KR20090032148A - 근육량을 증가시키기 위한 폴리스타틴의 용도 - Google Patents

근육량을 증가시키기 위한 폴리스타틴의 용도 Download PDF

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KR20090032148A
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KR1020097005537A
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이세진
알렉산드라 씨. 맥퍼런
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더 존스 홉킨스 유니버시티
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Abstract

본 발명은 GDF-8(마이오스타틴) 수용체를 비롯하여 실질적으로 정제된 성장분화인자(GDF) 수용체, 및 이의 기능성 펩타이드 부분을 제공한다. 또한, 본 발명은 GDF 수용체의 실효성 있는 대표물이나 이의 기능성 펩타이드 부분을 제공한다. 본 발명은 또한 세포에서 마이오스타틴 시그널 도입에 영향을 미치는 제제와 세포를 접촉시켜 세포에 미치는 마이오스타틴의 효과를 조절하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 피검체 내의 근육 또는 지방 조직의 이상 함량, 발달 또는 대사 활성을 적어도 부분적인 특징으로 하는 병리학적 증상의 정도를, 상기 피검체의 근육 세포 또는 지방조직 세포내의 마이오스타틴 시그널 도입을 조절함으로써 경감시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 진핵 유기체에 대한 마이오스타틴 시그널 도입에 영향을 미치는 제제를 투여함으로써 진핵 유기체 내의 근조직 또는 지방 조직의 성장을 조절하는 방법을 제공한다.
폴리스타틴, 성장 분화 인자, 마이오스타틴, 근조직, 지방 조직

Description

근육량을 증가시키기 위한 폴리스타틴의 용도{USE OF FOLLISTATIN TO INCREASE MUSCLE MASS}
본 발명은 포괄적으로 성장 분화 인자(GDF) 수용체, 보다 상세하게는 GDF-8(마이오스타틴) 수용체, 세포내 마이오스타틴 시그널 도입에 영향을 미치는 조성물 및 이러한 조성물을 세포내 마이오스타틴 시그널 도입의 조절에 사용하는 방법에 관한 것이다.
미국에서 체중을 감소시키고자 하는 개인의 의지에 따라 해마다 소비되는 시간, 노력 및 금전의 양은 경이적이다. 이러한 개인들 대부분의 목표는 단지 보기 좋아지려는 것 뿐만 아니라, 보다 중요하게는 과체중과 관련된 필연적인 의학적 문제점을 피하는 것이다.
미국내 성인의 절반 이상은 과체중인 것으로 생각된다. 또한, 미국내 성인 남성의 20 내지 30%와 성인 여성의 30 내지 40%는 지나치게 살찐 것으로 간주되고 있고, 빈민과 소수집단에서 가장 높은 비율이 나타나고 있다. 비만과다증의 평균 수준 보다 최소 약 20% 이상인 것으로 정의되는 비만증은 과거 수십년 동안 우세하게 급격히 증가하였고, 소아 집단에서 주요 문제가 되고 있다. 현재, 전 아동의 20%가 과체중으로 간주되고 있고, 이 수는 과거 5년 동안 2배가 늘어난 숫자이다.
비만증과 이를 직접적인 원인으로 하는 의학적 문제들은 전세계적으로 질병률과 사망률의 주요 원인이 되고 있다. 비만증은 각종 병리적 증상, 예컨대 죽상경화증, 고혈압, 심장 발작, II형 당뇨병, 담낭 질환 및 특정 암을 발생시키는 주요 위험 요인으로서, 조기 사망에 기여한다. 심장 질환은 미국에서 사망률의 주요 원인이고, II형 당뇨병은 미국내 1600만명 이상이 앓고 있는 질병에 의한 주요 사망 원인 중 하나이다.
II형 당뇨병의 80% 이상은 비만인 사람에게서 나타난다. II형 당뇨병은 모든 인종이 걸리는 것이지만, 특히 아메리칸 인디안, 미국흑인 및 라틴 아메리카인에게 많이 나타난다. 중요한 것은, 40세 이상의 성인에게서 거의 독점적으로 나타났던 II형 당뇨병이 현재는 아동에서도 나타나고, 이의 보고된 증례는 과거 5년 동안 거의 3배에 달하고 있다. 비인슐린 의존성 당뇨병이라고도 불리는 II형 당뇨병은 일반적으로 혈행내 인슐린 농도가 정상이거나 상승되지만, 글루코스에 대한 반응 시의 인슐린 분비의 감소와 인슐린 작용에 대한 신체 저항성을 특징으로 한다. II형 당뇨병은 각종 여러 조직과 기관의 기능에 영향을 미쳐, 혈관 질환, 신부전, 신장병 및 신경병을 일으킬 수 있다.
비만증과 관련된 의학적 문제와 대조적으로, 특정 만성 질환 환자에게서 일반적으로 나타나는 심각한 체중 감소 역시 의학적 개입에 있어서 도전해볼 만한 일이다. 악액질이라고도 하는 이러한 체중 감소의 분자적 기본에 대해서는 아직 명확하게 규명된 것이 없다. 하지만 분명한 것은, 악액질이 상기 질환의 치료를 어렵게 하고, 그 환자들의 예후를 불량하게 만든다는 점이다. 악액질의 영향은 암 환자 및 AIDS 환자에서 나타나는 소모증후군에서 분명하게 나타난다.
체중 조절에 관여하는 생물학적 과정을 해명하기 위하여 상당한 노력이 기울여져 왔지만, 실제 가치 보다 더 과장된 결과만이 얻어졌다. 예를 들어, 인간의 지방 축적에 관여하는 분자적 기본을 이해하기 위한 돌파구이며, 이와 함께 비만증 치료의 희망으로서 렙틴의 발견이 인정받은 바 있다. 동물 연구에서는 렙틴이 식욕을 조절하는 내인성 시그널을 전달하는데 관여하는 것으로 나타나서, 렙틴이 비만증에 걸린 인간을 치료하는데 유용하게 사용할 수 있을 것으로 제안되었다. 하지만, 비만증을 치료하기 위해 렙틴을 사용하는 연구는 그 진행상황이 느려서 지금까지 렙틴에 대한 초기의 기대에 미치지 못하고 있다.
현재 병적 비만증 환자의 치료는 장의 일부를 제거하는 수술을 하여 식품( 및 열량)의 흡수량을 감소시키는 방법에 한정되어 있다. 중간정도의 비만증 환자의 경우에 유일한 "치료"는 건강식을 먹고 규칙적으로 운동하는 것이며, 이 방법은 잘하면 적당히 성공을 거두는 것으로 입증되어 있다. 따라서, 비만증과 악액질과 같은 질병을 치료하는 방법이 개발될 수 있도록 근육 발달 및 지방 축적을 비롯한 체중 조절에 관여하는 생물학적 요인의 동정이 요구된다. 이에, 본 발명은 이러한 요구를 충족시키면서 추가의 잇점을 제공하고자 한다.
발명의 개요
본 발명은 실질적으로 정제된 GDF 수용체에 관한 것이다. 본 발명의 GDF 수용체는 예를 들어, 마이오스타틴 수용체, GDF-11 수용체 또는 다른 GDF 수용체일 수 있다. 예를 들어, 마이오스타틴 수용체는 최소한 마이오스타틴과 특이적으로 상호작용할 뿐만 아니라, 추가적으로 하나 또는 몇몇 성숙 GDF 펩타이드와도 특이적으로 상호작용할 수 있다. 또한, 본 발명은 GDF 수용체를 암호하는 폴리뉴클레오타이드, GDF 수용체와 특이적으로 상호작용하는 항체 등도 제공한다.
또한, 본 발명은 GDF가 작용하는 시그널 도입에 영향을 미쳐 GDF의 효과를 조절하는 방법에 관한 것이다. 그 예로서, 세포내 마이오스타틴 시그널 도입에 영향을 미치는 제제와 세포를 접촉시켜 세포에 미치는 마이오스타틴의 효과를 조절하는 방법을 제공한다. 일 구체예로서, 제제는 그 세포에 의해 발현된 마이오스타틴 수용체와 마이오스타틴의 특이적 상호작용을 변화시켜 세포내 마이오스타틴 시그널 도입을 조절한다. 마이오스타틴 수용체는 액티빈 수용체이거나 또는 마이오스타틴 시그널 도입이 활성화되도록 성숙 마이오스타틴이나 이의 기능성 펩타이드 부분이 접촉할 수 있는 임의의 다른 수용체일 수 있다. 다른 구체예로서, 제제는 마이오스타틴 수용체에 결합하여, 수용체에 대한 마이오스타틴의 결합성을 향상시키거나 수용체에 대하여 마이오스타틴과 경쟁하기도 한다. 이 제제 그 자체는 마이오스타틴 시그널 도입을 증가시키거나, 또는 마이오스타틴 시그널 도입을 감소 또는 억제할 수 있다. 또 다른 구체예로서, 제제는 세포내의 마이오스타틴 시그널 도입을 변화시키기 위해 세포내적으로 작용하는 것이다.
세포내 GDF 시그널 도입을 조절하는데 유용한 제제는 펩타이드, 펩타이드모방체(peptidomimetic), 폴리뉴클레오타이드, 작은 유기 분자, 또는 다른 모든 제제일 수 있고, GDF 시그널 도입의 작용제(agonist) 또는 GDF 시그널 도입의 길항제(antagonist)로서 작용할 수 있다. 일 구체예로서, 펩타이드 제제는 마이오스타틴 수용체와 마이오스타틴의 특이적 상호작용을 변화시킨다. 이와 같은 펩타이드 제제는 예를 들어 마이오스타틴에 결합하거나 그렇지 않으면 마이오스타틴을 격리시켜, 그 수용체와 특이적 상호작용을 하는 마이오스타틴의 성질에 영향을 미친다. 이러한 제제의 예로는 돌연변이 마이오스타틴 수용체, 예컨대 마이오스타틴과 특이적으로 상호작용할 수 있는 마이오스타틴 수용체의 가용성 세포외 도메인; 마이오스타틴과 특이적으로 상호작용할 수 있는 마이오스타틴 프로도메인; 및 프로도메인과 성숙 마이오스타틴으로의 단백분해성 절단에 저항성이 있고 마이오스타틴과 특이적으로 상호작용할 수 있는 돌연변이 마이오스타틴 폴리펩타이드가 있으며, 이들은 세포내에서 마이오스타틴 시그널 도입을 감소 또는 억제하는 마이오스타틴 시그널 도입 길항제로서 유용하게 사용될 수 있다.
다른 구체예로서, 펩타이드 제제는 세포에 의해 발현된 마이오스타틴 수용체와 특이적으로 상호작용할 수 있어, 그 수용체에 대하여 마이오스타틴과 경쟁한다. 이와 같은 펩타이드 제제의 예로는 항마이오스타틴 수용체 항체 또는 항마이오스타틴 항체의 항유전자형(anti-idiotypic) 항체가 있다. 이와 같은 펩타이드 제제는 마이오스타틴과 특이적으로 상호작용하여 그 수용체에 대하여 마이오스타틴 수용체와 경쟁하는 성질이 있는 것 뿐만 아니라 마이오스타틴 시그널 도입을 활성화시키지 않는 성질이 있는 것으로 추가 선택할 수 있다는 장점을 더불어 제공한다. 따라서, 세포에 의해 발현된 마이오스타틴 수용체와 특이적으로 상호작용하고 마이오스타틴 의존성 시그널 도입을 활성화시키는 펩타이드 제제는 세포내 마이오스타틴 시그널 도입을 증가시키는 마이오스타틴 작동제로서 사용될 수 있는 반면, 세포에 의해 발현된 마이오스타틴 수용체와 특이적으로 상호작용하지만 마이오스타틴 시그널 도입을 활성화시키지 않는 펩타이드 제제는 세포내 마이오스타틴 시그널 도입을 감소 또는 억제하는 마이오스타틴 길항제로서 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에 유용한 제제는 또한 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 일반적으로, 폴리뉴클레오타이드는 세포 내로 도입되어 즉시 또는 전사나 해독 후 또는 둘 모두의 시점에서 그 기능을 발휘하는 것이지만, 반드시 그런 것은 아니다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 제제는 펩타이드를 암호할 수 있는데, 이 펩타이드는 세포에서 발현되어 마이오스타틴 활성을 조절한다. 이와 같이 발현된 펩타이드는 예를 들어 가용성 마이오스타틴 수용체 세포외 도메인과 같은 돌연변이 마이오스타틴 수용체; 막 부착 도메인과 작동가능하게 결합된 마이오스타틴 수용체 세포외 도메인; 또는 단백질 키나제 활성이 결실된 돌연변이 마이오스타틴 수용체일 수 있다.
또한, 폴리뉴클레오타이드 제제로부터 발현된 펩타이드는 GDF 시그널 도입 경로의 세포내 폴리펩타이드 성분의 농도 또는 활성에 영향을 미치는 펩타이드일 수 있다. 이 세포내 폴리펩타이드로는 예를 들어 본원에 개시된 바와 같이 세포내 마이오스타틴 시그널 도입에 영향을 미칠 수 있는 주요 음성(negative) Smad와 같은 Smad 폴리펩타이드가 있다. 즉, 폴리뉴클레오타이드 제제는, 세포내에서 발현시 세포내 마이오스타틴 시그널 도입을 감소 또는 억제시키는 주요 음성 Smad2, Smad3 또는 Smad4 폴리펩타이드를 암호할 수 있거나; 또는 발현시 세포내 마이오스타틴 시그널 도입을 감소시키는 Smad 6 또는 Smad 7 폴리뉴클레오타이드를 암호할 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오타이드 제제는, 발현시 마이오스타틴 시그널 도입을 감소 또는 억제할 수 있는 세포내 c-ski 폴리펩타이드를 암호할 수도 있다.
본 발명의 방법에 유용한 폴리뉴클레오타이드 제제는 또한 안티센스 분자, 리보자임 또는 3본쇄화제(triplexing agent)이거나 또는 이들을 암호할 수 있다. 예를 들어, 이 폴리뉴클레오타이드는 세포내 마이오스타틴 시그널 도입을 증가시킬 수 있는 안티센스 c-ski 뉴클레오타이드 서열과 같은 안티센스 뉴클레오타이드 서열이거나(또는 이를 암호할 수 있거나); 또는 특정 Smad 안티센스 뉴클레오타이드 서열에 따라 마이오스타틴 시그널 도입을 증가시키거나 또는 마이오스타틴 시그널 도입을 감소 또는 억제시킬 수 있는 안티센스 Smad 뉴클레오타이드 서열이거나 또는 이를 암호할 수 있다.
본 발명은 또한 피검체내의 근육 또는 지방 조직의 비정상적 양, 발생 또는 대사 활성을 적어도 부분적인 특징으로 하는 병리적 증상의 중증도를 경감시키는 방법에 관한 것이다. 이와 같은 방법은 이러한 병리적 증상과 관련있는 세포내 GDF 시그널 도입을 조절하는 것, 예를 들어 피검체내의 근육 세포나 지방 조직 세포내 마이오스타틴 시그널 도입을 조절하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법을 사용하여 경감시키기 쉬운 다양한 병리적 증상으로는, 예컨대 악액질, 식욕부진, 근육 발생장애, 신경근육병과 같은 소모성 질환; 및 비만증과 II형 당뇨병 같은 대사 질환이 있다.
본 발명은 또한 GDF 수용체에 의해 매개되는 시그널 도입에 영향을 미치는 제제를 진핵 유기체에게 투여하여, 그 유기체 내의 근조직이나 지방 조직의 성장을 조절하는 방법에 관한 것이다. 일 구체예로서, 근조직이나 지방 조직의 성장을 조절하는 방법은 마이오스타틴 시그널 도입에 영향을 미치는 제제를 투여함으로써 실시한다. 다른 구체예에서, 상기 제제는 GDF-11 시그널 도입, 또는 마이오스타틴과 GDF-11 시그널 도입에 영향을 미친다. 이 제제는 예를 들어 마이오스타틴 수용체와 마이오스타틴의 특이적 상호작용을 변화시키는 제제; 마이오스타틴 수용체와 마이오스타틴의 특이적 상호작용을 감소 또는 억제시키는 제제; 또는 본 명세서에 개시된 바와 같은 임의의 다른 제제일 수 있다. 진핵 유기체는 척추동물, 예컨대 포유동물, 조류 또는 어류 유기체이거나 또는 무척추동물, 예컨대 작은 새우, 가리비, 오징어, 낙지, 달팽이 또는 민달팽이와 같은 연체동물일 수 있다.
또한, 본 발명은 성장 분화 인자(GDF) 수용체와 특이적으로 상호작용하는 제제를 동정하는 방법에 관한 것이다. 이러한 본 발명의 스크리닝 방법은 예를 들어 시험 제제와 GDF 수용체를 접촉시키는 단계 및 GDF 수용체와 특이적으로 상호작용하는 시험 제제를 측정하여 GDF 수용체와 특이적으로 상호작용하는 제제를 동정하는 단계를 통해 실시할 수 있다. 상기 GDF 수용체는 모든 GDF 수용체일 수 있고, 구체적으로 마이오스타틴 수용체일 수 있으며, 상기 제제는 GDF 시그널 도입을 증 가시키는 GDF 수용체 작용제 또는 GDF 시그널 도입을 감소 또는 억제시키는 GDF 수용체 길항제일 수 있다. 이와 같은 본 발명의 방법은 시험 제제의 라이브러리, 특히 시험 제제의 조합적 라이브러리를 스크리닝하는데 유용하다.
본 발명은 또한 GDF 수용체의 실효성 있는 대표물이나 GDF 수용체의 기능성 펩타이드 부분, 예를 들어 GDF 8 수용체 또는 GDF-11 수용체의 실효성 있는 대표물을 제공한다. 일 구체예로서, 실효성 있는 대표물은 GDF 수용체와 특이적으로 상호작용하는 제제를 포함한다. 그 자체적으로, 본 발명은 또한 컴퓨터 시스템을 사용하여 성장 분화 인자(GDF) 수용체 또는 GDF 수용체의 기능성 펩타이드 부분과 특이적으로 상호작용하는 제제를 동정하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 이 방법은 실효성 있는 GDF 수용체 또는 이의 기능성 펩타이드 부분과 특이적으로 상호작용하는 성질이 있는지에 대하여 실효성 있는 시험 제제를 테스트하는 단계; 및 이 실효성 있는 시험 제제와 실효성 있는 GDF 수용체 또는 이의 기능성 펩타이드 부분의 특이적 상호작용을 측정하여 GDF 수용체 또는 이의 기능성 펩타이드 부분과 특이적으로 상호작용하는 제제를 동정하는 단계를 통해 실시할 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 프로마이오스타틴 폴리펩타이드의 실질적으로 정제된 펩타이드 부분을 제공한다. 종래 성장 분화 인자-8(GDF-8)로 불려온 프로마이오스타틴은 아미노 말단 프로도메인과 C-말단 성숙 마이오스타틴 펩타이드를 포함한다(미국 특허 제5,827,733호 참조). 마이오스타틴의 활성은 프로마이오스타틴으로부터 절단된 후 성숙한 마이오스타틴 펩타이드에 의해 나타난다. 따라서, 프로마이오스타틴은 단백분해성 절단 후 활성 마이오스타틴을 생성하는 전구체 폴리펩타이드이다. 본 명세서에 개시한 바와 같이, 마이오스타틴 프로도메인은 마이오스타틴 활성, GDF-11 활성 또는 이 둘 모두를 억제할 수 있다.
또한, 본 발명은 프로-GDF-11 폴리펩타이드의 실질적으로 정제된 펩타이드 부분을 제공한다. 종래 일반적으로 GDF-11로 불려온 프로-GDF-11은 아미노 말단의 프로도메인과 C-말단 성숙 GDF-11 펩타이드를 포함한다(본원에 참고인용되는 국제공개번호 WO98/35019 참조). GDF-11 활성은 프로-GDF-11로부터 절단된 성숙한 GDF-11 펩타이드에 의해 실시된다. 따라서, 프로마이오스타틴과 같이 프로-GDF-11은 단백분해성 절단 후 활성 GDF-11을 생성하는 전구체 폴리펩타이드이다. 본 명세서에 개시한 바와 같이, GDF-11 프로도메인은 GDF-11 활성, 마이오스타틴 활성 또는 그 둘 모두를 억제할 수 있다.
프로마이오스타틴과 프로-GDF-11은 다양한 종류의 세포에서 증식, 분화 및 다른 기능을 조절하는 다기능 폴리펩타이드로 구성된 형질전환 성장 인자-β(TGF-β) 상과(superfamily)의 구성원이다. 배 발생 동안 다양한 분화 과정에 영향을 미치는, 구조적 관련성이 있는 일군의 단백질을 포함하는 TGF-β상과로는, 예컨대 정상적인 웅성의 성 발달에 필요한 뮬러 억제 물질(MIS)(Behringer et al., Nature 345: 167, 1990), 등배축 형성과 성충반의 형태발생에 필요한 초파리 DPP(decapentaplegic) 유전자 산물(Padgett et al., Nature 325:81-84, 1987), 알의 식물극에 위치하는 제노퍼스 Vg-1 유전자 산물(Weeks et al., Cell 51: 861- 867, 1987), 제노퍼스 배아의 중배엽과 전방 구조의 형성을 유도할 수 있는(Thomsen et al., Cell 63:485, 1990) 액티빈(Mason et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 135: 957-964, 1986) 및 새로이 연골 및 뼈 형성을 유도할 수 있는(Sampath et al., J. Biol. Chem. 265:13198, 1990) 뼈 형태발생 단백질(BMP, 오스테오제닌, OP-1)이 있다. TGF-β과의 구성원들은 지방형성, 근육발생, 연골형성, 조혈 및 상피세포 분화를 비롯한 다양한 분화 과정에 영향을 미칠 수 있다(Massague, Cell 49:437, 1987; Massague, Ann. Rev. Biochem. 67:753-791, 1998; 각각 본원에 참고인용됨).
TGF-β계의 많은 구성원들은 다른 펩타이드 성장 인자에 대하여 조절 효과(양성 또는 음성)를 나타낸다. 구체적으로, TGF-β상과의 특정 구성원들은 발현 패턴이 있거나 신경계의 기능과 관련된 활성을 갖고 있다. 예를 들어, 인히빈(inhibin)과 액티빈(activin)은 뇌에서 발현되며(Meunier et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85:247, 1988; Sawchenko et al., Nature 334:615, 1988), 액티빈은 신경 세포 생존 분자로서 작용할 수 있다(Schubert et al., Nature 344:868, 1990). 다른 구성원인 성장 분화 인자-1(GDF-1)은 그 발현 패턴이 신경계 특이적이며(Lee, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88:4250, 1991), 다른 구성원인 Vgr-1(Lyons et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86:4554, 1989; Jones et al., Development 111:531, 1991), OP-1(Ozkaynak et al., J.Biol.Chem. 267:25220, 1992) 및 BMP-4(Jones et al., Development 111:531, 1991) 역시 신경계에서 발현된다. 골격근은 운동신경세포의 생존을 촉진하는 인자(들)를 생성하기 때문에(Brown, Trends Neurosci. 7:10, 1984), 근육에서의 마이오스타틴(GDF-8)과 GDF-11의 발현은 마이오스타틴과 GDF-11이 신경세포의 영양 인자일 수 있음을 암시한다. 마이오스타틴, GDF-11 또는 이 둘 모두의 활성을 조절하는 방법 자체는 근육위축가쪽경화증이나 근육 발생장애와 같은 신경변성 질환의 치료 또는 이식 이전의 배양 세포 또는 조직의 유지에 유용할 수 있다.
TGF-β과의 단백질은 이후에 C 말단으로부터 약 110 내지 140개 아미노산인 염기성 잔기의 클러스터에서 단백분해성 절단을 일으켜 프로도메인 펩타이드와 C-말단 성숙 펩타이드를 형성시키는 대형 전구체 단백질로서 합성된다. 이러한 단백질과에 속하는 구성원들의 C-말단 성숙 펩타이드들은 구조적 관련이 있으며, 이들의 상동성 정도를 기준으로 하여 상이한 과의 구성원들을 다른 서브그룹으로 분류할 수 있다. 특정 서브그룹 내에서의 상동성은 아미노산 서열 동일성이 70% 내지 90% 범위이지만, 서브그룹 간의 상동성은 매우 낮아서, 일반적으로 20% 내지 50% 범위이다. 어떤 경우든지, 활성 종은 C-말단 펩타이드 단편의 이황화 결합 이량체인 것으로 보인다.
프로마이오스타틴과 프로-GDF-11 폴리펩타이드는 포유동물, 조류 및 어류 종들에서 동정되었고, 마이오스타틴은 다양한 다른 종, 예컨대 척추동물과 무척추동물에서도 활성을 보인다. 예를 들어, 마이오스타틴은 배 발생 동안과 성숙한 동물에서 미오겐 계통의 세포에 의해 특이적으로 발현된다(본원에 참고인용되는 McPherron et al., Nature 387:83-90, 1997). 초기 배발생 동안에 마이오스타틴은 발달하는 원체절의 근절 구획에 있는 세포에 의해 발현된다. 후기 배 단계와 성숙 한 동물에서, 마이오스타틴은 골격근 조직에서 다양하게 발현되며, 그 발현 농도는 근육마다 상당히 다르다. 마이오스타틴 발현은 또한 지방 조직에서도 검출되는데, 그 발현 농도는 근육에서보다는 낮다. 이와 마찬가지로, GDF-11은 골격근과 지방 조직은 물론 성인 흉선, 비장 및 자궁에서 발현되고, 또한 다양한 발달 단계의 뇌에서도 발현된다.
다양한 종 기원의 프로마이오스타틴 폴리펩타이드는 실질적인 서열 동일성을 공유하는데, 인간, 쥐, 래트 및 닭 성숙 마이오스타틴 C-말단 서열의 아미노산 서열은 100% 동일하다(도 1 참조). 본 명세서에 예시(도 1 참조)한 프로마이오스타틴 폴리펩타이드로는 인간 프로마이오스타틴(서열번호 2); 쥐 프로마이오스타틴(서열번호 4); 래트 프로마이오스타틴(서열번호 6); 비비 프로마이오스타틴(서열번호 10); 소 프로마이오스타틴(서열번호 12); 돼지 프로마이오스타틴(서열번호 14); 양 프로마이오스타틴(서열번호 16); 닭 프로마이오스타틴(서열번호 8); 칠면조 프로마이오스타틴(서열번호 18) 및 제브라피쉬 프로마이오스타틴(서열번호 20)이 있다. 또한, 본 명세서에 예시한 프로마이오스타틴 폴리펩타이드의 예로는 연어 대립유전자 1의 일부를 포함하는 폴리펩타이드(서열번호 27; "연어1") 및 연어 대립유전자 2의 일부를 포함하는 폴리펩타이드(서열번호 29; "연어2")가 있다(도 2 참조). 이러한 프로마이오스타틴 폴리펩타이드를 암호하는 핵산 분자는 각각 서열번호 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 7, 17, 19, 26 및 28로서 본 명세서에 개시하였다(또한, 본원에 참고인용되는 문헌 McPherron and Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12457, 1997 참조). 프로-GDF-11 폴리펩타이드는 인간 프로-GDF-11(서열번호 25)를 들어 본 명세서에 예시하였고, 이것은 서열번호 24에 의해 암호된다.
프로마이오스타틴 폴리펩타이드, 특히 인간과 어류 정도의 상이한 종 간의 상당한 보존성을 볼 때, 연어1 서열과 연어2 서열의 나머지를 비롯하여 임의의 종 유래의 마이오스타틴을 암호하는 폴리뉴클레오타이드를 수득하고, 임의의 종에서 나타나는 프로마이오스타틴 또는 마이오스타틴 발현을 동정하는 것은 통상적인 일이다. 구체적으로, 성숙한 마이오스타틴 서열은 TGF-β 상과에 속하는 다른 구성원들과 유의적인 상동성을 공유하며, 마이오스타틴은 다른 과의 구성원들 사이와 다른 종에서도 고도로 보존되는 대부분의 잔기를 함유한다. 또한, TGF-β 및 인히빈 □처럼 마이오스타틴은 거의 모든 다른 과의 구성원들에 존재하는 7개의 시스테인 잔기 외에도 여분의 시스테인 잔기 쌍을 함유한다. 마이오스타틴은 Vgr-1과 상동성이 가장 크다(45% 서열 동일성). TGF-β 상과의 다른 구성원들과 마찬가지로 마이오스타틴은 단백분해성으로 절단되어 활성 마이오스타틴 펩타이드가 되는 대형 전구체 프로마이오스타틴 폴리펩타이드로서 합성된다.
다양한 유기체의 프로마이오스타틴 폴리펩타이드를 암호하는 폴리뉴클레오타이드는 개시된 서열과의 동일성(또는 상동성)을 근거로 하여 널리 공지된 절차와 알고리즘을 사용하여 확인할 수 있다. 상동성 또는 동일성은 보통 서열분석 소프트웨어, 예컨대 제네틱스 컴퓨터 그룹(미국 위스콘신 53705 매디슨 유니버시티 애비뉴 1710 유니버시티 오브 위스콘신 바이오테크놀로지 센터)의 서열분석 소프트웨어 패키지를 사용하여 측정한다. 이러한 소프트웨어는 다양한 결실, 치환 및 다른 변형에 상동성 정도를 부여여 유사한 서열을 결합시킨다. 본 명세서에서 사용된 2종 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열과 관련하여 "상동성" 및 "동일성"이란 용어는, 임의의 수의 서열 비교 알고리즘을 사용하여 측정하거나 또는 수동 정렬 및 육안 조사로 측정함으로써 비교 창 또는 지정된 영역에 대하여 비교하여 최대 상응성으로 정렬시켰을 때 동일하거나 또는 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드의 특정 비율을 가진 2종 이상의 서열 또는 준서열을 의미한다.
서열을 비교할 때, 일반적으로 하나의 서열은 시험 서열이 비교되는 참조 서열로서의 기능을 갖는다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때에는, 시험 서열과 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요한 경우 준서열 동등물을 지정한 뒤, 서열 알고리즘 프로그램 변수를 지정한다. 디폴트 프로그램 변수를 사용하거나 또는 대안적인 변수를 지정할 수 있다. 그 다음, 서열 비교 알고리즘으로, 프로그램 변수에 근거하여 참조 서열에 대한 시험 서열의 서열 동일성 비율을 계산한다.
본원에 사용된 "비교 창"이란 용어는 포괄적으로 인접 위치의 번호중 어느 하나, 예를 들어 약 20 내지 600 번 위치, 일반적으로 약 50 내지 약 200 번 위치, 보다 일반적으로 약 100 내지 약 150 번 위치의 아미노산이나 뉴클레오타이드 위치 의 분절을 의미하는 것을 포함하는 것으로서, 동일한 번호의 인접 위치 참조 서열과 비교될 서열을 적당히 정렬시킨 후, 이 서열을 비교할 수 있다. 비교하기 위하여 서열을 정렬시키는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 비교하기 위한 서열의 적당한 정렬은 예를 들어, 스미드와 워터만(Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981)의 국소 상동성 알고리즘, 니들만과 운쉬(Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970)의 상동성 정렬 알고리즘, 퍼슨과 립 만(Person and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85:2444, 1988)의 유사성 조사 방법(상기 문헌들은 모두 본원에 참고인용됨); 이들 알고리즘의 전산화 실행(GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 미국 위스콘신 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재); 또는 수동 정렬 및 육안 조사를 통해 실시할 수 있다. 상동성이나 동일성을 측정하는 다른 알고리즘으로는 예를 들어 BLAST 프로그램(Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information) 외에도, ALIGN, AMAS(Analysis of Multiply Aligned Sequences), AMPS(Protein Multiple Sequence Alignment), ASSET(Aligned Segment Statistical Evaluation Tool), BANDS, BESTSCOR, BIOSCAN(Biological Sequence Comparative Analysis Node), BLIMPS(BLocks IMProved Searcher), FASTA, Intervals & Points, BMB, CLUSTAL L, CLUSTAL W, CONSENSUS, LCONSENSUS, WCONSENSUS, 스미드-워터만 알고리즘, DARWIN, 라스베가스 알고리즘, FNAT(Forced Nucleotide Alignment Tool), 프레임얼라인(Framealign), 프레임서치(Framesearch), DYNAMIC, FILTER, FSAP(Fristensky Sequence Analysis Package), GAP(Global Alignment Program), GENAL, GIBBS, GenQuest, ISSC(Sensitive Sequence Comparison), LALIGN(Local Sequence Alignment), LCP(Local Content Program), MACAW(Multiple Alignment Construction & Analysis Workbench), MAP(Multiple Alignment Program), MBLKP, MBLKN, PIMA(Pattern-Induced Multi-sequence Alignment), SAGA(Sequence Alignment by Genetic Algorithm) 및 WHAT-IF가 있다. 이와 같은 정렬 프로그램은 또한 게놈 데 이터베이스를 탐색하여 서열이 거의 동일한 폴리뉴클레오타이드 서열을 동정하는 데에도 사용할 수 있다.
비교용의 게놈 데이터베이스는 수많은 종류가 이용가능한데, 예를 들어 인간 게놈의 상당 부분은 인간 게놈 서열결정 프로젝트(J.Roach, http://weber.u.Washington.edu/~roach/human_genome_progress 2. html)의 일부로서 이용할 수 있다. 또한, 최소한 21개의 게놈은 그 전체 서열이 분석되어 있다(예를 들어, M.제니탈륨(M. genitalium), M.잔나쉬(M. jannaschii), H.인플루엔자(H. influenzae), E.콜라이(E. Coli), 효모(S.세레비지에 ; S. cerevisiae), 및 D.멜라노가스터(D. melanogaster)). 또한, 모델 유기체, 예컨대 마우스, C.엘레강스(C. elegans) 및 아라비돕시스(Arabidopsis) 종의 게놈들의 서열 결정은 상당한 발전이 이루어져 있다. 일부 기능성 정보가 첨부된 게놈 정보를 포함하는 여러 데이터베이스는 몇몇 조직에서 보관하고 있으며, 다음과 같이 인터넷을 통해 입수할 수 있다: http://wwwtigr.org/tdb; http://www.genetics.wisc.edu; http://genome-www.stanford.edu/~ball; http://hiv-web.lanl.gov; http://www.ncbi.nlm.nih.gov; http://www.ebi.ac.uk; http://Pasteur.fr/other/biology; 및 http://www.genome.wi.mit.edu.
유용한 알고리즘의 일 예는 BLAST와 BLAST 2.0 알고리즘으로서, 본원에 참고인용된 문헌[Altschul et al. Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1977; J.Mol.Biol. 215:403-410, 1990]에 기술되어 있다. BLAST 분석을 수행하는 소프트웨어는 더 내쇼날 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이 션(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)으로부터 누구나 이용할 수 있다. 이 알고리즘은 먼저 데이터베이스 서열 중에서 길이가 동일한 워드(word)와 함께 정렬시켰을 때 역치 스코어 T가 약간 양성 값이거나 이를 충족시키는, 길이 W의 단쇄 워드를 의문 서열(query sequence) 중에서 확인하여 고 스코어링 서열 쌍(high scoring sequence pairs ; HSP)을 동정하는 것을 수반한다. T는 이웃 워드 스코어 역치라고도 불린다(Altschul et al., 상기 문헌 참조, 1977, 1990). 이러한 최초 이웃 워드 히트(hit)는 이를 함유하는 보다 긴 HSP를 찾아내기 위한 검색을 개시할 수 있는 시드(seed)로서 작용한다. 이 워드 히트를, 누적 정렬 스코어를 상승시킬 수 있는 한, 각 서열을 따라 양방향으로 확장시킨다. 누적 스코어는 뉴클레오타이드 서열에 대하여 변수 M(한쌍의 매칭 잔기의 보상 스코어; 항상 >0)을 사용하여 계산한다. 아미노산 서열의 경우에는, 누적 스코어를 계산하기 위하여 스코어링 매트릭스를 사용한다. 각 방향에서 워드 히트의 확장은 누적 정렬 스코어가 최대 도달값에서 X 양만큼 떨어진 경우; 1개 또는 그 이상의 음성 스코어 잔기의 정렬이 축적되어서 누적 스코어가 0 또는 그 이하로 떨어진 경우; 또는 어느 한 서열의 말단에 도달한 경우에는 중지시킨다. BLAST 알고리즘 변수 W, T 및 X는 정렬 속도와 민감도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오타이드 서열의 경우)은 디폴트 값으로서 워드길이(W) 11, 기대치(E) 10, M=5, N= 4를 이용하여 양 가닥을 비교한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트 값으로서 워드길이 3, 기대치(E) 10을 이용하고, BLOSUM62 스코어링 매트릭스(Henikoff and Henikoff, Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 89:10915, 1989)는 정렬값(B) 50, 기대치(E) 10, M=5, N= -4를 이용하여 양가닥을 비교한다.
또한, BLAST 알고리즘은 두 서열 사이의 유사도를 통계적으로 분석한다[예컨대, 본원에 참고인용되는 문헌(Karlin and Altschul, Proc.Natl.Acad.Sci., USA 90:5873, 1993) 참조]. BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 1가지 유사도 측정법은 최소 합계 확률(P(N))이며, 이것은 2개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 사이에 우연히 매치될 수 있는 확률을 표시한다. 예를 들어, 시험 핵산과 참조 핵산을 비교하여 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우에, 그 핵산은 참조 서열과 유사한 것으로 간주한다.
일 구체예에서, 단백질과 핵산 서열의 상동성은 기본 국소 정렬 검색 도구(Basic Local Alignment Search Tool, "BLAST")를 사용하여 평가한다. 구체적으로, 5가지 특정 BLAST 프로그램을 사용하여 다음과 같은 과제를 실시한다:
(1) BLASTP 및 BLAST3을 사용하여 단백질 서열 데이터베이스와 아미노산 의문 서열을 비교한다;
(2) BLASTN을 사용하여 뉴클레오타이드 서열 데이터베이스와 뉴클레오타이드 의문 서열을 비교한다;
(3) BLASTX를 사용하여 단백질 서열 데이터베이스와 뉴클레오타이드 의문 서열(양 가닥)의 6개 프레임 추정 해독 산물을 비교한다;
(4) TBLASTN을 사용하여 총 6개 리딩 프레임(양 가닥)에서 해독된 뉴클레오타이드 서열 데이터베이스와 의문 단백질 서열을 비교한다;
(5) TBLASTX를 사용하여 뉴클레오타이드 서열 데이터베이스의 6개 프레임 해독 서열과 의문 뉴클레오타이드 서열의 6개 프레임 해독 서열을 비교한다.
BLAST 프로그램은 의문의 아미노산이나 핵산 서열과 시험 서열, 바람직하게는 단백질이나 핵산 서열 데이터베이스에서 입수한 서열 사이에서 유사 분절(본 명세서에서, "고 스코어링 분절 쌍"이라고도 지칭함)을 확인하여 상동성 서열을 동정한다. 고 스코어링 분절 쌍은 당해 기술분야에 공지되어 있는 다양한 스코어링 매트릭스를 사용하여 동정(즉, 정렬)하는 것이 바람직하다. 특히, 스코어링 매트릭스는 BLOSUM62 매트릭스를 사용하는 것이 바람직하다(Gonnet et al., Science 256:1443-1445, 1992; Henikoff and Henikoff, Proteins 17:49-61, 1993, 본원에 참고인용됨). 이 보다 바람직하지는 않지만, PAM 또는 PAM250 매트릭스를 또한 사용할 수도 있다(Schwartz and Dayhoff, eds., "Matrices for Detecting Distance Relastionships: Atlas of Protein Sequence and Structure"(Washington, National Biomedical Research Foundation 1978)). BLAST 프로그램은 미국국립의학도서관, 예컨대 www.ncbi.nlm.nih.gov를 통해 입수할 수 있다.
상기 알고리즘에 사용된 변수들은 조사된 서열 길이와 상동성 정도에 따라 조정될 수 있다. 일부 구체예에서, 변수는 사용자의 지침사항이 없이 각 알고리즘에서 사용되는 디폴트 변수일 수 있다.
프로마이오스타틴을 암호하는 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어, 마우스, 래트, 소, 돼지, 인간, 닭, 칠면조, 제브라피쉬, 연어, 핀피쉬, 다른 수생 유기체 및 다른 종을 비롯하여, 임의의 유기체에서 유래하는 것일 수 있다. 수생 유기체의 예 로는 피시나(Piscina) 강에 속하는 것, 예컨대 송어, 곤들매기류, 아유(ayu), 잉어, 중어, 금붕어, 잉어과 민물고기(roach), 뱅어, 뱀장어, 붕장어, 정어리, 날치, 농어과 식용어(sea bass), 감성돔과 식용어(sea bream), 패롯 바스, 도미류, 고등어, 다랑어, 참치, 가다랭이, 방어류, 볼락, 플루크, 혀가자미, 가자미목, 복어류, 쥐치; 두족류 강에 속하는 것, 예를 들어, 오징어, 뼈오징어,낙지; 부족류 강에 속하는 것, 예를 들어, 대합조개(예, 경갑류, 마닐라, 대합류조개(Quahog), 서프(Surf), 연갑류); 새조개, 홍합, 수주고둥; 가리비(예, 바다, 만, 칼루); 소라류, 뱀장어, 해삼; 피조개; 굴(예, C.버지니카(C. virginica), 걸프, 뉴질랜드, 태평양); 복족류 강에 속하는 것, 예를 들어 터번 조가비, 전복(예, 녹색, 핑크, 적색); 갑각류 강에 속하는 것, 예컨대 바다가재, 비제한적으로 대하, 락(Rock) 및 아메리칸(American) 바다가재; 참새우류; 작은새우, 예컨대, 비제한적으로 M.로젠버지(M. rosenbergii), P.스틸롤(P. styllrolls), P.인디커스(P. indicus), P.제포니오스(P. jeponious), P.모노돈(P. monodon), P.반네멜(P. vannemel), M.엔시스(M. ensis), S.멜란토(S. melantho), N.노르베지어스(N. norvegious), 냉수 새우; 게, 예컨대, 비제한적으로 블루(Blue), 룩(rook), 스톤(stone), 킹, 퀸, 스노우(snow), 갈색, 식용게, 요나(Jonah), 망그로브(Mangrove), 연갑성 게; 갯가재, 크릴새우, 랑고스티노스(langostinos); 가재, 예컨대, 비제한적으로, 블루, 마론(Marron), 레드 크로우(Red Claw), 레드 스웜프(Red Swamp), 연갑성 가재, 백색 가재; 환형동물문; 척삭 동물문, 예컨대, 비제한적으로 악어, 거북과 같은 파충류; 양서류, 예컨대 개구리; 및 극피동물, 예컨대 비제한적으로 성게가 있다.
본 발명은 프로마이오스타틴 폴리펩타이드의 실질적으로 정제된 펩타이드 일부 및 프로-GDF-11 폴리펩타이드의 실질적으로 정제된 펩타이드 일부를 제공한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 "프로-GDF", 예컨대 프로마이오스타틴 또는 프로-GDF-11은 아미노 말단의 프로도메인과 카르복시 말단의 생물학적 활성 GDF 펩타이드를 포함하는 전장의(full-length) 폴리펩타이드를 의미한다. 또한, 프로도메인은 이 프로도메인의 아미노 말단에 있는 대략 처음 15개 내지 30개 아미노산을 포함하는 시그널 펩타이드(리더 서열)을 포함한다. 이 시그널 펩타이드는 전장의 프로-GDF 폴리펩타이드로부터 절단될 수 있고, 추가로 Arg-Xaa-Xaa-Arg(서열번호 21) 단백분해성 절단 부위에서 절단될 수도 있다.
본 명세서에 기술된 아미노산 잔기에 대한 언급은 도 1 및 2(또한, 서열목록 참조)에 도시한 바와 같은 전장의 프로-GDF 폴리펩타이드와 비교하여 이루어진 것이다. 또한, 본 명세서에서는 특정 펩타이드에 대한 언급을 "대략적인" 특정 아미노산 잔기로 시작하거나 종결되는 것으로 기술하였다. 본 명세서에서 "대략적인"이란 용어는, 특정 프로테아제가 프로-GDF 폴리펩타이드를 단백분해성 절단 인식 부위에서 절단하거나 또는 그 부위의 근접 부위에서 절단하거나 또는 그 인식 부위로부터 1개 이상의 아미노산이 떨어진 부위에서 절단할 수 있기 때문에 사용되었다. 예를 들어, 서열번호 4의 대략 1 내지 263번 아미노산 잔기 서열을 가진 마이오스타틴 프로도메인에 대한 언급 자체는, 시그널 펩타이드를 포함하고 257 내지 269 번 아미노산 잔기로 종결되는 카르복시 말단, 바람직하게는 260 내지 266 번 아미노산 잔기로 종결되는 카르복시 말단을 보유하는 프로마이오스타틴의 아미노 말단 펩타이드 일부를 포함한다.
이와 마찬가지로, 시그널 펩타이드는, 예를 들어 나머지 프로도메인의 기능에 영향을 미치지 않는 한, 프로-GDF 폴리펩타이드의 대략 15 내지 30 번 아미노산 잔기 중의 임의의 위치, 예를 들어 15, 20, 25 또는 30 번 잔기에서 절단될 수 있다. 따라서, 편의상 본원에 기술된 시그널 펩타이드가 절단된 프로-GDF 폴리펩타이드의 펩타이드 일부에 대한 언급은 일반적으로 대략 20번 아미노산 잔기에서 시작하는 것으로 이해한다. 하지만, 시그널 펩타이드의 절단은 프로-GDF 폴리펩타이드의 처음 15 내지 30 아미노 말단 아미노산 내의 임의의 아미노산 위치에서 이루어질 수 있는 것으로 이해한다. 예를 들어, 서열번호 4의 대략 20 내지 263 번 아미노산 잔기 서열을 가진 마이오스타틴 프로도메인에 대한 언급 자체는, 시그널 펩타이드를 포함하는, 프로마이오스타틴의 대략 처음 15개 내지 30개 아미노산이 결실되고 257 내지 269 번 아미노산 잔기, 바람직하게는 260 내지 266 번 아미노산 잔기에서 종결되는 카르복시 말단을 보유하는 프로마이오스타틴의 펩타이드 일부를 포함하는 것이다.
일반적으로, 본 명세서에 사용된 프로-GDF 폴리펩타이드 또는 GDF 프로도메인에 대한 언급은 대략 아미노산 1에서 시작하는 것으로 이해한다. 그러나, 이와 같이 개시된 사항에 비추어보았을때, 상기 시그널 펩타이드가 결실된 프로-GDF 폴리펩타이드 또는 GDF 프로도메인도 본 발명에 포함된다는 것은 자명한 일이다. 또한, 이러한 점에서 본 발명의 펩타이드에 시그널 펩타이드가 존재하는지 여부는 예를 들어 마이오스타틴 프로도메인과 같은 펩타이드가 통과하는 세포의 구역 및 그 펩타이드가 세포에서 분비되는 것인지를 비롯한 펩타이드의 세포내 최종 배치에 영향을 미칠 수 있다는 알 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 프로-GDF 폴리펩타이드의 실질적으로 정제된 시그널 펩타이드 일부를 제공한다. 본 명세서에 개시하였듯이, 이러한 시그널 펩타이드는 이 시그널 펩타이드의 기원인 자연발생의 GDF와 동일한 세포 구역으로 제제, 특히 펩타이드 제제를 표적화시키는데 사용할 수 있다.
"펩타이드" 또는 "펩타이드 일부"란 용어는 펩타이드 결합에 의해 결합된 2개 또는 그 이상의 아미노산을 의미하는 것으로 포괄적으로 사용하였다. 또한, 본 명세서에 사용된 "단편" 또는 "단백분해성 단편"이란 용어는 폴리펩타이드에 단백분해 반응 이후 생성될 수 있는 산물, 즉 폴리펩타이드 중의 펩타이드 결합이 절단되었을 때 생성되는 펩타이드를 의미하는 것이다. "단백분해성 단편"이란 용어가 본 명세서에서 단백분해 반응에 의해 생성될 수 있는 펩타이드를 의미하는 것으로 포괄적으로 사용되었지만, 그 단편이 반드시 단백분해 반응에 의해 생성될 필요는 없고, 단백분해성 단편과 동등한 합성 펩타이드를 생성하기 위하여 이하에 보다 상세하게 설명하는 화학합성법이나 재조합 DNA 기법을 사용하여 생성될 수도 있음을 알아야 한다. TGF-β상과의 다른 구성원들과 프로마이오스타틴의 개시된 상동성을 볼 때, 본 발명의 펩타이드는 부분적으로 종래 개시된 TGF-β상과의 구성원들에 존재하지 않는다는 점에서 특징적인 것임을 알아야 한다. 프로마이오스타틴 또는 프로-GDF-11 폴리펩타이드의 펩타이드 일부가 종래 개시된 TGF-β상과의 구성원들에 존재하는지의 여부는 전술한 컴퓨터 알고리즘을 사용하여 측정할 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 펩타이드는 적어도 약 6개의 아미노산, 보통 약 10개의 아미노산을 포함하고, 15개 또는 그 이상의 아미노산, 특히 20개 또는 그 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 "펩타이드"란 용어는 분자를 포함하는 특정 크기 또는 특정 수의 아미노산을 암시하는 것이 아니며, 본 발명의 펩타이드는 최고 수 개 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있음을 알아야 한다. 예를 들어, 전장 성숙 C-말단 마이오스타틴 펩타이드는 100개 이상의 아미노산을 포함하고, 전장의 프로도메인 펩타이드는 260개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된, "실질적으로 정제된" 또는 "실질적으로 순수한" 또는 "분리된"이란 용어는 언급된 분자, 예컨대 펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드가 자연에서는 결합된 단백질, 핵산, 지질, 탄수화물 또는 기타 물질이 비교적 없는 형태에 있음을 의미한다. 일반적으로, 실질적으로 순수한 펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 다른 분자는 샘플의 적어도 20%, 일반적으로 샘플의 적어도 약 50%, 보통 샘플의 적어도 약 80%, 특히 샘플의 약 90% 또는 95% 또는 그 이상을 차지한다. 본 발명의 펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드가 실질적으로 순수한지 여부는 공지의 방법, 예를 들어 전기영동을 실시한 후 그 특정 분자를 비교적 독립된 밴드로서 확인하는 방법 등으로 측정할 수 있다. 실질적으로 순수한 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어 그 폴리뉴클레오타이드를 클로닝하거나 또는 화학합성법이나 효소합성법으로 수득할 수 있다. 실질적으로 순수한 펩타이드는 예를 들어 화학합성법이나 단백질 정제법을 사용한 후, 단백분해반응시키고, 필요한 경우 크로마토그래피법이나 전기영동법으로 추가 정제하여 얻을 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 프로마이오스타틴이나 프로-GDF-11 서열과 비교한 뒤, 그 펩타이드의 아미노산 서열이 각각 프로마이오스타틴 또는 프로-GDF-11 폴리펩타이드 서열 안에 있는 것인지를 측정하여 확인할 수 있다. 하지만, 본 발명의 펩타이드는 프로마이오스타틴 또는 프로-GDF-11의 상응하는 아미노산 서열과 반드시 동일할 필요는 없음을 알아야 한다. 즉, 본 발명의 펩타이드는 프로마이오스타틴 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 상응할 수 있으나, 예를 들어 상응하는 L-아미노산 대신에 1개 이상의 D-아미노산을 포함하거나; 또는 1개 또는 그 이상의 아미노산 유사체, 예컨대 그 반응성 측쇄가 유도체화되거나 다르게 변형된 아미노산을 함유하여 자연발생의 서열과 상이할 수 있다. 이와 마찬가지로, 펩타이드 중의 1 또는 그 이상의 펩타이드 결합이 변형될 수도 있다. 또한, 아미노 말단이나 카르복시 말단 또는 그 양 말단에 존재하는 반응성 기가 변형될 수도 있다. 이러한 펩타이드는 예를 들어 이 펩타이드가 생물학적 환경에서 만날 수 있는 프로테아제, 산화제 또는 다른 반응성 물질에 대한 안정성이 향상되도록 변형될 수 있으며, 이에 따라 본 발명의 방법을 실시하는데 특히 유용할 수 있다. 이러한 펩타이드는 물론 펩타이드가 환경에서 활성형인 시간을 감소시키기 위해서 생물학적 환경에서의 안정성을 감소시키도록 변형될 수도 있다.
본 발명에 따른 펩타이드의 서열은 그 펩타이드 중에 1개 또는 몇 개의 아미노산 대신에 보존적 치환 아미노산을 포함시켜 프로마이오스타틴 또는 프로-GDF-11 폴리펩타이드 중의 상응하는 서열에 상대적으로 변형시킬 수도 있다. 보존적 아미노산 치환은 하나의 아미노산 잔기를 화학적 특성이 비교적 동일한 다른 아미노산 잔기로 대체하는 것, 예를 들어 이소루신, 발린, 루신 또는 메티오닌과 같은 하나의 소수성 잔기를 다른 잔기로 치환시키는 것, 또는 하나의 극성 잔기를 다른 극성 잔기로 치환시키는 것, 예를 들어 리신 대신 아르기닌으로의 치환; 또는 아스파르트산 대신 글루탐산으로의 치환; 또는 아스파라긴 대신 글루타민으로의 치환 등을 포함한다. 변형될 수 있는 프로마이오스타틴 폴리펩타이드 위치의 예는, 프로마이오스타틴 또는 마이오스타틴 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 마이오스타틴 프로도메인 및 성숙 마이오스타틴 펩타이드에 존재하는 다양한 아미노산 차이를 나타내는, 도 1을 분석함으로써 분명히 알 수 있다.
또한, 본 발명은 성장 분화 인자(GDF) 폴리펩타이드(프로-GDF 폴리펩타이드)의 실질적으로 정제된 단백분해성 단편 또는 이의 기능성 펩타이드 일부를 제공한다. 프로-GDF 폴리펩타이드의 단백분해성 단편의 예로는 프로마이오스타틴 폴리펩타이드의 단백분해성 단편 및 프로-GDF-11 폴리펩타이드의 단백분해성 단편이 있다. 본 명세서에 개시되듯이, 프로-GDF의 단백분해성 단편과 동등한 프로-GDF 폴리펩타이드의 펩타이드 일부는 화학법이나 재조합 DNA법으로 제조할 수 있다. 본 발명의 개시를 통해, 다른 GDF 폴리펩타이드의 단백분해성 단편도 쉽게 제조 및 사용될 수 있다.
일반적으로, 프로-GDF 폴리펩타이드의 단백분해성 단편에 상응하는 펩타이드의 예로는, GDF 수용체와 특이적으로 상호작용하여 GDF 시그널 도입에 영향을 미칠 수 있는 카르복시 말단(C-말단) 성숙 GDF 단편, 및 시그널 펩타이드를 포함할 수 있고 본 명세서에 개시되듯이 프로-GDF 폴리펩타이드 또는 성숙 GDF 펩타이드와 특 이적으로 상호작용하여 GDF 시그널 도입의 수행 능력에 영향을 미칠 수 있는 아미노 말단 프로도메인 단편이 있다. 예를 들어, 프로마이오스타틴 폴리펩타이드의 단백분해성 단편은, 마이오스타틴 수용체와 특이적으로 상호작용하여 마이오스타틴 시그널 도입을 유도할 수 있는 C-말단 성숙 마이오스타틴 펩타이드; 및 마이오스타틴과 특이적으로 상호작용하여 마이오스타틴 시그널 도입을 유도하는 마이오스타틴의 능력을 감소 또는 억제할 수 있는 아미노 말단 프로도메인 단편을 포함한다.
프로-GDF 폴리펩타이드의 단백분해성 단편 또는 이의 기능성 펩타이드 부분은 부분적으로 GDF 시그널 도입의 자극이나 억제와 관련된 활성이 있거나 이 활성에 영향을 미치는 것을 특징으로 한다. 예를 들어, 프로마이오스타틴 폴리펩타이드 또는 이의 기능성 펩타이드 부분은 마이오스타틴 수용체 결합 활성, 마이오스타틴 시그널 도입 자극 또는 억제 활성, 마이오스타틴 결합 활성, 프로마이오스타틴 결합 활성 또는 이의 조합 활성을 보유할 수 있다. 따라서, 프로-GDF 폴리펩타이드를 참고로 하여 본 명세서에 사용한 "기능성 펩타이드 부분"이란 용어는 수용체와 특이적으로 상호작용하여 GDF 시그널 도입을 자극 또는 억제할 수 있는 프로-GDF 폴리펩타이드의 펩타이드 부분; 성숙 GDF 또는 프로-GDF와 특이적으로 상호작용할 수 있는 프로-GDF 폴리펩타이드의 펩타이드 부분; 또는 세포 국소화 활성, 즉 시그널 펩타이드의 활성을 나타내는 프로-GDF 폴리펩타이드의 펩타이드 부분을 의미한다. 하지만, 전장의 성숙 마이오스타틴 펩타이드의 기능성 펩타이드 부분이 예를 들어 성숙 마이오스타틴과 동일한 활성, 예컨대 마이오스타틴 시그널 도입을 자극하는 능력을 가질 필요는 없는데, 그 이유는 성숙 펩타이드의 기능성 펩타이드 부분이 예를 들어 시그널 도입 경로를 활성화시키는 능력 없이 마이오스타틴 수용체와 특이적으로 상호작용하는 능력을 가질 수 있기 때문이다. 이와 같이 마이오스타틴 길항제로서 유용할 수 있는 프로-GDF 폴리펩타이드의 기능성 펩타이드 부분을 확인하는 방법은 본 명세서에 개시되어 있거나 당해 기술분야에 공지되어 있다. 즉, 일 구체예에서 프로마이오스타틴 폴리펩타이드의 기능성 펩타이드 부분은 마이오스타틴 수용체와 특이적으로 상호작용하고, 마이오스타틴 시그널 도입을 자극하는 작용제로서 또는 마이오스타틴 시그널 도입을 감소 또는 억제하는 길항제로서 작용할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 프로마이오스타틴 폴리펩타이드의 기능성 펩타이드 부분은 프로마이오스타틴 폴리펩타이드 또는 성숙한 마이오스타틴 펩타이드와 특이적으로 상호작용하여 마이오스타틴 시그널 도입을 차단시킬 수 있다. 이러한 프로마이오스타틴의 기능성 펩타이드 부분은 예를 들어 프로마이오스타틴 폴리펩타이드의 성숙한 마이오스타틴으로의 절단을 방해하거나; 성숙 마이오스타틴 펩타이드와 복합체를 형성하거나; 또는 일부 다른 기작을 통해 작용할 수 있다. 펩타이드-마이오스타틴 복합체를 형성하는 경우에는, 이 복합체가 마이오스타틴의 수용체와 특이적으로 상호작용하는 마이오스타틴의 능력을 감소 또는 억제하거나, 또는 마이오스타틴 시그널 도입을 유도하는 능력이 없는 형태로 수용체에 결합시킴으로써 마이오스타틴 시그널 도입을 차단할 수 있다.
프로-GDF 폴리펩타이드의 단백분해 단편은 콘센서스 아미노산 서열 Agr-Xaa-Xaa-Arg(서열번호 21)을 가진 단백분해성 절단 부위에서 그 폴리펩타이드를 절단함 으로써 수득할 수 있다. 이러한 단백분해성 인식 부위로는 서열번호 1(프로마이오스타틴)에 263 내지 266 번 아미노산 잔기 또는 서열번호 25(인간 프로-GDF-11; 도 2의 상대적 위치 267 내지 270 참조)에 295 내지 298 번 아미노산 잔기로 나타낸 Arg-Ser-Arg-Arg(서열번호 22) 및 서열번호 20에 263 내지 266 번 아미노산 잔기로 나타낸 Arg-Ile-Arg-Arg(서열번호 23) 서열이 있다.
프로마이오스타틴 폴리펩타이드는 시그널 서열의 단백분해성 절단 부위 외에, 예컨대 2개의 추가 잠재적 단백분해성 프로세싱 부위(Lys-Arg 및 Arg-Arg)를 함유한다. 이러한 단백분해성 프로세싱 부위는 콘센서스 Arg-Xaa-Xaa-Arg(서열번호 21) 단백분해 절단 인식 부위(예컨대, 서열번호 2의 263 내지 266 번 아미노산 잔기 참조) 내에 포함되어 있는 것으로서, 이 부위 또는 그 부근에서의 프로마이오스타틴 폴리펩타이드의 절단은 생물학적으로 활성인 C-말단 성숙 인간 마이오스타틴 단편을 생성한다. 예로 들은 전장의 성숙 마이오스타틴 펩타이드는 약 103개 내지 약 109개 아미노산을 함유하고 약 12,400 달톤(Da)의 예상 분자량을 나타낸다. 또한, 마이오스타틴은 이량체를 형성할 수 있으며, 그 예상 분자량은 약 23 내지 30 킬로달톤(Da)이다. 이 이량체는 마이오스타틴 동종이량체이거나 또는 GDF-11이나 다른 GDF 또는 TGF-β과 구성원과의 이종이량체일 수 있다.
본 발명의 단백분해성 단편의 예로는 GDF 프로도메인, 예를 들어 프로마이오스타틴 폴리펩타이드의 대략 20 내지 262 번 아미노산 잔기를 포함하는 마이오스타틴 프로도메인이나 이의 기능성 펩타이드 부분, 또는 프로-GDF-11 폴리펩타이드의 대략 20 내지 295 번 아미노산 잔기를 포함하는 GDF-11 프로도메인이나 이의 기능 성 펩타이드 부분이 있으며, 그 각각은 각 프로-GDF 폴리펩타이드의 대략 아미노산 1 내지 20을 함유하는 시그널 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 마이오스타틴 프로도메인의 또 다른 예로는 서열번호 4와 서열번호 6에 기술된 바와 같은 대략 20 내지 263 번 아미노산 잔기; 서열번호 2, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 8, 서열번호 18, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 20에 기술된 바와 같은 대략 약 20 내지 262 번 아미노산 잔기가 있으며, 이들은 상응하는 프로마이오스타틴 폴리펩타이드의 단백분해성 절단으로 생성되거나, 화학적으로 합성되거나 또는 단백분해성 단편을 암호하는 재조합 폴리뉴클레오타이드로부터 발현될 수 있다. 마이오스타틴 프로도메인의 기능성 펩타이드 부분의 예로는 마이오스타틴 또는 프로마이오스타틴과 특이적으로 상호작용할 수 있는 마이오스타틴 프로도메인의 펩타이드 부분이 있다. GDF-11 프로도메인의 예로는 서열번호 25의 대략 1 내지 20 번 아미노산 잔기를 함유하는 시그널 펩타이드를 추가로 포함할 수 있는 서열번호 25의 대략 20 내지 295 번 아미노산 잔기가 있고, GDF-11 프로도메인의 기능성 펩타이드 부분의 예로는 성숙 GDF-11 또는 프로-GDF-11 폴리펩타이드와 특이적으로 상호작용할 수 있는 GDF-11 프로도메인의 펩타이드 부분이 있다. GDF 프로도메인의 기능성 펩타이드 부분은 예를 들어 GDF가 이의 수용체와 특이적으로 상호작용하는 능력을 감소 또는 억제시키거나 또는 그 수용체를 불활성 복합체로서 결합시킴으로써, 시그널 도입을 자극하는 대응 GDF 또는 관련 GDF의 능력을 억제하는 것이 바람직하다. 일 구체예로서, 본 발명은 GDF 시그널 펩타이드, 바람직하게는 프로마이오스타틴 또는 프로-GDF-11의 대략 처음 15개 내지 30개 아미노 말단 아미노산을 각각 함유 하는 마이오스타틴 시그널 펩타이드 또는 GDF-11 시그널 펩타이드에 작동가능하게 결합된, 프로-GDF 폴리펩타이드의 기능성 단편, 특히 GDF 프로도메인의 기능성 단편을 제공한다.
본 명세서에 개시된 바와 같이, 마이오스타틴 프로도메인 또는 GDF-11 프로도메인은 성숙 마이오스타틴, GDF-11 또는 이 둘 모두와 상호작용하여, 수용체와 특이적으로 상호작용하는 성숙 GDF의 능력을 감소 또는 억제시킬 수 있다(실시예 7 및 8 참조). 즉, 마이오스타틴 프로도메인의 기능성 펩타이드 부분은 예를 들어 본 명세서에 제시된 방법들을 사용하여 마이오스타틴 프로도메인의 펩타이드 부분들을 분석한 다음, 마이오스타틴 또는 프로마이오스타틴과 특이적으로 상호작용하여 마이오스타틴 수용체와 특이적으로 상호작용하는 마이오스타틴의 능력을 감소 또는 억제시키거나 마이오스타틴 시그널 도입을 자극할 수 있는, 프로도메인의 기능성 펩타이드 부분을 동정하여 수득할 수 있다.
마이오스타틴과 특이적으로 상호작용할 수 있는, 마이오스타틴 프로도메인의 기능성 펩타이드 부분 또는 다른 GDF 프로도메인의 기능성 펩타이드 부분은 또한 특정 단백질-단백질 상호작용을 확인하는데 유용한 것으로 알려진 다양한 임의의 분석법을 사용하여 확인할 수 있다. 이러한 분석법으로는, 예를 들어 겔 전기영동법, 친화성 크로마토그래피법, 필즈와 송의 이중 하이브리드 시스템(Fields and Song, Nature 340:245-246, 1989; 미국 특허 제5,283,173호; Fearon et al., Proc.Natl.Acad.Sci., USA 89:7958-7962, 1992; Chien et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:9578-9582, 1991; Young, Biol.Reprod. 58:302-311(1998), 이 문헌들 각각은 본원에 참고인용됨), 역 이중 하이브리드 분석법(Leanna and Hannink, Nucl. Acids Res. 24:3341-3347, 1996, 본원에 참고인용됨), 억제성 트랜스액티베이터 시스템(미국 특허 제5,885,779호, 본원에 참고인용됨), 파지 디스플레이 시스템(Lowman, Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct. 26:401-424. 1997, 본원에 참고인용됨), GST/HIS 풀 다운(pull down) 분석법, 돌연 변이 오퍼레이터(WO98/01879, 본원에 참고인용됨), 단백질 모집(incruitment) 시스템(미국 특허 제5,776,689호, 본원에 참고인용됨) 및 기타 방법(예를 들어, Mathis, Clin. Chem. 41:139-147, 1995 Lam, Anticancer Drug Res. 12:145-167, 1997; Phizicky et al., Microbiol.Rev. 59:94-123, 1995; 각각 본원에 참고인용됨)이 있다.
GDF 프로도메인의 기능성 펩타이드 부분은 또한 분자 모델링법을 사용하여 확인할 수도 있다. 예를 들어, 성숙 마이오스타틴 펩타이드의 아미노산 서열을, 적당한 모델링 소프트웨어가 내장된 컴퓨터 시스템에 입력하면 마이오스타틴의 3차원 화상("가상의 마이오스타틴")을 얻을 수 있다. 또한, 상기 모델링 소프트웨어가 프로마이오스타틴 서열의 부분, 예를 들어 프로도메인의 부분을 자극할 수 있도록 프로마이오스타틴 아미노산 서열을 컴퓨터 시스템에 입력하면, 가상의 마이오스타틴과 특이적으로 상호작용할 수 있는 프로도메인의 상기 펩타이드 부분을 확인할 수 있다. 특이적 상호작용의 염기 라인(base line)은, 이러한 상호작용이 마이오스타틴의 활성을 억제하는 것으로 알려져 있는 바, 가상의 마이오스타틴과 전장의 프로마이오스타틴 프로도메인을 모델링한 뒤, 프로도메인과 "접촉"하는 가상의 마이오 스타틴 중의 아미노산 잔기를 확인하여 미리 정해 놓을 수 있다.
이중 하이브리드 분석법 및 분자 모델링 방법을 포함하는 상기 방법은 또한 본 발명에 속하는 다른 특이적 상호작용 분자를 동정하는 데에도 사용할 수 있음을 알아야 한다. 즉, 이중 하이브리드 분석법과 같은 방법은, 예를 들어 이 분석법의 하나의 결합 성분으로서 Act RIIA 또는 Act RIIB 수용체와 특이적으로 상호작용하는 마이오스타틴 펩타이드 또는 이의 펩타이드 부분을 사용하여 이 마이오스타틴 펩타이드와 특이적으로 상호작용하는 GDF 수용체를 동정함으로써, 마이오스타틴 수용체와 같은 GDF 수용체를 동정하는데 사용할 수 있다. 이와 마찬가지로, 분자 모델링 방법은 성숙 마이오스타틴과 같은 성숙 GDF 펩타이드 또는 GDF 수용체와 특이적으로 상호작용하여, GDF 또는 GDF 수용체가 매개하는 시그널 도입의 작용제 또는 길항제로서 유용하게 사용할 수 있는 제제를 동정하는데 이용할 수 있다. 이와 같은 제제로는, 예컨대 마이오스타틴 프로도메인 또는 GDF-11 프로도메인의 기능성 펩타이드 부분 또는 GDF 프로도메인의 작용을 모방하는 화학 제제일 수 있다.
본 명세서에 개시한 목적에 유용한 모델링 시스템은 예를 들어 결정학적 분석법이나 핵자기공명분석법으로 입수한 구조 정보 또는 1차 서열 정보에 근거하여 제작할 수 있다(예를 들어, Dunbrack et al., "Meeting review: the Second meeting on the Critical Assessment of Techniques for Protein Structure Prediction(CASP2) (Asilomar, California, December 13-16, 1996); Fold Des. 2(2):R27-42(1997); Fischer and Eisenberg, Protein Sci. 5:947-55, 1996; (미국 특허 제5,436,850호 참조); Havel, Prog. Biophys. Mol. Biol. 56:43-78, 1991; Lichtarge et al., J.Mol.Biol. 274:325-37, 1997; Matsumoto et al., J.Biol.Chem. 270:19524-31, 1995; Sali et al., J.Biol.Chem. 268:9023-34, 1993; Sali, Molec.Med.Today 1:270-7, 1995a; Sali, Curr. Opin. Biotechnol. 6:437-51, 1995b; Sali et al., Proteins 23:318-26, 1995c; Sali, Nature Struct.Biol. 5:1029-1032, 1998; 미국 특허 제5,933,819호; 미국 특허 제5,265,030호 참조. 각 문헌은 본원에 참고인용됨).
프로마이오스타틴 폴리펩타이드 또는 GDF 수용체의 결정 구조 대등물(coordinate)을 사용하여 그 단백질에 결합하여 단백질의 물리적 또는 생리학적 성질을 다양한 방식으로 변화시키는 화합물을 디자인할 수 있다. 이러한 단백질의 구조 대등물을 사용하여 소분자 데이터베이스를 전산으로 검색하여 그 폴리펩타이드에 결합하는 제제를 스크리닝함으로써 GDF 시그널 도입의 작용제 또는 길항제로서 작용할 수 있는 조절제 또는 결합제를 개발할 수 있다. 이와 같은 제제는 표준 방정식을 사용하는 컴퓨터 피팅 키네틱 데이터를 통해 확인할 수 있다(예를 들어, Segel, "Enzyme Kinetics"(J.Wiley & Sons, 1975), 본원에 참고인용됨).
억제제 또는 결합제를 고안하기 위하여 결정 구조 데이터를 사용하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, GDF 수용체 대등물을, 억제제가 결합된 수용체를 비롯하여 유사 수용체의 다른 이용가능한 대등물 상에 적층시키면, 억제제가 수용체와 상호작용하는 대략적인 방식을 얻을 수 있다. 추정 약물 고안에 실제 사용되는 컴퓨터 프로그램은 또한, 예컨대 성숙 마이오스타틴과 공결정된 마이오스타틴 프로도메인 사이에서 발견되는 것과 유사한 상호작용 특성을 재현하는 화합물을 동정하는데 사용될 수 있다. 이러한 특정 상호작용의 본질을 상세하게 알게 되면 결합 활성에 영향을 미치지 않고 가용성, 약물동력학 등이 변화 또는 개선된 화합물 변형체를 얻을 수 있다.
결정 구조 정보를 사용하여 제제를 고안하는데 필요한 작업을 수행하는 컴퓨터 프로그램은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 프로그램의 예로는 다음과 같은 것이 있다: Catalyst Databases™ [BioByte Master File, Derwent WDI 및 ACD와 같은 화학적 데이터베이스에 접근하는 정보 검색 프로그램]; Catalyst/HYPO™ [후보 약물의 구조로 활성의 변화를 설명하는 가설과 화합물 모델 제작]; Ludi™ [상보성 극성 기와 소수성 기를 동정하고 매치시켜 단백질 활성 부위에 적당한 분자 제공]; 및 Leapfrog™ [사용자의 제어하에 있는 변수를 이용하는 유전자 알고리즘을 사용하여 새로운 리간드를 "발달(grow)시킴"].
이러한 프로그램으로 다양한 일반용 기계를 사용하거나, 또는 보다 편리하게 그 조작을 수행하는 보다 전문화된 장치를 제작할 수 있다. 일반적으로, 적어도 하나의 프로세서, 적어도 하나의 데이터 저장 시스템(일시적 및 비일시적 기억 및/또는 저장 부품 포함), 적어도 하나의 입력 장치 및 적어도 하나의 출력 장치를 각각 포함하는 프로그램된 시스템에서 하나 이상의 컴퓨터 프로그램을 실행시킴으로써 하나의 구체예는 구현될 수 있다. 상기 프로그램은 본원에 기술된 기능을 수행하는 프로세서상에서 실행된다.
이와 같은 각각의 프로그램은 컴퓨터 시스템과 통신하기 위해 임의의 적당한 컴퓨터 언어, 예컨대 컴퓨터, 어셈블리, 고급 절차상 또는 객체 지향 프로그래밍 언어로 구현될 수 있다. 어떤 경우든지, 언어는 컴파일링 또는 해독될 언어일 수 있다. 컴퓨터 프로그램은 일반적으로 일반용 또는 전문가용의 프로그램된 컴퓨터에 의해 판독가능한 저장 매체 또는 장치, 예컨대 ROM, CD-ROM, 자기 매체 또는 광 매체 등에 저장되어, 본 명세서에 기술된 절차를 수행하기 위하여 컴퓨터가 저장 매체 또는 장치를 판독할 때 컴퓨터를 구성하고 작동시킨다. 또한, 이 시스템은 컴퓨터 프로그램으로 구성된, 컴퓨터에 의해 판독가능한 저장 매체로서 구현될 수 있는 것으로 생각되며, 이와 같이 구성된 저장 매체를 통해 컴퓨터는 본 명세서에 기술된 기능을 수행하기 위하여 특정한 소정 방식으로 작동하게 된다.
본 발명의 구체예는 시스템, 예를 들어 인터넷 본위의 시스템, 특히 본 명세서에 개시된 바와 같은 결정학적 분석이나 NMR 분석을 통해 수득한 대등물 정보 또는 아미노산이나 뉴클레오타이드 서열 정보가 저장되어 처리되는 시스템을 포함한다. 본 명세서에 사용된 "컴퓨터 시스템"이란 용어는 하드웨어 부품, 소프트웨어 구성요소 및 본 명세서에 기술된 바와 같은 대등물이나 서열을 분석하는데 사용되는 데이터 저장 부품을 의미한다. 이 컴퓨터 시스템은 일반적으로 서열 데이터를 처리하고, 이용하여 조작하는 프로세서를 포함한다. 이 프로세서는 임의의 공지된 종류의 중앙처리장치, 예컨대 인텔 코포레이션 사의 펜티엄 II 또는 펜티엄 III 프로세서이거나, 또는 이와 유사한 선(Sun), 모토롤라, 컴팩, 어드밴스드 마이크로디바이스 또는 인터내쇼날 비즈니스 머신 사의 프로세서일 수 있다.
일반적으로, 컴퓨터 시스템은 상기 프로세서와, 데이터를 저장하는 1 이상의 내부 데이터 저장 부품 및 이 데이터 저장 부품에 저장된 데이터를 검색하는 1 이 상의 데이터 검색 장치를 포함하는 일반용 시스템이다. 당업자라면 현재 이용가능한 컴퓨터 시스템 중 어느 것이 적합한 지를 쉽게 알 수 있을 것이다.
일 구체예에서, 컴퓨터 시스템은 모선을 통해 메인 메모리에 접속되고, 바람직하게는 RAM으로서 구현되는 프로세서와, 데이터가 기록된 하드 드라이브 또는 다른 컴퓨터 판독 매체와 같은 1 이상의 내부 데이터 저장 장치를 포함한다. 일부 구체예에서, 이 컴퓨터 시스템은 내부 데이터 저장 장치에 저장된 데이터를 판독하는 1 이상의 데이터 검색 장치를 추가로 포함하기도 한다.
데이터 검색 장치는 예를 들어 플로피 디스크 드라이브, 컴팩트 디스크 드라이브, 자기 테이프 드라이브 또는 원거리 데이터 저장 시스템에 접속할 수 있는 모뎀(예컨대, 인터넷을 통해)을 나타낼 수 있다. 일부 구체예에서, 내부 데이터 저장 장치는 제어 논리 및/또는 데이터가 기록되어 있는 플로피 디스크, 컴팩트 디스크, 자기 테이프 등과 같은 분리가능한 컴퓨터 판독 매체이다. 컴퓨터 시스템은 데이터 검색 장치에 삽입된 즉시 데이터 저장 부품으로부터 제어 논리 및/또는 데이터를 판독할 수 있는 적당한 소프트웨어를 포함하거나 그 소프트웨어로 프로그램된 것이 유리하다.
컴퓨터 시스템은 일반적으로 컴퓨터 사용자에게 출력을 보여주는데 사용되는 디스플레이를 포함한다. 또한, 컴퓨터 시스템은 이 컴퓨터 시스템을 중앙집중식으로 이용할 수 있도록 통신망 또는 광역 통신망을 통해 다른 컴퓨터 시스템에 연결될 수 있다.
마이오스타틴 또는 GDF 수용체와 특이적으로 상호작용하는 화학적 실재물을 동정하고자 하는 경우에는, 상기 분자와 특이적으로 상호작용하는 능력을 통해 화학적 실재물이나 단편을 스크리닝하는 여러 가지 방법 중 임의의 방법을 사용할 수 있다. 이와 같은 공정은 먼저 예를 들어 컴퓨터 스크린에서 마이오스타틴 및 마이오스타틴 프로도메인을 육안 조사함으로써 시작할 수 있다. 그 다음, 모의체로서 작용할 수 있는 화학적 실재물이나 또는 프로도메인에서 선별된 펩타이드 부분을 다양한 배향으로 배치하거나 또는 마이오스타틴의 각 결합 부위에 도킹시킬 수 있다. 도킹은 퀀타(Quanta) 및 시빌(Sybyl) 같은 소프트웨어와, 그 다음 CHARMN 및 AMBER 같은 표준 분자역학 역장을 이용하는 분자동력학과 에너지 최소화를 통해 실시할 수 있다.
전문화된 컴퓨터 프로그램은 예컨대 GDF 수용체 작용제 또는 길항제로서 유용한 화학적 실재물이나 프로도메인의 펩타이드 부분을 선별하는데 특히 유용할 수 있다. 이러한 프로그램으로는, 예컨대 GRID(Goodford, J. Med. Chem., 28:849-857, 1985; 영국 옥스퍼드에 소재하는 옥스퍼드 유니버시티에서 입수용이함); MCSS(Miranker and Karplus, Proteins: Structure. Function and Genetics 11:29-34, 1991, 미국 매사츄세츠 버링톤에 소재하는 몰리큘라 시뮬레이션스에서 입수용이함); AUTODOCK(Goodsell and Olsen, Proteins: Structure. Function, and Genetics 8:195-202, 1990, 미국 캘리포니아 라졸라에 소재하는 스크립스 리서치 인스티튜트에서 입수용이함); DOCK(Kuntz, et al., J.Mol.Biol. 161:269-288, 1982, 미국 캘리포니아 샌프란시스코에 소재하는 유니버시티 오브 캘리포니아에서 입수용이함)가 있으며, 상기 문헌 각각은 본원에 참고인용된 것이다.
선별된 적합한 펩타이드 또는 제제는 단독 화합물이나 결합제로 조립될 수 있다. 조립은 컴퓨터 스크린에서 3차원 영상을 시현하여 단편 각각에 대한 관계를 육안 조사한 뒤, 퀀타 또는 시빌과 같은 소프트웨어를 사용하여 수동으로 모델을 구성하여 수행할 수 있다. 당업자가 각각의 화학적 실재물이나 단편을 연관짓는 것을 도울 수 있는 유용한 프로그램으로는, 예컨대 CAVEAT(Bartlett et al., Special Pub., Royal Chem.Soc. 78:182-196, 1989, 미국 캘리포니아 버클리에 소재하는 유니버시티 오브 캘리포니아에서 입수용이함); 3D 데이터베이스 시스템, 예컨대 MACCS-3D(미국 캘리포니아 산 린드로에 소재하는 MDL 인포메이션 시스템스에서 입수용이함; Martin, J.Med.Chem.35:2145-2154, 1992 참조); HOOK(미국 매사츄세츠 베링톤에 소재하는 몰리큘라 시뮬레이션스에서 입수용이함)가 있으며, 상기 각 문헌들은 본원에 참고인용된 것이다.
이와 같은 특이적 상호작용 제제를 단계적 방식, 즉 전술한 바와 같이 한번에 하나의 단편 또는 화학적 실재물을 구축하거나 동정하는 방법 외에도, 제제는 텅빈 활성 부위를 사용하거나 또는 경우에 따라 예컨대 마이오스타틴과 특이적으로 상호작용하는 전장의 마이오스타틴 프로도메인에 특이적으로 상호작용하는 공지 제제의 일부 부분들을 포함시켜 전체적으로 또는 새롭게 다시 고안할 수 있다. 이와 같은 방법으로는, 예컨대 LUDI(Bohm, J.Comp.Aid.Molec.Design 6:61-78, 1992, 미국 캘리포니아 산디에고 바이오심 테크놀로지스에서 입수용이함); LEGEND(Nishibata and Itai, Tetrahedron 47:8985, 1991, 미국 매사츄세츠 베링톤에 소재하는 몰리큘라 시뮬레이션스에서 입수용이함); LeapFrog(미국 미주리 세인 트 루이스에 소재하는 트리포스 어소시에이츠에서 입수용이함); 및 코헨 등(J.Med.Chem. 33:883-894, 1990), 나비아와 무코(Navia and Murcko, Curr.Opin.Struct.Biol. 2:202-210, 1992)에 의해 기술된 것 등이 있으며, 상기 각 문헌들은 본원에 참고인용된 것이다.
전문 컴퓨터 소프트웨어는 화합물 변형 에너지 및 정전기 상호작용을 평가하는 기술분야에서 입수용이하다. 이러한 용도로 고안된 프로그램의 예로는 Gaussian 92, 개정 C(Frisch, Gaussian, Inc., 미국 펜실베니아 피츠버그 소재, 1992); AMBER, 버전 4.0(Kollman, 미국 샌프란시스코에 있는 유니버시티 오브 캘리포니아, 1994); QUANTA/CHARMM(미국 매사츄세츠 베링톤에 있는 몰리큘라 시뮬레이션스 인크, 1994); 및 Insight II/Discover(미국 캘리포니아 산디에고에 있는 바이오심 테크놀로지스 인크.)가 있다. 이러한 프로그램들은 예컨대 실리콘 그래픽스 워크스테이션(Silicon Graphics workstation), IRIS 4D/35 또는 IBM RISC/6000 워크스테이션 모델 550을 사용하여 구현될 수 있다. 다른 하드웨어 시스템과 소프트웨어 패키지도 당업자에게 공지되어 있으며, 그 속도와 처리용량은 지속적으로 변화되고 있다.
목적 분자, 예를 들어 성숙 마이오스타틴과 같은 성숙 GDF 펩타이드 또는 GDF 수용체와 특이적으로 상호작용하는 제제를 동정하기 위한 분자 모델링 방법은 본 명세서에 개시된 바와 같이 수행할 수 있다. 제1 단계로서, 표적 분자, 예컨대 마이오스타틴을 가상적으로 나타낸다. 따라서, 일 구체예에서, 본 발명은 표적 분자를 가상적으로 나타내며, 여기에서 표적 분자는 프로-GDF 폴리펩타이드, 예컨대 프로마이오스타틴; 프로-GDF 폴리펩타이드의 펩타이드 부분; GDF 수용체; 및 GDF 수용체의 관련 도메인, 예컨대 GDF 결합 도메인 중에서 선택되는 것이다. 표적 분자의 가상 표현은 시현되거나 또는 컴퓨터 시스템 기억장치에 저장될 수 있다. 이 공정은 가상 표적 분자를 포함하는 출발 상태에서 시작되어, 1 이상의 가상 시험 분자를 포함하는 데이터베이스가 컴퓨터 시스템의 기억장치에 저장되어 있는 상태로 이동한다. 전술한 바와 같이 기억장치는 RAM 또는 내부 저장 장치를 비롯하여 임의 종류의 기억장치일 수 있다.
다음으로 이 공정은 가상의 표적 분자와 특이적으로 상호작용하는 가상의 제1 시험 분자의 능력을 측정하는 단계로 이동하며, 여기에서 시험 분자 집단의 하나일 수 있는 가상의 시험 분자를 포함하는 데이터베이스는 가상의 표적 분자와 가상의 시험 분자의 상호작용을 분석하기 위해 공개된후 분석이 이루어진다. 특이적 상호작용의 측정은 컴퓨터 시스템에 내장된 소프트웨어가 수행한 계산에 근거하거나 또는 컴퓨터 시스템의 기억장치에 저장되어 적당한 때에 이용할 수 있는 소정의 특이적 상호작용과 비교하여 이루어질 수 있다.
그 다음 이 공정은 특이적 상호작용이 측정된 경우에는 가상의 시험 분자가 시현되거나 또는 컴퓨터의 제2의 데이터베이스에 저장된 상태로 이동한다. 적당한 경우에는, 이 공정을 가상의 표적 분자와 제2의 가상 시험 분자, 제3의 가상 시험 분자 등에 대해서도 필요한 만큼 반복한다.
가상의 시험 분자가 가상의 표적 분자와 특이적으로 상호작용하는 것이 측정되면, 확인된 가상의 시험 분자를 데이터베이스로부터 이동시켜 사용자에게 시현시 킬 수 있다. 이 상태는 시현된 명칭이나 구조를 갖는 분자가 입력된 제약조건 안에서 표적 분자와 특이적으로 상호작용하는 것임을 사용자에게 통지한다. 확인된 시험 분자의 명칭이 일단 사용자에게 시현되면, 이 공정을 결정 단계로 이동시켜, 보다 많은 가상의 시험 분자가 데이터베이스에 존재하거나 조사되어야 하는지를 결정한다. 데이터베이스에 더 이상의 분자가 존재하지 않는다면, 이 공정을 종료 단계에서 종결시킨다. 하지만, 데이터베이스에 시험 분자가 더 존재한다면 이 공정을 데이터베이스에 있는 다음 시험 분자로 포인터를 이동시켜 특이적 결합 활성을 조사할 수 있는 상태로 이동시킨다. 이와 같은 방식으로, 새로운 분자를 가상의 표적 분자와 특이적으로 상호작용하는 능력에 대하여 조사한다.
전술한 바와 같은 방법들은 본 발명의 청구 범위 내에서 다양한 양태로 사용될 수 있다. 즉, 이 방법들은 마이오스타틴과 특이적으로 상호작용하여, 마이오스타틴 수용체와 상호작용하는 마이오스타틴의 능력을 감소 또는 억제시키거나 또는 시그널 도입을 수행시키는 마이오스타틴의 능력에 영향을 미치는 프로마이오스타틴 프로도메인의 펩타이드 부분을 확인하는데 사용할 수 있다. 이와 마찬가지로, 이 방법들은 GDF 프로도메인의 작용을 모방하여, 마이오스타틴이나 GDF-11 시그널 도입을 감소 또는 억제시키는 작은 유기 분자를 확인하는데 사용할 수도 있다. 또한, 이 방법들은 GDF 수용체, 예컨대 Act RIIA, Act RIIB 또는 다른 GDF 수용체와 특이적으로 상호작용하여, 세포 내에서 GDF 시그널 도입을 조절할 수 있는 GDF 수용체의 작용제 또는 길항제로서 유용한 제제를 확인하는데 사용할 수도 있다. 또한, 이 방법들은 예를 들어 특정 폴리펩타이드의 보존적 구조 특성을 확인하여, 미지의 프 로-GDF 폴리펩타이드 또는 GDF 수용체를 확인하는 수단을 제공한다.
TGF-β 상과의 다른 구성원들과 마찬가지로, 활성 GDF 펩타이드는 전구체 폴리펩타이드로 발현되어, 절단된 뒤 성숙한 생물학적 활성 형태가 된다. 따라서, 또 다른 구체예로서, 프로-GDF 폴리펩타이드의 단백분해성 단편은 성숙 GDF 펩타이드이거나, 또는 전술한 바와 같이 GDF 작용제 또는 길항제 활성을 가질 수 있다면 성숙 GDF 펩타이드의 기능성 펩타이드 부분이다. 이 단백분해성 단편은 프로마이오스타틴 폴리펩타이드의 약 268 내지 374 번 아미노산 잔기(도 1 및 도 2 참조)를 포함하는 성숙 C-말단 마이오스타틴 펩타이드이거나 또는 프로-GDF-11 폴리펩타이드의 약 299 내지 407 번 아미노산 잔기를 포함하는 성숙 C-말단 GDF-11 펩타이드일 수 있다. 전장의 성숙 마이오스타틴 펩타이드는 예컨대, 서열번호 4 및 서열번호 6에 기술된 바와 같은 대략 268 내지 375 번 아미노산 잔기; 서열번호 2, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 8, 서열번호 18, 서열번호 14, 서열번호 16 및 서열번호 20에 기술된 바와 같은 대략 267 내지 374 번 아미노산 잔기; 서열번호 27의 대략 49 내지 157 번 아미노산 잔기; 및 서열번호 29의 대략 28 내지 136 번 아미노산 잔기가 있다. 전장의 성숙 GDF-11 펩타이드의 예로서는 예컨대, 서열번호 25의 대략 299 내지 407번 아미노산 잔기가 있다. 성숙 GDF 펩타이드의 기능성 펩타이드 부분은 예컨대 성숙 GDF 펩타이드의 활성에 대하여 작용제 또는 길항제 활성이 있는 성숙 마이오스타틴 또는 성숙 GDF-11의 펩타이드 부분이다. 상기 성숙 GDF 펩타이드의 활성은 그 수용체와 특이적으로 상호작용하는 능력인 것이 바람직하다.
본 명세서에 개시한 바와 같이, 성숙 마이오스타틴 펩타이드(본 명세서에서 는 일반적으로 "마이오스타틴"이라고 지칭함)는 세포 표면에서 발현된 마이오스타틴 수용체와 특이적으로 상호작용하여 마이오스타틴 시그널 도입 활성을 유도할 수 있다(실시예 7 참조). 따라서, 마이오스타틴의 기능성 펩타이드 부분은 본 명세서에 기술된 방법(실시예 7)이나 당해 기술분야에 공지된 다른 방법을 사용하여 성숙 마이오스타틴 펩타이드의 펩타이드 부분을 조사한 뒤, 세포에서 발현되는 마이오스타틴 수용체, 예컨대 액티빈 IIA형(Act RIIA) 또는 Act RIIB 수용체(Act RIIA, Cell 65:973-982, 1991; Act RIIB Cell 68:97-108, 1992, 상기 두 문헌은 모두 전체적으로 본원에 참고인용됨)와 특이적으로 상호작용하는 마이오스타틴의 기능성 펩타이드 부분을 확인하여 수득할 수 있다.
마이오스타틴 프로도메인은 마이오스타틴 시그널 도입 활성을 감소 또는 억제할 수 있다. 일 구체예에서, 마이오스타틴 프로도메인은 마이오스타틴과 특이적으로 상호작용하여 마이오스타틴 수용체와 특이적으로 상호작용하는 마이오스타틴 펩타이드의 능력을 감소 또는 억제시킬 수 있다. 본 명세서에 개시한 바와 같이, 전구체 프로마이오스타틴은 또한 마이오스타틴 수용체와 특이적으로 상호작용하는 능력이 없으며, 따라서 성숙 마이오스타틴으로 절단될 프로마이오스타틴의 능력을 감소 또는 억제시킨 프로마이오스타틴의 돌연변이는 마이오스타틴 시그널 도입을 감소 또는 억제시키는 수단을 제공한다. 따라서, 또 다른 구체예로서, 본 발명은 돌연변이 프로-GDF가 활성 성숙 GDF 펩타이드로 단백분해성 절단되는 것을 방해하는 1 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 돌연변이 프로-GDF 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명의 돌연변이 프로-GDF 폴리펩타이드는 프로-GDF 폴리펩타이드에 존재하는 콘센서스 단백분해성 절단 인식 부위 Arg-Xaa-Xaa-Arg(서열번호 21)와 같은 단백분해성 절단 부위에서의 절단에 영향을 미치는 돌연변이를 가질 수 있다. 따라서, 돌연변이는 서열번호 21의 Arg 잔기의 돌연변이로서, 이 돌연변이 프로마이오스타틴은 예를 들어 마이오스타틴 프로도메인과 성숙 마이오스타틴 펩타이드로 절단될 수 있다. 하지만, 이 돌연변이는 단백분해성 절단 부위 이외의 다른 부위에서의 돌연변이일 수 있어서, 프로-GDF 폴리펩타이드에 결합하는 프로테아제의 능력을 변화시켜 절단 부위에서 단백분해시킬 수 있다. 본 발명의 돌연변이 프로-GDF 폴리펩타이드, 예컨대 돌연변이 프로마이오스타틴 또는 돌연변이 프로-GDF-11은 마이오스타틴 또는 GDF-11에 대하여 우성의 음성 활성을 가질 수 있어서, 세포내에서 마이오스타틴 또는 GDF-11 시그널 도입을 감소시키거나 또는 억제하는데 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 전술한 바와 같은 프로마이오스타틴 폴리펩타이드 또는 돌연변이 프로마이오스타틴의 펩타이드 부분이나, 또는 프로-GDF-11 폴리펩타이드 또는 돌연변이 프로-GDF-11의 펩타이드 부분을 암호하는 실질적으로 정제된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 이하에 보다 상세하게 설명되는 바와 같이, 본 발명은 또한 마이오스타틴이 세포에 미치는 영향을 조절하기 위한 제제로서 유용한 폴리뉴클레오타이드를 제공하며, 추가로 GDF 수용체 또는 이의 기능성 펩타이드 부분을 암호하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 이러한 폴리뉴클레오타이드의 예는 이하에 제시한다. 이하의 개시 내용 자체는 본 명세서에 개시한 본 발명의 다양한 구체예 들과 관련된 것임을 알 수 있을 것이다.
본 명세서에 포괄적으로 사용된 "폴리뉴클레오타이드"란 용어는 포스포디에스테르 결합에 의해 함께 연결된 2 이상의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드의 서열을 의미한다. "폴리뉴클레오타이드"란 용어 자체는, 유전자 또는 이의 일부, cDNA, 합성 폴리데옥시리보핵산 서열 등이고, 1본쇄 또는 2본쇄일 수 있는 RNA 및 DNA는 물론, DNA/RNA 하이브리드를 포함한다. 또한, 본 명세서에 사용된 "폴리뉴클레오타이드"란 용어는 세포에서 분리할 수 있는 자연발생의 핵산 분자는 물론, 예를 들어 화학적 합성법이나 효소적 방법, 예컨대 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)으로 제조할 수 있는 합성 분자를 포함한다. 다양한 구체예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오타이드 유사체를 포함하거나 또는 포스포디에스테르 결합 이외에 다른 골격 결합(backcone bond)을 포함할 수 있다(전술한 내용 참조).
일반적으로, 폴리뉴클레오타이드를 구성하는 뉴클레오타이드들은 2'-데옥시리보스에 결합된 아데닌, 시토신, 구아닌 또는 티민과 같은 자연발생의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보스에 결합된 아데닌, 시토신, 구아닌 또는 우라실과 같은 리보뉴클레오타이드이다. 하지만, 폴리뉴클레오타이드는 비자연발생의 합성 뉴클레오타이드 또는 변형된 자연발생의 뉴클레오타이드를 비롯하여 뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수도 있다. 이러한 뉴클레오타이드 유사체는 이러한 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서 당해 기술분야에 공지되어 있고, 시판되고 있다(Lin et al., Nucl. Acids Res. 22:5220-5234(1994); Jellinek et al., Biochemistry 34:11363-11372(1995); Pagratis et al., Nature Biotechnol. 15:68-73(1997), 이 문헌들은 각각 본원에 참고인용된 것임).
폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드를 결합시키는 공유 결합은 일반적으로 포스포디에스테르 결합이다. 하지만, 공유 결합은 또한 임의의 다양한 다른 결합, 예컨대 티오디에스테르 결합, 포스포로티오에이트 결합, 펩타이드 유사 결합 또는 뉴클레오타이드를 결합시켜 합성 폴리뉴클레오타이드를 생성하는데 유용한 것으로 당해 기술분야에 공지된 임의의 다른 결합(예컨대, Tam et al., Nucl. Acids. Res. 22:977-986(1994); Ecker and Crooke, BioTechnology 13:351360(1995), 각각 본원에 참고인용됨)일 수 있다. 비자연발생의 뉴클레오타이드 유사체 또는 뉴클레오타이드나 유사체를 연결하는 결합의 도입은 폴리뉴클레오타이드가 핵산분해 활성을 포함할 수 있는 환경, 예컨대 조직 배양 배지에 노출되어야만 하거나 생존 피검체에 투여하는 경우, 이러한 변형 폴리뉴클레오타이드는 분해에 대한 감수성이 떨어지기 때문에 특히 유용할 수 있다.
자연발생의 뉴클레오타이드 및 포스포디에스테르 결합을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 화학적으로 합성하거나 또는 주형으로서 적당한 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 재조합 DNA 방법으로 생산할 수도 있다. 이에 반해, 뉴클레오타이드 유사체 또는 포스포디에스테르 결합 이외의 다른 공유 결합을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 화학적으로 합성하는 것이 일반적이다. 하지만, T7 폴리머라제와 같은 효소는 특정 유형의 뉴클레오타이드 유사체를 폴리뉴클레오타이드에 도입시킬 수 있으므로, 이러한 폴리뉴클레오타이드를 적당한 주형으로부터 재조합을 통해 생산 하는데 사용될 수 있다(Jellinek et al., 상기 문헌 참조, 1995).
폴리뉴클레오타이드가 펩타이드, 예컨대 프로마이오스타틴의 펩타이드 부분 또는 펩타이드 제제를 암호하는 경우에, 암호 서열은 일반적으로 벡터에 포함시키는데, 이 경우 상기 서열은 필요한 조직 특이적 프로모터 또는 인헨서를 포함하는 적당한 조절 인자들에 작동가능하게 결합된다. 암호된 펩타이드는 추가로 His-6 태그 등과 같은 펩타이드 태그에 작동가능하게 결합시킬 수 있는데, 이는 표적 세포에서 상기 제제의 발현을 용이하게 확인시켜준다. His-6과 같은 폴리히스티딘 태그 펩타이드는 니켈 이온, 코발트 이온 등과 같은 이가 양이온을 사용하여 측정할 수 있다. 또 다른 펩타이드 태그로는, 예컨대 항-FLAG 항체를 사용하여 검출할 수 있는 FLAG 에피토프(예컨대, Hopp et al., BioTechnology 6:1204(1988); 미국 특허 제5,011,912호, 각각 본원에 참고인용됨); 에피토프에 특이적인 항체를 사용하여 검출할 수 있는 c-myc 에피토프; 스트렙트아비딘 또는 아비딘을 사용하여 검출할 수 있는 바이오틴; 및 글루타치온을 사용하여 검출할 수 있는 글루타치온 S-트란스퍼라제가 있다. 이와 같은 태그는, 예를 들어 마이오스타틴 폴리펩타이드의 단백분해성 단편에 상응하는 실질적으로 정제된 펩타이드를 수득하고자 하는 경우에, 작동가능하게 결합된 펩타이드 또는 펩타이드 제제를 용이하게 분리시킬 수 있다는 장점을 추가로 제공할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "작동가능하게 결합된" 또는 "작동가능하게 연결된" 이란 용어는 2 이상의 분자가 단일 단위처럼 작용하여 한 분자 또는 두 분자에 의한 기능 또는 이의 조합에 의한 기능에 영향을 미치도록 2 이상의 분자를 각각에 대하 여 배치한 것을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 펩타이드를 암호하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 조절 인자에 작동가능하게 결합될 수 있는데, 이 경우에 조절 인자는 세포내에서 정상적으로 결합되어 있는 폴리뉴클레오타이드 서열에 영향을 미치는 방식과 유사하게 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 그 인자의 조절 효과를 부여한다. 또한, 제1 폴리뉴클레오타이드 암호 서열은 제2 (또는 그 이상의) 암호 서열에 작동가능하게 결합되어, 이와 같이 작동가능하게 결합된 암호 서열로부터 키메라 폴리펩타이드가 발현될 수 있다. 키메라 폴리펩타이드는 2개(또는 그 이상)의 암호된 펩타이드가 단일 폴리펩타이드로 해독되는, 즉 펩타이드 결합을 통해 공유 결합된 융합 폴리펩타이드이거나; 또는 해독시 서로 작동가능하게 결합하여 안정된 복합체를 형성할 수 있는 2개의 분리 펩타이드로 해독될 수 있다.
키메라 폴리펩타이드는 일반적으로 각 펩타이드 성분의 일부 특징 또는 전체 특징을 나타낸다. 키메라 폴리펩타이드 자체는 본 명세서에 개시된 바와 같은 본 발명의 방법들을 수행하는데 특히 유용할 수 있다. 예를 들어, 일 구체예로서 본 발명의 방법은 세포내에서 마이오스타틴 시그널 도입을 조절할 수 있다. 따라서, 키메라 폴리펩타이드의 한 펩타이드 성분이 세포 구역 국소화 도메인을 암호하고 제2 펩타이드 성분이 우성의 음성 Smad 폴리펩타이드를 암호하는 경우에, 기능성 키메라 폴리펩타이드는 세포 구역 국소화 도메인에 의해 지정된 세포 구역으로 이동하여 Smad 폴리펩타이드의 우성의 네거티브 활성을 나타내어 세포내에서 마이오스타틴 시그널 도입을 조절할 수 있다.
세포 구역화 도메인은 공지되어 있으며, 예를 들어 혈장막 국소화 도메인, 핵 국소화 시그널, 미토콘드리아막 국소화 시그널, 소포체 국소화 시그널 등이 있다(예컨대, Hancock et al., EMBO J. 10:4033-4039, 1991; Buss et al., Mol.Cell. Biol. 8:3960-3963, 1988; 미국 특허 제5,776,689호 참조, 각 문헌은 본원에 참고인용된 것임). 이와 같은 도메인은 제제를 세포의 특정 구역으로 표적화하거나 제제가 세포로부터 분비되도록 표적화하는데 유용할 수 있다. 예를 들어, Act RIIB와 같은 마이오스타틴 수용체의 키나제 도메인은 일반적으로 혈장막의 내면에 결합되어 있다. 따라서, 우성의 네거티브 마이오스타틴 수용체 키나제 도메인을 포함하는 키메라 폴리펩타이드, 예컨대 키나제 활성이 없는 우성의 네거티브 Act RIIB 수용체에 추가로 혈장막 국소화 도메인을 포함시키면, 우성의 네거티브 Act RIIB 키나제 도메인을 세포 내막에 위치시킬 수 있다.
본 명세서에 개시된 바와 같이, 프로-GDF 시그널 펩타이드는 세포 국소화 활성을 갖고 있다. 본 명세서에 사용된 "세포 국소화 활성"이란 용어는 시그널 펩타이드에 작동가능하게 결합된 펩타이드를 1 이상의 특정 세포내 구역으로 유도하거나 또는 세포로부터 그 분자의 분비를 유도하는 시그널 펩타이드의 능력을 의미한다. 프로-GDF 시그널 펩타이드 자체는 시그널 펩타이드에 작동가능하게 결합된 펩타이드 또는 다른 제제를, 거의 동일한 시그널 펩타이드를 가진 자연발현성 GDF와 동일한 세포내 구역으로 유도하는데 특히 유용할 수 있다. 또한, 시그널 펩타이드, 예컨대 프로마이오스타틴의 처음 약 15 내지 30개 아미노산을 포함하는 프로마이오스타틴 시그널 펩타이드는 작동가능하게 결합된 제제가, 자연발생의 상기 시그널 펩타이드를 함유하는 프로-GDF와 동일한 경로를 통해 세포로부터 분비되도록 유도 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법을 수행하는데 특히 유용한 제제로는 GDF 시그널 펩타이드에 작동가능하게 결합된 GDF 프로도메인 또는 이의 기능성 펩타이드 부분, 바람직하게는 프로마이오스타틴 또는 프로-GDF-11 시그널 펩타이드이다.
본 발명의 방법을 수행하는데 유용한 폴리뉴클레오타이드 제제를 비롯하여 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 표적 세포와 직접 접촉시킬 수 있다. 예를 들어, 안티센스 분자로서 유용한 올리고뉴클레오타이드, 리보자임 또는 3본쇄화제는 표적 세포와 직접 접촉시킬 수 있으며, 그 즉시 세포로 유입되어 그 기능을 발휘할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 제제는 또한 폴리펩타이드, 예컨대 마이오스타틴 수용체(또는 마이오스타틴)과 특이적으로 상호작용하여, 그 수용체와 특이적으로 상호작용하는 마이오스타틴의 능력을 변화시킬 수 있다. 이와 같은 폴리뉴클레오타이드는 물론 이 폴리뉴클레오타이드를 제조 및 확인하는 방법은 본 명세서에 개시되거나 당해 기술분야에 공지되어 있다(예컨대, O'Connel et al., Proc. Natl. Acad.Sci., USA 93:5883-5887, 1996; Tuerk and Gold, Science 249:505-510, 1990; Gold et al., Ann. Rev. Biochem. 64:763-797, 1995; 각 문헌은 본원에 참고인용됨).
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 프로마이오스타틴과 같은 프로-GDF 폴리펩타이드의 펩타이드 부분을 암호하거나, 돌연변이 프로마이오스타틴 폴리펩타이드를 암호하거나, GDF 수용체 또는 이의 기능성 펩타이드 부분을 암호하거나 또는 본 발명의 방법을 수행하는데 유용한 폴리뉴클레오타이드 제제일 수 있는 것으로서, 벡터에 포함되어, 이 폴리뉴클레오타이드를 표적 세포로 도입시키는 것과 같은 폴리 뉴클레오타이드의 조작이 용이해질 수 있다. 이 벡터는 폴리뉴클레오타이드를 유지하는데 유용한 클로닝 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드 외에 이 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는데 유용한 조절 인자를 포함하는 발현 벡터이거나 폴리뉴클레오타이드가 펩타이드를 암호하는 경우 암호된 펩타이드를 특정 세포에서 발현시키는데 유용한 조절 인자를 포함하는 발현 벡터일 수 있다. 발현 벡터는 예컨대 암호성 폴리뉴클레오타이드를 지속적으로 전사시키는데 필요한 발현 인자를 포함할 수 있거나, 또는 벡터에 클로닝하기 전에 폴리뉴클레오타이드에 조절 인자를 작동가능하게 결합시킬 수 있다.
발현 벡터(또는 폴리뉴클레오타이드)는 일반적으로 암호성 폴리뉴클레오타이드의 구성형 또는 바람직한 경우 유도형 또는 조직 특이적 또는 발달 단계 특이적 발현을 제공할 수 있는 프로모터 서열, 폴리-A 인식 서열 및 리보솜 인식 부위 또는 내부 리보솜 유입 부위, 또는 조직 특이적일 수 있는 인헨서와 같은 다른 조절 인자를 포함하거나 암호한다. 벡터는 또한 필요한 경우 원핵 또는 진핵 숙주계에서, 또는 바람직하게는 이들 모두에서 복제하는데 필요한 인자를 함유할 수 있다. 이러한 벡터로서, 플라스미드 벡터 및 바이러스 벡터, 예컨대 박테리오파지, 바큘로바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스 및 아데노 관련 바이러스 벡터 등의 벡터는 공지되어 있고, 시판되는 공급원(프로메가, 위스콘신 매디슨 소재; 스트라타진, 캘리포니아 라졸라 소재; 기브코/BRL, 매사츄세츠 개터스버그 소재)으로부터 구입하거나 당업자에 의해 제작될 수 있다(예컨대, Meth. Emzymol., Vol. 185, Goeddel, ed.(Academic Press, Inc., 1990); Jolly, Canc.Gene Ther. 1:51-64, 1994; Flotte, J. Bioenerg. Biomemb. 25:37-42, 1993; Kirshenbaum et al., J.Clin.Invest. 92:381-387, 1993; 각 문헌은 본원에 참고인용된 것임).
본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 단백분해성 프로세싱 부위가 변이되어 우성의 음성 형태의 마이오스타틴을 암호하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 성숙 마이오스타틴 펩타이드와 복합체를 형성할 수 있는 마이오스타틴 프로도메인를 암호하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 우성의 음성 형태의 GDF 수용체를 암호하는 폴리뉴클레오타이드의 발현을 유도하는데 특히 유용한 프로모터는 테트라사이클린(tet) 유도성 프로모터일 수 있다. tet 유도성 프로모터에 작동가능하게 결합된 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 피검체에게 테트라사이클린이나 이의 유사체를 투여하면, 암호된 펩타이드의 발현이 유도되어 이 펩타이드가 그 활성에 영향을 미치게 되는데, 예를 들어 펩타이드 제제는 마이오스타틴 시그널 도입을 감소시키거나 억제할 수 있다. 이와 같은 방법은 예를 들어 성숙 유기체의 근육 비대를 유도하는데 사용할 수 있다.
이 폴리뉴클레오타이드는 또한 조직 특이적 조절 인자, 예컨대 근육 세포 특이적 조절 인자에 작동가능하게 결합되어, 암호된 펩타이드가 개체의 근육 세포에서만 발현되도록 하거나 또는 배양물, 예컨대 기관 배양물 중의 혼합 세포 집단 중에서 근육 세포에서만 발현되도록 할 수 있다. 근육 세포 특이적 조절 인자, 예컨대 근육 크레아틴 키나제 프로모터(Sternberg et al., Mol.Cell.Biol. 8:2896-2909, 1988, 참조인용됨) 및 마이오신 경쇄 인헨서/프로모터(Donoghue et al., Proc.Natl.Acad.Sci., USA 88:5847-5851, 1991, 본원에 참고인용됨)는 당해 기술분야에 공지되어 있다.
바이러스 발현 벡터는 폴리뉴클레오타이드를 세포, 특히 피검체 중의 세포로 도입시키는데 특히 유용할 수 있다. 바이러스 벡터는 비교적 고효율로 숙주 세포를 감염시키며 특정 세포 종류를 감염시킬 수 있다는 장점이 있다. 예를 들어, 마이오스타틴 프로도메인이나 이의 기능성 펩타이드 부분을 암호하는 폴리뉴클레오타이드는 바큘로바이러스 벡터에 클로닝된 후, 곤충 숙주 세포를 감염시키는데 사용될 수 있으며, 이에 따라 암호된 프로도메인을 다량으로 생산할 수 있는 수단이 될 수 있다. 이 바이러스 벡터는 또한 당해의 유기체 세포, 예컨대 포유류, 조류 또는 어류 숙주 세포와 같은 척추동물 숙주 세포를 감염시키는 바이러스로부터 유래하는 것일 수 있다. 바이러스 벡터는 본 발명의 방법을 수행하는데 유용한 폴리뉴클레오타이드를 표적 세포로 도입시키는데 특히 유용할 수 있다. 바이러스 벡터는 특정 숙주계, 특히 포유류계에 사용하기 위하여 개발되었고, 그 예로는 레트로바이러스 벡터, 기타 다른 렌티바이러스 벡터, 예컨대 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에 근거한 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터 등이 있다(Miller and Rosman, BioTechniques 7:980-990, 1992; Anderson et al., Nature 392:25-30 Suppl., 1998; Verma and Somia, Nature 389:239-242, 1997; Wilson, New Engl. J. Med. 334:1185-1187(1996), 각 문헌은 본원에 참고인용됨).
레트로바이러스가 예컨대 유전자 전이에 사용되는 경우에는, 레트로바이러스 벡터 생산에 이용된 패키징 세포주에서 바이러스 유전자 서열과 레트로바이러스 벡터의 재조합으로 인하여 복제 컴피턴트 레트로바이러스가 이론적으로 발생할 수 있다. 재조합에 의해 복제 컴피턴트 바이러스 생산이 감소되거나 제거된 패키징 세포주는 복제 컴피턴트 레트로바이러스가 생성될 가능성을 최소화시키는데 사용할 수 있다. 세포를 감염시키는데 사용하는 레트로바이러스 벡터 상청액으로부터 PCR 및 역전사효소 분석법과 같은 표준 분석법으로 복제 컴피턴트 바이러스를 선별한다. 레트로바이러스 벡터는 이종 유전자를 숙주 세포 게놈 내로 통합시킬 수 있어서 세포 분열 후 유전자를 딸세포로 전달한다.
벡터에 포함될 수 있는 폴리뉴클레오타이드는 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법 중 임의의 방법으로 세포로 도입시킬 수 있다(Sambrook et al., Molecualr Cloning: A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD(1987, and supplements through 1995), 각 문헌은 본원에 참고인용됨). 이와 같은 방법으로는, 예컨대 형질감염, 리포펙션, 미량주사, 일렉트로포레이션 및 바이러스 벡터를 사용하는 감염이 있고; 리포좀, 마이크로에멀젼 등의 사용을 포함할 수 있으며, 이것은 세포로 폴리뉴클레오타이드를 용이하게 도입시킬 수 있고 세포로 도입되기 이전에 폴리뉴클레오타이드가 분해되지 않도록 보호할 수 있다. 특정 방법의 선택은 폴리뉴클레오타이드가 도입되는 세포, 및 세포가 배양물에서 분리 상태인지, 또는 조직이나 기관 배양물중에 있는 상태인지 또는 원위치에 있는 상태인지에 따라 달라질 것이다.
바이러스 벡터를 이용한 감염으로 폴리뉴클레오타이드를 세포내로 도입시키는 방법은 핵산 분자를 생체외 또는 생체내의 세포로 효과적으로 도입시킬 수 있다는 점에서 특히 유리하다(예컨대 미국 특허 제5,399,346호, 본원에 참고인용됨). 또한, 바이러스는 매우 특수하여, 1종 또는 몇가지 특정 세포 종류에서 감염 및 전파하는 능력에 따라 벡터로서 선별될 수 있다. 따라서, 벡터 천연의 특이성을 이용하여 이 벡터에 함유된 핵산 분자를 특정 세포 종류로 표적화할 수 있다. HIV에 근거한 벡터 자체는 T 세포를 감염시키는데 사용할 수 있고, 아데노바이러스에 근거한 벡터는 예컨대 호흡기 상피세포를 감염시키는데 사용할 수 있으며, 헤르페스바이러스에 근거한 벡터는 신경원 세포를 감염시키는데 사용할 수 있다. 아데노 관련 바이러스와 같은 다른 벡터는 숙주 세포 범위가 보다 넓어서 다양한 세포 종류를 감염시키는데 사용할 수 있다. 또한 바이러스 또는 비바이러스 벡터는 특정 수용체 또는 리간드로 변형시켜 수용체 매개 과정을 통해 표적 특이성을 변화시킬 수도 있다.
본 발명은 또한 프로마이오스타틴 폴리펩타이드의 펩타이드 부분 또는 돌연변이 프로마이오스타틴 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 특히 유용한 항체로는 마이오스타틴 프로도메인, 이의 기능성 펩타이드 부분에 특이적으로 결합하는 항체, 및 프로마이오스타틴 폴리펩타이드에 결합하여 이 프로마이오스타틴의 성숙한 마이오스타틴 펩타이드로의 단백분해성 절단을 감소 또는 억제하는 항체가 있다. 또한, 본 발명의 항체는 하기 기술되는 바와 같이 GDF 수용체 또는 이의 기능성 펩타이드 부분에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 본 발명의 항체를 제조 및 분리하는 방법은 이하에 보다 상세하게 설명될 것이며, 이 설명은 본원에 참고로 인용된 것이다.
마이오스타틴은 골격 근육량을 적당히 조절하는데 필수적인 요소이다. 마이오스타틴이 없는 마이오스타틴 녹아웃 마우스는, 야생형 마우스와 비교했을 때, 이상증식과 비대의 조합으로 인해 근육량이 2 내지 3배이다. 본 명세서에 개시한 바와 같이, 마이오스타틴 녹아웃 마우스는 또한 적어도 부분적으로 체내 골격근 조직의 증가된 합성대사 상태로 인한 지방 축적의 급격한 감소를 나타낸다. 이에 반해, 누드 마우스에서의 마이오스타틴의 과잉발현은 암이나 AIDS와 같은 만성 질환을 앓고 있는 인간 환자에서 관찰되는 악액질 상태와 유사한 소모성 증후군을 유도하였다. 본 명세서에 추가로 개시한 바와 같이, 마이오스타틴 활성은 Smad 시그널 도입 경로의 특징을 가진 시그널 도입을 통해 매개될 수 있다. 따라서, 본 발명은 세포에서 마이오스타틴 시그널 도입에 영향을 미치는 제제와 세포를 접촉시켜 그 세포에 미치는 마이오스타틴의 영향을 조절하는 방법을 제공한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 세포에 미치는 마이오스타틴의 영향과 관련하여 사용한 "조절한다"란 용어는 그 세포에서의 마이오스타틴 시그널 도입이 증가되거나 감소 또는 억제되는 것을 의미한다. "증가" 및 "감소 또는 억제"란 용어는 마이오스타틴 시그널 도입 활성의 기준 농도와 관련하여 사용된 것으로서, 이 기준 농도는 마이오스타틴 없이 시그널 도입 경로에서 나타나는 활성 농도이거나 또는 마이오스타틴이 존재하는 정상 세포에서의 활성 농도일 수 있다. 예를 들어, 마이오스타틴 시그널 도입 경로는 마이오스타틴과 접촉된 근육 세포에서 특정 활성을 나타내고, 이 근육 세포를 마이오스타틴 프로도메인과 추가로 접촉시키면 마이오스타틴 시그널 도입 활성은 감소되거나 억제될 수 있다. 마이오스타틴 프로도메인 자체는 마이오스타틴 시그널 도입을 감소 또는 억제하는데 유용한 제제이다. 이와 마찬가지로, GDF-11 프로도메인과 같은 다른 GDF 과 구성원의 프로도메인이나 또는 액티빈 프로도메인, MIS 프로도메인 등과 같은 다른 TGF-β계 구성원의 프로도메인은 마이오스타틴 시그널 도입을 감소시키는데 유용하게 사용될 수 있다. "감소 또는 억제"란 용어는 본 명세서에 함께 사용되었는데, 이것은 몇몇 경우에 마이오스타틴 시그널 도입 농도가 특정 분석법으로 검출될 수 있는 농도 이하로 감소될 수 있는 것으로 인식되었기 때문이다. 따라서, 이러한 분석법을 사용해서는 마이오스타틴 시그널 도입 농도가 적게 남아있는지, 또는 시그널 도입이 완전히 억제된 것인지 측정할 수 없다.
본 명세서에 사용된, "마이오스타틴 시그널 도입"이란 용어는 일련의 과정, 일반적으로 세포의 표면에서 발현된 마이오스타틴 수용체와 마이오스타틴의 특이적 상호작용으로 인하여 세포에서 일어나는 일련의 단백질-단백질 상호작용을 의미하는 것이다. 마이오스타틴 시그널 도입 자체는 예를 들어 세포 상의 마이오스타틴 수용체와 마이오스타틴의 특이적 상호작용을 측정하거나, 세포에서 마이오스타틴 시그널 도입 경로에 관여하는 1종 이상의 폴리펩타이드들의 인산화를 측정하거나, 마이오스타틴 시그널 도입으로 인해 특이적으로 유도된 1종 이상의 유전자 발현을 측정하거나 또는 마이오스타틴 시그널 도입에 대한 반응으로 일어나는 표현형의 변화를 측정하여 검출할 수 있다(실시예 참조). 본 명세서에 개시된 바와 같이, 본 발명의 방법에 유용한 제제는 마이오스타틴 시그널 도입을 자극하는 작용제로서 또는 마이오스타틴 시그널 도입을 감소 또는 억제하는 길항제로서 작용할 수 있다.
본 발명의 방법은 본 명세서에서 일반적으로 마이오스타틴과 관련하여 예시하였다. 하지만, 본 발명의 방법은 보다 포괄적으로 세포에서 GDF에 의한 시그널 도입에 영향을 미치는 제제와 세포를 접촉시킴으로써 세포에 미치는 다른 GDF 펩타이드, 예컨대 GDF-11의 효과를 조절하는 방법도 포함한다는 것을 알아야 한다. 본 발명의 범위에 속하는 실시 방법은 본 명세서의 설명을 통해 용이하게 알 수 있는 것으로서, 예컨대 GDF 수용체를 확인하는 방법, GDF와 그 수용체와의 특이적 상호작용으로 인한 시그널 도입을 조절하는 제제를 확인하는 방법 등이 있다.
본원에 예시한 마이오스타틴 시그널 도입 경로로는 Smad 경로가 있으며, 이 경로는 마이오스타틴이 액티빈 II형 수용체의 세포외 도메인과 특이적 상호작용시 개시되어, 세포내에서 Smad 단백질을 비롯한 세포내 폴리펩타이드의 상호작용을 통해 전파된다. 일반적으로, 마이오스타틴 시그널 도입은 Smad 폴리펩타이드와 같은 특정 세포내 폴리펩타이드의 인산화 또는 탈인산화와 관련이 있다. 따라서, 세포에서의 마이오스타틴 시그널 도입은 마이오스타틴 부재하에서의 1종 이상의 Smad 폴리펩타이드 인산화 농도와 비교하여, 마이오스타틴 존재하에서의 1종 이상의 Smad 폴리펩타이드 인산화의 농도 증가를 측정함으로써 검출할 수 있다. 본 발명의 방법은 마이오스타틴 시그널 도입을 증가 또는 감소시키는 수단을 제공하며, 이에 따라 마이오스타틴 시그널 도입 경로에 관여하는 Smad 폴리펩타이드의 인산화 농도는 각각 정상 농도 이상으로 증가되거나 마이오스타틴 존재하에 예상한 농도 이하로 감 소될 것이다.
본 발명의 방법은 예를 들어 적합한 조건하에, 표적 세포와, 이 세포에서 마이오스타틴 시그널 도입에 영향을 미치는 제제를 접촉시켜 수행할 수 있다. 적합한 조건은 분리 세포이거나 조직이나 기관의 성분일 수 있는 세포를 적당한 배양 배지에 첨가하거나 또는 세포를 유기체내 원위치에서 접촉시킴으로써 제공할 수 있다. 예를 들어, 세포를 함유하는 배지를, 이 세포 상에 발현된 마이오스타틴 수용체와 특이적으로 상호작용하는 마이오스타틴의 능력에 영향을 미치는 제제와 접촉시키거나 또는 세포에서 마이오스타틴 시그널 도입 경로에 영향을 미치는 제제와 접촉시킬 수 있다. 일반적으로 세포는 피검체에 존재하는 조직이나 기관의 성분으로서, 세포를 접촉시키는 것은 제제를 피검체에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 하지만, 세포는 배양물 상태로 처리될 수 있어서 배양물내에서 유지된 뒤 피검체에 투여하거나 또는 인간을 제외한 트랜스게닉 동물을 제조하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에 유용한 제제는 임의 유형의 분자, 예컨대 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 펩타이드모방체, 비닐위치치환 펩토이드와 같은 펩토이드(peptoid), 작은 유기 분자 등으로서, 마이오스타틴 시그널 도입에 영향을 미치는 다양한 임의의 방식으로 작용할 수 있다. 이 제제는 마이오스타틴 또는 액티빈 수용체와 같은 마이오스타틴 수용체를 결합시켜 세포외에서 작용하도록 함으로써 마이오스타틴 수용체와 특이적으로 상호작용하는 마이오스타틴의 능력을 변화시키거나 또는 세포내에서 작용시켜 세포내의 마이오스타틴 시그널 도입을 변화시킬 수 있다. 또한, 이 제제는 세포에 미치는 마이오스타틴의 효과, 예컨대 마이오스타틴 수용체와 특이적으로 상호작용하는 마이오스타틴의 능력을 모방하거나 향상시켜 세포에서 마이오스타틴 시그널 도입을 증가시키는 작용제이거나 또는 세포에 미치는 마이오스타틴의 효과를 감소 또는 억제하여 세포에서의 마이오스타틴 시그널 도입을 감소 또는 억제시키는 길항제일 수 있다.
본 명세서에 사용된 "특이적 상호작용" 또는 "특이적으로 결합하는" 등의 용어는 두 분자가 생리적 조건하에서 비교적 안정한 복합체를 형성한다는 것을 의미한다. 이 용어는 본 명세서에에서 다양한 상호작용, 예컨대 마이오스타틴과 마이오스타틴 수용체의 상호작용, 마이오스타틴 시그널 도입 경로의 세포내 성분들의 상호작용, 항체와 그 항원과의 상호작용 및 마이오스타틴과 마이오스타틴 프로도메인과의 상호작용 등과 관련하여 사용되고 있다. 특이적 상호작용은 해리 상수가 적어도 약 1 x 10-6M, 일반적으로 적어도 약 1 x 10-7M, 보통 적어도 약 1 x 10-8M, 특히 적어도 약 1 x 10-9M 또는 1 x 10-10M 이상인 것이 특징일 수 있다. 특이적 상호작용은 일반적으로 생리적 조건, 예컨대 인간이나 다른 척추동물 또는 무척추동물과 같은 살아있는 개체에서 나타나는 조건은 물론, 포유동물 세포 또는 다른 척추동물 유기체 또는 무척추동물 유기체 유래의 세포를 유지하는데 사용되는 것과 같은 세포 배양물 중의 조건 하에서 안정적이다. 또한, 마이오스타틴 프로도메인과 마이오스타틴과의 세포외 상호작용과 같은 특이적 상호작용은 일반적으로 상업적으로 가치있는 해양 유기체의 수중생물배양에 사용되는 것과 같은 조건하에서 안정적이다. 두 분자의 특이적 상호작용 여부를 측정하는 방법은 공지되어 있으며, 그 예로는 평형 투석, 표면 플라스몬 공명 등이 있다.
마이오스타틴과 그 수용체와의 특이적 상호작용을 변화시키는 제제는 예를 들어 마이오스타틴에 결합하여 마이오스타틴의 세포 수용체와 특이적으로 상호작용할 수 없도록 하거나, 마이오스타틴 수용체에 대한 결합을 마이오스타틴과 경쟁시키거나 또는 마이오스타틴 시그널 도입을 유도하기 위해 마이오스타틴이 마이오스타틴 수용체와 특이적 상호작용하는 필요조건의 측로를 통해 작용할 수 있다. 마이오스타틴 수용체의 가용성 세포외 도메인과 같은 절두형 마이오스타틴 수용체는, 마이오스타틴에 결합하여 마이오스타틴을 격리시켜 세포 표면 마이오스타틴 수용체와 특이적으로 상호작용하는 마이오스타틴의 능력을 감소 또는 억제시킬 수 있는 제제의 일 예이다. 마이오스타틴 프로도메인 또는 이의 기능성 펩타이드 부분도 마이오스타틴에 결합하여 세포 표면 마이오스타틴 수용체와 특이적으로 상호작용하는 마이오스타틴의 능력을 감소 또는 억제시킬 수 있는 제제의 다른 일 예이다. 이와 같은 마이오스타틴 길항제는 본 발명의 방법을 실시하는데, 특히 세포에서 마이오스타틴 시그널 도입을 감소 또는 억제하는데 유용하다.
폴리스타틴은 마이오스타틴에 결합하여 마이오스타틴 수용체와 특이적으로 상호작용하는 마이오스타틴의 능력을 감소 또는 억제하는 제제의 또 다른 일 예이다. 폴리스타틴은 다양한 TGF-β계 구성원, 예컨대 마이오스타틴(GDF-8; 미국 특허 제6,004,937호) 및 GDF-11(Gamer et al., Devel.Biol. 208:222-232, 1999)에 결합하여 그 활성을 억제할 수 있어서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 방법을 수행하는데 사용할 수 있다. 마이오스타틴의 효과를 조절하는데 사용할 수 있는 폴리스타틴 의 용도는 이미 논의된 바 있지만(미국 특허 제6,004,937호), 폴리스타틴이 Act RIIB와 같은 마이오스타틴 수용체와 특이적으로 상호작용하는 마이오스타틴의 능력을 감소 또는 억제한다는 것은 본 발명의 개시 이전에 알려진 바가 없다.
본 발명의 방법에 유용한 제제는 또한 세포의 마이오스타틴 수용체와도 상호작용할 수 있어서, 그 수용체에 대해서 마이오스타틴과 경쟁한다. 이러한 제제로는, 예컨대 마이오스타틴 결합 도메인 전체 또는 일부를 비롯한 세포 표면 마이오스타틴 수용체에 특이적으로 결합하여 마이오스타틴이 그 수용체와 특이적으로 상호작용하지 못하도록 방해하는 항체일 수 있다. 이와 같은 항마이오스타틴 수용체 항체는 마이오스타틴 시그널 도입을 활성화하지 않고 그 수용체에 특이적으로 결합하는 능력에 따라 선별하여, 마이오스타틴 시그널 도입을 감소 또는 억제하는 마이오스타틴 길항제로서 유용하게 사용할 수 있는 것이거나, 또는 그 수용체에 특이적으로 결합하고 마이오스타틴 시그널 도입을 활성화하는 능력에 따라 선별하여 마이오스타틴 작용제로서 유용하게 사용할 수 있는 것이다. 이 항체는 면역원으로서 마이오스타틴 수용체 또는 이 수용체의 세포외 도메인을 사용하여 생성될 수 있는 것이거나, 또는 항마이오스타틴 항체에 대해 생성되어 마이오스타틴을 모방하는 항유전자형 항체일 수 있다. 항GDF 수용체 항체는 이하에 보다 상세히 설명할 것이다.
본 발명의 방법에 유용한 제제는 또한 프로-GDF 폴리펩타이드가 활성형의 성숙 GDF 펩타이드로 단백분해성 절단되는 것을 감소 또는 억제하여, GDF 시그널 도입을 감소 또는 억제할 수 있는 제제일 수 있다. 이와 같은 제제는 프로테아제 억제제, 구체적으로 Arg-Xaa-Xaa-Arg(서열번호 21) 단백분해성 인식 부위를 인식하여 절단하는 프로테아제의 활성을 억제하는 것일 수 있다. 프로-GDF가 프로마이오스타틴인 경우에, 마이오스타틴에 존재하는 Arg-Xaa-Xaa-Arg(서열번호 21) 단백분해성 절단 부위에 대한 프로테아제의 특이적 결합을 감소 또는 억제시키는 항마이오스타틴 항체는 또한 프로마이오스타틴의 단백분해작용을 감소 또는 억제하여 성숙 마이오스타틴의 생산량을 감소시킬 수 있다. 이와 같은 항체는 단백분해성 절단 부위에 결합하거나 또는 프로테아제의 결합과 이에 의한 절단이 감소 또는 억제되도록 프로-GDF 폴리펩타이드 상의 약간 다른 부위에 결합할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에 유용한 제제는 돌연변이 마이오스타틴 수용체로서, 예를 들어 마이오스타틴 결합에 대한 반응으로 마이오스타틴 시그널 도입 활성을 나타내지 않거나 또는 구성형 마이오스타틴 시그널 도입 활성이 있는 것이다. 예를 들어, 돌연변이 마이오스타틴 수용체는 키나제 활성이 결여되도록 키나제 도메인에 점 돌연변이, 결실 등이 있는 것일 수 있다. 이와 같은 우성의 음성 돌연변이 마이오스타틴 수용체는 마이오스타틴에 특이적으로 결합할 수 있음에도 불구하고 마이오스타틴 시그널 도입을 전달하는 능력이 없다.
본 발명의 방법에 유용한 제제는 또한 마이오스타틴 시그널 도입 경로에 관여하는 세포내 폴리펩타이드의 농도 또는 활성을 조절할 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, 마이오스타틴에 의한 근육 성장의 조절에는 액티빈 II형 수용체에 의해 활성화되는, 시그널 도입 경로의 성분을 포함할 수 있다(실시예 7 및 9 참조; 또한 실시예 14 참조). 마이오스타틴은 특이적으로 배양물 중의 COS 세포에서 발현된 액티빈 IIB형 수용체(Act RIIB)와 특이적으로 상호작용한다(실시예 7). 낮은 결 합 친화성은, Act RIIB에 대한 생체내 마이오스타틴 결합이 Ⅰ형 수용체가 존재할 때에도 II형 수용체에 대해 유의적으로 높은 친화성을 나타내는 TGF-β(Attisano et al., Cell 75:671-680, 1993) 또는 시그널링 수용체에 리간드를 제공하는 다른 분자를 필요로 하는 다른 시스템과 유사한 다른 인자를 수반할 수 있음을 시사한다(Massague, 상기문헌참조, 1998; Wang et al., Cell 67:795-805, 1991).
Act RIIB와 마이오스타틴의 특이적 상호작용은 마이오스타틴 시그널 도입이 Smad 시그널 도입 경로의 성분을 필요로 할 수 있음을 시사한다. 즉, Smad 시그널 도입 경로는 세포에 미치는 마이오스타틴의 효과를 조절하기 위한 표적을 제공하는 바, Smad 경로에 영향을 미치는 제제는 세포에서 마이오스타틴 시그널 도입을 조절하는데 유용하게 사용될 수 있다.
GDF 시그널 도입에 관여하는 세포내 폴리펩타이드 성분들의 농도 또는 활성을 조절하는데 유용한 제제로는 시그널 도입 활성을 증가시킬 수 있는 작용제와, 시그널 도입 활성을 감소 또는 억제시킬 수 있는 길항제가 있다. 마이오스타틴의 경우에, 예컨대 마이오스타틴 시그널 도입 활성을 증가시킬 수 있는 제제로는 예컨대 Smad 폴리펩타이드의 탈인산화를 감소 또는 억제하여 Smad의 시그널 도입 활성을 연장시킬 수 있는 포스파타제 억제제가 있다. 마이오스타틴 시그널 도입에 미치는 Smad6과 Smad7의 억제 효과를 실효시킬 수 있는 우성의 음성 Smad6과 Smad7 폴리펩타이드는 Smad 시그널 도입을 증가시켜 마이오스타틴 시그널 도입 활성을 증가시킬 수 있는 제제의 또 다른 예이다.
마이오스타틴 시그널 도입 활성을 감소 또는 억제시킬 수 있는 길항제로는, 예컨대 우성의 음성 Smad 폴리펩타이드, 예컨대 우성의 음성 Smad 2, Smad 3 또는 Smad 4가 있으며, 이들은 C-말단 인산화 부위가 돌연 변이되어 있다. Smad 2 및 Smad 3의 활성화를 억제하는 Smad 6과 Smad 7과 같은 억제성 Smad 폴리펩타이드; 및 Smad 폴리펩타이드에 결합하여 시그널 도입을 억제하는 c-ski 폴리펩타이드도 Smad 시그널 도입을 감소시켜 마이오스타틴 시그널 도입을 감소 또는 억제시키는데 유용한 길항제의 또 다른 예이다.
세포내적으로 작용하는 제제가 펩타이드인 경우에는, 제제를 세포와 직접 접촉시거나, 또는 이 펩타이드(또는 폴리펩타이드)를 암호하는 폴리뉴클레오타이드를 세포 내로 도입시켜 세포에서 펩타이드를 발현시킬 수도 있다. 본 발명의 방법에 유용한 펩타이드 중 일부는 비교적 커서 세포막을 쉽게 통과할 수 없는 경우가 있음을 알아야 한다. 하지만, 펩타이드를 세포 내로 도입시키는 방법으로서는, 다양한 방법이 공지되어 있다. 이러한 펩타이드를 세포 내로 도입시키는 방법의 선택은 부분적으로 폴리펩타이드를 제공하고자 하는 표적 세포의 특징에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 표적 세포 또는 이 표적 세포를 비롯한 몇몇 세포 종류가, 특정 리간드에 결합하면 세포 내로 국소화되는 수용체를 발현하는 경우에는, 그 펩타이드 제제를 리간드와 작동가능하게 결합시킬 수 있다. 이 경우, 펩타이드는 수용체에 결합하는 즉시, 수용체 매개의 엔도시토시스(endocytosis)에 의해 세포 내로 전위하게 된다. 또한, 펩타이드 제제는 리포좀에 캡슐화되거나 지질 복합체로 배합될 수 있으며, 이에 따라 세포 내부로의 펩타이드 도입이 용이해지고, 추가 변형으로 수용체(또는 리간드)를 전술한 바와 같이 발현시킬 수 있다. 펩타이드 제제는 또한 세포 내부로의 펩타이드의 전위를 용이하게 하는 인간 면역결핍 바이러스 TAT 단백질 도입 도메인과 같은 단백질 도입 도메인을 펩타이드에 포함시킴으로써, 세포 내부로의 도입을 촉진할 수도 있다(Schwarze et al., Science 285:1569-1572(1999), 본원에 참고인용됨; Derossi et al., J.Biol.Chem. 271:18188(196)).
표적 세포는 이 세포에서 발현될 수 있는 펩타이드 제제를 암호하는 폴리뉴클레오타이드와 접촉될 수도 있다. 발현된 펩타이드 제제는 돌연변이 GDF 수용체 또는 이의 펩타이드 부분일 수 있다. 돌연변이 GDF 수용체의 예로는 리간드(예컨대 마이오스타틴)에 특이적으로 결합하는 능력이 있지만, 이 능력이 반드시 필요한 것은 아닌 마이오스타틴 수용체의 키나제 결손형 형태, 예컨대 우성의 음성 Act RIIA 또는 Act RIIB; 및 마이오스타틴에 결합하여 세포의 마이오스타틴 수용체와 특이적으로 상호작용하지 못하도록 마이오스타틴을 격리시키는 절두형 마이오스타틴 또는 다른 GDF 수용체, 예컨대 마이오스타틴 수용체의 가용성 형태; C-말단 인산화 부위를 돌연변이시킨 Smad 폴리펩타이드의 우성 음성 형태, 예컨대 우성의 음성 Smad3(Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 94:10669-10674, 1997); Smad 2와 Smad 3의 활성화를 억제하는 Smad 7 폴리펩타이드(Heldin et al., Nature 390:465-471, 1997); 또는 Smad 폴리펩타이드에 결합하여 Smad에 의한 시그널 도입을 억제할 수 있는 c-ski 폴리펩타이드를 포함한다(Sutrave et al., Genes Devel. 4:1462-1472, 1990).
세포 내에서의 c-ski 펩타이드 제제의 발현은 마이오스타틴 시그널 도입을 조절하는데 특히 유용할 수 있다. c-ski가 결여된 마우스는 골격 근육량의 심각한 감소를 보이는 반면(Berk et al., Genes Devel. 11:2029-2039, 1997), 근육에서 c-ski를 과잉발현하는 트랜스게닉 마우스는 급격한 근육 비대를 보인다(Sutrave et al., 상기 문헌 참조, 1990). c-ski는 TGF-β 수용체와 액티빈 II형 수용체의 시그널링을 매개하는 특정 Smad 단백질, 예컨대 Smad 2, Smad 3 및 Smad 4와 상호작용하여 그 활성을 차단시킨다(Luo et al., Genes Devel. 13:2196-1106, 1999; Stroschein et al., Science 286:771-774, 1999; Sun et al., Mol. Cell 4:499-509, 1999a; Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 96:112442-12447, 1999b; Akiyoshi et al., J.Biol.Chem. 274:35269, 1999). 마이오스타틴 활성이 Act RIIB 결합을 통해 매개될 수 있다는 본 발명의 개시를 통해, 마이오스타틴 활성 또는 Smad 경로를 이용하는 임의의 GDF의 활성이 표적 세포 내의 c-ski 발현을 증가 또는 감소시킴으로써 조절될 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다.
본 발명의 방법에 유용한 제제는 전술한 바와 같이 세포와 직접 접촉하거나 또는 세포 내로 도입될 수 있는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 일반적으로, 폴리뉴클레오타이드는 세포 내로 도입되어, 그 기능을 직접 발휘하거나 또는 전사 또는 해독 후 또는 전사 후와 해독 후에 기능을 발휘하는데, 반드시 그런 것은 아니다. 예를 들어, 전술한 바와 같이, 폴리뉴클레오타이드는, 세포 내에서 발현되어 마이오스타틴 활성을 조절하는 펩타이드 제제를 암호할 수 있다. 이와 같이 발현된 펩타이드는, 예를 들어 활성 마이오스타틴으로 절단될 수 없는 돌연변이 프로마이오스타틴 폴리펩타이드이거나; 돌연변이 마이오스타틴 수용체, 예컨대 절두형 마이오스타틴 수용체 세포외 도메인이거나; 또는 막 부착 도메인에 작동가능하게 결합된 마이오스타틴 수용체 세포외 도메인; 또는 단백질 키나제 활성이 결여된 돌연변이 마이오스타틴 수용체일 수 있다. 세포 내로 폴리뉴클레오타이드를 도입시키는 방법은 이하에 예시되었거나 당해 기술분야에 공지된 것이 있다.
본 발명의 방법에 유용한 폴리뉴클레오타이드 제제는 또한 안티센스 분자, 리보자임 또는 3본쇄화제이거나 또는 이들을 암호할 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 세포 내에서 마이오스타틴 시그널 도입을 증가시키는 작용제로서 작용할 수 있는 안티센스 c-ski 뉴클레오타이드 서열과 같은 안티센스 뉴클레오타이드 서열; 또는 특정 Smad 안티센스 뉴클레오타이드 서열에 따라 마이오스타틴 시그널 도입을 증가시키는 작용제로서 또는 마이오스타틴 시그널 도입을 감소 또는 억제시키는 길항제로서 작용할 수 있는 안티센스 Smad 뉴클레오타이드 서열일 수 있다(또는 이 서열을 암호할 수 있다). 이와 같은 폴리뉴클레오타이드는 표적 세포와 직접 접촉하여, 세포가 흡수하는 즉시 이들의 안티센스, 리보자임 또는 3본쇄화 활성을 수행할 수 있거나; 또는 세포로 도입된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호되어, 그 즉시 폴리뉴클레오타이드가 발현되어 예컨대 활성을 나타내는 안티센스 RNA 분자 또는 리보자임을 생성할 수도 있다.
안티센스 폴리뉴클레오타이드, 리보자임 또는 3본쇄화제는 표적 서열에 상보적인 것으로서, DNA 또는 RNA 서열, 예를 들어 메신저 RNA일 수 있고, 암호 서열이거나 인트론-엑손 결합을 포함하는 뉴클레오타이드 서열, 샤인-달가노 서열과 같은 조절 서열 등일 수 있다. 상보성의 정도는, 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 안티센스 폴리뉴클레오타이드가 세포 내에서 표적 서열과 특이적으로 상호작용할 수 있는 정 도면 된다. 안티센스 또는 다른 폴리뉴클레오타이드의 전장에 따라서, 표적 서열에 대해 1개 또는 수개의 미스매치가, 그 표적 서열에 대한 폴리뉴클레오타이드의 특이성을 상실함이 없이 허용될 수 있다. 따라서, 예컨대 20개의 뉴클레오타이드로 구성된 안티센스 분자에는 임의의 미스매치가 거의 허용되지 않지만, 예컨대 세포의 폴리펩타이드를 암호하는 표적 mRNA의 전장에 상보적인 안티센스 분자의 하이브리드화 효율에는 몇 개의 미스매치가 영향을 미치지 않을 것이다. 허용될 수 있는 미스매치의 수는 하이브리드화 동력학을 측정하는 공지의 식(Sambrook et al. 상기 문헌 참조 1989)을 사용하여 산정하거나 또는 본 명세서에 개시된 방법이나 당해 기술분야에 공지된 다른 방법, 특히 안티센스 폴리뉴클레오타이드, 리보자임 또는 3본쇄화제의 세포내 존재가 이 세포내에서 표적 서열의 농도 또는 그 표적 서열에 의해 암호된 폴리펩타이드의 발현 농도를 감소시키는지의 여부를 측정하여 실험적으로 결정할 수 있다.
안티센스 분자, 리보자임 또는 3본쇄화제로서 유용한 폴리뉴클레오타이드는 해독을 억제하거나 그 핵산 분자를 절단하여, 세포에서의 마이오스타틴 시그널 도입을 조절할 수 있다. 예를 들어, 안티센스 분자는 mRNA에 결합하여, 2본쇄 분자를 형성할 수 있는데, 이 2본쇄 분자는 세포내에서 해독될 수 없다. 적어도 약 15개 내지 25개 뉴클레오타이드의 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성 용이하고 표적 서열과 특이적으로 하이브리드화할 수 있어 바람직하지만, 표적 세포로 도입된 폴리뉴클레오타이드로부터 더 긴 안티센스 분자가 발현될 수도 있다. 안티센스 분자로서 유용한 특정 뉴클레오타이드 서열은 공지의 방법, 예컨대 유전자 워킹법(gene walking method)(예컨대, Seimiya et al., J.Biol.Chem. 272:4631-4636(1997), 본원에 참고인용됨)을 사용하여 확인할 수 있다. 안티센스 분자가 표적 세포와 직접 접촉하는 경우에는, 안티센스 분자에 화학적 반응성 기, 예컨대 철 결합 EDTA를 작동가능하게 결합시킬 수 있으며, 이는 하이브리드화 부위에 있는 표적 RNA를 절단한다. 이에 비해, 3본쇄화제는 전사를 중지시킬 수 있다(Maher et al., Antisense Res. Devel. 1:227(1991); Helene, Anticancer Drug Design 6:569(1991)). 따라서, 3본쇄화제는 예컨대 Smad 유전자 조절 인자의 서열을 인식하도록 고안하여, 세포내의 Smad 폴리펩타이드의 발현을 감소 또는 억제함으로써 표적 세포에서 마이오스타틴 시그널 도입을 조절할 수 있도록 할 수 있다.
본 발명은 또한 세포에 미치는 마이오스타틴과 같은 GDF의 효과를 변화시킬 수 있는 제제, 구체적으로 GDF의 세포 수용체와 특이적으로 상호작용하는 GDF의 능력을 변화시킬 수 있는 제제를 확인하는 방법을 제공한다. 이와 같은 제제는 GDF 수용체와 특이적으로 상호작용하는 GDF의 능력을 증가 또는 감소시키는 작용을 할 수 있어서 GDF 시그널 도입을 각각 증가 또는 감소시키는데 유용하게 사용할 수 있다. 본 발명의 스크리닝 방법으로, 마이오스타틴 수용체, 예컨대 Act RIIA 또는 Act RIIB와 같은 액티빈 II형 수용체를 사용하는 방법을 본 명세서에 예시하였다.
본 발명의 스크리닝 방법은 예컨대 마이오스타틴, 또는 이의 기능성 펩타이브 부분, Act RIIA 또는 Act RIIB와 같은 마이오스타틴 수용체 및 시험 제제를, 적당한 조건하에서 접촉시켜 수행할 수 있다. 마이오스타틴, 수용체 및 제제는 필요에 따라 임의의 순서대로 접촉시킬 수 있다. 이 스크리닝 방법 자체는 수용체에 대 한 마이오스타틴 결합을 경쟁적 또는 비경쟁적으로 억제할 수 있는 제제, 수용체에 대한 마이오스타틴 결합을 매개 또는 향상시킬 수 있는 제제, 특이적으로 결합된 마이오스타틴을 수용체로부터 해리 유도할 수 있는 제제, 및 시그널 도입을 유도하는 마이오스타틴의 능력에 다른 방식으로 영향을 미치는 제제를 확인하는데 사용할 수 있으며, 이와 같은 제제는 작용제 또는 길항제 활성을 나타낸다. 제제의 작용이 마이오스타틴 또는 다른 GDF 수용체에 대해 특이적인지의 여부를 확인하기 위하여 적당한 대조 반응을 실시한다.
본 발명의 스크리닝 방법을 수행하기에 적당한 조건은 본 명세서에 개시된 방법(실시예 7 및 9)이나 당해 기술분야에 공지된 다른 방법을 비롯하여 마이오스타틴이 그 수용체와 특이적으로 상호작용할 수 있도록 하는 모든 조건일 수 있다. 따라서, 스크리닝 분석을 수행하기에 적당한 조건으로는, 예컨대 실질적으로 정제된 마이오스타틴 수용체를 이용하는 시험관내 조건; 마이오스타틴 수용체를 정상적으로 발현하는 세포, 예컨대 지방 세포 또는 근육 세포, 또는 표면에 기능성 마이오스타틴 수용체를 발현하도록 유전자 변형시킨 세포를 이용하는 세포 배양 조건; 또는 유기체 내에서 발생하는 것과 같은 동일계내 조건이 있다.
본 발명의 스크리닝 방법은 또한 전술한 분자 모델링 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 분자 모델링 방법의 이용은 잠재적 제제의 조합형 라이브러리와 같은 대규모 집단 중에서, GDF 수용체와 특이적으로 상호작용할 가능성이 가장 커서 생물학적 분석법을 사용한 스크리닝을 필요로 하는 잠재적 제제의 수를 감소시키는 제제를 확인할 수 있는 편리하고 저렴한 수단을 제공한다. 이러한 분자 모델링 방 법을 사용하여 Act RIIB와 같은 GDF 수용체와 특이적으로 상호작용하는 제제를 확인하면, 선별한 제제를 가지고 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 세포에 미치는 마이오스타틴과 같은 GDF의 효과를 조절하는 능력을 조사할 수 있다.
마이오스타틴의 효과를 조절하는 시험 제제의 능력은 본 명세서에 개시된 방법(실시예 7 및 9)이나 당해 기술분야에 공지된 다른 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 본 명세서에 포괄적으로 사용된 "시험 제제" 또는 "시험 분자"란 용어는 본 발명의 방법에서 작용제 또는 길항제 활성에 대하여 조사되는 모든 제제를 의미하는 것이다. 이 방법은 본 명세서에 기술된 바와 같은 작용제 또는 길항제로서 작용할 수 있는 미지의 분자를 확인하는 스크리닝 분석법으로서 일반적으로 사용되기는 하지만, 이 방법들은 또한 특정 활성이 있는 것으로 알려진 제제가 예컨대 상기 제제의 활성을 표준화하는 활성이 있는지를 확인하는데 사용할 수도 있다.
본 발명의 방법은 예를 들어 Act RIIB 수용체를 발현하도록 유전자 변형시킨 세포와 마이오스타틴을 접촉시킨 뒤, 제제, 예컨대 우성의 음성 Act RIIB의 효과를, 마이오스타틴 시그널 도입 경로에 관여하는 Smad 폴리펩타이드의 인산화를 조사하여 측정함으로써 수행할 수 있다. 필요한 경우에는, 마이오스타틴 시그널 도입 경로, 예컨대 Smad 경로의 활성화에 따라 발현이 달라지는 리포터 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 세포를 추가로 유전자 변형시킬 수 있고, 시험 제제의 효과는 이 제제, 마이오스타틴 또는 그 혼합물의 존재 및 부재하에 리포터 뉴클레오타이드 서열의 발현을 비교하여 결정할 수 있다. 리포터 뉴클레오타이드 서열의 발현은 예를 들어, 리포터 뉴클레오타이드 서열의 RNA 전사체를 측정하거나 또는 리포터 뉴 클레오타이드 서열이 암호하는 폴리펩타이드를 측정하여 검출할 수 있다. 폴리펩타이드 리포터로는, 예컨대 β-락타마제, 클로람페니콜 아세틸트란스퍼라제, 아데노신 디아미나제, 아미노글리코사이드 포스포트란스퍼라제, 디하이드로폴레이트 리덕타제, 하이그로마이신-B 포스포트란스퍼라제, 티미딘 키나제, β-갈락토시다제, 루시퍼라제 또는 크산틴 구아닌 포스포리보실트란스퍼라제 폴리펩타이드 등이 있고, 예를 들어 방사능, 발광성, 화학발광성, 형광성, 효소 활성 또는 리포터 폴리펩타이드에 의한 특이적 결합을 측정하여 검출할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법은 고수율 분석법으로 변형될 수 있는 장점을 제공하며, 따라서 시험 제제의 조합 라이브러리를 스크리닝하여, 마이오스타틴과 마이오스타틴 수용체의 특이적 상호작용을 변화시킬 수 있는 제제를 비롯한, 세포에 미치는 마이오스타틴의 특이적 상호작용을 변화시킬 수 있는 제제를 확인할 수 있다. 바람직한 활성을 얻기 위해 시험할 수 있는 분자의 조합 라이브러리를 제조하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 그 예로는 억제 펩타이드(constrained peptide)일 수 있는 펩타이드의 파지 디스플레이 라이브러리(예컨대, 미국 특허 제5,622,699호; 미국 특허 제5,206,347호; Scott and Smith, Science 249: 386-390, 1992; Markland et al., Gene 109:13-19, 1991; 각 문헌은 참고인용됨); 펩타이드 라이브러리(미국 특허 제5,264,563호, 참고인용됨); 펩타이드모방체 라이브러리(Blondelle et al., Trends Anal. Chem. 14:83-92, 1995); 핵산 라이브러리(O'Connell et al., 상기문헌참조, 1996; Tuerk and Gold, 상기 문헌 참조, 1990; Gold et al., 상기문헌참조, 1995; 각 문헌은 참고인용된 것임); 올리고사카 라이드 라이브러리(York et al., Carb. Res., 285:99-128, 1996; Liang et al., Science, 274: 1520-1522, 1996; Ding et al., Adv. Expt. Med. Biol., 376: 261-269, 1995; 각 문헌은 참고인용됨); 지단백질 라이브러리(de Kruif et al., FEBS Lett., 399: 232-236, 1996, 참고인용됨); 당단백질 또는 당지질 라이브러리(Karaoglu et al., J.Cell Biol., 130: 567-577, 1995, 본원에 참고인용됨); 또는 예컨대 약물이나 다른 약학적 제제를 함유하는 화학적 라이브러리(Gordon et al., J.Med.Chem., 37:1385-1401, 1994; Ecker and Crooke, Bio/Technology, 13:351-360, 1995; 각 문헌은 참고인용됨)를 제조하는 방법이 있다. 폴리뉴클레오타이드는 마이오스타틴과 그 수용체와의 특이적 상호작용을 조절할 수 있는 제제로서 특히 유용한데, 그 이유는 세포 표적, 예컨대 세포 폴리펩타이드에 대해 결합 특이성이 있는 핵산 분자가 자연에 존재하는 것이고, 그 특이성이 있는 합성 분자는 용이하게 제조 및 동정될 수 있기 때문이다(예컨대 참고인용되는 미국 특허 제5,750,342호 참조).
본 명세서의 개시내용을 통해 알 수 있듯이, 본 발명의 방법을 실시하는데 유용한 제제를 확인하기 위한 연구 수단으로서 다양한 동물 모델 시스템을 사용할 수 있다. 예를 들어, 트랜스게닉 마우스 또는 다른 실험 동물은 본 명세서에 개시된 다양한 마이오스타틴 억제제 작제물을 사용하여 제조할 수 있고, 인간을 제외한 트랜스게닉 유기체에서 특정 제제를 다양한 농도로 발현시켜 나타나는 효과를 측정함으로 써 상기 유기체가 직접 조사될 수 있다. 또한, 트랜스게닉 유기체, 예컨대 트랜스게닉 마우스를 다른 마우스, 예컨대 ob/ob, db/db 또는 아고티 치사 황색 돌 연변이 마우스와 교배하여 비만증, II형 당뇨병 등의 질환을 치료 또는 예방하는데 유용한 마이오스타틴 억제제의 최적 발현 농도를 측정할 수 있다. 본 발명 자체는 인간을 제외한 트랜스게닉 유기체, 보다 상세하게는 마이오스타틴 시그널 펩타이드를 포함할 수 있는 마이오스타틴 프로도메인, 프로펩타이드(실시예 참조)를 암호하는 폴리뉴클레오타이드 또는 돌연변이 프로마이오스타틴 폴리펩타이드를 암호하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 트랜스게닉 유기체를 제공한다. 또한, 본 발명은 다량의 폴리스타틴을 발현하거나 또는 우성의 음성 Act IIB 수용체(실시예 참조)를 발현하는 인간을 제외한 돌연변이 유기체를 제공한다. 이와 같은 유기체는 마이오스타틴 녹아웃 마우스에서 관찰되는 것과 유사하게 근육량이 급격히 증가한다(예컨대, 참고인용되는 미국 특허 제5,994,618호 참조). 본 명세서에서 논의되는 바와 같이, 이와 같은 동물 모델은 치료용 및 농업용으로 근육 성장을 향상시키는 제제를 확인하는데 중요하다. 인간을 제외한 트랜스게닉 동물을 제조하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다(예컨대, 미국 특허 제6,140,552호; 제5,998,698호; 제6,218,596호, 각 문헌은 본원에 참고인용된 것임).
본 발명의 마이오스타틴 폴리뉴클레오타이드는 임의의 유기체, 예컨대 마우스, 래트, 소, 돼지, 인간, 닭, 양, 칠면조, 핀피쉬 및 다른 수생 유기체와 기타 종에서 얻은 것이다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 본원에 기술된 바와 같은 트랜스게닉 동물을 제조하는데 사용될 수 있다. 트랜스게닉 개체를 제조할 수 있는(또한 마이오스타틴 폴리뉴클레오타이드를 얻을 수 있는) 수생 동물의 예로는 피시나(Piscina) 강에 속하는 것, 예컨대 연어, 송어, 곤들매기류, 아유(ayu), 잉어, 중어, 금붕어, 잉어과 민물고기(roach), 뱅어, 뱀장어, 붕장어, 정어리, 제브라피쉬, 날치, 농어과 식용어(sea bass), 감성돔과 식용어(sea bream), 패롯 바스, 도미류, 고등어, 다랑어, 참치, 가다랭이, 방어류, 볼락, 플루크, 혀가자미, 가자미목, 복어류, 쥐치; 두족류 강에 속하는 것, 예를 들어, 오징어, 뼈오징어, 낙지; 부족류 강에 속하는 것, 예를 들어, 대합조개(예, 경갑류, 마닐라, 대합류조개(Quahog), 서프(Surf), 연갑류); 새조개, 홍합, 수주고둥; 가리비(예, 바다, 만, 칼루); 소라류, 뱀장어, 해삼; 피조개; 굴(예, C.버지니카(C. virginica), 걸프, 뉴질랜드, 태평양); 복족류 강에 속하는 것, 예를 들어 터번 조가비, 전복(예, 녹색, 핑크, 적색); 갑각류 강에 속하는 것, 예컨대 바다가재, 비제한적으로 대하, 락(Rock) 및 아메리칸(American) 바다가재; 참새우류; 작은새우, 예컨대, 비제한적으로 M.로젠버지(M. rosenbergii), P.스틸롤(P. styllrolls), P.인디커스(P. indicus), P.제포니오스(P. jeponious), P.모노돈(P. monodon), P.반네멜(P. vannemel), M.엔시스(M. ensis), S.멜란토(S. melantho), N.노르브지어스(N. norvegious), 냉수 새우; 게, 예컨대, 비제한적으로 블루(Blue), 룩(rook), 스톤(stone), 킹, 퀸, 스노우(snow), 갈색, 식용게, 요나(Jonah), 망그로브(Mangrove), 연갑성 게; 갯가재, 크릴새우, 랑고스티노스(langostinos); 가재, 예컨대, 비제한적으로, 블루, 마론(Marron), 레드 크로우(Red Claw), 레드 스웜프(Red Swamp), 연갑성 가재, 백색 가재; 환형동물문; 척삭 동물문, 예컨대, 비제한적으로 악어, 거북과 같은 파충류; 양서류, 예컨대 개구리; 및 극피동물, 예컨대 비제한적으로 섬게가 있다.
트랜스게닉 동물을 제조하는 방법은 다양한 방법이 공지되어 있다. 그 중 하나로서, 전핵단계의 배아("1 세포 배아")를 암컷에서 수거한 뒤, 이 배아에 트랜스유전자를 미량주사하여, 트랜스유전자(transgene)를 최종의 성숙 동물의 생식 세포와 체세포내 염색체에 통합시키는 방법이 있다. 다른 방법으로, 배아 줄기 세포를 분리한 뒤, 이 줄기 세포에 일렉트로포레이션, 플라스미드 형질감염 또는 미량주사를 통해 트랜스유전자를 도입시킨 다음, 이 줄기 세포를 다시 배아로 재도입시켜 증식시킴으로써 생식세포계열로 키우는 방법이 있다. 폴리뉴클레오타이드를 포유류 종 내로 미량주사하는 방법은, 예컨대 미국 특허 제4,873,191호(본원에 참고인용됨)에 기술되어 있다. 또 다른 방법으로서, 배아 세포를 트랜스유전자를 함유하는 레트로바이러스로 감염시켜 배아의 생식 세포가 염색체에 통합된 트랜스유전자를 갖게 하는 방법이 있다.
트랜스게닉화될 동물이 조류인 경우에는, 수정란의 전핵으로 미량주사하는 방법은 조류의 수정란이 일반적으로 처음 20시간 동안은 난관에서 세포분열되는 바 전핵에 접근할 수 없기 때문에 문제가 된다. 따라서, 조류 종을 돌연변이화하는 데에는 레트로바이러스 감염 방법이 바람직하다(미국 특허 제5,162,215호, 본원에 참고인용됨). 미량주사가 조류 종에 사용되어야만 한다면, 이전에 낳은 알이 낳은 지 약 2.5시간이 된 후에 암탉을 죽여 배아를 수득할 수 있으며, 배반의 세포질로 트랜스유전자를 미량주사하고, 이 배아를 성숙기까지 숙주의 껍질(host shell)에서 배양한다(Love et al., Biotechnology 12, 1994). 돌연변이될 동물이 소 또는 돼지인 경우에는, 난자가 불투명하여 미량주사를 방해할 수 있는데, 이에 따라 통상적 인 차등 간섭-대비 현미경으로 핵을 확인하기가 어려워진다. 이러한 문제를 극복하기 위하여, 쉽게 관찰할 수 있도록 전핵을 분리하기 위해 먼저 난자를 원심분리한다.
본 발명의 인간을 제외한 트랜스게닉 동물은 소, 돼지, 양, 어류, 조류 또는 다른 동물일 수 있다. 트랜스유전자는 다양한 발달 단계의 배아 표적 세포로 도입시킬 수 있는데, 배아 표적 세포의 발달 단계에 따라 다른 방법을 선택한다. 미량주사의 최적의 표적은 접합체이다. 유전자 전이용 표적으로서 접합체의 사용은 주사된 DNA가 제1 분열 이전에 숙주의 유전자로 도입될 수 있다는 주요 장점이 있다(Brinster et al., Proc.Natl.Acad.Sci., USA 82:4438-4442, 1985). 결과적으로, 인간을 제외한 트랜스게닉트 동물의 모든 세포는 도입된 트랜스유전자를 운반하여, 생식 세포의 50%가 트랜스유전자를 보유하게 되는, 창시자(founder)의 자손에게 트랜스유전자를 효과적으로 전달할 수 있다.
트랜스게닉 동물은 각각 번식에 사용되는 세포 내에 외인성 유전자 물질을 포함하는 2종의 키메라 동물을 이종교배시킴으로써 수득할 수 있다. 수득되는 자손의 25%는 외인성 유전자 물질에 대해 동형접합성인 돌연변이 동물이고, 50%는 이형접합성이며, 나머지 25%는 외인성 유전자 물질 없이 야생형 표현형을 갖는 것이다.
미량주사법에서, 트랜스유전자는 예를 들어 겔 전기영동법을 사용하여 임의의 벡터 DNA로부터 절단하여 정제한다. 이 트랜스유전자는, 전사에 관여하는 세포 단백질과 상호작용하여 구성형 발현, 조직 특이적 발현, 발생 단계 특이적 발현 등을 제공하는, 작동가능하게 결합된 프로모터를 포함할 수 있다. 이와 같은 프로모 터로는 사이토메갈로바이러스(CMV), 몰로니 백혈병 바이러스(MLV), 및 헤르페스 바이러스 유래의 프로모터 뿐만 아니라, 메탈로티오네인, 골격 액틴, 포스페놀피루베이트 카르복실라제(PEPCK), 포스포글리세레이트(PGK), 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 및 티미딘 키나제(TK)를 암호하는 유전자 유래의 프로모터가 있다. 바이러스의 장말단 반복체(LTR), 예컨대 루스 육종 바이러스 LTR 유래의 프로모터 역시 사용할 수 있다. 트랜스게닉화될 동물이 조류인 경우에는 닭 β-글로빈 유전자, 닭 리소자임 유전자 및 조류 벽혈병 바이러스의 프로모터 등이 바람직한 프로모터이다. 배아 줄기 세포의 플라스미드 형질감염에 유용한 작제물은 부가의 조절 인자를 이용하는데, 그 예로는 전사를 자극하는 인헨서 인자, 스플라이싱 공여체, 종결 및 폴리아데닐화 시그널, 해독을 위한 리보솜 결합 부위 등이 있다.
레트로바이러스 감염법에서, 비인간의 성장 배아는 시험관내 배양을 통해 낭포 단계로 성장시킬 수 있다. 이 시기 동안의 난할구는 레트로바이러스 감염의 표적이 될 수 있다(Jaenich, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 73:1260-1264, 1976). 난할구의 효과적인 감염은 투명대를 제거하는 효소 처리로 얻어진다[Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986]. 트랜스유전자의 도입에 사용되는 바이러스 벡터 시스템은 일반적으로 트랜스유전자를 운반하는 복제 결손형 레트로바이러스이다(Jahner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:6927-6931, 1985; Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:6148-6152, 1985). 형질감염은 단층의 바이러스 생산 세포 상에서 난할구를 배양함으로써 용이하고 효과적으로 얻어진다(Van der Putten et al., 상기문헌참 조, 1985; Stewart et al., EMBO J. 6:383-388, 1987). 대안적으로, 이후의 단계에서 감염을 실시할 수도 있다. 즉, 바이러스 또는 바이러스 생산 세포를 분할강에 주사할 수 있다(Jahner et al., Nature 298: 623-628, 1982). 창시자의 대부분은 트랜스유전자가 모자이크되어 있는데, 이것은 비인간 트랜스게닉 동물을 형성한 세포의 일부에서만 도입이 일어나기 때문이다. 또한, 창시자는 게놈의 여러 위치에 트랜스유전자의 다양한 레트로바이러스 삽입체를 포함할 수 있으며, 이는 일반적으로 자손에서 분리되게 된다. 또한, 트랜스유전자는 임신중기 배아의 자궁내 레트로바이러스 감염에 의해 낮은 효율이지만 생식세포계열로 도입될 수도 있다(Jahner et al., 상기문헌참조, 1982).
배아 줄기 세포(ES) 역시 트랜스유전자 도입의 표적이 될 수 있다. ES 세포는 시험관내 배양된 착상전 배아에서 수득하여 배아와 융합시킨다(Evans et al., Nature 292:154-156, 1981; Bradley et al., Nature 309:255-258, 1984; Gossler et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83:9065-9069, 1986; Robertson et al., Nature 322:445-448, 1986). 트랜스유전자는 DNA 형질감염이나 레트로바이러스 매개 형질도입에 의해 ES 세포로 효과적으로 도입될 수 있다. 이와 같이 형질전환된 ES 세포는 그 다음 인간을 제외한 동물의 낭포와 합체될 수 있다. 그 다음, 이 ES 세포를 배아에 이식하면 최종 키메라 동물의 생식세포계열이 된다(Jaenishc, Science 240:1468-1474, 1988).
본 명세서에 개시한 바와 같이, 마이오스타틴은 적어도 부분적으로 Smad 시그널 도입 경로를 통해 그 활성을 발휘할 수 있으며, 마이오스타틴 발현은 다양한 병리학적 증상과 관련이 있을 수 있다. 본 발명은 자체적으로 비만증과 II형 당뇨병 같은 대사적 증상을 비롯한, 마이오스타틴과 관련된 다양한 병리학적 증상을 치료하기 위한 새로운 표적을 제공한다. 따라서, 본 발명은 피검체의 근육 세포 또는 지방 조직 세포에서 마이오스타틴 시그널 도입을 조절하여, 근육이나 지방 조직의 이상 함량, 이상 발생 또는 이상 대사 활성을 적어도 부분적인 특징으로 하는 피검체의 병리학적 증상의 정도를 경감시키는 방법을 제공한다.
마이오스타틴은 근육 성장의 음성 조절인자로서 작용한다(McPherron et al., 상기문헌참조, 1997). 마이오스타틴 녹아웃 마우스는 야생형 한배새끼 보다 약 25 내지 30% 이상 체중이 더 나가고, 이와 같이 조사된 마우스의 체중 증가는 전적으로 골격 근조직 중량의 급격한 증가 때문이었다. 마이오스타틴이 결여된 마우스에서, 골격 근육량은 야생형 한배새끼의 대응 근육량의 약 2 내지 3배 정도였다. 이와 같은 동형접합성 녹아웃 마우스에서의 근육량의 증가는 이상증식과 비대의 조합으로부터 나타났다.
본 명세서에 개시된 바와 같이, 이형접합성 마이오스타틴 녹아웃 마우스 역시 골격 근육량의 증가를 나타내었고, 그 정도는 동형접합성 돌연변이 마우스에서 관찰된 양보다 적었으며, 이로부터 마이오스타틴이 생체내에서 용량 의존적 방식으로 작용한다는 것을 알 수 있었다(실시예 1 참조). 또한, 동물에서 마이오스타틴의 과잉발현은 근육 성장 면에서 반대 효과를 나타낸다. 예를 들어, 마이오스타틴 발현 종양을 보유하는 누드 마우스는 근육과 지방 중량의 급격한 상실을 특징으로 하는 소모성 증후군을 나타내었다(실시예 8). 누드 마우스의 이러한 증상은 암이나 AIDS 같은 만성 질환 환자에서 나타나는 악액질 상태와 유사하였다.
마이오스타틴 면역반응성 물질의 혈청 농도는 근육 소모증이 있는 환자의 상태와 상호관련성이 있다(Gonzalez-Kadavid et al., Proc. Natl. Acad. Med., USA 95:14938-14943, 1998, 본원에 참고인용됨). 즉, 총 체중 감소로 악액질 징후를 보인 AIDS 환자의 마이오스타틴 면역반응성 물질의 혈청 농도는 체중이 감량되지 않은 AIDS 환자 또는 AIDS를 앓고 있지 않은 정상 남성에 비하여 약간 증가하였다. 하지만, 이 결과의 해석은, 혈청 시료에서 검출된 마이오스타틴 면역반응성 물질이 진정 프로세싱된 마이오스타틴에 대해서 예측된 SDS 겔 상의 이동성을 나타내지 않았기 때문에 설명하기가 어려웠다.
본 명세서에 개시하였듯이, 마이오스타틴은 근육량 뿐만 아니라 유기체의 전반적 대사에도 영향을 미친다. 예를 들어, 마이오스타틴은 지방 조직에서 발현되고, 마이오스타틴 결손형 마우스는 나이가 들수록 지방 축적의 급격한 감소를 나타낸다(실시예 II 및 III 참조). 본 명세서에서 마이오스타틴 작용의 기작에 대해 제안하지는 않았지만, 마이오스타틴의 효과는 지방 조직에 미치는 마이오스타틴의 직접적인 효과, 또는 골격 근조직에 미치는 마이오스타틴 활성의 결여로 나타나는 간접 효과일 수 있다. 이러한 기작에도 불구하고, 마이오스타틴 활성의 감소에 대한 반응으로 나타나는 근조직에서의 전반적인 합성대사 효과는 유기체의 전반적인 대사를 변화시켜 지방 형태의 에너지 저장에 영향을 미칠 수 있는데, 이것은 비만 마우스 종(아고티 치사 황색(Ay) 마우스)에 마이오스타틴 돌연변이를 도입한 결과 지방 축적이 5배까지 억제되는 것으로 나타난 실험을 통해 확인하였다(실시예 5 참 조). 이상 글루코스 대사 역시 마이오스타틴 돌연변이를 함유하는 아고티 마우스에서 부분적으로 억제되었다. 이와 같은 결과로부터, 마이오스타틴 억제가 비만증 및 II형 당뇨병 같은 대사 질환을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명의 방법은, 예를 들어 암과 같은 만성 질환과 관련된 악액질(Norton et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol. 7:289-327, 1987) 및 II형 당뇨병, 비만증 및 다른 대사 질환 등의 증상을 비롯한 다양한 병리학적 증상의 중증도를 경감시키는데 유용하다. 본 명세서에 사용된 "병리학적 증상"이란 용어는 근육이나 지방 조직의 이상 함량, 발달 또는 대사 활성을 적어도 부분적인 특징으로 나타내는 장애를 의미한다. 이와 같은 병리학적 증상, 예컨대 비만증; 비만증과 관련있는 증상, 예컨대 동맥경화증, 고혈압 및 심근 경색과 관련된 증상; 근육 발생장애, 신경근육병, 악액질 및 식욕부진과 같은 근육 소모성 장애; 및 일반적으로 비만증과 관련이 있지만 반드시 그렇지는 않은 II형 당뇨병 같은 대사 장애는 본 발명의 방법을 사용하여 치료하기가 특히 쉽다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 근육이나 지방 조직의 함량, 발달 또는 대사 활성과 관련하여 사용된 "이상"이란 용어는 전문임상의 또는 다른 관련 당업자가 정상이거나 전형적인 것으로 이해하는 함량, 발달 또는 대사 활성과 비교하여 상대적 의미로 사용한 것이다. 이와 같은 정상이나 전형적인 값은 임상의에게 공지되어 있고, 해당 집단 내의 건강한 개체에서 일반적으로 관찰되거나 요구되는 평균 값에 근거하고 있다. 예를 들어, 임상의는 특정 신장과 체형의 사람에 있어서 "전형적" 체중 범위의 약 20% 이상인 체중일 때 비만증이라고 알고 있을 수 있다. 하지만, 바디빌더는 다른 해당 집단 내의 동일한 체중과 체형의 사람에 대해서 예상된 체중 보다 20% 이상인 체중이라고 해서 단순하게 반드시 비만인 것은 아님을 알 것이다. 이와 마찬가지로, 근육 활성의 이상 감소를 나타내는 증례를 보이는 환자는, 예컨대 환자에게 다양한 강도 시험을 실시하고 그 결과를 해당 집단 내의 건강한 평균 개체에서 예상되는 결과와 비교함으로써, 근육의 이상 발달을 보유하는지 여부를 확인할 수 있음을 당업자라면 잘 알고 있을 것이다.
본 발명의 방법은, 근육이나 지방 조직에서 이상 함량, 발달 또는 대사 활성을 적어도 부분적인 특징으로 나타내는 병리학적 증상의 정도를, 이 증상의 병인과 관련있는 근육이나 지방 조직 세포의 마이오스타틴 시그널 도입을 조절함으로써 경감시킬 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 병리학적 증상의 정도와 관련하여 사용된 "경감시키다"라는 용어는 그 증상과 관련된 징후 또는 증후가 감소된다는 것을 의미한다. 모니터되는 징후나 증후는 특정 병리학적 증상의 특징으로서, 이 징후와 증상을 모니터하는 방법과 마차가지로 전문임상의라면 잘 알고 있는 것이다. 예를 들어, 병리학적 증상이 II형 당뇨병이라면, 전문임상의는 피검체에서 글루코스 농도, 글루코스 제거 속도 등을 모니터할 것이다. 병리학적 증상이 비만증이나 악액질이라면 임상의는 간단히 피검체의 체중을 모니터할 것이다.
피검체에게 투여하는 제제는 표적 세포와 제제의 접촉이 용이하고, 적당한 경우에는 세포로의 유입이 용이한 상태하에서 투여한다. 폴리뉴클레오타이드 제제의 세포로의 유입은 예컨대, 세포에 감염될 수 있는 바이러스 벡터에 폴리뉴클레오 타이드를 도입시킴으로써 용이하게 이루어질 수 있다. 세포 종류에 특이성이 있는 바이러스 벡터를 입수할 수 없는 경우에는, 표적 세포에서 발현되는 리간드(또는 수용체)에 특이적인 수용체(또는 리간드)를 발현하도록 벡터를 변형시키거나 또는 이러한 리간드(또는 수용체)를 포함하도록 변형시킬 수 있는 리포좀 내에 벡터를 캡슐화하는 방법이 있다. 펩타이드 제제는 다양한 방법으로 세포에 도입시킬 수 있는데, 그 일 예로서 세포 내로 펩타이드의 전위를 용이하게 할 수 있는 단백질 도입 도메인, 예컨대 인간 면역결핍 바이러스 TAT 단백질 도입 도메인을 펩타이드에 포함시키는 방법이 있다(Schwartze et al., 상기문헌참조, 1999; Derossi et al., 상기문헌참조, 1996).
표적 세포 내의 제제의 존재는 예컨대 검출가능한 라벨을 제제에 작동가능하게 결합시키거나, 제제, 특히 펩타이드 제제에 특이적인 항체를 사용하거나, 또는 이 제제에 의한 하류의 효과, 예컨대 세포에서 Smad 폴리펩타이드의 감소된 인산화를 측정함으로써 직접 확인할 수 있다. 제제는 당해 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 검출할 수 있도록 라벨화될 수 있다(Hermanson, "Bioconjugate Techniques"(Academic Press, 1996), 본원에 참고인용됨; Harlow and Lane, 상기문헌참조, 1988). 예를 들어, 펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 제제는 방사능라벨, 알칼리성 포스파타제와 같은 효소, 바이오틴, 플루오로크롬 등을 포함하는 다양한 검출가능성 잔기로 라벨화될 수 있다. 제제가 키트에 내장되는 경우에는, 제제를 라벨화하는 시약 역시 키트에 포함시키거나 또는 라벨화 시약은 별도로 시판품을 구입하여 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에 유용한 제제는 병리학적 증상 부위로 투여하거나 또는 폴리뉴클레오타이드 또는 펩타이드를 가진 표적 세포를 제공하는 임의의 방법으로 투여할 수 있다. 본 명세서에 사용된 "표적 세포"란 용어는 제제와 접촉되어야 하는 근육 세포 또는 지방세포를 의미한다. 살아있는 피검체에게 투여하기 위해서는, 제제는 일반적으로 피검체에게 투여하기에 적합한 약학적 조성물로 조제하는 것이 좋다. 따라서, 본 발명은 세포에서 마이오스타틴 시그널 도입을 조절하기에 유용한 제제를 약학적 허용성 담체에 함유하는 약학적 조성물을 제공한다. 또는, 제제 자체가 본 명세서에 명시된 병리학적 증상을 앓고 있는 피검체를 치료하는 약제로서 유용하게 사용될 수 있다.
약학적 허용성 담체는 당해 기술분야에 공지되어 있는데, 그 예로는 물이나 생리적 완충 식염수 또는 글리콜, 글리세롤 같은 다른 용매나 부형제, 올리브유 같은 오일 또는 주사용 유기 에스테르 등이 있다. 약학적 허용성 담체는 예컨대 접합체의 흡수를 증가시키거나 안정화하는 생리적 허용성 화합물을 포함할 수 있다. 이와 같은 생리적 허용성 화합물로는, 예컨대 글루코스, 슈크로스 또는 덱스트란 같은 탄수화물, 아스코르브산이나 글루타치온과 같은 항산화제, 킬레이트화제, 저분자량 단백질이나 다른 안정화제 또는 부형제가 있다. 당업자라면, 생리적 허용성 화합물을 비롯한 약학적 허용성 담체의 선택이 예컨대 치료제의 물리화학적 특성과 조성물의 투여 경로, 예컨대 정맥내, 주사, 삽관이나 다른 당해 기술분야에 공지된 방법과 같은 경구 또는 비경구 경로 등에 따라 달라진다는 것을 잘 알 것이다. 또한, 약학적 조성물은 진단 시약, 영양 물질, 독소 또는 치료제, 예컨대 암 화학치 료제와 같은 제2 시약을 함유할 수도 있다.
제제는 캡슐화 재료 내에 예컨대 수중유 에멀젼, 마이크로에멀젼, 미셀, 복합 미셀, 리포좀, 미소구 또는 다른 중합체 기질로 도입될 수 있다(예컨대, Gregoriadis, Liposome Technology, Vol.1 (CRC Press, Boca Raton, FL 1984); Fraley, et al., Trends Biochem.Sci., 6:77(1981), 각 문헌은 본원에 참고인용됨). 리포좀은 예를 들어 인지질이나 다른 지질로 이루어지고, 비독성이며 생리적 허용성이고 대사가능한 담체로서, 제조 및 투여가 비교적 간단하다. "스텔스(stealth)" 리포좀(예컨대, 미국 특허 제5,882,679호; 제5,395,619호; 및 제5,225,212호, 각 문헌은 참고인용됨)은 본 발명의 방법을 실시하는데 유용한 약학적 조성물의 제조에 특히 유용한 상기 캡슐화 재료의 일 예이고, 다른 "매스킹된(masked)" 리포좀도 이와 유사하게 사용될 수 있는데, 이와 같은 리포좀은 치료제가 혈행중에 유지되는 시간을 연장시킨다. 예를 들어, 양이온성 리포좀은 특정 수용체 또는 리간드로 변형될 수 있다(Morishita et al., J.Clin.Invest., 91:2580-2585(1993), 본원에 참고인용됨). 또한, 폴리뉴클레오타이드 제제는 예를 들어, 아데노바이러스-폴리라이신 DNA 복합체를 사용하여 세포로 도입시킬 수도 있다(예, Michael et al., J.Biol.Chem. 268:6866-6869(1993), 참고인용됨).
마이오스타틴 시그널 도입을 변화시키는 제제를 함유하는 약학적 조성물을 투여하는 경로는 부분적으로 분자의 화학 구조에 따라 달라진다. 예를 들어, 폴리펩타이드와 폴리뉴클레오타이드는 경구 투여하는 경우에는 특히 유용하지 않은데, 그 이유는 이 성분이 소화관에서 분해될 수 있기 때문이다. 하지만, 예를 들어 내 인성 프로테아제에 의한 분해 감수성을 감소시키고 소화관을 통한 흡수성을 향상시키기 위한 폴리펩타이드의 화학적 변형 방법이 이미 잘 알려져 있다(예컨대, Blondelle et al., 상기 문헌설명 참조, 1995; Ecker and Crook, 상기문헌설명 참조, 1995). 또한, 펩타이드 제제는 D-아미노산을 사용하여 제조하거나 또는 펩타이드 도메인의 구조를 모방하는 유기 분자인 펩타이드모방체를 주성분으로 한 1 이상의 도메인을 포함하거나; 또는 비닐위치치환 펩토이드와 같은 펩토이드를 주성분으로 한 1 이상의 도메인을 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시한 약학적 조성물은 경구 또는 비경구, 예컨대 정맥내, 근육내, 피하, 안와내, 캡슐내, 복강내, 직장내, 수조내 등을 포함하는 다양한 경로,또는 예컨대 피부 패치 또는 경피성 이온삼투요법 등을 이용한 피부를 통한 수동 또는 촉진 흡수에 의해 각각 개체에게 투여될 수 있다. 또한, 약학적 조성물은 주사, 삽관, 경구 또는 국소 투여될 수 있는데, 이 중 후자는 연고를 직접 도포함에 의한 수동형이거나, 또는 비측 분무제 또는 흡입제 등을 이용하는 능동형일 수 있으며, 능동형의 경우, 조성물 중의 한 성분은 적당한 추진제이다. 또한, 약학적 조성물은 병리학적 증상 부위에 투여할 수 있는데, 예컨대 종양에 공급되는 혈관에 정맥내 또는 동맥내로 투여할 수 있다.
본 발명의 방법을 실시하는데 있어서 제제의 총 투여량은 단독 투여량으로, 환괴 또는 주입에 의해 비교적 단시간에 걸쳐 피검체에게 투여할 수 있거나 또는 복수의 투여량을 장시간에 걸쳐 투여하는 분획 치료 방법으로 투여할 수 있다. 당업자라면, 피검체의 병리학적 증상을 치료하기 위한 약학적 조성물의 양이 피검체 의 연령과 일반 건강 상태는 물론 투여 경로와 투여될 치료 횟수 등의 다양한 요인에 따라 달라진다는 것을 잘 알고 있을 것이다. 이러한 요인에 따라 당업자는 필요에 따라 특정 용량으로 조정할 수 있다. 일반적으로 약학적 조성물의 제형과 투여 경로 및 횟수는 먼저 단계 I 및 단계 II 임상 시험을 통해 결정해둔다.
약학적 조성물은 경구 제제, 예컨대 정제, 또는 용액이나 현탁액 형태로 제조되거나; 또는 장용 또는 비경구 형태에 적합한 유기 또는 무기 담체 또는 부형제와의 혼합물을 포함하고, 예를 들어 정제, 환제, 캅셀, 좌약, 용제, 에멀젼, 현탁제 또는 다른 적합한 사용 형태에 통상적인 비독성 약학적 허용성 담체와 배합될 수 있다. 전술한 것 외에도 담체는 글루코스, 락토스, 만노스, 아카시아검, 젤라틴, 만니톨, 전분 페이스트, 삼규산마그네슘, 탈크, 옥수수전분, 케라틴, 콜로이드성 실리카, 감자 전분, 우레아, 중간 사슬 길이의 트리글리세라이드, 덱스트란 및 기타 다른 고형, 반고형, 또는 액형 제조물을 제조하는데 적합한 다른 담체를 포함할 수 있다. 또한, 보조제, 안정화제, 증점제 또는 착색제 및 향료가 사용될 수 있으며, 그 예로는 트리울로스와 같은 안정화 건조제가 있다(예컨대, 미국 특허 제5,314,695호 참조).
본 발명은 또한 피검체에서 근조직이나 지방 조직의 성장을 조절하는 방법을 제공한다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, Act RIIA 및 Act RIIB와 같은 GDF 수용체는 마이오스타틴과 같은 GDF의 효과를 매개하는데 관여하고, 이것은 근조직과 지방 조직 형성에 관여한다. 즉, 일 구체예에서, 근조직이나 지방 조직의 성장을 조절하는 방법은 GDF 수용체, 예컨대 액티빈 수용체, 예를 들어 Act RIIA 또는 Act RIIB 유래의 시그널 도입에 영향을 미치는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 우성의 음성 활성, 구성형 활성 등을 가진 돌연변이 GDF 수용체를 조직의 세포들과 접촉시키거나 또는 그 세포에서 발현시킴으로써 수행할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 유기체에서 근조직이나 지방 조직의 성장을 조절하는 방법은 마이오스타틴 시그널 도입에 영향을 미치는 제제를 유기체에 투여함으로써 실시된다. 바람직하게는, 제제는 마이오스타틴 프로도메인 또는 돌연변이 프로마이오스타틴 폴리펩타이드이거나 이를 암호하는 것으로서, 이 중 어느 하나는 마이오스타틴 시그널 펩타이드를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 "성장"이란 용어는 본 발명의 방법으로 처리된 유기체에 존재하는 근조직의 질량이나 지방 조직의 질량을, 본 발명의 방법으로 처리하지 않은 대응 유기체의 해당 질량과 비교하여 나타내어 상대적 의미로 사용된 것이다. 따라서, 본 발명의 방법이 마이오스타틴 시그널 도입이 감소 또는 억제되도록 수행되는 경우에, 유기체에서의 근조직의 성장은 마이오스타틴 시그널 도입이 감소 또는 억제되지 않은 대응 유기체(또는 유기체의 집단)에 비해 근육 질량을 증가시킨다는 것을 쉽게 알 수 있을 것이다.
본 발명의 방법은 유기체의 근육 질량을 증가시키거나 지방 함량을 감소시키거나 또는 그 둘 모두에 유용할 수 있다. 예를 들어, 이와 같은 방법이 식품 공급원으로서 유용한 유기체에 실시되는 경우에, 식품의 단백질 함량은 증가될 수 있고, 콜레스테롤 농도는 감소될 수 있으며 식품의 품질이 향상될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 유기체, 예컨대 환경에 유해한 유기체에서 근조직의 성장을 감소시켜 그 유기체의 환경에서의 경쟁력을 저하시키는데 유용할 수 있다. 즉, 본 발명의 방법은 마이오스타틴을 발현하는 임의의 진핵 유기체, 예컨대 척추동물 유기체, 그 예로서 포유동물, 조류 또는 어류 유기체에 또는 무척추 유기체, 예컨대 연체동물, 극피동물, 복족동물 또는 두족류동물에 실시될 수 있다.
제제는 본 명세서에 개시된 바와 같이 마이오스타틴 시그널 도입을 변화시키는 임의의 제제일 수 있고 임의의 편리한 방법으로 유기체에 투여할 수 있다. 예를 들어, 치료될 유기체가 수생 생물 배양에서 성장하는 어류, 새우, 가리비 등인 경우 제제는 그 유기체가 유지되는 물에 첨가하거나 또는 특히 제제가 가용성 펩타이드 또는 작은 유기 분자인 경우에는 그 사료에 첨가할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용된 제제가 펩타이드 제제, 안티센스 제제 등을 암호하는 폴리뉴클레오타이드인 경우에는, 이 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 인간을 제외한 유기체의 생식 세포를 선별하여, 이 제제를 발현하는 트랜스게닉 유기체를 제조할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 유도성 조절 인자의 제어하에 있어서, 이 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호된 제제가 한번에, 필요에 따라 일정 기간 동안 발현될 수 있는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명은 인간을 제외한 트랜스게닉 유기체 및 이 유기체에 의해 생산되는 식 제품을 제공한다. 이와 같은 식 제품은 근조직의 증가로 인하여 영양적 가치가 증가된 것이다. 인간을 제외한 트랜스게닉 동물은 본 명세서에 개시된 임의의 종, 예컨대 소, 돼지, 양, 닭. 칠면조 및 어류와 같은 척추동물 유기체 및 새우, 바다가재, 게, 오징어, 굴 및 전복 등과 같은 무척추동물 종일 수 있다.
TGF-β계 구성원들의 조절 및 이들과 세포 표면 수용체와의 특이적 상호작용 은 해명되기 시작하고 있다. 따라서, TGF-β계 구성원의 프로도메인과 다른 TGF-β계 구성원의 성숙 영역과의 동시발현은 세포내 이량체화와 관련이 있고, 생물학적 활성 동종이량체의 분비가 나타난다(Gray et al., Science 247:1328, 1990). 예를 들어, BMP-4 성숙 영역을 보유하는 BMP-2 프로도메인을 사용하였을 경우 성숙 BMP-4 발현을 급격히 증가시켰다(Hammonds et al., Mol.Endocrinol. 5:149, 1991). 연구된 이 계열의 구성원들 대부분에서, 동종이량체 종은 생물학적으로 활성인 반면, 인히빈(Ling et al., Nature 321:779, 1986) 및 TGF-β(Cheifetz et al., Cell 48:409, 1987)와 같은 다른 계열의 구성원들에서는 이종이량체가 또한 검출되었고 각각의 동종이량체와 생물학적 성질이 상이한 것으로 나타났다.
수용체-리간드 상호작용 연구는 세포가 외부 자극에 반응하는 방식과 관련하여 상당한 정보를 제시하였고, 에리스로포이에틴, 콜로니 자극 인자 및 PDGF와 같은 치료적으로 중요한 화합물의 형성을 유도하였다. 이와 같이, TGF-β계 구성원들의 작용을 매개하는 수용체를 동정하기 위한 노력은 계속되고 있다. 본 명세서에 개시한 바와 같이, 마이오스타틴은 액티빈 II형 수용체와 특이적으로 상호작용한다. 따라서, 이 상호작용의 확인은 농업용 및 인간 치료용, 예컨대 다양한 병리학적 증상, 예컨대 비만증, II형 당뇨병 및 악액질을 치료하는데 유용한 길항제 및 작용제를 확인할 수 있는 표적을 제공한다. 이러한 특이적 상호작용의 확인은 또한 다른 마이오스타틴 수용체는 물론 다른 성장 분화 인자의 특이적 수용체를 확인할 수 있는 수단을 제공한다. 따라서, 본 발명은 GDF 또는 GDF 배합물, 예컨대 마이오스타틴, GDF-11 또는 이 둘 모두와의 배합물과 특이적으로 상호작용하는 GDF 수용 체를 제공한다.
본 명세서에서 예시한 본 발명의 GDF 수용체로는, 마이오스타틴 및 GDF-11과 특이적으로 상호작용하는, 마이오스타틴 수용체, 특히 액티빈 II형 수용체가 있다. 하지만, 마이오스타틴과는 특이적으로 상호작용하나 GDF-11과는 상호작용하지 않는 마이오스타틴 수용체도 본 발명에 포함되며, 이와 마찬가지로 마이오스타틴과는 상호작용하지 않으나 GDF-11과는 특이적으로 상호작용하는 GDF-11 수용체 및 이러한 유사물들도 본 발명에 포함된다. 논의의 편리함을 위해, 본 명세서에서 본 발명의 수용체는 포괄적으로 "GDF 수용체"라 하였고, 그 예로는 최소한 마이오스타틴과 특이적으로 상호작용하는 수용체인 마이오스타틴 수용체가 있다. 이와 같이, 마이오스타틴 수용체와 마이오스타틴의 특이적 상호작용에 대하여 일반적으로 기술하였지만, 본 발명은 최소한 GDF-11과 특이적으로 상호작용하는 GDF-11 수용체를 비롯한 모든 GDF 수용체를 보다 포괄적으로 포함하는 것으로 이해해야 할 것이다.
또한, GDF 수용체 폴리펩타이드를 발현하는 재조합 세포주는 이 수용체에 특이적으로 결합하는 항체, 이 수용체를 암호하는 실질적으로 정제된 폴리뉴클레오타이드 및 실질적으로 정제된 GDF 수용체 폴리펩타이드로서 제공된다. GDF 수용체의펩타이드 부분 역시 제공되는데, 그 예로는 본 명세서에 개시된 바와 같이 마이오스타틴과 세포의 마이오스타틴 수용체와의 특이적 상호작용을 변화시킬 수 있는 마이오스타틴 수용체와 같은 GDF 수용체의 가용성 세포외 도메인; 세포에서 GDF 시그널 도입을 유도, 자극 또는 유지할 수 있는 GDF 수용체의 구성적으로 활성인 세포내 키나제 도메인 또는 마이오스타틴 또는 다른 GDF 시그널 도입을 조절하는 능력 이 있는 GDF 수용체의 다른 절두형 부분이 있다.
또한, 본 발명은 GDF 수용체 폴리펩타이드를 확인하는 방법, 예컨대 발현 라이브러리일 수 있는 게놈 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리를 뉴클레오타이드 프로브 또는 항체 프로브를 사용하여 스크리닝하는 방법; 마이오스타틴 또는 이의 기능성 펩타이드 부분과 같은 GDF 등을 사용하여, 이에 반응하여 수용체를 발현하는 세포를 스크리닝하는 방법; 전술한 바와 같이, 제1 하이브리드 성분으로서, 예컨대 GDF 펩타이드와, 제2 하이브리드 성분으로서 GDF의 수용체를 발현하는 세포로부터 제조된 cDNA 라이브러리에서 발현된 펩타이드를 사용하는 2중 하이브리드 분석법 등을 제공한다.
전술한 바와 같이, GDF 수용체, 예컨대 Act RIIB와 같은 마이오스타틴 수용체와 특이적으로 상호작용하는 제제는 그 수용체를 사용하여 상기와 같은 제제를 스크리닝함으로써 확인할 수 있다. 이와 반대로, Act RIIB 수용체와 같은 마이오스타틴 수용체와 특이적으로 상호작용하는 능력이 있는 것으로 확인된 제제는 다른 마이오스타틴 수용체 또는 다른 GDF 수용체를 스크리닝하는데 사용할 수 있다. 이와 같은 방법은 상기 제제(또는 마이오스타틴 또는 다른 GDF)와 같은 성분과, 절두형 막결합 수용체 또는 가용성 수용체일 수 있는 GDF 수용체를 발현하는 세포를, 상기 제제(또는 GDF)와 상기 수용체의 특이적 상호작용을 허용하기에 충분한 조건하에서 항온처리하는 단계; 상기 수용체에 결합된 제제(또는 GDF)를 측정하는 단계; 및 그 수용체를 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 전술한 바와 같은 분자 모델링 방법 역시 GDF 수용체 또는 이의 기능성 펩타이드 부분을 확인하는 스크리닝 방 법으로서 유용하게 사용될 수 있다.
GDF 수용체의 발현을 특징으로 하는 표현형을 가진 인간을 제외한 트랜스게닉 동물 역시 제공되며, 이 표현형은 동물의 체세포 및 생식세포에 포함된 트랜스유전자에 의해 부여되는 것이다. 트랜스유전자는 GDF 수용체, 예컨대 마이오스타틴 수용체 폴리펩타이드를 암호하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 이와 같은 트랜스게닉 동물을 제조하는 방법은 본 명세서에 개시되거나 당해 기술분야에 공지되어 있다.
본 발명은 GDF 수용체 전체 또는 이의 펩타이드 부분을 암호하는 실질적으로 정제된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. GDF 수용체로서 본 명세서에 예시한 것은 액티빈 II형 수용체이지만, 액티빈 II형 수용체를 암호하는 폴리뉴클레오타이드는 이미 개시된 바 있다(미국 특허 제5,885,794호). 따라서, 이러한 액티빈 II형 수용체는 본 발명에 포함되지 않는 것으로 이해되어야 한다(Massague, 상기문헌설명 참조; Heldin et al., 상기문헌설명 참조, 1997). 이와 마찬가지로, 액티빈 I형 수용체, 예컨대 Act RIB; TGF-β수용체, 예컨대 TGF-β RI 및 TGF-β RII; 및 BMP 수용체, 예컨대 BMP RIA, BMP RIB 및 BMP RII도 이미 개시된 것이고 당해 기술분야에 공지되어 있어서(Massague, 상기문헌설명 참조 1998; Heldin et al., 상기문헌설명 참조, 1997), 본 발명의 GDF 수용체에 포함되지 않는다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 마이오스타틴 수용체 활성, 예컨대 마이오스타틴 결합 활성을 가진 폴리펩타이드를 암호하거나, 또는 돌연변이 마이오스타틴 수용체, 예컨대 키나제 도메인에 돌연변이가 있어서 우성의 음성 마이오스타틴 수 용체(상기 설명 참조)로서 작용하는 돌연변이 마이오스타틴 수용체를 암호할 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 자연 발생 폴리뉴클레오타이드, 합성 폴리뉴클레오타이드 또는 의도적으로 조작된 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 예를 들어, mRNA 서열의 부분은 대안적인 RNA 스플라이싱(alternate RNA splicing) 패턴 또는 RNA 전사에 사용되는 대안적 프로모터의 사용을 통해 변화시킬 수 있다. 다른 예로서, 폴리뉴클레오타이드는 부위 지시성 돌연변이유발반응(site directed mutagenesis)으로 처리될 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오타이드는 안티센스 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 본 발명의 GDF 수용체 폴리뉴클레오타이드는 유전자 코드로 인해 축퇴성인 서열을 포함한다. 자연의 아미노산은 20개이며, 그 대부분은 1 이상의 코돈에 의해 지정된다. 따라서, 모든 축퇴성 뉴클레오타이드 서열은 본 발명에 포함되며, 단, 이 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호된 GDF 수용체 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 기능적으로 불변성이어야 한다. 또한, 마이오스타틴 수용체 폴리펩타이드를 암호하는 뉴클레오타이드 서열도 포함한다.
본 발명의 GDF 수용체를 암호하는 폴리뉴클레오타이드의 올리고뉴클레오타이드 부분 역시 본 발명에 포함된다. 이와 같은 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 길이가 최소한 약 15개 염기인 것으로서, 이 길이는 이 올리고뉴클레오타이드가 상기 수용체를 암호하는 폴리뉴클레오타이드에 선택적으로 하이브리드화되기에 충분한 길이이며, 적어도 약 18개 뉴클레오타이드 또는 21개 뉴클레오타이드 이상의 길이일 수도 있다. 본 명세서에 사용된 "선택적 하이브리드화" 또는 "선택적으로 하이브리드하는"이라는 용어는 관련있는 뉴클레오타이드 서열과 관련없는 뉴클레오타 이드 서열을 구별할 수 있는 중급 엄중성 또는 고급 엄중성 생리적 조건하에서 하이브리드화하는 것을 의미한다.
핵산 하이브리드화 반응에서 특정 엄중도 수준을 형성하는데 사용되는 조건은 하이브리드되는 핵산의 성질에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 길이, 상보성 정도, 뉴클레오타이드 서열 조성(예를 들어, 상대적 GC:AT 함량), 및 핵산 종류, 즉 올리고뉴클레오타이드 또는 표적 핵산 서열이 DNA 또는 RNA인지의 여부가 하이브리드화 조건 선택에 고려될 수 있다. 또 다른 고려할 사항은 핵산 중 하나가 예컨대 필터에 고정되는지의 여부이다. 적당한 엄중도 조건을 선택하는 방법은 실험적으로 결정하거나 또는 다양한 식을 통해 추정할 수 있으며, 이는 당해 기술분야에 공지되어 있다(예컨대, Sambrook et al., 상기문헌설명 참조, 1989).
점진적으로 고도한 엄중도 조건의 예는 다음과 같다: 대략 실온에서 2X SSC/0.1% SDS(하이브리드화 조건); 대략 실온에서 0.2X SSC/0.1% SDS(저급 엄중도 조건); 약 42℃에서 0.2X SSC/0.1% SDS(중급 엄중도 조건); 및 약 68℃에서 0.1X SSC(고급 엄중도 조건). 세척은 이러한 조건 중 하나, 예컨대 고급 엄중도 조건을 사용하여 실시하거나 또는 각 조건을 예를 들어 전술한 순서대로 각각 10분 내지 15분씩, 기술된 임의의 단계 또는 모든 단계를 반복하여 실시할 수 있다.
본 발명의 GDF 수용체 암호 폴리뉴클레오타이드는 여러 가지 방법 중 임의의 방법으로 수득할 수 있다. 예를 들어, 당해 기술분야에 공지된 바와 같은 하이브리드화 또는 전산시스템에 근거한 기법을 사용하여 폴리뉴클레오타이드를 분리할 수 있다. 이와 같은 방법으로는, 비제한적으로 1) 상동성 뉴클레오타이드 서열을 검출 하는 프로브를 이용한 게놈 또는 cDNA 라이브러리의 하이브리드화법; 2) 구조적 특징을 공유한, 클로닝된 DNA 단편을 검출하기 위한 발현 라이브러리의 항체 스크리닝법; 3) 당해의 DNA 서열에 어닐링할 수 있는 프라이머를 사용한 게놈 DNA 또는 cDNA에 대한 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)법; 4) 컴퓨터로 유사 서열들의 서열 데이터베이스를 검색하는 방법(상기 참조); 5) 추출된 DNA 라이브러리의 차등 스크리닝법; 및 6) 하이브리드 중의 하나로서 예컨대 성숙 GDF 펩타이드를 사용하는 2중 하이브리드 분석법 등이 있다.
액티빈 수용체가 마이오스타틴과 특이적으로 상호작용한다는 본 발명의 개시에 근거하여, 올리고뉴클레오타이드 프로브는 액티빈 수용체를 암호하는 서열, 예를 들어 마이오스타틴에 결합하는 세포외 도메인을 암호하는 서열에 기초하여 고안하고, 이를 사용하여 근육 세포 또는 지방세포와 같이 마이오스타틴에 반응성인 세포로부터 제조한 라이브러리를 스크리닝함으로써 마이오스타틴 수용체를 암호하는 폴리뉴클레오타이드를 용이하게 확인할 수 있다. 선별된 클론은 예를 들어 삽입체를 발현 벡터에 서브클로닝한 다음, 클로닝된 서열을 발현시킨 후, 발현된 폴리펩타이드를 마이오스타틴을 사용하여 스크리닝함으로써 추가 스크리닝될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 마이오스타틴 수용체를 암호하는 폴리뉴클레오타이드는 척추동물 종, 예컨대 포유동물, 조류 또는 어류 종을 기원으로 하거나 또는 무척추동물 종을 기원으로 할 수 있다. 적당한 프로브를 이용할 수만 있다면, 핵산 하이브리드화에 기초한 스크리닝 절차를 통해 모든 유기체 유래의 임의의 유전자 서열을 분리할 수 있다. 당해의 단백질을 암호하는 서열의 일부에 상 응하는 올리고뉴클레오타이드 프로브는 화학적으로 합성할 수 있다. 여기에는, 공지된 짧은 아미노산 서열의 올리고펩타이드 스트레치가 필요하다. 수용체를 암호하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 유전자 코드의 축퇴성을 고려하여 유전자 코드로부터 추론될 수 있다. 서열이 축퇴성인 경우에는 복합 부가 반응을 실시할 수 있다. 이 반응은 변성된 이본쇄 DNA의 이종 혼합물을 포함한다. 이와 같은 스크리닝에는, 일본쇄 DNA 또는 변성된 이본쇄 DNA를 가지고 하이브리드화를 실시하는 것이 바람직하다. 하이브리드화는 당해 폴리펩타이드와 관련된 mRNA 서열의 양이 극히 소량인 공급원 유래의 cDNA 클론을 검출하는데 특히 유용하다. 따라서, 비특이적 결합을 피하기 위한 엄중성 하이브리드 조건을 사용함으로써, 표적 핵산의 완전한 보체인, 혼합물 상태의 올리고뉴클레오타이드 프로브에 표적 DNA를 하이브리드화하여 방사능사진촬영에 의한 가시화를 통해 특정 cDNA 클론을 확인할 수 있다(Wallace et al., Nucl. Acid Res., 9:879, 1981, 본원에 참고인용됨). 대안적으로, 추출성 라이브러리(substractive library)를 사용하여, 비특이적 cDNA 클론을 제거할 수 있다.
당해 폴리펩타이드의 전체 아미노산 서열이 알려져 있지 않다면 DNA 서열의 직접 합성법은 불가능하며 선택가능한 방법은 cDNA 서열의 합성법이다. 당해의 cDNA 서열을 분리하는 표준 절차 중에는 플라스미드 또는 파지에 제조된 cDNA 라이브러리의 형성법이 있는데, 이 방법에서 라이브러리는 유전자 발현율이 높은 공여체 세포에 풍부한 mRNA의 역전사를 통해 얻어진다. 폴리머라제 연쇄 반응 기법과 함께 사용하면 심지어 발현이 드문 산물도 클로닝할 수 있다. 폴리펩타이드의 아미 노산 서열의 상당 부분이 공지되어 있는 경우에는, 표적 cDNA에 존재하는 것으로 추정되는 서열에 중복되는 라벨화된 일본쇄 또는 이본쇄 DNA 또는 RNA 프로브 서열의 제조를, 일본쇄 형태로 변성시킨 cDNA의 클로닝된 복사체를 가지고 실시하는 하이브리드화 절차에 이용할 수 있다(Jay et al., Nucl. Acid Res., 11:2325, 1983, 본원에 참고인용됨).
람다 gt11 라이브러리와 같은 cDNA 발현 라이브러리는 GDF 수용체에 특이적인 항체, 예컨대 항Act RIIB 항체를 이용하여 GDF 수용체 펩타이드에 대해 스크리닝될 수 있다. 이 항체는 폴리클로날이거나 모노클로날일 수 있고, GDF 수용체 cDNA의 존재를 나타내는 발현 산물을 검출하는데 사용할 수 있다. 이와 같은 발현 라이브러리는 또한 마이오스타틴 수용체의 마이오스타틴 결합 도메인 중 적어도 일부분을 암호하는 클론을 동정하기 위하여 GDF 펩타이드, 예컨대 마이오스타틴이나 이의 기능성 펩타이드 부분으로 스크리닝될 수 있다.
돌연변이 GDF 수용체 및 돌연변이 GDF 수용체 폴리펩타이드를 암호하는 폴리뉴클레오타이드 역시 본 발명에 포함된다. GDF 수용체를 암호하는 폴리뉴클레오타이드의 변화는 점돌연변이, 논센스(STOP) 돌연변이, 미스센스 돌연변이, 스플라이싱00 부위 돌연변이 또는 프레임이동과 같은 유전자간 돌연변이이거나, 또는 이형접합성 결실이나 동형접합성 결실일 수 있으며, 자연발생의 돌연변이이거나 예컨대 재조합 DNA 방법을 이용하여 조작된 것일 수 있다. 이와 같은 변화는 당업자에게 공지된 표준 방법, 예컨대 비제한적으로 뉴클레오타이드 서열 분석, 서던 블롯 분석, PCR계 분석, 예컨대 다중쇄 PCR 또는 서열 태그화 부위(STS) 분석, 또는 동일 계내 하이브리드화 분석 등으로 검출할 수 있다. GDF 수용체 폴리펩타이드는 표준 SDS-PAGE, 면역침전 분석, 웨스턴 블롯 분석 등으로 분석할 수 있다. 돌연변이 GDF 수용체의 예로는 동족 GDF에 특이적으로 결합하는 능력이 있을 수 있으나 키나제 도메인은 결여된 가용성 세포외 도메인 ; 구성형 키나제 활성을 나타낼 수 있는 세포내 GDF 수용체 키나제 도메인을 포함하는 절두형 GDF 수용체; 및 수용체의 키나제 활성이나 수용체의 리간드 결합 능력을 붕괴시키는 점 돌연변이를 포함하는 GDF 수용체 등이 있다. 이와 같은 GDF 수용체 돌연변이체는 GDF 시그널 도입을 조절하는데 유용하며, 따라서 본 발명의 다수의 방법을 실시하는데 유용하다.
GDF 수용체를 암호하는 폴리뉴클레오타이드는 이것을 적합한 숙주 세포에 도입시켜 시험관내에서 발현시킬 수 있다. "숙주 세포"는 특정 벡터가 전파될 수 있고 적당한 경우에 그 벡터에 함유된 폴리뉴클레오타이드가 발현될 수 있는 모든 세포일 수 있다. "숙주 세포"란 용어는 원 숙주 세포의 모든 자손을 포함한다. 숙주 세포의 모든 자손은 모 세포와 동일하지 않을 수 있는데, 그 이유는 복제 동안 일어나는 돌연변이 때문이다. 하지만, 이와 같은 자손도 "숙주 세포"란 용어가 사용될 때 포함되는 것이다. 본 발명의 도입된 폴리뉴클레오타이드를 일시적으로 또는 안정적으로 함유하는 숙주 세포를 수득하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다.
본 발명의 GDF 수용체 폴리뉴클레오타이드는 클로닝 벡터 또는 재조합 발현 벡터일 수 있는 벡터에 삽입될 수 있다. "재조합 발현 벡터"란 용어는 폴리뉴클레오타이드의 삽입 또는 도입에 의해 조작된, 구체적으로 본 발명의 경우에는 GDF 수 용체 전체 또는 그 펩타이드 부분을 암호하는 폴리뉴클레오타이드가 삽입 또는 도입된, 당해 기술분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 다른 비이클을 의미한다. 이와 같은 발현 벡터는 숙주의 삽입된 유전자 서열이 효율적으로 전사할 수 있도록 도모하는 프로모터 서열을 포함한다. 발현 벡터는 일반적으로 복제 기점, 프로모터 및 형질전환된 세포를 표현형으로 선별할 수 있도록 하는 특정 유전자를 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 벡터로는, 박터리아에서의 발현용인 T7계 발현 벡터(Rosenberg, et al., Gene 56:125, 1987), 포유동물에서의 발현용인 pMSXND 발현 벡터(Lee and Nathans, J.Biol.Chem. 263:3521, 1988) 및 곤충 세포에서의 발현용인 바큘로바이러스 유래의 벡터가 있으나, 이것에 국한되는 것은 아니다. DNA 분절은 조절 인자, 예컨대 T7 프로모터, 메탈로티오네인 I 프로모터, 폴리헤드린 프로모터 또는 경우에 따라 다른 프로모터, 특히 조직 특이적 프로모터 또는 유도성 프로모터와 같은 프로모터에 작동적으로 결합되어 벡터에 존재할 수 있다.
GDF 수용체를 암호하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 원핵세포 또는 진핵세포에서 발현될 수 있다. 숙주는 미생물, 효모, 곤충 및 포유동물 유기체를 포함할 수 있다. 원핵세포에서 진핵세포 서열이나 바이러스 서열을 가진 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법은 숙주에서 발현 및 복제할 수 있는 생물학적 기능성 바이러스 및 플라스미드 DNA 벡터와 마찬가지로 당해 기술분야에 공지되어 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 발현 벡터를 작제하는 방법은 예컨대 그 폴리뉴클레오타이드가 특정 세포 종류에서 또는 특정 조건하에서 우선적으로 발현되는 지의 여부를 비롯하여 전사 또는 해독 조절 시그널을 선택하는데 고려해야 할 인자와 마 찬가지로 공지되어 있다(예컨대, Sambrook et al., 상기문헌 참조, 1989).
GDF 수용체 암호 서열을 발현시키기 위하여 다양한 숙주 세포/발현 벡터 시스템, 예컨대 재조합 박테이로파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아와 같은 미생물; 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모 세포; 꽃양배추 모자이크 바이러스 또는 담배 모자이크 바이러스와 같은 재조합 바이러스 발현 벡터로 감염된 식물 세포계 또는 Ti 플라스미드와 같은 재조합 플라스미드 발현 벡터로 형질전환된 식물 세포계; 바큘로바이러스와 같은 재조합 바이러스 발현 벡터로 감염된 곤충 세포; 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 백시니아 바이러스 벡터와 같은 재조합 바이러스 발현 벡터로 감염된 동물 세포계; 및 발현이 안정되도록 유전자 조작된 형질전환된 동물 세포계가 있으나, 이것에 국한되는 것은 아니다. 발현된 GDF 수용체가 글리코실화 등에 의해 해독후 변형되는 경우에는, 바람직한 변형에 영향을 미칠 수 있는 숙주 세포/발현 벡터계, 예컨대 포유동물 숙주 세포/발현 벡터계를 선택하는 것이 특히 유리할 수 있다.
사용되는 숙주 세포/벡터계에 따라서, 임의의 다수의 적합한 전사 및 해독 인자, 예컨대 구성형 및 유도형 프로모터, 전사 인헨서 인자, 전사 종결인자 등이 발현 벡터에 사용될 수 있다(Bitter et al., Meth. Enzymol. 153:516-544, 1987). 예를 들어, 박테리아계에서 클로닝하는 경우에는, 박테리오파지 λ의 pL, plac, ptrp, ptac(ptrp-lac 하이브리드 프로모터) 등과 같은 유도형 프로모터를 사용할 수 있다. 포유동물 세포계에서 클로닝하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈 유래의 프로모터, 예컨대 인간 또는 마우스 메탈로티오네인 프로모터; 또는 포유동물 바이 러스 유래의 프로모터, 예컨대 레트로바이러스 장말단 반복체, 아데노바이러스 후기 프로모터 또는 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터를 사용할 수 있다. 재조합 DNA 또는 합성 기법으로 제조한 프로모터 역시 삽입된 GDF 수용체 암호 서열을 전사시키는데 사용할 수 있다.
효모 세포에서는, 구성형 또는 유도형 프로모터를 함유하는 다수의 벡터를 사용할 수 있다[Ausubel et al., 상기문헌참조, 1987, 13장 참조; Grant et al., Meth. Enzymol. 153:516-544, 1987; Glover, DNA Cloning Vol. II(IRL Press, 1986), 3장 참조; Bitter, Meth. Enzymol. 152:673-684, 1987; The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces (Eds., Strathern et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982), Vols. I and II]. ADH 또는 LEU2와 같은 구성형 효모 프로모터 또는 GAL과 같은 유도형 프로모터도 사용할 수 있다(Rothstein, DNA Cloning Vol.II (상기문헌참조, 1986), 3장). 대안적으로, 효모 염색체 내로 이종 DNA 서열의 통합을 촉진하는 벡터를 사용할 수도 있다.
진핵세포 시스템, 특히 포유동물 발현 시스템은 발현된 포유동물 단백질의 적절한 해독후 변형을 허용한다. 1차 전사체의 적당한 프로세싱, 글리코실화, 인산화 및 유리하게는 유전자 산물의 혈장막 삽입에 필요한 세포 기구를 보유하는 진핵세포는 GDF 수용체 폴리펩타이드 또는 이의 기능성 펩타이드 부분을 발현시키는 숙주 세포로서 사용될 수 있다.
발현 유도에 재조합 바이러스 또는 바이러스 인자를 이용하는 포유동물 세포계는 유전자조작될 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스 발현 벡터를 사용하는 경 우에, GDF 수용체 암호 서열은 아데노바이러스 전사/해독 조절 복합체, 예컨대 후기 프로모터와 3성분 리더 서열에 연결될 수 있다. 대안적으로, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터가 사용될 수 있다(Mackett et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 79:7415-7419, 1982; Mackett et al., J.Virol. 49:857-864, 1984; Panicali et al., Proc.Natl. Acad. Sci., USA 79: 4927-4931, 1982). 특히, 염색체외 인자로서 복제할 수 있는 소 유두종 바이러스 벡터가 유용하다(Sarver et al., Mol. Cell. Biol. 1:486, 1981). 이 DNA를 마우스 세포에 도입시킨 직후에 플라스미드는 세포 당 약 100 내지 200개의 복사본으로 복제한다. 삽입된 cDNA의 전사에는 숙주 세포 염색체로의 플라스미드의 통합이 필요하지 않기 때문에 다량의 발현을 얻을 수 있다. 이와 같은 벡터는 플라스미드에 neo 유전자와 같은 선별 마커를 첨가함으로써 안정된 발현에 이용될 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포에서 GDF 수용체 유전자를 도입시켜 그 발현을 유도할 수 있는 벡터로서 레트로바이러스 게놈을 사용하기 위하여 변형시킬 수 있다(Cone and Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 81:6349-6353, 1984). 또한, 비제한적으로 메탈로티오네인 IIA 프로모터 및 열 쇼크 프로모터를 포함하는 유도성 프로모터를 사용하여도 다량의 발현을 얻을 수 있다.
장기간 동안 다량의 재조합 단백질을 생산하기 위해서는 안정된 발현이 바람직하다. 따라서, 바이러스 복제 기점을 함유하는 발현 벡터를 사용하기 보다는, 프로모터, 인헨서, 서열, 전사 종결인자 및 폴리아데닐화 부위와 같은 적당한 발현 조절 인자에 의해 조절되는 GDF 수용체 cDNA와 선택가능한 마커로 숙주세포를 형질전환시킬 수 있다. 재조합 플라스미드에서 선택가능한 마커는 선택을 위한 내성을 부여할 수 있어서 세포가 그 염색체 내로 재조합 플라스미드를 안정하게 통합한 뒤 증식시켜, 결과적으로 클로닝되어 세포주로 발달될 수 있는 초점을 형성하게 한다. 예를 들어, 이종 DNA 도입 후, 조작된 세포는 강화 배지에서 1 내지 2일 동안 증식시킨 다음, 선택 배지로 옮긴다. 선택 시스템으로는 다양한 종류가 있으며, 예컨대 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제(Wigler et al., Cell 11:223, 1977), 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트란스퍼라제(Szybalska and Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 48:2026, 1982) 및 아데닌 포스포리보실트란스퍼라제(Lowy, et al., Cell 22:817, 1980) 유전자는 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt-세포에서 이용될 수 있으나, 이것에 국한되는 것은 아니다. 또한, 항대사산물 내성은 선택 기준으로서 메토트렉세이트에 내성을 부여하는 dhfr(Wigler, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 77:3567, 1980; O'Hare et al., Proc.Natl.Acad.Sci., USA 78:1527, 1981); 마이코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt(Mulligan and Berg, Proc.Natl.Acad.Sci., USA 78:2072, 1981); 아미노글리코사이드 G-418에 대한 내성을 부여하는 neo(Colberre-Garapin et al., J.Mol.Biol. 150:1. 1981); 및 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro(Santerre et al., Gene 30:147, 1984) 유전자를 이용할 수 있다. 또한, 또 다른 선택성 유전자로서, 세포가 트립토판 대신에 인돌을 이용할 수 있도록 하는 trpB; 세포가 히스티딘 대신에 히스티놀을 이용할 수 있도록 하는 hisD(Hartman and Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85:8047, 1988); 및 오르니틴 디카르복실라제 억제제, 2-(디플루오로메틸)-DL-오르니틴, DFMO에 대한 내성을 부여하는 ODC(오르니틴 디카르복실라제)(McConlogue, Curr. Comm. Mol. Biol.(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1987)도 개시되어 있다.
숙주가 진핵세포인 경우에는, 인산칼슘 공침전물로 DNA를 형질감염시키는 방법, 미량주사, 일렉트로포레이션과 같은 통상적인 기계적 절차, 리포좀에 포장된 플라스미드의 삽입, 또는 바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 또한, 진핵세포는 본 발명의 GDF 수용체를 암호하는 DNA 서열과 선택적 표현형을 암호하는 제2의 이종 DNA 분자, 예컨대 헤르페스 심플렉스 티미딘 키나제 유전자로 공동형질감염시킬 수 있다. 또 다른 방법으로서, 진핵세포 바이러스 벡터, 예컨대 시미안 바이러스 40(SV40) 또는 소 유두종 바이러스를 이용하여 진핵세포를 일시적으로 감염 또는 형질전환시킨 뒤 단백질을 발현시키는 방법이 있다(Gluzman, Eukaryotic Viral Vectors(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982)).
또한, 본 발명은 GDF 수용체 폴리펩타이드를 발현하고 GDF 수용체를 암호하는 DNA를 함유하는 안정된 재조합 세포주를 제공한다. 적합한 세포 종류로는, NIH 3T3 세포(쥐), C2C12 세포, L6 세포 및 P19 세포가 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다. C2C12 및 L6 근원세포는 배양물에서 자발적으로 분화하고 특정 증식 조건에 따라 근관세포를 형성한다(Yaffe and Saxel, Nature 270:725-727, 1977; Yaffe, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 61:477-483, 1968). P19는 배아 암종 세포주이다. 이와 같은 세포는 예를 들어 미국 모식균 배양물 수집소(ATCC)의 세포주 카탈로그에 기술되어 있다. 이 세포는 공지의 방법을 사용하여 안정하게 형질전환시킬 수 있다(예컨대, Ausubel et al., 상기문헌참조, 1995, 9.5.1-9.5.6 참조).
GDF 수용체는 본 명세서에 기술된 바와 같이 유도형 또는 구성형 조절 인자를 사용하여 본 발명의 재조합 폴리뉴클레오타이드로부터 발현될 수 있다. 목적 단백질을 암호하는 서열과 작동적으로 결합된 프로모터는 선형 분자이거나 공유적으로 폐쇄된 원형 분자일 수 있는 비복제형 DNA(또는 RNA) 분자로서 수용체 세포로 도입될 수 있다. 목적 분자의 발현은 도입된 서열의 순간 발현으로 나타나거나, 또는 예컨대 폴리뉴클레오타이드가 숙주 세포 염색체에 통합되어 세포에서 안정되게 유지되어 보다 영구적인 발현을 나타낼 수 있다. 따라서, 세포는 안정되거나 일시적으로 형질전환된(형질감염된) 세포일 수 있다.
이용될 수 있는 벡터의 일 예는 목적 유전자 서열을 숙주 세포 염색체로 통합시킬 수 있는 것이다. 도입된 DNA를 자신의 염색체 내로 안정하게 통합시킨 세포는 또한 그 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 선택할 수 있도록 하는 1개 이상의마커를 도입시킴으로써 선택될 수 있다. 이러한 마커는 일반적인 효모 영양요구성 마커인 leu2, leu3과 같이 숙주에서 영양요구성을 보충하거나; 항생제 또는 구리 등과 같은 중금속 이온에 대해 살생제 내성을 부여할 수 있다. 선택성 마커 유전자는 발현될 DNA 유전자 서열에 직접 결합되거나 또는 공동형질감염에 의해 동일 세포로 도입될 수 있다.
도입 서열은 수용체 숙주에서 자율 복제할 수 있는 플라스미드 또는 바이러스 벡터로 도입시킬 수 있다. 이러한 목적에 사용할 수 있는 벡터로는 다양한 종류가 있다. 특정 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 선택하는데 중요한 인자로는 벡터를 함유하는 수용체 세포를, 벡터를 함유하지 않는 세포 중에서 인식 및 선택할 수 있는 용이성; 특정 숙주 세포에서 요구되는 벡터의 복사체 수; 및 상이한 종의 숙주 세포 사이에서 "셔틀" 벡터로서 이용가능한 지의 여부 등이 있다.
포유동물 숙주의 경우에 발현에 이용할 수 있는 벡터 시스템으로는 여러 가지가 있다. 이러한 벡터의 제1 군은 동물 바이러스, 예컨대 소 유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스 또는 SV40 바이러스 유래의 염색체외 플라스미드를 자율적으로 복제할 수 있는 DNA 인자를 이용한다. 벡터의 제2 군은 백시니아 바이러스 발현 벡터를 포함한다. 벡터의 제3 군은 목적 유전자 서열을 숙주 염색체에 통합시키는 것이다. 도입 DNA가 자신의 염색체에 안정되게 통합된 세포는 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포의 선택을 허용하는 1 이상의 마커 유전자(전술한 바와 같이)를 도입시킴으로써 선택될 수 있다. 선택성 마커 유전자는 발현시킬 DNA 서열에 직접 결합되거나 또는 공동형질감염에 의해 동일 세포 내로 도입될 수 있다. 암호된 mRNA 또는 펩타이드가 적절하게 합성되도록 추가 인자를 제공할 수 있는데, 그 예로는 스플라이싱 시그널, 전사 프로모터 또는 인헨서 및 전사 또는 해독 종결 시그널이 있다. 적당한 조절 인자를 도입시킨 cDNA 발현 벡터는 당해기술분야에 공지되어 있다(예를 들어, Okayama, Mol.Cell.Biol. 3:280, 1983).
발현을 위한 벡터 또는 이 작제물을 함유하는 DNA 서열이 제조되면, 이 DNA 작제물을 적당한 숙주에 도입시킬 수 있다. 폴리뉴클레오타이드를 세포내로 도입시키는 방법으로는 다양한 방법을 사용할 수 있는데, 그 예로는 원형질 융합, 인산칼슘 침전 및 일렉트로포레이션과 같은 형질감염이나 형질전환법 또는 벡터가 바이러스 벡터인 경우에는 감염과 같은 다른 통상적인 기법이 있다.
또한, 본 발명은 재조합 GDF 수용체를 발현하는 세포를 보유하는 트랜스게닉 동물을 제공한다. 이와 같은 트랜스게닉트 동물은 지방 함량이 감소되거나 근육량이 증가된 것, 또는 두가지 특성 모두를 가진 것을 선택할 수 있으며, 따라서 근육과 단백질 함량이 높고 지방과 콜레스테롤 함량이 적은 식 제품 공급원으로서 유용할 수 있다. 이러한 동물은 그 생식세포와 체세포에 있는 염색체가 변이된 것으로서, GDF, 특히 마이오스타틴 생산은 정상 수준으로 유지되나 마이오스타틴 수용체가 적은 양으로 생산되거나 완전히 붕괴되어, 이 동물의 세포가 마이오스타틴과 결합하는 능력이 감소되어서, 그 결과 근조직이 정상 수준 보다 높고, 바람직하게는 지방이나 콜레스테롤 수준이 증가되지 않은 동물이 얻어지게 된다. 따라서, 본 발명은 이러한 동물에 의해 제공되는 식 제품을 제공한다. 이와 같은 식 제품은 근조직의 증가로 인해 영양적 가치가 증가되었다. 인간을 제외한 본 발명의 트랜스게닉 동물은 소, 돼지, 양 및 조류 동물 뿐만 아니라 다른 척추동물을 포함하며, 트랜스게닉 무척추 동물도 포함한다.
또한, 본 발명은 근육량이 증가된 동물 식 제품을 제조하는 방법을 제공한다. 이와 같은 방법은 동물의 전핵 배아의 생식 세포 유전자 구성을 변형시키는 단계, 이 배아를 가임신(pseudopregnant) 암컷의 난관에 이식하여 배아를 만기 임신(full term)의 자손으로 성숙시키는 단계, 트랜스유전자가 존재하는지에 대해 그 자손을 테스트하여 트랜스유전자 양성 자손을 확인하는 단계, 트랜스유전자 양성 자손을 이종교배하여 다른 트랜스유전자 양성 자손을 수득하는 단계 및 이 자손을 가공하여 식 제품을 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 생식세포의 변형은 마 이오스타틴 수용체 단백질의 생산을 위해 암호하는 자연발생의 유전자의 발현이 감소 또는 억제되도록 유전자 조성을 변화시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 트랜스유전자는 마이오스타틴 수용체를 암호하는 폴리뉴클레오타이드에 특이적인 안티센스 분자를 포함하거나; 내인성 마이오스타틴 수용체 유전자 또는 트랜스유전자에 치환되거나 개재되는 비기능성 서열을 포함하거나; 또는 마이오스타틴 수용체 길항제, 예컨대 우성의 음성 Act RIIB와 같은 우성의 음성 마이오스타틴 수용체를 암호할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "동물"이란 용어는 모든 새, 어류 또는 인간을 제외한 포유동물을 의미하는 것으로서, 모든 발생 단계, 예컨대 배아 단계 및 태아 단계의 동물을 포함한다. 돼지, 염소, 양, 소, 말, 토끼 등과 같은 사육 동물; 마우스와 같은 설치류; 및 고양이와 개 같은 애완동물이 이러한 "동물"의 의미에 포함되는 것이다. 또한, 본 명세서에 사용된 "유기체"라는 용어는 전술한 바와 같은 동물은 물론 다른 진핵생물, 예컨대 파충류와 양서류 같은 다른 척추 동물 뿐만 아니라 전술한 바와 같은 무척추동물도 포함한다.
본 명세서에 사용된, "트랜스게닉(transgenic)"이란 용어는 동물이나 유기체와 관련하여 사용되었을 때, 이 동물이나 유기체의 세포가 유전자 조작되어 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열을 그 세포내에 안정되게 유지하고 있는 것을 의미한다. 이러한 조작으로는, 예컨대 그 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 재조합 바이러스로의 감염이나 폴리뉴클레오타이드의 미량주사가 있다. 따라서, 본 명세서에 사용된 "트랜스게닉"이란 용어는 1 이상의 세포가 재조합 폴리뉴클레오타이드를 수용하여 그 세포에서 염색체로 통합되거나, 또는 효모 인공 염색체로 조작될 수 있듯이 염색체외적으로 복제하는 폴리뉴클레오타이드로서 유지될 수 있는 동물(유기체)를 의미한다. "트랜스게닉 동물"이란 용어는 "생식세포주" 트랜스게닉 동물을 포함하기도 한다. 생식세포주 트랜스게닉 동물은 유전자 정보가 생식세포주 세포에 흡수 및 도입되어 그 정보를 자손에게 전하는 능력을 갖고 있는 트랜스게닉 동물이다. 이러한 자손이 사실상 그 정보의 일부 또는 전체를 보유한다면 그 자손 역시 트랜스게닉 동물로 간주한다. 본 발명은 또한 트랜스게닉 유기체를 제공한다.
트랜스게닉 유기체는 배아 초기 단계 또는 수정란을 시험관내 조작하거나 또는 임의의 트랜스게닉 기법으로 특정 유전자를 녹아웃(knock-out)시킴으로써 게놈이 변화되어 있는 임의의 유기체일 수 있다. "유전자 녹아웃(gene knock-out)"이란 용어는 세포 또는 생체내에서 유전자를 표적화 붕괴시켜 완전하게 기능을 상실시키는 것을 의미한다. 트랜스게닉 동물에서 표적 유전자는 무능화될 유전자에 표적화된 삽입, 예컨대 상동성 재조합에 의해 또는 세포에서 유전자의 기능을 붕괴시키는 다른 임의의 방법에 의해 무능화될 수 있다.
본 발명을 실시하는데 사용되는 트랜스유전자는 변형된 GDF 수용체 암호 서열을 포함하는 DNA 서열일 수 있다. 변형된 GDF 수용체 유전자는 배아 줄기 세포에서 상동성 표적화에 의해 붕괴되는 것이다. 예를 들어, GDF 수용체 유전자의 전체 성숙 C-말단 영역이 결실될 수 있다(실시예 13). 경우에 따라서, 붕괴(또는 결실)는 다른 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 무능성 GDF 수용체 서열의 삽입이나 치환을 수반할 수 있다. "녹아웃" 표현형은 또한 유기체내의 세포에서 안티센스 GDF 수용 체 폴리뉴클레오타이드를 도입시키거나 발현시킴으로써, 또는 세포에서 항체 또는 우성의 음성 GDF 수용체를 발현시킴으로써 부여될 수 있다. 적당하다면, GDF 수용체 활성이 있는 단백질을 암호하지만 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 자연발생의 GDF 유전자 서열과 뉴클레오타이드 서열이 상이한 폴리뉴클레오타이드를, 절두 형태, 대립유전자 변형체 및 이종간 상동체와 마찬가지로 본 발명에 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 GDF 수용체에 특이적으로 결합하여, 이 수용체에 대한 GDF 결합을 차단하는 항체를 제공한다. 이러한 항체는, 예를 들어 근조직과 관련된 세포 증식 질환 같은 병리학적 증상을 경감시키는데 사용할 수 있다.
GDF 수용체, 특히 마이오스타틴 수용체에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체는 골격근의 발달을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 방법에 대한 바람직한 구체예에서는, GDF 수용체 모노클로날 항체, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드가 근육 소모성 질환, 신경근육 질환, 근위축증, 노화 등과 같은 병리학적 증상을 겪는 환자에게 투여된다. GDF 수용체 항체, 특히 항마이오스타틴 수용체 항체는 또한 근이영양증, 척수 외상, 상해성 외상, 울혈성 폐쇄성 폐질환(COPD), AIDS 또는 악액질과 같은 병리학적 증상을 겪고 있는 환자에게 투여할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 항마이오스타틴 수용체 항체는 정맥내, 근육내 또는 피하 주사를 통해 근소모성 질환이나 질병이 있는 환자에게 투여한다. 바람직하게는, 모노클로날 항체를 약 0.1 ㎍/kg 내지 약 100㎎/kg 사이; 보다 바람직하게는 약 1 ㎍/kg 내지 75 ㎎/kg 사이; 가장 바람직하게는 약 10㎎/kg 내지 50㎎/kg 사이의 용량 범위로 투여하는 것이 좋다. 항체는 예를 들어 환제 주사 또는 서행 주입 으로 투여할 수 있다. 서행 주입은 30분 내지 2시간 동안 지속되는 것이 바람직하다. 항마이오스타틴 수용체 항체 또는 다른 항GDF 수용체 항체는 환자에게 투여하기에 적합한 제형으로 조제될 수 있다. 이와 같은 제형은 당해 기술분야에 공지되어 있다.
투여 방식은 마이오스타틴 수용체 단백질의 작용을 변화시키는 다양한 인자, 예컨대 형성시키고자 하는 조직의 양, 조직 손상 부위, 손상 조직의 상태, 상처 크기, 손상 조직의 종류, 환자의 연령, 성별, 음식, 임의의 감염 정도, 투여횟수 및 다른 임상적 요인을 고려하여 담당의가 결정할 수 있을 것이다. 투여량은 조성물에 사용할 제제의 종류, 예컨대 항마이오스타틴 수용체 항체 및 복원에 사용되는 기질의 종류에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로 전신 투여 또는 주사 투여, 예컨대 정맥내, 근육내 또는 피하 주사가 좋다. 투여는 일반적으로 최소 유효량인 용량에서부터 시작하여 양성 효과가 관찰될 때까지 소정의 시간 동안 증가시킨다. 그 다음, 투여량의 점증적 증가는 이에 상응하는 효과의 증가를 나타내는 수준으로, 나타날 수 있는 임의의 부작용을 고려하여 그 점증적 증가량을 제한한다. 또한, 근육량 증가를 도울 수 있는 다른 공지된 성장 인자, 예컨대 IGF I(인슐린 유사 성장 인자 I), 인간, 소 또는 닭 성장 호르몬을 최종 조성물에 첨가하는 것은 그 투여량에 영향을 미칠 수 있다. 항마이오스타틴 수용체 항체가 투여되는 구체예에서, 항체는 일반적으로 약 0.1㎍/kg 내지 약 100㎎/kg 범위, 보다 바람직하게는 약 10㎎/kg 내지 50 ㎎/kg 범위의 용량으로 투여된다.
본 명세서에 사용된 "항체"라는 용어는 포괄적 의미로 사용되어 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체 뿐만 아니라 이러한 항체의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명의 방법에 유용한 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 예를 들어 GDF 수용체, 그 예로 마이오스타틴 수용체의 에피토프에 대한 특이적 결합 활성이 있는 것을 특징으로 한다. 또한, 전술한 바와 같이 본 발명의 항체는 프로마이오스타틴 폴리펩타이드의 펩타이드 부분, 특히 마이오스타틴 프로도메인 또는 이의 기능성 펩타이드 부분에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 이하에 제시하는 GDF 수용체 항체를 제조 및 특성규명하는 방법은 본 발명의 다른 항체, 예컨대 마이오스타틴 프로도메인에 특이적으로 결합하는 항체, 프로마이오스타틴 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하고 프로마이오스타틴이 마이오스타틴으로 단백분해성 절단되는 것을 억제 또는 감소시키는 항체 등의 제조 및 특성규명에도 적용할 수 있음을 알 수 있을 것이다.
항체와 관련하여 사용된 경우 "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적 결합 활성"이란 용어는 항체와 특정 에피토프 간의 상호작용에 대한 해리 상수가 적어도 약 1 x 10-6, 일반적으로 적어도 약 1 x 10-7, 보통 적어도 약 1 x 10-8, 특히 적어도 약 1 x 10-9 또는 1 x 10-10 또는 그 이하인 것을 의미한다. GDF 수용체의 에피토프에 대해 특이적 결합 활성을 보유하는 항체의 Fab, F(ab')2, Fd 및 Fv 단편 자체도 항체의 정의에 포함되는 것이다. 본 발명의 목적상, 예를 들어 마이오스타틴 수용체의 에피토프와 특이적으로 반응하는 항체가 TGF-β또는 BMP 수용체에 비해 마이오스타틴 수용체에 대한 결합 친화성이 적어도 2배 이상, 일반적으로 적어도 5배 이상, 특히 적어도 10배 이상인 경우에는, 그 항체는 TGF-β 수용체 또는 BMP 수용체와는 실질적으로 반응성이 없는 것으로 간주한다.
본 명세서에 사용된 "항체"라는 용어는 자연발생의 항체는 물론 비자연발생의 항체, 예컨대 일본쇄 항체, 키메라 이기능성 인간화 항체 및 이 항체의 항원 결합 단편을 포함한다. 이러한 비자연발생의 항체는 고상 펩타이드 합성법으로 작제하거나, 재조합적으로 제조하거나 또는 예컨대 가변성 중쇄와 가변성 경쇄로 이루어진 조합 라이브러리를 스크리닝하여 수득할 수 있다(Huse et al., Science 246:1275-1281(1989), 본원에 참고인용됨). 이러한 키메라 인간화 CDR 그라프트된 일본쇄 및 이기능성 항체를 제조하는 상기 방법 및 기타 다른 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다(Winter and Harris, Immunol. Today 14:243-246, 1993; Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989; Harlow and Lane, Antibodies: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988); Hilyard et al., Protein Engineering: A practical approach(IRL Press 1992); Borrabeck, Antibody Engineering, 2nd ed. (Oxford University Press 1995); 각 문헌은 본원에 참고인용됨).
GDF 수용체와 특이적으로 결합하는 항체는 그 수용체를 면역원으로 사용하여 유발시킨 뒤, 예를 들어 TGF-βI형 또는 II형 수용체, 액티빈 수용체(예컨대 Act RIB, Act RIIA 또는 Act RIIB) 또는 BMP 수용체(예컨대 BMP RII, BMP RIA 및 BMP RIB)와 교차반응하는 항체를 제거하여 얻을 수 있다[Massague, 상기 문헌설명 참조, 1998]. 본 발명의 항체는 편리하게는 TGF-β, 액티빈 또는 BMP 수용체에 존재 하지 않는 마이오스타틴 수용체의 펩타이드 부분을 사용하여 유발시킬 수 있다. 이와 마찬가지로, 마이오스타틴 프로도메인에 특이적으로 결합하는 항체는 면역원으로서 프로도메인 또는 이의 기능성 펩타이드 부분을 사용하여 유발시킬 수 있다. 이와 같은 펩타이드가 비면역원성인 경우에는, 합텐을 소혈청 알부민(BSA) 또는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)과 같은 담체 분자에 커플링시키거나 또는 그 펩타이드 부분을 융합 단백질로서 발현시켜 면역원성으로 만들 수 있다. 다른 다양한 담체 분자와 합텐을 담체 분자에 커플링시키는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다(예컨대 Harlow and Lane, 상기문헌설명 참조, 1988).
필요한 경우에는, 본 발명의 방법에 유용한 항체 또는 다른 제제를 포함하는 키트를 제조할 수 있다. 이러한 키트는 제제외에도 피검체에 투여하기 위해 제제를 복원시킬 수 있는 약학적 조성물을 포함할 수 있다. 또한, 키트는 예를 들어 항체 검출 시약이나, GDF 수용체에 대한 항체의 특이적 결합을 검출하는 시약을 포함할 수 있다. 이러한 검출 시약은 항체를 라벨화하거나 다른 방식으로 동정하는데 유용하며, 이에 관하여는 본 명세서에 기술되어 있고 당해 기술분야에 공지되어 있다.
폴리클로날 항체를 예를 들어, 토끼, 염소, 마우스 또는 다른 포유동물에서 유발시키는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다(예컨대, Green et al., "Production of Polyclonal Antisera", in Immunochemical Protocols(Manson, ed., Humana Press 1992), pages 1-5; Coligan et al., "Production of Polyclonal Antisera in Rabbits, Rats, Mice and Hamsters", in Curr. Protocols Immunol. (1992), section 2.4.1; 각 문헌은 본원에 참고인용됨). 또한, 모노클로날 항체는 공지되고 당해 기술분야에서 통상적인 방법을 사용하여 수득할 수 있다(Harlow and Lane, 상기문헌설명 참조, 1988). 예를 들면, 마이오스타틴 수용체 또는 이의 에피토프 단편으로 면역화된 마우스의 비장 세포를 SP/02 골수종 세포와 같은 적당한 골수종 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 제조한다. 클로닝된 하이브리도마 세포주를 라벨화된 항원으로 스크리닝하여 적당한 특이성을 가진 모노클로날 항체를 분비하는 클론을 동정할 수 있으며, 바람직한 특이성과 친화성을 가진 항체를 발현하는 하이브리도마는 분리하여 항체의 연속 공급원으로 이용할 수 있다. 이러한 항체는 마이오스타틴 수용체와의 특이적 결합성 상실에 대하여 추가 스크리닝될 수 있다. 이러한 항체는, 예를 들어 표준화된 임상용 키트를 제조하는데 유용하다. 또한, 예를 들어 일본쇄 항마이오스타틴 수용체 항체를 발현하는 재조합 파지 역시, 표준화된 키트를 제조하는데 사용할 수 있는 항체를 제공한다.
모노클로날 항체를 제조하는 방법은 공지되어 있다(예컨대, Kohler and Milsterin, Nature 256:495, 1975, 본원에 참고인용됨; Coligan et al., 상기문헌설명 참조, 1992, 섹션 2.5.1-2.6.7 참조; Harlow and Lane, 상기문헌설명 참조, 1988). 간략히 설명하면, 모노클로날 항체는 항원을 함유하는 조성물을 마우스에게 주사하고, 혈청 샘플을 분리하여 항체 생산의 존재를 확인한 뒤, 비장을 분리하여 B 림프구를 수득하고, 이 B 림프구를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마를 제조하고, 이 하이브리도마를 클로닝한 다음, 그 항원에 대한 항체를 생산하는 양성 클론을 선택하고, 이 하이브리도마의 배양물로부터 항체를 분리하여 수득할 수 있다.
모노클로날 항체는 하이브리도마 배양물로부터 다양한 공지의 기법, 예컨대 프로테인 A 세파로즈를 이용한 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피 등으로 분리 및 정제할 수 있다(Coligan et al., 상기문헌설명 참조, 1992, 섹션 2.7.1-2.7.12 및 2.9.1-2.9.3 참조; Barnes et al., "Purification of Immunoglobulin G(IgG)" in Meth. Molec. Biol. 10:79-104(Humana Press, 1992), 본원에 참고인용됨). 모노클로날 항체를 시험관내 및 생체내에서 증폭시키는 방법은 당해기술분야에 공지되어 있다. 시험관내 증폭은 둘베코 변형 이글 배지 또는 RPMI 1640 배지와 같은 적당한 배양 배지에, 경우에 따라 태내 송아지 혈청과 같은 포유동물 혈청이나 미량 원소 및 성장 유지 보충물, 예컨대 정상 마우스 복막 삼출물 세포, 비장 세포, 골수 대식세포를 보충하여 수행할 수 있다. 시험관내 생산은 비교적 순수한 항체 제조물을 제공하며, 정률 증가시켜 다량의 목적 항체를 수득할 수 있다. 대량의 하이브리도마 배양은 에어리프트 반응기, 연속 교반 반응기에서의 균일한 현탁 배양 또는 고정되거나 포획된 세포 배양액에서의 균일한 현탁 배양으로 수행될 수 있다. 생체내에서의 증폭은 모 세포와 조직화합성인 포유동물, 예컨대 동계 마우스(synergenic mouse)에게 세포 클론을 주사하여 항체 생산 종양을 성장시킴으로써 실시될 수 있다. 경우에 따라, 주사 이전에 동물에게 탄화수소, 특히 프리스탄(테트라메틸펜타데칸)과 같은 오일을 공급하기도 한다. 2주 내지 3주 후 목적 모노클로날 항체는 동물의 체액으로부터 회수한다.
본 명세서에 개시된 항체의 치료적 용도 역시 본 발명의 일부분이다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 유인 영장류 항체에서 유래하는 것일 수 있다. 비비원숭이 에서 치료적으로 유용한 항체를 유발시키는 일반적 기법은 예를 들어 본원에 참고인용되는 문헌[Goldenberg et al., 국제특허출원 공개번호 WO91/11465(1991); Losman et al., Int. J. Cancer 46:310, 1990]에서 찾아볼 수 있다.
치료적으로 유용한 항GDF 수용체 항체도 또한 "인간화(humanized)" 모노클로날 항체로부터 유도될 수 있다. 인간화 모노클로날 항체는 마우스 면역글로불린의 가변성 중쇄 및 경쇄 유래의 마우스 상보성 결정 영역을 인간 가변성 도메인에 전이시킨 다음, 쥐 대응부의 프레임워크 영역에서 인간 잔기를 치환시켜 제조한다. 인간화 모노클로날 항체 유래의 항체 성분의 이용은 쥐 불변 영역의 면역원성과 관련된 잠재적 문제점을 해소한다. 쥐 면역글로불린 가변 도메인을 클로닝하는 일반 기법은 공지되어 있다(예컨대, 본원에 참고인용되는 문헌 Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86:3833, 1989). 인간화 모노클로날 항체를 제조하는 기법도 또한 공지되어 있다(예컨대, Jones et al., Nature 321:522, 1986; Riechmann et al., Nature 332:323, 1988; Verhoeyen et al., Science 239:1534, 1988; Carter et al., Proc.Natl.Acad.Sci., USA 89:4285, 1992; Sandhu, Crit.Rev.Biotechnol. 12:437, 1992; 및 Singer et al., J.Immunol. 150:2844, 1993; 각 문헌은 본원에 참고인용됨).
본 발명의 항체는 또한 조합형 면역글로불린 라이브러리로부터 분리된 인간 항체 단편으로부터 유도될 수 있다(예컨대, Barbas et al., METHODS: A Companion to Methods in Immunology 2:119, 1991; Winter et al., Ann. Rev. Immunol. 12:433, 1994, 본원에 참고인용됨). 인간 면역글로불린 파지 라이브러리를 제조하 는데 유용한 클로닝 및 발현 벡터는 예컨대 스트라타진 클로닝 시스템스(캘리포니아 라졸라 소재)로부터 입수할 수 있다.
본 발명의 항체는 또한 인간 모노클로날 항체로부터 유도될 수 있다. 이러한 항체는 항원 공격에 대한 반응에서 특이적 인간 항체를 생산하도록 "조작된" 트랜스게닉 마우스로부터 수득한다. 이 기술에서, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 요소들은 내인성 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 표적화된 붕괴를 포함하는 배아 줄기 세포주로부터 유도된 마우스 종으로 도입된다. 이 트랜스게익 마우스는 인간 항원에 특이적인 인간 항체를 합성할 수 있어서, 인간 항체 분비 하이브리도마를 제조하는데 사용할 수 있다. 트랜스게닉 마우스로부터 인간 항체를 수득하는 방법은 예를 들어 문헌[Green et al., Nature Genet. 7:13, 1994; Lonberg et al., Nature 368:856, 1994; 및 Taylor et al., Int. Immunol. 6:579, 1994; 각 문헌은 본원에 참고인용되고 있다]에 개시되어 있다.
본 발명의 항체 단편은 항체를 단백분해성 가수분해하여 제조하거나 그 단편을 암호하는 DNA를 E.콜라이에서 발현시켜 제조할 수 있다. 항체 단편은 전체 항체를 통상적인 방법으로 펩신 또는 파파인 분해시켜 얻을 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 펩신으로 항체를 효소 절단함으로써 F(ab')2라는 5S 단편을 얻을 수 있다. 이 단편을 티올 환원제와, 경우에 따라 이황화 결합을 절단하여 얻어지는 설프하이드릴 기에 대한 차단기를 사용하여 절단하면 3.5S Fab' 1가 단편을 제조할 수 있다. 대안적으로, 펩신을 이용한 효소 절단은 2개의 1가 Fab' 단편과 하나의 Fc 단 편을 직접 생산한다(예컨대, 각각 본원에 참고인용되는 Goldenberg, 미국 특허 제4,036,945호 및 미국 특허 제4,331,647호 및 여기에 포함된 참고문헌들; Nisonhoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, Biochem. J. 73:119, 1959; Edelman et al., Meth. Enzymol. 1:422(Academic Press 1967), 각각 본원에 참고인용됨; Coligan et al., 상기문헌설명 참조, 1992, 섹션 2.8.1-2.8.10 및 2.10.1-2.10.4 참조).
단편이 원상태의 항체에 의해 인식되는 항원에 특이적으로 결합하기만 한다면, 다른 항체 절단 방법, 예컨대 1가 경쇄/중쇄 단편을 형성하기 위한 중쇄의 분리, 단편의 추가 절단 또는 다른 효소적, 화학적 또는 유전자적 기법도 사용할 수 있다. 예를 들어, Fv 단편은 VH 및 VL 쇄의 회합체를 포함한다. 이 회합은 비공유결합성일 수 있다(Inbar et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 69:2659, 1972). 대안적으로, 가변쇄는 분자간 이황화 결합에 의해 결합하거나 글루타르알데하이드와 같은 화학물질에 의해 가교결합될 수 있다(Sandhu, 상기문헌설명 참조, 1992). 바람직하게는, Fv 단편은 펩타이드 링커에 의해 연결된 VH 및 VL 쇄를 포함하는 것이 좋다. 이 일본쇄 항원 결합 단백질(sFv)은 VH 및 VL 도메인을 암호하는 DNA 서열을 올리고뉴클레오타이드에 의해 연결시킨 구조 유전자를 작제함으로써 제조한다. 이 구조 유전자는 그 다음 발현 벡터에 삽입되고 이어서 E.콜라이와 같은 숙주 세포에 도입된다. 이 재조합 숙주 세포는 2개의 V 도메인을 가교하는 링커 펩타이드를 가진 단일 폴리펩타이드쇄를 합성한다. sFv를 제조하는 방법은, 예컨대 문헌[Whitlow et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97, 1991; Bird et al., Science 242: 423-426, 1988; Ladner et al., 미국 특허 제4,946,778호; Pack et al., Bio/Technology 11:1271-1277, 1993; 각 문헌은 본원에 참고인용됨; 또한, Sandhu, 상기문헌설명 참조, 1992]에 기술되어 있다.
항체 단편의 또 다른 형태는 단일 상보성 결정 영역(CDR)을 암호하는 펩타이드이다. CDR 펩타이드("최소 인식 단위")는 당해 항체의 CDR을 암호하는 유전자를 작제하여 수득할 수 있다. 이러한 유전자는 예컨대 항체 생산 세포의 RNA로부터 가변 영역을 합성하는 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여 제조한다(예컨대, Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 106, 1991, 본원에 참고인용됨).
또한, 본 발명은 GDF 수용체 폴리펩타이드를 동정하는 방법을 제공한다. 이 방법은 예컨대, GDF 폴리펩타이드와, 전장의 수용체 또는 절두형 수용체를 발현하는 세포를 포함하는 성분들을 GDF와 수용체의 결합을 허용하기에 충분한 조건하에서 항온처리하고; 수용체에 대한 GDF 폴리펩타이드의 결합을 측정한 뒤; 수용체를 분리함으로써 실시될 수 있다. GDF는 임의의 공지된 GDF(예컨대, GDF-1-16)일 수 있고, 바람직하게는 GDF-8(마이오스타틴) 또는 GDF-11이다. 수용체를 분리하는 방법은 다음에 기술되는 실시예에서 보다 상세하게 설명될 것이다. 따라서, 본 발명은 자연발생의 GDF 수용체 보다 적은 수의 아미노산 잔기를 가진 GDF 수용체의 펩타이드 및 펩타이드 유도체 뿐만 아니라, 실질적으로 정제된 GDF 수용체를 제공하기도 한다. 이러한 펩타이드 및 펩타이드 유도체는 근육 소모성 질환을 연구하고 보다 효과적인 치료제를 개발하는데 있어서 연구 및 진단 도구로서 유용하게 사용 된다.
또한, 본 발명은 GDF 수용체 변형체를 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, "GDF 수용체 변형체"라는 용어는 GDF 수용체의 구조 중 적어도 일부분을 자극하는 분자를 의미한다. GDF 수용체 변형체는 GDF 결합을 감소 또는 억제하여 본원에 개시된 바와 같은 병리학적 증상을 경감시키는데 유용하게 사용될 수 있다. GDF 수용체 변형체의 예로는 GDF 수용체의 가용성 세포외 도메인과 같은 절두형 GDF 수용체; 키나제 활성이 결여된 우성의 음성 Act RIIB 수용체와 같은 우성의 음성 GDF 수용체; 또는 다른 절두형 또는 돌연변이 GDF 수용체가 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다.
본 발명은 자연발생의 GDF 수용체의 펩타이드 및 펩타이드 변형체 뿐만 아니라 GDF 수용체 변형체, 예컨대 돌연변이 GDF 수용체, 및 마이오스타틴과 같은 GDF에 특이적으로 결합하는 GDF 수용체의 화학적으로 합성된 유도체도 제공한다. 예를 들어, GDF 수용체의 아미노산 서열의 변화도 본 발명에 포함되는 것이다. GDF 수용체는 그 단백질을 암호하는 DNA를 변화시켜 변이시킬 수 있다. 바람직하게는, 동일하거나 유사한 성질을 가진 아미노산을 사용하여 단지 보존적 아미노산 변이가 이루어진 것이 좋다. 아미노산 치환의 예로는 알라닌의 세린으로의 변화; 아르기닌의 리신으로의 변화; 아스파라긴의 글루타민 또는 히스티딘으로의 변화; 아스파테이트의 글루타메이트로의 변화; 시스테인의 세린으로의 변화; 글루타민의 아스파라긴으로의 변화; 글루타메이트의 아스파테이트로의 변화; 글리신의 프롤린으로의 변화; 히스티딘의 아스파라긴 또는 글루타민으로의 변화; 이소루신의 루신 도는 발린으로 의 변화 ; 루신의 발린 또는 이소루신으로의 변화 ; 리신의 아르기닌, 글루타민 또는 글루타메이트로의 변화; 메티오닌의 루신 또는 이소루신으로의 변화; 페닐알라닌의 티로신, 루신 또는 메티오닌으로의 변화; 세린의 트레오닌으로의 변화; 트레오닌의 세린으로의 변화; 트립토판의 타이로신으로의 변화; 타이로신의 트립토판 또는 페닐알라닌으로의 변화; 발린의 이소루신 또는 루신으로의 변화가 있다.
본 발명에 유용한 변형체는 각 GDF에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 GDF 수용체의 유사체, 상동체, 뮤테인 및 모방체를 포함한다. 다른 구체예에서는, 우성의 음성 활성을 가진 변형 GDF 수용체도 이 변형체가 이의 GDF와 특이적으로 상호작용하는지의 여부에 관계없이 고려된다. GDF 수용체의 펩타이드는 GDF 수용체의 능력을 보유하는 GDF 수용체의 아미노산 서열의 일부를 의미한다. 이 변형체는 GDF 수용체 자체를 화학적 변형하거나, 단백분해성 효소 절단하거나 또는 이를 복합적으로 사용하여 직접 제조될 수 있다. 또한, 유전자 조작 기법 뿐만 아니라, 아미노산 잔기로부터 직접 폴리펩타이드를 합성하는 방법을 사용할 수도 있다.
펩타이드는 알파-아미노기의 t-BOC 또는 FMOC 보호와 같은 일반적 방법을 사용하여 합성할 수 있다. 이 두 방법은 펩타이드의 C 말단에서부터 시작하여 각 단계마다 하나의 아미노산을 첨가하는 단계식 합성을 포함한다(Coligan, et al., Current Protocols in Immunology(Wiley Interscience, 1991), Unit 9, 본원에 참고인용됨). 본 발명의 펩타이드는 또한 0.1 내지 1.0 mMol 아민/g 중합체를 함유하는 코폴리(스티렌-디비닐벤젠)을 사용하여 공지의 고상 펩타이드 합성법으로 합성할 수도 있다(Merrifield, J.Am.Chem.Soc., 85:2149, 1962; Stewart and Young, Solid Phase Peptides Synthesis(Freeman, San Francisco, 1969), p.27-62, 상기 각 문헌은 본원에 참고인용됨). 화학 합성이 완료되면, 펩타이드의 보호기를 제거하고 액체 HF-10% 아니솔로 약 1/4 내지 1 시간 동안 0℃에서 처리하여 중합체로부터 절단해 낸다. 시약을 증발시킨 후, 1% 아세트산 용액으로 처리하여 중합체로부터 펩타이드를 추출해내고, 그 다음 동결건조하여 미정제 물질을 얻는다. 그 다음, 이것을 일반적으로 용매로서 5% 아세트산을 사용하는 세파덱스 G-15 겔 여과와 같은 기술을 사용하여 정제할 수 있다. 컬럼의 적당한 분획을 동결건조하면 균일한 펩타이드 또는 펩타이드 유도체를 얻을 수 있고, 이를 그 다음 아미노산 분석, 박층 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피, 자외선 흡수 분광분석법, 몰 광회전도, 용해도 시험법 등의 표준 기법으로 특성규명한 뒤, 고상 에드만 분해법으로 정량할 수 있다.
GDF 수용체의 결합과 기능을 모방하는 비펩타이드 화합물("모방체")은 문헌[Saragovi et al., Science 253:792-95, 1991, 본원에 참고인용됨]에 약기된 연구법에 의해 제조할 수 있다. 모방체는 단백질 2차 구조의 요소들을 모방하는 분자이다(Johnson et al., "Peptide Turn Mimetics" in Biotechnology and Pharmacy(Pezzuto et al., Eds.: Chapman and Hall, New York, 1993), 본원에 참고인용됨). 펩타이드 모방체를 사용하는 근본적 이유는 단백질의 펩타이드 골격이 주로 그 아미노산 측쇄가 분자 상호작용을 촉진시키도록 배향되게 존재하기 때문이다. 본 발명의 목적상, 적당한 모방체는 GDF 수용체의 등가물인 것으로 간주할 수 있다.
장쇄의 펩타이드는 펩타이드를 함께 결합시키는 "천연 화학물질" 연결 기법으로 제조할 수 있다(Dawson et al., Science 266:776, 1994, 본원에 참고인용됨). 변형체는 게놈 또는 cDNA 클로닝 방법을 이용하여 재조합 기법으로 제조할 수 있다. 부위 특이적이며 영역 지향성인 돌연변이유발 기법을 이용할 수 있다(Ausubel et al., 상기문헌설명 참조, 1989 및 1990, 1993 증보판, 제1권, 제8장 참조; Protein Engineering(Oxender and Fox eds., A.Liss,Inc., 1987)). 뿐만 아니라, 돌연변이유발에 링커 스캐닝(linker scanning) 및 PCR 매개성 기법이 사용될 수 있다[Erlich, PCR Technology(Stockton Press, 1989) ; Ausubel et al., 상동, 1989∼1993)]. 전술한 기법에 사용되는 임의의 단백질 서열결정, 구조 및 모델링 연구법은 상기 문헌에 개시되어 있다.
본 발명은 또한 GDF가 이의 수용체에 특이적으로 결합하는 것을 차단하는 GDF 수용체 결합제를 제공한다. 이러한 제제는 예를 들어, 전술한 근육 소모성 질환의 연구에 있어서 연구 및 진단 도구로서, 또한 치료제로서 유용하며, 본원에 기술된 방법 예를 들어, 분자 모델링 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 또한, GDF 수용체 결합제를 함유하는 약학적 조성물은 효과적인 치료제일 수 있다. 본 발명의 명세서에서 "GDF 수용체 결합제"는 GDF 수용체, 예컨대 GDF-1 내지 GDF-16의 자연발생의 리간드; GDF 수용체의 합성 리간드 또는 천연이나 합성 리간드의 적당한 유도체를 나타낸다. 리간드의 결정과 분리에 관하여는 당해 기술분야에 공지되어 있다(Lerner, Trends Neurosci. 17:142-146, 1994, 본원에 참고인용됨).
또 다른 구체예에서, 본 발명은 GDF 수용체와 GDF 사이의 결합을 방해하는 GDF 수용체-결합제에 관한 것이다. 이러한 결합제는 경쟁적 억제, 비경쟁적 억제(non-competitive inhibition) 또는 불경쟁적 억제(uncompetitive inhibition)를 통해 방해할 수 있다. GDF 수용체와 1종 이상의 GDF 사이의 정상적 결합의 방해는 유용한 약리학적 효과를 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명은 GDF 수용체에 결합하는 조성물을 동정하는 방법을 제공한다. 이 방법은 조성물과 GDF 수용체를 함유하는 성분을 이 성분의 특이적 상호작용을 허용하기에 충분한 조건하에서 항온처리하고, GDF 수용체에 대한 상기 조성물의 결합을 측정하는 것을 포함한다. GDF 수용체에 결합하는 조성물로는 전술한 바와 같은 펩타이드, 펩타이드모방체, 폴리펩타이드, 화학적 화합물 및 생물학적 제제가 있다. 항온처리는 시험 조성물과 GDF 수용체를 상호 접촉시키고 생체내에서 일어날 수 있는 특이적 상호작용에 적합한 조건을 제공하는 조건하에 반응물을 노출시키는 것을 포함한다. 접촉은 용액 상에서 또는 고체 상에서 일어날 수 있다. 시험 리간드/조성물은 경우에 따라 전술한 바와 같은 복수의 조성물을 스크리닝하기 위한 조합형 라이브러리일 수 있다. 본 발명의 방법에서 확인된 조성물은 용액 상태에서 또는 고상 지지체에 결합시킨 후 추가로 평가, 검출, 클로닝, 서열결정될 수 있는데, 이때 사용되는 방법으로는 특정 DNA 서열의 검출에 일반적으로 이용되는 임의의 방법, 예컨대 PCR, 올리고머 제한(Saiki et al., Bio/Technology 3:1008-1012, 1985, 본원에 참고인용됨), 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오타이드(ASO) 프로브 분석법(Conner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 80:278, 1983, 본원에 참고인용됨), 올리고뉴클레오타이드 결찰 분석법(OLA)(Landegren et al., Science 241: 1077, 1988, 본원에 참고인용됨) 등(Landegren et al., Science 242:229-237, 1988, 본원에 참고인용됨)이 있다.
조성물이 수용체 단백질과 기능적으로 복합체를 형성할 수 있는지를 측정하기 위하여, 외인성 유전자에 의해 암호된 단백질의 단백질 농도 변화를 모니터하거나 또는 본원에 개시된 임의의 다른 방법으로 외인성 유전자의 유도 여부를 모니터할 수 있다. 조성물이 외인성 유전자의 전사를 유도할 수 있음이 확인되면, 이 조성물이 초기 샘플 시험 조성물을 암호하는 핵산에 의해 암호된 수용체 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 것으로 간주한다.
외인성 유전자의 발현은 예컨대 기능 분석법이나 또는 단백질 산물의 분석법으로 모니터할 수 있다. 따라서, 외인성 유전자는 외인성 유전자의 발현을 검출할 수 있도록 분석가능한/측정가능한 발현 산물을 제공하는 유전자이다. 이러한 외인성 유전자로는 비제한적으로 리포터 유전자, 예컨대 클로람페니콜 아세틸트란스퍼라제 유전자, 알칼리성 포스파타제 유전자, β-갈락토시다제, 루시퍼라제 유전자, 녹색 형광성 단백질 유전자, 구아닌 크산틴 포스포리보실트란스퍼라제, 알칼리성 포스파타제 및 네오마이신 포스포트란스퍼라제와 같은 항생제 내성 유전자(상기 참조)가 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다.
외인성 유전자의 발현은 GDF 수용체와 조성물의 특이적 상호작용을 나타내는 것으로서, 결합 또는 차단 조성물을 동정하고 분리할 수 있다. 본 발명의 조성물은 배양 배지 또는 세포로부터 일반적으로 사용되는 공지의 단백질 정제 기법, 예컨대 추출, 침전, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 겔 여과법 등으로 추출 및 정제할 수 있다. 조성물의 분리는 컬럼 매트릭스에 결합된 변형 수용체 단백질 세포외 도메인을 사용하는 친화성 크로마토그래피나 또는 헤파린 크로마토그래피를 사용하여 분리할 수 있다.
또한, 본 발명의 스크리닝 방법에는 전술한 바와 같이 GDF 수용체에 결합하는 화학적 화합물을 동정하는 조합적 화학 방법이 있다. 따라서, 스크리닝 방법은 또한 필요에 따라 물리적(예컨대 입체적)인 것은 아니지만 기능적으로 길항제 또는 작용제로서 작용하는 변형체, 결합제 또는 차단제 등을 동정하는데 유용하다.
본 발명은 GDF-8(마이오스타틴) 수용체를 비롯하여 실질적으로 정제된 성장분화인자(GDF) 수용체, 및 이의 기능성 펩타이드 부분을 제공한다. 또한, 본 발명은 GDF 수용체의 실효성 있는 대표물이나 이의 기능성 펩타이드 부분을 제공한다. 본 발명은 또한 세포에서 마이오스타틴 시그널 도입에 영향을 미치는 제제와 세포를 접촉시켜 세포에 미치는 마이오스타틴의 효과를 조절하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 피검체 내의 근육 또는 지방 조직의 이상 함량, 발달 또는 대사 활성을 적어도 부분적인 특징으로 하는 병리학적 증상의 정도를, 상기 피검체의 근육 세포 또는 지방조직 세포내의 마이오스타틴 시그널 도입을 조절함으로써 경감시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 진핵 유기체에 대한 마이오스타틴 시그널 도입에 영향을 미치는 제제를 투여함으로써 진핵 유기체 내의 근조직 또는 지방 조직의 성장을 조절하는 방법을 제공한다.
하기 실시예는 예시적인 것으로서, 본 발명을 한정하는 것이 아니다.
실시예 1
용량-의존적 양상으로 작용하는 마이오스타틴
본 실시예는 근육 성장을 억제하는 마이오스타틴의 활성이 생체내 마이오스타틴 발현의 수준에 의존한다는 것을 증명한다.
마이오스타틴은 골격근육량의 음성 조절인자이다 (상기 McPherron et al., 1997; 상기 McPherron and Lee, 1997). 마이오스타틴 유전자의 결실을 위해 동형접합된 마이오스타틴 녹아웃(불활성화) 마우스는 전체 체중이 25-30% 증가하였다. 동형접합 녹아웃 마우스의 검사 결과 증가된 근육량은 신체 전반에 걸쳐 골격근육량이 약 100-200% 증가하였기 때문인 것으로 나타났다.
마이오스타틴 돌연변이를 위해 이형접합한 마우스 또한 전체 체중이 증가하였다. 그러나, 이형접합체의 체중 증가는 동형접합체에 비해 적었으며 많은 피검체 가운데 단지 하나의 년령층 및 성별 그룹에서만이 통계적으로 유의적이었다. 이형접합 마우스가 야생형 마우스와 동형접합 마이오스타틴 녹아웃 마우스사이에 중간적인 표현형을 갖는지를 측정하기 위해 이형접합 마우스에 까지 확장하여 근육량을 분석하였다. 이형접합 마우스로부터 채취된 개개 근육은 야생형 마우스보다 중량이 약 25-50% 증가하였다. 이들 결과는 마이오스타틴 유전자의 결실을 위해 이형접합하는 마우스가 야생형 마우스의 표현형과 동형접합 마이오스타틴 녹아웃 마우스의 표현형사이에 중간적인 표현형을 가진다는 것을 증명하며, 또한 마이오스타틴이 생체내에서 용량-의존적 효과를 나타낸다는 것을 증명한다.
이들 결과는 마이오스타틴 활성을 조절하는 것이 근육소모증 및 기타 마이오스타틴 활성과 연관된 대사성 질환을 치료하는데 유용할 수 있음을 가리킨다. 또한, 마이오스타틴의 용량-의존적 효과는 마이오스타틴 활성의 완전한 억제를 달성하지 않고서 치료 효과를 얻을 수 있으며, 이로써 예를 들면 특정 수준의 마이오스타틴 활성이 환자에게 바람직하지 않는 효과를 나타내는 경우 마이오스타틴 활성을 조절할 수 있음을 시사하는 것이다.
실시예 2
마이오스타틴 효과는 녹아웃 마우스가 나이가 들면서 감소한다.
이 실시예는 야생형 마우스와 동형접합 마이오스타틴 녹아웃 마우스사이에 체중의 감소차가 그러한 돌연변이 마우스의 근육량의 감소와 연관이 있음을 증명한다.
생후 5개월에서 마이오스타틴 녹아웃 마우스는 야생형 마우스보다 체중이 약 25-30% 더 무겁다(상기 McPherron et al., 1997). 그러나, 전체 체중의 이러한 차이는 마우스들이 나이가 들어가면서 유의적인 정도로 작아지거나 없어졌다. 이와 같은 효과가 예를 들면 근육 퇴화로 인한 녹아웃 마우스의 상대적 체중 감소에 의한 것인지, 아니면 야생형 마우스가 상대적으로 보다 크게 체중이 증가하여 발생한 것인지를 결정하기 위하여, 근육량을 나이의 함수로서 상세히 분석하였다.
생후 2개월에서부터 17개월까지 검사한 모든 나이에서, 동형접합 돌연변이 마우스의 흉근 중량은 야생형 마우스의 것보다 유의적으로 더 높았다. 가장 현저한 차이는 5개월에서 관찰되었으며, 이 시점에서 돌연변이 마우스의 흉근 중량이 야생형 보다 약 200% 더 높았다. 비록 흉근 중량이 나이가 들어가면서 약간씩 감소하였을 지라도, 돌연변이 마우스의 흉근 중량은 야생형의 것보다 2배를 유지하였다. 이러한 기본 성향은 상완 삼두근, 사두근, 비복근, 족척근 및 전경골근을 포함한 다른 모든 피검 근육에서 동일하게 관찰되었다. 유사한 성향이 수컷 및 암컷 양쪽 마우스에서 관찰되었다. 이들 결과는 나이가 들면서 관찰된 돌연변이 마우스와 야생형 마우스사이의 전체 체중의 감소된 차이가 돌연변이 마우스의 근육량이 약간 감소하기 때문임을 증명한다.
실시예 3
마이오스타틴은 용량-의존적 양상으로 지방 축적에 영향을 미친다.
이 실시예는 마이오스타틴 녹아웃 마우스가 지방을 축적하지 못하며, 지방 축적의 감소가 생체내 마이오스타틴 발현의 수준과 연관이 있음을 증명한다.
실시예 2에서 입증된 바와 같은 마이오스타틴 돌연변이 마우스의 근육량 감소가, 야생형 마우스와 돌연변이 마우스는 종국엔 거의 체중이 동일하다는 관찰 결과를 충분히 설명하지 못했기 때문에, 야생형과 돌연변이 마우스의 지방 축적량을 검사하였다. 수컷 마우스의 서혜, 부고환 및 후복막강 지방층을 검사하였다. 생후 2개월된 야생형 및 돌연변이 마우스간에 상기 지방층 어떠한 것도 중량의 차가 없었다. 생후 5-6개월까지 야생형 및 이형접합 녹아웃 마우스 모두는 광범위한 지방층 중량을 나타냈고, 평균적으로 지방층 중량은 마우스가 생후 9 내지 10개월된 시점까지 약 3배 내지 5배로 증가하였다. 이들 마우스에서 관찰된 광범위한 지방층으로 인해서 일부 마우스는 다른 마우스보다 훨씬 더 증가하였다(10배 까지).
야생형 및 이형접합 녹아웃 마우스와 대조적으로, 마이오스타틴 동형접합 돌연변이 마우스의 지방층 중량은 범위가 비교적 좁았고 실질적으로 생후 2개월된 마우스에서 및 생후 9 내지 10개월된 마우스에서 같았다. 따라서, 야생형 마우스에서 나이가 들면서 일어나는 지방 축적의 증가는 동형접합 마이오스타틴 녹아웃 마우스에서 관찰되지 않았다. 동형접합 돌연변이 마우스에서 나이의 함수로서 근육량의 미미한 감소와 함께 지방 축적의 그러한 차이는 야생형 마우스가 종국에 돌연변이 마우스와 전체 체중이 같아진다는 관찰결과를 충분히 설명해 주었다.
생후 9 내지 10개월된 이형접합 녹아웃 마우스의 평균 지방층 중량은 야생형 마우스와 동형접합 돌연변이 마우스의 것 중간이었다. 이러한 차이는 통계적으로 유의적인 것은 아니지만, 이들 및 야생형 마우스에서 광범위한 지방층 중량으로 인해, 이들 결과는 마이오스타틴이, 근육 성장에 영향을 미치는 것과 유사하게, 지방의 축적에 용량-의존적으로 영향을 미친다는 것을 가리킨다.
실시예 4
대사에 미치는 마이오스타틴의 영향
이 실시예는 혈청 인슐린 및 당 수준뿐만 아니라 대사 활성이 마이오스타틴 발현의 수준에 의해 영향을 받는다는 것을 증명한다.
마이오스타틴 돌연변이 마우스의 골격근 비대 및 지방 축적 결핍이 총 대사에 미치는 영향에 기인하는지를 결정하기 위해, 돌연변이 마우스의 대사 프로필을 검사하였다. 혈청 트리글리세라이드 및 혈청 콜레스테롤 수준은 야생형 대조 마우스에 비하여 마이오스타틴 돌연변이 마우스에서 유의적으로 더 낮았다(표 1). 혈 청 인슐린 수준 또한 마이오스타틴 돌연변이 마우스에서 더 낮은 것으로 나타났다. 그러나, 급식 및 공복 당 수준 모두는 동형접합 돌연변이 마우스 및 야생형 마우스사이에서 차이가 없었고(표 1) 양 그룹의 마우스는 당 내성 시험에서 정상적인 반응을 나타냈다. 이 결과들은 동형접합 마이오스타틴 녹아웃 마우스가 비록 이들의 혈청 인슐린 수준이 야생형 마우스의 것보다 더 낮을지라도 혈청 당의 정상적인 수준을 유지할 수 있음을 증명한다.
혈청 변수
+/+ -/-
트리글리세라이드(㎎/㎗) 131.5 +/- 16.5 66.8 +/- 11.4 p=0.012
콜레스테롤(mg/㎗) 138.3 +/- 8.1 94.5 +/- 6.8 p=0.0034
식후 당(mg/㎗) 114.0 +/- 4.8 119.3 +/- 5.2 n.s.(p=0.43)
공복시 당(mg/㎗) 86.5 +/- 3.8 103.0 + 9.3 n.s.(p=0.13)
+/+는 야생형 마우스를 가리킨다; -/-는 동형접합 녹아웃 마우스를 가리킨다.
대사율의 차이가 돌연변이 마우스의 지방 축적 결손을 설명할 수 있는지를 결정하기 위해, 야생형 및 돌연변이 마우스의 산소 소비율을 열량계를 사용하여 비교하였다. 돌연변이 마우스는 야생형 대조 마우스보다 더 낮은 기초대사율과 더 낮은 총 대사율을 나타냈다. 이들 결과는 마이오스타틴 돌연변이 마우스의 지방 축적 결손이 보다 높은 대사활성율로 인한 것이 아님을 가리킨다.
실시예 5
마이오스타틴은 유전적 비만 마우스의 지방 축적에 영향을 미친다.
이 실시예는 마이오스타틴 발현의 결손이 유전적 비만 모델인 마우스에서 지방 축적을 억제함을 증명한다.
마이오스타틴 활성의 손실이 정상 마우스뿐만 아니라 비만 마우스에서 지방 축적을 억제할 수 있는지를 결정하기 위해, 유전적 비만 모델(Yen et al., FASEB J. 8:479-488, 1994)로 대표되는 쥐색 치사 황색 (Ay) 마우스에서의 마이오스타틴의 영향을 검사하였다. 치사 황색 및 마이오스타틴 돌연변이를 위해 이중 이형접합된 마우스를 생산하고 이들 이중 이형접합 마우스를 교배하여 생산한 후손을 검사하였다.
Ay/a, 마이오스타틴 -/- 이중 돌연변이 마우스의 전체 체중은 Ay/a, 마이오스타틴 +/+ 마우스에 비하여 현저히 감소하였다 (약 9 그램). 이와 같은 전체 체중 감소는 Ay/a, 마이오스타틴 -/- 이중 돌연변이 마우스가 AY/a, 마이오스타틴 +/+ 마우스에 비해 약 2 내지 3배 더 많은 골격근을 갖고 있다는 점을 고려해 볼때 훨씬 더 놀라운 것이었다. 이중 돌연변이 마우스는 Ay/a, 마이오스타틴 +/+ 마우스보다 약 10 그램 더 많은 근육을 가졌으며, 이에 따라 나머지 조직의 전체 중량 감소는 약 19 그램이었다.
전체 체중의 감소는 총 지방 함량의 감소에 의한 것이었다. 표 2에서 보듯이, Ay/a, 마이오스타틴 -/- 이중 돌연변이 마우스는 자궁주위 및 후복강 지방층의 중량이 Ay/a, 마이오스타틴 +/+ 마우스에 비하여 5배 내지 6배 감소하였다. 이들 결과는 마이오스타틴 돌연변이의 존재가 비만에서 지방 축적을 현저히 억제한다는 것을 가리킨다.
마이오스타틴 돌연변이의 존재는 또한 당 대사에 현저히 영향을 미쳤다. 마이오스타틴 돌연변이가 없는 쥐색 치사 마우스는 상당히 비정상적인 당 내성 시험 결과를 나타냈는데, 혈청 당 수준은 자주 450 내지 600 mg/dl에 도달하였고 4시간에 걸쳐 단지 서서히 기저 수준으로 회복하였다. 암컷 쥐색 치사 마우스는 수컷 마우스보다 덜 영향을 받았으며, 상기된 바와 같이(상기 Yen et al., 1994) 일부 암컷은 이 시험에서 거의 정상적으로 반응하였다. 대조적으로, 비록 Ay/a, 마이오스타틴 -/- 마우스는 약간 비정상적인 당 내성 시험을 나타냈을 지라도, 이들 마우스중 어느 것도 Ay/a 마이오스타틴 +/+ 마우스에서 관찰되는 바와 같이 상당히 비정상적이지는 않았다.
이들 결과는 마이오스타틴 돌연변이가 쥐색 치사 마우스에서 비정상적인 당 대사의 발전을 적어도 부분적으로 억제하였음을 가리킨다. 중요하게는, 마이오스타틴 돌연변이를 위해 이형접합된 마우스는 마이오스타틴 +/+ 및 마이오스타틴 -/- 마우스와 비교하여 중간정도의 반응을 나타냈으며, 이에 따라 마이오스타틴의 용량-의존적 효과가 검증된 것이다.
실시예 6
재조합 마이오스타틴의 정제
이 실시예는 재조합 마이오스타틴을 제조하고 분리하는 방법을 제공한다.
마이오스타틴의 생물학적 활성을 밝히기 위해 생분석법을 위한 다량의 마이오스타틴 단백질을 정제하였다. 메토트렉세이트 스크리닝 계획(상기 McPherron et al., 1997)을 이용하여 디하이드로폴레이트 리덕타제 카세트와 더불어 마이오스타틴 발현 카세트를 동시-증폭시킴으로써 고 수준의 마이오스타틴 단백질을 생성하는 안정한 챠이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주를 생성하였다. 최고의 생성 세포주의 조성된 배지를 하이드록시아파타이드, 렌틸 렉틴 SEPHAROSE, DEAE 아가로즈 및 헤파린 SEPHAROSE상에서 연속적으로 분별하여 마이오스타틴을 정제하였다. 은 염색 분석 결과 이들 4가지의 컬럼 크로마토그래피 단계 후 얻은 정제된 단백질("헤파린 용출물"이라고 한다)은 분자량이 약 35 킬로달톤(kDa) 및 12 kDa인 두 종으로 구성된 것으로 밝혀졌다.
정제된 단백질 제제를 여러 기준으로 결정한 결과 두가지의 마이오스타틴 프로도메인 펩타이드와 성숙 C-말단 마이오스타틴 펩타이드의 디설파이드-결합된 이량체의 복합체로 나타났다. 첫째, 프로마이오스타틴 서열의 특정 부분에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석 결과 35 kDa 밴드가 프로도메인으로, 12 kDa 밴드가 성숙 C-말단 펩타이드로 동정되었다. 둘째, 비환원 조건하에서, 성숙 C-말단 펩타이드에 대한 항체와 반응하는 종은 디설파이드 연결된 이량체와 일치하는 전기영동 이동을 나타냈다. 셋째, 프로도메인 대 성숙 C-말단 펩타이드의 몰비는 약 1:1이었다. 넷째, 프로도메인과 성숙 C-말단 펩타이드는 상기 4가지 컬럼 크로마토그래피 단계를 통해 동시-정제되었다. 마지막으로, 비록 C-말단 영역이 컨센서스 N-연결된 글리코실화 시그널을 함유하지 않을지라도 성숙 C-말단 펩타이드는 렌틸 렉틴 컬럼에 결합하였는데, 이것은 성숙 C-말단 펩타이드가 잠재 N-연결된 글리코실화 부위를 함유하는 프로도메인 펩타이드와의 상호작용으로 인해 컬럼에 결합하였음을 가리킨다.
이들 결과는 유전적으로 변형된 CHO 세포에 의해 생성된 마이오스타틴이 단백질분해적으로 프로세싱된 형태로 분비되고 생성된 프로도메인과 성숙 C-말단 영역이 비공유 결합하여 두가지의 프로도메인 펩타이드와 TGF-β에 대해 기술된 것과 유사한 C-말단 단백질분해 단편의 디설파이드-연결된 이량체를 함유한 복합체를 형성함을 가리킨다. TGF-β 복합체에서, C-말단 이량체는 불활성, 잠재 형태로 존재하며(Miyazono et al., J. Biol. Chem. 263:6407-6415, 1988), 이 잠재 복합체를 산, 카오트로픽제, 반응성 산소 종 또는 플라스민으로 처리하거나, 트롬보스폰딘 및 인테그린 αvβ6를 포함한 다른 단백질과의 상호작용에 의해 활성 종을 분리할 수 있다(Lawrence et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 133:1026-1034, 1985; Lyons et al., J. Cell Biol. 106:1659-1665, 1988; Schultz-Cherry and Murphy-Ullrich, J. Cell Biol. 122:923-932, 1993; Barcellos-Hoff and Dix, Mol. Endocrinol. 10:1077-1083, 1996; Munger et al., Cell 96:319-328, 1999). 또한, TGF-β 복합체에 정제된 프로도메인 펩타이드(또한 잠재-연관된 펩타이드 또는 LAP로 알려져 있다)의 부가는 시험관내 및 생체내에서 정제된 C-말단 이량체의 생물학적 활성을 억제한다(Gentry and Nash, Biochemistry 29:6851-6857, 1990; Bottinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 93:5877-5882, 1996).
프로도메인과 성숙 C-말단 펩타이드의 복합체로 구성된 헤파린 용출물은 HPLC C4 역상 컬럼을 이용하여 좀더 정제하였다. HPLC 컬럼으로부터 C-말단 이량체가 프로도메인보다 먼저 용출되었으며, 이에 따라 프로도메인이 없는 C-말단 이량체를 분리할 수 있었다. 또한, 대부분 프로도메인을 함유한 분획을 수득하였으며, 이들 분획은 소량의 C-말단 이량체를 함유하였다. 일부 단백질은 또한 고분자량의 복합체로 존재하였다. 고분자량 복합체의 성질은 알려져 있지 않지만, 환원제의 유무하에 웨스턴 블롯 분석을 기초로 하여, 이들 복합체는 한개 이상의 디설파이드 결합에 의해 연결된 적어도 하나의 프로도메인 펩타이드와 하나의 C 말단 성숙 마이오스타틴 펩타이드를 함유할 수 있다. 사실, 프로펩타이드에 대해 증식된 HPLC 분획(HPLC 분획 35-37)에 존재하는 대부분의 성숙 C-말단 펩타이드는 이들 고분자량 복합체에 존재하였다. 이들 고분자량 복합체는 유전적으로 변형된 CHO 세포에 의해 분비되는 부적절하게 폴딩된 단백질을 나타낸다.
실시예 7
액티빈 수용체와 특이적으로 상호작용하는 마이오스타틴
이 실시예는 마이오스타틴이 배양물의 세포에서 발현된 액티빈 II형 수용체와 특이적으로 결합하고, 이 특이적 결합이 마이오스타틴 프로도메인에 의해 억제된다는 것을 증명한다.
일부 TGF-β 계열 일원에 대한 수용체가 동정되어 왔으며, 대부분은 단일 막 경유 세린/트레오닌 키나제(Massague and Weis-Garcia, Cancer Surveys 27:41-64, 1996)이다. 액티빈 II형 수용체(Act RIIA 및/또는 Act RIIB)는 예를 들면 TGF-β 상위계열의 일원과 결합하는 것으로 알려져 있다. Act RIIB 수용체가 결여된 마우스의 표현형은 GDF-11 녹아웃 마우스에서 관찰된 것과 아주 흡사한 전/후 축 패턴 결함 및 신장 비정상을 보였다(McPherron et al., Nat. Genet. 22:260-264, 1999; Oh and Li, Genes Devel. 11:1812-1826, 1997). GDF-11과 마이오스타틴(GDF-8)의 아미노산 서열은 성숙 C-말단 영역에서 90% 동일하기 때문에, 마이오스타틴이 액티빈 II형 수용체와 특이적으로 상호작용하는 능력을 검사하였다.
마이오스타틴을 방사성-요오드화에 의해 표지하고 Act RIIB 발현 작제물로 형질감염된 COS 세포를 이용하여 결합 연구를 실시하였다. 마이오스타틴은 형질감염된 COS 세포와 특이적으로 상호작용하였다. 마이오스타틴 결합은 과량의 비표지된 마이오스타틴과 용량-의존적 양상으로 경쟁하였고 공 벡터로 형질감염된 대조 COS 세포에서 유의적으로 더 낮았다. BMP RII 또는 TGF-β RII 발현 작제물로 형질감염된 세포에는 유의적인 결합이 일어나지 않았다. Act RIIB-형질감염된 세포와의 마이오스타틴 결합은 포화적이었으며, 결합 친화력은 Scatchard 분석 결과 약 5 nM로 결정되었다.
또한, 수용체 결합 분석법을 이용하여 이 시스템에서 성숙 C-말단 이량체가 Act RIIB와 특이적으로 상호작용하는 능력을 억제하는 마이오스타틴 프로도메인의 능력을 검사하였다. 정제된 프로도메인 펩타이드의 부가는 C-말단 이량체가 Act RIIB 형질감염된 COS 세포와 용량-의존적 양상으로 결합하는 능력을 차단하였다. 이들 결과는 마이오스타틴 프로도메인이 마이오스타틴의 천연 억제제임을 가리킨다.
실시예 8
증가된 마이오스타틴 수준은 체중 감소를 유도한다.
이 실시예는 마이오스타틴의 증가된 수준이 실질적인 생체내 체중 감소를 유도할 수 있음을 증명한다.
한 세트의 실험에서, 마이오스타틴을 발현하는 CHO 세포를 누드 마우스에 주사하였다. 마이오스타틴 발현 CHO 세포 종양을 가진 누드 마우스는 세포의 주사 후 약 12 내지 16일 경과하는 과정에서 심한 소모성 현상을 보여주었다. 이 소모성 증후군은 유사한 스크리닝 과정을 겪었으나 마이오스타틴을 발현하지 않는 여러 대조 CHO 세포주중 어느 것으로 주사된 누드 마우스에서도 관찰되지 않았다. 또한, CHO 세포를 형질감염하기 위해 사용된 작제물에서 마이오스타틴 암호 서열은 메탈로티오네인 프로모터의 조절하에 있었고 소모성 증후군은 마이오스타틴 발현 종양을 함유한 마우스가 황산아연을 함유한 물에서 유지되었을 때 악화되었다. 웨스턴 블롯 분석 결과 마이오스타틴-발현 CHO 세포를 함유한 누드 마우스의 혈청에 고수준의 마이오스타틴 단백질이 존재하는 것으로 나타났다. 이들 결과는 소비 증후군이 누드 마우스에서 마이오스타틴의 증가된 수준에 반응하여 유도되었고, 아래에서 논의된 바와 같이 이 결과는 정제된 마이오스타틴이 주사된 마우스에서 유사한 효과를 관찰함으로써 검증되었다.
마이오스타틴 발현 CHO 세포를 함유한 누드 마우스에서 관찰된 현저한 체중 감소는 지방과 근육량 둘다의 불균형적인 감소에 주로 기인하였다. 백색 지방층(견갑내 백색, 자궁 및 후복막강 지방) 중량은 대조 CHO 세포 종양을 함유한 마우스와 비교하여 90% 이상 감소하였다. 근육량도 상당히 감소하였는데, 개개 근육의 중량은 마이오스타틴 발현 마우스가 대조 마우스보다 16일째까지 약 절반이었다. 이러한 근육의 감량에 따라, 이에 상응하여 섬유 크기 및 단백질 함량도 감소하였다.
마이오스타틴 발현 CHO 세포 종양을 함유한 마우스는 또한 심한 저혈당증을 보였다. 그러나, 모든 마우스는 16일간의 연구 기간동안에 시험된 각 시간대에서 동일한 양의 사료를 소비하였기 때문에, 체중 감소 및 저혈당증은 사료 소비의 차이에 기인한 것이 아니었다. 이들 결과는 마이오스타틴 과발현이 급격한 체중 감소를 유도함을 나타내며, 이것은 암 또는 AIDS와 같은 만성 질병을 앓고 있는 환자에게 일어나는 악액질 소비 증후군과 유사하다.
저용량의 마이오스타틴을 이용한 더욱 만성적인 투여와 함께, 지방 중량의 변화가 관찰되었다. 예를 들면, 7일 동안 마이오스타틴 단백질 1 ㎍의 일일 2회 주사는 많은 다른 백색 지방층(견갑내 백색, 자궁 및 후복막강 지방층)의 중량을 약 50% 감소시켰고, 한편 갈색 지방(견갑내 갈색)에는 유의적인 영향이 없었다. 이들 결과는 마이오스타틴이 체중 감소를 유도할 수 있고 극단적인 경우로 생체내 소비 증후군을 유도할 수 있음을 가리킨다.
실시예 9
액티빈 수용체에 결합하는 마이오스타틴의 특성규명
이 실시예는 액티빈 수용체와 결합하는 마이오스타틴과 생체내 마이오스타틴에 의해 생물학적 효과의 관계를 특성규명하는 방법을 기술한 것이다.
Act RIIA 또는 Act RIIB 녹아웃 마우스를 사용하여 Act RIIA 또는 Act RIIB가 생체내 마이오스타틴의 수용체임을 검증할 수 있다. 이들 마우스의 상세한 근육 분석은 액티빈 수용체의 녹아웃이 근섬유 수 또는 크기의 변화와 연관이 있는지를 결정할 수 있다. Act RIIA/Act RIIB 이중 동형접합 돌연변이 마우스는 배발생 초기에 사망하기 때문에(Song et al., Devel. Biol. 213:157-169, 1999), 단지 여러 동형접합/이형접합 조합 마우스만을 검사할 수 있다. 그러나, 양 유전자들이 단지 근조직에서만 "결실"될 수 있도록 하는 조직-특이적 또는 조건적 녹아웃 마우스를 생산할 수 있으며, 이로써 이중 동형접합 녹아웃 마우스의 출생후 검사가 가능할 수 있다.
마우스의 노화에 따라 지방 조직에 미치는 영향을 검사하여 지방세포의 수 또는 이들 지방세포에 의한 지질의 축적이 녹아웃 마우스에서 변화가 있는지를 결정할 수 있다. 지방세포 수 및 크기는 콜라게나제 처리된 조직으로부터 세포 현탁액을 제조함으로써 결정한다(Rodbell, J. Biol. Chem. 239:375-380, 1964; Hirsch and Gallian, J. Lipid Res. 9:110-119, 1968). 마우스에서의 전체 지질 함량은 건조 지육 중량을 측정한 다음, 지질 추출 후 잔여 건조 지육 중량을 측정함으로써 결정한다(Folch et al., J. Biol. Chem. 226:497-509, 1957).
또한, 식후 및 공복 당과 인슐린, 트리글리세라이드, 콜레스테롤 및 렙틴을 포함한 여러 혈청 변수를 검사할 수 있다. 상기된 바와 같이, 혈청 트리글리세라이드 및 혈청 인슐린은 마이오스타틴 돌연변이 동물에서 감소한다. 또한 당 내성 시험을 이용하여 액티빈 수용체 녹아웃 마우스가 외인성 당 로드(exogenous glucose load)에 반응하는 능력을 검사할 수 있다. 상기된 바와 같이, 당 로드에 대한 반응은 생후 5개월된 야생형과 마이오스타틴 돌연변이 마우스에서 반드시 동일하였다. 이러한 관찰은 마우스가 나이가 들어감에 따라 마우스에서 상기 변수를 측정함으로써 계속될 수 있다. 또한 혈청 인슐린 수준을 당 내성 시험동안에 여러 시간대에서 측정할 수 있다.
또한, 열량계(Columbus Instruments)를 이용하여 기초대사율을 모니터링할 수 있다. 상기된 바와 같이, 마이오스타틴 돌연변이 마우스는 이들의 야생형 마우스보다 생후 3개월 시점에서 보다 낮은 대사율을 나타낸다. 이 분석 대상을 좀더 노후한 마우스까지 확대할 수 있으며, 또한, 이들 마우스에서 산소소비량을 측정할 수 있다. 기초 체온뿐만 아니라 4℃에 넣었을 때 체온을 유지하는 능력을 측정함으로써 정상적인 열발생 유지 능력을 측정할 수 있다. 또한, 갈색 지방, 백색 지방 및 기타 조직에서 갈색 지방 중량 및 UCP1, UCP2 및 UCP3의 발현 수준을 검사할 수 있다(Schrauwen et al., 1999).
체중 증가와 상관하여 사료 섭취를 모니터링할 수 있으며 사료 효율을 계산할 수 있다. 또한, 고 지방 사료를 공급한 마우스에서의 체중 증가를 모니터링할 수 있다. 본원에 기술된 결과들은 액티빈 수용체 돌연변이 마우스가 상대적으로 마른 상태로 있을 것임을 가리키는 반면, 고 지방 사료를 공급한 야생형 마우스는 지방을 급속히 축적하였다.
상기 연구의 결과는 마이오스타틴 마우스의 효과에 대해 보다 완벽한 프로필을 제공할 수 있고, 특히 마이오스타틴 마우스의 총 대사 상태의 관점에서 그러하며, 이로써 마이오스타틴 녹아웃 마우스가 지방 축적을 억제하는 능력은 지방 형태로 저장할때 에너지가 거의 이용되지 않도록 에너지 이용을 변화시키는 근육에서의 마이오스타틴 돌연변이의 동화작용임을 알 수 있다. 예를 들면, 감소된 지방 축적은 증가된 열발생율에 기인할 수 있다. 이들 결과들은 또한 비만과 II형 당뇨병의 다른 유전 모델에서 마이오스타틴 활성의 효과를 비교하는 기준선을 제공할 것이다.
실시예 10
비만 및 II 형 당뇨병의 유전 모델에서 마이오스타틴 작용의 특성규명
이 실시예는 비만 및 II형 당뇨병을 치료하는데 있어서의 마이오스타틴의 효과를 결정하는 방법을 기술한 것이다.
야생형 마우스와 비교하여 마이오스타틴 돌연변이 마우스에서 총 지방 축적의 현저한 감소는 마이오스타틴 활성을 조절하여 비만 또는 II형 당뇨병을 치료 또는 예방할 수 있음을 가리킨다. "비만" 마우스(ob/ob), "당뇨" 마우스(db/db) 및 쥐색 치사 황색(Ay) 돌연변이 스트레인(mutant strain)을 포함한 상기 대사성 질환의 특성규명이 잘된 수 종류 마우스 모델을 이용하여 마이오스타틴 돌연변이의 효과를 검사할 수 있다. 이들 각 스트레인은 실제로 상기된 모든 변수 및 시험에 대해 비정상적이다(참조예: 상기 Yen et al., 1994; Friedman and Halaas, Nature 395:763-770, 1998). 이중 돌연변이 마우스를 작제한 다음, 이 이중 돌연변이 마우스를 단지 ob/ob, db/db 또는 쥐색 치사 황색 돌연변이를 갖는 적절한 대조 마우스와 함께 여러 시험에 적용함으로써, 다른 돌연변이를 보유한 마우스에서 상기 비정상성의 발달을 둔화시키거나 억제하는 마이오스타틴 돌연변이의 능력을 검사할 수 있다.
상기된 바와 같이, Ay 마우스의 마이오스타틴 돌연변이는, 당 내성 시험에 의해 평가된 비정상적인 당 대사의 발달의 부분적인 억제와 함께, 마이오스타틴 돌연변이 Ay 마우스에서의 지방 축적의 약 5배 억제와 연관이 있었다. 이들 결과는 여러 나이별의 마우스에까지 확대될 수 있으며 ob/ob 및 db/db 돌연변이 마우스로 비슷한 연구를 실시할 수 있다. 이들 양 돌연변이는 열성이기때문에, 마이오스타틴 돌연변이에 대해 이중 동형접합이거나 ob 또는 db 돌연변이중 어느 하나인 마우스를 생산할 수 있다. 이들 유전 모델계에서 마이오스타틴 작용의 부분적 상실에 따른 효과를 검사하기 위해, ob 또는 db 돌연변이에 대해 동형접합이고 마이오스타틴 돌연변이에 대해 이형접합인 마우스를 또한 검사한다. 마이오스타틴과 ob 돌연변이에 대해 이중 이형접합인 마우스를 생산하였고, 이들 이중 이형접합 마우스를 교미시켜 생산한 후손을 특히 지방 축적 및 당 대사의 관점에서 검사할 수 있다. 비만 돌연변이 마우스에서 이들 비정상성중 어느 하나 또는 둘다의 부분적인 억제는 마이오스타틴이 비만 및 II형 당뇨병의 치료에 있어서 표적임을 시사한다.
실시예 11
마이오스타틴 활성에 영향을 미칠 수 있는 우성 음성 폴리펩타이드를 발현하는 트랜스게닉 마우스의 특성규명
이 실시예는 마이오스타틴 발현 또는 마이오스타틴 시그널 도입을 차단할 수 있는 우성 음성 폴리펩타이드를 발현시킴으로써 생후 마이오스타틴의 효과를 특성규명하는 방법을 기술한 것이다.
마이오스타틴 억제인자
생후 마이오스타틴 활성의 조절을 이용하여 근섬유 수(증식증) 및 근섬유 크기(비대증)에 미치는 마이오스타틴의 영향을 결정할 수 있다. 마이오스타틴 유전자가 마우스의 생존 동안에 정해진 시간대에서 결실된 조건적 마이오스타틴 녹아웃 마우스를 이들 연구에 사용할 수 있다. cre 재조합효소와 조합된 tet 조절인자는 그러한 마우스를 생산하기 위한 시스템을 제공한다. 이 시스템에서 cre의 발현은 독시사이클린의 투여에 의해 유도된다.
또한, 마이오스타틴 활성이 마우스의 생존 동안에 정해진 시간대에서 감소되거나 억제될 수 있도록 유도성 프로모터로부터 마이오스타틴의 억제제를 발현하는 트랜스게닉 마우스를 생산할 수 있다. 테트라사이클린 조절인자는 마이오스타틴 발현이 독시사이클린에 의해 유도되는 트랜스게닉 마우스를 생산하는데 유용하다.
하이브리드 역 tet-전사활성화인자(돌연변이 역 tet 억제인자와 VP16의 활성화 도메인의 융합 단백질)와 하이브리드 tet-전사억제인자(천연 tet 억제인자와 포유동물 Kox1의 KRAB 억제인자 도메인의 융합 단백질)의 동시 발현을 이용하는 tet 시스템의 변형은 트랜스게닉 마우스를 생산하는데 특히 유용하다(Rossi et al., Nat. Genet. 20:389-393, 1998; Forster et al., Nucl. Acids Res. 27:708-710, 1999). 이 시스템에서, 하이브리드 역 tet-전사활성화인자는 tet 오퍼레이터 서열과 결합하고, 단지 테트라사이클린의 존재하에서만 전사를 활성화한다; 하이브리드 tet-전사억제인자는 테트라사이클린의 부재하에서만 tet 오페레이터 서열과 결합하고 전사를 억제한다. 이들 두 융합 단백질을 동시 발현시킴으로써, 표적 프로모터의 기초 활성은 테트라사이클린의 부재하에서 tet-전사억제인자에 의해 침묵되며, 테트라사이클린의 투여시 역 tet-전사활성화제에 의해 활성화된다.
두 유형의 트랜스게닉 라인을 생산할 수 있다. 첫번째 유형으로, 트랜스유전자는 근육 특이적 프로모터, 예를 들면 근육 크레아틴 키나제 프로모터(상기 Sternberg et al., 1988) 또는 마이오신 경쇄 인핸서/프로모터(상기 Donoghue et al., 1991)의 조절하에 마이오스타틴 억제인자 폴리펩타이드를 암호한다. 개개 트랜스게닉 라인을 골격근에서 tet 조절인자의 특이적 발현에 대해 스크리닝하고, 두 프로모터 각각에 대한 여러 독립된 라인을 스크리닝 및 검사하여 관찰된 어떠한 효과도 예를 들면 통합 부위-특이적 효과에 의한 것이 아님을 확인하였다. 마이오신 경쇄 프로모터/인핸서의 조절하에 두 tet 조절인자를 함유한 작제물을 작제하였고 수정란 주사를 위해 사용할 수 있다. 두번째 유형으로, 트랜스유전자는 추가로 tet 오퍼레이터 서열을 함유한 최소 CMV 프로모터의 조절하에 마이오스타틴 억제인자 폴리펩타이드를 함유한다.
마이오스타틴 억제인자는 본원에 기술된 바와 같이 마이오스타틴 활성을 억제할 수 있는 마이오스타틴의 우성 음성 형태 또는 마이오스타틴 프로도메인일 수 있다. TGF-β 계열 일원의 우성 음성 형태는 공개되어 있으며(참조예: Lopez et al., Mol. Cell Biol. 12:1674-1679, 1992; Wittbrodt and Rosa, Genes Devel. 8:1448-1462, 1994), 예를 들면 돌연변이 단백질분해성 절단부위를 함유함으로써 단백질이 생물학적 활성 종으로 프로세싱되는 것을 방지한다. 돌연변이 단백질은, 내인성 야생형 유전자를 갖는 세포에서 동시 발현될 때, 야생형 단백질과 비작용성 헤테로이량체를 형성하며, 이로써 우성 음성으로 작용한다. 프로마이오스타틴 절단부위가 돌연변이된 돌연변이 마이오스타틴 폴리펩타이드를 작제하여, 293 세포에서 여러 비율로 돌연변이 마이오스타틴을 야생형 마이오스타틴과 동시 발현시킴으로써 우성 음성 효과에 대해 검사할 수 있다. 작제물로 일시적으로 형질감염된 293 세포로부터 조성된 배지를 웨스턴 블롯 분석에 의해 검사할 수 있으며 돌연변이체가 성숙 C-말단 이량체의 형성을 차단하는 능력을 검사할 수 있다.
단지 마이오스타틴 프로도메인만을 암호하는 발현 작제물을 또한 이용할 수 있다. 상기된 바와 같이, 프로도메인은 성숙 C-말단 이량체와의 조밀한 복합체를 형성하며, 성숙 C-말단 마이오스타틴 이량체가 배양물중의 수용체 발현 세포에서 Act RIIB와 결합하는 능력을 차단한다. TGF-β와 유사하게, 마이오스타틴 프로도메인은 또한 생체내에서 불활성 잠재 복합체의 성숙 C-말단 이량체를 유지할 수 있다.
이들 돌연변이 동물은 tet 조절인자를 발현하는 것과 함께 번식시켜 tet 조절인자와 억제인자 표적 작제물 둘다를 함유한 이중 트랜스게닉 라인을 생산할 수 있다. 이들 이중 돌연변이 라인은 상이한 성분 모두가 적절히 발현되는 것에 대해 스크리닝할 수 있다. 음료수에 독시사이클린의 투여 전후 각 라인에서 대표적인 마우스로부터의 여러 근육 및 대조 조직으로부터 얻은 RNA를 이용한 노던 블롯 분석을 이용하여 그러한 트랜스게닉 라인을 동정할 수 있다. 독시사이클린의 부재하에 어떠한 조직에서도 트랜스유전자를 발현하지 않으며 독시사이클린의 존재하에 근육에서만 트랜스유전자를 발현하는 트랜스게닉 라인을 스크리닝할 것이다.
독시사이클린을 스크리닝된 돌연변이 동물에 투여하고 근육량에 미치는 효과를 검사한다. 독시사이클린을 임신한 모체에 투여하여 배발생동안에 억제인자의 발현을 유도할 수 있다. 트랜스게닉 동물의 발생동안에 마이오스타틴 활성을 차단하는 효과는 마이오스타틴 녹아웃 마우스에서 관찰된 효과와 비슷할 수 있다. tet 조절인자의 발현을 가동하는 프로모터는 마이오스타틴이 처음 발현되는 시점보다 발생 동안의 후반기에 유도할 수 있기 때문에, 트랜스게닉 마우스에서 근육량에 미치는 효과는 마이오스타틴 녹아웃 마우스에서 일어나는 효과와 비슷할 수 있다.
생후 마이오스타틴 활성을 억제하는 효과는 출생후 여러 시간대에서 이중 돌연변이 마우스에 독시사이클린을 투여함으로써 검사할 수 있다. 독시사이클린 처리는 예를 들면 3주령에서 시작할 수 있으며, 마우스는 근육량의 차이가 마이오스타틴 녹아웃 마우스 대 야생형 마우스에서 최대가 되는 나이인 생후 5개월에서 분석할 수 있다. 마우스는 근육량에 미치는 억제인자의 효과에 대해 검사한다. 또한 근육은 조직학적으로 검사하여 섬유 수 및 섬유 크기에 미치는 영향을 결정할 수 있다. 또한, 돌연변이 마우스에서 여러 근육의 섬유 유형 분석을 실시하여 I형 또는 II형 섬유에 미치는 특정한 효과가 있는지를 결정할 수 있다.
독시사이클린을 상이한 용량 및 상이한 시간대에서 투여하여 마이오스타틴 억제인자의 효과를 특성규명할 수 있다. 또한, 이중 돌연변이 마우스를 장기간 동안 독시사이클린에서 유지한 다음, 지방층 중량에 대한 영향 및 기타 상기된 바와 같은 관련된 대사 변수에 대해 검사할 수 있다. 이들 연구의 결과는 생후 마이오스타틴 활성을 조절하는 것이 근육량을 증가시키거나 지방 축적을 감소시키다는 것을 증명할 수 있으며, 이에 따라 표적 마이오스타틴이 임상적으로 여러 근육 소모성 질환 및 대사성 질환을 치료하는데 유용할 수 있음을 가리킨다.
마이오스타틴
또한, 마이오스타틴 트랜스유전자를 함유한 돌연변이 마우스를 검사할 수 있고 마이오스타틴의 발현시에 발생된 효과는 마이오스타틴-발현 CHO 세포를 함유한 누드 마우스에서 관찰된 것과 비슷할 수 있다. 상기된 바와 유사하게, 마이오스타틴을 조건적(tet) 및 조직 특이적 조절 요소의 조절하에 둘 수 있으며 트랜스게닉 마우스에서 마이오스타틴의 발현을 검사하여 소비 증후군이 누드 마우스에서 관찰된 것과 유사하게 일어나는지를 결정할 수 있다. 마이오스타틴 트랜스유전자는 예를 들면 트랜스유전자가 내인성 마이오스타틴 유전자와 구분될 수 있도록 SV40으로부터 유도된 프로세싱 시그널을 포함할 수 있다.
독시사이클린의 투여 후 여러 시간대에서 마이오스타틴 트랜스게닉 마우스로부터 혈청 시료를 분리할 수 있으며 혈청중의 마이오스타틴 트랜스유전자 산물의 수준을 측정할 수 있다. 마우스의 전체 체중을 시간별로 모니터링하여 마우스가 유의적인 체중 감소를 보여주는지를 측정한다. 또한, 개개 근육 및 지방층을 분리하고 중량을 잰다음 근섬유의 수, 크기 및 유형을 선택된 근육 샘플에서 측정한다.
마우스에 투여된 독시사이클린의 용량을 변화시킴으로써 마이오스타틴 트랜스유전자의 발현 수준을 변화시킬 수 있다. 트랜스유전자 발현은 예를 들면 근육내 트랜스유전자 RNA 수준 또는 혈청중 마이오스타틴 단백질 수준의 노던 블롯 분석을 이용하여 모니터링할 수 있다. 특정 수준의 마이오스타틴 발현의 동정은 마이오스타틴에 의해 유도된 소모성 정도의 상관관계를 파악할 수 있다. 또한, 트랜스게닉 라인을 마이오스타틴 녹아웃 마우스와 교배시켜 마이오스타틴의 공급원만이 트랜스유전자로부터 발현된 것인 마우스를 생산할 수 있다. 발생동안의 여러 시간대에서 마이오스타틴의 발현을 검사하고 섬유수, 섬유크기 및 섬유유형에 미치는 마이오스타틴의 효과를 결정할 수 있다. 마이오스타틴의 발현이 정확하고 신속하게 조절될 수 있는 마우스의 이용가능성은 마이오스타틴 시그널 도입 경로를 추가로 특성규명하고 마이오스타틴 시그널 도입을 조절하는데 잠재적으로 유용할 수 있는 여러 제제의 효과를 검사하는 강력한 도구를 제공한다.
마이오스타틴 시그널 도입의 효능인자
골격근에서 특이적으로 발현되는 TGF-β 시그널 도입 경로의 성분을 포함할 수 있는 마이오스타틴 시그널 도입 경로의 우성 음성 형태중 어느 하나를 함유한 트랜스게닉 마우스를 생산할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 액티빈 II형 수용체에 의해 유도된 경로를 통해 시그널 도입을 매개하는 Smad 단백질이 마이오스타틴 시그널 도입에 연루될 수 있다.
Act RIIB는 마이오스타틴과 고도로 연관이 있는 GDF-11(상기 McPherron et al., 1997; 상기 Gamer et al., 1999; Nakashima et al., Mech. Devel. 80:185-189, 1999)와 결합할 수 있고, Smad 2, Smad 3 및 Smad 4와 결합하고 억제할 수 있는 c-ski의 발현은 근육 성장에 상당한 영향을 미친다(상기 Sutrave et al., 1990; 상기 Berk et al., 1997; 상기 Luo et al., 1999; 상기 Stroschein et al.; 상기 Sun et al., 1999a 및 b; 상기 Akiyoshi et al., 1999). 본원에 기술된 바와 같이, 마이오스타틴은 Act RIIB와 특이적으로 상호작용하며, 이로써 생체내에서 액틴 II형 수용체와 결합하고 Smad 시그널링 경로를 활성화시킴으로써 적어도 부분적으로 생물학적 효과를 발휘할 수 있다.
근육 성장을 조절하는데 있어서 Smad 시그널링 경로의 역할은 Act RIIB/Smad 시그널 도입 경로중 특정 시점에서 차단되거나 차단될 수 있는 트랜스게닉 마우스 라인을 사용하여 검사할 수 있다. 근육 크레아틴 키나제 프로모터 또는 마이오신 경쇄 인핸서/프로모터를 사용하여 Smad 시그널 도입 경로의 여러 억제인자의 발현을 구동시킬 수 있다.
이 시스템에 유용한 억제인자는 예를 들면 폴리스타틴; 우성 음성 Act RIIB 수용체; 우성 음성 Smad 폴리펩타이드(예, Smad 3); c-ski; 또는 억제 Smad 폴리펩타이드(예, Smad 7)을 포함할 수 있다. 폴리스타틴은 GDF-11을 포함한 특정 TGF-β 계열 일원과 결합하고 이의 활성을 억제할 수 있다(상기 Gamer et al., 1999). 액티빈 II형 수용체의 우성 음성 형태는 절두형 GDF 수용체를 발현시킴으로써, 예를 들면 세포외 도메인, 특히 Act RIIB 세포외 도메인의 가용성 형태를 발현시키거나, 키나제 도메인이 결손되어 있거나 돌연변이 수용체가 키나제 활성이 결핍되도록 돌연변이된 절두형 Act RIIB 수용체를 발현시킴으로써 얻을 수 있다. Smad 7은 액티빈, TGF-β 및 BMP에 의해 유도된 시그널링 경로를 차단할 수 있는 억제 Smad로서 작용한다. Smad 3의 우성 음성 형태는 예를 들면 Smad 3 C-말단 인산화 부위를 돌연변이시키고, 이로써 Smad 3 기능을 차단함으로써 작제할 수 있다(상기 Liu et al., 1997). c-ski 과발현은 트랜스게닉 마우스에서 근육 비대증과 연관이 있어 왔다(상기 Sutrave et al., 1990).
트랜스게닉 마우스를 제조할 수 있고, 각 창시자 라인을 트랜스유전자의 적절한 근육-특이적 발현에 대해 검사한다. 스크리닝된 마우스는 전체 체중, 개개 근육량 및 근섬유 크기, 수 및 유형에 대해 검사한다. 근육량에 미치는 뚜렷한 효과를 증명하는 라인을 추가로 지방 축적 및 상기된 다른 관련된 대사 변수에 대해 검사할 수 있다. 액티빈 수용체/Smad 시그널 도입 경로중 표적 특이적 단계에서 이들 상이한 물질을 사용하면 상이한 물질에 대한 시그널링 경로가 다른 단계에서 중복하기 때문에 특히 유익하다. 예를 들면, 폴리스타틴은 액티빈 및 GDF-11과 결합하고 이들의 활성을 억제하지만 TGF-β와는 결합하지 않는 반면, 우성 음성 Smad 3은 액티빈과 TGF-β 수용체 둘다를 통해 시그널링을 차단할 수 있다. Smad 7은 또한 BMP 수용체를 통해 시그널링을 차단할 수 있기 때문에, 훨씬 더 다기능성일 수 있다. 이 연구들은 마이오스타틴 활성을 조절하는 특이 표적의 동정을 가능케하며, 이에 따라 마이오스타틴 시그널 도입을 조절하고 이로써 마이오스타틴 활성을 조절하는 약물 또는 기타 제제를 개발하기 위한 여러 전략을 제공한다.
특히, 본원 기술된 트랜스게닉 라인을 사용하여 비만 또는 II형 당뇨병의 발전에 미치는 생후 마이오스타틴 기능의 차단 효과 또는 Smad 시그널링 경로의 차단 효과를 결정할 수 있다. 예를 들면, 억제 트랜스유전자를 ob/ob, db/db 및 Ay 돌연변이 마우스내로 교차시킬 수 있다. 독시사이클린의 부재하에, 억제인자 트랜스유전자는 발현되지 않으며, 이에 따라 마우스는 모 돌연변이 마우스와 식별할 수 없다. 독시사이클린의 존재하에서 억제인자는 발현되고 마이오스타틴 활성을 차단할 수 있다. 이들 돌연변이 마우스에서 대사성 비정상성의 발생에 미치는 마이오스타틴 활성 차단 효과를 검사할 수 있다.
억제인자의 발현을 어린 나이, 예를 들면 3주령에서 유도하여 효과를 최대로 할 수 있다. 또한, 마이오스타틴 활성은 대사성 비정상성이 비가역적일 정도로 심하게 되는 시점에 도달하기 전에 차단할 수 있다. 마우스를 독시사이클린에서 유지하고, 지방 축적 및 당 대사와 연관된 것을 포함한 상기 시험을 이용하여 연령대별로 평가할 수 있다. 하나 이상의 시험 결과가 ob/ob, db/db 및 Ay 돌연변이 마우스에서 비정상적인 나이에서의 어떠한 지연도 동정할 수 있다. 비만 또는 II형 당뇨병의 징후중 일부를 발달시킨 보다 더 나이를 먹은 마우스를 이용하여 비슷한 연구를 수행할 수 있고, 지방 중량 및 당 대사를 포함하여 여러 변수에 미치는 마이오스타틴 활성의 차단 효과를 측정할 수 있다. 이들 연구의 결과는 또한 비만 또는 II형 당뇨병을 예방 또는 치료하고자 하는 노력으로 조절할 수 있는 특정 표적을 동정할 수 있다.
실시예 12
악액증의 유도에 대한 마이오스타틴 효과의 특성규명
이 실시예는 악액증의 발달 및 진행에 마이오스타틴 시그널 도입의 역할을 결정하는 방법을 기술한 것이다.
액티빈 수용체 및 Smad 경로는 정상 개체에서 마이오스타틴 활성을 매개하는데 연루된 시그널 도입 경로의 적어도 일부를 구성할 수 있으며, 이에 따라 마이오스타틴의 과다한 수준으로 인해 개체에서 일어나는 효과를 매개하는데 연루될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 악액증은 예를 들면 비정상적으로 고수준인 마이오스타틴에 의해 적어도 부분적으로 매개될 수 있다. 이러한 경우로서, Smad 경로를 통해 시그널 도입을 조절하는 방법은 일반적으로 근육 소모증, 특히 악액증을 치료하기위한 약물을 개발하는 새로운 기법을 제공할 수 있다.
악액증에서 Smad 시그널링 경로의 역할은 예를 들면 인터루킨-6(IL-6; Black et al., Endocrinology 128:2657-2659, 1991-이 문헌의 내용은 본원에 참고로 원용된다), 종양 괴사 인자-α(TNF-α; Oliff et al., Cell 50:555-563, 1987-이 문헌의 내용은 본원에 참고로 원용된다) 또는 특정 종양 세포에 의해 유도될 수 있는 악액증에 관하여 상기된 여러 트랜스게닉 라인의 민감도를 검사함으로써 검사할 수 있다. IL-6 및 TNF-α의 경우에, 억제인자 트랜스유전자를 누드 마우스 백그라운드로 교배시킬 수 있고, 그다음 이러한 양상으로 과발현될때 누드 마우스에서 소모증을 유도하는 IL-6 또는 TNF-α를 생성하는 CHO 세포로 마우스를 공격할 수 있다. IL-6 또는 TNF-α를 과생산하는 CHO 세포는 마이오스타틴 과생산 세포를 생성하기 위한 상기 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, TNF-α cDNA를 pMSXND 발현 벡터(Lee and Nathans, J. Biol. Chem. 263:3521-3527, 1988)내로 클로닝한 다음, 발현 벡터의 증폭된 복제물을 갖는 세포를 메토트렉세이트의 농도를 증가시키면서 단계별로 스크리닝할 수 있다.
마우스에서 악액증을 유도할 수 있는 Lewis 폐 암종 세포(Matthys et al., Eur. J. Cancer 27:182-187, 1991-이 내용은 본원에 참고로 원용된다) 또는 결장 26 선암종 세포(Tanaka et al., J. Cancer Res. 50:2290-2295, 1990-이 내용은 본원에 참고로 원용된다)와 같은 종양 세포를 또한 이들 연구에 이용할 수 있다. 이들 세포주는 마우스에서 종양으로 성장될때 심각한 소모증을 일으킨다. 따라서, 이들 종양의 효과를 본원에 기술된 여러 돌연변이 마우스에서 검사할 수 있다. 여러 종양 세포는 단지 특정 유전적 백그라운드에서만 성장하는 것으로 이해되고 있다. 예를 들면, Lewis 폐 암종 세포는 C57 BL/6 마우스에서 통상적으로 성장하고, 결장 26 암종 세포는 통상 BALB/c 마우스에서 성장한다. 따라서, 트랜스유전자를 이들 또는 다른 유전적 백그라운드내로 역교배시켜 종양 세포의 성장을 가능케할 수 있다.
전체 체중, 개별 근육량, 근섬유 크기 및 수, 사료 섭취 및 혈청 변수(당 수준 포함)를 포함한 여러 변수를 모니터링할 수 있다. 또한, 근육에서 혈청 마이오스타틴 수준 및 마이오스타틴 RNA 수준을 검사하여 마이오스타틴 발현의 중가가 악액증과 상호연관이 있음을 확인할 수 있다. 이들 연구의 결과들은 마이오스타틴의 작용이 이들 실험 모델에서 악액증-유도 제제의 하류 성분임을 입증할 수 있다. 또한, 이들 결과는 Smad 시그널링 경로가 이들 모델에서 악액증의 발전에 필수적임을 확인할 수 있고 Smad 시그널링을 조절함으로써 악액증의 치료에 치료 효과를 얻을 수 있음을 증명할 수 있다.
실시예 13
성장 분화 인자-8( GDF -8) 및 GDF -11 수용체의 동정 및 특성규명
이 실시예는 GDF-8(마이오스타틴) 및 GDF-11에 대한 세포 표면 수용체를 동정하고 특성규명하는 방법을 기술한 것이다.
정제된 GDF-8 및 GDF-11 단백질은 생물학적 활성을 분석하는데 주로 사용될 것이다. GDF-8 및 GDF-11 작용에 대한 잠재적 표적 세포를 동정하기 위해 이들의 수용체를 발현하는 세포를 조사할 것이다. 이 목적을 위해, 정제된 단백질은 클로르아민 T 방법을 이용하여 방사성-요오드화될 것이다. 이 방법은 수용체 결합 연구를 위해 TGF-β(상기 Cheifetz et al., 1987), 액티빈(Sugino et al., J. Biol. Chem. 263:15249-15252, 1988) 및 BMP(Paralkar et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88:3397-3401, 1991)과 같은 이 상위계열의 다른 일원을 라벨화하는데 성공적으로 사용되었다. GDF-8 및 GDF-11의 프로세싱된 성숙 형태 각각은 다수 티로신 잔기를 함유한다. 두가지 다른 방법을 사용하여 이들 단백질에 대한 수용체를 동정할 것이다.
한 가지 방법은 수용체의 수, 친화성 및 분포를 결정할 것이다. 배양물에서 성장한 전체 세포, 배 또는 성체 조직의 동결 표본 또는, 조직 또는 배양 세포로부터 제조된 전체 막 분획을 라벨화된 단백질과 배양하고, 결합된 단백질의 양 또는 분포를 결정할 것이다. 세포주 또는 막과 연관된 실험의 경우, 수회 세척후 접시상의 세포에 결합된 방사성 양을 측정하거나, 막의 경우에 원심분리 후 막과 함께 침전되거나 필터상에 막과 함께 보유된 방사성의 양을 측정함으로써 결합 양을 결정할 것이다. 세포의 수가 더욱 한정적일 수 있는 일차 배양물과 연관된 실험의 경우, 결합 부위는 사진유제와 중첩시켜 직접적으로 가시화할 것이다. 동결 표본과 연루된 실험의 경우, 이들 표본을 고해상 베타-맥스 하이퍼필름에 노출시킴으로써 리간드 결합 부위를 가시화할 것이다; 만일 부위를 좀더를 세밀히 보고자 하는 경우, 표본을 사진유제에 침지시킬 수 있다. 이들 모든 실험의 경우, 과량의 비표지된 단백질을 경쟁자로서 첨가하여 특정 결합을 결정할 것이다(참조예: 상기 Lee and Nathans, 1988).
두번째 방법은 수용체를 생화학적으로 특성규명할 것이다. 막 제제 또는 배양물에서 성장한 잠재적 표적 세포를 라벨화된 리간드와 배양할 것이며, 수용체/리간드 복합체는 디숙신이미딜 수베레이트를 사용하여 공유적으로 가교시킬 것이다. 이 물질은 TGF-β 상위계열의 일원을 포함한 여러 리간드에 대한 수용체를 동정하는데 통상 사용되는 것이다(Massague and Like, J. Biol. Chem. 260:2636-2645, 1985). 가교된 복합체는 SDS 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동하여 과량의 비표지된 단백질의 부재하에서는 라벨화되지만, 이의 부재하에서는 라벨화되지 않는 밴드를 검출함으로써 분리한다. 추정 수용체의 분자량은 리간드의 분자량을 공제함으로써 산출할 것이다. 이들 실험이 다루는 중요한 문제는 GDF-8 및 GDF-11이 TGF-β 상위계열의 많은 다른 일원과 같은 I형 및 II형 수용체를 통해 시그널을 도입하는가 하는 것이다(상기 Massague and Weis-Garcia, 1996).
일단 이들 분자에 대한 수용체를 검출하는 방법이 완료되면, 보다 상세한 분석을 실시하여 결합 친화성 및 특이성을 결정할 것이다. Scatchard 분석을 사용하여 결합 부위 수 및 해리 상수를 결정할 것이다. GDF-8과 GDF-11 사이에 교차 경쟁(cross-competition) 분석을 실시함으로써 이들이 동일한 수용체에 결합할 수 있는지의 문제와 이들의 상대적 친화성을 측정할 수 있을 것이다. 이들 연구는 이들 분자들이 동일하거나 상이한 수용체를 통해 시그널을 전달하는지에 관하여 정보를 제공할 것이다. 다른 TGF-β 계열 일원을 사용한 경쟁 실험을 실시하여 특이성을 결정할 것이다. 이들 리간드중 일부는 시판되고 있으며, 다른 일부는 Genetics Institute, Inc.로부터 입수할 수 있다.
이들 실험을 위해 여러 배 및 성숙 조직 및 세포주를 시험할 것이다. 골격근에서 GDF-8의 특정 발현 및 GDF-8 녹아웃 마우스의 표현형을 기초로 하여, 초기 연구는 막을 제조하기 위해서 및 동결 표본을 이용한 수용체 연구를 위해서 배 및 성숙 근조직에 집중한다. 또한, 근육모세포를 분리하고 임신 후 여러 일에서 배로부터 분리하고 배양하거나 위성 세포(satelite cell)를 문헌[Vivarelli and Cossu, Devel. Biol. 117:319-325, 1986; Cossu et al., Cell Diff. 9:357-368, 1980]에 기술된 바와 같이 성숙 근육으로부터 분리하고 배양할 것이다. 배양 후 여러 일이 경과하여 이들 일차 세포에 대한 결합 연구를 실시하고, 결합 부위가 근육 마이오신(Vivarelli et al., J. Cell Biol. 107:2191-2197, 1988)과 같은 여러 근성 마커와 공동-국소화시킬 수 있고, 다핵 근관의 형성과 같은 세포의 분화 상태와 결합을 상호연관시킬 수 있도록 방사선 자동사진으로 위치를 정할 수 있다. 일차 세포를 사용하는 것외에, 세포주를 이용하여 수용체를 검출할 것이다. 특히, 초기 촛점은 세종류의 세포주, C2C12, L6 및 P19에 맞춰질 것이다. C2C12 및 L6 근육모세포는 배양물에서 자발적으로 분화하고 특정 성장 상태에 따라 근관을 형성한다(상기 Yaffe and Saxel, 1977; 상기 Yaffe, 1968). P19 배 암종 세포를 유도하여 DMSO(Rudnicki and McBurney, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A practical approach (E.J. Robertson, IRL Press, Cambridge 1987)의 존재하에 골격근 세포를 포함한 여러 세포유형으로 분화시킬 수 있다. 이들 세포주에 대하여 여러 성장 조건하에 및 여러 분화 단계에서 수용체 결합 연구를 실시할 것이다. 비록 초기 연구가 근육 세포에 초점을 맞출 것이지만, 다른 조직 및 세포 유형들은 GDF-8 및 GDF-11 수용체의 존재에 대해 검사될 것이다.
이들 결합 연구에 재조합 인간 GDF-8(rhGDF-8) 단독이량체를 사용할 것이다. CHO 세포를 이용하여 RhGDF-8을 발현시키고 약 90% 순도로 정제하였다. rhGDF-8은 25 kDa 내지 27 kDa의 예상된 분자량을 가졌으며, 환원시 12 kDa 단량체로 감소었다. 수용체-리간드 결합 분석법에서 I-125 표지된 GDF-8을 사용하였을 경우, 두 근육모세포주 L6 및 G-8은 GDF-8과 결합하였다. 라벨화되지 않은 GDF-8이 라벨화된 리간드의 결합과 효과적으로 경쟁하였기 때문에, 결합은 특이적이었다. 해리 상수(Kd)는 370 pM이었고, L6 근육모세포는 상당히 많은(5000개 수용체/세포) 세포 표면 결합 단백질을 갖는다. GDF-11(BMP-11)은 GDF-8과 매우 상동적이다(>90%). 수용체 결합 연구 결과 GDF-8과 GDF-11이 L6 근육모세포상의 동일한 결합 단백질과 결합한 것으로 나타났다. GDF-8이 공지된 TGF-β 수용체와 결합하는지 여부를 확인하는 것은 중요하다. TGF-β는 GDF-8의 결합과 경쟁하지 않았으며, 이것은 GDF-8 수용체가 TGF-β 수용체와 구별된다는 것을 시사한다. GDF-8 수용체는 GDF-8과 결합하지 않는 4가지 근육모세포 세포주 C2C12, G7, MLB13MYC c14 및 BC3H1을 포함한 모든 근육모 세포주에서 발현되지 않았다.
GDF-8 및 GDF-11에 대한 수용체를 암호하는 유전자 또는 유전자들을 얻을 수 있다. GDF-8 및 GDF-11이 생물학적 효과를 발휘하는 기전을 이해하고자 하는 첫번째 단계로서, 그들의 수용체를 암호하는 유전자를 클로닝하는 것은 중요하다. 상기 실험으로부터, GDF-8 및 GDF-11이 동일한 수용체 또는 상이한 수용체와 결합하는지 여부가 더욱 명백할 것이다. 또한, 이들 수용체의 조직 및 세포 유형 분포에 관한 상당한 정보가 있을 것이다. 이 정보를 이용하여, 두가지 상이한 방법을 취하여 수용체 유전자를 클로닝할 것이다.
첫번째 방법은 발현 클로닝 전략을 사용하는 것이다. 사실, 이것은 제1 액티빈 및 TGF-β수용체를 클로닝하기 위해 Mathews 및 Vale(Cell 65:973-982, 1991) 및 Lin 등(Cell 68:775-785, 1992)에 의해 최초로 사용된 전략이다. 최고 상대치의 고친화성 결합 부위를 발현하는 조직 또는 세포 유형으로부터 유래한 폴리 A-선택된 RNA를 수득할 것이며, CMV 프로모터 및 SV40 복제 기점을 함유한 포유동물 발현 벡터 pcDNA-1에서 cDNA 라이브러리를 제조하는데 사용할 것이다. 라이브러리를 플레이팅하고, 각 플레이트로부터의 세포를 브로쓰에 모은후 동결시킨다. DNA의 제조를 위해 풀로부터 얻은 분취물을 성장시킨다. 각각의 풀을 챔버 슬라이드에서 COS 세포내로 일시적으로 형질감염시키고, 형질감염 세포를 요오드화된 GDF-8 또는 GDF-11과 배양한다. 비결합된 단백질을 세척한 후, 리간드 결합의 부위를 방사선 자동 사진으로 가시화할 것이다. 일단 양성 풀이 동정되면, 이 풀로부터 얻은 세포를 보다 낮은 밀도로 재플레이팅하고, 이 과정을 반복한다. 그런 다음, 양성 풀을 플레이팅하고 개개 콜로니를 그리드로 옮겨서 문헌[Wong et al., Science 228:810-815, 1985]에 기술된 바와 같이 재분석할 것이다.
처음에 1500개 콜로니의 풀 크기를 이용하여 스크리닝할 것이다. 이 복합 혼합물에서 양성 클론을 확실히 동정하기 위해, TGF-β 및 클로닝된 II형 수용체를 이용한 대조 실험을 수행한다. TGF-β II형 수용체의 암호 서열을 pcDNA-1 벡터내로 클로닝하고 이 작제물로 형질전환된 박테리아를 본 발명의 라이브러리로부터 얻은 박테리아와 1:1500을 포함한 여러 비율로 혼합한다. 이어서, 이 혼합물로부터 제조된 DNA를 COS 세포내로 형질감염시키고, 요도드화된 TGF-β와 배양하며, 방사선 자동 사진으로 가시화한다. 1:1500의 비율에서 양성 시그널이 관찰되면, 1500개 클론의 풀을 스크리닝한다. 다른 한편으로, 대조 실험에서는 양성 시그널을 동정하기에 충분하게 민감한 방법에서의 비율에 상응하는 보다 작은 풀 크기를 사용한다.
또한, 동정된 TGF-β 상위계열의 일원에 대한 대부분의 수용체가 막-경유 세린/트레오닌 키나제 계열에 속한다는 사실(상기 Massague and Wies-Garcia, 1996)을 이용하여, GDF-8 및 GDF-11 수용체를 클로닝하기 위한 두번째 전략을 사용할 것이다. 이들 수용체의 세포질 도메인들은 서열에서 관련이 있기 때문에, 축퇴 PCR 프로브를 사용하여 GDF-8 및 GDF-11에 대한 결합 부위를 포함하는 조직에서 발현되는 이 수용체 계열의 일원을 클로닝하는데 사용할 것이다. 사실, 이것은 이 수용체 계열의 일원중 대부분을 동정하는데 사용된 방법이다. 일반적인 전략은 공지된 수용체의 보존된 영역에 상응하는 축퇴성 프라이머를 디자인하여 이들 프라이머를 적당한 RNA 샘플(대부분 골격근으로부터 얻음)로부터 제조된 cDNA에 대한 PCR을 위해 사용하여 PCR 산물을 서브클로닝하고 마지막으로 개개 서브클론을 서열분석한다. 서열이 동정됨에 따라, 이들을 하이브리드화 프로브으로 사용하여 추가적인 분석으로부터의 이중 클론을 제거한다. 그런 다음 동정된 수용체를 정제된 GDF-8 및 GDF-11과 결합하는 이의 능력에 대해 시험한다. 이 스크리닝은 단지 작은 PCR 산물만을 제공하기 때문에, 적당한 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 각 수용체에 대해 전장 cDNA 클론을 수득하고, 이를 pcDNA-1 벡터내로 삽입하며, COS 세포내로 형질감염시키고, 형질감염된 세포를 이것이 요오드화된 GDF-8 또는 GDF-11과 결합하는 능력에 대해 분석법한다. 이상적으로는, 이 스크리닝에서 동정되는 모든 수용체는 이들 리간드와 결합하는 능력에 대해 시험될 것이다. 그러나, 동정되는 수용체의 수가 많을 수 있으며, 전장 cDNA 모두를 분리하고 이들을 시험하는 것은 상당한 노력을 필요로 할 수 있다. 동정되는 수용체중 일부는 공지된 수용체에 상응할 것이며, 이들 경우에서, 다른 연구진으로부터 전장 cDNA 클론을 얻거나 암호 서열을 공지된 서열을 기초로 PCR에 의해 증폭하는 것이 간편할 수 있다. 신규한 서열의 경우, 노던 블롯 분석에 의해 조직 분포를 결정하고 발현 양상이 상기 결정된 GDF-8 및/또는 GDF-11 결합 부위의 분포와 가장 많이 닮은 수용체에게 최고의 우선권을 부여한다.
특히, 이들 수용체는 두 부류 즉, I형 및 II형에 속하는 것으로 알려져 있으며, 이들 두 부류는 서열을 기초로 구분될 수 있고 둘다 완전한 활성을 위해 필요하다. 어떤 리간드는 II형 수용체의 부재하에 I형 수용체와 결합할 수 없는 한편, 또 다른 리간드는 양쪽 수용체 유형과 결합할 수 있다(상기 Massague and Weis-Garcia, 1996). 상기 요약된 가교 실험은 양쪽 I형 및 II형 수용체가 또한 GDF-8 및 GDF-11의 시그널링에 연루되어 있는지에 관한 약간의 정보를 제공해야 한다. 그렇다면, GDF-8 및 GDF-11이 이들의 시그널을 전파하는 방법을 충분히 이해하기 위해 그들 수용체 하위 유형 모두를 클로닝하는 것이 중요하다. I형 수용체가 II형 수용체의 부재하에 GDF-8 및 GDF-11과 상호작용할 수 있는지에 관하여 예측할 수 없기때문에, II형 수용체가 먼저 클로닝될 것이다. 단지 적어도 하나의 II형 수용체가 이들 리간드에 대해 동정된 후만이, GDF-8 및 GDF-11에 대한 I형 수용체를 동정하는 시도를 할 것이다. 일반적인 전략은 PCR 스크리닝에서 동정되는 I형 수용체의 각각과 함께 II형 수용체를 동시형질감염시킨다음, 가교에 의해 형질감염된 세포를 분석하는 것이다. I형 수용체가 GDF-8 또는 GDF-11에 대한 수용체 복합체의 일부인 경우, 두 가교된 수용체 종(하나는 I형 수용체에 상응하는 것이고 다른 하나는 II형 수용체에 상응하는 것이다)은 형질감염된 세포에서 검출되어야 한다.
GDF-8 및 GDF-11 수용체의 조사는 TGF-β 상위계열중 적어도 한개의 일원, 즉 GDFN가 GPI-결합된 성분(GDNFR-알파) 및 수용체 티로신 키나제(c-ret; Trupp et al., Nature 381:785-789, 1996; Durbec et al., Nature 381:789-793, 1996; Treanor et al., Nature 382:80-83, 1996; Jing et al., Cell 85:1113-1124, 1996)을 포함한 수용체 복합체의 완전히 상이한 유형을 통해 시그널링을 할 수 있다는 사실로 인하여 복잡하다. 비록 GDNF가 TGF-β 상위계열의 가장 멀리-연관된 일원일지라도, 다른 TGF-β 계열 일원이 또한 유사한 수용체 시스템을 통해 시그널을 전달할 수 있음이 확실히 가능하다. 만일 GDF-8 및 GDF-11이 유사한 수용체 복합체를 통해 시그널링하는 경우, 발현 스크리닝 방법은 이 복합체의 적어도 GPI-결합된 성분(사실, GDNFR-알파는 발현 스크리닝 방법을 이용하여 동정되었다)을 동정할 수 있어야 한다. GDNF의 경우에, GDNF- 및 c-ret-결손 마우스에서의 표현형이 유사함은 c-ret가 GDNF에 대한 잠재적인 수용체인 것을 시사한다.
실시예 14
GDF -11 녹아웃 마우스의 제조 및 특성규명
GDF-11 녹아웃 마우스의 표현형은 몇가지 관점에서 액티빈 IIB형 수용체(Act RIIB)를 포함한 TGF-β 상위계열의 일부 일원에 대한 수용체의 결실을 포함한 마우스의 표현형과 유사하다. GDF-11의 생물학적 기능을 결정하기 위해, GDF-11 유전자를 배아줄기세포에서 동종 표적화에 의해 붕괴시켰다.
Stratagene(La Jolla, CA)에 의해 제공된 지침에 따라 람다 FIXII에서 쥐 129 SvJ 게놈 라이브러리를 제조하였다. GDF-11 유전자의 구조를 라이브러리로부터 분리된 파이지 클론의 제한효소 맵핑 및 부분적인 서열결정으로부터 유추하였다. 표적 작제물을 제조하기 위한 벡터는 Philip Soriano 및 Kirk Thomas에 의해 제공되었다. 생성된 마우스가 GDF-11 기능에 대해 효력이 없음을 확인하기 위해, 완전한 성숙 C-말단 영역을 결실시키고 neo 카세트로 치환하였다. R1 ES 세포를 표적 작제물로 형질감염시키고, 간시클로비르(2 μM) 및 G418(250 ㎍/ml)로 스크리닝하여 서던 블롯 분석으로 분석하였다.
GDF-11 유전자의 동종 표적화가 8/155 간시클로비르/G418 이중 내성 ES 세포 클론에서 관찰되었다. C57BL/6J 포배기 배아내로 수가지 표적화된 클론을 주입한 후, C57BL/6J 및 129/SvJ 암컷 모두에 교잡되었을 때 이형접합 새끼를 생산한 한개의 ES 클론으로부터 키메라를 얻었다. C57BL/6J/129/SvJ 하이브리드 F1 이형접합체의 교잡은 49 마리 야생형(34%), 94 마리 이형접합체(66%)를 생산했고, 동형접합 돌연변이 성숙 후손은 생산하지 못했다. 유사하게, 129/SvJ 백그라운드에서 성숙 비동형접합 동물은 관찰되지 않았다(32 마리 야생형(36%) 및 56 마리 이형접합 돌연변이 (64%) 동물).
동형접합 돌연변이체가 사망한 나이를 측정하기 위해, 이형접합 수컷과 교미한 이형접합 암컷으로부터 여러 재태기에서 분리된 배아를 유전자분석하였다. 검사된 모든 배아 단계에서, 동형접합 돌연변이 배아는 대략 25%의 예상된 빈도로 존재하였다. 하이브리드 신생 마우스가운데, 상이한 유전형이 또한 1:2:1(34+/+(28%), 61+/-(50%) 및 28-/-(23%))의 예상된 멘델 비율로 표본이 되었다. 동형접합 돌연변이 마우스는 살아서 태어났으며 호흡하고 양육할 수 있었다. 그러나, 모든 동형접합 돌연변이체는 출생 후 처음 24시간내에 사망하였다. 정확한 사망 원인은 밝혀지지 않았으나, 치사율은 동형접합 돌연변이체의 신장이 심한 저형성부전이거나 완전히 없는 사실과 관련이 있을 수 있다.
동형접합 돌연변이 동물은 이들의 심하게 짧아진 꼬리 또는 소실된 꼬리에 의해 쉽게 인식가능하다. 이들 동형접합 돌연변이 동물에서 꼬리 결함을 추가로 특성규명하기 위해, 이들의 골격을 검사하여 꼬리 척추뼈의 붕괴 정도를 측정하였다. 그러나, 후기 배아 및 신생 마우스의 야생형 및 돌연변이 골격 표본을 비교한 결과 마우스의 꼬리 영역뿐만 아니라 많은 다른 영역에서 차이가 드러났다. 차이가 주목된 거의 모든 경우에서, 특정 절편이 보다 전방에 있는 절편의 전형적인 형태를 갖는 것으로 보이는 척추 절편의 호메오 변형에 있어서 비정상성을 나타냈다. 이들 변형은 경부 영역으로부터 꼬리 영역의 축방향 골격 전체에서 명료하였다. 축방향 골격에서 관찰된 결함을 제외하고, 두개골 및 사지 뼈와 같은 나머지 골격은 정상으로 나타났다.
돌연변이 신생 동물에서 척추의 전방향 변형은 흉부에서 가장 명백한 반면, 흉부(T) 절편의 수는 급격히 증가하였다. 검사된 모든 야생형 마우스는 13개의 흉부 척추뼈와 각각이 연결된 한쌍의 늑골로된 전형적인 패턴을 보였다. 대조적으로, 동형접합 돌연변이 마우스는 흉부 척추의 수에서 현저한 증가를 보였다. 검사된 모든 동형접합 돌연변이체는 총 17 내지 18개에서 4 내지 5개 여분의 늑골쌍을 지녔다. 그러나, 이들 동물의 1/3은 18번째 늑골이 퇴화한 듯이 나타났다. 그러므로, 요추(L) 절편 L1 내지 L4 또는 L5에 보통 상응하는 절편은 돌연변이 동물에서 흉부 절편으로 변형된 것으로 나타났다.
게다가, 한개의 흉부 척추가 다른 흉부 척추의 형태적 특징을 갖는, 흉부 영역내에서의 변형이 또한 분명하였다. 예를 들면, 야생형 마우스에서, 첫번째 7쌍의 늑골은 흉골에 연결되어 있으며, 나머지 6개는 연결되지 않거나 자유로운 상태로 있다. 동형접합 돌연변이체에서, 연결된 늑골쌍은 10-11개로, 자유로운 늑골쌍은 7-8개로 증가하였다. 따라서, 야생형 동물에서 모두 유리된 늑골을 갖는 흉부 절편 T8, T9, T10 및 일부 경우 T11이 돌연변이 동물에서 변형되어 보다 더 전방에 있는 흉부 절편의 전형적인 특징을 나타냈는데, 즉 늑골리 흉골에 연결되었다. 이러한 발견과 일치하는 것으로, 야생형 동물 T10에서 정상적으로 발견되는 변환 극돌기 및 변환 관절돌기가 동형접합 돌연변이체의 T13에서 발견되었다. 흉부내 추가적인 변형이 또한 다른 돌연변이 동물에서 주목되었다. 예를 들면, 야생형 마우스에서, T1으로부터 유래된 늑골은 흉골의 정상과 접촉한다. 그러나, 검사된 2/23 하이브리드 및 2/3 129/SvJ 동형접합 돌연변이 마우스에서 T2는 T1의 것과 유사한 형태를 갖도록 변형된 듯이 나타났다. 즉, 이들 동물에서, T2로부터 유래된 늑골은 연장되어 융골의 상부와 접촉된다. 이들 경우에서, T1으로부터 유래된 늑골은 제2 늑골쌍과 융합되어 있는 듯하였다. 마지막으로, 동형접합 돌연변이체중 82%는, T2에 정상적으로 존재하는 긴 극돌기가 T3의 위치로 이동하였다. 임의의 다른 동형접합 돌연변이에서, 한 쌍의 척추흉골 늑골의 비대칭 융합은 다른 흉골 수준으로 관찰되었다.
전방 변형은 흉골부에 한정되지 않았다. 우리가 관찰한 대부분의 전방 변형은 6번째 경부 척추(C6)의 수준에 있었다. 야생형 마우스에서, C6는 복부측면상의 두개의 전방 결절의 존재에 의해 용이하게 동정될 수 있다. 몇가지 동형접합 돌연변이 마우스에서, 비록 이들 두 전방 결절중 하나가 C6에 존재하였을 지라도, 다른 하나는 C7의 위치에 존재하였다. 그러므로, 이들 마우스에서, C7은 C6의 것과 닮은 형태를 갖도록 부분적으로 변형된 듯하였다. 한개의 다른 동형접합 돌연변이는 C7에 2개의 전방 결절을 지녔으나, 부분적인 C6 내지 C5 변형을 제외한 완전한 C7 내지 C6 변형 위해 C6에 한개를 유지하였다.
축방향 골격의 변형은 또한 요추부로 확대되었다. 야생형 동물이 정상적으로 단지 6개의 요추 척추를 지니고 있는 반면, 동형접합 돌연변이체는 8 내지 9개를 지녔다. 상기된 데이터가 4 내지 5개의 요추 절편이 흉부 절편으로 변형되었음을 제시하고 있기때문에, 돌연변이체에서 요추 척추중 적어도 6개는 정상적으로 천골 및 꼬리 척추를 발생하는 절편으로부터 유래되었어야 한다. 따라서, 동형접합 돌연변이 마우스는 야생형 마우스에 정상적으로 존재하는 26개의 천골앞 척추에 비하여 총 33-34개의 천골앞 척추를 지녔다. 가장 공통적인 천골앞 척추 패턴은 돌연변이 마우스의 경우 C7/T18/L8 및 C7/T18/L9인 반면, 야생형 마우스의 경우 C7/T13/L6이었다. 돌연변이 동물에서 추가적인 천골앞 척추의 존재는, 앞다리에 대하여 뒷다리의 위치가 7 내지 8개 절편에 의해 후미로 자리가 바뀌어졌음에 따라 골격을 면밀히 관찰하지 않고도 명백했다.
비록 천골 및 꼬리 뼈가 또한 동형접합 돌연변이 마우스에서 영향을 받았을 지라도, 각 형질전환의 완전한 특성을 용이하게 동정할 수는 없었다. 야생형 마우스에서, 천골 절편 S1 및 S2는 S3 및 S4에 비하여 전형적으로 넓은 횡돌기를 갖는다. 돌연변이체에서, S1 또는 S2 뼈는 식별할 수 없었다. 대신, 돌연변이 동물은 S3과 유사한 형태를 갖는 것으로 보인 수개의 뼈를 가졌다. 또한, 모든 4개 천골뼈의 횡돌기는 비록 신생동물에서 처음 3개 뼈의 융합물만이 보통 관찰될지라도 서로 정상적으로 융합된다. 그러나, 동형접합 돌연변이체에서, 천골뼈의 횡돌기는 보통 융합되지 않았다. 꼬리 최근접 영역에서, 모든 돌연변이 동물은 또한 연골의 광범위한 융합과 함께 심히 기형된 뼈를 지녔다. 비록 융합의 중증으로 인해 꼬리 영역의 총 골수를 셀 수 없을 지라도, 몇몇 동물에서는 15개까지의 횡돌기가 계수되었다. 돌연변이에서 이들이 천골 및 꼬리 뼈를 대표하는지를 결정할 수 없었는데 그 이유는 야생형 신생 동물에서 조차 꼬리뼈로부터 S4를 구별하기 위한 형태적 기준이 설정될 수 없었기 때문이다. 이들의 동일성과 상관없이, 이 영역의 뼈의 총수는 약 30개의 정상적인 수로부터 상당히 감소되었다. 그러므로, 비록 돌연변이가 야생형 마우스보다 상당히 더 많은 흉추골과 요추골을 지녔을 지라도, 돌연변이체의 절편의 총수는 꼬리의 절단으로 인해 감소되었다.
이형접합 마우스는 비록 표현형이 이형접합 마우스보다 훨씬 더 정상적이었을 지라도, 축방향 골격은 비정상이었다. 이형접합 마우스에서 가장 뚜렷한 비정상성은 결합된 늑골쌍과 추가의 흉추 절편의 존재였다. 이러한 변형은 검사된 모든 이형접합 동물에 존재하였으며, 모든 경우에서 추가의 늑골쌍은 흉골에 연결되었다. 그러므로, 결합된 늑골이 정상적으로는 흉골에 접하고 있지 않은 T8은, 보다 전방의 흉추골의 특징적인 형태로 변형된 것으로 나타났으며, L1은 후방의 흉추골의 특징적인 형태로 변형된 것으로 보였다. 전방 변형을 나타내는 다른 비정상성도 또한 이형접합 마우스에서 다양한 정도로 관찰되었다. 이들은 T2의 특징인 긴 극돌기를 T3으로의 한개의 절편에 의한 변환, T10으로부터 T11의 관절돌기 및 극돌기의 변환, C6상의 전방 결절의 C7로의 변환 및 T2와 연결된 늑골이 흉골의 상부에 접하고 있는 T2의 T1로 변형을 포함하였다.
GDF-11 돌연변이 마우스에서 관찰된 축방향 패턴에서의 비정상성의 원인을 이해하기 위해, 여러 발생 단계에서 분리된 돌연변이 배를 검사하고 야생형 배와 비교하였다. 전체 형태적 검사에 의해, 임신 9.5일 이하로 경과된 분리 동형접합 돌연변이 배는 상응하는 야생형 배와 용이하게 구별되지 않았다. 특히, 주어진 모든 발생 단계에 존재하는 체절의 수는 돌연변이 배아와 야생형 배아 사이에 동일하였으며, 이것은 체절 형성율이 돌연변이체에서 변이되지 않았음을 시사한다. 10.5-11.5일째 p.c.까지, 돌연변이 배는 7-8개 체절에 의한 뒷다리의 후방 치환에 의해 야생형 배와 쉽게 구별될 수 있었다. 꼬리 발생에서의 비정상성은 또한 이 단계에서 용이하게 명백하였다. 이들 데이터를 종합해 볼때 돌연변이 골격에서 관찰된 비정상성이 예를 들면 증가된 체결형성율에 의해 추가적인 절편의 삽입보다 절편의 진정한 변형을 나타낸다는 것을 알 수 있다.
호메오박스 함유 유전자의 발현에서의 변이는 초파리 및 척추동물에서의 변형을 일으키는 것으로 알려져 있다. Hox 유전자(척추동물 호메오박스 함유 유전자)의 발현 패턴이 GDF-11 무효 돌연변이에서 변이되었는지를 알아보기 위해, 3개의 대표적인 Hox 유전자(Hoxc-6, Hoxc-8 및 Hoxc-11)의 발현 패턴을 호울 마운트 동일계 하이브리드화에 의해 12.5일째 p.c. 야생형, 이형접합 및 동형접합 돌연변이 배에서 결정하였다. 야생형 배에서 Hoxc-6의 발현 패턴은 흉추 절편 T1-T8에 상응하는 프리척추 8 내지 15에 걸쳐있었다. 그러나, 동형접합 돌연변이체에서, Hoxc-6 발현 패턴은 후방으로 이동하였고 전척추 9-18(T2-T11)로 확장하였다. 유사한 이동이 Hoxc-8 프로브으로 관찰되었다. 야생형 배에서, HOxc-8이 전척추 13-18(T6-T11)에서 발현되었으나, 동형접합 돌연변이 배에서 Hoxc-8은 전척추 14-22(T7-T15)에서 발현되었다. 마지막으로, Hoxc-11 발현이 또한 돌연변이 배에서 발현의 전방 범위가 전척추 28 tin 야생형 배로부터 전척추 36으로 변했다는 관점에서 후방으로 이동하였다. (주지: 뒷다리의 위치가 돌연변이 배에서 후방으로 이동하기 때문에, 야생형 및 돌연변이에서 Hoxc-11 발현 패턴이 뒷다리리와 관련하여 유사하였다). 이들 데이터는 돌연변이 동물에서 관찰된 골격 비정상성이 호메오 형질전환을 대표하는 추가의 증거를 제공한다.
GDF-11 마우스의 표현형은 GDF-11이 배발생 초기에 축방향 패턴화의 전체 조절인자로 작용한다는 것을 제시하였다. GDF-11이 이의 효과를 발휘하는 기전을 검사하기 위해, 초기 마우스 배아에서 GDF-11의 발현 패턴을 호울 마운트 동일계 하이브리드화로 검사하였다. 이들 단계에서, GDF-11 발현의 일차 위치는 중배엽 세포가 발생하는 것으로 알려진 위치와 정확하게 관련이 있었다. GDF-11의 발현은 진입 세포가 발생하는 배아의 중배엽을 형성하는 위치인 원시선 영역에서 8.25-8.5일째 p.c.(8-10개 체절)에 처음으로 검출되었다. 발현은 원시선에서 8.75일째에 유지되었으나, 꼬리 돌기가 새로운 중배엽 세포의 근원으로서 원시선을 대체하는 9.5일째 p.c.까지 GDF-11의 발현이 꼬리 돌기로 이동하였다. 그러므로, 이들 초기 단계에서, GDF-11은 새로운 중배엽 세포가 발생하고 추정상 그들의 위치를 획득하는 발생 배아의 영역에서 합성되는 듯하다.
몇가지 관점에서 GDF-11 녹아웃 마우스의 표현형은 TGF-β 상위계열의 일부 일원에 대한 수용체, 즉 액티빈 IIB형 수용체(Act RIIB)의 결실을 갖는 마우스의 표현형과 닮았다. GDF-11 녹아웃 마우스의 경우에서 처럼, Act RIIB 녹아웃 마우스는 여분의 늑골쌍과 형성부전 신장으로부터 신장의 완전한 부재에 이르는 신장 결함의 스펙트럼을 갖는다. 이들 마우스의 표현형 유사성은 Act RIIB가 GDF-11에 대한 수용체일 수 있다는 가능성을 제기한다. 그러나, Act RIIB가 GDF-11에 대한 유일한 수용체일 수 없는데 그 이유는 GDF-11 녹아웃 마우스의 표현형이 Act RIIB 마우스의 표현형보다 더 심하기 때문이다. 예를 들면, GDF-11 녹아웃 동물이 4-5개 여분의 늑골쌍을 갖고 있으며 축방향 골격 전체에 호메오 변형을 보여주는 반면, Act RIIB 녹아웃 동물은 단지 3개 여분의 늑골쌍을 갖고 있고 다른 축 수준에서 형질전환을 보이지 않는다. 또한, 이 데이터는 GDF-11 녹아웃 마우스의 신장 결함이 Act RIIB 녹아웃 마우스의 것보다 더 심하다는 것을 나타낸다. Act RIIB 녹아웃 마우스는 우리가 지금까지 GDF-11 녹아웃 마우스에서 관찰하지 못했던 폐 이성(lung isomerism) 및 심장 결함과 같은 좌/우축 형성에서의 결함을 보여준다. Act RIIB는 액티빈 및 특정 BMP와 결합할 수 있다. 한편, 이들 리간드에 대해 생산된 녹아웃 마우스는 어떠한 것도 좌/우축 형성에서의 결함을 보이지 않는다.
만일 GDF-11이 중배엽 세포에서 직접 작용하여 위치 실체를 설정한다면, 여기에 제시된 데이터는 GDF-11 작용에 대한 짧은 범위 또는 형태형성인자 모델과 일치할 것이다. 즉, GDF-11은 중배엽 전구체에 작용하여 이들 세포가 GDF-11 발현 부위에서 생성됨에 따라 Hox 유전자 발현의 패턴을 설정할 수 있거나, 배의 후방 말단에서 생성된 GDF-11은 확산되어 형태형성인자 구배를 형성할 수 있다. GDF-11의 작용 기전이 어찌되든, 전체 전방/후방 패턴화가 GDF-11 녹아웃 동물에서 일어난다는 사실은 GDF-11이 전방/후방 특정화의 유일한 조절인자가 아닐 수 있음을 제시한다. 그럼에도 불구하고, GDF-11이 축방향 형상화의 전체적인 조절인자로서 중요한 역할을 하며, 이 분자의 추가 연구는 전후방 축을 따라 위치 실체가 척추동물 배아에서 어떻게 설정되는 가에 관해 중요하고도 새로운 입장을 이끌어 간다는 것은 분명하다.
유사한 표현형이 GDF-8 녹아웃 동물에서 예상된다. 예를 들면, GDF-8 녹아웃 동물은 야생형과 비교했을 때 증가된 수의 늑골, 신장 결함 및 해부학적 차이를 가질 것으로 예상된다.
실시예 15
마이오스타틴 프로- 펩타이드 , 폴리스타틴 또는 우성 음성 ACT RIIB 를 발현하는 트랜스게닉 마우스의 생산
마이오스타틴의 정제. 전구체 단백질의 프로세싱을 개선하기 위해 퓨린 프로테아제 PACE의 발현 작제물(Monique Davies에 의해 제공받음)로 마이오스타틴 발현 작제물의 증폭된 복제물을 갖는 챠이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포를 형질감염시켰다. 조성된 배지(매릴랜드 미들타운 소재의 Cell Trends에 의해 제조됨)를 하이드록실아파타이트(200 mM 인산나트륨 pH 7.2로 용출함), 렌틸 렉틴 세파로즈(50 mM 트리스 pH 7.4, 500 mM NaCl, 500 mM 메틸 만노즈로 용출함), DEAE 아가로즈(50 mM 트리스 pH 7.4, 50 mM NaCl중에서 컬럼을 통해 유출된 물질을 수집함) 및 헤파린 세파로즈(50 mM 트리스 pH 7.4, 200 mM NaCl로 용출함)에 연속적으로 통과시켰다. 그런 다음 헤파린 컬럼으로부터의 용출물을 역상 C4 HPLC 컬럼에 결합시키고 0.1% 트리플루오로아세트산중의 아세토니트릴 구배로 용출하였다. 성숙 C-말단 단백질에 대한 항체는 공개된 것이다(참조: 미국특허 제5,827,733호-이 특허의 내용은 본원에 참고로 원용된다). 프로펩타이드에 대한 항체를 생성하기 위해, 아미노산 122-261에 상응하는 인간 마이오스타틴 단백질의 일부분을 RSET 벡터(캘리포니아 샌디에고 소재의 Invitrogen)를 사용하여 박테리아에서 발현시키고, 니켈 킬레이트 크로마토그래피하여 정제한 다음, 토끼에 주사하였다. Spring Valley Labs(매릴랜드 우드바인 소재)에 의해 면역화를 실시하였다.
수용체 결합. 클로르아민 T 방법을 사용하여 정제된 마이오스타틴을 방사성요오드화하였다(Frolik, C.A., Wakefield, L.M., Smith, D.M. & Sporn, M.B. (1984) J Biol Chem 259, 10995-11000). 6 또는 12 웰 플레이트에서 성장한 COS-7 세포를 리포펙타민을 사용하여 1-2 ㎍ pCMV5 또는 pCMV5/수용체 작제물로 형질감염시켰다(Gibco, Rockville, MD). 문헌[Franzen, P., ten Dijke, P., Ichijo, H., Yamashita, H., Schultz, P., Heldin, C.-H. & Miyazono, K. (1993) Cell 75, 681-692]에 기술된 바와 같이 형질감염 후 2일 경과하여 가교 실험을 실시하였다. 정량 수용체 결합 분석을 위해, 세포 단층을 1 mg/ml BSA를 함유한 PBS로 2회 세척하고 4℃하에 비표지된 여러 농도의 마이오스타틴, 프로펩타이드 또는 폴리스타틴의 존재 또는 부재하에 표지된 마이오스타틴과 배양하였다. 이어서, 세포를 동일한 완충액으로 3회 세척하고, 0.5N NaOH로 용균시키며, 감마 계수기로 계수하였다. Act RIIB로 형질감염된 세포와 벡터로 형질감염된 세포사이의 결합된 마이오스타틴의 차이로서 특이적 결합을 계산하였다. 특이적 결합을 계산하는 이 방법은 프로펩타이드의 첨가가 또한 농도-의존적 양상으로 비-특이적 결합을 감소시킴에 따라 프로펩타이드의 효과를 평가하는데 특히 중요하였다.
돌연변이 마우스. 아미노산 1-174에 상응하는 쥐 Act RIIB의 절두형 형태, 아미노산 1-267에 상응하는 쥐 마이오스타틴 프로펩타이드 및 사람 폴리스타틴의 짧은 형태를 암호하는 DNA를 마이오신 경쇄 프로모터 및 1/3 인핸서를 함유한 MDAF2 벡터내로 클로닝하였다(McPherron, A.C. & Lee, S.-J. (1993) J Biol Chem 268, 3444-3449). 마이오신 경쇄 조절 서열 및 SV40 프로세싱 부위를 포함한 정제된 트랜스유전자를 미량주입을 위해 사용하였다. 모든 미량주입 및 배 전달은 Medicine Transgenic Core Facility의 Johns Hopkins School에 의해 실시되었다. 하이브리드 SJL/C57BL/6 백그라운드에서 돌연변이 창시 마우스를 야생형 C57BL/6 마우스와 교배시키고 F1 후손을 이용하여 모든 연구를 실시하였다. 근육량의 분석을 위해, 개개 근육을 거의 모든 동물의 양측으로부터 절개하고 좌우 근육량의 평균을 이용하였다. 섬유 수 및 크기의 분석은 문헌[McPherron, A.C., Lawler, A.M. & Lee, S.-J. (1997) Nature 387, 83-90]에 기술된 바와 같이 실시하였다. RNA 분리 및 노던 분석은 문헌[McPherron, A.C. & Lee, S.-J. (1993) J Biol Chem 268, 3444-3449]에 기술된 바와 같이 실시하였다.
마이오스타틴 단백질을 과생산하기 위해, 마이오스타틴 발현 작제물의 증폭된 복제물을 갖는 CHO 세포주를 생산하였다(McPherron, A.C., Lawler, A.M. & Lee, S.-J. (1997) Nature 387, 83-90). 이 세포주의 조성된 배지를 하이드록실아파타이트, 렌틸 렉틴 세파로즈, DEAE 아가로즈 및 헤파린 세파로즈에서 연속적으로 분별하여 마이오스타틴을 정제하였다. 정제된 단백질 제제의 은 염색 분석 결과 29 kd 및 12.5 kd 단백질 두 종이 존재하는 것으로 나타났다. 여러 데이터는 이 정제된 단백질이 두 프로펩타이드 분자가 디설파이드-결합된 C-말단 이량체에 결합된 비공유 복합체로 구성되어 있음을 제시하였다. 첫째, 웨스턴 분석에 의해 29 kd 및 12.5 kd 종이 각각 프로펩타이드 및 C-말단 성숙 영역에 상응하는 마이오스타틴의 박테리아 발현된 단편에 대한 항체와 면역반응하였다. 둘째, 환원제의 부재하에서, C-말단 영역은 이량체의 것과 일치하는 전기영동 이동성을 가졌다. 셋째, 두 종은 약 1:1의 몰비로 존재하였다. 넷째, C-말단 이량체는 렉틴 컬럼에 체류하였고 비록 이 단백질의 일부가 잠재적인 N-연결된 글리코실화 부위를 함유지 않았을 지라도 메틸 만노스로 용출할 수 있었다. 이들 데이터의 가장 간단한 해석은 C-말단 영역이 글리코실화 시그널을 갖는 프로펩타이드와의 조밀한 복합체에 존재함으로써 간접적으로 렉틴과 결합하였다는 것이다.
C-말단 이량체가 다른 TGF-β 계열 일원에 대해 생물학적으로 활성적인 분자인 것으로 알려져 있기 때문에, 마이오스타틴의 C-말단 이량체는 이의 프로펩타이드로부터 역상 HPLC에 의해 정제되었다. 정제된 C-말단 이량체를 함유한 분획(32-34)은 균질한 것으로 나타났다. 그러나, 프로펩타이드에 대해 가장 증식된 분획(35-37)은 소량의 C-말단 이량체 및 대부분 미스폴딩된 단백질인 고분자량의 복합체로 오염되었다.
TGF-β 상위계열의 대부분의 일원은 세린/트레오닌 키나제 수용체와 결합한 후 Smad 단백질의 활성화에 의해 시그널을 전달하는 것으로 제시되어 왔다(Heldin, C.-H., Miyazono, K.& ten Dijke, P.(1997) Nature 390, 465-471; Massague, J., Blain, S.W. & Lo, R.S. (2000) Cell 103, 295-309). 시그널링 경로의 과정에서 초기 이벤트는 II형 수용체에 리간드가 결합하는 것이다. 마이오스타틴이 연관된 리간드에 대한 공지의 II형 수용체중 어떠한 것에 대해서도 결합할 수 있는지 여부를 측정하기 위해, TGF-β, BMP 또는 액티빈 II형 수용체에 대한 발현 작제물로 형질감염된 COS-7 세포에서 방사성요오드화 마이오스타틴 C-말단 이량체로 가교 연구를 실시하였다. 예상된 크기의 가교된 복합체(마이오스타틴에 결합된 전장 수용체)를 Act RIIA 또는 Act RIIB를 발현하는 세포에 대해 검출하였다. 가교 및 표준 수용체 결합 분석 모두에서 Act RIIA보다 Act RIIB에 보다 높은 수준으로 결합한다는 것이 관찰되었으며, 이에 따라 수용체 결합 연구는 Act RIIB에 집중되었다. Act RIIB에 대한 마이오스타틴의 결합은 특이적이고(결합은 과량의 비표지된 마이오스타틴과 경쟁할 수 있었다) 포화적이었으며, 모든 마이오스타틴 단백질이 생활성적임을 가정하여, 우리는 Scatchard 분석에 의한 해리 상수가 약 10 nM인 것으로 산정하였다. TGF-β의 경우 II형 수용체에 대한 친화성이 적당한 I형 수용체의 존재하에서 유의적으로 더 높고 다른 분자들이 리간드를 수용체에 제공하는데 연루되어 있는 것으로 알려져 있다.
액티빈 II형 수용체가 생체내 마이오스타틴 시그널링에 연루될 수 있는지를 결정하기 위해, 마우스에서 Act RIIB의 우성 음성 형태를 발현하는 효과를 조사하였다. 이 목적을 위해, 우리는 키나제 도메인이 없는 Act RIIB의 절두형 형태가 골격근-특이적 마이오신 경쇄 프로모터/인핸서의 하류에 배치된 작제물을 제조하였다. 이 작제물의 수정란 주사로부터 트랜스유전자에 대해 양성인 총 7마리 창시 동물이 동정되었다. 생후 7개월된 이들 창시 동물의 분석 결과 이들 모두는 골격근육량에 있어서 유의적인 증가를 보였고 이들 창시 동물의 개개 근육은 중량이 유사한 주사로부터 유도된 대조 비돌연변이 동물에 비하여 125%까지 증가하였다 (표 2).
이들 세개의 라인에 관한 증거는 이들 창시 동물에서 근육량의 증가가 트랜스유전자의 발현에 의한 것임을 제시하였다. 첫째, 야생형 C57BL/6 마우스와 함께 세개의 창시 동물(다른 네 창시 동물은 분석에 충분한 수의 후손을 생산하지 못했다)의 교잡으로부터 유래된 후손의 분석은 근육량의 증가가 트랜스유전자의 존재와 상관관계가 있음을 보여주었다(표 3). 둘째, 비록 근육량이 다른 트랜스유전자 라인간에 변하였을 지라도, 증가량이 검사된 모든 근육 및 수컷과 암컷 모두에 대해 주어진 라인에서 동물간에 상당히 일치하였다(표 3). 예를 들면, C5 라인의 수컷과 암컷 둘다의 모든 근육은 중량이 대조 동물의 것보다 약 30-60% 더 무거운 반면, C11 마우스 유래의 모든 근육의 중량은 약 110-180% 더 나갔다. 셋째, 트랜스게닉 동물로부터 제조된 RNA 샘플의 노던 분석은 트랜스유전자의 발현이 골격근으로 한정되며 트랜스유전자 발현의 상대적 수준이 근육중량 증가량과 상관관계가 있음을 보여주었다(표 3). 예를 들면, 근육량이 가장 많이 증가한 C11 라인 유래의 동물은 또한 트랜스유전자의 발현 수준이 가장 높았다.
이들 데이터는 Act RIIB의 우성 음성 형태의 발현이 마이오스타틴 녹아웃 마우스에서 관찰된 것과 유사한 근육량의 증가를 일으킬 수 있음을 보여주었다. 마이오스타틴 녹아웃 마우스에서, 근육량의 증가는 섬유 수 및 섬유 크기 모두의 증가에 의해 발생된 것으로 제시되었다. 우성 음성 Act RIIB의 발현이 또한 증식증 및 비대증 모두를 유발하는지를 결정하기 위해, C27 라인의 동물로부터 비복근 및 족척근 표본을 분석하였다. 대조 근육과 비교하여, C27 동물의 근육은 총 횡단면적에서 뚜렷한 증가를 보였다. 이러한 면적 증가는 부분적으로 섬유 수의 증가에 기인하였다. 가장 넓은 관점에서, 비복근과 족촉근은 C27 라인(n=3)의 동물에서 총 10015+1143 섬유를 가졌고 이에 반하여 대조 동물(n=3)은 7871+364 섬유를 가졌다. 그러나, 근육 섬유 비대증은 또한 전체 면적의 증가에 의한 것이었다. C27 라인의 동물에서 평균 섬유 직경은 51 ㎛였고, 대조적인 대조 동물에서 43 ㎛였다. 따라서, 근육량의 증가는 섬유수의 약 27% 증가 및 섬유 직경의 19% 증가에 기인하는 듯 보였다(섬유가 대체로 원통형인 것으로 가정하였을때, 직경이 이와같이 증가하면 횡단면은 약 40% 증가하였다). 그러나, 섬유수 및 크기의 증가를 제외하고, 트랜스게닉 동물 유래의 근육은 전반적으로 정상으로 보였다. 특히, 아주 다양한 섬유 크기(섬유 크기의 표준 편차는 대조 동물과 트랜스게닉 동물 사이에 비슷하였다) 또는 광범위한 섬유증 또는 지방 침윤과 같은 퇴화의 뚜렷한 징후는 없었다.
이들 방법을 사용하여 마이오스타틴을 억제하는 다른 가능한 전략을 개발하였다. 첫째, 우리는 마이오스타틴 프로펩타이드의 효과를 연구하였다. TGF-β의 경우, C-말단 이량체는 이의 프로펩타이드를 포함하여 다른 단백질과 불활성적이고 잠재성인 복합체로 존재하며 TGF-β의 프로펩타이드는 시험관내 및 생체내 모두에서 TGF-β 활성에 억제 효과를 나타낼 수 있는 것으로 알려져 있다(Miyazono, K., Hellman, U., Wernstedt, C.&Heldin, C.-H. (1988) J Biol Chem 263, 6407-6415; Gentry, L.E.&Nash, B.W.(1990) Biochem. 29, 6851-6857; Bottinger, E.P., Factor, V.M., Tsang, M.L.-S., Weatherbee, J.A., Kopp, J.B., Qian, S.W., Wakefield, L.M., Roberts, A.B., Thorgeirsson, S.S.&Sporn, M.B.(1996) Proc Natl Acad Sci, USA 93, 5877-5882). 마이오스타틴 C-말단 이량체 및 프로펩타이드가 동시에 정제되었다는 관찰 결과는 마이오스타틴이 유사한 잠재성 복합체로 정상적으로 존재할 수 있고 마이오스타틴 프로펩타이드가 억제 활성을 가질수 있다는 가능성을 제기하였다. 둘째, 우리는 수가지 TGF-β 계열 일원과 결합하고 이의 활성을 억제할 수 있는 것으로 제시되어 온 폴리스타틴의 효과를 검사하였다. 특히, 폴리스타틴은 마이오스타틴과 고도로 연관된 GDF-11의 활성을 차단할 수 있으며, 폴리스타틴 녹아웃 마우스는 출생시 근육량이 감소된 것으로 제시되어 왔으며, 이것은 마이오스타틴의 과활성과 일치한다(Gamer, L., Wolfman, N., Celeste, A., Hattersley, G., Hewick, R.& Rosen, V.(1999) Dev Biol 208, 222-232; Matzuk, M.M., Lu, N., Vogel, H., Sellheyer, K., Roop, D.R.& Bradley, A. (1995) Nature 374, 360-363).
이어서, 프로펩타이드 및 폴리스타틴의 시험관내 효과를 연구하였다. 마이오스타틴 프로펩타이드 및 폴리스타틴 둘다는 Act RIIB에 C-말단 이량체가 결합하는 것을 차단할 수 있었다. 폴리스타틴의 Ki는 약 470 pM이고, 프로펩타이드의 Ki는 이의 적어도 50배 이상인 것으로 산정되었다. 그러나, 프로펩타이드에 대한 Ki의 계산은 최종 제제에서 모든 단백질이 생물학적으로 활성적인 프로펩타이드를 나타냈음을 가정한 것이므로, 이에 따라 과대평가치인 듯하다. 상기 논의된 바와 같이, 프로펩타이드 제제는 소량의 C-말단 이량체와 미스폴딩된 고분자량 종으로 오염되었다.
이들 분자가 또한 생체내 마이오스타틴 활성을 차단할 수 있는 지를 결정하기 위해, 마이오스타틴 프로펩타이드 또는 폴리스타틴을 발현시키기 위해 마이오신 경쇄 프로모터/인핸서가 사용된 트랜스게닉 마우스를 생산하였다. 프로펩타이드 작제물의 수정란 주사로부터 증가된 근육 발달을 나타낸 세가지 돌연변이 마우스 라인(이들중 둘인 B32A 및 B32B는 하나의 최초 창시 동물에서 트랜스유전자 삽입 부위를 독립적으로 격리시킨 것이다)을 동정하였다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 각 라인으로부터 유래된 동물의 근육량은 트랜스게닉 마우스의 근육량에 비하여 대략 20∼110% 증가하였다. 이들 라인 각각의 대표적인 동물로부터 제조된 RNA 샘플의 노던 분석은 트랜스유전자의 발현 수준이 근육량의 증가 크기와 상관관계가 있음을 보여주었다. 특히, 근육량의 약 20-40% 증가만을 나타낸 B32A 라인의 동물은 가장 낮은 수준의 트랜스유전자 발현을 나타냈으며, 근육량의 약 70-100% 증가를 나타낸 B32B 및 B53 라인의 동물은 최고 수준의 트랜스유전자 발현을 나타냈다. 아미도 중요하게는, B32A와 B32B 삽입 부위에 대해 이중 돌연변이인 동물의 근육량은, 이중 돌연변이 동물이 보다 높은 수준의 트랜스유전자 발현을 보였다는 사실에도 불구하고, B32B 삽입 부위에 대해서만 트랜스게닉인 동물에서 관찰된 것과 유사하였다(표 3). 이들 발견은 B32B 라인 (및 B53 라인)에서 관찰된 효과가 프로펩타이드를 과발현하여 달성할 수 있는 최대치였음을 제시한다. Act RIIB의 우성 음성 형태를 발현하는 동물에서와 같이, 프로펩타이드를 발현하는 동물은 근섬유 수 및 크기 모두에서 증가를 보였다. B32A 및 B32B 삽입 부위에 대해 이중 돌연변이인 두 동물의 비복근 및 족척근의 분석은 섬유수가 대조 동물에 비하여 약 40%까지 증가하였고(두 동물은 11940 및 10420개 섬유를 보유함), 섬유 직경은 약 21%(52 ㎛)까지 증가하였다.
골격근에 대해 가장 현저한 효과는 폴리스타틴 작제물을 이용하여 얻었다. 두 창시 동물(F3 및 F66)은 근육 발달이 증가하였다(표 2). 이들 동물중 하나(F3)에서, 근육량은 대조 동물에 비하여 194-327%까지 증가하였으며, 이것은 증식증(비복근 및 족척근에서 섬유수가 13051개로 66% 증가)과 비대증(섬유직경이 55 ㎛로 28% 증가)의 조합에 의한 것이다. 비록 본 발명자는 하이브리드 SJL/C57BL/6 백그라운드에서 마이오스타틴 녹아웃 마우스의 근육량을 분석하지 못했으나, F3 창시 동물에서 관찰된 근육량의 증가는 우리가 다른 유전자 백그라운드에서 마이오스타틴 무효 동물에서 관찰한 증가량보다 유의적으로 더 컸다. 이들 결과는 폴리스타틴의 효과중 적어도 일부가 마이오스타틴 이외에 다른 리간드의 억제에 의한 것일 수 있음을 제시한다. 분명하게는, 추가적인 폴리스타틴 트랜스게닉 라인의 분석이 다른 리간드가 또한 근육 성장을 음성적으로 조절하는것과 연루되어 있을 수 있는 지를 결정하는데 필수적일 것이다.
단백질분해의 프로세싱 후, 마이오스타틴 C-말단 이량체는 이의 프로펩타이드 및 아마도 다른 단백질과의 잠재적인 복합체로 유지되는 듯하다. 마이오스타틴은 또한 C-말단 이량체와 결합하여 마이오스타틴이 수용체와 결합하는 능력을 억제하는 폴리스타틴에 의해 음성적으로 조절된다. 미지의 기전에 의하여 이들 억제 단백질로부터 C-말단 이량체를 분리시키면 마이오스타틴이 액티빈 II형 수용체와 결합할 수 있다. 다른 계열의 일원과 유사하게, 우리는 이들 수용체의 활성화가 I형 수용체 및 Smad 단백질의 활성화를 유도한다고 추정한다.
이러한 마이오스타틴 조절 및 시그널링의 전체적인 모델은 본원에 제시된 데이터 뿐만 아니라 다른 유전적 데이터와 일치한다. 앞서 논의된 바와 같이, 폴리스타틴 녹아웃 마우스는 출생시 근육량이 감소된 것으로 제시되어 왔으며, 이로써 마이오스타틴 활성은 억제되지 않았음을 예상할 수 있는 것이다. 유사한 근육 표현형이 Smad2 및 3의 활성을 억제하는 것으로 제시된, ski 결손 마우스에 관하여는 보고된 바 있으며, 상반된 표현형, 즉 과량의 골격근이 ski 과발현 마우스에서 관찰되었다. 현재의 발견을 근거로, 한가지 제시되는 가설은 이들 관찰된 표현형이 이들 마우스에서 각각 마이오스타틴의 과다활성과 저활성을 반영한다는 것이다.
비록 모든 시험관내 및 유전적 데이터가 우리가 본원에 개진한 전체 모델과 일치할 지라도, 이들 데이터는 또한 다른 수용체 및 리간드가 연루된 다른 방법의 모델과 일치할 것이다. 예를 들면, 우리는 Act RIIB의 절두형 형태가 우리의 돌연변이 마우스에서 근육 성장을 증가시켜 주는 기전을 모른다. 절두형 리포터는 표적 세포에서 시그널링을 차단하는 작용을 하지 않고 마이오스타틴의 체외 농도를 감소시키는 싱크(sink)로 작용할 수 있다. 또한, 절단된 수용체가 마이오스타틴외에 다른 리간드의 시그널링을 차단할 수도 있다. 이러한 관점에서, II형 액티빈 수용체의 우성 음성 형태가 다른 종에서 여러가지 상이한 TGF-β 연관된 리간드의 시그널링을 차단할 수 있는 것으로 제시되어 왔다. 유사하게, 본 발명의 데이터는 폴리스타틴이 생체내에서 마이오스타틴 활성을 차단하여 근육 성장을 촉진한다고 명백하게 제시하지 못한다. 이러한 관점에서, 폴리스타틴 발현 창시 동물중 하나에서 관찰된 상당한 정도의 근육발달은 다른 폴리스타틴-감수성 리간드가 근육 성장을 조절하는데 연루될 수 있음을 제시한다.
그러나, 지금까지 마이오스타틴이 생체내에서 근육량을 조절하는데 음성적 역할을 하는 분비형 단백질임을 입증하였다. 비록 이러한 전체적인 모델의 관점을 증명하고 다른 시그널링 요소를 동정하는데 추가의 실험이 필요할 지라도, 우리의 데이터는 폴리스타틴 및 마이오스타틴 프로펩타이드와 같은 마이오스타틴 길항제 또는 액티빈 II형 수용체 길항제가 사람 및 가축에게 효과적인 근육 강화제가 될 수 있음을 제시한다.
Figure 112009016307897-PAT00001
Figure 112009016307897-PAT00002
이상, 실시예를 참조로 하여 본 발명을 설명하였지만, 본 발명의 범위내에서 다양한 변형과 수정이 가능하다는 것은 자명한 것이다. 따라서, 본 발명은 다음 청구의 범위에 의해서만 제한된다.
도 1은 쥐(murine)의 프로마이오스타틴의 아미노산 서열(서열번호 4); 래트의 프로마이오스타틴의 아미노산 서열(서열번호 6); 인간 프로마이오스타틴의 아미노산 서열(서열번호 2); 비비의 프로마이오스타틴의 아미노산 서열(서열번호 10); 소의 프로마이오스타틴의 아미노산 서열(서열번호 12); 돼지의 프로마이오스타틴의 아미노산 서열(서열번호 14); 양의 프로마이오스타틴의 아미노산 서열(서열번호 16); 닭의 프로마이오스타틴의 아미노산 서열(서열번호 8); 칠면조의 프로마이오스타틴의 아미노산 서열(서열번호 18) 및 제브라피쉬 프로마이오스타틴의 아미노산 서열(서열번호 20)을 도시한 것이다. 아미노산의 번호는 인간 프로마이오스타틴(서열번호 2)에 상대적인 번호이다. 대시선은 상동성을 최대화하기 위해 도입시킨 갭을 나타낸다. 음영 부분은 서열 간의 동일한 잔기를 나타내는 것이다.
도 2는 쥐 프로마이오스타틴(서열번호 4)과 제브라피쉬 프로마이오스타틴(서열번호 20)의 아미노산 서열과, 연어 대립유전자 1 프로마이오스타틴(서열번호 27; "연어 1")과 연어 대립유전자 2 프로마이오스타틴(서열번호 29: "연어 2") 아미노산 서열의 일부를 도시한 것이다. 인간 프로마이오스타틴에 상대적인 아미노산 위치는 각 줄의 왼쪽에 표시하였다(도 1 참조; 연어 1의 제1 아미노산은 인간 프로마이오스타틴 218에 해당하고; 연어 2의 제1 아미노산은 인간 프로마이오스타틴 239에 해당한다). 대시선은 상동성을 최대화하기 위해 도입시킨 갭을 나타낸다. 갭을 포함하는 아미노산의 상대적 위치는 각 줄의 위쪽에 표시하였다. 음영 부분은 서열 사이의 동일한 잔기를 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> THE JOHNS HOPKINS UNIVERSITY Lee, Se-Jin McPherron, Alexandra C. <120> USE OF FOLLISTATIN TO INCREASE MUSCLE MASS <130> JHU1470-3KR <150> PCT/US 02/13103 <151> 2002-04-24 <150> US 09/841,730 <151> 2001-04-24 <160> 29 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 2743 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (59)...(1183) <400> 1 aagaaaagta aaaggaagaa acaagaacaa gaaaaaagat tatattgatt ttaaaatc 58 atg caa aaa ctg caa ctc tgt gtt tat att tac ctg ttt atg ctg att 106 Met Gln Lys Leu Gln Leu Cys Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile 1 5 10 15 gtt gct ggt cca gtg gat cta aat gag aac agt gag caa aaa gaa aat 154 Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn 20 25 30 gtg gaa aaa gag ggg ctg tgt aat gca tgt act tgg aga caa aac act 202 Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr 35 40 45 aaa tct tca aga ata gaa gcc att aag ata caa atc ctc agt aaa ctt 250 Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu 50 55 60 cgt ctg gaa aca gct cct aac atc agc aaa gat gtt ata aga caa ctt 298 Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Val Ile Arg Gln Leu 65 70 75 80 tta ccc aaa gct cct cca ctc cgg gaa ctg att gat cag tat gat gtc 346 Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val 85 90 95 cag agg gat gac agc agc gat ggc tct ttg gaa gat gac gat tat cac 394 Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His 100 105 110 gct aca acg gaa aca atc att acc atg cct aca gag tct gat ttt cta 442 Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu 115 120 125 atg caa gtg gat gga aaa ccc aaa tgt tgc ttc ttt aaa ttt agc tct 490 Met Gln Val Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser 130 135 140 aaa ata caa tac aat aaa gta gta aag gcc caa cta tgg ata tat ttg 538 Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu 145 150 155 160 aga ccc gtc gag act cct aca aca gtg ttt gtg caa atc ctg aga ctc 586 Arg Pro Val Glu Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu 165 170 175 atc aaa cct atg aaa gac ggt aca agg tat act gga atc cga tct ctg 634 Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu 180 185 190 aaa ctt gac atg aac cca ggc act ggt att tgg cag agc att gat gtg 682 Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val 195 200 205 aag aca gtg ttg caa aat tgg ctc aaa caa cct gaa tcc aac tta ggc 730 Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly 210 215 220 att gaa ata aaa gct tta gat gag aat ggt cat gat ctt gct gta acc 778 Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr 225 230 235 240 ttc cca gga cca gga gaa gat ggg ctg aat ccg ttt tta gag gtc aag 826 Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys 245 250 255 gta aca gac aca cca aaa aga tcc aga agg gat ttt ggt ctt gac tgt 874 Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys 260 265 270 gat gag cac tca aca gaa tca cga tgc tgt cgt tac cct cta act gtg 922 Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val 275 280 285 gat ttt gaa gct ttt gga tgg gat tgg att atc gct cct aaa aga tat 970 Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr 290 295 300 aag gcc aat tac tgc tct gga gag tgt gaa ttt gta ttt tta caa aaa 1018 Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys 305 310 315 320 tat cct cat act cat ctg gta cac caa gca aac ccc aga ggt tca gca 1066 Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala 325 330 335 ggc cct tgc tgt act ccc aca aag atg tct cca att aat atg cta tat 1114 Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr 340 345 350 ttt aat ggc aaa gaa caa ata ata tat ggg aaa att cca gcg atg gta 1162 Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val 355 360 365 gta gac cgc tgt ggg tgc tca tgagatttat attaagcgtt cataacttcc 1213 Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 370 375 taaaacatgg aaggttttcc cctcaacaat tttgaagctg tgaaattaag taccacaggc 1273 tataggccta gagtatgcta cagtcactta agcataagct acagtatgta aactaaaagg 1333 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tcctttttta tttactttgg tatattttta cactaaggac atttcaaatt aagtactaag 2233 gcacaaagac atgtcatgca tcacagaaaa gcaactactt atatttcaga gcaaattagc 2293 agattaaata gtggtcttaa aactccatat gttaatgatt agatggttat attacaatca 2353 ttttatattt ttttacatga ttaacattca cttatggatt catgatggct gtataaagtg 2413 aatttgaaat ttcaatggtt tactgtcatt gtgtttaaat ctcaacgttc cattatttta 2473 atacttgcaa aaacattact aagtatacca aaataattga ctctattatc tgaaatgaag 2533 aataaactga tgctatctca acaataactg ttacttttat tttataattt gataatgaat 2593 atatttctgc atttatttac ttctgttttg taaattggga ttttgttaat caaatttatt 2653 gtactatgac taaatgaaat tatttcttac atctaatttg tagaaacagt ataagttata 2713 ttaaagtgtt ttcacatttt tttgaaagac 2743 <210> 2 <211> 375 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gln Lys Leu Gln Leu Cys Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile 1 5 10 15 Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn 20 25 30 Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr 35 40 45 Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu 50 55 60 Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Val Ile Arg Gln Leu 65 70 75 80 Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val 85 90 95 Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His 100 105 110 Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu 115 120 125 Met Gln Val Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser 130 135 140 Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu 145 150 155 160 Arg Pro Val Glu Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu 165 170 175 Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu 180 185 190 Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val 195 200 205 Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly 210 215 220 Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr 225 230 235 240 Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys 245 250 255 Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys 260 265 270 Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val 275 280 285 Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr 290 295 300 Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys 305 310 315 320 Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala 325 330 335 Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr 340 345 350 Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val 355 360 365 Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 370 375 <210> 3 <211> 2676 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (104)...(1231) <400> 3 gtctctcgga cggtacatgc actaatattt cacttggcat tactcaaaag caaaaagaag 60 aaataagaac aagggaaaaa aaaagattgt gctgattttt aaa atg atg caa aaa 115 Met Met Gln Lys 1 ctg caa atg tat gtt tat att tac ctg ttc atg ctg att gct gct ggc 163 Leu Gln Met Tyr Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile Ala Ala Gly 5 10 15 20 cca gtg gat cta aat gag ggc agt gag aga gaa gaa aat gtg gaa aaa 211 Pro Val Asp Leu Asn Glu Gly Ser Glu Arg Glu Glu Asn Val Glu Lys 25 30 35 gag ggg ctg tgt aat gca tgt gcg tgg aga caa aac acg agg tac tcc 259 Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Ala Trp Arg Gln Asn Thr Arg Tyr Ser 40 45 50 aga ata gaa gcc ata aaa att caa atc ctc agt aag ctg cgc ctg gaa 307 Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Glu 55 60 65 aca gct cct aac atc agc aaa gat gct ata aga caa ctt ctg cca aga 355 Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln Leu Leu Pro Arg 70 75 80 gcg cct cca ctc cgg gaa ctg atc gat cag tac gac gtc cag agg gat 403 Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val Gln Arg Asp 85 90 95 100 gac agc agt gat ggc tct ttg gaa gat gac gat tat cac gct acc acg 451 Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His Ala Thr Thr 105 110 115 gaa aca atc att acc atg cct aca gag tct gac ttt cta atg caa gcg 499 Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu Met Gln Ala 120 125 130 gat ggc aag ccc aaa tgt tgc ttt ttt aaa ttt agc tct aaa ata cag 547 Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser Lys Ile Gln 135 140 145 tac aac aaa gta gta aaa gcc caa ctg tgg ata tat ctc aga ccc gtc 595 Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu Arg Pro Val 150 155 160 aag act cct aca aca gtg ttt gtg caa atc ctg aga ctc atc aaa ccc 643 Lys Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu Ile Lys Pro 165 170 175 180 atg aaa gac ggt aca agg tat act gga atc cga tct ctg aaa ctt gac 691 Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu Lys Leu Asp 185 190 195 atg agc cca ggc act ggt att tgg cag agt att gat gtg aag aca gtg 739 Met Ser Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val Lys Thr Val 200 205 210 ttg caa aat tgg ctc aaa cag cct gaa tcc aac tta ggc att gaa atc 787 Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly Ile Glu Ile 215 220 225 aaa gct ttg gat gag aat ggc cat gat ctt gct gta acc ttc cca gga 835 Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr Phe Pro Gly 230 235 240 cca gga gaa gat ggg ctg aat ccc ttt tta gaa gtc aag gtg aca gac 883 Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys Val Thr Asp 245 250 255 260 aca ccc aag agg tcc cgg aga gac ttt ggg ctt gac tgc gat gag cac 931 Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His 265 270 275 tcc acg gaa tcc cgg tgc tgc cgc tac ccc ctc acg gtc gat ttt gaa 979 Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu 280 285 290 gcc ttt gga tgg gac tgg att atc gca ccc aaa aga tat aag gcc aat 1027 Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn 295 300 305 tac tgc tca gga gag tgt gaa ttt gtg ttt tta caa aaa tat ccg cat 1075 Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His 310 315 320 act cat ctt gtg cac caa gca aac ccc aga ggc tca gca ggc cct tgc 1123 Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys 325 330 335 340 tgc act ccg aca aaa atg tct ccc att aat atg cta tat ttt aat ggc 1171 Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly 345 350 355 aaa gaa caa ata ata tat ggg aaa att cca gcc atg gta gta gac cgc 1219 Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg 360 365 370 tgt ggg tgc tca tgagctttgc attaggttag aaacttccca agtcatggaa 1271 Cys Gly Cys Ser 375 ggtcttcccc tcaatttcga aactgtgaat tcaagcacca caggctgtag gccttgagta 1331 tgctctagta acgtaagcac aagctacagt gtatgaacta aaagagagaa tagatgcaat 1391 ggttggcatt caaccaccaa aataaaccat actataggat gttgtatgat ttccagagtt 1451 tttgaaatag atggagatca aattacattt atgtccatat atgtatatta caactacaat 1511 ctaggcaagg aagtgagagc acatcttgtg gtctgctgag ttaggagggt atgattaaaa 1571 ggtaaagtct tatttcctaa cagtttcact taatatttac agaagaatct atatgtagcc 1631 tttgtaaagt gtaggattgt tatcatttaa aaacatcatg tacacttata tttgtattgt 1691 atacttggta agataaaatt ccacaaagta ggaatggggc ctcacataca cattgccatt 1751 cctattataa ttggacaatc caccacggtg ctaatgcagt gctgaatggc tcctactgga 1811 cctctcgata gaacactcta caaagtacga gtctctctct cccttccagg tgcatctcca 1871 cacacacagc actaagtgtt caatgcattt tctttaagga aagaagaatc tttttttcta 1931 gaggtcaact ttcagtcaac tctagcacag cgggagtgac tgctgcatct taaaaggcag 1991 ccaaacagta ttcatttttt aatctaaatt tcaaaatcac tgtctgcctt tatcacatgg 2051 caattttgtg gtaaaataat ggaaatgact ggttctatca atattgtata aaagactctg 2111 aaacaattac atttatataa tatgtataca atattgtttt gtaaataagt gtctcctttt 2171 atatttactt tggtatattt ttacactaat gaaatttcaa atcattaaag tacaaagaca 2231 tgtcatgtat cacaaaaaag gtgactgctt ctatttcaga gtgaattagc agattcaata 2291 gtggtcttaa aactctgtat gttaagatta gaaggttata ttacaatcaa tttatgtatt 2351 ttttacatta tcaacttatg gtttcatggt ggctgtatct atgaatgtgg ctcccagtca 2411 aatttcaatg ccccaccatt ttaaaaatta caagcattac taaacatacc aacatgtatc 2471 taaagaaata caaatatggt atctcaataa cagctacttt tttattttat aatttgacaa 2531 tgaatacatt tcttttattt acttcagttt tataaattgg aactttgttt atcaaatgta 2591 ttgtactcat agctaaatga aattatttct tacataaaaa tgtgtagaaa ctataaatta 2651 aagtgttttc acatttttga aaggc 2676 <210> 4 <211> 376 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met Met Gln Lys Leu Gln Met Tyr Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu 1 5 10 15 Ile Ala Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Gly Ser Glu Arg Glu Glu 20 25 30 Asn Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Ala Trp Arg Gln Asn 35 40 45 Thr Arg Tyr Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys 50 55 60 Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln 65 70 75 80 Leu Leu Pro Arg Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp 85 90 95 Val Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr 100 105 110 His Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe 115 120 125 Leu Met Gln Ala Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser 130 135 140 Ser Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr 145 150 155 160 Leu Arg Pro Val Lys Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg 165 170 175 Leu Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser 180 185 190 Leu Lys Leu Asp Met Ser Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp 195 200 205 Val Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu 210 215 220 Gly Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val 225 230 235 240 Thr Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val 245 250 255 Lys Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp 260 265 270 Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr 275 280 285 Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg 290 295 300 Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln 305 310 315 320 Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser 325 330 335 Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu 340 345 350 Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met 355 360 365 Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 370 375 <210> 5 <211> 1131 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1)...(1128) <400> 5 atg att caa aaa ccg caa atg tat gtt tat att tac ctg ttt gtg ctg 48 Met Ile Gln Lys Pro Gln Met Tyr Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Val Leu 1 5 10 15 att gct gct ggc cca gtg gat cta aat gag gac agt gag aga gag gcg 96 Ile Ala Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asp Ser Glu Arg Glu Ala 20 25 30 aat gtg gaa aaa gag ggg ctg tgt aat gcg tgt gcg tgg aga caa aac 144 Asn Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Ala Trp Arg Gln Asn 35 40 45 aca agg tac tcc aga ata gaa gcc ata aaa att caa atc ctc agt aaa 192 Thr Arg Tyr Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys 50 55 60 ctc cgc ctg gaa aca gcg cct aac atc agc aaa gat gct ata aga caa 240 Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln 65 70 75 80 ctt ctg ccc aga gcg cct cca ctc cgg gaa ctg atc gat cag tac gac 288 Leu Leu Pro Arg Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp 85 90 95 gtc cag agg gat gac agc agt gac ggc tct ttg gaa gat gac gat tat 336 Val Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr 100 105 110 cac gct acc acg gaa aca atc att acc atg cct acc gag tct gac ttt 384 His Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe 115 120 125 cta atg caa gcg gat gga aag ccc aaa tgt tgc ttt ttt aaa ttt agc 432 Leu Met Gln Ala Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser 130 135 140 tct aaa ata cag tac aac aaa gtg gta aag gcc cag ctg tgg ata tat 480 Ser Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr 145 150 155 160 ctg aga gcc gtc aag act cct aca aca gtg ttt gtg caa atc ctg aga 528 Leu Arg Ala Val Lys Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg 165 170 175 ctc atc aaa ccc atg aaa gac ggt aca agg tat acc gga atc cga tct 576 Leu Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser 180 185 190 ctg aaa ctt gac atg agc cca ggc act ggt att tgg cag agt att gat 624 Leu Lys Leu Asp Met Ser Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp 195 200 205 gtg aag aca gtg ttg caa aat tgg ctc aaa cag cct gaa tcc aac tta 672 Val Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu 210 215 220 ggc att gaa atc aaa gct ttg gat gag aat ggg cat gat ctt gct gta 720 Gly Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val 225 230 235 240 acc ttc cca gga cca gga gaa gat ggg ctg aat ccc ttt tta gaa gtc 768 Thr Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val 245 250 255 aaa gta aca gac aca ccc aag agg tcc cgg aga gac ttt ggg ctt gac 816 Lys Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp 260 265 270 tgc gat gaa cac tcc acg gaa tcg cgg tgc tgt cgc tac ccc ctc acg 864 Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr 275 280 285 gtc gat ttc gaa gcc ttt gga tgg gac tgg att att gca ccc aaa aga 912 Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg 290 295 300 tat aag gct aat tac tgc tct gga gag tgt gaa ttt gtg ttc tta caa 960 Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln 305 310 315 320 aaa tat ccg cat act cat ctt gtg cac caa gca aac ccc aga ggc tcg 1008 Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser 325 330 335 gca ggc cct tgc tgc acg cca aca aaa atg tct ccc att aat atg cta 1056 Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu 340 345 350 tat ttt aat ggc aaa gaa caa ata ata tat ggg aaa att cca gcc atg 1104 Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met 355 360 365 gta gta gac cgg tgt ggg tgc tcg tga 1131 Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 370 375 <210> 6 <211> 376 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 6 Met Ile Gln Lys Pro Gln Met Tyr Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Val Leu 1 5 10 15 Ile Ala Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asp Ser Glu Arg Glu Ala 20 25 30 Asn Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Ala Trp Arg Gln Asn 35 40 45 Thr Arg Tyr Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys 50 55 60 Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln 65 70 75 80 Leu Leu Pro Arg Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp 85 90 95 Val Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr 100 105 110 His Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe 115 120 125 Leu Met Gln Ala Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser 130 135 140 Ser Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr 145 150 155 160 Leu Arg Ala Val Lys Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg 165 170 175 Leu Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser 180 185 190 Leu Lys Leu Asp Met Ser Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp 195 200 205 Val Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu 210 215 220 Gly Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val 225 230 235 240 Thr Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val 245 250 255 Lys Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp 260 265 270 Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr 275 280 285 Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg 290 295 300 Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln 305 310 315 320 Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser 325 330 335 Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu 340 345 350 Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met 355 360 365 Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 370 375 <210> 7 <211> 1128 <212> DNA <213> Gallus gallus <220> <221> CDS <222> (1)...(1125) <400> 7 atg caa aag ctg gca gtc tat gtt tat att tac ctg ttc atg cag atc 48 Met Gln Lys Leu Ala Val Tyr Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Gln Ile 1 5 10 15 gcg gtt gat ccg gtg gct ctg gat ggc agt agt cag ccc aca gag aac 96 Ala Val Asp Pro Val Ala Leu Asp Gly Ser Ser Gln Pro Thr Glu Asn 20 25 30 gct gaa aaa gac gga ctg tgc aat gct tgt acg tgg aga cag aat aca 144 Ala Glu Lys Asp Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr 35 40 45 aaa tcc tcc aga ata gaa gcc ata aaa att caa atc ctc agc aaa ctg 192 Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu 50 55 60 cgc ctg gaa caa gca cct aac att agc agg gac gtt att aag cag ctt 240 Arg Leu Glu Gln Ala Pro Asn Ile Ser Arg Asp Val Ile Lys Gln Leu 65 70 75 80 tta ccc aaa gct cct cca ctg cag gaa ctg att gat cag tat gat gtc 288 Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Gln Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val 85 90 95 cag agg gac gac agt agc gat ggc tct ttg gaa gac gat gac tat cat 336 Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His 100 105 110 gcc aca acc gag acg att atc aca atg cct acg gag tct gat ttt ctt 384 Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu 115 120 125 gta caa atg gag gga aaa cca aaa tgt tgc ttc ttt aag ttt agc tct 432 Val Gln Met Glu Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser 130 135 140 aaa ata caa tat aac aaa gta gta aag gca caa tta tgg ata tac ttg 480 Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu 145 150 155 160 agg caa gtc caa aaa cct aca acg gtg ttt gtg cag atc ctg aga ctc 528 Arg Gln Val Gln Lys Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu 165 170 175 att aag ccc atg aaa gac ggt aca aga tat act gga att cga tct ttg 576 Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu 180 185 190 aaa ctt gac atg aac cca ggc act ggt atc tgg cag agt att gat gtg 624 Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val 195 200 205 aag aca gtg ctg caa aat tgg ctc aaa cag cct gaa tcc aat tta ggc 672 Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly 210 215 220 atc gaa ata aaa gct ttt gat gag act gga cga gat ctt gct gtc aca 720 Ile Glu Ile Lys Ala Phe Asp Glu Thr Gly Arg Asp Leu Ala Val Thr 225 230 235 240 ttc cca gga cca gga gaa gat gga ttg aac cca ttt tta gag gtc aga 768 Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Arg 245 250 255 gtt aca gac aca ccg aaa cgg tcc cgc aga gat ttt ggc ctt gac tgt 816 Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys 260 265 270 gat gag cac tca acg gaa tcc cga tgt tgt cgc tac ccg ctg aca gtg 864 Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val 275 280 285 gat ttc gaa gct ttt gga tgg gac tgg att ata gca cct aaa aga tac 912 Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr 290 295 300 aaa gcc aat tac tgc tcc gga gaa tgc gaa ttt gtg ttt cta cag aaa 960 Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys 305 310 315 320 tac ccg cac act cac ctg gta cac caa gca aat ccc aga ggc tca gca 1008 Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala 325 330 335 ggc cct tgc tgc aca ccc acc aag atg tcc cct ata aac atg ctg tat 1056 Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr 340 345 350 ttc aat gga aaa gaa caa ata ata tat gga aag ata cca gcc atg gtt 1104 Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val 355 360 365 gta gat cgt tgc ggg tgc tca tga 1128 Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 370 375 <210> 8 <211> 374 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 8 Gln Lys Leu Ala Val Tyr Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Gln Ile Ala 1 5 10 15 Val Asp Pro Val Ala Leu Asp Gly Ser Ser Gln Pro Thr Glu Asn Ala 20 25 30 Glu Lys Asp Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr Lys 35 40 45 Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg 50 55 60 Leu Glu Gln Ala Pro Asn Ile Ser Arg Asp Val Ile Lys Gln Leu Leu 65 70 75 80 Pro Lys Ala Pro Pro Leu Gln Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val Gln 85 90 95 Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His Ala 100 105 110 Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu Val 115 120 125 Gln Met Glu Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser Lys 130 135 140 Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu Arg 145 150 155 160 Gln Val Gln Lys Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu Ile 165 170 175 Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu Lys 180 185 190 Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val Lys 195 200 205 Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly Ile 210 215 220 Glu Ile Lys Ala Phe Asp Glu Thr Gly Arg Asp Leu Ala Val Thr Phe 225 230 235 240 Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Arg Val 245 250 255 Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp 260 265 270 Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp 275 280 285 Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys 290 295 300 Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr 305 310 315 320 Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly 325 330 335 Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe 340 345 350 Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val Val 355 360 365 Asp Arg Cys Gly Cys Ser 370 <210> 9 <211> 1128 <212> DNA <213> Baboon <220> <221> CDS <222> (1)...(1125) <400> 9 atg caa aaa ctg caa ctc tgt gtt tat att tac ctg ttt atg ctg att 48 Met Gln Lys Leu Gln Leu Cys Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile 1 5 10 15 gtt gct ggt cca gtg gat cta aat gag aac agt gag caa aaa gaa aat 96 Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn 20 25 30 gtg gaa aaa gag ggg ctg tgt aat gca tgt act tgg aga caa aac act 144 Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr 35 40 45 aaa tct tca aga ata gaa gcc att aaa ata caa atc ctc agt aaa ctt 192 Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu 50 55 60 cgt ctg gaa aca gct cct aac atc agc aaa gat gct ata aga caa ctt 240 Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln Leu 65 70 75 80 tta ccc aaa gcg cct cca ctc cgg gaa ctg att gat cag tat gat gtc 288 Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val 85 90 95 cag agg gat gac agc agc gat ggc tct ttg gaa gat gac gat tat cac 336 Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His 100 105 110 gct aca acg gaa aca atc att acc atg cct aca gag tct gat ttt tta 384 Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu 115 120 125 atg caa gtg gat gga aaa ccc aaa tgt tgc ttc ttt aaa ttt agc tct 432 Met Gln Val Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser 130 135 140 aaa ata caa tac aat aaa gtg gta aag gcc caa cta tgg ata tat ttg 480 Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu 145 150 155 160 aga ccc gtc gag act cct aca aca gtg ttt gtg caa atc ctg aga ctc 528 Arg Pro Val Glu Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu 165 170 175 atc aaa cct atg aaa gac ggt aca agg tat act gga atc cga tct ctg 576 Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu 180 185 190 aaa ctt gac atg aac cca ggc act ggt att tgg cag agc att gat gtg 624 Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val 195 200 205 aag aca gtg ttg caa aat tgg ctc aaa caa cct gaa tcc aac tta ggc 672 Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly 210 215 220 att gaa ata aaa gct tta gat gag aat ggt cat gat ctt gct gta acc 720 Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr 225 230 235 240 ttc cca gga cca gga gaa gat ggg ctg aat ccc ttt tta gag gtc aag 768 Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys 245 250 255 gta aca gac aca ccc aaa aga tcc aga agg gat ttt ggt ctt gac tgt 816 Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys 260 265 270 gat gag cac tca aca gaa tcg cga tgc tgt cgt tac cct cta act gtg 864 Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val 275 280 285 gat ttt gaa gct ctt gga tgg gat tgg att atc gct cct aaa aga tat 912 Asp Phe Glu Ala Leu Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr 290 295 300 aag gcc aat tac tgc tct gga gag tgt gaa ttt gta ttt tta caa aaa 960 Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys 305 310 315 320 tat cct cat act cat ctg gta cac caa gca aac ccc aga ggt tca gca 1008 Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala 325 330 335 ggc cct tgc tgt act ccc aca aag atg tct cca att aat atg cta tat 1056 Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr 340 345 350 ttt aat ggc aaa gaa caa ata ata tat ggg aaa att cca gcc atg gta 1104 Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val 355 360 365 gta gac cgc tgc ggg tgc tca tga 1128 Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 370 375 <210> 10 <211> 375 <212> PRT <213> Baboon <400> 10 Met Gln Lys Leu Gln Leu Cys Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile 1 5 10 15 Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn 20 25 30 Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr 35 40 45 Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu 50 55 60 Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln Leu 65 70 75 80 Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val 85 90 95 Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His 100 105 110 Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu 115 120 125 Met Gln Val Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser 130 135 140 Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu 145 150 155 160 Arg Pro Val Glu Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu 165 170 175 Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu 180 185 190 Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val 195 200 205 Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly 210 215 220 Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr 225 230 235 240 Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys 245 250 255 Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys 260 265 270 Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val 275 280 285 Asp Phe Glu Ala Leu Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr 290 295 300 Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys 305 310 315 320 Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala 325 330 335 Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr 340 345 350 Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val 355 360 365 Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 370 375 <210> 11 <211> 1128 <212> DNA <213> Bovine <220> <221> CDS <222> (1)...(1125) <400> 11 atg caa aaa ctg caa atc tct gtt tat att tac cta ttt atg ctg att 48 Met Gln Lys Leu Gln Ile Ser Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile 1 5 10 15 gtt gct ggc cca gtg gat ctg aat gag aac agc gag cag aag gaa aat 96 Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn 20 25 30 gtg gaa aaa gag ggg ctg tgt aat gca tgt ttg tgg agg gaa aac act 144 Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Leu Trp Arg Glu Asn Thr 35 40 45 aca tcg tca aga cta gaa gcc ata aaa atc caa atc ctc agt aaa ctt 192 Thr Ser Ser Arg Leu Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu 50 55 60 cgc ctg gaa aca gct cct aac atc agc aaa gat gct atc aga caa ctt 240 Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln Leu 65 70 75 80 ttg ccc aag gct cct cca ctc ctg gaa ctg att gat cag ttc gat gtc 288 Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Leu Glu Leu Ile Asp Gln Phe Asp Val 85 90 95 cag aga gat gcc agc agt gac ggc tcc ttg gaa gac gat gac tac cac 336 Gln Arg Asp Ala Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His 100 105 110 gcc agg acg gaa acg gtc att acc atg ccc acg gag tct gat ctt cta 384 Ala Arg Thr Glu Thr Val Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Leu Leu 115 120 125 acg caa gtg gaa gga aaa ccc aaa tgt tgc ttc ttt aaa ttt agc tct 432 Thr Gln Val Glu Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser 130 135 140 aag ata caa tac aat aaa cta gta aag gcc caa ctg tgg ata tat ctg 480 Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Leu Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu 145 150 155 160 agg cct gtc aag act cct gcg aca gtg ttt gtg caa atc ctg aga ctc 528 Arg Pro Val Lys Thr Pro Ala Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu 165 170 175 atc aaa ccc atg aaa gac ggt aca agg tat act gga atc cga tct ctg 576 Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu 180 185 190 aaa ctt gac atg aac cca ggc act ggt att tgg cag agc att gat gtg 624 Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val 195 200 205 aag aca gtg ttg cag aac tgg ctc aaa caa cct gaa tcc aac tta ggc 672 Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly 210 215 220 att gaa atc aaa gct tta gat gag aat ggc cat gat ctt gct gta acc 720 Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr 225 230 235 240 ttc cca gaa cca gga gaa gat gga ctg act ccc ttt tta gaa gtc aag 768 Phe Pro Glu Pro Gly Glu Asp Gly Leu Thr Pro Phe Leu Glu Val 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Ile Pro Ala Met Val 355 360 365 gta gat cgc tgt ggg tgt tca tga 1128 Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 370 375 <210> 12 <211> 375 <212> PRT <213> Bovine <400> 12 Met Gln Lys Leu Gln Ile Ser Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile 1 5 10 15 Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn 20 25 30 Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Leu Trp Arg Glu Asn Thr 35 40 45 Thr Ser Ser Arg Leu Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu 50 55 60 Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln Leu 65 70 75 80 Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Leu Glu Leu Ile Asp Gln Phe Asp Val 85 90 95 Gln Arg Asp Ala Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His 100 105 110 Ala Arg Thr Glu Thr Val Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Leu Leu 115 120 125 Thr Gln Val Glu Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser 130 135 140 Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Leu Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu 145 150 155 160 Arg Pro Val Lys Thr Pro Ala Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu 165 170 175 Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu 180 185 190 Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val 195 200 205 Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly 210 215 220 Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr 225 230 235 240 Phe Pro Glu Pro Gly Glu Asp Gly Leu Thr Pro Phe Leu Glu Val Lys 245 250 255 Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys 260 265 270 Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val 275 280 285 Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr 290 295 300 Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys 305 310 315 320 Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala 325 330 335 Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr 340 345 350 Phe Asn Gly Glu Gly Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val 355 360 365 Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 370 375 <210> 13 <211> 1128 <212> DNA <213> Porcine <220> <221> CDS 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Glu Ser Asn Leu Gly 210 215 220 att gaa atc aaa gct tta gat gag aat ggt cat gat ctt gct gta acc 720 Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr 225 230 235 240 ttc cca gga cca gga gaa gat ggg ctg aat ccc ttt tta gaa gtc aag 768 Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys 245 250 255 gta aca gac aca cca aaa aga tcc agg aga gat ttt gga ctc gac tgt 816 Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys 260 265 270 gat gag cac tca aca gaa tct cga tgc tgt cgt tac cct cta act gtg 864 Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val 275 280 285 gat ttt gaa gct ttt gga tgg gac tgg att att gca ccc aaa aga tat 912 Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr 290 295 300 aag gcc aat tac tgc tct gga gag tgt gaa ttt gta ttt tta caa aaa 960 Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys 305 310 315 320 tac cct cac act cat ctt gtg cac caa gca aac ccc aga ggt tca gca 1008 Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala 325 330 335 ggc ccc tgc tgt act ccc aca aag atg tct cca atc aat atg cta tat 1056 Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr 340 345 350 ttt aat ggc aaa gaa caa ata ata tat ggg aaa att cca gcc atg gta 1104 Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val 355 360 365 gta gat cgc tgt ggg tgc tca tga 1128 Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 370 375 <210> 14 <211> 375 <212> PRT <213> Porcine <400> 14 Met Gln Lys Leu Gln Ile Tyr Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile 1 5 10 15 Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn 20 25 30 Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Met Trp Arg Gln Asn Thr 35 40 45 Lys Ser Ser Arg Leu Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu 50 55 60 Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln Leu 65 70 75 80 Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val 85 90 95 Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His 100 105 110 Ala Thr Thr Glu Thr 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Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala 325 330 335 Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr 340 345 350 Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val 355 360 365 Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 370 375 <210> 15 <211> 1128 <212> DNA <213> Ovine <220> <221> CDS <222> (1)...(1125) <400> 15 atg caa aaa ctg caa atc ttt gtt tat att tac cta ttt atg ctg ctt 48 Met Gln Lys Leu Gln Ile Phe Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Leu 1 5 10 15 gtt gct ggc cca gtg gat ctg aat gag aac agc gag cag aag gaa aat 96 Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn 20 25 30 gtg gaa aaa aag ggg ctg tgt aat gca tgc ttg tgg aga caa aac aat 144 Val Glu Lys Lys Gly Leu Cys Asn Ala Cys Leu Trp Arg Gln Asn Asn 35 40 45 aaa tcc tca aga cta gaa gcc ata aaa atc caa atc ctc agt aag ctt 192 Lys Ser Ser Arg Leu Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu 50 55 60 cgc ctg gaa aca gct cct aac atc agc aaa gat gct ata aga caa ctt 240 Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys 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Glu Lys Asp Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr 35 40 45 aaa tcc tcc aga ata gaa gcc ata aaa att caa atc ctc agc aaa ctg 192 Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu 50 55 60 cgc ctg gaa caa gca cct aac att agc agg gac gtt att aaa caa ctt 240 Arg Leu Glu Gln Ala Pro Asn Ile Ser Arg Asp Val Ile Lys Gln Leu 65 70 75 80 tta ccc aaa gct cct ccg ctg cag gaa ctg att gat cag tat gac gtc 288 Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Gln Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val 85 90 95 cag aga gac gac agt agc gat ggc tct ttg gaa gac gat gac tat cat 336 Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His 100 105 110 gcc aca acc gaa acg att atc aca atg cct acg gag tct gat ttt ctt 384 Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu 115 120 125 gta caa atg gag gga aaa cca aaa tgt tgc ttc ttt aag ttt agc tct 432 Val Gln Met Glu Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser 130 135 140 aaa ata caa tat aac aaa gta gta aag gca caa tta tgg ata tac ttg 480 Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu 145 150 155 160 agg caa gtc caa aaa cct aca acg gtg ttt gtg cag atc ctg aga ctc 528 Arg Gln Val Gln Lys Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu 165 170 175 att aaa ccc atg aaa gac ggt aca aga tat act gga att cga tct ttg 576 Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu 180 185 190 aaa ctt gac atg aac cca ggc act ggt atc tgg cag agt att gat gtg 624 Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val 195 200 205 aag aca gtg ttg caa aat tgg ctc aaa cag cct gaa tcc aat tta ggc 672 Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly 210 215 220 atc gaa ata aaa gct ttt gat gag aat gga cga gat ctt gct gta aca 720 Ile Glu Ile Lys Ala Phe Asp Glu Asn Gly Arg Asp Leu Ala Val Thr 225 230 235 240 ttc cca gga cca ggt gaa gat gga ctg aac cca ttt tta gag gtc aga 768 Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Arg 245 250 255 gtt aca gac aca cca aaa cgg tcc cgc aga gat ttt ggc ctt gac tgc 816 Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys 260 265 270 gac gag cac tca acg gaa tct cga tgt tgt cgc tac ccg ctg aca gtg 864 Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val 275 280 285 gat ttt gaa gct ttt gga tgg gac tgg att ata gca cct aaa aga tac 912 Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr 290 295 300 aaa gcc aat tac tgc tct gga gaa tgt gaa ttc gta ttt cta cag aaa 960 Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys 305 310 315 320 tac ccg cac act cac ctg gta cac caa gca aat cca aga ggc tca gca 1008 Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala 325 330 335 ggc cct tgc tgc aca ccc acc aag atg tcc cct ata aac atg ctg tat 1056 Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr 340 345 350 ttc aat gga aaa gaa caa ata ata tat gga aag ata cca gcc atg gtt 1104 Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val 355 360 365 gta gat cgt tgc ggg tgc tca tga 1128 Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 370 375 <210> 18 <211> 375 <212> PRT <213> Meleagris gallopavo <400> 18 Met Gln Lys Leu Ala Val Tyr Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Gln Ile 1 5 10 15 Leu Val His Pro Val Ala Leu Asp Gly Ser Ser Gln Pro Thr Glu Asn 20 25 30 Ala Glu Lys Asp Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr 35 40 45 Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu 50 55 60 Arg Leu Glu Gln Ala Pro Asn Ile Ser Arg Asp Val Ile Lys Gln Leu 65 70 75 80 Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Gln Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val 85 90 95 Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His 100 105 110 Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu 115 120 125 Val Gln Met Glu Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser 130 135 140 Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu 145 150 155 160 Arg Gln Val Gln Lys Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu 165 170 175 Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu 180 185 190 Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val 195 200 205 Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly 210 215 220 Ile Glu Ile Lys Ala Phe Asp Glu Asn Gly Arg Asp Leu Ala Val Thr 225 230 235 240 Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Arg 245 250 255 Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys 260 265 270 Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val 275 280 285 Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr 290 295 300 Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys 305 310 315 320 Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala 325 330 335 Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr 340 345 350 Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val 355 360 365 Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 370 375 <210> 19 <211> 1125 <212> DNA <213> Danio rerio <220> <221> CDS <222> (1)...(1122) <400> 19 atg cat ttt aca cag gtt tta att tct cta agt gta tta att gca tgt 48 Met His Phe Thr Gln Val Leu Ile Ser Leu Ser Val Leu Ile Ala Cys 1 5 10 15 ggt cca gtg ggt tat gga gat ata acg gcg cac cag cag cct tcc aca 96 Gly Pro Val Gly Tyr Gly Asp Ile Thr Ala His Gln Gln Pro Ser Thr 20 25 30 gcc acg gag gaa agc gag ctg tgt tcc aca tgt gag ttc aga caa cac 144 Ala Thr Glu Glu Ser Glu Leu Cys Ser Thr Cys Glu Phe Arg Gln His 35 40 45 agc aag ctg atg aga ctg cat gcc atc aag tcc caa att ctt agc aaa 192 Ser Lys Leu Met Arg Leu His Ala Ile Lys Ser Gln Ile Leu Ser Lys 50 55 60 ctc cga ctc aag cag gct cca aac atc agc cgg gac gtg gtc aag cag 240 Leu Arg Leu Lys Gln Ala Pro Asn Ile Ser Arg Asp Val Val Lys Gln 65 70 75 80 ctg tta ccc aaa gca ccg cct ttg caa caa ctt ctg gat cag tac gat 288 Leu Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Gln Gln Leu Leu Asp Gln Tyr Asp 85 90 95 gtt tta gga gat gac agt aag gat gga gct gtg gaa gag gac gat gaa 336 Val Leu Gly Asp Asp Ser Lys Asp Gly Ala Val Glu Glu Asp Asp Glu 100 105 110 cat gcc acc aca gag acc atc atg acc atg gcc aca gaa cct gac ccc 384 His Ala Thr Thr Glu Thr Ile Met Thr Met Ala Thr Glu Pro Asp Pro 115 120 125 att gtt caa gta gat cgg aaa ccg aag tgt tgc ttt ttc tcc ttc agt 432 Ile Val Gln Val Asp Arg Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Ser Phe Ser 130 135 140 ccg aag atc caa gcg aac cgg atc gta aga gcg cag ctc tgg gtt cat 480 Pro Lys Ile Gln Ala Asn Arg Ile Val Arg Ala Gln Leu Trp Val His 145 150 155 160 ctg aga ccg gcg gag gag gcg acc acc gtc ttc tta cag ata tct cgg 528 Leu Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Thr Val Phe Leu Gln Ile Ser Arg 165 170 175 ctg atg ccc gtt aag gac gga gga aga cac cga ata cga tcc ctg aaa 576 Leu Met Pro Val Lys Asp Gly Gly Arg His Arg Ile Arg Ser Leu Lys 180 185 190 atc gac gtg aac gca gga gtc acg tct tgg cag agt ata gac gta aag 624 Ile Asp Val Asn Ala Gly Val Thr Ser Trp Gln Ser Ile Asp Val Lys 195 200 205 cag gtg ctc acg gtg tgg tta aaa caa ccg gag acc aac cga ggc atc 672 Gln Val Leu Thr Val Trp Leu Lys Gln Pro Glu Thr Asn Arg Gly Ile 210 215 220 gag att aac gca tat gac gcg aag gga aac gac ttg gcc gtc act tca 720 Glu Ile Asn Ala Tyr Asp Ala Lys Gly Asn Asp Leu Ala Val Thr Ser 225 230 235 240 acc gag act ggg gag gat gga ctg ctc ccc ttt atg gag gtg aaa ata 768 Thr Glu Thr Gly Glu Asp Gly Leu Leu Pro Phe Met Glu Val Lys Ile 245 250 255 tca gag ggc cca aaa cga atc cgg agg gac tcc gga ctg gac tgc gat 816 Ser Glu Gly Pro Lys Arg Ile Arg Arg Asp Ser Gly Leu Asp Cys Asp 260 265 270 gag aat tcc tca gag tct cgc tgc tgc agg tac cct ctc act gtg gac 864 Glu Asn Ser Ser Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp 275 280 285 ttc gag gac ttt ggc tgg gac tgg att att gct cca aaa cgc tat aag 912 Phe Glu Asp Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys 290 295 300 gcg aat tac tgt tca gga gaa tgc gac tac atg tac ctg cag aag tat 960 Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Asp Tyr Met Tyr Leu Gln Lys Tyr 305 310 315 320 ccc cac acc cat ctg gtg aac aag gcc agt ccg aga gga acg gct ggg 1008 Pro His Thr His Leu Val Asn Lys Ala Ser Pro Arg Gly Thr Ala Gly 325 330 335 ccc tgc tgc act ccc acc aag atg tct ccc atc aac atg ctt tac ttt 1056 Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe 340 345 350 aac ggc aaa gag cag atc atc tac ggc aag atc cct tcg atg gta gta 1104 Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ser Met Val Val 355 360 365 gac cgc tgt ggc tgc tca tga 1125 Asp Arg Cys Gly Cys Ser 370 <210> 20 <211> 374 <212> PRT <213> Danio rerio <400> 20 Met His Phe Thr Gln Val Leu Ile Ser Leu Ser Val Leu Ile Ala Cys 1 5 10 15 Gly Pro Val Gly Tyr Gly Asp Ile Thr Ala His Gln Gln Pro Ser Thr 20 25 30 Ala Thr Glu Glu Ser Glu Leu Cys Ser Thr Cys Glu Phe Arg Gln His 35 40 45 Ser Lys Leu Met Arg Leu His Ala Ile Lys Ser Gln Ile Leu Ser Lys 50 55 60 Leu Arg Leu Lys Gln Ala Pro Asn Ile Ser Arg Asp Val Val Lys Gln 65 70 75 80 Leu Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Gln Gln Leu Leu Asp Gln Tyr Asp 85 90 95 Val Leu Gly Asp Asp Ser Lys Asp Gly Ala Val Glu Glu Asp Asp Glu 100 105 110 His Ala Thr Thr Glu Thr Ile Met Thr Met Ala Thr Glu Pro Asp Pro 115 120 125 Ile Val Gln Val Asp Arg Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Ser Phe Ser 130 135 140 Pro Lys Ile Gln Ala Asn Arg Ile Val Arg Ala Gln Leu Trp Val His 145 150 155 160 Leu Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Thr Val Phe Leu Gln Ile Ser Arg 165 170 175 Leu Met Pro Val Lys Asp Gly Gly Arg His Arg Ile Arg Ser Leu Lys 180 185 190 Ile Asp Val Asn Ala Gly Val Thr Ser Trp Gln Ser Ile Asp Val Lys 195 200 205 Gln Val Leu Thr Val Trp Leu Lys Gln Pro Glu Thr Asn Arg Gly Ile 210 215 220 Glu Ile Asn Ala Tyr Asp Ala Lys Gly Asn Asp Leu Ala Val Thr Ser 225 230 235 240 Thr Glu Thr Gly Glu Asp Gly Leu Leu Pro Phe Met Glu Val Lys Ile 245 250 255 Ser Glu Gly Pro Lys Arg Ile Arg Arg Asp Ser Gly Leu Asp Cys Asp 260 265 270 Glu Asn Ser Ser Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp 275 280 285 Phe Glu Asp Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys 290 295 300 Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Asp Tyr Met Tyr Leu Gln Lys Tyr 305 310 315 320 Pro His Thr His Leu Val Asn Lys Ala Ser Pro Arg Gly Thr Ala Gly 325 330 335 Pro Cys 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gcg gcg 152 Leu Arg Pro Arg Gly Glu Ala Ala Glu Gly Pro Ala Ala Ala Ala Ala 20 25 30 gcg gcg gcg gcg gcg gca gcg gcg ggg gtc ggg ggg gag cgc tcc agc 200 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Val Gly Gly Glu Arg Ser Ser 35 40 45 cgg cca gcc ccg tcc gtg gcg ccc gag ccg gac ggc tgc ccc gtg tgc 248 Arg Pro Ala Pro Ser Val Ala Pro Glu Pro Asp Gly Cys Pro Val Cys 50 55 60 65 gtt tgg cgg cag cac agc cgc gag ctg cgc cta gag agc atc aag tcg 296 Val Trp Arg Gln His Ser Arg Glu Leu Arg Leu Glu Ser Ile Lys Ser 70 75 80 cag atc ttg agc aaa ctg cgg ctc aag gag gcg ccc aac atc agc cgc 344 Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Lys Glu Ala Pro Asn Ile Ser Arg 85 90 95 gag gtg gtg aag cag ctg ctg ccc aag gcg ccg ccg ctg cag cag atc 392 Glu Val Val Lys Gln Leu Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Gln Gln Ile 100 105 110 ctg gac cta cac gac ttc cag ggc gac gcg ctg cag ccc gag gac ttc 440 Leu Asp Leu His Asp Phe Gln Gly Asp Ala Leu Gln Pro Glu Asp Phe 115 120 125 ctg gag gag gac gag tac cac gcc acc acc gag acc gtc att agc atg 488 Leu Glu Glu Asp Glu Tyr His Ala Thr Thr Glu Thr Val Ile Ser Met 130 135 140 145 gcc cag gag acg gac cca gca gta cag aca gat ggc agc cct ctc tgc 536 Ala Gln Glu Thr Asp Pro Ala Val Gln Thr Asp Gly Ser Pro Leu Cys 150 155 160 tgc cat ttt cac ttc agc ccc aag gtg atg ttc aca aag gta ctg aag 584 Cys His Phe His Phe Ser Pro Lys Val Met Phe Thr Lys Val Leu Lys 165 170 175 gcc cag ctg tgg gtg tac cta cgg cct gta ccc cgc cca gcc aca gtc 632 Ala Gln Leu Trp Val Tyr Leu Arg Pro Val Pro Arg Pro Ala Thr Val 180 185 190 tac ctg cag atc ttg cga cta aaa ccc cta act ggg gaa ggg acc gca 680 Tyr Leu Gln Ile Leu Arg Leu Lys Pro Leu Thr Gly Glu Gly Thr Ala 195 200 205 ggg gga ggg ggc gga ggc cgg cgt cac atc cgt atc cgc tca ctg aag 728 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Arg His Ile Arg Ile Arg Ser Leu Lys 210 215 220 225 att gag ctg cac tca cgc tca ggc cat tgg cag agc atc gac ttc aag 776 Ile Glu Leu His Ser Arg Ser Gly His Trp Gln Ser Ile Asp Phe Lys 230 235 240 caa gtg cta cac agc tgg ttc cgc cag cca cag agc aac tgg ggc atc 824 Gln Val Leu His Ser Trp Phe Arg Gln Pro Gln Ser Asn Trp Gly Ile 245 250 255 gag atc aac gcc ttt gat ccc agt ggc aca gac ctg gct gtc acc tcc 872 Glu Ile Asn Ala Phe Asp Pro Ser Gly Thr Asp Leu Ala Val Thr Ser 260 265 270 ctg ggg ccg gga gcc gag ggg ctg cat cca ttc atg gag ctt cga gtc 920 Leu Gly Pro Gly Ala Glu Gly Leu His Pro Phe Met Glu Leu Arg Val 275 280 285 cta gag aac aca aaa cgt tcc cgg cgg aac ctg ggt ctg gac tgc gac 968 Leu Glu Asn Thr Lys Arg Ser Arg Arg Asn Leu Gly Leu Asp Cys Asp 290 295 300 305 gag cac tca agc gag tcc cgc tgc tgc cga tat ccc ctc aca gtg gac 1016 Glu His Ser Ser Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp 310 315 320 ttt gag gct ttc ggc tgg gac tgg atc atc gca cct aag cgc tac aag 1064 Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys 325 330 335 gcc aac tac tgc tcc ggc cag tgc gag tac atg ttc atg caa aaa tat 1112 Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Gln Cys Glu Tyr Met Phe Met Gln Lys Tyr 340 345 350 ccg cat acc cat ttg gtg cag cag gcc aat cca aga ggc tct gct ggg 1160 Pro His Thr His Leu Val Gln Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly 355 360 365 ccc tgt tgt acc ccc acc aag atg tcc cca atc aac atg ctc tac ttc 1208 Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe 370 375 380 385 aat gac aag cag cag att atc tac ggc aag atc cct ggc atg gtg gtg 1256 Asn Asp Lys Gln Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Gly Met Val Val 390 395 400 gat cgc tgt ggc tgc tct taagtgggtc actacaagct gctggagcaa 1304 Asp Arg Cys Gly Cys Ser 405 agacttggtg ggtgggtaac ttaacctctt cacagaggat aaaaaatgct tgtgagtatg 1364 acagaaggga ataaacaggc ttaaagggt 1393 <210> 25 <211> 407 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Met Val Leu Ala Ala Pro Leu Leu Leu Gly Phe Leu Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 Glu Leu Arg Pro Arg Gly Glu Ala Ala Glu Gly Pro Ala Ala Ala Ala 20 25 30 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Val Gly Gly Glu Arg Ser 35 40 45 Ser Arg Pro Ala Pro Ser Val Ala Pro Glu Pro Asp Gly Cys Pro Val 50 55 60 Cys Val Trp Arg Gln His Ser Arg Glu Leu 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gag ggc ccg aag cgc tcc agg 143 Gln Pro Phe Met Glu Val Thr Ile Ser Glu Gly Pro Lys Arg Ser Arg 35 40 45 aga gac tcg ggc ctg gac tgt gac gag aac tcc ccc gag tcc cgc tgt 191 Arg Asp Ser Gly Leu Asp Cys Asp Glu Asn Ser Pro Glu Ser Arg Cys 50 55 60 tgc cgc tac ccc ctc acg gta gac ttt gaa gac ttt ggc tgg gac tgg 239 Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Asp Phe Gly Trp Asp Trp 65 70 75 att att gcc ccc aag cgc tac aag gcc aac tac tgc tct ggt gag tgt 287 Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys 80 85 90 95 gag tac atg cac ctg cag aag tac ccc cac acc cac ctg gtg aac aag 335 Glu Tyr Met His Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val Asn Lys 100 105 110 gct aac cct cgc ggc acc gca ggg ccc tgc tgc acc ccc acc aag atg 383 Ala Asn Pro Arg Gly Thr Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met 115 120 125 tcc ccc atc aac atg ctc tac ttc aac cgc aaa gag cag atc atc tac 431 Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Arg Lys Glu Gln Ile Ile Tyr 130 135 140 ggc aag atc ccc tcc atg gtg gtg gac cgt tgc gga tgc tcg 473 Gly Lys Ile Pro Ser Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 145 150 155 tga 476 <210> 27 <211> 157 <212> PRT <213> Salmon-1 <400> 27 Gln Pro Glu Thr Asn Trp Gly Ile Glu Ile Asn Ala Phe Asp Ser Lys 1 5 10 15 Gly Asn Asp Leu Ala Val Thr Ser Ala Glu Ala Gly Glu Gly Leu Gln 20 25 30 Pro Phe Met Glu Val Thr Ile Ser Glu Gly Pro Lys Arg Ser Arg Arg 35 40 45 Asp Ser Gly Leu Asp Cys Asp Glu Asn Ser Pro Glu Ser Arg Cys Cys 50 55 60 Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Asp Phe Gly Trp Asp Trp Ile 65 70 75 80 Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu 85 90 95 Tyr Met His Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val Asn Lys Ala 100 105 110 Asn Pro Arg Gly Thr Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser 115 120 125 Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Arg Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly 130 135 140 Lys Ile Pro Ser Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 145 150 155 <210> 28 <211> 412 <212> DNA <213> Salmon-2 <220> <221> CDS <222> (2)...(409) <400> 28 g gtt acc tca act gaa gcc gga gaa gga ctg caa ccc ttc atg gag gtg 49 Val Thr Ser Thr Glu Ala Gly Glu Gly Leu Gln Pro Phe Met Glu Val 1 5 10 15 aag att tcg gag ggc ccg aag cgc tcc agg aga gat tcg ggc ctg gac 97 Lys Ile Ser Glu Gly Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Ser Gly Leu Asp 20 25 30 tgt gat gag aac tcc ccc gag tcc cgc tgc tgc cgg tac ccc ctc acg 145 Cys Asp Glu Asn Ser Pro Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr 35 40 45 gtg gac ttt gaa gac ttt ggc tgg gac tgg att att gcc ccc aag cgc 193 Val Asp Phe Glu Asp Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg 50 55 60 tac aag gcc aac tac tgc tct ggt gag tgc gag tac atg cac ctg cag 241 Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Tyr Met His Leu Gln 65 70 75 80 aag tac ccc cac acc cac ctg gtg aac aag gct aac cct cgc ggc acc 289 Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val Asn Lys Ala Asn Pro Arg Gly Thr 85 90 95 gcg ggg ccc tgc tgc acc ccc acc aag atg tcc ccc atc aac atg ctc 337 Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu 100 105 110 tac ttc aac cgc aaa gag cag atc atc tac ggc aag atc ccc tcc atg 385 Tyr Phe Asn Arg Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ser Met 115 120 125 gtg gtg gac cgc tgc ggc tgc tcg tga 412 Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 130 135 <210> 29 <211> 136 <212> PRT <213> Salmon-2 <400> 29 Val Thr Ser Thr Glu Ala Gly Glu Gly Leu Gln Pro Phe Met Glu Val 1 5 10 15 Lys Ile Ser Glu Gly Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Ser Gly Leu Asp 20 25 30 Cys Asp Glu Asn Ser Pro Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr 35 40 45 Val Asp Phe Glu Asp Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg 50 55 60 Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Tyr Met His Leu Gln 65 70 75 80 Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val Asn Lys Ala Asn Pro Arg Gly Thr 85 90 95 Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu 100 105 110 Tyr Phe Asn Arg Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ser Met 115 120 125 Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 130 135

Claims (27)

  1. 액티빈 수용체 IIB형(ActRIIB)의 세포외 도메인을 포함하는 ActRIIB 폴리펩티드의 치료적 유효량을 포함하는 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, ActRIIB 폴리펩티드는 성장분화인자-8(GDF-8) 활성을 조절할 수 있는 것인 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 경구 또는 비경구 투여를 위해 제제화되는 것인 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서, ActRIIB 폴리펩티드는 1×10-6M 이상의 해리 상수(Kd)로 GDF-8에 결합하는 것인 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서, ActRIIB 폴리펩티드는 1×10-7M 이상의 해리 상수(Kd)로 GDF-8에 결합하는 것인 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서, ActRIIB 폴리펩티드는 1×10-8M 이상의 해리 상수(Kd)로 GDF-8에 결합하는 것인 약학 조성물.
  7. 제1항에 있어서, ActRIIB 폴리펩티드는 1×10-9M 이상의 해리 상수(Kd)로 GDF-8에 결합하는 것인 약학 조성물.
  8. 제1항에 있어서, ActRIIB 폴리펩티드는 1×10-10M 이상의 해리 상수(Kd)로 GDF-8에 결합하는 것인 약학 조성물.
  9. 액티빈 수용체 IIB형(ActRIIB)의 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서의 근육량 증가 방법.
  10. 제9항에 있어서, 포유동물은 근육 질환 및 신경근육 질환 중 선택된 질환 또는 질병을 겪는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 질환 또는 질병은 근육 질환인 것인 방법
  12. 제11항에 있어서, 근육 질환은 근육 발생장애(muscular dystrophy), 근위축증(muscle atrophy) 및 근육 소모성 질환 중 하나 이상에서 선택되는 것인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 근육 질환은 근육 발생장애인 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 근육 발생장애는 뒤센형(Duchenne) 근육 발생장애인 것인 방법.
  15. 제11항에 있어서, 근육 질환은 근위축증인 것인 방법.
  16. 제11항에 있어서, 근육 질환은 근육 소모성 질환인 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 근육 소모성 질환은 악액질인 것인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 근육 소모성 질환은 식욕부진인 것인 방법.
  19. 제10항에 있어서, 질환 또는 질병은 신경근육 질환인 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 신경근육 질환은 근위축성 측삭 경화증(ALS)인 것인 방법.
  21. 제9항에 있어서, 포유동물은 인간인 것인 방법.
  22. 제9항에 있어서, ActRIIB 폴리펩티드는 성장분화인자-8(GDF-8)에 결합할 수 있고 GDF-8 활성을 저해할 수 있는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, ActRIIB 폴리펩티드는 1×10-6M 이상의 해리 상수(Kd)로 GDF-8에 결합하는 것인 방법.
  24. 제22항에 있어서, ActRIIB 폴리펩티드는 1×10-7M 이상의 해리 상수(Kd)로 GDF-8에 결합하는 것인 방법.
  25. 제22항에 있어서, ActRIIB 폴리펩티드는 1×10-8M 이상의 해리 상수(Kd)로 GDF-8에 결합하는 것인 방법.
  26. 제22항에 있어서, ActRIIB 폴리펩티드는 1×10-9M 이상의 해리 상수(Kd)로 GDF-8에 결합하는 것인 방법.
  27. 제22항에 있어서, ActRIIB 폴리펩티드는 1×10-10M 이상의 해리 상수(Kd)로 GDF-8에 결합하는 것인 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019039630A1 (ko) * 2017-08-22 2019-02-28 주식회사 진셀팜 폴리스타틴 유래 생리활성 펩타이드, 및 이의 용도

Families Citing this family (92)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7566768B1 (en) 1995-10-26 2009-07-28 The Johns Hopkins University School Of Medicine Promyostatin peptides and methods of using same
US7393682B1 (en) * 1993-03-19 2008-07-01 The Johns Hopkins University School Of Medicine Polynucleotides encoding promyostatin polypeptides
US6891082B2 (en) 1997-08-01 2005-05-10 The Johns Hopkins University School Of Medicine Transgenic non-human animals expressing a truncated activintype II receptor
US6656475B1 (en) * 1997-08-01 2003-12-02 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor receptors, agonists and antagonists thereof, and methods of using same
TW200526779A (en) * 2001-02-08 2005-08-16 Wyeth Corp Modified and stabilized GDF propeptides and uses thereof
AU2002336517B2 (en) * 2001-09-13 2008-09-11 California Institute Of Technology Method for producing transgenic animals
US7320789B2 (en) 2001-09-26 2008-01-22 Wyeth Antibody inhibitors of GDF-8 and uses thereof
CA2476654A1 (en) * 2002-02-21 2003-09-04 Wyeth Follistatin domain containing proteins
AU2003267246A1 (en) * 2002-09-16 2004-04-30 The Johns Hopkins University Metalloprotease activation of myostatin, and methods of modulating myostatin activity
US7261893B2 (en) 2002-10-22 2007-08-28 Wyeth Neutralizing antibodies against GDF-8 and uses therefor
US20040223966A1 (en) * 2002-10-25 2004-11-11 Wolfman Neil M. ActRIIB fusion polypeptides and uses therefor
AR042545A1 (es) * 2002-12-20 2005-06-22 Amgen Inc Agentes ligantes que inhiben la miostatina
MXPA05012965A (es) * 2003-06-02 2006-03-09 Wyeth Corp Uso de inhibidores de miostatina (gdf8) en conjuncion con corticoesteroides para el tratamiento de desordenes neuromusculares y composiciones farmaceuticas para ello.
WO2005025601A1 (en) * 2003-09-15 2005-03-24 Monash University Follistatin isoforms and uses thereof
US7246056B1 (en) * 2003-09-26 2007-07-17 The Mathworks, Inc. Runtime parameter mapping for system simulation
WO2005084699A1 (en) * 2004-03-02 2005-09-15 Acceleron Pharma Inc. Alk7 and myostatin inhibitors and uses thereof
JP4688483B2 (ja) * 2004-04-15 2011-05-25 株式会社テクノネットワーク四国 フォリスタチン変異体ポリペプチド
ES2426005T3 (es) * 2004-07-23 2013-10-18 Acceleron Pharma Inc. Polipéptidos del receptor ACTRII, procedimientos y composiciones
CA2601667A1 (en) * 2005-03-23 2006-09-28 Wyeth Detection of gdf-8 modulating agents
SI2407486T1 (en) 2005-08-19 2018-04-30 Wyeth Llc Antagonist antibodies against GDF-8 and use in the treatment of ALS and other disorders associated with GDF-8
CN100380118C (zh) * 2005-09-07 2008-04-09 集美大学 鲍鱼种类鉴别方法
US8067562B2 (en) * 2005-11-01 2011-11-29 Amgen Inc. Isolated nucleic acid molecule comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1
US8128933B2 (en) 2005-11-23 2012-03-06 Acceleron Pharma, Inc. Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody
KR20180030264A (ko) 2005-11-23 2018-03-21 악셀레론 파마 인코포레이티드 액티빈-ａｃｔｒⅱａ 길항제 및 골 성장을 촉진하기 위한 이들의 용도
AU2006321906C1 (en) * 2005-12-06 2014-01-16 Amgen Inc. Uses of myostatin antagonists
CN100347298C (zh) * 2005-12-30 2007-11-07 中国水产科学研究院黄海水产研究所 鱼类肌肉生长抑素mstn基因克隆及其基因打靶载体构建
AU2007221177A1 (en) * 2006-02-28 2007-09-07 Trustees Of Boston University Methods to identify factors associated with muscle growth and uses thereof
US20070275036A1 (en) * 2006-05-18 2007-11-29 Celldyne Biopharma, Llc Avian follistatin product
US7663019B2 (en) * 2006-05-24 2010-02-16 North Carolina State University Transgenic snakes and methods of making
US8895016B2 (en) * 2006-12-18 2014-11-25 Acceleron Pharma, Inc. Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels
US20100028332A1 (en) * 2006-12-18 2010-02-04 Acceleron Pharma Inc. Antagonists of actriib and uses for increasing red blood cell levels
KR102223231B1 (ko) * 2006-12-18 2021-03-08 악셀레론 파마 인코포레이티드 액티빈-ａｃｔｒｉｉ 길항물질과 적혈구 수준을 증가시키기 위한 이의 용도
RU2473362C2 (ru) * 2007-02-01 2013-01-27 Акселерон Фарма Инк. АНТАГОНИСТЫ АКТИВИНА-ActRIIa-Fc И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
TWI782836B (zh) 2007-02-02 2022-11-01 美商艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ActRIIB的變體與其用途
EA018221B1 (ru) 2007-02-09 2013-06-28 Акселерон Фарма Инк. АНТАГОНИСТЫ АКТИВИНА-ActRIIa И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА КОСТИ У БОЛЬНЫХ РАКОМ
US8501678B2 (en) 2007-03-06 2013-08-06 Atara Biotherapeutics, Inc. Variant activin receptor polypeptides and uses thereof
TW201718635A (zh) * 2007-03-06 2017-06-01 安美基公司 變異之活動素受體多肽及其用途
WO2008109779A2 (en) * 2007-03-07 2008-09-12 The Johns Hopkins University Use of follistatin-like related gene (flrg) to increase muscle mass
ES2617957T3 (es) 2007-08-03 2017-06-20 Summit (Oxford) Limited Combinaciones farmacológicas para el tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne
GB0715087D0 (en) 2007-08-03 2007-09-12 Summit Corp Plc Drug combinations for the treatment of duchenne muscular dystrophy
CN107412734A (zh) 2007-09-18 2017-12-01 阿塞勒隆制药公司 活化素‑actriia拮抗剂和减少或抑制fsh分泌的用途
WO2009111793A2 (en) * 2008-03-07 2009-09-11 Myoscience, Inc. Subdermal tissue remodeling using myostatin, methods and related systems
NZ590327A (en) 2008-06-26 2013-12-20 Acceleron Pharma Inc Methods for dosing an activin-actriia antagonist and monitoring of treated patients
DK3494986T3 (da) 2008-08-14 2020-08-03 Acceleron Pharma Inc GDF fanger
US8216997B2 (en) 2008-08-14 2012-07-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators
KR101778134B1 (ko) 2008-11-26 2017-09-13 암젠 인크 액티빈 ｉｉｂ 수용체 폴리펩타이드의 변이체 및 이의 용도
CA2749544A1 (en) 2009-01-13 2010-07-22 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing adiponectin
EA027071B1 (ru) * 2009-04-27 2017-06-30 Новартис Аг АНТИТЕЛО К ActRIIB И СОДЕРЖАЩАЯ ЕГО КОМПОЗИЦИЯ
WO2010134686A2 (ko) * 2009-05-20 2010-11-25 강릉원주대학교산학협력단 마이오스타틴 억제 활성을 갖는 가용성 마이오스타틴 프로도메인 재조합 단백질 및 그의 용도
EP3845239A1 (en) * 2009-06-08 2021-07-07 Acceleron Pharma Inc. Use of anti-actriib proteins for increasing thermogenic adipocytes
CN107267520A (zh) 2009-06-12 2017-10-20 阿塞勒隆制药公司 截短的actriib‑fc融合蛋白
EP2475427B1 (en) * 2009-09-09 2016-11-30 Acceleron Pharma, Inc. Actriib antagonists and dosing and uses thereof
CA2779472C (en) 2009-11-03 2021-03-16 Acceleron Pharma Inc. The use of a composition comprising an activin type iib receptor polypeptide in the treatment of fatty liver disease
EP2323133B1 (en) 2009-11-16 2015-10-14 Sony Corporation Disc cartridge
AU2010322011B2 (en) * 2009-11-17 2016-03-31 Acceleron Pharma Inc. ActRIIB proteins and variants and uses therefore relating to utrophin induction for muscular dystrophy therapy
US20150359850A1 (en) 2009-11-25 2015-12-17 Santa Maria Biotherapeutics, Inc. Administration of an anti-activin-a compound to a subject
WO2011102483A1 (ja) * 2010-02-19 2011-08-25 独立行政法人理化学研究所 ヒトTGF-βのLAPに結合する抗体
JP6105838B2 (ja) * 2010-08-24 2017-03-29 国立大学法人 岡山大学 疼痛の治療剤
EP2618829B1 (en) 2010-09-22 2019-05-01 The Regents of the University of Colorado, a body corporate Smad7 for use in the treatment of oral mucositis or psoriasis
CA2817008A1 (en) 2010-11-08 2012-05-18 Acceleron Pharma Inc. Actriia binding agents and uses thereof
CN102648977B (zh) * 2011-02-25 2014-12-10 中国科学院上海生命科学研究院 滤泡素抑制素样蛋白1在调节钠钾atp酶活性中的用途
EP2793925B1 (en) 2011-12-19 2019-03-20 Amgen Inc. Variant activin receptor polypeptides, alone or in combination with chemotherapy, and uses thereof
CA2863964C (en) * 2012-02-07 2021-10-26 Global Bio Therapeutics Usa, Inc. Compartmentalized method of nucleic acid delivery and compositions and uses thereof
WO2013149258A2 (en) 2012-03-30 2013-10-03 Charles Drew University of Medicine and Science Compositions and methods for treating or preventing metabolic syndrome disorders
CN104487453B (zh) 2012-06-15 2018-09-28 辉瑞公司 经改良的抗gdf-8的拮抗剂抗体及其用途
WO2014039189A1 (en) 2012-08-01 2014-03-13 Mcnally Elizabeth Mitigating tissue damage and fibrosis via latent transforming growth factor beta binding protein (ltbp4)
EP3608419A1 (en) * 2012-10-24 2020-02-12 Celgene Corporation Biomarker for use in treating anemia
NZ707477A (en) 2012-11-02 2019-09-27 Celgene Corp Activin-actrii antagonists and uses for treating bone and other disorders
US10456448B2 (en) 2013-03-08 2019-10-29 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate PTD-SMAD7 therapeutics
SG10201800800YA (en) * 2013-05-06 2018-03-28 Scholar Rock Inc Compositions and methods for growth factor modulation
US10010498B2 (en) 2014-06-04 2018-07-03 Acceleron Pharma Inc. Methods for treatment of amyotrophic lateral sclerosis with follistatin fusion proteins
US10023621B2 (en) 2014-06-04 2018-07-17 Acceleron Pharma Inc. Follistatin-related fusion proteins
EP3154566B1 (en) 2014-06-13 2022-08-03 Acceleron Pharma Inc. Actrii antagonist for the treatment or prevention of a cutaneous ulcer in a subject that has anemia
MA41052A (fr) 2014-10-09 2017-08-15 Celgene Corp Traitement d'une maladie cardiovasculaire à l'aide de pièges de ligands d'actrii
AU2015342936B2 (en) 2014-11-06 2020-10-08 Scholar Rock, Inc. Anti-pro/latent-Myostatin antibodies and uses thereof
EP3227675B1 (en) 2014-12-03 2023-03-15 Celgene Corporation Activin-actrii antagonists and uses for treating myelodysplastic syndrome
WO2016115345A1 (en) 2015-01-14 2016-07-21 The Brigham And Women's Hospital, Treatment of cancer with anti-lap monoclonal antibodies
JP2018510637A (ja) 2015-03-26 2018-04-19 アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド フォリスタチン関連融合タンパク質およびその使用
MX2017013520A (es) 2015-04-22 2018-05-22 Alivegen Usa Inc Nuevas proteinas hibridas de bloqueo del ligando actriib para tratar enfermedades de atrofia muscular.
EP3350220B1 (en) 2015-09-15 2021-05-19 Scholar Rock, Inc. Anti-pro/latent-myostatin antibodies and uses thereof
CN105372276B (zh) * 2015-11-24 2017-09-29 大连工业大学 一种海参加热过程中质构品质无损检测方法
WO2017156488A2 (en) 2016-03-10 2017-09-14 Acceleron Pharma, Inc. Activin type 2 receptor binding proteins and uses thereof
ES2944357T3 (es) 2017-01-06 2023-06-20 Scholar Rock Inc Tratamiento de enfermedades metabólicas inhibiendo la activación de miostatina
LT3609431T (lt) 2017-04-13 2021-11-25 N.R Soos Technology Ltd. Įrenginiai ir būdai, skatinantys patelių embrionų gavybą kiaušiniuose
WO2019075090A1 (en) 2017-10-10 2019-04-18 Tilos Therapeutics, Inc. ANTI-LAP ANTIBODIES AND USES THEREOF
WO2019129768A1 (en) * 2017-12-29 2019-07-04 Anagenesis Biotechnologies S.A.S. Method for preparing bap or ba cells
CN109006709A (zh) * 2018-08-17 2018-12-18 孟维巍 一种紧凑式蜚蠊养殖系统
US11130802B2 (en) 2018-10-10 2021-09-28 Tilos Therapeutics, Inc. Anti-lap antibody variants
CA3124415A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Northwestern University Use of annexins in preventing and treating muscle membrane injury
WO2020139977A1 (en) 2018-12-26 2020-07-02 Northwestern University Use of glucocorticoid steroids in preventing and treating conditions of muscle wasting, aging and metabolic disorder
CN110438154A (zh) * 2019-08-10 2019-11-12 湖南文理学院 一种基于转基因增加鲫鱼生长速度的方法
CN112088804B (zh) * 2020-10-13 2021-12-21 四川省旺达饲料有限公司 一种根据家禽体型自动定量出料的饲料投喂装置

Family Cites Families (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4036945A (en) 1976-05-03 1977-07-19 The Massachusetts General Hospital Composition and method for determining the size and location of myocardial infarcts
US4331647A (en) 1980-03-03 1982-05-25 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibody fragments specific to tumor-associated markers
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US5206347A (en) 1985-08-06 1993-04-27 La Jolla Cancer Research Foundation Isolation and use of receptors binding to a peptide column
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5011912A (en) 1986-12-19 1991-04-30 Immunex Corporation Hybridoma and monoclonal antibody for use in an immunoaffinity purification system
US5162215A (en) 1988-09-22 1992-11-10 Amgen Inc. Method of gene transfer into chickens and other avian species
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US6218596B1 (en) 1989-06-30 2001-04-17 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Enhancement of musculature in non-human mammals expressing c-ski
US5225212A (en) 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
US5283173A (en) 1990-01-24 1994-02-01 The Research Foundation Of State University Of New York System to detect protein-protein interactions
EP0438803B1 (en) 1990-01-26 1997-03-12 Immunomedics, Inc. Vaccines against cancer and infectious diseases
US5265030A (en) 1990-04-24 1993-11-23 Scripps Clinic And Research Foundation System and method for determining three-dimensional structures of proteins
US5750342A (en) 1990-06-11 1998-05-12 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligands of tissue target
US5264563A (en) 1990-08-24 1993-11-23 Ixsys Inc. Process for synthesizing oligonucleotides with random codons
US5314695A (en) 1990-11-13 1994-05-24 Corvas International, Inc. Tissue factor based prothrombin time reagent
US6162896A (en) * 1991-05-10 2000-12-19 The Salk Institute For Biological Studies Recombinant vertebrate activin receptors
US5885794A (en) 1991-05-10 1999-03-23 The Salk Institute For Biological Studies Recombinant production of vertebrate activin receptor polypeptides and identification of receptor DNAs in the activin/TGF-β superfamily
AU2408292A (en) 1991-07-11 1993-02-11 Regents Of The University Of California, The A method to identify protein sequences that fold into a known three-dimensional structure
US5395619A (en) 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
DE69432815T2 (de) 1993-03-19 2003-12-11 Univ Johns Hopkins Med Wachstumsfaktor-8
US6465239B1 (en) 1993-03-19 2002-10-15 The John Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8 nucleic acid and polypeptides from aquatic species and non-human transgenic aquatic species
US5994618A (en) 1997-02-05 1999-11-30 Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8 transgenic mice
BR9406715A (pt) * 1993-05-12 1996-02-06 Genetics Inst Molécula de DNA isolada célula hospedeira vetor método para produzir uma proteina (BMP-11) polipeptideo de proteina-11 morfogenética de osso purificada (BMP-11) e molécula de DNA quimérica
DK0776337T3 (da) * 1994-07-08 2005-12-12 Univ Johns Hopkins Med Vækstdifferentieringsfaktor-11
US6008434A (en) 1994-07-08 1999-12-28 Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-11 transgenic mice
US5734039A (en) 1994-09-15 1998-03-31 Thomas Jefferson University Antisense oligonucleotides targeting cooperating oncogenes
US5545616A (en) * 1994-09-22 1996-08-13 Genentech, Inc. Method for predicting and/or preventing preterm labor
US5998698A (en) 1995-06-07 1999-12-07 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Transgenic fish capable of expressing exogenous lytic peptides
US5622699A (en) 1995-09-11 1997-04-22 La Jolla Cancer Research Foundation Method of identifying molecules that home to a selected organ in vivo
AU7271996A (en) * 1995-10-23 1997-05-15 Queen's University At Kingston Method and pharmaceutical composition for chondrostimulation with a prostaglandin (e.g. misoprostol) and tgf-beta, optionally in combination with igf-1
DE19626982C1 (de) 1996-07-04 1997-09-25 Siemens Ag Elektromagnetisches Relais und Verfahren zu dessen Herstellung
US5776689A (en) 1996-07-19 1998-07-07 The Regents Of The University Of California Protein recruitment system
DE69739375D1 (de) * 1996-11-27 2009-06-04 Immunex Corp Verfahren zur regulierung der stickstoffmonoxid-erzeugung
WO1998033887A1 (en) 1997-02-05 1998-08-06 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8
US5827533A (en) 1997-02-06 1998-10-27 Duke University Liposomes containing active agents aggregated with lipid surfactants
WO1998052038A1 (en) * 1997-05-16 1998-11-19 The Procter & Gamble Company The use of a bone morphogenetic protein (bmp) receptor complex for screening
US5933819C1 (en) 1997-05-23 2001-11-13 Scripps Research Inst Prediction of relative binding motifs of biologically active peptides and peptide mimetics
ATE359298T1 (de) * 1997-05-30 2007-05-15 Stefan Weiss Löslicher laminin rezeptor vorläufer und verfahren zur verhinderung von laminins interaktionen
DE69838334T2 (de) * 1997-06-18 2008-06-12 Merck & Co., Inc. (A New Jersey Corp.) Kdr, ein menschlicher tyrosin kinase rezeptor
AU8666398A (en) 1997-08-01 1999-02-22 Johns Hopkins University School Of Medicine, The Methods to identify growth differentiation factor (gdf) receptors
US6656475B1 (en) * 1997-08-01 2003-12-02 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor receptors, agonists and antagonists thereof, and methods of using same
US6891082B2 (en) 1997-08-01 2005-05-10 The Johns Hopkins University School Of Medicine Transgenic non-human animals expressing a truncated activintype II receptor
US6372454B2 (en) * 1997-08-29 2002-04-16 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acid molecules encoding Follistatin-3
EP1009424A2 (en) * 1997-08-29 2000-06-21 Ontogeny, Inc. Regulation of muscle tissues by hedgehog-like polypeptides, and formulations and uses related thereto
US5885779A (en) 1997-09-09 1999-03-23 University Of British Columbia Repressed trans-activator system for characterization of protein-protein interactions
WO1999040181A1 (en) 1998-02-05 1999-08-12 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8
US6004937A (en) 1998-03-09 1999-12-21 Genetics Institute, Inc. Use of follistatin to modulate growth and differentiation factor 8 [GDF-8] and bone morphogenic protein 11 [BMP-11]
US6156952A (en) * 1998-04-09 2000-12-05 Constituent Institution Of The University Of Maryland System HIV transgenic animals and uses therefor
CA2331410C (en) 1998-05-06 2009-07-14 Metamorphix, Inc. Methods for treating diabetes by inhibiting gdf-8
AU762574B2 (en) * 1998-05-14 2003-06-26 Immunex Corporation Method of inhibiting osteoclast activity
AU1177700A (en) 1998-11-13 2000-06-05 Takeda Chemical Industries Ltd. Novel protein and utilization thereof
NZ513642A (en) * 1999-01-21 2004-02-27 Metamorphix Inc Growth differentiation factor inhibitors and uses therefor
AU5474400A (en) 1999-06-08 2000-12-28 Rutgers, The State University Compositions and methods for targeted gene insertion
EP1593689A3 (en) 2000-01-18 2006-04-05 Ovita Limited Myostatin and mimetics thereof
TWI782836B (zh) 2007-02-02 2022-11-01 美商艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ActRIIB的變體與其用途

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019039630A1 (ko) * 2017-08-22 2019-02-28 주식회사 진셀팜 폴리스타틴 유래 생리활성 펩타이드, 및 이의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
CA2448835A1 (en) 2002-10-31
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AU2002307564B2 (en) 2007-02-08
WO2002085306A3 (en) 2002-12-12
BR0209191A (pt) 2004-04-20
EP2340709A1 (en) 2011-07-06
IL158420A (en) 2009-08-03
JP4361955B2 (ja) 2009-11-11
PL367201A1 (en) 2005-02-21
CA2448835C (en) 2013-06-11
JP5425537B2 (ja) 2014-02-26
JP5004930B2 (ja) 2012-08-22
US20020157126A1 (en) 2002-10-24
EP1395113A2 (en) 2004-03-10
WO2002085306A2 (en) 2002-10-31
CN1520256A (zh) 2004-08-11
US6891082B2 (en) 2005-05-10
US8822411B2 (en) 2014-09-02
JP2004537982A (ja) 2004-12-24
KR20040002927A (ko) 2004-01-07
NO20034693D0 (no) 2003-10-20
EP1395113A4 (en) 2007-09-12
US8124830B2 (en) 2012-02-28
CN1520256B (zh) 2013-02-13

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