직장암을 연구하는 임상 시도는 당단백질 및 글리코리피드 표적에 대한 항체와 관련된다. 선암종에 특이성을 가지는 17-1 A와 같은 항체는 50명 이상의 환자에서 Phase 2 임상 시험을 하였는데, 1명만 부분적인 반응을 보였다. 다른 시험에서, 추가적인 사이클로포스파미드를 이용하는 프로토콜에서 52명의 환자중에서 17-1 A를 이용한 결과 1명이 완전한 반응을 그리고 2명의 미미한 반응을 보였다. 17-1A가 연관된 다른 시도에서도 유사한 결과를 얻었다. 이미징으로 초기 승인받은 뮤린 인화 단클론 항체를 이용하였을 때 종양 진행이 일어나지는 않았다. 최근까지 결장암에 효과적인 항체는 없었다. 유사하게, 폐 암, 뇌 암, 난소 암, 췌장 암, 전 립선 암 및 위암에 동등한 나쁜 결과들이 있었다. 흑색종에서 항-GD3 단클론 항체를 이용한 경우 제한된 성공을 거두기도 하였다. 따라서, 사람의 임상 시험을 위한 선행조건이 되는 작은 규모의 동물 연구가 성공적이기는 하였지만, 테스트된 항체들은 대부분 비효과적이었다.

선행 특허:

U.S. 특허 No. 5,750,102에서는 환자의 종양에서 얻은 세포가 환자의 세포 또는 조직으로부터 클론될 수 있는 MHC 유전자로 전이감염되는 과정을 설명한다. 이와 같은 전이감염된 세포들을 환자에 백신주사하는데 이용한다.

U.S. 특허 No. 4,861,581에서는 포유류의 정상 세포와 신형성 세포의 내부 세포 성분(외부 성분은 아님)에 특이적인 단클론 항체를 수득하는 단계를 설명하는데, 단클론 항체를 라벨링시키고, 라벨된 항체를 신형성 세포를 죽이기 위해 요법으 제공받은 포유류 조직과 접촉시키고, 치료 효과는 퇴행 신형성 세포의 내부 세포 성분에 라벨된 항체의 결합을 측정함으로써 결정하는 단계로 구성된다. 사람 세포내 항원에 대한 항체를 준비함에 있어서, 특허권자는 악성 세포가 이와 같은 항원의 편리한 소스를 제공한다는 것을 인지한다.

U.S. 특허 No. 5,171,665에서는 신규한 항체 및 이를 생산하는 방법을 제공한다. 특히 이 특허에서는 결장 및 폐와 같은 사람 종양과 연합된 단백질 항원에 강하게 결합하고, 정상 세포에는 이보다 훨씬 약하게 결합하는 성질을 가진 단클론 항체 생성을 설명한다.

U.S. 특허 No. 5,484,596에서는 암 요법을 설명하는데, 사람 암 환자로부터 종양 조직을 외과적으로 제거하고, 종양 조직을 처리하여 종양 세포를 얻고, 종양 세포에 조사하여(irradiating) 볼 수 있게 하고, 이들 세포를 이용하여 동시에 전이를 저해하면서 원발성 종양의 재발을 저해할 수 있는 환자의 백신을 준비하는 것으로 구성된다. 이 특허는 종양 세포의 표면 항원과 반응성이 있는 단클론 항체의 개발에 대해 설명한다. col. 4, lines 45 et seq.,에서 특허권자는 사람의 신형성에 활성이 있는 특이적인 면역 요법을 발현하는 단클론 항체의 개발에 자생(autochthonous) 종양세포를 이용한다.

U.S. 특허 No. 5,693,763는 사람 암종의 당단백질 항원 특징을 설명하고, 상피 조직 기원에는 의존적이지 않다고 설명한다.

U.S. 특허 No. 5,783,186는 Her2 발현 세포에서 아포프토시스를 유도하는 항-Her2 항체, 이 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주, 이 항체를 이용한 암 치료 방법 및 이 항체를 포함하는 약학 조성물에 대해 설명한다.

U.S. 특허 No. 5,849,876에서는 종양 및 비-종양 소스로부터 정제한 뮤신 항원에 대한 단클론 항체를 생산하기 위한 신규한 하이브리도마 세포주를 설명한다.

U.S. 특허 No. 5,869,268에서는 원하는 항원에 특이적인 항체를 생산하는 사람 임파세포를 만드는 방법, 단클론 항체를 생산하는 방법 뿐만 아니라 이 방법에 의해 만들어진 단클론 항체에 대해 설명한다. 이 특허는 특별히 암의 진단 및 치료에 유용한 항-HD 사람 단클론 항체의 생산을 설명하고 있다.

U.S. 특허 No. 5,869,045에서는 사람 암종 세포와 반응성이 있는 항체, 항체 단편, 항체 콘쥬게이트 및 단일 쇄 이뮤노톡신에 대해 설명한다. 이들 항체가 기능을 하는 기전은 두배인데, 분자는 사람 암종의 표면에 존재하는 세포 막 항원과 반응성이며, 추가로 항체는 암종 세포를 내화시킬 수 있는 능력이 있고, 이어서 결합하여 항체-약물 및 항체-독소 콘쥬게이트를 형성하는데 유익하다. 변형안된 형으로, 항체는 특정 농도에서 세포 독성 성질을 나타낸다.

U.S. 특허 No. 5,780,033에서는 종양 치료 및 예방을 위한 자가 항체의 이용에 대해 설명한다. 그러나, 이런 항체는 나이든 포유류에서는 항핵 자가항체(antinuclear autoantibody)이다. 이 경우에, 자가항체는 면역계에서 볼 수 있는 자생 항체 타입이다. 자가 항체는 “나이든 포유류”에서 나오기 때문에, 자가 항체가 실질적으로 치료를 받을 항체로부터 나올 필요는 없다. 또한, 이 특허에서는 나이든 포유류로부터 자연적 그리고 항핵 자가 항체에 대해 설명하고, 단크론 항핵 자가항체를 생산하는 하이브리도마에 대해서도 설명한다.

발명의 요약

이 출원의 발명자들은 암 질환 치료에 유용한 개인에 맞춤 항-암 항체를 선별하는 공정에 대한 것으로 “맞춤화된 환자 특이적 항암 항체”의 제목의 출원이이미 미국 특허 6,180,357을 부여받았다.

본 출원은 암 질환 변경 단클론 항체를 인코드하는 하이브리도마 세포주를 분리하기 위해 ‘357 특허에서 설명된 것과 같이 환자 특이적인 항-암 항체를 생산하는 방법을 이용한다. 이들 항체는 하나의 종양에 특이적이며, 암 치료의 환자 맞춤이 가능하다. 이 출원 내용 범위안에서, 세포-치사(세포독성) 또는 세포-생장 저 해(세포정균) 성질을 가지는 항-암 세포를 세포 독성이라고 한다. 이들 항체는 암의 단계 결정, 진단에 도움이 될 수 있으며, 종양 전이 치료에 이용될 수도 있다.

개인 맞춤화된 항암 치료 전망으로 환자를 관리하는 방식으로 변화를 가져올 것이다. 있음직한 임상 시나리오는 종양 샘플을 프리젠테이션 시점에서 구하여 은행에 보관한다. 이 샘플에서, 기존의 암질환 변경 항체 패널로부터 종양의 종류를 타입핑할 수 있을 것이다. 환자를 편리하게 연출될 수 있을 것이고, 이용가능한 항체는 환자의 추가 연출을 위해 이용될 것이다. 환자는 즉시 기존 항체로 치료를 받을 것이며, 종양에 특이적 항체 패널은 여기에서 제시하는 방법 또는 여기에서 설명하는 스크리닝 방법과 파아지 디스플레이 라이브러리를 이용하여 만들 수 있을 것이다. 다른 종양들은 치료되는 종양과 동일한 에피토프의 일부를 가지고 있을 가능성이 있기 때문에 생성된 모든 항체를 항-암 항체의 라이브러리에 추가할 수 있을 것이다. 이와 같은 방법에 따라 생산된 항체는 이들 항체에 결합하는 암을 가지는 임의의 환자에서 암 질환 치료에 유용할 수 있을 것이다.

항-암 항체에 추가하여, 환자는 치료의 다중-형태 계획의 일부로 현재 추천되는 치료법을 수용하는가를 선택할 수 있다. 현재 방법을 통하여 분리된 항체는 비-암세포에 상대적으로 비독성이라는 사실이 이용될 수 있는 높은 약량에서 항체 단독 또는 통상의 치료법과 병행하는 것을 허용한다. 높은 치료 지수는 치료 저항 세포의 출현 가능성을 감소시켜야 하는 단시간 규모에서 재-치료를 허용할 수도 있다.

또한, 본 발명의 CDMAB에 방사능핵종과 같은 표준 화학요법 모달리티를 콘쥬 게이트 시켜 상기 화학요법제를 이용하는데 초점을 두는 것도 본 발명의 범위내에 있다.

환자가 치료의 초기 과정을 감당할 수 없거나 또는 전이가 발생되면, 종양에 특이적 항체를 발생시키는 과정을 재-치료를 위해 반복시킬 수 있다. 또한, 항-암 항체를 한자로부터 수득한 적혈구 세포와 콘쥬게이트 시키고, 전이 치료를 위해 재-주입시킬 수 있다. 전이 암에 효과적인 치료는 거의 없고, 전이는 통상 나쁜 결과를 의미하고, 결국 사망에 이른다. 그러나, 전이 암은 통상 혈관조직이 잘 발달되어, 적혈구 세포에 의한 항-암 항체의 운반이 종양 부위에 항체를 집중시키는 효과를 가질 것이다. 전이 전에, 대부분의 암 세포는 세포 생존을 위해 숙주의 혈액 공급에 의존하여, 적혈구 세포에 콘쥬게이트된 항-암 항체는 종양에 효과적일 수 있다. 또는 항체를 다른 조혈성 세포 예를 들면, 임파세포, 대식세포, 단세포, NK 세포 등에 콘쥬게이트할 수도 있을 것이다.

다섯가지 항체 종류가 있으며, 이 각각은 중쇄에 기능이 부여되어 있다. 일반적으로 네이키드 항체에 의한 암 세포 치사는 항체 의존성 세포의 세포독성 또는 컴플리먼트(complement) 의존성 세포독성을 통하여 중개되는 것으로 보고 있다. 예를 들면, 뮤린 IgM 및 IgG2a는 컴플리먼트 시스템의 C-1 성분의 결합으로, 컴플리번트 활성화의 고유 경로를 활성화시켜, 종양 분해를 유도함으로써 사람 컴플리먼트를 활성화시킬 수 있다. 사람 항체의 경우, 가장 효과적인 컴플리먼트 활성화 항체는 일반적으로 IgM 과 IgGl 이다. 뮤린 항체 IgG2a 및 IgG3 이소타입은 Fc 수용체를 가지고 있어, 단세포, 대식세포, 과랍세포 및 일부 임파세포에 의한 세포 치 사를 유도할 수 있는 세포 독성 세포를 모집하는데 효과가 있다. 사람 항체의 IgGl 및 IgG3 이소타입은 ADCC 중개한다.

항체 중개된 암 치사의 또 다른 가망 기전은 세포막 및 이에 연합된 당단백질 또는 글리코리피드에 있는 다양한 화학 결합의 가수분해를 촉매하는 기능을 가진, 소위, 촉매 항체를 이용하여 이루어 질 수 있을 것이다.

항체-중개된 암 세포 치사에는 추가 두 가지 기전이 있다. 첫째는 백신으로 항체를 이용하여 암 세포에 있는 가망 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 것이다. 둘째는 항체를 성장 수용체를 표적화시키고, 이들의 기능을 간섭하거나 또는 수용체를 하향 조절하여 기능을 효과적으로 상실하는데 이용하는 것이다.

따라서, 본 발명의 목적은 사람 종양에서 선택된 조직 샘플에서 암 세포의 항체 유도된 세포의 세포독성을 개시하는 방법을 교수하고, 이때 이 방법에는 사람 종양으로부터 조직 샘플을 제공하고, ATCC에 기탁된 PTA-4890, PTA-4891 또는 PTA-5643의 하이브리도마에 의해 생산되는 단클론 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 분리된 단클론 항체를 제공하거나 또는 이의 항원 결합 단편을 유도하는 세포 독성을 제공하고; 분리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유도하는 세포의 세포독성을 조직 샘플과 접촉시키는 것으로 구성된다.

본 발명의 또 다른 목적은 포유류에서 항체 유도된 세포의 세포독성에 민감한 사람 유방 또는 전립선 종량을 치료하는 방법을 교수하는데, 이때 유방 또는 전립선 종양은 ATCC에 기탁된 PTA-4890, PTA-4891 또는 PTA-5643의 하이브리도마에 의해 생산되는 단클론 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 분리된 단클론 항체 에 특이적으로 결합하는 항원을 발현시키거나 또는 이의 항원 결합 단편을 유도하는 세포 독성을 발현시키고, 이 방법은 세포 독성을 유도하는데 효과량의 분리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포유류에 투여하여, 포유류의 종양 부하를 감소시키는 것이 포함된다.

본 발명의 또 다른 목적은 하이브리도마 세포주를 분리하고, 하이브리도마에 인코드된 이에 상응하는 분리된 단클론 항체와 이의 항원 결합 단편을 분리시키기 위해, 특정 개인으로부터 유도된 암 세포 또는 하나 또는 그 이상의 특정 암 세포주에 대해 생성된 암질환 변경 항체를 생산하는 방법을 이용하는 것이 목적인데, CDMAB는 암 세포에 대해 세포독성이며 동시에 암 세포가 아닌 것에는 상대적으로 비독성이다.

본 발명의 추가 목적은 암질환 변경 항체, 리간드 및 이의 항원 결합 단편을 교수하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 항체의 세포 독성이 항체 의존성 세포 독성을 통하여 중개되는 암질환 변경 항체를 생산하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 항체의 세포 독성이 컴플리먼트 의존성 세포 독성을 통하여 중개되는 암질환 변경 항체를 생산하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 항체의 세포독성이 세포 화학 결합의 가수분해를 촉매하는 이들의 능력이 되는 암질환 변경 항체를 생산하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 암의 진단, 예후, 모니터링을 위한 결합 검사에 유용한 암질환 변경 항체를 생산하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 장점들은 여기에서 제시하는 다음의 설명, 실시예 및 특정 구체예를 통하여 명백하게 나타날 것이다.

도 1은 몇 가지 암과 비-암 세포주에 대한 1A245.6 항체, 항-EGFR 항체, 이들 두 항체의 이소타입 대조군 항체의 FACS 히스토그램을 포함한다.

도 2는 몇 가지 암과 비-암 세포주에 대해 7BD-33-11A 항체, 1A245.6에 대한 이소타입 대조군 항체, 항-EGFR 항체, 항-EGFR에 대한 이소타입 대조군 항체의 대표적인 FACS 히스토그램을 포함한다.

도 3은 몇 가지 암과 비-암 세포주에 대해 11BD-2E11-2 항체, 이 항체에 대한 이소타입 대조군 항체, 항-EGFR 항체, 항-EGFR에 대한 이소타입 대조군 항체의 대표적인 FACS 히스토그램을 포함한다.

도 4는 특정 항체 치료에 대해 시간에 따른 종양 용적의 그래프 분석이다.

도 5는 시간에 따른 MB231 사람 유방 암 종양 용적에 항체 효과의 그래프 분석이다.

도 6은 항체 치료에 대해 시간에 따른 생존 비율의 정량적 그래프 분석이다.

일반적으로 다음의 단어 또는 구는 요약, 명세서, 실시예 및 청구범위에서 사용되었을 때 다음의 정의를 가진다.

"항체"는 광범위한 의미는 사용되며, 특히 단일 단클론 항체 (항진, 길항, 중화 항체, 탈면역화된, 뮤린, 키메라 또는 인화 항체를 포함), 폴리펩티드 특이성을 가지는 항체 조성물, 단일 쇄 항체, 면역콘쥬게이트 및 항체의 단편(하기 참고)를 포함한다.

여기에서 사용된 "단클론 항체"는 실질적으로 상동성 항체 군으로부터 수득한 항체를 말하는데, 예를 들면, 군을 이루는 개별 항체들은 소량으로 존재할 수도 있는 자연적으로 발생하는 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단클론 항체는 단일 항원 부위에 대해 매우 특이적이다. 또한, 상이한 결정부위(에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 준비물과는 달리, 각 단클론 항체는 항원에서 단일 결정부위에 대한 것이다. 이들의 특이성에 추가하여, 단클론 항체는 다른 항체에 오염되지 않고 합성될 수 있는 장점이 있다. 변형물질 "단클론"은 항체의 실질적으로 상동성 군으로부터 얻은 항체의 특징을 나타내는데, 이는 임의 특정 방법에 의해 항체의 생산을 요구하지 않는 것으로 추정하지는 않는다. 예를 들면, 본 발명에 따라 이용될 수 있는 단클론 항체는 Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)에 의해 처음으로 설명된 하이브리도마 방법(뮤린 또는 사람)으로 만들 수 있거나 또는 재조합 DNA 방법으로 만들 수도 있다(see, e.g., U.S. Pat. No.4,816,567). "단클론 항체"는 예를 들면, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581 -597 (1991)에서 설명하는 기술을 이용하여 파아지 항체 라이브러리로부터 분리할 수도 있다.

"항체 단편"은 고유 항체의 일부분으로 구성되는데, 바람직하게는 항원-결합 부위 또는 이의 가변 부위로 구성된다. 항체 단편의 예로는 전장보다 짧은 항체, Fab, Fab', F(ab')₂, 및 단편; 이중특이성항체(diabodies); 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자; 단일-쇄 항체, 단일 도메인 항체 분자, 융합 단백질, 재조합 단백질 및 항체 단편들로부터 형성된 멀티특이적 항체가 포함된다.

"고유" 항체는 항원-결합 가변 부위와 경쇄 항상성 도메인(C_L) 및 중쇄 항상성 도메인, C_H1, C_H2, C_H3으로 구성된 것이다. 항상성 도메인은 고유 서열 항상성 도메인(예를 들면 사람 고유 서열 항상성 도메인) 또는 이의 아미노산 가변부위가 될 수 있다. 적절하게는 고유 항체는 하나 또는 그이상의 효과물질 기능을 가진다.

이들의 중쇄 항상성 도메인의 아미노산 서열에 따라, 고유 항체를 상이한 “류별”로 분류할 수 있을 것이다. 고유 항체에는 다섯가지 주요 류별이 있는데; IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, 그리고 이들중 일부를 다시 하위류별 "subclasses" (이소타입), 예를 들면, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgA2로 추가 분류할 수 있다. 항체의 상이한 류별에 상응하는 중쇄 항상성 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, μ로 부른다. 하위 단위 및 이뮤노글로블린의 상이한 종류의 3차원 모양은 공지되어 있다.

항체 "효과물질 기능"은 항체의 Fc 부분(고유 서열 Fc 부분 또는 아미노산 서열 가변 Fc 부분)에 기여하는 생물학적 활성을 말한다. 항체 효과물질 기능의 예로는 C1q 결합; 컴플리먼트 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포- 중개된 세포독성 (ADCC); 식균작용(phagocytosis); 세포 표면 수용체(e.g. B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등이 포함된다.

"항체-의존성 세포-중개된 세포독성" 및 "ADCC" 는 세포-중개된 반응을 말하는데, Fc 수용체(FcRs) (예를 들면, Natural Killer (NK) 세포, 호중구, 그리고 대식세포)를 발현하는 비-특이적인 세포독성 세포가 표적 세포상에 결합 항체를 인지하고, 연속하여 표적 세포의 용해의 원인이 된다. ADCC, NK 세포를 중개하기 위한 원발성(primary) 세포들은 FcγRIII만을 발현하고, 반면 단세포(monocytes)는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포에서 FcR 발현은 Ravetch and Kinet, Aram. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)의 p464의 표 3에 요약되어있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, U.S. Pat. No. 5,500,362 또는 5,821,337에서 설명된 것과 같이 in vitro ADCC 검사를 실행할 수도 있다. 이와 같은 검사에 유용한 효과물질 세포에는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 Natural Killer (NK) 세포가 포함된다. 대안으로 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)에서 설명하는 것과 같이 동물 모델에서 평가할 수도 있다.

"효과물질 세포"는 하나 또는 그이상의 FcRs를 발현시키고, 효과물질 기능을 실행하는 백혈구세포이다. 적절하게는, 세포들은 최소한 FcγRIII를 발현시키고, ADCC 효과물질 기능을 수행한다. ADCC를 중개하는 사람 백혈구의 예로는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), natural killer (NK) 세포, 단세포, 세포독성 T 세포 및 호중구가 포함되나; PBMCs 및 NK 세포가 적절하다. 효과물질 세포를 여기에서 설명한 것과 같이 혈액 또는 PBMC와 같은 고유 소스로부터 분리해낼 수도 있다.

"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fe 부분에 결합하는 수용체를 설명할 때 이용된다. 적절한 FcR은 고유 서열의 사람 FcR이다. 바람직한 FcR은 IgG 항체(감마 수용체)에 결합하는 것이고, 수용체의 FcγRI, FcγRII, Fcγ RIII 하위류별, 대립형질 변이체 또는 이들 수용체의 대안적으로 슬라이스된 형태(alternatively spliced forms)가 포함된다. FcγRII 수용체에는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("저해 수용체")가 포함되는데, 이들은 세포질 도메인에서 주로 상이한, 유사 아미노산 서열을 가진다. 활성화 수용체 FcγRIIA에는 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-계 활성화 모티프 (ITAM)를 포함한다. 저해 수용체 FcγRIIB에는 세포질 도메인에 면역수용체 티로신- 계 저해 모티프 (ITIM)를 포함한다( M. in Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcRs are reviewed in Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al, Immunomethods 4:25-34 (1994); and de Haas et al, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). 앞으로 확인될 수 있는 것들을 포함하여 다른 FcRs도 여기 “FcR"에 포함된다. 이 용어에는 신생아 수용체, FcRn이 포함되는데, 이는 모체 IgG를 태아로 운반하는 책임을 맞고 있다(Guyer et al, J. Immunol. 1 17:587 (1976) and Kim et al., Eur. J. Immunol. 24:2429 (1994)).

"컴플리먼트 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 컴플리먼트 존재하에 표적을 용해시키기 위한 분자의 능력을 말한다. 컴플리먼트 활성화 경로는 컴플리먼트 시스템(C1q)의 제1 성분이 동종 항원과 복합된 분자(예를 들면 항체)에 결합함으로써 개시된다. 컴플리먼트 활성화를 평가하기 위해, Gazzano-Santoro et al, J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)에서 설명하는 것과 같은 CDC 검사를 실시할 수도 있다.

"가변(variable)"은 항체가운데 가변 도메인의 특정 부분이 서열에서 상당히 상이한 것을 말하고, 이는 특정 항원에 각 특정 항체의 결합 및 특이성에 이용된다. 그러나, 변이성이 항체의 가변 도메인을 통하여 고르게 분포되는 것은 아니다. 경쇄와 중쇄 가변 도메인에 초가변 부위(hypervariable region)라고 부르는 세가지 단편에 집중된다. 가변 도메인의 매우 보존된 부분을 프레임워크 부분(FRs)이라고 한다. 고유 중쇄 및 경쇄의 가변 부분은 네 가지 FR로 구성되는데, 대부분 β-쉬트 모양을 취하고, 일부의 경우에는 >쉬트 구조를 형성하기도 한다. 각 쇄의 초가변 부분은 FR에 근접하게 있으며, 다른 쇄의 초가변부분과 함께 항체의 항원 결합 부위를 형성하는데 기여한다(Kabat et al, Sequences of 단백질s of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). 항상성 도메인은 항원에 항체가 결합하는데 직접적으로 관여하지는 않지만 다양한 효과물질 기능 예를 들면, 항체 의존성 세포의 세포독성(ADCC)에 참여한다.

여기에서 사용된 "초가변부분(hypervariable region)"은 항원 결합을 책임지는 항체의 아미노산 잔기를 말한다. 초가변 부분은 일반적으로 “상보성 결정 부위(complementarity determining region)" 또는 "CDR"의 아미노산 잔기로 구성된다(예를 들면, 경쇄 가변 도메인에서 잔기 24-34 (Ll), 50-56 (L2), 89-97 (L3) 그리고 중쇄 가변 도메인에서 31 -35 (Hl), 50-65 (H2), 95-102 (H3)); Kabat el al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) 그리고/또는 ”초가변 루프의 아미노산 잔기 (예를 들면, 경쇄 가변 도메인에서 잔기 2632 (Ll), 50-52 (L2), 91 -96 (L3) 그리고 중쇄 가변 도메인에서 26-32 (Hl), 53-55 (H2), 96-101 (H3); Chothia and Lesk J. MoI. Biol. 196:901 -917 (1987)). "프레임워크 부분" 또는 "FR" 잔기는 여기에서 정의된 바의 초가변 부분 잔기이외의 가변 도메인 잔기다. 항체를 파파인으로 처리하면 두 개의 동일한 항원-결합 단편, 즉, "Fab" 단편을 얻는데, 이들 각각은 하나의 항원-결합 부위와 나머지 "Fc" 단편을 만드는데, 이 이름은 바로 결정화될 수 있는 능력을 반영한 것이다. 펩신 처리로 두 개의 항원-결합 부위를 가지는 F(ab')₂ 단편을 만드는데, 이것은 항원에 교차-연결될 수 있다. "Fv" 는 컴플리트-항원 인지 및 항원-결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 부위는 하나의 중쇄와 하나의 경쇄 가변 부분 도메인이 단단하게비-공유적으로 연합된 이량체로 구성된다. 이 모양에서 각 가변 도메인의 세 개 초가변 부위가 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면상에 항원-결합 부위를 한정한다. 집합적으로, 6개 초가변 부위는 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인(Fv의 절반은 항원에 특이적인 세가지 가변 부분으로만 구성된다)은 전체적인 결합 부위보다는 낮은 친화성을 가지나 항원을 인지하고 결합하는 능력을 가진다. Fab 단편에는 또한 경쇄의 항상성 도메인과 중쇄의 제1 항상성 도메인(CH1)을 포함한다. Fab' 단편은 항체의 힌지 부분으로부터 하나 또는 그이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇 개 잔기가 추가되어 Fab 단편과는 상이하다. Fab'-SH는 Fab'에 항상성 도메인의 시스테인 잔기가 최소 한 개의 자유 티올기를 가지는 것을 말한다. F(ab')₂ 항체 단편들은 원래 Fab' 단편 사이에 힌지 시스테인을 가지는 Fab'의 쌍으로 생성된다. 항체 단편들의 다른 화학 커플링 또한 공지되어 있다.

"Fv" 는 완전한-항원 인지 및 항원-결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 부위는 하나의 중쇄와 하나의 경쇄 가변 부분 도메인이 단단하게비-공유적으로 연합된 이량체로 구성된다. 이 모양에서 각 가변 도메인의 세 개 초가변 부위가 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면상에 항원-결합 부위를 한정한다. 집합적으로, 6개 초가변 부위는 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인(Fv의 절반은 항원에 특이적인 세가지 가변 부분으로만 구성된다)은 전체적인 결합 부위보다는 낮은 친화성을 가지나 항원을 인지하고 결합하는 능력을 가진다. Fab 단편에는 또한 경쇄의 항상성 도메인과 중쇄의 제1 항상성 도메인(CH1)을 포함한다. Fab' 단편은 항체의 힌지 부분으로부터 하나 또는 그이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇 개 잔기가 추가되어 Fab 단편과는 상이하다. Fab'-SH는 Fab'에 항상성 도메인의 시스테인 잔기가 최소 한 개의 자유 티올기를 가지는 것을 말한다. F(ab')₂ 항체 단편들은 원래 Fab' 단편 사이에 힌지 시스테인을 가지는 Fab'의 쌍으로 생성된다. 항체 단편들의 다른 화학 커플링 또한 공지되어 있다.

임의 척추동물의 항체의 “경쇄”는 항상성 도메인의 아미노산 서열에 근거하여, 두 개의 명백하게 별개의 타입 카파 (K) 와 람다(λ)중 하나가 된다.

"하나의 -쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편들은 항체의 VH 와 VL 도메인으로 구성되는데, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재한다. 바람직하게는 Fv 폴리펩티드는 항원 겨합을 위한 원하는 구조를 scFv가 형성할 수 있도록 VH와 VL 도메인사이에 폴리펩티드 링크를 포함한다. scFv에 대해서는 Plckthun in The Pharmacology of monoclonal antiboty, vol. 1 13, Rosenburg and Moore eds., Springer- Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)을 참고한다.

이중특이성항체("diabodies")는 두 개의 항원-결합 부위를 가지는 작은 항체 단편을 말하는데, 이때 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄(V_H-V_L)에서 가변 경쇄 도메인(V_L)에 연결된 가변 중쇄 도메인(V_H)로 구성된다. 동일한 쇄에서 두 개 도메인사이에 짝을 만들기에는 너무 짧은 링커를 이용하여 도메인은 다른 쇄의 상보적인 도메인과의 쌍을 이루도록 함으로써 두 개의 항원-결합 부위가 생겨한다. 이중특이성항체에 대해서 예를 들면 EP 404,097; WO 93/1 1 161 ; and Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. ScL USA, 90:6444-6448 (1993)에서 상세하게 설명하고 있다.

"분리된(isolated)" 항체는 동정되고, 자연 환경 성분으로 분리되거나 회수한 것을 말한다. 자연 환경의 오염 성분들은 항체에 대해 진단 또는 치료 용도를 간섭할 수 있는 물질을 말하며, 여기에는 효소, 호르몬 및 다른 단백질 또는 비-단백질 용질이 포함된다. 분리된 항체에는 항체의 자연 환경의 최소 하나의 성분이 없을 수 있기 때문에 재조합 세포내에 원래 위치한(in situ) 항체를 포함한다. 그러나, 보통은 분리된 항체는 최소 하나의 정제 단계에 의해 준비될 것이다.

소요의 항원 예를 들면 CD63 항원 모이어티에 “결합하는”항체는 충분한 친화성을 가지고 항원에 결합할 수 있는 것으로, 항체는 항원을 발현하는 세포를 표적하여 치료 또는 진단 물질로써 유용하다. 항체는 CD63 항원 모이어티에 결합하여 다른 수용체와는 반대로 CD63 항원 모미어티에 적절하게 결합하고, 비-특이적 Fc 접촉을 포함하는 우연한 결합이 포함되지 않거나 또는 다른 항원에 통상적인 전사후 변형에 대한 결합이 포함되지 않고, 다른 단백질과 유의적인 교차 반응을 하지 않는 것이다. 원하는 항원에 결합하는 항체를 감지하는 방법들이 당분야에 공지되어 있으나 FACS, 세포 ELISA 및 Western blot를 포함하나 이에 한정시키지는 않는다.

여기에서 사용된 바와 같이, "세포", "세포주", "세포 배양물"은 서로 상호호환적으로 사용되며, 이들 모두 자손을 포함한다. 모든 자손이 DNA 함량에서 정확하게 일치하지 않을 수도 있는데, 그 이유는 계획된 또는 부적절한 돌연변이 때문이다. 고유적으로 형질변환된 세포에 대해 스크린된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 가지는 돌연변이 후손이 포함된다. 별개의 명칭을 사용하고자 하는 경우는 설명에서 분명하게 할 것이다.

처리("Treatment")는 치료요법적 치료, 예방 또는 저지 수단을 마하는데, 목적은 표적이 되는 병인 상태 또는 질환을 방해하거나 경감시키는 것이다. 치료를 요하는 개체에는 이미 이 질병을 가진 개체 뿐만 아니라 질환이 있을 가능성이 있거나 이 질환을 예방하고자 하는 개체가 포함된다. 여기에서, 치료되는 포유류는 질환을 가지고 있는 것으로 진단을 받거나 또는 이 질환에 잘 걸릴 것으로 보이는 개체가 될 수 있다.

"암" 및 "암의(cancerous)"는 제어안된 세포 생장 또는 죽음을 특징으로 하는 포유류에 생리학적 상태를 말하거나 설명하는 것이다. 암에는 암종, 임파종, 아세포종(blastoma), 육종(sarcoma), 백혈졍 또는 임파계 악성종양을 포함한다. 이와 같은 암의 특정 예로는 비늘성(squamous) 세포 암 (예를 들면 상피 비늘성 세포 암), 소-세포 폐암, 폐의 선암, 폐의 비늘성 암종을 포함하는 폐암, 복막암, 간세포암, 위장 또는 위암(위내장 암을 포함하는), 췌장암, 신경교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 직장암, 결장암, 자궁내막 또는 자궁암종, 타액선 암종, 신장 또는 콩팥암, 전립선암, 외음부 암, 갑상선 암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종 및 머리 및 목 암등이 포함된다.

"치료요법제(chemotherapeutic agent)"는 암 치료에 유용한 화학물질이다. 치료요법제의 예로는 티오테파(thiotepa) 및 사이클로포스파미드(CYTOXAN™)와 같은 알킬화 물질; 알킬 설포네이트 예를 들면, 부술판(busulfan), 임프로술판(improsulfan) 및 피포술판(piposulfan); 아지르딘 예를 들면 벤조도파(benzodopa), 카르보퀴논(carboquone), 메투어도파(meturedopa), 및 우레도파(uredopa); 에틸렌이민 및 메틸렌이민(알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸올멜라민 포함); 니트로젠 무스타드 예를 들면, 클로람부칠, 클로나파진, 클로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로로에타민, 메클로로에타민 옥시드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레디니무스틴, 트로포르파미드, 우라실 무스타드; 니트로조우레아 예를 들면, 카르무스틴, 크로로조토신, 페토무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제 예를 들면, 아클라치노미신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리체미친, 카라비친, 카르노마이신, 카르지노필린, 클로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르우리신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 퀘엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물질 예를 들면, 메토트렉세이트 및 5-플루오르우라실(5-FU); 엽산 유사체 예를 들면, 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테인, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체 예를 들면, 플루다라빈, 6-멀캅토퓨린, 티아미피린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체 예를 들면, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아주리딘, 카르모퓨르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 도시플루리딘, 에노시타빈, 플록소루비딘, 5-FU; 안드로겐 예를 들면 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-아드레날 예를 들면, 아미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스탄; 엽산 공급물 예를 들면, 프로린산; 아세갈락톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린 산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트라세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지퀴논; 엘포르미틴; 엘리프리니움 아세테이트; 에토글루시드; 갈리움 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미토산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카르바진; PSK; 라조산; 시조피란; 스피로게르마니움; 텐우라존산; 트리아지퀴논; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토부로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁산, 예를 들면, 파클리탁셀 (TAXOL, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ.) 및 도쎄탁셀(TAXOTERE, Aventis, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로로암부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 멀캅도퓨린; 메토트렉세이트; 플라티늄 유사체 예를 들면, 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈들라스틴; 플라티늄; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미토산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 셀로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소메라제 저해물질 RFS 2000; 디플로로메틸오르니틴(DMFO); 레티논산; 에스페라미신; 카페시타빈; 그리고 상기 물질의 제약학적으로 수용가능한 염, 산 또는 이의 유도체. 또한 이 정의예는 종양에 ghmahs 작용을 조절 또는 저해하는 항-호르몬 물질도 포함되는데 예를 들면, 탐옥시펜, 라록시펜, 아로메타제 예를 들면 4(5)-이미다졸, 4-하이드록시탐옥시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LYl 17018, 오나프리스톤 및 토레미펜(Fareston); 그리고 항-안드로겐 예를 들면, 플루타미드, 니루타미드, 비칼루타미드, 루프로리드 및 고세레린; 상기 물질의 제약학적으로 수용가능한 염, 산 또는 이의 유도체가 포함된다.

치료를 목적으로 하는 “포유류”는 포유류로 분류되는 임의 동물을 말하는데, 사람, 생쥐, SCID 또는 누드 생쥐 또는 생쥐의 계통, 농장 동물 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물 예를 들면, 양, 개, 말, 고양이, 소 등이 포함된다. 바람직하게는 여기에서 포유류는 사람이다.

"올리고뉴클레오티드(Oligonucleotides)"는 공지의 방법으로 화학적으로 합성된 짧은 길이의, 단일 또는 이중 스트랜드의 폴리데옥시뉴클레오티드인데 이때 방법은 EP 266,032, published 4 May 1988에서 설명된 것과 같이 고형상 기술을 이용하여 포스포트리에스터, 포스파이트 또는 포스포라미디트 화학물질과 같이 또는 Froehler et al., Nucl. Acids Res., 14:5399-5407, 1986에서 설명하는 데옥시뉴클레오시드 H-포스포네이트 중간생성물을 통하여 합성된다. 이를 그 다음 폴리아크릴아미드 겔상에서 정제한다.

"키메라(Chimeric)" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄가 특정 종에서 유도된 또는 특정 항체 류 또는 아류에 속하는 항체 또는 원하는 생물학적 활성을 나타낸다면 이들 항체의 단편에 상응하는 서열과 동일하거나 유사하나 쇄의 나머지는 다른 종에서 유도된 또는 다른 항체 류 또는 아류에 속하는 항체 원하는 생물학적 활성을 나타낸다면 이들 항체의 단편에에 상응하는 서열과 동일하거나 유사한 이뮤노글로블린이다(U.S. Pat. No. 4,816,567 and Morrison et al, Proc. Natl. Acad. ScL USA, 81 :6851-6855 (1984)).

비-사람(예를 들면, 뮤린) 항체의 "인화(humanized)" 형태는 사람의 것이 아닌 이뮤노글로블린으로부터 유도된 최소 서열을 포함하는 특이적 키메라 이뮤노글로블린, 이뮤노글로블린 쇄 또는 이의 단편들(예를 들면 Fv, Fab, Fab', F(ab)₂ 또는 항체의 다른 항원-결합 부분열(subsequences))이다. 대부분의 경우에, 인화 항체는 수용 항체의 상보성 결정 부위(CDRs)를 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하는 생쥐, 쥐 또는 토기와 같은 사람이 아닌 종(도너 항체)의 잔기로 치환한 사람 이뮤노글로블린(수용 상체)이다. 일부 경우에, 사람 이뮤노글로블린의 Fv 프레임워크 부분(FR) 잔기는 사람의 것이 아닌 FR 잔기로 대체된다. 또한, 인화 항체는 수용 항체에서 또는 도입된 CDR 또는 FR 서열에서 볼 수 없는 잔기를 포함할 수 있다. 이와 같은 변형을 만들어 항체를 개량하고 항체 성능을 최적화한다. 일반적으로, 인화 항체는 실질적으로 최소한 한 개, 일반적으로 두 개의 가변 도메인으로 구성되는데 이때 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 부분은 비-사람 이뮤노글로블린에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 잔기는 사람 이뮤노글로블린 콘센선스 서열의 것에 이다. 인화 항체는 적절하게는 이뮤노글로블린 항상성 부분(Fc)의 최소한 일부, 일반적으로 사람 이뮤노글로블린의 것으로 구성될 것이다.

"면역해제(De-immunized)" 항체는 주어진 종에 면역원성이 없거나 적은 이뮤노글로블린을 말한다. 항체의 구조적 변형을 통하여 면역해제(De- immunization)시킬 수 있다. 당분야에 공지된 임의 면역해제 기술을 이용할 수 있다. 면역 해제 항체의 임의 적절한 기술은 WO 00/34317(June 15, 2000)에 설명되어 있다.

아포프토시스("apoptosis")를 유도하는 항체는 아넥신 V의 결합, DNA 분절화, 세포 축소(shrinkage), 형질세막의 팽창, 세포 분절화 또는 막 소포 형성(아포프토시스 체라고도 함)에 의해 결정되는 것과 같이 예정된 세포 죽음을 유도하는 항체이다.

본 명세서를 통하여 하이브리도마 세포주 및 이로부터 생성되는 분리된 단클론 항체는 내부적으로 7BD-33-11A, 1A245.6 또는 11BD-2E11-2 또는 ATCC에 기탁된 PTA-4890, PTA-4891 또는 PTA-5643이라 한다.

여기에서, “항체-리간드”에는 표적 항원에 결합 특이성을 보이는 모이어티를 포함하는데, 여기에는 고유 항체 분자, 항체 단편, 최소한 항원-결합 부분 또는 이의 일부분(예를 들면 항체 분자의 가변 부분) 가령, Fv 분자, Fab 분자, Fab' 분자, F(ab').sub.2 분자, 이중특이성 항체, 융합 단백질 또는 ATCC에 기탁된 PTA-4890, PTA-4891 또는 PTA-5643(각각 PTA-4890, PTA-4891 또는 PTA-5643 항원)으로 지적된 하이브리도마 세포주에 의해 생산되는 분리된 단클론 항체에 결합되는 항원을 특이적으로 인지하고 결합하는 유전공학적으로 조작된 분자가 될 수 있다.

여기에서 이용된 바와 같이, "암질환 변환 항체" (CDMAB)는 환자에게 유익함을 주는 방법으로 예를 들면 종양 부하를 감소시키거나 종양을 가진 개체의 생존을 연장시킴으로써 유익함을 주는 암질환 과정을 변형시키는 단클론 항체 또는 이의 단편을 말한다.

여기에서 사용된 것과 같이, "항원-결합 부분"은 표적 항원을 인지하는 분자의 일부분을 의미한다.

여기에서 사용된 것과 같이, 경쟁적으로 저해하는("competitively inhibits")의 의미는 통상의 상호 항체 경쟁 검사(Belanger L., Sylvestre C. and Dufour D. (1973), Enzyme linked immunoassay for alpha fetoprotein by competitive and sandwich procedures. Clinica Chimica Acta 48, 15)를 이용하여, ATCC에 기탁된 PTA-4890, PTA-4891 또는 PTA-5643(PTA-4890, PTA-4891 또는 PTA-5643 항원)로 지정된 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 단클론 항체가 향하는 결정 부위를 인지하고 결합하는 능력을 말한다.

여기에서 사용된 것과 같이 “표적 항원”은 ATCC에 기탁된 PTA-4890, PTA-4891 또는 PTA-5643 항원 또는 이의 일부분을 말한다.

여기에서 사용된 바와 같이 “면역콘쥬게이트("immunoconjugate")는 세포독소, 방사능활성 물질, 효소, 톡신, 효소, 항-종양 약물 또는 치료제에 화학적으로 또는 생물학적으로 결합된 항체와 같은 CDMAB 또는 임의 분자를 말한다. 항체 또는 CDMAB는 세포독소, 방사능활성 물질, 항-종양 약물 또는 치료제의 임의 위치에서 표적에 결합할 수 있는 한 결합된 것을 말한다. 면역콘쥬게이트의 예로는 항체 독소 화학 콘쥬게이트, 항체-독소 융합 단백질을 포함한다.

여기에서 사용된 바와 같이, 융합 단백질("fusion protein")은 항원 결합 부분이 독소, 효소 또는 단백질 약물과 같은 생물학적으로 활성 분자에 연결된 임의 키메라 단백질을 말한다.

본 발명의 CDMAB는 분자내에 아미노산 변형에 의해 유도체 분자를 만들어 변형될 수도 있다. 화학적 변형도 가능하다.

유도체 분자는 폴리펩티드의 기능성 성질 즉, 치환체를 가지는 분자가 ATCC에 기탁된 PTA-4890, PTA-4891 또는 PTA-5643 항원 또는 이의 일부분에 폴리펩티드 결합을 여전히 허용할 것이다.

이와 같은 아미노산 치환에는 보존성("conservative")과 같은 공지의 아미노산 치환이 포함되나 반드시 이에 한정되지는 않는다.

예를 들면, 단백질의 모양 또는 기능을 변화시키지 않고 단백질에 특정 아미노산 치환 “보존성 아미노산 치환”의 단백질 화학 원리가 잘 확립되어 있다.

이와 같은 변화에는 소수성 아미노산에 대해 이소루이신(I), 발린(V), 루이신(L)의 치환; 글루타민산(E)에 대한 아스파르트산(D)의 치환 및 이의 역; 아스파라진(N)에 대한 글루타민(Q)의 치환 및 이의 역; 그리고 트레오닌(T)에 대한 세린(S)의 치환 및 이의 역과 같은 치환을 포함한다. 단백질의 3차원 구조에서 특정 아미노산의 환경 및 이의 역할에 따라 다른 치환도 보존성으로 간주할 수 있을 것이다. 예를 들면, 글리신(G) 및 알라닌(A)은 흔히 알라닌과 발린(V)으로 상호 교환될 수 있다. 상대적으로 소수성인 메티오닌(M)은 루이신 및 이소루이신 그리고 종종 발린으로 상호교환될 수 있다. 리신(K) 과 아르기닌(R)은 아미노산 잔기의 중요한 특징이 이의 전하이고, 이들 아미노산 잔기의 상이한 pK 값이 유의성이 없는 위치에서 흔히 상호교환가능하다. 특정 환경에서는 다른 변화도 “보존성”으로 간주될 수 있다.

하이브리도마 생산- 하이브리도마 세포주 7 BD -33-11A, 1A245.6, 11 BD -2 E11 -2 하이브리도마

하이브리도마 세포주 7BD-33-11A, 1A245.6는 부다페스트 조약에 따라 국제 기탁기관 American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209에 2003년 1월 8일자로 기탁되어 수탁번호 Accession Number PTA-4890 및 PTA-4889를 각각 부여받았다. 37 CFR 1.808에 따르면, 기탁자는 기탁된 물질의 대중의 이용성에 부가하는 모든 제한은 특허시에 변경불가하게 제거된다는 것을 확인한다. 기탁기관이 살아있는 샘플을 배포할 수 없는 경우에 기탁물을 돌려줄 것이다.

하이브리도마 세포주 11BD-2E11-2는 부다페스트 조약에 따라 국제 기탁기관 American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209에 2003년 11월 11일자로 기탁되어 수탁번호 Accession Number PTA-5643을 부여받았다. 37 CFR 1.808에 따르면, 기탁자는 기탁된 물질의 대중의 이용성에 부가하는 모든 제한은 특허시에 변경불가하게 제거된다는 것을 확인한다. 기탁기관이 살아있는 샘플을 배포할 수 없는 경우에 기탁물을 돌려줄 것이다.

항암 항체 7BD-33-11A를 생산하는 하이브리도마를 만들기 위해, 사람 유방 암 세포와 같은 항원의 단일 세포 현탁액을 냉각 PBS에 준비하였다. 8 내지 9주령의 BALB/c 생쥐에 피하와 복막으로 Freund's Complete Adjuvant와 분할된 약량으로 2십만 내지 2.5백만 세포를 포함하는 항원-어쥬번트 100㎕를 주사하여 면역화시켰다. 새로 준비된 항원-어쥬번트를 이용하여 초기 면역 주가후 3주와 최종 부스터후 2주에 항원-어쥬번트를 이용하여 2십만 내지 2.5백만 세포로 면역주사를 맞은 생쥐에 부스터시켰다. 비장은 최종 면역주사후에 2일에 융합을 위해 이용한다. 하이브리도마는 분리된 비장세포와 Sp2/0 골수종 짝을 융합시켜 준비하였다. 융합물의 상 청액은 하이브리도마 서브클론에 대해 테스트하였다.

항암 항체 1A245.6를 생산하는 하이브리도마를 만들기 위해, 사람 유방 암 세포와 같은 항원의 단일 세포 현탁액을 냉각 PBS에 준비하였다. 8 내지 9주령의 BALB/c 생쥐에 피하와 복막으로 Freund's Complete Adjuvant와 분할된 약량으로 2.5백만 세포를 포함하는 항원-어쥬번트 100㎕를 주사하여 면역화시켰다. 새로 준비된 항원-어쥬번트를 이용하여 초기 면역 주가후 3주째, 2주후, 5주후, 그리고 최종 부스터후 3주에 항원-어쥬번트를 이용하여 2.5백만 세포로 면역주사를 맞은 생쥐에 부스터시켰다. 비장은 최종 면역주사후에 2일에 융합을 위해 이용한다. 하이브리도마는 분리된 비장세포와 NSO-1 골수종 짝을 융합시켜 준비하였다. 융합물의 상청액은 하이브리도마 서브클론에 대해 테스트하였다.

항암 항체 11BD-2E11-2를 생산하는 하이브리도마를 만들기 위해, 사람 유방 암 세포와 같은 항원의 단일 세포 현탁액을 냉각 PBS에 준비하였다. 8 내지 9주령의 BALB/c 생쥐에 피하와 복막으로 Freund's Complete Adjuvant와 분할된 약량으로 2십만 내지 2.5백만 세포를 포함하는 항원-어쥬번트 100㎕를 주사하여 면역화시켰다. 새로 준비된 항원-어쥬번트를 이용하여 초기 면역 주가후 2주와 최종 부스터후 2주에 항원-어쥬번트 2십만 내지 2.5백만 세포로 면역주사를 맞은 생쥐에 부스터시켰다. 비장은 최종 면역주사후에 2일에 융합을 위해 이용한다. 하이브리도마는 분리된 비장세포와 NSO-1 골수종 짝을 융합시켜 준비하였다. 융합물의 상청액은 하이브리도마 서브클론에 대해 테스트하였다.

하이브리도마 세포로부터 분비되는 항체가 IgG 또는 IgM 이소타입인지를 결 정하기 위해, ELISA 검사를 이용하였다. 40℃에서 100㎕/well 염소 항-생쥐 IgG + IgM (H+L)를 2.4㎍/㎖ 코팅 완충액(0.1M carbonate/bicarbonate buffer, pH 9.2-9.6) 농도로 ELISA 플레이트에 하룻밤동안 첨가하였다. 이들 플레이트는 세척 완충액(PBS + 0.05% Tween) 내에서 3회 세척하였다. 100㎕/웰 차단 완충액(blocking buffer)(세척 완충액에서 5% 우유)을 실온에서 1시간동안 플레이트에 추가하고, 이후 세척 완충액 내에서 3회 세척하였다. 100 ㎕/웰의 하이브리도마 상청액을 추가하고, 플레이트는 실온에서 1시간동안 배양하였다. 이들 플레이트는 세척 완충액으로 3회 세척하고, 1/100,000 희석된 염소 항-생쥐 IgG 또는 IgM 양고추냉이 과산화효소 콘주게이트(1% 소 혈청 알부민을 포함하는 PBS에서 희석됨), 100 ㎕/웰을 추가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간동안 배양한 이후, 상기 플레이트는 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 100 ㎕/웰의 TMB 용액은 실온에서 1-3분동안 배양하였다. 색깔 반응은 50 ㎕/웰 2M H₂SO₄를 추가함으로써 종결시키고, 플레이트는 Perkin-Elmer HTS7000 플레이트 리더로 450에서 판독하였다. 표 1에 지시된 바와 같이, 7BD-33-11A, 1A245.6, 11BD-2E11-2 하이브리도마는 IgG 이소타입의 항체를 일차적으로 분비하였다.

1~4차 제한 희석(limiting dilution) 이후에, 하이브리도마 상청액은 세포 ELISA 검사에서 표적 세포에 결합된 항체를 조사하였다. 3가지 인간 유방암세포주 를 조사하였다: MDA-MB-231 (MB-231라고도 함), MDA-M B- 468 (MB-468라고도 함), 그리고 SKBR-3. 도말된 세포는 사용에 앞서 고정시켰다. 이들 플레이트는 실온에 서, MgCl₂와 CaCl₂를 포함하는 PBS로 3회 세척하였다. PBS에 희석된 100 ㎕의 2% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 실온에서 10분동안 각 웰에 추가하고, 이후 폐기하였다. 다시 한번, 이들 플레이트는 실온에서, MgCl₂와 CaCl₂를 포함하는 PBS로 3회 세척하였다. 차단은 실온에서 1시간동안 세척 완충액(PBS + 0.05% Tween)에서 100 ㎕/웰의 5% 우유로 수행하였다. 플레이트는 세척 완충액으로 3회 세척하고, 하이브리도마 상청액을 실온에서 1시간동안 100 ㎕/웰로 추가하였다. 이들 플레이트는 세척 완충액으로 3회 세척하고, 양고추냉이 과산화효소(1% 소 혈청 알부민을 포함하는 PBS에서 희석됨)에 결합된 100 ㎕/웰의 1/5,000 희석된 염소 항-생쥐 IgG 항체를 추가하였다. 실온에서 1시간 배양후, 플레이트는 세척 완충액으로 3회 세척하고, 100 ㎕/웰의 TMB 기질을 실온에서 1-3분동안 배양하였다. 반응은 50 ㎕/웰 2M H₂SO₄로 종결시키고, 플레이트는 Perkin-Elmer HTS7000 플레이트 리더로 450 nm에서 판독하였다. 표 1로 제시된 결과는 IgG 이소타입 대조와 비교하여 배경(background)을 초과하는 배수(fold)의 숫자로서 표시되었다. 하이브리도마 7BD-33-11A 및 1A245.6 로부터 항체는 조사된 세 가지 유방 세포주 모두에 대한 강력하게 결합하였는데, 배경보다 최소 6배 이상 강하였다. 두 가지 항체 모두 MDA-MB-231 세포주에 강하게 결합하였다. 11BD-2E11-2 하이브리도마로부터 생성된 항체 또한 MDA-MB-231 세포주에 강력하게 결합하였으나, 다른 2개 세포주에 결합은 배경보다 크다는 설명이 없었다. 이들 결과로부터 이 항체에 의해 인지되는 에피토프는 MDA-MB-468 또는 SKB-3 세포에 존재하지 않고 7BD-33-11A 및 1A245.6에 의해 인지 되는 에피토프와는 구별된다.

항체 결합에 대한 조사와 함께, 하이브리도마 상청액의 세포독성 효과(cytotoxic effect)를 세포주: MDA-MB- 231, MDA-MB-468, SKBR-3에서 조사하였다. Live/Dead 세포독성 검사는 Molecular Probes(Eugene, OR)로부터 구입하였다. 이들 검사는 아래에 열거된 변화와 함께, 제조업체의 사용설명서에 따라 수행하였다. 세포는 검사에 앞서, 미리 결정된 적절한 밀도로 도말하였다. 2일후, 하이브리도마 마이크로역가 플레이트로부터 100 ㎕의 상청액은 세포 플레이트에 이전하고 5% CO₂ 배양기 내에서 5일 동안 배양하였다. 양성 대조로서 기능하는 웰은 비어있을 때까지 흡기하고, 100 ㎕의 나트륨 아지드(sodium azide)(NaN₃) 또는 사이클로헥시미드(cycloheximide)를 추가하였다. 3BD-27 단클론 항체는 이소타입 대조군으로 첨가하는데, 이는 테스트되는 세 가지 유방암 세포주에 결합하지 않는 것으로 알려져있기 때문이다. 항-EGFR 항체(C225)를 비교를 위해 검사에 사용하였다.

5일간의 실험후, 플레이트는 뒤집어 비우고, 건조 블랏팅하였다. MgCl₂와 CaCl₂를 포함하는 실온 DPBS(Dulbecco's phosphate buffered saline)를 다중채널 스퀴즈 병(multichannel squeeze bottle)으로부터 각 웰 내로 분배하고, 3회 두드리고, 뒤집기(inversion)로 비우고, 건조 블랏팅하였다. MgCl₂와 CaCl₂를 포함하는 DPBS에서 희석된 50 ㎕의 형광 Live/Dead 염료를 각 웰에 추가하고, 37℃에서 5% CO₂ 배양기 내에서 30분동안 배양하였다. 플레이트는 Perkin-Elmer HTS7000 형광 플 레이트 리더에서 판독하고, 데이터는 Microsoft Excel에서 분석하였다. 결과는 표 1로 제시된다.

3가지 항체에서 차등의 세포독성이 관찰되었다. 11BD-2E11-2는 39-73% 치사하는데, SKBR-3 세포에서 최대 세포독성이 관찰되었다. 1A245.6 및 7BD-33-11A는 MDA-MB-231 세포에서 유사한 세포독성을 나타내나, 1A245.6은 MDA-MB-468 세포에서는 세포독성이나 7BD-33-11A은 아니다.

이는 암 세포에서 하이브리도마 세포로부터 유도된 상기 항체가 세포독성을 만들 수 있음을 말한다. 또한 하이브리도마 상청액에 의해 만들어진 세포독성과 항체 결합 정도사이에는 일반적인 관계가 있었다. 이 경향에는 몇 가지 예외가 있는데 예를 들면, 소량의 결합에도 불구하고 MB-478 암세포, SKBR-3 암세포에서 11BD-2E11-2에 의해 생성되는 세포독성의 양 등이다. 이는 항체가 이와 같은 세포 타입에서 세포 ELISA 결합 검사에 의해 감지되지 않은 중재 작용을 가지거나 또는 세포 고정과 같은 검사의 제한으로 인하여 결합을 감지할 수 없을 수도 있다는 것을 암시하였다. 최종적으로, 여전히 다른 가능성도 있는데, 즉, 검사가 이와 같은 특정 상황에 세포독성을 중재하기에 충분한 결합을 감지할 정도로 감지성이 있지 않다는 것이다. 다른 예외는 이소타입 대조군과 비교하여 배경보다 결합이 6배 증가하였음에도 불구하고 MB-468 세포에 대한 7BD-33-11A의 세포 독성의 상대적 결핍이다. 이는 결합이 고유 항원의 항체 결찰의 결과로 반드시 전조되는 것이 아니라는 가능성을 말하는 것이다.

실시예 2

항체 생산

하이브리도마 7BD-33-11A, 1A245.6, 11BD-2E11-2를 CL-1000 플라스크(BD Biosciences, Oakville, ON)에서 수거, 재접종(주당 2회) 및 Protein G Sepharose 4 Fast Flow(Amersham Biosciences, Baie d'Urfe, QC)을 이용한 표준 항체 정제 과정으로 배양하여 단클론 항체를 만들었다. 인화항체, 키메라항체 또는 뮤린 항체인 단클론 항체를 이용하는 것도 본원 발명의 범위에 속한다. 7BD-33-11A, 1A245.6, 11BD-2E11-2를 다수의 포지티브 대조군(항-Fas (EOS9.1, IgM, kappa, 20 micrograms/mL, eBioscience, San Diego, CA), 항-Her2/nieu (IgGl, kappa, 10 microgram/mL, Inter Medico, Markham, ON), 항-EGFR (C225, IgGl, kappa, 5 microgram/mL, Cedarlane, Hornby, ON), Cycloheximide (100 micromolar, Sigma, Oakville, ON), NaN3 (0.1%, Sigma, Oakville, ON)) 및 네가티브 대조군(107.3 (항-TNP, IgGl, kappa, 20 microgram/mL, BD Biosciences, Oakville, ON), G155-178 (anti-TNP, IgG2a, kappa, 20 microgram/mL, BD Biosciences, Oakville,ON), MPC-11 (항원 특이성이 공지되지 않음, IgG2b, kappa, 20 microgram/mL), J6O6 (항-푸락토산, IgG3, kappa, 20 microgram/mL), IgG Buffer (2%)) 과 함께 세포독성 검사를 비교하였다(표 2). 유방 암(MB-231, MB-468, MCF-7), 결장암 (HT-29, SWl 1 16, SW620), 폐암 (NCI H460), 난소암 (OVCAR), 전립선 암 (PC-3), 비-암 세포주(CCD 27sk, Hs888 Lu)를 테스트하였다(모두 ATCC, Manassas, VA에서 구함). Live/Dead 세포독성 검사는 Molecular Probes (Eugene, OR)에서 구하였다. 하기 제시된 변화를 이용하여 제조업자의 지시대로 검사를 실행하였다. 세포는 검사에 앞서, 미리 결정된 적절한 밀도로 도말하였다. 2일후, 100 ㎕의 정제된 항체를 배지로 희석시키고, 그 다음 세포 플레이트에 이전하고 8% CO₂ 배양기 내에서 5일 동안 배양하였다. 플레이트는 뒤집어 비우고, 건조 블랏팅하였다. MgCl₂와 CaCl₂를 포함하는 실온 DPBS(Dulbecco's phosphate buffered saline)를 다중채널 스퀴즈 병(multichannel squeeze bottle)으로부터 각 웰 내로 분배하고, 3회 두드리고, 뒤집기(inversion)로 비우고, 건조 블랏팅하였다. MgCl₂와 CaCl₂를 포함하는 DPBS에서 희석된 50 ㎕의 형광 Live/Dead 염료를 각 웰에 추가하고, 37℃에서 5% CO₂ 배양기 내에서 30분동안 배양하였다. 플레이트는 Perkin-Elmer HTS7000 형광 플레이트 리더에서 판독하고, 데이터는 Microsoft Excel에서 분석하였다. 결과는 표 2로 제시된다. 데이터는 3중 반복된 4가지 실험의 평균으로 나타내고, 다음과 같은 방법으로 정량적으로 표시하였다; 기준 세포독성보다 큰 실험 4/4(+++), 기준 세포독성보다 큰 실험 3/4(++), 기준 세포독성보다 큰 실험 2/4(+). 표 2에 표시되지 않은 세포는 기준 세포독성보다 적은 효과를 가지거나 일관성이 없는 것을 나타낸다. 7BD-33-11A 및 1A245.6 항체는 선택적으로 유방 종양 및 전립선 종양 세포에 세포독성이 있고, 비-형질변환된 정상 세포에는 효과가 없었다. 이들 둘은 포지티브 대조군 항-Fas 항체보다 25-50%이상의 치사율을 가진다. 11BD-2E11-2는 유방 및 난소 종양 세포에 특이적인 세포독성이 있으나, 정상 세포에는 효과가 없었다. 화학적인 세포 독성 물질은 예상된 세포독성을 유도하나 다수의 다른 항체(비교를 목적으로 유도된)들은 생물학적 세포 검사의 제한요건을 제공하여 예상된 것과 같이 실행하였다. 종합적으로, 세가지 항체는 다수의 암 세포 타입에 대해 세포독성 활성을 가졌다. 이들 항체는 모든 암 세포타입에 민감성을 부여하지 않기 때문에 활성이 선택적이다. 또한, 이들 항체들은 비-암 세포 타입에서는 세포독성을 만들기 않기 때문에 기능적 선택성을 가지는데, 이것은 치료 상황에서는 아주 중요한 인자가 된다.

세포를 DPBS(Ca⁺⁺, Mg⁺⁺불포함)으로 세포 단층을 처음 세척하여 FACS를 위해 준비해두었다. 세포 해리 완충액(INV1TROGEN)을 이용하여 세포 배양 플레이트로부터 37℃에서 세포를 떼어내었다. 원심분리 및 수거후, 세포를 Dulbecco's 인산염 완충 염(MgCl₂, CaCl₂, 25% 태아 송아지 혈청)(세척 배지)으로 4℃에서 재현탁시키고, 카운트하고, 적절한 세포 밀로도 나눈다음 스핀다운시켜 세포 펠렛을 만들고, 7BD-33-11A, 1A245.6, 11BD-2E11-2 또는 대조군(이소타입 대조군 또는 항-EGF-R) 항체를 포함하는 착색 배지(MgCl₂, CaCl₂를 포함하는 DPBC)에 얼음위에서 30분간 ㎖당 20㎍의 농도로 재현탁시킨다. Alexa Fluor 488-콘쥬게이트된 2차 항체를 첨가시키기 전에, 세포를 세척 배지로 다시 한번 세척하였다. 착색 배지내 Alexa Fluor 488-콘쥬게이트된 항체를 20분간 추가하였다. 그 다음 세포를 최종 시간 동안 세척하고, 1㎍/㎕ 프로피디움 요오드를 포함하는 착색 배지에 재현탁시켰다. 유세포 획득(Flow cytometric acquisition)은 CellQuest 소프트웨어(BD Biosciences)를 이용하여 FACScan상에서 샘플을 이동시켜 평가하였다. 세포의 전방(FSC) 및 측면 확산(SSC)는 FSC와 SSC 감지기상의 볼프와 진폭 값을 조정하여 세팅하였다. 세가지 형광 채널(FLl, FL2, FL3)에 대한 감지기들은 정제된 이소타입 대조군 항체와 따라오는 ALexa Fluor 488-콘쥬게이트된 2차 항체로 착색된 세포를 이용시켜 조정하여 약 1-5 유닛의 중간 정도의 형광 강도를 가지는 일정한 피크를 가진다. 살아있는 세포는 FSC 및 프로피디움 요오드 압출을 차단(gating)하여 수득하였다. 예를 들면, 약 10,000 살아있는 세포를 분석을 위해 수득하였고 그 결과는 표 3에 제공하였다. 표 3에서는 이소타입 이상에서 평균 형광 강도 배수 증가를 표로 나타내었고, 이를 정량적으로 나타내었다; 5 미만(-); 5 내지 50(+); 50 내지 100(++); 100 이상(+++), 괄호는 착색된 세포의 비율이다.

7BD-33-11A의 대표적인 히스토그램을 도 1에 나타내었다. 1A245.6 항체의 히스토그램을 도 2에 나타내었고, 11BD-2E11-2에 대한 대표적인 히스토그램을 도 3에 나타내었고, 일부 경우에 설명된 이중 모드 피크를 포함한 결합 특징을 증명하였다. 11BD-2E11-2는 유방 종양 세포 MDA-MB-231에 종양 특이적 결합을 나타내었다. 7BD-33-11A 및 1A245.6도 유방(MDA-MB-231, MCF-7), 결장, 폐, 난소 및 전립선 기원의 종양 세포주에 유사한 결합을 나타내었고, 유방 종양 세포주중 하나(MDA-MB-468)에는 차등적인 결합을 보였다. 비-암 세포에 세가지 모든 항체의 결합이 있었으나, 결합으로 세포독성을 유도하지는 않았다. 이는 결합으로 이의 고유 항원에 항체 결찰의 결과가 반드시 전조되는 것이 아니하는 것을 증거한다. 이는 상이한 세포에 항체 결찰이 항체 결합보다는 세포독성의 결정하는 것임을 암시하였다.

실시예 3

in vivo 실험

도 5와 6에서 제공하는 데이터를 참고하여, 4 내지 8주령의 암컷 SCID 생쥐에 목덜미 피하로 100㎕에 5백만 MDA-MB-231 사람 유방암 세포를 이식하였다. 생쥐를 무작위로 10명의 그룹으로 된 4개 처리군으로 나누었다. 이식 하루전에 11BD-2E11-2, 7BD-33-11A, 1A245.6 테스트 항체 또는 3BD-27 이소타입 대조군 항체(MDA-MB-231 세포에 결합하지 않는 것으로 알려짐) 20㎎/㎏을 2.7mM KCl, 1mM KH₂PO₄, 137mM NaCl, 20mM Na₂HPO₄를 포함하는 희석액으로 원액을 희석한 후에 300㎕ 용적으로 복막을 통하여 주사하였다. 그 다음 동일한 방식으로 7주간 1주일에 1회씩 투여하였다.

종양 생장을 매 7일간격으로 최고 10주 또는 개별 동물이 Animal Care(CCAC) 엔드포인트의 Canadian Council에 도달할 때 까지 caliper로 측정하였다. 동물의 체중은 연구 기간동안 기록하였다. 연구 종료시점에서 모든 동물은 CCAC 규정에 따라 마취시켰다.

연구 동안 독성에 대한 임상 징후는 없었다. 주단위로 측정된 체중은 참살이 및 번영에 대한 실패의 대리 지표이다. 이소타입, 3BD-27, 7BD-33-11A, 1A245.6 또는 11BD-2E11-2로 처리된 그룹간에 체중에서는 미미한 차이가 있었다. 60일째에(처리를 중단후 11일), 1A245.6으로 치료된 그룹의 종양 용적은 대조군의 5.2%(p=0.0002)이고, 이는 항체 처리로 종양 부하 감소에 효과가 있음을 설명하는 것이다. 7BD-33-11A 항체로 처리된 암을 가진 생쥐는 질병으로부터 자유로왔고, 종양 부하가 없었다. 종양 용적은 67일에 11BD-2E11-2 처리군(대조군의 45%)(p=0.08)로 훨씬 낮았다. 이는 또한 7BD-33-11A, 1A245.6, 11BD-2E11-2 세포독성 항체로 처리하여 얻는 이에 상응하는 생존 잇점도 있다(도 6). 3BD-27 항체로 처리된 대조군은 이식후 74일에 100% 치사율에 다다랐다. 대조적으로 7BD-33-11A으로 처리된 군은 질병이 없었고, 1A245.6 처리된 동물은 100% 생존하였고, 11BD-2E11-2로 처리된 군은 24% 생존하였다.

전체적으로, 잘 인지된 사람의 암 질환 모델에서 대조군 항체와 비교하였을 때 세포독성 항체 처리로 종양 부하가 감소되었고, 생존이 증가된 것은 사람을 포함하는 포유류에 치료요법으로 이들 항체(7BD-33-11A, 1A245.6, 11BD-2E11-2)의 약리역학적 그리고 약리학적 장점을 암시하는 것이다.

실시예 4

in vivo 확정된 종양 실험

5 내지 6주령의 암컷 SCID 생쥐에 목덜미 피하로 100㎕에 5백만 MDA-MB-231 사람 유방암 세포를 이식하였다. 종양 생존은 매주 caliper로 측정하였다. 대부분의 군에서 종양 용적이 이식후 34일에 100㎣(50-200㎣)에 다다르면, 8-10마리 생쥐를 생쥐를 무작위로 3마리의 처리군으로 나누었다. 7BD-33-11A, 1A245.6 테스트 항체 또는 3BD-27 이소타입 대조군 항체(MDA-MB-231 세포에 결합하지 않는 것으로 알려짐) 15㎎/㎏을 2.7mM KCl, 1mM KH₂PO₄, 137mM NaCl, 20mM Na₂HPO₄를 포함하는 희석액으로 원액을 희석한 후에 150㎕ 용적으로 복막을 통하여 주사하였다. 그 다음 동일한 방식으로 이식후 56일짜기 10회 약량으로 매주 3회씩 투여하였다. 종양 생장을 이식후 59일까지 매 7일간격으로 또는 개별 동물이 Animal Care(CCAC) 엔드포인트의 Canadian Council에 도달할 때 까지 caliper로 측정하였다. 동물의 체중은 연구 기간동안 기록하였다. 연구 종료시점에서 모든 동물은 CCAC 규정에 따라 마취시켰다.

연구 동안 독성에 대한 임상 징후는 없었다. 주단위로 측정된 체중은 참살이 및 번영에 대한 실패의 대리 지표이다. 이소타입 대조군, 7BD-33-11A, 1A245.6 으로 처리된 그룹간에 체중에서는 유의적인 차이가 없었다. 도 4에서 볼 수 있는 것과 같이, 이식후 59일째에(처리를 중단후 2일), 7BD-33-11A으로 치료된 그룹의 종양 용적은 대조군의 29.5%(p=0.0002)였다. 이 군에서 59일에 값이 52일에 갑과 비교하였을 때(p=0.25) 평균 종양 용적이 감소되는 경향이 있었다. 유사하게, 1A245.6 항체하면 종양 생장이 상당히 억제되었고, 종양 부하가 감소되었다. 이 항체로 처리된 종양을 가진 동물은 이소타입 대조군으로 처리된 군의 56.3%의 종양 용적을 가졌다(p=0.07).

전체적으로, 잘 인지된 사람의 암 질환 모델에서 대조군 항체와 비교하였을 때 7BD-33-11A 또는 1A245.6 항체 처리로 종양 부하가 상당히 감소되었고, 생존이 증가된 것은 사람을 포함하는 포유류에 치료요법으로 이들 항체 7BD-33-11A 또는 1A245.6의 약리역학적 그리고 약리학적 장점 가졌다.

본 명세서에 언급된 모든 특허와 간행물은 본 발명이 속하는 당분야에서 당업자의 수준을 지시한다. 모든 특허와 간행물은 본 명세서에서 독립적으로, 동일한 정도로 참조로서 편입된다.

본 발명의 특정 형태가 예시되긴 하지만, 본 발명은 본 명세서에 기술되고 도시된 특정 형태 또는 일부 배열에 한정되지 않는다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 다양한 개변이 가능하고, 본 발명은 본 명세서에 기술되고 도시된 것에 한정되지 않는다. 당업자는 본 발명이 본 명세서에 언급된 것뿐만 아니라 여기에 내재된 목적을 수행하고 이점을 획득하기 위하여 개조될 수 있음을 용이하게 인지할 것이다. 본 명세서에 기술된 임의의 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 생물학적으로 관련된 화합물, 방법, 절차 및 기술은 바람직한 구체예를 대표할 뿐이며, 본 발명의 범위를 한정하지 않는다. 본 발명의 기술적 사상 내에 포섭되고 첨부된 특허청구범위에 의해 정의되는 변화 및 다른 용도는 당업자에게 자명할 것이다. 본 발명이 특정의 바람직한 구체예와 관련하여 기술되긴 했지만, 청구되는 본 발명은 이런 특정 구체예에 부당하게 한정되지 않는다. 실제로, 당업자에게 명백한, 본 발명을 수행하기 위한 앞서 기술된 양식의 다양한 개변은 아래의 특허청구범위 내에 속하는 것으로 간주된다.

Claims (15)

1. 사람 유방 또는 전립선 종양에서 선택된 조직 샘플에서 암 세포의 항체 유도된 세포독성을 개시하는 방법에 있어서,

   사람 유방 또는 전립선 종양으로부터 조직 샘플을 제공하고;

   ATCC에 기탁된 PTA-4890 하이브리도마에 의해 생산되는 단클론 항체 또는 이와 동일한 에피토프에 결합하는 분리된 항원 결합 단편을 제공하고;

   단클론 항체 또는 이의 세포독성을 유도하는 항원 결합 단편을 조직 샘플과 접촉시키는 단계로 구성된 방법.
2. 사람 유방 또는 전립선 종양을 치료하는 방법에 있어서,

   포유류에 ATCC에 기탁된 PTA-4890의 하이브리도마에서 생산되는 단클론 항체 또는 이와 동일한 에피토프에 결합하는 이의 항원 결합 단편을 투여하고, 이때 투여는 포유류에서 세포독성을 유도하고 포유류 종양 부하를 감소시키는데 효과적인 양이 되는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 청구항 2항에 있어서, 분리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 세포독성 모이어티에 콘쥬게이트 된 방법.
4. 청구항 3항에 있어서, 세포독성 모이어티는 방사능활성 동위원소인 방법.
5. 청구항 2항에 있어서, 분리된 단클론 항체는 컴플리먼트를 활성화시키는 방법.
6. 청구항 2항에 있어서, 분리된 단클론 항체는 항체 의존적 세포의 세포독성을 중재하는 방법.
7. 청구항 2항에 있어서, 분리된 단클론 항체는 인화항체인 방법.
8. 청구항 2항에 있어서, 분리된 단클론 항체는 키메라형인 방법.
9. 포유류에서 유방 또는 전립선 종양을 치료하기 위해 투여가능한 형태의 화합물의 용도에 있어서,

   이때 화합물은 ATCC에 기탁된 PTA-4890 하이브리도마에 의해 생산되는 단클론 항체 또는 이와 동일한 에피토프에 결합하는 분리된 항원 결합 단편으로 구성되며, 투여 가능한 형태는 세포독성을 유도하고 포유류 종양 부하를 감소시키는데 효과적인 양이 되는 것을 특징으로 하는 용도.
10. 청구항 9항에 있어서, 분리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 세포독성 모이어티에 콘쥬게이트 된 용도.
11. 청구항 9항에 있어서, 세포독성 모이어티는 방사능활성 동위원소인 용도.
12. 청구항 9항에 있어서, 분리된 단클론 항체는 컴플리먼트를 활성화시키는 용도.
13. 청구항 9항에 있어서, 분리된 단클론 항체는 항체 의존적 세포의 세포독성을 중재하는 용도.
14. 청구항 9항에 있어서, 분리된 단클론 항체는 인화항체인 용도.
15. 청구항 9항에 있어서, 분리된 단클론 항체는 키메라형인 용도.

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