KR20090043475A

KR20090043475A - 증강된 ｔｈ-1 프로파일을 나타내는 ｃ-당지질

Info

Publication number: KR20090043475A
Application number: KR1020087031199A
Authority: KR
Inventors: 모리야 츠지; 광우 첸; 리처드 프랭크; 광리 양
Original assignee: 뉴욕 유니버시티; 더 애론 다이아몬드 에이즈 리서치 센터 포 더 시티 오브 뉴욕, 인코퍼레이티드; 리서치 파운데이션 오브 더 시티 유니버시티 오브 뉴욕
Priority date: 2006-05-22
Filing date: 2007-05-22
Publication date: 2009-05-06
Also published as: EP2035011A2; JP2009538337A; NZ573689A; WO2007137258A2; MX2008014972A; CN101500580B; AU2007253715B2; CN101500580A; ZA200810710B; EA016042B1; IL195456A0; WO2007137258A3; US8883745B2; AU2007253715A1; EP2035011A4; EA200870560A1; CA2653647A1; US20100233207A1

Abstract

본 발명은 IL-12 분비 증강 및 수지세포 활성 증가를 특징으로 하는 Th1-타입 면역 반응을 선택적으로 유도하는 신규한 합성 C-당지질에 관한 것이다. 따라서 본 발명의 화합물은 감염, 암, 세포증식성 질환, 및 자가 면역질환에 직접적으로 또는 항원보강제로서 유용하다.

Th1-타입 면역 반응, 선택적 유도, 합성 C-당지질, 감염, 암, 세포증식성 질환, 자가 면역질환

Description

증강된 ＴＨ-1 프로파일을 나타내는 Ｃ-당지질{C-GLYCOLIPIDS WITH ENHANCED TH-1 PROFILE}

본 발명은 IL-12의 분비 증강 및 수지세포와 같은 항원-제시세포(APCs)의 활성 증가를 특징으로 하는 Th1-타입 면역 반응을 선택적으로 유도하는 신규한 합성 C-당지질에 관한 것으로, 이들은 감염, 암, 세포증식성 질환, 자가 면역질환에 직접적으로 또는 항원보강제(adjuvant)로서 유용하다.

Th1-타입 및 Th2-타입 면역반응은 두개의 서로 다른 그룹의 사이토킨을 분비하는 두개의 구별되는 CD4+ T 세포(헬퍼 T 세포-Th) 서브세트에 의해 매개되는 면역 반응으로 정의된다. 이에 대한 최근의 평론은 Trends Pharmacol. Sci., 2005, 26(5):252-257 및 이에 인용된 자료를 참조할 수 있다.

Th1 세포는 인터페론-감마(IFN-γ) 및 인터루킨 12 (IL-12)를 포함하는 Th1-타입의 사이토킨을 분비한다. Th1-타입 사이토킨의 주요 기능은 식균-매개 방어를 자극시키고 CD8+ T 세포 (세포독성 T 세포) 및 자연 살해 (NK) 세포의 활성을 증강시켜 세포-매개 면역을 보조함으로써, 암세포, 바이러스 및 다른 세포내 병원체를 제거하는 것이다. 또한 Th1 사이토킨은 B 세포에 의한 면역 글로불린 합성의 스위칭을 저해하여 IgG1 및 알레르기의 유발에 특히 중요한 IgE와 같은 면역글로불린 이소타입의 생성을 억제한다. IL-12은 주로 수지세포(DCs) 및 마크로파지를 포함하는 항원-제시세포들(APCs)에 의해 분비되며, CD8+ T 세포 및 NK 세포들을 활성화시킨다. Th2 세포들은 IL-4, IL-5, IL-10, 및 IL-13을 포함하는 Th2-타입 사이토킨들을 분비한다. Th2-타입 사이토킨들은 체액 면역(humoral immunity, 예를 들면 IgE 및 호산구/비만세포-매개 면역반응을 자극한다)을 보조하며 Th1-타입 면역 반응을 하향 조절한다.

Th1- 및 Th2-타입 면역반응간 균형의 부조절은 질병을 유발한다. 많은 타입의 암은 Th2-타입 반응이 우세한 특징을 가지며, 많은 병원체는 Th1-Th2 균형을 Th2 모드로 변경시키는 사이토킨을 생성함으로써 면역 반응을 회피한다(Wilson 및 Delovitch, 2003, Nat. Rev. Immunol., 3: 211-222; Dredge, Cancer Immunol. Immunother., 2002, 51:521-531; Servet 및 Zitvogel, Curr Mol. Med., 2002, 2:739-756; Pinto, Pediatrics, 2006, Apr. 17 [Epub ahead of print]). 천식과 같은 많은 자가면역질환 또한 Th1-Th2 균형이 Th2 모드로 변경되는 특징을 갖는다. 반면, 1형 당뇨 및 다발성 경화증과 같은 면역 질환은 자가병원성 Th1 세포에 의해 매개되며 저반응성 Th2 세포의 특징을 나타내며, 이는 Th1-양 사이토킨 프로파일을 초래한다(Hayakawa 등., 2004, Curr. Med. Chem., 11: 241-252; Wilson 및 Delovitch, 2003, Nat. Rev. Immunol., 3: 211-222; Van Kaer, 2004, Immunol. Cell Biol., 82: 315-322).

자연살해 T(NKT) 세포는 Th1- 및 Th2-타입 면역반응의 조절에 결정적인 역할을 한다. NKT 세포는 독특한 집단의 림포구로서 NK 세포 마커와 함께 세미-비가변 T 세포 수용체(TCR)를 공발현한다. 마우스에서 대부분의 NKT의 세포 TCR은 Vα14 및 Jα18 유전자 세그먼트에 의해 코딩되는 비가변 Vα 사슬과 주로 Vβ8.2, Vβ7 또는 Vβ2 유전자 세그먼트에 의해 코딩되는 가변 Vβ 사슬 세트가 짝을 이뤄 구성된다. 이러한 TCR은 NKT 세포로 하여금 주 조직적합 복합체(MHC) 클래스I-양 분자 CD1d을 인식할 수 있게 하여, 지질이나 소수성 펩티드와 같은 소수성 분자를 NKT 세포에 제시할 수 있다.

지금까지 단지 소수의 분자만이 NKT 세포를 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 이들 중 오키나완 마린 스폰지에서 추출된 당지질인 알파-갈락토실세라미드(alpha-galactosylceramide; 이후, α-GalCer로 지칭)(Natori 등., Tetrahedron, 50: 2771-2784, 1994)가 가장 잘 규명되었다. α-GalCer의 합성 아날로그인 KRN 7000 (2S,3S,4R)-1-O-(α-D-갈락토피라노실)-2-(N-헥사코사노일아미노)-1,3,4-,옥타데칸트리올은 Pharmaceutical Research Laboratories, Kirin Brewery (Gumna, Japan)에서 구하거나 또는 Morita 등., J. Med. Chem., 1995, 38: 2176-2187에 개시된 방법으로 합성할 수 있다. 다른 α-GalCer 유도체들은 미국 특허 제5,780,441호 (Kirin)에 개시되어 있다. 기린사의 최초 개시에 뒤이어 α-GalCer는 원발성 암 및 이들의 전이를 포함한 질환, 말라리아 및 B형 간염과 같은 감염성 질환, 및 당뇨와 천식과 같은 수종의 자가면역질환을 포함하는 여러 질환을 치료할 수 있음이 밝혀졌다(Hayakawa 등, 2004, Curr. Med. Chem, 11:241-252; Wilson 및 Delovitch, 2003, Nat. Rev. Immunol., 3:211-222; Taniguchi et al, 2003, Annu. Rev. Immunol., 21　:483-513　; Van Kaer 2004, Immunol. Cell Biol. 82:315-322 참조). 또한 α-GalCer는 다른 항원에 의해 유도된 보호성 면역 반응의 지속을 증강하거나 및/또는 연장시킬 수 있는 항원보강제로 사용할 수 있음이 입증되었다(US 2003-0157135 및 Gonzalez-Aseguinolaza 등., J Exp Med., 2002, 195:617-24 참조).

α-GalCer는 NKT세포를 생체외 및 생체내에서 활성화시킬 수 있다(Kawano 등., 1997, Science, 278:1626-1629; Burdin 등., 1998, J. Immunol., 161:3271-3281　; Spada 등., 1998, J. Exp. Med., 188:1529-1534; Brossay 등., 1998, J. Exp. Med. 188:1521-1528). 도 1에 보인 바와 같이 α-GalCer는 단핵구, 단핵구-유래 미성숙 수지세포 및 마크로파지와 같은 항원제시세포들에 의한 CD1d와 함께 존재하는 경우, NKT 세포의 TCR과 반응하여 NKT 세포 및 APC 세포들 양자를 활성화시켜, Th1-타입 사이토킨 IFN-γ와 NKT 세포에 의한 Th2-타입 사이토킨 양자를 생성하도록 한다. 이후 IL-12 수용체가 NKT 세포 표면상에서 활성화되고, 동시에 활성화된 APC들에 의해 IL-12이 생성된다. APC에 의해 생성된 IL-12는 NKT세포들에서 이차 IFN-γ의 생성을 유도하며 NK 세포를 활성화하여 IFN-γ을 생성하도록 한다(Hayakawa 등, 2004, Curr. Med. Chem, 11:241-252; Kawano 등., 1997, Science, 278, 1626-1629; Godfrey 등., 2000, Immunol. Today, 21:573-583; Wilson 등., 2002, Trends Mol. Med., 8:225-231; Matsuda 등., 2000, J. Exp. Med., 192:741-753). 따라서 α-GalCer에 의한 NKT 세포의 활성화는 NK세포, B 세포, CD8+ T 세포, 수지세포 및 골수세포를 포함하는 수개의 다른 세포 타입의 이차적인 활성화를 초래하고, CD4+ T 세포를 Th1 또는 Th2 세포로 분화시킨다.

α-GalCer를 마우스에 투여한 결과 신속한 강력한 항-말라리아효과를 나타내 었으며, 설치류 말라리아 기생충 P. yoeli 및 P. berghei 의 간세포내 단계의 전개를 저해하는 것이 입증되었다(Gonzalez-Aseguinolaza 등., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 8461-8466). α-GalCer는 IFN-γ 또는 IFN-γ 수용체가 결여된 마우스의 간에서는 기생충 전개를 저해할 수 없었으며, 이는 이 당지질의 항-말라리아 활성이 주로 IFN-γ에 의해 매개됨을 나타낸다. α-GalCer에 의해 자극된 IL-4는 이 당지질이 자가면역성 1형 당뇨 및 자가면역성 뇌척수염을 포함하는 다수의 상이한 자가면역질환을 경감시킬 수 있도록 한다(Wilson 등., 2002, Trends Mol. Med., 8:225-231).

이러한 면역 반응 증강작용 이외에도 α-GalCer는 그 용량에 관계없이 설치류나 원숭이에서 독성을 유발하지 않음이 입증되었다(Nakagawa 등., 1998, Cancer Res., 58: 1202-1207).

그러나 α-GalCer 요법의 유효성은 심각하게 제한되는데, Th1- 및 Th2-타입의 사이토킨 양자를 동시에 자극하기 때문이다(예를 들면 IFN-γ, IL-12 및 IL-4) (Pal 등., 2001, J. Immunol., 166:662-668; Berkers 등 Ovaa, Trends Pharmacol. Sci., 2005, 26:252-257). 실제로 α-GalCer는 고형암 환자에 대한 임상 제1 단계 연구에서 거의 효과를 나타내지 않았다(Giaccone 등., 2002, Clin. Cancer Res., 8: 3702-3709). α-GalCer를 사용한 치료는 NKT 세포의 사이토킨 프로파일이 변경되었을 때, 예컨대 CD1d-펄스된 수지세포의 투여에 의해 Th1-타입으로 변경되었을때 더욱 효과적인 것으로 나타났다(Fujii 등., 2002, Nat. Immunol., 3: 867-874).

따라서 Th1- 또는 Th2-타입 면역반응을 선택적으로 유도할 수 있는 α- GalCer 아날로그는 더욱 유망한 치료적 잠재력을 가진다.

최근 글리코사이드 결합의 산소 원자를 탄소원자로 치환한 몇 개의 α-C-GalCer 아날로그들이 개발되었다. 예를 들어 미국 특허 제 6,635,622호; Schmieg 등, 2003, J. Exp. Med, 198(11)　:1631-1641; Chen 등., Org Lett., 2004, 6:4077-80; Yang 등., Angew Chem Int Ed Engl., 2004, 43:3818-22, 및 이들 소유 미국 특허출원 제10/462,211호 (US 2004-0127429); 11/193,852호 (US 2006-0019246); 11/096,340 (US 2005-0222048)호를 참조할 수 있다. 이들 아날로그들은 탈당화(deglycosylation)에 저항적이며 따라서 긴 유효기간을 갖는다(Bertozzi 등., Synthesis of C-glycosides: stable mimics of O-glycosidic linkages. In Modern Methods in Carbohydrate Synthesis. Khan and O'Neill, editors. Harwood Academic Publishers, London, UK, 1996, p. 316-351; Bertozzi 등., 1992. J. Am. Chem. Soc., 114:10639-10641; Levy 및 Tang, The Chemistry of C-Glycosides, Elsevier Science Ltd., 1995; Postema, C-Glycoside Synthesis, CRC Press, Inc., 1995).

α-C-GalCer CRONY 101는 첫번째 C-글리코사이드 예로서, O-글리코사이드 결합 대응물에 비하여 현저히 개선된 치료적 잠재력을 나타내었다. Schmieg 등. (2003, J. Exp. Med., 198: 1631-1641) 및 Yang 등. (2004, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 43: 3818-3822)의 간행물에 개시된 바와 같이 CRONY 101를 생체내 투여한 경우 Th2-타입 사이토킨 IL-4의 생성은 줄어들었으며 (α-GalCer에 비하여), Th1-타입 사이토킨 IFN-γ 및 IL-12의 생성은 증강되고 연장되었으며, 흑색종 전이 및 말라리아에 대해 각각 100배 및 1000-배나 개선된 활성을 나타내었다.

Th1-타입 사이토킨 IL-12은 최근 특히 관심을 끌고 있는데, 감염 및 암에 대한 내인성 저항성 및 염증 반응의 조절에 의한 고유 면역 및 적응 면역간의 상호작용에 필수적인 역할을 하기 때문이다(Colombo 및 Trinchieri의 평론, Cytokine Growth Factor Rev., 2002, 13:155-68; Watford, Cytokine Growth Factor Rev., 2003, 14:361-368 참조). 내인성 IL-12은 많은 병원체 및 암들에 대한 저항성에 요구된다. 실제로 실험적 암 모델에서 재조합 IL-12 처치는 이식성 암, 화학적으로 유도된 암, 및 유전학적으로 변경된 마우스에서 자발적으로 생성되는 암들에 대해 현저한 항암 효과를 나타낸다.

전술한 바와 같이 IL-12는 주로 수지세포 및 마크로파지와 같은 다양한 APC들에 의해 분비되며, Th1-타입 면역반응에 기여한다(Roitt, Brostoff, Male, Immunology, Mosby ed., 6th ed.; Ma 및 Trinchieri, Adv Immunol., 2001, 79:55-92; Hilkens, Blood, 1997, 90:1920-1926; Szabo, Annu. Rev. Immunol., 2003, 21:713-58). IL-12에 의해 유도되는 IFN-γ 및 일련의 다른 2차 및 3차 전-염증성 사이토킨들은 감염 세포 및 암세포에 대해 직접적인 독성 효과를 나타내며 강력한 항-맥관형성 기전을 활성화시킨다. 항원-특이성 면역에 대한 IL-12의 자극 활성은 대부분 이들의 Th1 및 세포독성 T 림파구 반응의 결정 또는 증대 능력에 기인한다. 이러한 능력으로 인해 IL-12은 암 및 다른 백신에서 강력한 항원보강 활성을 나타낸다. 항암 면역치료의 전-임상 모델에서 수득된 유망한 데이타들은 IL-12가 암에 대한 강력한 치료제가 될 수 있을 것이라는 많은 희망을 불러일으킨다. 그러나 IL- 12 임상 실험에서 관찰된 과도한 독성은 IL-12 활성화가 전신적인 방식보다는 국소적인 방식으로 이루어져야 할 필요성을 강조한다.

전술한 바와 같이 생체내 독성이 낮고, 생체내 안정성이 높으며, 선택적으로 Th1-타입 면역 반응을 유도하며, 특히 IL-12의 국소적인 생성 증가를 수반하는 Th1-타입 면역 반응을 선택적으로 유도하는 새로운 면역-자극 화합물이 요구된다. 본 발명은 상기 요구 및 기타 요구를 만족하는 새로운 합성 C-당지질을 제공한다. 본 발명의 화합물은 조절을 위해 Th1-타입 면역 반응이 요구되는 질병들을 치료할 수 있으며, 이들 질병은 비제한적으로 각종 감염, 암, 증식성 질환 및 자가 면역 질환을 포함한다. 이들 화합물은 포유류에서 항원의 면역원성을 증대시킬 수 있다.

본 발명의 C-당지질은 식(I)의 화합물 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르를 포함한다.

상기 식에서,

X는 O 또는 NH이고;

Y는 -CH₂-CH₂- 또는 -CH=CH- 이며;

Y가 -CH₂-CH₂-인 경우, Q는 C₂₃-C₃₃알케닐 또는 -R¹-O-R²이고;

Y가 -CH=CH-인 경우, Q는 C₂₇-C₃₂ 알킬, C₂₃-C₃₂알케닐, -R¹-O-R², 또는 페닐로 치환된 C₆-C₈ 알킬이고;

R¹ 및 R² 는 치환 또는 비치환된 알킬 또는 알케닐기로서, R¹ 및 R² 는 모두 합해 23 내지 32 탄소 원자를 가지며;

R³ 는 -OH 또는 단당류이고 R⁴ 는 H이거나, 또는 R³ 는 H이고, R⁴ 는 -OH 또는 단당류이며; 및

R⁵ 는 수소 또는 단당류이다.

바람직한 실시형태에서, Y는 트랜스(trans) 또는 시스(cis) 구조의 -CH=CH-이다. 더욱 바람직하게는 Y는 트랜스 구조의 -CH=CH-이다.

바람직하게는 IL-12의 분비 증강을 자극하는 화합물들이다. 이러한 화합물은 하기 화합물들 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염 및 에스테르를 포함한다:

(상기 묘사된 화합물들은 지방산 Q 사슬의 트랜스- 및 시스- 구조체이다(각각 GCK109 및 GCK151로 지칭된다]. 각각의 경우 Y는 트랜스-에틸렌(trans-ethylene)이다.)

이들 화합물들은 상기 CRONY 보다 더 우월한 Th1-타입 반응 특이성 및 약물동력학적 프로파일을 제공한다. 특정 이론에 매임없이 이들 화합물들은 수지세포에 의한 IL-12 분비 및 NKT 또는 NK 세포들에 의한 IFN-γ 분비의 균형 개선을 제공하며, 이는 나아가 반응 특이성을 반영하고, 이들 화합물들의 안정성을 개선시키는 것으로 사료된다. 이들 화합물들은 NKT 또는 NK 세포들에 의한 IL-4 분비를 실질적으로 자극하지 않는다.

추가적인 본 발명의 C-당지질은 하기 식의 화합물 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염 및 에스테르를 포함한다.

여기에서,

Y 는 -CH₂-CH₂-이고;

X 는 O, R⁵ 은 H, R³ 는 OH, R⁴ 은 H이며; 및

Q 는 -(CH₂)₂₇-CH₃이다.

본 발명의 다른 실시형태는 전술한 화합물과 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이다. 상기 약학적 조성물은 항원을 추가적으로 포함할 수 있다.

또 다른 실시형태는 포유류에서 NKT 세포에 의한 특이적 Th1-타입 면역 반응을 자극하고, 수지세포를 활성화하는 방법으로서, 상기 방법은 본 발명 화합물의 유효량을 포유류에 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 화합물들은 Th1-타입의 면역 반응을 선택적으로 그리고 효율적으로 유도하므로 직접 사용되거나 질병-특이적 항원과 함께 항원보강제로서 사용될 때 치료에 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명의 다른 실시형태는 치료가 요구되는 포유류에서 질병 조절을 위해 Th1-타입의 면역 반응이 요구되는 질병을 치료하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 유효량의 식(I) 화합물을 포유류에 투여하는 것을 포함한다. 조절을 위해 Th1-타입의 면역 반응이 요구되는 상기 질병의 비제한적 예로서, 감염(infections), 암(cancers), 세포증식성 질환(cell proliferative disorders) 및 Th2-타입 자가면역질환(autoimmune diseases)을 포함한다. 바람직한 실시형태에서 조절을 위해 Th1-타입의 면역 반응이 요구되는 질병은 감염성 바이러스 질환이며, 예를 들어 인간면역결핍바이러스(HIV)에 의한 감염, C형 간염바이러스(HCV) 감염, B형 간염바이러스(HBV) 감염, 헤르페스 바이러스 감염, 또는 호흡기세포융합바이러스(RSV)에 의한 감염 등을 들 수 있다. 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 질병은 암이며, 예를 들면 전립선 또는 유방의 암종과 같은 고형암을 들 수 있다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 질병은 천식이다.

다른 실시형태는 식(I)의 화합물을 포함하는 항원보강제와 항원으로 포유류를 면역함으로써 포유류에서 항원의 면역원성을 증대하는 방법이다. 바람직한 실시형태에서, 상기 항원은 HIV-특이적 항원, 말라리아-특이적 항원, 전립선암-특이적 항원이다.

또 다른 실시형태는 전술한 식(I) 화합물을 제조하는 방법이다. 일 실시형태는 하기 식(I) 화합물, 그 약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르를 제조하는 방법이다:

상기 식에서,

X는 O 또는 NH이고;

Y는 -CH₂-CH₂- 또는 -CH=CH- 이며;

Y가 -CH₂-CH₂-인 경우, Q는 C₂₃-C₃₂알케닐 또는 -R¹-O-R²이고;

R³ 는 -OH 또는 단당류이고 R⁴ 는 H이거나, 또는 R³ 는 H이고 R⁴ 는 -OH 또는 단당류이며; 및

R⁵ 는 수소 또는 단당류이다.

상기 방법은 하기 단계들을 포함한다:

a) 식 (II)의 화합물을 먼저 Pg1을 제거하고, 식 (III)의 p-니트로페닐 에스테르로 처리하여 반응시키는 단계

(식에서, Q는 상기에서 정의한 바와 같다); 및

(b) 후속하여 Pg2 및 Pg3을 탈보호하고, 임의로 사이클릭기에 인접하는 탄소-탄소 이중 결합을 수소화하여 식(I)의 화합물을 형성시킨다.

바람직한 일 실시형태에 따르면, 상기 식 (II)의 화합물은

이다.

본 발명에서, "Th1-타입 면역반응" 및 "Th2-타입 면역반응"은 각각 Th1 CD4+ 헬퍼 T 세포 및 Th2 CD4+ 헬퍼 T 세포에 의해 매개되는 면역반응을 지칭한다.

"Th1-타입 사이토킨" 및 "Th2-타입 사이토킨"은 각각 Th1 및 Th2 세포에 의해 생성되는 사이토킨을 지칭한다. Th1-타입 사이토킨은 비제한적으로 IFN-γ 및 IL-12을 포함하며, Th2-타입 사이토킨의 비제한적 예로는 IL-4을 들 수 있다.

"조절을 위해 Th1-타입 반응을 요구하는 질병"은 Th2-타입 면역 반응의 우세 및 Th2-타입 사이토킨 프로파일을 나타내는 특징을 갖는 질병을 지칭한다. 이러한 질병의 예로는 비제한 적으로, HIV 감염, HCV 감염, HBV 감염, 헤르페스 바이러스 감염, 및 RSV 감염과 같은 바이러스 질환; 전립선암 또는 유방암과 같은 암; 천식 및 알레르기와 같은 Th2-타입 자가 면역질환을 포함한다.

"Th1-타입 면역반응의 선택적 유도"는 Th2-타입 면역 반응의 동시적 유도 및/또는 증강 및/또는 지속의 증강을 유발하지 않고, Th1-타입 면역 반응을 유도 및/또는 증강 및/또는 지속의 증강하는 것을 지칭한다. 본 발명의 화합물에서, Th1-타입 면역반응의 선택적 유도는 증강된 IL-12 분비 및 수지세포의 활성화 증가(선행기술의 화합물에 대비하여)로 반영되며, IL-4 분비의 동시적인 증강이 일어나지 않는다.

"단당류(monosaccharide)"는 알데하이드(알도스) 또는 케톤(케토스) 형태의 3-10 탄소 원자 사슬을 갖는 당 분자를 지칭한다. 본 발명에 사용되기에 적합한 단당류는 자연 발생적 단당류 및 합성 단당류를 포함한다. 적합한 단당류의 비제한적 예로서, 글리세로스(glycerose) 및 디하이드록시아세톤(dihydroxyacetone)과 같은 삼탄당(triose); 에리쓰로스(erythrose) 및 에리쓰룰로스(erythrulose)와 같은 사탄당(tetroses); 크실로스(xylose), 아라비노스(arabinose), 리보스(ribose), 크실룰로스(xylulose), 리불로스(ribulose)와 같은 오탄당(pentoses); 람노스(rhamnose), 퓨코스(fucose)와 같은 메틸 오탄당(methyl pentoses; 6-deoxyhexoses); 글루코스(glucose), 만노스(mannose), 갈락토스(galactose), 프락토스(fructose) 및 소보스(sorbose)와 같은 육탄당(hexoses); 및 글루코헵토스(glucoheptose), 갈라만노헵토스(galamannoheptose), 슈도헵툴로스(sedoheptulose) 및 만노헵툴로스(mannoheptulose)와 같은 칠탄당(heptoses)을 포함한다. 바람직한 단당류는 비제한적으로 육탄당을 포함한다.

질병, 예를 들어 암, 감염성 질환 또는 자가 면역질환의 치료를 위한 화합물의 "유효량(effective amount)"은 인간을 포함하는 포유류에서 상기 질병의 하나 이상의 증상 또는 파라메타의 측정가능한 경감을 결과하는 양을 지칭한다.

"그 약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르"는 의학적 판단 범위내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반등 등을 유발하지 않고 환자 조직에 접촉하여 사용하기에 적합하며, 합리적인 이점/위험 비율을 가지며, 의도된 용법에 효과적인 본 발명 화합물의 카복실레이트 염, 아미노산부가염과 같은 염들 및 에스테르와 가능한 경우 본 발명 화합물의 양성 형태(zwitterionic forms)를 지칭한다.

"처치(치료)"는 개체에서 질병의 예방 또는 하나 이상의 증상을 감소 또는 경감시키기 위해 사용되는 것을 지칭한다. 본 발명의 맥락에서 "처치(치료)"는 또한 잠복기(prepatency) 즉 감염과 질병이 임상적으로 발현되는 것 사이의 기간을 연장시키는 것을 의미한다.

용량 또는 양에 적용되는 "치료학적으로 유용한"이라는 용어는 필요로하는 포유류에 투여시 원하는 활성을 나타내기에 충분한 화합물 또는 약학적 조성물의 양을 의미한다.

"약학적으로 허용가능한" 및 "생리학적으로 허용가능한"은 상호 호환적으로 사용되며, 본 발명의 조성물에 관련하여 생리학적으로 내성이며 통상적으로 인간에 투여시 바람직하지 않은 작용을 나타내지 않는 조성물의 분자 물질(entities) 및 다른 성분을 의미한다. 바람직하게 "약학적으로 허용가능한"은 연방정부 또는 주정부에 의해 승인되거나 또는 미국 약전 또는 다른 인지된 약전에 포유물, 특히 인간에 사용가능한 것으로 수록되어 있는 것을 의미한다.

"담체"는 본 발명의 화합물과 함께 투여되는 희석제, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 약학적 담체는 물 및 오일과 같은 멸균 용액일 수 있으며, 땅콩유, 대두유, 광유 등과 같은 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 멸균 용액을 포함한다. 물 또는 수용액, 식염수 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 담체, 특히 주사액을 위한 담체로서 바람직하게 사용된다. 적합한 약학적 담체는 E. W. Martin의 "Remington's Pharmaceutical Sciences" 18판에 기술되어 있다.

"항원보강제(adjuvant)" 및 "면역 항원보강제(immunoadjuvant)"는 상호호환적으로 사용되며, 숙주에 단독으로 투여될 때는 비-면역원성이지만, 항원과 함께 투여되었을 때는 다른 항원의 숙주 면역 반응을 증대시키는 화합물 또는 혼합물을 지칭한다.

"함께 투여"한다는 것은 면역 항원보강제 및 항원 등과 같이 두 제제를 한 조성물내에서 동시에, 또는 다른 조성물로 동시에, 또는 순차적으로 투여하는 것을 지칭한다. 순차적인 투여가 "함께"로 간주되기 위해서는 항원보강제가 항원에 대한 면역 반응을 증대시킬 수 있는 정도의 시간 간격으로 투여되어야 한다. 예를 들어 항원이 폴리펩티드인 경우, 항원과 항원보강제는 같은 날 바람직하게는 한 시간이내에, 가장바람직하게는 동시에 투여된다. 그러나 핵산이 개체에 전달되고 숙주 세포내에서 폴리펩티드 항원이 발현되는 경우라면, 항원보강제는 바람직하게 핵산 투여 24시간내, 더욱 바람직하게는 6시간내 투여된다.

"개체"는 면역 시스템을 갖는 동물, 바람직하게 포유류를 지칭한다. 본 발명이 적용가능한 개체는 비제한적 예로서, 소, 말, 양, 돼지, 가금류(예, 닭), 염소, 고양이, 개, 설치류(예를 들면 햄스터, 마우스, 래트, 토끼), 원숭이, 유인원 및 인간을 포함한다. 바람직한 실시형태에서 상기 개체는 인간이다.

"약" 또는 "대략적으로"는 본 발명의 기술분야의 당업자에 의해 측정되는 특정 값에 대하여 허용가능한 오차 범위에 있는 것을 의미하며, 부분적으로 측정 또는 결정 방법 즉 측정 시스템의 제한 등에 의존할 수 있다. 예를 들면 "약"은 본 기술분야에서 실행 당 1 이상의 표준 편차내를 의미한다. 또는 "약"은 주어진 값에 대하여 20% 이내의 범위, 더욱 바람직하게는 10% 이내, 보다 바람직하게는 5% 이내, 가장 바람직하게는 1% 이내를 의미한다. 또는 생물학적 시스템 또는 공정에 대해, 값의 배수, 바람직하게는 5배 이내, 더욱 바람직하게는 2배 이내를 의미한다. 특정값이 출원 및 청구범위에 기재된 경우라도, 특별히 다르게 기술되어 있지 않는 한, "약"은 특정 값의 허용가능한 오차 범위내로 간주되어야 한다.

본 발명에 따르면 통상적인 분자 공학, 미생물학, 재조합 DNA 기술이 본 기술 분야의 범위내에서 채용되고 있다. 이러한 기술은 공지된 것이며 문헌에 충분히 설명되어 있다. 특히 예를 들어 Sambrook, Fritsch 및 Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (이하 "Sambrook 등., 1989"으로 지칭); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; Transcription And Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R.I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)을 참조할 수 있다.

본 발명의 화합물

바람직한 식(I) 화합물은 X가 O, R₅ 가 H, R₃ 가 OH 이고 R₄ 가 H인 화합물이다.

바람직하게 본 발명의 화합물은 지질 측쇄(즉, Q기)에 하나 이상의 친핵성 결합(nucleophilic bond)을 갖는다. 각 친핵성 결합은 바람직하게 에테르 결합(즉 Q가 -R¹-O-R²) 또는 이중 결합 (즉, Q가 알케닐)이다. 이 친핵성 결합은 바람직하게 측쇄 Q의 말단 탄소 원자에서 최소한 6 탄소 원자에 위치한다. 예를 들면 이중 결합은 측쇄 Q의 말단 탄소 원자로부터 6 내지 22 탄소 원자에 위치한다.

일 실시형태에 따르면, Q는 23 내지 32 탄소원자, 바람직하게는 25 내지 32 탄소원자, 더욱 바람직하게는 28 내지 32 탄소원자를 가지며, 하나, 두개 또는 세개의 이중 결합을 갖는 C₂₃-C₃₂ 알케닐이다. 바람직하게 상기 이중 결합은 C₇ 및 C₁₂ 사이에(카보닐기에 결합되어 있는 Q기 말단에서 부터), 더욱 바람직하게는 C₇ 와 C₁₀ 사이에(예를 들면 C₉ 와 C₁₀사이) 위치한다. 바람직하게 Q는 -C₈H₁₆-CH=CH-C₁₈H₃₇이다. 본 발명의 특정 패밀리는 Q 가 C₂₃-C₃₂ 알케닐이고 Y가 -CH=CH-, 바람직하게 트랜스 구조인 경우이다.

다른 실시형태에서 Q 는 -R¹-O-R²이다. 상기 산소 원소는 Q기 내 어디라도 위치할 수 있으나, 바람직하게 C₁ 및 C₂₅ 사이(카보닐기에 결합되어 있는 Q기 말단에서) (예를 들면 C₁ 및 C₂ 사이 또는 C₉ 및 C₁₀사이), 더욱 바람직하게는 C₁₈ 및 C₂₅ 사이(예를 들면 C₁₉ 및 C₂₀사이)에 위치한다. 예를 들면 Q는 C₁₉H₃₈-O-C₆H₁₃일 수 있다. 특정 화합물의 패밀리는 Q가 -R¹-O-R² 이고 Y 가 -CH₂-CH₂-인 경우이다. 바람직한 일 실시형태에서, Q는 -R¹-O-R² 이고, R¹ 및 R² 는 모두 알킬기이다.

또 다른 실시형태에서, Q는 -R¹-O-R² 이고, 최소한 R¹ 및 R² 중 하나는 알케닐이다. Q기는 바람직하게 1 내지 3개의 이중 결합을 가지며, 더욱 바람직하게는 하나의 이중 결합을 갖는다. 상기 이중 결합과 산소 원자는 Q기 내 어디에든 위치할 수 있다. 바람직하게 R¹ 는 알케닐이고 더욱 바람직하게 R¹ 는 알케닐이며 R² 는 알킬이다. Q기가 하나의 이중 결합을 가질 때, 바람직하게 이는 C₇ 및 C₁₂ 사이에(카보닐기에 결합되어 있는 Q기 말단에서), 더욱 바람직하게는 C₇및 C₁₀사이에, 보다 바람직하게는C₉ 및 C₁₀사이에 위치한다. 상기 산소 원자는 바람직하게 C₁ 및 C₂₅ 사이에(카보닐기에 결합되어 있는 Q기 말단에서)(예를 들면 C₁ 및 C₂ 사이 또는 C₉ 및 C₁₀사이), 더욱 바람직하게는 C₁₈ 및 C₂₅ 사이에(예를 들면 C₁₉ 및 C₂₀ 사이에) 위치한다. 예를 들면 Q는 -C₈H₁₆-CH=CH-C₉H₁₈-O-C₆H₁₃일 수 있다.

다른 바람직한 실시형태에 따르면 Y는 -CH=CH- 이고, Q 는 C₂₇-C₃₂ 알킬, 바람직하게 C₂₇ 또는 C₂₈알킬이다.

다른 바람직한 실시형태에 따르면 Y 는 -CH=CH- 이고, Q 는 -R¹-O-R²이며, 이때 R¹ 및 R² 는 상기 정의된 바와 같다. 바람직하게 Q는 23 내지 32 탄소 원자, 더욱 바람직하게는 25 내지 32 탄소 원자, 보다 바람직하게는 28 내지 32 탄소 원자를 포함한다. 예를 들면 Q는 C₁₉H₃₈-O-C₆H₁₃일 수 있다.

바람직한 본 발명의 화합물은 비제한적으로 하기의 화합물들 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염들 및 에스테르들을 포함한다:

다른 바람직한 본 발명의 화합물은 비제한적으로 하기 표 B에 나타낸 화합물들 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염 및 에스테르들을 포함한다.

[표 B]

(3S, 4S, 5R)-1-C-(α-D-갈락토피라노실)-3-(N-20-옥사노나코스-(10, 11-E)-에노일아미노)-4,5-노나데칸디올

(3S, 4S, 5R)-1-C-(α-D-갈락토피라노실)-3-(N-노나코사노일아미노)-4,5-노나데칸디올

(3S, 4S, 5R)-1-C-(α-D-갈락토피라노실)-3-(N-3-옥사펜타코사노일아미노)-4,5-노나데칸디올

(3S, 4S, 5R)-1-C-(α-D-갈락토피라노실)-3-(N-11-옥사헥사코사노일아미노)-4,5-노나데칸디올

(3S, 4S, 5R)-1-C-(α-D-갈락토피라노실)-3-(N-11-옥사헥사코사노일아미노)-4,5-노나데크-(1,2-E)-엔디올

(3S, 4S, 5R)-1-C-(α-D-갈락토피라노실)-3-(N-3-옥사펜타코사노일아미노)-4,5-노나데크-(1,2-E)-엔디올

(3S, 4S, 5R)-1-C-(α-D-갈락토피라노실)-3-(N-20-옥사헥사코사노일아미노)-4,5-노나데크-(1,2-E)-엔디올

(3S, 4S, 5R)-1-C-(α-D-갈락토피라노실)-3-(N-20-옥사헵타코사노일아미노)-4,5-노나데크-(1,2-E)-엔디올

(3S, 4S, 5R)-1-C-(α-D-갈락토피라노실)-3-(N-20-옥사노나코스-(10, 11-E)-에노일아미노)-4,5-노나데크-(1,2-E)-엔디올

(3S, 4S, 5R)-1-C-(α-D-갈락토피라노실)-3-(N-노나코사노일아미노)-4,5-노나데크-(1,2-E)-엔디올

본 발명의 득특한 화합물은 하기 식 화합물 및 이의 약학적 허용가능한 염 또는 에스테르이다.

치료적 용도

본 발명의 화합물은 Th1-타입 면역 반응의 선택적 유도, 특히 IL-12 분비 증강 및 수지세포와 같은 항원-제시 세포(APCs)들의 활성화 증가을 수반하나 IL-4 분비는 실질적으로 증강되지 않는 Th1-타입 면역 반응으로부터 혜택을 받을 수 있는 모든 질병의 치료에 유용하다.

특별한 이론에 얽매임없이, 본 발명의 화합물은 항원제시세포들(APCs)의 TCR에 결합함으로써 Th-1 타입의 면역 반응을 선택적으로 유도하고, NKT 세포들을 활성화시켜 NKT 세포에 의한 IFN-γ을 분비하는 것으로 사료된다. 그러나 이렇게 활성화된 NKT 세포는 실질적으로 IL-4은 분비하지 않는다. 활성화된 NKT 세포는 나아가 CD40 리간드를 통해 수지세포와 같은 항원제시세포(APCs)와 결합하여 IL-12의 국소 분비를 증강시킨다. 이러한 IL-12의 국소 분비는 IL-12 독성에 수반하는 부정적인 효과를 피할 수 있고 매우 효과적이고 특이적인 Th1-타입 면역 반응, 예를 들면 암이나 병원체에 대한 Th1-타입 면역 반응을 일으킨다. 본 발명의 화합물은 수지세포에 간접적으로 작용하며 α-GalCer 또는 α-C-GalCer (CRONY)에 비하여 이차적인 NK 세포 활성화에 대한 활성은 적은 것으로 사료된다. 따라서 NK 세포의 비-특이적인 활성화는 상당히 제한되며, 이로써 선행 기술 화합물을 상회하는 안전성 및 내약성을 나타낸다.

이러한 성질들은 본 발명의 화합물이 특히 조절을 위해 Th1-타입 반응을 요구하는 질병의 치료에 유용하게 한다.

일 실시형태에서, 본 발명의 화합물은 예컨대 종양의 성장을 저해하는 항암제와 같은 암 치료, 및 세포 증식성 질환의 치료에 유용하다. 본 발명의 화합물은 단독으로 사용되거나 화학요법, 방사선 요법 또는 면역 요법에 조합하여 사용될 수 있다.

특히 본 발명의 화합물은 다양한 암의 치료에 유용하며, 비제한적으로 방광암, 유방암, 결장암, 신장암, 간암, 소세포폐암, 비-소세포암을 포함하는 폐암, 식도암, 담낭암, 난소암, 췌장암, 고환암, 위암, 신장암, 간암, 경부암, 갑상선암, 전립선암, 편평세포암을 포함하는 피부암과 같은 암종; 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, B 세포 림프종, T 세포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 털세포 림프종(hairy cell lymphoma) 및 버킷 림프종(Burkett's lymphoma)과 같은 림프 계통의 조혈암(hematopoietic tumors); 급만성 골수백혈병, 골수형성이상증후군(myelodysplastic syndrome) 및 전골수구백혈병(promyelocytic leukemia)을 포함하는 골수 계통의 조혈암; 및 섬유육종 및 횡문근육종을 포함하는 중간엽 유래 종양; 별아교세포종, 신경모세포종, 신경아교종, 신경초종(schwannomas)을 포함하는 중추 및 말초 신경계 종양; 흑색종(melanoma), 고환종(seminoma), 기형암종, 뼈육종, 크세노더마 피그멘토섬(xenoderoma pigmentosum), 케라톡탄토마(keratoctanthoma), 갑상선소포암(thyroid follicular cancer), 카포시육종 등을 포함하는 기타 암의 치료에 유용하다. 바람직한 일 실시형태에서 상기 암은 전립선암 또는 유방암과 같은 고형암이다.

본 발명의 화합물이 유용한 세포 증식성 질환은 비제한적으로, 전립선 비대증, 가족성대장폴립증, 신경섬유종증, 건선, 동맥경화증에 수반되는 맥관성 평활근세포증식, 폐섬유증, 관절염 사구체신염, 수술후 협착 및 재협착을 포함한다.

다른 실시형태에서, 본 발명의 화합물은 바이러스 감염 및 비바이러스 감염을 포함하는 감염성 질병의 치료에 유용하다.

예를 들면 본 화합물은 레트로비리데(예를 들면 HIV-1 (HTLV-III, LAV 또는 HTLV-III/LAV, 또는 HIV-III로도 지칭됨)와 같은 인간 면역결핍바이러스); 및 HIV-LP와 같은 다른 분리체; 피코나비리데(예를 들면 폴리오 바이러스, A형 간염 바이러스; 엔테로바이러스, 인간 콕삭키 바이러스, 리노바이러스, 에코바이러스); 칼시비리데(예를 들면 위장관염을 일으키는 균주); 토가비리데(예를 들면 말뇌염바이러스, 루벨라바이러스); 플라비리데(예, 뎅기바이러스, 뇌염 바이러스, 황열바이러스); 코로나비리데(예, 코로나바이러스); 랩도비리데(예, 수포성 구내염 바이러스, 광견병바이러스), 필로비리데(예, 에볼라 바이러스); 파라믹소비리데(예, 파라인플루엔자 바이러스, 볼거리 바이러스, 홍역 바이러스, 호흡기세포융합바이러스); 오르쏘믹소비리데(예, 인플루엔자 바이러스); 분가비리데(예, 한탄 바이러스, 분가 바이러스, 펠보바이러스(phleboviruses) 및 나이로 바이러스); 아레나비리데(예, 출혈열바이러스); 레오비리데(예, 레오바이러스, 오비바이러스, 로타바이러스); 버나비리데; 헤파드나비리데(B형 간염 바이러스); 파보비리데(파보바이러스); 파포바비리데(파필로마 바이러스, 폴리오마 바이러스); 아데노비리데(대부분의 아데노바이러스); 헤르페스비리데(단순 포진 바이러스(HSV) 1형 및 2형, 대상포진 바이러스, 시토메갈로바이러스(CMV), 헤르페스 바이러스); 폭스비리데(바리올라 바이러스, 박시니아 바이러스, 폭스 바이러스); 및 이리도비리데(예, 아프리카 돼지열바이러스); 및 미분류 바이러스(예, 해면상뇌증의 원인 바이러스, 델타 간염 원인 바이러스(B형 간염 바이러스의 결손 위성으로 사료됨), 비-A 비-B 간염 바이러스(클래스 1= 내부 전염; 클래스 2= 혈액을 통한 전염(예, C형 간염); 노워크(Norwalk) 및 관련 바이러스, 및 아스트로 바이러스)에 의해 유발되는 바이러스 감염의 치료에 유용하다.

본 발명의 화합물은 또한 헬리코박터 파이오리, 보렐리아 부그도페리(Borellia burgdorferi), 레지오넬라 뉴모필리아, 미코박테리아속(예, 결핵균, 조류결핵균, M. 칸사시, M. 고도네), 스타필로코크스 아우레우스, 임균, 수막염균, 리스테리아 모노사이토진즈, 스트렙토코코스 파이오진즈(그룹 A 스트렙토코크스), 스트렙토코크스 아칼락티아(그룹 B 스트렙토코크스), 스트렙토코크스(비리단 그룹), 스트렙토코크스 패칼리스, 스트렙토코크스 보비스, 스트렙토코크스(혐기성속), 스트렙토코크스 뉴모니에, 병원성 캄필로박터속, 엔테로코크스속, 슈도모나스속, 뉴모코크스속, 클라미디아속, 헤모필러스 인플루엔자, 바실러스 안트라시스, 코리네박테륨 디프테리아, 코리네박테륨속, 에리시페로트릭스 류시오파티아(Erysipelothrix rhusiopathiae), 클로스트리듐 퍼프린져스, 클로스트리듐 테타니, 엔테로박터 에로젠즈, 클레비시엘라 뉴모니이, 파스투렐라 물토시다, 박테로이데스종, 푸소박테륨 뉴클레아튬, 스트렙토바실러스 모니리포미스, 트레포네마 팔리듐, 프레포네마 퍼테뉴, 렙토시피라, 액티노마이세스 이스라엘리 및 프란시엘라 튜라렌시스 등의 균에 의해 유발되는 세균성 감염의 치료에 유용하다. 또한 크립토코크스 네오포만스, 히스토플라스마 캅수라툼, 콕시디오이데스 이미티스, 블라스토마이세스 더마티티디스, 클라미디아 트라코마티스, 캔디다 알비칸스 등에 의해 유발되는 진균 및 원충 질환에 유용하다.

본 발명의 화합물은 또한 플라스모듐속(Plasmodium sp.), 레쉬마니아속(Leishmania sp), 스키스토소마속(Schistosoma sp) 및 토소플라스마속(Toxoplasma sp)을 포함하는 원생생물 및 효모와 기타 진균과 같은 감염성 유기체에 의해 유발되는 감염 치료에 유용하다.

바람직한 일 실시형태에서, 본 발명의 화합물은 인간면역결핍바이러스(HIV), C형 간염 바이러스(HCV), B형 간염 바이러스(HBV), 헤르페스 바이러스, 호흡기세포융합바이러스(RSV), 또는 말라리아에 의해 유발되는 감염의 치료에 유용하다.

다른 실시형태에서 본 발명의 화합물은 천식 및 알레르기와 같은 조절을 위해 Th1-타입 반응이 요구되는 자가면역질환의 치료에 유용하다.

본 발명의 치료 및 예방 방법은 다른 치료와 같이 사용될 수 있다. 예를 들면 본 발명의 화합물을 사용하는 항암 치료는 화학요법제 및/또는 방사선요법과 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물을 사용하는 항바이러스 요법은 IFN-α 치료와 조합하여 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법과 관련하여 면역원성적으로 유효량의 식 (I) 화합물 및 임의로 부가적인 면역자극제, 담체 또는 부형제(바람직하게 모두 약학적으로 허용가능하다)를 포함하는 약학적 및 백신 조성물을 제공한다.

투여모드

본 발명의 화합물과 조성물의 투여모드는 비제한적으로 경구투여, 장내투여, 정맥투여, 근육투여, 종양내 투여, 피하투여, 경피투여, 경비투여, 경점막투여(직장 및 부칼 투여 포함) 및 흡입투여를 포함한다. 바람직하게 경구투여, 경피투여, 피하투여 또는 흡입 또는 경비투여 경로가 사용된다(예, 각각 고형 또는 액상 경구 포뮬레이션, 피부 패치, 또는 경비 스프레이을 통해). 어떤 경우에는 본 화합물은 동계(syngenic) 수지세포와 펄스(pulse)된 후 정맥을 통해 환자에 전달될 수 있다. 즉 수지세포를 화합물과 인큐베이션하여 수지세포가 CD1d를 통해 화합물과 결합하고, 이들 화합물을 담은 수지세포를 환자에게 정맥을 통해 전달할 수 있다. 정맥 전달은 국소적으로 또는 전신적으로 수행될 수 있다.

약학적 조성물

본 발명의 화합물 및 조성물의 경구 투여용 고형 제제는 캡슐, 정제, 환약, 분말제, 과립제 및 좌약을 포함한다. 이러한 고형 제형에서 본 발명의 활성 화합물은 하나 이상의 소듐 시트레이트 또는 디칼슘 포스페이트와 같은 통상적인 불활성 부형제(또는 담체); 또는 (a) 전분, 락토스, 슈크로스, 글루코스, 만니톨 및 규산(silicic acid)과 같은 충전제 또는 익스텐더; (b) 카복시메틸셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 슈크로스 및 아카세이와 같은 바인더; (c) 글리세롤과 같은 습윤제; (d) 아가-아가, 칼슘 카보네이트, 감자 전분 또는 타피오카 전분, 알긴산, 실리케이트 복합체 및 소듐 카보네이트와 같은 붕해제; (e)파라핀과 같은 지연용액; (f) 4급 암모늄 화합물과 같은 흡수 촉진제; (g) 세틸알콜 및 글리세롤 모노스테아레이트와 같은 습윤제; (h) 카올린 및 벤토나이트와 같은 흡착제; 및 (i) 탈크, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고형 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 라우릴 설페이트, 또는 이들의 혼합물과 같은 윤활제 등과 혼합될 수 있다. 캡슐, 정제 및 환약의 경우 이들 제형은 또한 완충제를 포함할 수 있다. 상기와 같은 고형 조성물 또는 전술한 바와 유사한 고형 조성물은 락토스 또는 밀크, 설탕, 고분자량 폴리에틸렌글리콜 등과 같은 부형제를 충전제로 사용하여 연질 및 경질 젤라틴 캡슐에 채용될 수 있다.

정제, 드래그제, 캡슐, 환약 및 과립제와 같은 고형제형은 장코팅이나 다른 적합한 코팅 또는 셀등을 사용하여 코팅제나 쉘제로 제조될 수 있다. 이와 같은 코팅 및/또는 쉘은 본 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 불투명화제를 함유할 수 있고, 활성 화합물(들)을 특정 장 부위에서 연장된 방식으로 방출할 수 있다. 사용가능한 임베딩 조성물의 예는 폴리머물질과 왁스를 들 수 있다. 활성 화합물은 또한 전술한 부형제 하나 이상을 사용하여 적절한 경우 마이크로캡슐형태로 사용될 수 있다.

경구투여용 액상 제형은 약학적으로 허용가능한 에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 액상 제형은 활성 화합물과 함께, 본 기술분야에 통상적으로 사용되는 불활성 희석제, 예를 들면 물이나 기타 용매, 가용화제 및 유화제를 포함할 수 있으며, 예컨대 에틸알콜, 이소프로필 알콜, 에틸카보네이트, 에틸아세테이트, 벤질알콜, 벤질벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 디메틸포마이드, 오일, 특히 면실유, 그라운드넛 오일, 옥수수 배아오일, 올리버오일, 카스터 오일, 및 참기름, 글리세롤, 테트라하이드로푸푸릴알콜, 폴리에틸렌글리콜 및 소비탄 지방산 에스테르, 이들 물질의 혼합물 등을 포함할 수 있다. 필요한 경우 상기 조성물은 습윤제, 유화제, 현탁제, 감미제, 향미제 및/또는 방향제등과 같은 보조제를 포함할 수 있다.

상기 조성물은 전술한 담체를 포함할 수 있다. 적합한 담체는 순환계에서 용해되고 생리학적으로 허용가능한 고분자물질을 포함한다. 바람직하게 담체는 순환계에서 안정하며 허용가능한 소실 혈장 반감기를 갖는다. 이러한 고분자는 비제한적으로 대두 레시틴(Soya lecithin), 올레산 및 소비탄 트리올레이트를 포함하며, 바람직하게는 소비탄 트리올레이트이다.

현탁액은 상기 활성 화합물이외에 분산제를 함유할 수 있으며, 예컨대 에톡실레이트 이소스테아릴알콜, 폴리옥시에틸렌 소비톨 및 소비탄 에스테르, 미세결정셀룰로스, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 아가-아가, 트라가칸트 등을 들 수 있다. 필요한 경우 분산제 혼합물이 사용될 수 있다.

직장 투여용 조성물은 바람직하게 본 발명의 화합물과 코코아버터, 폴리에틸렌글리콜, 통상의 온도에서는 고형이나 체온에서는 액상이 되어 직장강 또는 질강에서 용융되어 활성 성분을 방출할 수 있는 좌약용 왁스와 같은 적당한 비자극성 부형제 또는 담체를 혼합하여 제조되는 좌제이다.

주사용 조성물은 생리학적으로 허용가능한 멸균 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼, 및 멸균주사 용액 또는 분산액으로 재구성되는 멸균 분말을 함유할 수 있다. 적절한 수성 및 비수성 담체, 희석제, 용제 또는 비히클의 예로는 물, 에탄올, 폴리올(프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 글리세롤 등), 이들의 적합한 혼합물, 식물유(올리브 오일과 같은), 및 에틸올레이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르 등을 포함한다. 적당한 유동성은 예를 들면 레시틴과 같은 코팅제를 사용하거나 분산제의 경우 요구되는 입자 크기를 유지하고 계면활성제를 사용하여 유지할 수 있다.

본 발명 화합물의 국소 투여용 제형은 연고, 분말, 스프레이 및 흡입제를 포함한다. 활성 성분은 적당한 조건하에서(예, 멸균 조건) 생리학적으로 허용가능한 담체 및 보존제, 버퍼 또는 필요한 경우 추진제 등과 혼합될 수 있다. 안약 포뮬레이션은 안연고, 분말 및 용액등의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명의 화합물은 바람직하게 천식이나 알레르기성 호흡기 질환의 치료에 특히 유용한 흡입 또는 경비 투여에 적합한 형태로 포뮬레이션될 수 있다. 이러한 포뮬레이션에서 특정 부형제는 원하는 제형에 따라 선택되며, 즉 용액이 드롭으로 사용될 것인가 또는 스프레이(에어로졸) 또는 현탁액으로 적용될 것인가 또는 비강에 연고 또는 겔로 적용될 것인가 여부에 따라 선택된다.

에어로졸 또는 압력 포장이 본 목적을 위해 채용될 수 있다. 이러한 에어로졸 포뮬레이션은 추진가스에 의해 일정 압력으로 치료 부위에 운반되는 매우 미세한 액체 또는 고체 입자를 포함한다. 약학적 에어로졸이 본 발명에 채용될 때, 상기 에어로졸은 액체 암체 및 추진제 혼합물에 용해, 현탁 또는 유화될 수 있는 치료학적으로 활성인 화합물을 함유한다. 에어로졸은 용액, 현탁액, 에멀젼, 분말 또는 반-고형 제제의 형태일 수 있다. 본 발명에 채용되는 에어로졸은 환자의 호흡기관을 통해 미세한 고형 입자 또는 액체 미스트로서 투여된다. 다양한 형태의 추진제가 본 발명이 속하는 분야에 알려져 있고 사용된다. 적합한 추진제의 예로는 비제한적으로 탄화수소 또는 다른 적합한 가스를 포함한다. 압력 에어로졸의 경우, 용량 단위는 일정량을 수송할 수 있는 값을 제공하여 결정될 수 있다. 본 발명은 또한 기체내에서 실질적으로 균일한 크기의 매우 미세한 액체 입자를 생성하는 기계인 네뷸라이져에 의해 투여될 수 있다. 바람직하게 본 발명의 화합물을 함유하는 액체는 방울(droplets)로 분산된다. 이 작은 방울은 네뷸라이져의 출구 튜브를 통해 기체 기류에 의해 수송될 수 있다. 생성되는 미스트는 환자의 호흡기관을 통해 침투한다.

또는 본 발명의 화합물을 함유하는 분말 조성물은 윤활제, 담체 또는 추진제와 함께 또는 없이 치료가 필요한 포유류에 투여될 수 있다. 이러한 본 발명의 실시형태는 흡입에 의해 분말 약학적 조성물을 수송하는 통상적인 장치로 수행될 수 있다. 예를 들면 화합물 및 락토스 또는 전분과 같은 적합한 분말 베이스의 분말 혼합물은 예를 들면 캡슐형 또는 카트리지, 예를 들면 젤라틴 또는 블리스트 포장의 단위 용량 형태로 제공되고, 분말을 흡입기를 사용하여 투여할 수 있다.

에어로졸 투여를 위해 본 발명의 혼합물은 약 1 내지 20㎛, 바람직하게는 약 3 내지 10㎛의 마이크로입자의 형태로 할 수 있다.

특정 실시형태에서 본 발명의 화합물은 리포좀 또는 마이셀 입자에 의해 수송될 수 있다.

정맥, 피하 또는 근육내 경로를 통해 비경구적으로 투여되는 경우, 리포좀은 연장된 시간 동안 봉입된 약물의 조절된 "데포" 방출을 제공할 수 있으며, 혈액내 자유 약물의 농도를 제한함으로써, 약물의 부작용을 경감할 수 있다. 리포좀은 치료학적으로 바람직한 방향으로 약물의 흡수 및 조직 분포를 변경할 수 있으며, 약물을 덜 자주 투여할 수 있으므로 치료의 간편성을 증대시킨다.

흡입으로 투여되는 경우 리포좀은 지질 조성에 따라 봉입된 약물을 몇시간 내지 수일로 반감기가 다양한 선택된 방출 속도로 방출할 수 있도록 할 수 있다. 나아가 약물이 리포좀내 격리되는 정도에 따라 호흡기 및 혈류에 빠르게 흡수되는 것에 따른 부작용이 경감된다.

점막 조직에 약물을 수송하는데 있어 리포좀의 추가적인 이점은 점막 점착성 증가에 따라 리포좀 표면을 변경시켜 목적하는 조직 부위에 리포좀의 잔류시간을 증강시킬 수 있다는 점이다.

약물을 봉입한 리포좀 제조 방법은 공지되어 있다. 일 방법으로서, 소낭 형성 지질을 플라스크 일면에 박막으로 증착하고 수성 버퍼액을 가하여 천천히 재수화시킨다. 봉입될 약물은 지질 필름내(친유성 약물의 경우), 또는 수성 수화 매질(친수성 약물의 경우)에 포함될 수 있다. 형성되는 리포좀은 약 0.05 내지 10 마이크론 정도의 비균일한 크기를 갖는 다층소포(MLVs)이다. 이 MLV는 이후 통상 균일화, 초음파처리 또는 막 압출에 의해 가공되어, 작고 균일한 크기의 현탁액으로 된다. 약 0.2 - 0.4 마이크론 이하로 크기를 줄인 리포좀이 바람직하다. 이 크기 범위의 리포좀은 0.45 마이크론 깊이 여과기를 통과시킴으로써 멸균할 수 있고, 응집이 덜 되며, 정맥 투여시 더욱 바람직한 기관 분포를 나타낼 수 있다(Gabizon). 리포좀 포뮬레이션이 제조되면, 바람직하게 동결방지제를 리포좀 내부 및 외부 매질내 존재시키고 동결건조할 수 있다.

이러한 동결방지제는 슈크로스, 트레할로스, 락토스, 말토스, 만니톨, 사이클로덱스트린 및 이들의 유도체와 같은 당류에서 선택될 수 있다.

이러한 동결방지제는 폴리에틸렌글리콜, 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈, 또는 하이드록시에틸 전분과 같은 폴리머 물질일 수 있다. 이러한 동결방지제는 단독 또는 조합하여 사용될 수 있다.

리포좀 포뮬레이션을 냉동건조하는 경우 아미노산을 추가적으로 사용할 수 있다.

수화 매질내 녹인 동결방지제을 사용하여 빈 리포좀을 제조하는 동안 리포좀 내부의 수화층내로 동결방지제를 도입할 수 있다. 약물 로딩 과정이 완결된 후에 수행되는 투석 여과동안 동결방지제를 외부에 도입할 수 있다. 원하는 동결방지제를 투석 여과에 의해 리포좀 현탁액 포뮬레이션의 외부 버퍼를 변경함으로써 도입될 수 있다. 리포좀 현탁액은 바이알에 충전되고 동결건조한다.

본 발명의 화합물을 포함하는 다른 비-리포좀 포뮬레이션도 동결건조될 수 있다.

항원보강제로서의 용도

나아가 본 발명은 포유류에서 항원의 면역원성을 증대시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 항원 및 식 (I)의 화합물을 포함하는 항원보강제를 함께 사용하여 포유류를 면역하는 것을 포함한다.

본 발명에 따르면 식 (I)의 화합물을 항원보강제로서 사용함으로써 항원에 의해 유도되는 보호성 면역을 증강하고 및/또는 작용기간을 연장할 수 있다. 예를 들면 후술하는 바와 같이 식 (I)의 화합물을 암 또는 바이러스 항원의 T 세포 또는 B 세포 에피토프에 해당하는 펩티드, 또는 이들 항원을 발현하는 DNA 조립체와 함께 투여함으로써 항원-특이적 면역 반응을 증강시킨다.

식 (I)의 항원보강제는 어떠한 항원, 특히 감염성 병원체 또는 암에서 유래된 항원과 함께 투여될 수 있다.

전술한 바와 같이 본 발명 화합물의 항원보강 활성은 최소한 부분적으로 NKT-매개 및 수지세포-매개된 항원-특이적 Th1-타입 T 세포 반응 및 CD8+ T 세포 반응을 증강 및/또는 연장시킬 수 있는 능력에 기인한다.

선행기술 화합물(KRN7000 및 CRONY 101 포함)에 비하여 본 발명 화합물은 선택적인 Th1-타입 면역 반응을 성취할 수 있어(즉 NKT 세포 시스템의 효과적이고 특이적이며 국소화된 활성화를 달성하며, 특히 IL-12 분비를 증대하고, IL-4 분비의 증가없이 수지세포의 효과적이고 특이적이며 국소화된 2차 활성화를 성취한다), 비-특이적인 세포독성을 유발함없이 활성화된 NKT 세포의 국소 세포독성을 증가시키며, 이로써 본 발명의 화합물은 매우 효과적으로 낮은 면역원성을 나타내는 다양한 암 및 감염성 항원의 면역원성을 증강시킬 수 있다. 게다가 본 발명 화합물에 의한 NKT 세포 활성화는 개인마다 단일형태인 CDld 분자에 의존하므로(Porcelli, Adv. Immunol., 59: 1-98, 1995), 이는 본 발명의 항원보강제가 MHC 주조직적합복합체의 할로타입(MHC haplotype)에 무관하게 모든 환자에게 사용될 수 있음을 의미한다.

본 발명에 따르면 항원 및 (I)의 화합물을 함유하는 항원보강제는 함께(conjointly) 투여된다. 항원 및 항원보강제의 투여 모드는 비제한적으로 경구투여, 장내투여, 근육투여, 종양내 투여, 피하투여, 경피투여, 경비투여, 경점막투여(직장 및 부칼 포함) 및 흡입을 포함한다. 바람직하게 경구투여, 경피투여, 피하투여 또는 흡입 또는 경비투여 루트가 사용된다(예, 각각 고형 또는 액상 경구 포뮬레이션, 피부 패치, 또는 경비 스프레이을 통해). 정맥을 통한 투여는 국소 또는 전신 투여일 수 있다. 본 발명의 화합물을 포함하는 항원보강제를 항원과 함께 동시에 투여하는 것이 바람직하며 통상 가장 효과적인 면역자극을 일으킨다. 두개의 상이한 조성물에 함유된 경우, 본 발명의 항원보강제 및 항원은 바람직하게 동일 부위, 바람직하게 서로로부터 1 cm 이내로 투여된다.

본 발명의 항원보강제는 복수의 상이한 항원과 조합하여 그 면역자극 활성을 나나타내므로, 예방 및 치료 모두에 유용하다. 따라서 추가적인 측면으로 본 발명은 포유류에 있어 조절을 위해 Th-1-타입 반응을 요구하는 질병의 예방 및/또는 치료적 방법을 제공하며, 이는 항원 및 식(I)의 화합물을 포함하는 항원보강제를 상기 포유류에 함께 투여하는 것을 포함한다. 이 방법은 예를 들면 다양한 감염 및 다양한 신생물 질환으로부터의 보호 및/또는 감염의 치료에 유용하다.

일 실시형태는 포유류에 바이러스-특이적 항원 및 식 (I)의 화합물로 된 항원보강제를 함께 투여함으로써, 포유류에서 인간 면역결핍 바이러스(HIV)감염, C형 간염 바이러스(HCV) 감염, B형 간염 바이러스(HBV) 감염, 헤르페스 바이러스 감염, 또는 호흡기세포융합바이러스(RSV) 감염에 대한 면역반응을 증강하는 방법이다. 다른 실시형태는 포유류에 암-특이적 항원 및 식 (I)의 화합물로 된 항원보강제를 함께 투여함으로써, 포유류에서 전립선암 또는 유방암에 대한 면역 반응을 증강하는 방법이다.

본 발명의 치료 및 예방 방법은 다른 치료와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들면 암-특이적 항원 및 본 발명의 항원보강제를 사용하는 항암 치료는 화학요법 및/또는 방사선 요법과 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명의 항원보강제를 포함하는 항-바이러스 백신은 IFN-α 치료와 조합하여 사용될 수 있다.

본 발명의 방법과 관련하여, 본 발명은 면역학적으로 유효량의 항원과 면역학적으로 유효량의 식 (I) 화합물을 포함하는 항원보강제 및, 임의로 추가적인 면역자극제, 담체 또는 부형제(바람직하게 모두 약학적으로 허용가능한 것들이다)를 포함하는 약학적 및 백신 조성물을 제공한다. 상기 항원과 항원보강제는 단일 조성물로 포뮬레이션되거나 또는 두개의 별개의 조성물로 포뮬레이션될 수 있다.

본 발명의 면역원성(예, 백신) 조성물에 사용되는 항원은 진핵 세포(예, 종양 또는 기생충, 효모 및 기타 진균), 박테리아 세포, 바이러스 입자 또는 이들의 부분에서 유래될 수 있다. 면역반응을 유발하는 물질이 항원성이 낮은 경우(예, 합성 또는 서브 유닛 항원), 예를 들어 시판하는 시약 키트를 사용하여 표준적인 공유 결합 기술로 알부민이나 햅텐과 같은 담체 물질에 콘쥬게이션될 수 있다. 추가적으로 특정 분자 부분을 포함하여 항원제시세포들에 특이적인 표적을 유발할 수 있으며, 예로서 시가 톡신의 베타 서브유닛, 특이적인 수지세포 친화성을 갖는 펩티드(Haicheur N, Bismuth E, Bosset S, Adotevi O, Warnier G, Lacabanne V, Regnault A, Desaymard C, Amigorena S, Ricciardi-Castagnoli P, Goud B, Fridman WH, Johannes L, Tartour E. The B subunit of Shiga toxin fused to a tumor antigen elicits CTL and targets dendritic cells to allow MHC class I-restricted presentation of peptides derived from exogenous antigens. J Immunol. 2000 Sep 15;165(6):3301-8.), DEC-205 수용체에 친화성을 갖는 펩티드(Sevilla et al., J. Exp. Med., 2000, 192:1249-1260), DC-SIGN에 대한 항체 (Tacken PJ, de Vries IJ, Gijzen K, Joosten B, Wu D, Rother RP, Faas SJ, Punt CJ, Torensma R, Adema GJ, Figdor CG. Effective induction of naive and recall T-cell responses by targeting antigen to human dendritic cells via a humanized anti-DC-SIGN antibody. Blood. 2005 Aug 15;106(4):1278-85.)등을 들 수 있다.

본 발명의 바람직한 항원의 예로는 (i) 조사된 플라즈모디얼 스포로조이트 또는 말라리아 서컴스포로조이트(CS) 단백질의 T 세포 및/또는 B 세포 에피토프를 하나 이상 함유하는 합성 항원과 같은 말라리아-특이적 항원(하기 참조); (ii) 인플루엔자 바이러스(예, 표면 당단백 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다제(NA))에서 유래된 바이러스 단백질 또는 펩티드 항원[칠면조 인플루엔자 HA 또는 조류 인플루엔자 HA); 면역결핍 바이러스 유래 바이러스 단백질 또는 펩티드 항원(예, 고양이 면역결핍바이러스(FIV) 항원, 원숭이 면역결핍바이러스(SIV)항원 또는 gp120, gp 160, p18 항원, Gag p17/p24, Tat, Pol, Nef, 및 Env와 같은 인간 면역결핍바이러스(HIV) 항원; 헤르페스 바이러스 유래 바이러스 단백질 또는 펩티드 항원(예, 고양이 헤르페스바이러스 유래 당단백질, 말 헤르페스바이러스 유래 당단백질, 소 헤르페스바이러스 유래 당단백질, 위광견 바이러스 유래 당단백질, 개 헤르페스바이러스 유래 당단백질, 단순 포진 바이러스(HSV, 예, HSV tk, gB, gD) 유래 당단백질, 마렉병 바이러스(Marek's Disease Virus)유래 당단백질, 칠면조 헤르페스 바이러스(HVT), 또는 시토메갈로바이러스(CMV) 유래 당단백질, 또는 엡스테인-바 바이러스 유래 당단백질); 간염 바이러스 유래 바이러스 단백질 또는 펩티드 항원(예, B형 간염 표면 항원(HBsAg)); (iii) 그램-음성 박테리아 세포벽에서 분리된 리포폴리사카라이드와 같은 박테리아 항원 및 스타필로코크스-특이적 항원, 스트렙토코크스-특이적 항원, 뉴모코크스-특이적 항원(예, PspA [PCT 공개공보 제WO 92/14488호 참조]), 임질균-특이적 항원, 보렐리아-특이적 항원(예, 보렐리아 부그도페리, 보렐리아 아프젤리 및 보렐리아 가리니와 같은 라임병을 일으키는 보렐리아의 OspA, OspB, OspC 항원들 [미국 특허 제5,523,089호; PCT 공개공보 제WO 90/04411호, WO 91/09870호, WO 93/04175호, WO 96/06165호, WO93/08306호 ; PCT/US92/08697; Bergstrom 등., Mol. Microbiol., 3: 479-486, 1989; Johnson 등., Infect. and Immun. 60: 1845-1853, 1992; Johnson 등., Vaccine 13: 1086-1094, 1995; The Sixth International Conference on Lyme Borreliosis: Progress on the Development of Lyme Disease Vaccine, Vaccine 13: 133-135, 1995]참조) (iv), 및 ErbB 수용체와 같은 암-특이적 단백질, Melan A [MARTI], gp100, 티로시나제, TRP-1/gp 75, 및 TRP-2 (흑색종에서); MAGE-1 및 MAGE-3 (방광암, 두부 및 목암, 비소세포암); HPV EG 및 E7 단백질 (경부암); 무신 [MUC-1] (유방암, 췌장암, 결장암 및 전립선암); 전립선-특이적 항원 [PSA] (전립선암); 암배아항원 [CEA] (결장암, 유방암 및 위장관암) 및 MAGE-2, MAGE-4, MAGE-6, MAGE-10, MAGE-12, BAGE-1, CAGE-1,2,8, CAGE-3 내지 7, LAGE-1, NY-ESO-1/LAGE-2, NA-88, GnTV, TRP2-INT2, 및 WT-1와 같은 공유된 암-특이적 항원 (윌림암 유전자)를 포함한다.

전술한 목록의 항원은 오직 예시적으로 사용된 것이며, 관심 항원은 어떠한 동물 또는 인간 병원체 또는 암에서 유래될 수 있다. 병원체-유래 관심 항원을 코딩하는 DNA에 대해서는 예를 들면 미국 특허 제4,722,848호; 5,174,993호; 5,338,683호; 5,494,807호; 5,503,834호; 5,505,941호; 5,514,375호; 5,529,780호; 영국 특허 GB 2 269 820 B; 및 PCT 공개공보 제WO 92/22641호; WO 93/03145호; WO 94/16716호; WO 96/3941호; PCT/US94/06652에 개시되어 있다. 암 바이러스에서 유래된 항원은 Molecular Biology of Tumor Viruses, RNA Tumor Viruses, Second Edition, Edited by Weiss et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982을 참조할 수 있다. 본 발명의 조성물에 사용되는 추가적인 항원 목록은 Stedman's Medical Dictionary (24th edition, 1982)을 참조할 수 있다.

일 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 말라리아, 특히 P. yoelii 및 주 인간 플라즈모디얼종 P. falciparum 및 P. vivax에 대한 보호 면역을 제공한다. 이들 조성물은 하나 이상의 하기 성분을 포함한다: (i) 바람직하게 다양한 유전적 배경을 갖는 포유류에서 항말라리아 T-세포 반응을 유발할 수 있는 T 세포 에피토프를 함유하는 하나 이상의 말라리아-특이적 펩티드(예, YNRNIVNRLLGDALNGKPEEK [서열 번호: 1] 또는 SYVPSAEQI [서열 번호: 2] P. yoelii CS 단백질의 T 세포 에피토프 [Renia 등., J. Immunol., 22: 157-160, 1993; Rodrigues 등., Int. Immunol., 3: 579-585, 1991] 또는 (NVDPNANP)_n [서열 번호: 3] 또는 EYLNKIQNSLSTE WSPCSVT [서열 번호: 4] P. falciparum CS 단백질의 T 세포 에피토프[Nardin 등., Science, 246:1603, 1989; Moreno 등., Int. Immunol., 3: 997: 1991; Moreno 등., J. Immunol., 151: 489, 1993]); 및/또는 (ii) 항-말라리아(예, 중화) 항체(예, 말라리아 유기체의 스포로조이트 단계에 대해)의 생성을 자극할 수 있는 B 세포 에피토프를 포함하는 하나 이상의 말라리아-특이적 펩티드(예, (NANP)₃ [서열 번호: 5] P. falciparum CS 단백질의 반복 영역내 위치하는 B 세포 에피토프[Nardin 등, J.Exp.Med., 156: 20, 1982; Nardin 등., Ann. Rev. Immunol., 11: 687, 1993]). 바람직하게, 본 발명의 면역원성 조성물은 하나 이상의 B 세포 에피토프 및 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다. B 세포 에피토프는 바람직하게 말라리아의 서컴스포로조이트(CS) 단백질을 특이적으로 인식하고 결합하는 항체의 생성을 유발한다. 대체적으로 또는 부가하여 본 발명의 조성물은 다른 말라리아 구성성분에서 유래되거나 이로 활성화된 B 세포 및/또는 T 세포 에피토프를 포함할 수 있으며, 상기 다른 말라리아 구성성분은 예로서, P. vivax 적혈구 분비단백질-1 또는 -2 (PvESP-1 또는 PvESP-2) (예를 들어 미국 특허 제5,874,527호 참조), 트롬보스폰딘 관련 접착(익명) 단백질(TRAP), 또는 스포로조이트 표면 단백질 2 (SSP2)로 지칭되는 P. falciparum 스포로조이트 표면 단백질, LSA-1, hsp70, SALSA, STARP, Hepl7, MSA, RAP-1, 및 RAP-2을 들 수 있다. 일 실시형태에서, B 세포 에피토프 및 T 세포 에피토프 성분은 중복항원펩티드(MAPs)에 삽입되어 고밀도의 에피토프를 함유하는 합성 고분자 폴리펩티드를 형성한다. MAP 합성 방법은 본 분야에서 잘 알려져 있다(예를 들면 Tam, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5409, 1988; Tam, Meth. Enzymol., 168: 7, 1989을 참조).

본 발명은 또한 예를 들어 비제한적으로 P. malariae, P. ovale, P. reichenowi, P. knowlesi, P. cynomolgi, P. brasilianum, P. berghei, 및 P. chabaudi를 포함하는 다른 플라즈모디얼 속에서 유래된 B 세포 및 T 세포 에피토프를 포함할 수 있다. 이들 에피토프들은 통상적으로 플라즈모디아 단백질에서 유래된 8 내지 18개의 아미노산 잔기를 포함한다.

다른 특이한 실시형태에서, 본 발명의 바람직한 항원은 HIV-특이적항원이다 (예, p18 단백질의 T 세포 에피토프[서열 번호: 6]).

다른 일 실시형태에서, 본 발명의 항원은 항원을 발현하는 재조합 바이러스에 의해 제시될 수 있다. 바람직하게 상기 바이러스는 재조합 아데노바이러스, 재조합 폭스바이러스 및 재조합 신드비스 바이러스로 구성되는 군에서 선택된다.

항원보강제로 사용되는 경우, 본 발명의 화합물은 항원을 포함하는 약학적 또는 백신 조성물의 일부로 투여되거나 또는 개별적인 포뮬레이션으로 투여될 수 있으며, 항원을 포함하는 제2 조성물과 함께 투여될 수 있다. 이들 조성물에서 본 발명의 화합물은 다른 항원보강제 및/또는 부형제/담체와 결합되어 사용될 수 있다. 이들 다른 항원보강제는 비제한적으로 완전 프로인트항원보강제, 불완전 프로인트항원보강제, MF59, 또는 SAF와 같은 오일-에멀젼 및 유화제-기초 항원보강제; 알루미늄하이드록시아드(알룸), 알루미늄포스페이트 또는 칼슘포스페이트와 같은 광물성 겔; 콜레라독소(CT), 백일해독소, 대장균 열민감독소(LT), 돌연변이독소 (예, LTK63 또는 LTR72), 칼메트-게랑 간균 (BCG), 코니박테륨 파븀, DNA CpG 모티프, 무라밀 디펩티드 또는 모노포스포릴 리피드 A와 같은 미생물학적으로 유래된 항원보강제; 면역자극 복합체(ISCOMs), 리포좀, 생체분해성 마이크로스피어, 또는 사포닌(예, QS-21)와 같은 입자 항원보강제; IFN-γ, IL-2, IL-12 또는 GM-CSF와 같은 사이토킨; 비이온성 블록 코폴리머, 무라밀 펩티드 아날로그(예, N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민[thr-MDP], N-아세틸-노르-무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민, N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-[1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴-옥시]-에틸아민), 폴리포스파젠, 또는 합성 폴리뉴클레오타이드, 및 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 폴리애니온(polyanions), 펩티드, 탄화수소 에멀젼, 키홀 림페트 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanins; KLH)과 같은 합성 항원보강제를 포함한다. 바람직하게 이들 부가적인 항원보강제는 약학적으로 인간에 사용가능한 것이다.

조성물의 순도

본 발명의 화합물은 바람직하게 적어도 75%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 가장 바람직하게 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 순도로 정제된다.

유효 용량

상기 발병의 치료에 유효한 량은 본 기술분야의 당업자에게 잘 알려져 있는 경험적인 방법 예를 들면 용량 매트릭스 및 투여 빈도를 수립하고 매트릭스내 각 점에 대해 개체 또는 일군의 실험적 단위를 비교함으로써 용이하게 결정될 수 있다. 환자에 투여되어야 할 정확한 양은 특정 질병, 질병의 상태 및 심각도 및 환자의 육체적인 조건에 따라 달라질 것이다. 증상 또는 파라메타의 측정가능한 경감은 본 분야의 숙련된 의사 또는 환자에 의한 의사에의 보고에 의해 결정될 수 있다. 임상적으로 상당한 경감 내지 감소는 환자 및/또는 의사에 인식가능한 정도를 의미한다.

특정환자에 대한 용량 수준 및 제형은 사용되는 화합물의 활성; 치료 개체의 나이, 체중, 전반적인 건강상태 및 성별; 투여 경로 및 시간; 배출속되 미리 투여된 다른 약제; 및 치료를 시행하고 있는 특정 질병의 심각도를 포함한 다양한 인자에 의존한다.

투여될 화합물의 양은 약 0.1 내지 500 ㎍/kg/투여당, 바람직하게는 약 0.5 내지 100 ㎍/kg/투여당, 가장 바람직하게는 약 1 내지 50 ㎍/kg/투여당 이다. 본 발명의 약제학적 조성물은 그 자체로 질병 치료에 유효한 화합물의 전량을 포함할 필요는 없으며, 이러한 유효량은 복수 용량의 약제학적 조성물의 투여에 의해 달성될 수 있다.

예를 들면 본 발명의 화합물은 캡슐 또는 정제로 포뮬레이션될 수 있고, 이들 각각은 바람직하게 본 발명의 화합물 0.06-3.00 mg을 함유한다.

본 발명의 화합물을 함유하는 조성물의 독성과 치료적 효능은 실험 동물을 사용하여 표준적인 약학적 과정에 의해, 예를 들면 LD50 (50% 치사 용량) 및 ED50 (50% 치료효과용량)을 측정함으로써 결정될 수 있다. 독성과 치료효과간의 용량 비율은 치료학적 계수로 지칭되며, LD50/ED50의 비율로 표현될 수 있다. 치료학적 계수가 큰 조성물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 치료제도 사용될 수 있지만(예, 심각한 암 또는 치명적인 감염을 치료하는 경우), 이러한 경우에는 이 면역원성 조성물이 특정 부위(예, 면역 반응을 매개하는 림프 조직, 암 또는 감염원의 복제가 이루어지는 기관)를 표적하도록 세심하게 약물 수송 시스템을 고안하여 다른 조직 및 기관에 대한 손상 가능성을 최소화하여 부작용을 줄일 수 있도록 하여야 한다.

전술한 바와 같이 동물 실험에서 수득한 데이타는 인간에 사용될 수 있는 용량 범위를 결정하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물의 인간에 있어서 치료학적 유효량은 바람직하게 독성이 거의 없거나 나타내지 않는 ED50 를 포함하는 순환 농도 범위내이다. 상기 용량은 채용되는 제형이나 투여 경로에 의존하여 상기 범위내에서 변경될 수 있다. 단일 용량이 사용되는 것이 이상적이다.

도 1은 O- 및 C-당지질에 의한 사이토킨 및 면역 세포 활성화의 개요도이다.

도 2a 내지 도 2c는 본 발명의 화합물 또는 대조 화합물을 BALB/c (도 2a) 및 C57BL/6 (도 2b-2c) 마우스에 투여하였을 때 방출되는 Th1-타입 사이토킨 IFN-γ의 키네틱 프로파일을 도시한 것이다. 도시된 화합물은 A= 트랜스-A-1 화합물, B= A-2 화합물, C=A-3 화합물, D= A-4 화합물, E= A-5 화합물, Z= 대조(PBS 단독), CRONY=α-C-GalCer, KRN=α-GalCer, GCK109 (A-1 트랜스-구조체), GCK151 (A-1 시스-구조체), 및 GCK152 [A-7]이며, 화합물 투여후 0, 2, 6, 12, 24, 48, 및 72 시간후 혈청내 IFN-γ수준을 효소-링크된 면역흡수어세이(ELISA)법에 따라 측정한 후, 데이타는 두개의 상이한 혈청 풀의 희석물에 대한 평균 +/- 표준편차 (SD)로 나타내었다.

도 3a 내지 도 3c는 본 발명의 화합물 또는 대조 화합물을 BALB/c (도 3a) 및 C57BL/6 (도 3b-3c) 마우스에 투여하였을 때 방출되는 Th1-타입 사이토킨 IL-12의 키네틱 프로파일을 도시한 것이다. 도시된 화합물은 A= 트랜스-A-1 화합물, B= A-2 화합물, C=A-3 화합물, D= A-4 화합물, E= A-5 화합물, Z= 대조(PBS 단독), CRONY=α-C-GalCer, KRN=α-GalCer, GCK109 (트랜스-A-1), GCK151 (시스-A-1), 및 GCK152 [A-7]이며, 화합물 투여후 0, 2, 6, 12, 24, 48, 및 72 시간후 혈청내 IL-12수준을 효소-링크된 면역흡수어세이(ELISA)법에 따라 측정한 후, 데이타는 두개의 상이한 혈청 풀의 희석물에 대한 평균 +/- 표준편차 (SD)로 나타내었다.

도 4a 내지 도 4c는 본 발명의 화합물 또는 대조 화합물을 BALB/c (도 4a) 및 C57BL/6 (도 4b-4c) 마우스에 투여하였을 때 방출되는 Th2-타입 사이토킨 IL-4의 키네틱 프로파일을 도시한 것이다. 도시된 화합물은 A= 트랜스-A-1 화합물, B= A-2 화합물, C=A-3 화합물, D= A-4 화합물, E= A-5 화합물, Z= 대조(PBS 단독), CRONY=α-C-GalCer, KRN=α-GalCer, GCK109 (트랜스-A-1), GCK151 (시스-A-1), 및 GCK152 [A-7]이며, 화합물 투여후 0, 2, 6, 12, 24, 48, 및 72 시간후 혈청내 IL-4수준을 효소-링크된 면역흡수어세이(ELISA)법에 따라 측정한 후, 데이타는 두개의 상이한 혈청 풀의 희석물에 대한 평균 +/- 표준편차 (SD)로 나타내었다.

도 5a 및 5b는 실험적 인간 생체외 NKT 세포 시스템내에서 ELISA법으로 측정한 본 발명 화합물의 사이토킨 수준을 도시한 것이다. 다양한 당지질(즉 GCK109 [트랜스-A-1], GCK151 [시스-A-1], GCK127 [A-2], GCK152 [A-7], 및 대조 화합물 CRONY=α-C-GalCer 및 KRN=α-GalCer)의 존재하에 동계 CD14-말초혈단핵세포(PBMCs)와 18시간 동안 공 배양된 미성숙 수지세포(DCs)의 배양 상등액내에 존재하는 IFN-γ 또는 IL-4의 농도를 ELISA법으로 측정하였다.

도 6a 및 6b는 실험적 인간 생체외 NKT 세포 시스템내에서 ELISPOT법으로 측정한 본 발명 화합물과 배양된 사이토킨-분비 PBMCs의 수를 도시한 것이다. IFN-γ 또는 IL-4를 분비하는 PBMCs의 수는 다양한 당지질(즉 GCK142A [A-6], GCK109 [트랜스-A-1], GCK151 [시스-A-1], GCK127 [A-2], GCK152 [A-7], 및 대조화합물 CRONY=α-C-GalCer 및 KRN=α-GalCer)의 존재하에 ELISPOT 플레이트에서 동계 CD14-말초혈단핵세포(PBMCs)와 22-26시간 동안 공 배양후 ELISPOT법으로 측정하였 다.

하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이며, 본 발명은 하기 실시예에 제한되지 않는다.

1. 합성예

A. 중간물질의 제조

지질 사슬 -C(O)-Q를 형성하기 위한 중간물질은 하기 반응도 1A 및 1B에 도시한 바와 같이 제조될 수 있다.

반응도 1A

반응도 1B

반응도 1A 및 1B에서 각 Alk은 독립적으로 알킬 사슬을 의미하며, 지방산 사 슬내 총 탄소수가 23 내지 32 탄소 원자가 되도록 한다. 반응도 1A에서 카복실산(A)는 DIC 존재하에 파라니트로페놀을 사용하여 파라니트로페놀 에스테르(B)로 전환된다. 유사하게 알케놀(E)은 소듐 하이드라이드 및 적합한 할로겐화 알칸으로 처리하여 알켄-에테르(F)로 전환된다. 최종적으로 파라니트로페놀 에스테르(B)는 2세대 그랍 촉매(Grubbs Catalyst)의 존재하에 적합한 알켄 화합물로 (B)를 반응시킴으로써 최종 지방산(D) 또는 (G)로 전환된다. 중간물질 (D) 또는 (G)는 실리카겔상의 칼럼 크로마토그래피와 같은 통상적인 방법에 의해 정제될 수 있다.

특정 중간물질의 합성을 하기 반응도 2A - 2E에 도시하였다.

반응도 2A

반응도 2B

반응도 2C

반응도 2D

화합물 2: 출발물질 무수 DCM (120 ml)내 운데실렌산(undecylenic) 용액(4.1 g, 22.2 mmol, 1.1 equiv.)에 파라니트로페놀(2.9 g, 20.9 mmol)을 첨가하였다. DIC (3.6 ml, 1.2 equiv.) 및 4-DMAP (60 mg) 존재하에, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고 반응 완료는 TLC(PE-EA 6:1, R_f: 0.52)로 확인하였다. 상기 현탁액을 DCM으로 희석하고 셀라이트로 여과하였다. 여액을 농축하여 잔사를 수득하였다. 잔사를 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(페트로에테르(Petroether)-CHCl₃ 2:1)로 정제하여 에스테르 2 (6.23 g, 98 %)를 수득하였다.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) 8.31 (d, J = 9.2 Hz, 2 H), 7.32 (d, J = 9.2 Hz, 2 H), 5.84 (m, 1 H, H-10), 5.03 (m, 2 H, H-11), 2.64 (t, J = 7.5 Hz, 2 H, H-2), 2.09 (m, 2 H, H-9), 1.80 (m, 2 H, H-3), 1.48-1.35 (m, 10 H, H-4-8), 3.96 (br s, 1 H), 3.87 (dd, J = 9.8, 2.4 Hz, 1 H), 3.51 (m, 2 H), 2.50 (d, J = 2.1 Hz, 1 H). ¹³ C NMR (75 MHz, CDCl₃): 171.1, 155.5, 145.2, 139.0, 125.1, 122.3, 114.2, 34.4, 33.8, 29.3, 29.2, 29.1, 29.0, 24.9.

화합물 2a: 출발물질 메탄올 내 운데실렌산 용액에 DCC 및 4-DMAP을 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다.

화합물 4: 건조 CH₂Cl₂ (15 ml)내 화합물 2 (197 mg, 0.646 mmol) 및 1-에이코센(eicosene; 850 mg, 4.2 equiv.) 교반 용액에 2세대 그랍 촉매(65 mg, 12 mol %)를 가하고 혼합물을 하루 동안 환류하고, 에스테르 2의 소모를 TLC(PE-DCM 1:1, R_f: 0.40)로 확인하였다. 반응물을 진공 농축한 후 실리카겔을 사용한 칼럼 크로마토그래피(PE-DCM 2:1)하여 표제 화합물 4 (190 mg, 53%, 트랜스/시스: 4:1)를 수득하였다.

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) 8.27 (d, J = 9.1 Hz, 2 H), 7.28 (d, J = 9.1 Hz, 2 H), 5.35 (m, 2 H, H-10, H-11), 2.59 (t, J = 7.5 Hz, 2 H, H-2), 2.02 (m, 4 H, H-9, H-12), 1.76 (pent., J = 7.5 Hz, 2 H, H-3), 1.42-1.25 (m, 42 H, H-4-8, H-13-H-28), 0.88 (t, J = 6.7 Hz, 3 H, H-29). ¹³ C NMR (125 MHz, CDCl₃): 171.3, 155.6, 145.3, 130.5, 130.2, 125.2, 122.4, 34.3, 32.6, 32.6, 31.9, 29.7, 29.7, 29.6, 29.5, 29.4, 29.3, 29.2, 29.1, 29.0, 24.7, 22.7, 14.1.

화합물 4a: 건조 CH₂Cl₂내 화합물 2a 및 1-에이코센 교반 용액에 2세대 그랍 촉매를 가하고 혼합물을 하루 동안 환류하였다. 반응물을 진공 농축하고 실리카겔을 사용한 칼럼 크로마토그래피하여 표제 화합물 4a를 수득하였다.

화합물 6: 무수 THF (15 ml) 및 DMF (5 ml)내 ω-운데실레닐 알콜(2 ml, 98 %, 9.74 mmol)용액에 소듐 하이드라이드(광유내 60 %, 584 mg, 1.5 equiv.)를 0℃에서 첨가하고 10분내 TBAI (80 mg) 및 1-브로모펜탄(1.82 ml, 1.5 equiv.)을 첨가하였다. 환류하면서 밤새 교반하고, 알콜의 소모를 TLC(PE-EA 6:1)로 확인하였다. 혼합물을 DCM로 희석한 후 물로 퀀칭하였다. 수상을 DCM (3x)으로 추출하고, 포화 소듐 바이카보네이트로 세척하고 이후 식염수로 세척하였다. 유기상을 건조하고(소듐 설페이트로), 농축하고, 잔사를 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(석유에테르-DCM, 3:1)로 정제하여 에테르 6을 수득하였다 (2.21 g, 99 %, R_f: 0.12 with PE-DCM 3:1). 6과 동일한 방식으로 화합물 7을 수율 94 %로 수득하였다.

6: ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) 5.81 (m, 1 H, H-10), 4.95 (m, 2 H, H-11), 3.38 (t, J = 7.0 Hz, 4 H, H-1, H-1', 2.03 (m, 2 H, H-9), 1.56 (m, 4 H, H-2, H-2'), 1.37-1.27 (m, 16 H, H-3-8; H-3'-4'), 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 3 H, H-5'). ¹³ C NMR (125 MHz, CDCl₃): 138.9, 114.1, 71.0, 70.6, 33.8, 31.9, 29.8, 29.5, 29.5, 29.4, 29.1, 28.9, 26.2, 19.4, 14.1.

화합물 8: 건조 클로로포름(20 ml) 내 에스테르 2 (190 mg, 0.623 mmol) 및 에테르 6 (200 mg, 0,833 mmol, 1.3 equiv.)의 교반 용액에 2세대 그랍 촉매(36 mg, 7 mol %)를 첨가하고 혼합물을 하루동안 환류하고, 반응물을 농축한 후 실리카겔을 사용한 칼럼 크로마토그래피(PE-DCM 3:2)하여 표제 화합물 8 (174 mg, 84 %, trans/cis: 4:1, R_f: 0.16 with PE-DCM 1:1)을 수득하였다. 8과 동일한 방식으로 화합물 9를 수율 81 %로 제조하였다.

8: ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) 8.26 (d, J = 9.0 Hz, 2 H), 7.27 (d, J = 9.1 Hz, 2 H), 5.37 (m, 2 H, H-10, H-11), 3.38 (t, J = 6.7 Hz, 4 H, H-20, H-22), 2.58 (t, J = 7.5 Hz, 2 H, H-2), 1.96 (m, 4 H, H-9, H-12), 1.75 (pent., J = 7.4 Hz, 2 H, H-3), 1.56 (m, 4 H, H-19, H-23), 1.39 (m, 2 H, H-4), 1.32-1.25 (m, 24 H, H-5-8, H-13-18, H-24-25), 0.88 (t, J = 6.7 Hz, 3 H, H-26). ¹³ C NMR (125 MHz, CDCl₃): 171.1, 155.6, 145.3, 130.5, 130.2, 125.2, 122.4, 71.0, 34.3, 32.6, 32.7, 29.8, 29.7, 29.6, 29.5, 29.3, 29.2, 29.0, 26.2, 25.8, 24.7, 22.6, 14.1.

화합물 13: Compound 4a을 DCM/MeOH (1:1)에 녹이고, 이 용액에 5% 탄소상 Pd(30 mol %)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 수소하에서 교반하고, TLC 분석으로 반응이 완전히 종료되는 것을 확인하였다. 이후 반응물을 진공 농축하고, 실리카겔을 사용한 칼럼 크로마토그래피하여 표제 화합물 13을 수득하였다.

화합물 14: 메틸 에스테르 13 (147 mg, 0.32 mmol)을 10 ml iPrOH/THF (1:1)에 용해시키고, 물(2 ml) 내 100 mg NaOH를 가하였다. 상기 혼합물을 60℃에서 5시간 동안 교반하고, TLC(PE/EA 12:1)로 가수분해가 완료된 것을 확인하였다. 2 N HCl로 중화한 후, 상기 용액을 직접 진공 농축하였다. DCM (10 ml) 내 상기 지방산 잔사 용액에 파라니트로페놀(160 mg, 0.5 mmol)을 첨가하였다. DCC (160 mg) 및 4-DMAP (35 mg)존재하에 상기 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, 반응이 종료된 것을 TLC(PE-EA 10:1)로 확인하였다. 상기 현탁액을 DCM로 희석하고, 이에 소량의 실리카겔을 가하였다. 증발 후 잔사를 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(PE/EA 20:1)로 정제하여 에스테르 14 (154 mg, 86 %)를 수득하였다.

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) 8.27 (d, J = 9.1 Hz, 2 H), 7.28 (d, J = 9.1 Hz, 2 H), 2.59 (t, J = 7.5 Hz, 2 H, H-2), 1.76 (pent., J = 7.5 Hz, 2 H, H-3), 1.41 (pent., J = 7.0 Hz, 2 H, H-4), 1.37-1.22 (m, 48 H, H-5 to H-28), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 3 H, H-29). ¹³ C NMR (125 MHz, CDCl₃): 171.3, 155.6, 145.3, 125.2, 122.4, 34.4, 33.7, 31.9, 30.2, 29.7, 29.7, 29.6, 29.6, 29.5, 29.4, 29.4, 29.2, 29.2, 29.1, 26.7, 24.8, 22.7, 14.1.

상기 특정 중간 물질들을 줄리아-리드고-코시엔스키 커플링 반응(Julia-Lythgoe-Kocienski coupling chemistry)을 사용하여 합성하는 대체 방법을 반응도 2E에 도시하였다. 이 방법에서 상업적으로 입수 가능한 알킬브로마이드 18은 상업적으로 입수 가능한 벤즈티아졸 티올 19과 반응하여 브롬이 치환된 후 카복실산 20이 형성된다. 이 티오에테르 카복실산 20은 이후 mCPBA로 산화되어 설폰 21을 형성한다. 설폰 21은 이후 리튬 헥사메틸디실아자이드의 존재하에 줄리아-리드고-코시엔스키 조건에서 알데하이드 23 (예를 들면 스원 조건을 사용하여 상업적으로 입수 가능한 알콜 22에서 합성된다)와 반응한다. 이로써 알켄 카복실산 24이 생성된다. 카복실산 24는 DCC 및 DMAP의 존재하에 p-니트로페놀로 처리하여 직접 비포화 p-니트로페닐 에스테르 4로 전환되거나, 또는 (1) 예를 들면 수소 존재하 탄소상 5% 팔라듐으로 수소화되고 (2) 생성되는 포화 산 25를 DCC 및 DMAP 존재하에 p-니트로페놀로 처리하여 포화 p-니트로페닐 에스테르 15로 전환된다.

반응도 2E

B. 당지질의 제조

본 발명의 당지질은 하기 반응도 3에 도시된 방법에 의해 제조될 수 있다.

반응도 3

반응도 3에서, Z는 -CH=CH-, O, -O-Alk-CH=CH-, 또는 -CH=CH-O-이고; 각 Alk은 독립적으로 알킬 사슬을 나타내며 지방산내 탄소수가 23 내지 32 탄소원자로 되도록 한다. 화합물 (H)는 바람직하게 트리플루오로아세트산 및 디클로로메탄내 트리에틸실란으로 처리하여 탈보호되고(즉 BOC 및 이소프로필리덴 보호기가 제거된다),지방산 에스테르 (D) 또는 (G)와 반응하여 화합물 (I)이 생성된다. 화합물 (I)은 이후 예를 들면 소듐과 암모니아로 탈보호되어 알켄-결합 화합물(J)이 생성되거나, 예를 들면 탄소상 팔라듐 상에서 수소 가스로 환원되어 알칸-결합 화합물 (K)가 생성된다. 이들 화합물은 플래쉬 칼럼 크로마토그래피와 같은 본 분야에 공지된 방법에 의해 정제될 수 있다.

화합물 (H)는 염기에 민감한 당 알데하이드 (L) 밀 설폰 (M)간의 원-폿 줄리아-리드고-코시엔스키(one-pot Julia-Lythgoe-Kocienski reaction)반응을 사용하여 제조될 수 있으며, 이를 하기 반응도 3a에 나타내었다.

반응도 3a

화합물(H), 화합물 (U)로의 -CH₂-CH₂-결합 아날로그의 대체 합성을 하기 반응도 3b에 도시하였다.

반응도 3b

반응도 3b에서, 알데하이드 (O)는 알켄(N)에서 유래된다. 위티그 반응을 통한 호몰로그화(Homologation) 이후 알콜로 환원하여 알릴 알콜을 수득할 수 있으며 잘-수립된 샵리스 에폭시화로 에폭시(Q)가 형성된다. 소듐 아자이드 개방 및 반전으로 보호된 아미노 하이드록시 알데하이드(S)가 형성된다. 이후 그리나드 반응으로 알콜 (T)이 수득된다.

특정 당지질의 합성을 하기 반응도 4에 도시하였다.

반응도 4

아미드 형성의 전형적인 과정: 화합물 10 (53 mg, 0.054 mmol)을 DCM (4 ml)에 녹이고, 이에 적량의 트리플루오로아세트산(0.2 ml) 및 트레이틸실란(0.1 ml)을 0℃에서 가하였다. 실온에서 2시간 교반 후, 상기 혼합물을 직접 진공 농축하였다. THF내 상기 잔사 용액에 지방산 4의 p-니트로페닐 에스테르(31 mg, 1.03 equiv.) 및 촉매량의 DMAP를 첨가하였다. 이후 상기 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 아미드화의 종결을 TLC(석유에테르-EtOAc, 2:1)로 확인하였다. 상기 혼합물을 증발시키고 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(석유에테르-EtOAc-CHCl₃, 2.5:1:0.5)로 정제하여 화합물 11 (39 mg, 2 단계에 대해 58 %)을 수득하였다.

A-6: 화합물 A-6은 화합물 10이 화합물 16과 반응하여 벤질 보호된 A-6를 형성하는 것을 제외하고는 A-1 화합물에 대해 전술한 동일한 과정을 사용하여 제조된다. 이후 벤질기는 암모니아내 소듐으로 제거하여 표제 화합물 A-6를 수득한다.

A-7: 화합물 A-7은 화합물 10이 p-니트로페닐-ω-페닐헵타노에이트와 반응하여 벤질 보호된 A-7를 형성하는 것을 제외하고는 A-1 화합물에 대해 전술한 동일한 과정을 사용하여 제조된다. 이후 벤질기는 암모니아내 소듐으로 제거하여 표제 화합물 A-7를 수득한다.

p-니트로페닐-ω-페닐헵타노에이트는 1 당량의 DCC 와 5 mol % DMAP의 존재하에 디클로로메탄내 동량의 p-니트로페닐과 페닐헵탄산을 반응시켜 제조한다. 반응이 완료된 후 디사이클로헥실 유레아 침전물을 여과하고, 디클로로메탄을 진공에서 제거한다. 이후 상기 물질을 신속하게 실리카겔상의 크로마토그래피하여 정제한다.

2. 생물학적 실시예

실시예 1: 본 발명의 화합물의 생체내 투여후 방출되는 Th1- 및 Th2-타입 사이토킨의 키네틱 프로파일 결정

물질 및 방법

시험 화합물

α-GalCer (KRN7000)는 Kirin Brewery (Gumma, Japan)에 의해 합성되었다. α-C-GalCer (CRONY 101)는 Schmieg J, Yang G, Franck RW, Tsuji M. 2003, Superior protection against malaria and melanoma metastases by a C-glycoside analogue of the natural killer T cell ligand a-galactosylceramide. J Exp Med 198: 1631-1641에 기술된 대로 합성하였다.

다른 시험 합성 C-당지질은 전술한 바와 같이 합성하였다.

화합물 생체내 투여

5 내지 6 주령 암컷 C57BL/6 마우스 및 BALB/c 마우스를 Taconic사에서 구입하였다. 각 당지질은 100% DMSO내에 1mg/ml로 보관하였다. 200㎕ 멸균 인산 버퍼 식염수(PBS)에 희석한 각 당지질 1㎍을 마우스에 정맥주사하였다. 지정된 시간에 각 동물에서 혈청을 수거하고, 혈청내 IFN-γ, IL-4, 및 IL-12 농도를 효소-결합 면역흡수법(ELISA)으로 측정하였다.

효소-결합 면역흡수법(ELISA)에 의한 사이토킨 평가

혈청내 IFN-γ, IL-4, 및 IL-12 농도는 ELISA 키트 (eBioscience, San Diego, CA)를 사용하여 평가하였다. 간략하게 설명하면, 96 웰의 평면 바닥 ELISA 플레이트(NUNC)를 제조자 지시에 따라 포획 항체로 코팅하고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 PBS + 0.05% 트윈 20 (PBS-T)으로 세척한 후, 제조자 제공 차단 용액과 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하여 비-특이적 반응 부위를 차단하였다. PBS-T로 세척한 후, 1:10으로 희석된 혈청을 웰에 가하고 실온에서 2시간 인큐베이션하였다. 이후 플레이트를 실온에서 한시간 동안 비오틴화된 검출 항체와 인큐베이션하고, 세척한 후, 말 라디시 퍼옥시다제(HRP) 콘쥬게이트된 아비딘과 30분 동안 실온에서 인큐베이션하고, 세척한 후 최종적으로 실온에서 10분간 암소에서 테트라메틸벤지딘 기질과 인큐베이션하였다. 항체, 아비딘-HRP, 및 기질 용액을 모두 제조자 지시에 따라 희석하였다. 2.0N 황산으로 반응을 중지시키고, 각 웰내 사이토킨 농도를 기지 표준물질과 450 nm에서의 흡광도를 비교하여 결정하였다.

결과

Th1- 및 Th2-타입 사이토킨 수준은 두개의 상이한 유전적 배경, 즉 C57BL/6 마우스 및 BALB/c 마우스에 대해 결정되었다. 하기 화합물들을 투여하였다: A= 화합물(A-1 트랜스-구조체), B= 화합물 (A-2), C= 화합물 (A-3), D= 화합물 (A-4), E= 화합물 (A-5), Z= 대조 (PBS 단독), CRONY=α-C-GalCer, KRN=α-GalCer, GCK109 (A-1 트랜스-구조체), GCK151 (A-1 시스-구조체), GCK152 (A-7). 사이토킨 수준은 화합물 투여 0, 2, 6, 12, 24, 48, 및 72 시간 후에 측정하였다. Th1-타입 사이토킨 IFN-γ 및 IL-12의 수준을 도 2a-2c 및 3a-3c에 각각 도시하였다. Th2-타입 사이토킨 IL-4의 수준은 도 4a-4Cc에 나타내었다. 상응값들을 하기 표 1-6에 나타내었다. 표 7은 다양한 화합물에 대한 IFN-γ/IL-4 및 IL-12/IL-4 비율을 나타낸 것이며, 이는 Th1-타입 면역 반응을 선택적으로 자극할 수 있는 능력을 나타내는 표시자로 사용될 수 있다. 도면 및 표에서 알 수 있듯이 본 발명의 테스트된 합성 C-당지질들은 α-GalCer (KRN)에 비교해 볼 때 (i) Th1-타입 사이토킨 IFN-γ 및 IL-12 모두가 상당히 고 수준으로 그리고 그 분비가 연장되었으며 (ii) Th2-타입 사이토킨 IL-4는 상당히 낮은 수준을 나타내었다. 특히 이러한 효과는 화합물 A-1 (트랜스-구조체), A-2, 및 A-5에서 현저하게 나타났다.

Th2-타입 사이토킨의 유도 없이 Th1-타입 사이토킨 IL-12을 고수준으로 선택적으로 유도하는 본 발명 화합물의 능력은 이들 화합물이 국소적이며 수지세포의 2차 활성화를 수반하는 Th1-타입 면역반응의 매우 강력하고 선택적인 자극자임을 나타낸다. 따라서 본 발명의 화합물들은 직접 사용되거나 항원보강제로 사용되었을 때 조절을 위해 Th1-타입 반응을 요구하는 다양한 질병의 치료에 매우 유용하다.

[표 1] 당지질을 BALB/c 마우스에 투여시 IFN-γ수준

[표 2] 당지질을 C57BL/6 마우스에 투여시 IFN-γ수준

[표 3] 당지질을 BALB/c 마우스에 투여시 IL-12 수준

[표 4] 당지질을 C57BL/6 마우스에 투여시 IL-12 수준

[표 5] 당지질을 BALB/c 마우스에 투여시 IL-4 수준

[표 6] 당지질을 C57BL/6 마우스에 투여시 IL-4 수준

[표 7] 테스트 당지질에 대한 IL-12/IL4 및 IFN-γ/IL-4 비율 (표 1-6의 값을 기초로 산출)

실시예 2: 본 발명의 신규한 합성 C-당지질의 말라리아 감염 및 암 전이 저해능의 결정

본 발명 합성 C-당지질 GCK109 (A-1 트랜스-구조체), GCK151 (A-1 시스-구조체) 및 GCK127 (A-2)과 대조 화합물 CRONY= α-C-GalCer 및 KRN=α-GalCer의 단일 용량을 마우스에 i.m., s.c., i.v 또는 i.p 투여하였다. 면역 후 2-8주에 화합물들의 보호 효과를 결정하였다.

말라리아에 대한 보호능을 테스트하기 위해, 감염된 모기의 절개된 침샘에서 수득한 P. yoelii 종충(sporozoite)을 챌린지(challenge)로 사용하였다. 말라리아 감염의 혈액 단계에서의 전개를 결정하기 위해 합성 C-당지질들 또는 대조 화합물로 면역된 마우스에 마우스의 꼬리 정맥에 75개의 살아있는 종충들을 정맥 주 사(i.v.)하여 챌린지하였다. 챌린지후 4일부터 챌린지후 17일 까지 매일 각 마우스에서 말초 혈액 도말 표본을 수득하여 현미경으로 혈액 단계 기생충의 존재를 검사하였다. 검사 기간 동안 하나 이상의 혈액 단계 기생충이 존재하는 경우 기생충혈증양성으로 간주하였다. 말라리아 감염의 간-단계에서의 전개를 결정하기 위해 합성 C-당지질들 또는 대조 화합물로 면역된 마우스에 마우스의 꼬리 정맥에 10,000개의 살아있는 종충들을 정맥 주사(i.v.)하여 챌린지하였다. 챌린지 결과는 40-42시간 후에 마우스의 간내 P. yoelii-특이적 18S rRNA 분자를 정량적 실시간 RT-PCR 방법에 의해 정량함으로써 결정하였으며, 상기 RT-PCR 방법은 Bruna-Romero 등., Int. J. Parasitol. 31, 1449-1502, 2001에 개시된 방법에 따라 수행되었다. 간략하게 설명하면, 추출된 RNA의 역전사후 cDNA가 생성되고 그 양을 실시간 PCR에 의해 분석하였으며, 이때 PCR은 GeneAmp 5700 시퀀스 검출 시스템(PE Applied Biosystems, Foster City, CA)을 사용하여 수행되었다. 프라이머 및 형광 프로브는 P. yoelii (17XNL) 18S rRNA 시퀀스를 사용하고 ABI 프리즘 프라이머 발현 소프트웨어(PE Biosystems)를 사용하여 디자인하였다. 예를 들면, 프라이머 5'- GGGGATTGGTTTTGACGTTTTTGCG-3'(54nM)[서열 번호: 7] 및 5'-AAGCATTAAATAAAGCGAATACATCCTTAT-3'(60 nM) [서열 번호: 8] 이 사용되며, 생성된 PCR 산물을 검출하기 위한 PCR 반응 버퍼(PE Biosystems, Foster City, CA)내 삽입된 dsDNA-특이적 염료 SYBR 그린 I과 함께 사용될 수 있다. 반응 온도 프로파일은 95℃에서 10분간, 이후 95℃에서 15초간 변성 35 사이클, 60℃에서 1분간 어닐링/연장으로 하였다. 본 분석에서 검출된 정확한 양의 기생충-유래 18S cDNA 분자는 간 샘플에서 수득된 CT값과 기지량의 플라스미드 18S cDNA로 생성된 표준 곡선에서 얻어진 값을 수용하여 선형 회귀 분석에 의해 결정하였다.

흑색종 폐 전이 전개에 대한 합성 C-당지질 또는 대조 화합물로 면역된 마우스의 보호 정도는 10% FCS 보충 DMEM에 부유시킨 5x10⁴ 동계 B16 흑색종 세포를 마우스에 정맥주사로 1차 챌린지하여 결정하였다. 챌린지 2주 후 마우스를 희생하고 폐를 적출하여 전이성 노듈수(metastatic nodules)를 Fujii et al., Natl. Immunol. 3, 867-874 (2002)에 개시된 바에 따라 계수하였다.

본 발명의 모든 합성 C-당지질들은 간 말라리아 챌린지 및 흑색종 전이에 대해 강력한 마우스 보호 활성을 나타내었다.

실시예 3　: 본 발명의 신규한 합성 C-당지질의 항원보강 활성의 결정

단일 용량의 본 발명 합성 C-당지질 GCK109 (A-1 트랜스-구조체), GCK151 (A-1 시스-구조체) 및 GCK127 (A-2)과 대조 화합물 CRONY= α-C-GalCer 및 KRN=α-GalCer 및 하위 적정용량(sub-optimal dose; 1 x 10⁷ p.f.u.)의 P. yoelii CS 단백질을 발현하는 재조합 아데노바이러스, AdPyCS (Rodrigues et al., J. Immunol., 158: 1268-1274, 1997)를 마우스에 i.m., s.c., i.v 또는 i.p 투여하였다. 면역 2 내지 8주 후, 일부 마우스들을 희생하고 비장을 적출하여 림프구를 수득한 후 말라리아-특이적 CD8+ T 세포 반응을 ELISPOT 분석으로 측정하였다. AdPyCS 단독으로 면역시킨 마우스를 대조로 사용하였다.

AdPyCS 및 합성 C-당지질, 또는 대조 화합물, 또는 대조 마우스(AdPyCS만으로 면역)에서 얻은 비장세포를 분석하여 (i) IFN-γ를 생성하는 CS-특이적 CD8⁺ T-세포(Th1 세포) 및 (ii) IL-4를 생성하는 CS-특이적 CD8⁺ T 세포 (Th2 세포)의 수를 측정하였다. CS-특이적 CD8⁺ T 세포수는 ELISPOT 분석법을 사용하여 측정되었다(Miyahira 등, J. Immunol. Methods 1995; 181: 45-54). 간략하게 설명하면, 96-웰 니트로셀룰로스 플레이트 (Millipone, Bedford, MA)를 밤새 실온에서 비오틴화 항-마우스 IFN-γ 또는 항-마우스 IL-4 단클론 항체(mAb)로 코팅하였다. PBS로 수회 세척한 후, 항-마우스 IFN-γ 또는 항-마우스 IL-4 단클론 항체로 코팅된 플레이트내 배양 매질내 비장세포 단계 희석액들을 위치시키고, CD8+ 에피토프에 해당하는 펩타이드의 존재 또는 비존재하에 20-24 시간동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터내에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션후 상기 플레이트들을 PBS-T로 세척하였다. 이후 상기 플레이트들을 각각 실온에서 3시간 동안 비오틴화 항-마우스 IFN-γ 또는 항-마우스 IL-4 단클론 항체와 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 PBS-T로 세척한 후 스트렙타비딘-AP 콘쥬게이트를 가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 다시 PBS-T로 세척하고 증류수로 1회 세척한 후 원스텝 BCIP/NPT 시약으로 스폿 전개하였다. 스폿을 면역 스폿 리더(Cellular Technology Ltd., Cleveland, Ohio)로 계수하였다.

항말라리아 보호 수준은 살아있는 P. yoelii 종충들을 면역된 마우스에 정맥 주사하여 챌린지한 후 2-8주에 결정하였다. 면역되지 않은 마우스를 대조로 사용하였다.

상기 실시예 2에 전술한 바와 같이 기생충의 혈액 및 간 단계에서의 보호 수준을 측정하였다. 혈액 단계는 75개의 살아 있는 P. yoelii 종충으로 챌린지한 후 3 내지 14일간 매일 수득한 김사-염색 혈액 도말을 현미경 검사하여 모니터하였다. 간 단계는 10,000 P. yoelii 종충들로 챌린지한 후 42시간에 마우스에서 간을 적출하여 측정하였으며, 간에 있는 기생충은 실시예 2에서 전술한 바와 같이 실시간 RT-PCR에 의해 플라즈모디아 rRNA(plasmodial rRNA)을 측정하여 결정하였다.

본 발명의 모든 합성 C-당지질들은 강력한 항원보강 효과를 나타내었다.

실시예 4: 본 발명의 화합물의 실험적 인간 생체외 NKT 세포 시스템에서의 사이토킨 프로파일 결정

물질과 방법

미성숙 수지세포 (DCs) 및 CD14-PBMCs의 생성. CD14+ 세포는 항-CD14 단클론 항체가 결합된 자기 비드(Miltenyi biotec, Auburn, CA)를 사용하여 류코팩(leukopaks)에서 분리하였다. 이후 300 U/ml GM-CSF (R&D systems, Minneapolis, MN) 및 100 U/ml IL-4 (R&D systems, Minneapolis, MN) 존재하에 3일간 인큐베이션한 후 상기 CD14+ 세포에서 미성숙 수지세포(DCs)가 생성되었다. CD14- 세포들은 하기 실험에서 말초혈액단핵세포(PBMCs)로 사용되었다.

PBMCs 및 미성숙 DCs을 사용한 생체외 IFN-γ 및 IL-4 ELISA 분석. 3000 rads로 조사한 후, 5 x 10⁴ 미성숙 수지세포를 10 ng/ml의 다양한 당지질의 존재하에 (즉 GCK109 [A-1 트랜스-구조체], GCK151 [A-1 시스-구조체], GCK127 [A-2], GCK152 [A-7], 및 대조 화합물 CRONY=α-C-CalCer 및 KRN=α-GalCer), 96-웰 플레이트내에서 5 x 10⁵의 동계 CD14- PBMCs와 공-배양하였다. 18시간 동안 배양한 후 배양 상등액내 IFN-γ 또는 IL-4 농도를 제조자 지시에 따라 ELISA (BD Pharmingen, San Diego, CA)법으로 측정하였다.

PBMCs 및 미성숙 DCs을 사용한 생체외 IFN-γ 및 IL-4 ELISPOT 분석. 96 웰 니트로셀룰로스 플래이트(Milititer HA, Millipore)를 75㎕ PBS에 함유된 10㎍/ml의 항-인간 인터페론 γ mAb (Mabtech, OH)로 코팅하였다. 실온에서 밤새 인큐베이션한 후 상기 웰을 반복적으로 세척하고 배양 매질로 1시간 동안 37℃에서 차단하였다. 3000 rads로 조사한 후, 5 x 10⁴ 미성숙 수지세포를 100 ng/ml의 다양한 당지질의 존재하에 (즉 GCK109 [A-1 트랜스-구조체], GCK151 [A-1 시스-구조체], GCK127 [A-2], GCK152 [A-7], 및 대조 화합물 CRONY=α-C-CalCer 및 KRN=α-GalCer), ELISPOT 플레이트내에서 5 x 10⁵의 동계 CD14- PBMCs와 22-26시간 동안 37℃, 5% CO₂에서 공배양하였다. 상기 플레이트를 PBS 0.05% 트윈 20 (PBS T)로 완전히 세척한 후, PBS-T 내 1 ㎍/ml의 비오틴화 항-인간 인터페론 γ (Mabtech, OH)를 가한 후, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 PBS-T로 세척하고, 제조자 지시에 따라 희석된 100㎕의 퍼옥시다제-라벨된 스트렙타비딘(Kirkegaard & Perry Laboratories)을 가한 후 인큐베이션하였다. 인큐베이션 1시간 후 1 mg/ml의 3 3' 디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드 디하이드레이트(DAB) 플러스 5 ㎍/10 ml의 30% H₂O₂를 함유하는 50 mM 트리스 HCl pH7.5을 가하여 스폿 전개하였다. 10 내지 15분 후, IFN-γ 분비 세포에 해당하는 스폿수를 스테레오현미경을 사용하여 측정하였다. 에피토프 특이적 IL-4 형성 NKT 세포수를 측정하기 위해 항-인간 IL-4 mAbs 페어(Mabtech, OH)가 사용된 것을 제외하고는 상기와 동일한 절차를 수행하였다.

결과

ELISA 분석에서 도 5a-5b에 나타낸 바와 같이, GCK109 (A-1 트랜스-구조체), GCK151 (A-1 시스-구조체), GCK127 (A-2) 및 GCK 152 [A-7]은 미성숙 수지세포와 생체외 공배양 18시간 후 PBMCs을 활성화하여 KRN(α-GalCer)과 유사한 수준의 IFN-γ 및 IL-4을 생성하였다.

ELISPOT 분석에서 도 6a-6b에 나타낸 바와 같이 GCK151 (A-1 시스-구조체) 및 GCK152 [A-7]은 일관되게 높은 빈도의 PBMCs을 자극하여 IFN-γ 및 IL-4을 분비하게 하였고, 활성화된 PBMCs의 빈도는 KRN에 의해 자극된 것과 유사하였다. GCK109 (A-1 트랜스-구조체) 및 GCK127 (A-2) 또한 미성숙 DCs와 공배양 24시간 후에는 유사한 빈도의 PBMCs를 자극할 수 있었다.

상기 데이타는 테스트된 본 발명의 C-당지질이 한편으로는 CD1d와 다른 한 편으로는 비가변 NKT 수용체와 상호작용함을 입증한다. 이는 본 화합물이 인 비보에서 사람에게 활성임을 알려준다.

그러나 상술한 인간 생체외 세포 시스템은 다양한 화합물의 활성을 그 인 비보 성능에 대한 투사를 제공하는 방식으로 비교되는 것을 허용하지 않을 수 있다. 예를 들면 상기 생체외 세포 시스템은 화합물들의 생체내 분해의 상이한 속도 및 그 효과의 상이한 키네틱 등을 포함하는 생체내에서의 진실한 생물학적 반응에 영향을 주는 중요한 인자들을 고려하지 않는다. 또한 본 실험 시스템에서 테스트된 상호작용은 NKT 세포 및 CD1d 항원제시세포에 국한된 것이다. 생체내에서는 다른 DCs 및 NK 세포들이 IL-12 및 IFN-γ의 추가적인 방출을 저해할 것이다. 최종적으로 대조 화합물 KRN은 본 발명의 다소 지용성인 테스트 화합물보다 수성 용액에 더 잘 용해되며, 이는 대조 화합물이 생체외 세포 배양 테스트에서 더욱 생체이용적이게 하며 테스트 화합물이 더욱 연장된 효과를 가질 수 있는 생체내 상황을 반영하지 않을 수 있다.

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본 발명은 전술한 특정 실시 형태에 국한되지 않는다. 실제로 전술한 것 이외에 다양한 변경이 본 명세서의 기술과 도면에 의해 당업자에게 자명한 것으로 인식될 것이다. 이러한 변경은 본 발명의 범위에 속한다. 개시된 모든 값들은 대략적이며, 기술을 위해 제공된 것이다.

본 출원을 통해 인용된 특허, 특허출원, 간행물, 제품 설명 및 프로토콜들은 전체로서 본 발명의 참조로 포함된다.

Claims

식 (I)의 화합물 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르.

(상기 식에서,

X는 O 또는 NH이고;

Y는 -CH₂-CH₂- 또는 -CH=CH- 이며;

Y가 -CH₂-CH₂-인 경우, Q는 C₂₃-C₃₂알케닐 또는 -R¹-O-R²이고;

Y가 -CH=CH-인 경우, Q는 C₂₇-C₃₂ 알킬, C₂₃-C₃₂알케닐, -R¹-O-R², 또는 페닐로 치환된 C₆-C₈ 알킬이고;

R¹ 및 R² 는 치환 또는 비치환된 알킬 또는 알케닐기로서, R¹ 및 R² 는 모두 합해 23 내지 32 탄소 원자를 가지며;

R³ 는 -OH 또는 단당류이고 R⁴ 는 H이거나, 또는 R³ 는 H이고 R⁴ 는 -OH 또는 단당류이며; 및

R⁵ 는 수소 또는 단당류이다)
제1항에 있어서, X 는 O이고, R⁵ 는 H이며, R³ 은 OH 이고, R⁴ 는 H인 화합물.
제1항 또는 제2항에 있어서, Y는 -CH=CH-이고, 트랜스 구조인 화합물.
제3항에 있어서, Q가 -C₈H₁₆-CH=CH-C₁₈H₃₇인 화합물.
제1항 또는 제2항에 있어서, Y는 -CH=CH- 이고 Q는 C₂₇-C₂₈ 알킬 또는 C₂₈-C₃₂알케닐인화합물.
제5항에 있어서, Q 는 하나, 두개 또는 세개의 이중 결합을 갖는 C₂₈-C₃₂ 알케닐인 화합물.
제6항에 있어서, Q는 하나의 이중 결합을 갖는 C₂₈-C₃₂ 알케닐인 화합물.
제7항에 있어서, 상기 이중 결합은 카보닐기에서 7번째 탄소원자와 카보닐기 에서 12번째 탄소원자 사이에 위치하는 화합물.
제8항에 있어서, 상기 이중 결합은 카보닐기에서 7번째 탄소원자와 카보닐기에서 10번째 탄소원자 사이에 위치하는 화합물.
제9항에 있어서, 상기 이중 결합은 카보닐기에서 9번째 탄소원자와 카보닐기에서 10번째 탄소원자 사이에 위치하는 화합물.
제1항에 있어서, 하기 식의 화합물 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염.
제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서, Y가 -CH=CH-이고, Q가 -R¹-O-R²인 화합물.
제12항에 있어서, -R¹-O-R²내 O 원자가 카보닐기에서 첫번째 탄소원자 및 25번째 탄소원자 사이에 위치하는 화합물.
제13항에 있어서, -R¹-O-R²내 O 원자가 카보닐기에서 18번째 탄소원자 및 25번째 탄소원자 사이에 위치하는 화합물.
제14항에 있어서, Q가 -C₁₉H₃₈-O-C₆H₁₃인 화합물.
제1항에 있어서, 하기 식의 화합물 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염.
제1항에 있어서, 하기 식의 화합물 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염.
제1항에 있어서, 하기 식의 화합물 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염.
제1항에 있어서, 하기 식의 화합물 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염.
제1항에 있어서, 하기 식의 화합물 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 화합물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
제21항에 있어서, 항원을 추가적으로 포함하는 약학적 조성물.
제22항에 있어서, 상기 항원은 바이러스 또는 암 항원인 약학적 조성물.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 화합물 유효량을 포유류에 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서 Th1-타입 면역 반응을 선택적으로 유도하는 방법.
제24항에 있어서, 상기 화합물이 IL-12의 분비 증강을 유도하는 것인 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 화합물 유효량을 포유류에 투여하는 것을 포함하는, 질병 조절을 위해 Th1-타입 반응을 요구하는 질병을 치료하는 방법.
제26항에 있어서, 상기 질병은 감염, 암, 세포증식성 질환 및 자가면역질환으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
제27항에 있어서, 상기 질병은 감염성 비-바이러스성 질환인 방법.
제27항에 있어서, 상기 질병은 감염성 바이러스성 질환인 방법.
제29항에 있어서, 상기 질병은 HIV에 의한 감염인 방법.
제29항에 있어서, 상기 질병은 HCV에 의한 감염인 방법.
제29항에 있어서, 상기 질병은 HBV에 의한 감염인 방법.
제29항에 있어서, 상기 질병은 말라리아에 의한 감염인 방법.
제27항에 있어서, 상기 질병은 암인 방법.
제34항에 있어서, 상기 질병은 전립선암 또는 흑색종인 방법.
제26항에 있어서, 상기 질병은 천식 또는 알레르기인 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는 항원보강제와 항원으로 포유류를 면역하는 것을 포함하는, 포유류에서 항원의 면역원성을 증대하는 방법.
제37항에 있어서, 상기 항원과 항원보강제가 동시에 투여되는 방법.
제38항에서 있어서, 상기 항원이 HIV-특이적 항원인 방법.
제38항에 있어서, 상기 항원이 말라리아-특이적 항원인 방법.
식(I)의 화학물을 제조하는 방법으로서,

(상기 식에서,

X는 O 또는 NH이고;

Y는 -CH₂-CH₂- 또는 -CH=CH- 이며;

Y가 -CH₂-CH₂-인 경우, Q는 C₂₃-C₃₂알케닐 또는 -R¹-O-R²이고;

Y가 -CH=CH-인 경우, Q는 C₂₇-C₃₂ 알킬, C₂₃-C₃₂알케닐, -R¹-O-R², 또는 페닐로 치환된 C₆-C₈ 알킬이고;

R¹ 및 R² 는 치환 또는 비치환된 알킬 또는 알케닐기로서, R¹ 및 R² 는 모두 합해 23 내지 32 탄소 원자를 가지며;

R³ 는 -OH 또는 단당류이고 R⁴ 는 H이거나, 또는 R³ 는 H이고 R⁴ 는 -OH 또는 단당류이며; 및

R⁵ 는 수소 또는 단당류이다)

a) 식 (II)의 화합물을 먼저 Pg1을 제거하고, 식 (III)의 p-니트로페닐 에스테르로 처리하여 반응시키는 단계; 및

(식에서, Q는 상기에서 정의한 바와 같다)

(b) 후속하여 Pg2 및 Pg3을 탈보호하고, 임의로 사이클릭기에 인접하는 탄소-탄소 이중 결합을 수소화하여 식(I)의 화합물을 형성시키고, 임의로 단계 (b)의 화합물을 그 약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르로 전환시키는 단계를 포함하는 제조방법.
제41항에 있어서, 상기 식 (II)의 화합물은

인 방법.
하기 식의 화합물 및 그 약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르.
하기 식의 화합물 및 그 약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르.
하기 식의 화합물 및 그 약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르.
하기 식의 화합물 및 그 약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르.