KR20090031459A - Ｃｈｋ1 억제에 유용한 헤테로아릴 우레아 유도체 - Google Patents
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Abstract
DNA 복제에서의 DNA 손상 또는 병변과 관련된 질환 및 질병의 치료에 유용한 치환된 우레아 화합물이 개시되어 있다. 상기 화합물의 제조 방법 및, 예를 들어, 암 및 DNA 복제, 염색체 분열, 또는 세포 분열에서의 결함을 특징으로 하는 기타 질환의 치료에 있어서 치료제로서의 그들의 용도 또한 개시되어 있다.
비정상적 증식 세포, DNA 복제, DNA 손상, 체크포인트, 키나제, 화학감작제, 방사선감작제
Description
본 발명은 유전 물질의 완전성을 유지 및 회복시키는 효소를 억제하는데 유용한 화합물에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 일련의 아릴- 및 헤테로아릴-치환된 우레아 화합물, 상기 화합물의 제조 방법, 및, 예를 들어, 암 및 데옥시리보핵산 (DNA) 복제, 염색체 분열, 또는 세포 분열에서의 결함을 특징으로 하는 기타 질환의 치료에 있어서 치료제로서의 그들의 용도에 관한 것이다.
각종 질환, 질병, 및 장애 (이후 "적응증")는 비정상적 증식 세포를 수반하는 것을 특징으로 한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "비정상적 증식 세포" (또는 "비정상적 세포 증식")는 정상적인, 적절한, 또는 예상되는 과정으로부터 벗어난 세포 증식을 의미한다. 예를 들어, 비정상적 세포 증식은 DNA 또는 기타 세포 성분이 손상되거나 결함이 있는, 세포의 부적절한 증식을 포함한다. 비정상적 세포 증식은 또한 부적절하게 높은 수준의 세포 분열, 부적절하게 낮은 수준의 세포사 (예를 들어, 세포자멸사), 또는 양자 모두에 의해서 야기되거나, 매개되거나, 또는 그로부터 발생한 임상적 적응증을 특징으로 한다. 상기 적응증은, 예를 들 어, 세포, 세포군 또는 조직(들)의 단일의 또는 복수의 국부적인 비정상적 증식을 특징으로 할 수 있으며, 암성 (양성 또는 악성) 및 비암성 적응증을 포함한다.
정의에 의하면, 모든 암 (양성 및 악성)은 어떠한 형태의 비정상적 세포 증식을 수반한다. 몇몇 비암성 적응증 또한 비정상적 세포 증식을 수반한다. 비정상적 세포 증식을 수반하는 비암성 적응증의 예는 류마티스 관절염, 건선, 백반증, 베게너(Wegener) 육아종증, 및 전신 루푸스를 포함한다.
비정상적 증식 세포를 수반하는 적응증을 치료하는 한 접근법은 DNA 손상제의 사용을 포함한다. 상기 작용제는 필수불가결한 세포 과정, 예컨대 DNA 대사, DNA 합성, DNA 전사, 및 미세관 방추 형성을 분열시켜서, 비정상적 증식 세포를 사멸시키도록 고안되었다. 그들은 또한, 예를 들어, 염색체의 구조적 완전성을 교란하는 병변을 DNA에 도입시킴으로써 작동할 수 있다. DNA 손상제는 정상적인 건강한 세포는 최소로 손상시키면서, 비정상적 증식 세포에서는 최대의 손상 및 그에 따른 세포사를 유발하고자 하는 방식으로 고안 및 투여된다.
화학요법제 및 방사선을 비롯한 각종 DNA 손상제가 지금까지 개발되어 왔고, 나머지는 개발중이다. 불행하게도, 비정상적 세포 증식을 수반하는 질병을 치료하는데 있어서 DNA 손상제의 효과는, 특히 암 치료에서는, 원하는 바에 미치지 못했다. 건강한 세포보다 비정상적 증식 세포에 대한 상기 작용제의 선택성 (때때로 치료 지수라고 칭함)은 종종 한계치였다.
또한, 모든 세포는 DNA 손상제에 방해작용을 할 수 있는 탐지 및 회복 기작을 가진다. 세포 주기 체크포인트라고 칭하는 상기 탐지 기작은 다양한 세포 복제 단계의 순서를 유지하고, 각 단계가 높은 박진성(fidelity)으로 실행되게끔 해 준다 (문헌 [Hartwell et al., Science , 246:629-634 (1989)]; [Weinert et al., Genes Dev ., 8:652 (1994)]). 세포가 DNA 손상제에 의해서 고의로 유도된 손상을 비롯한 DNA 손상을 탐지하면, 특정 신호전달 경로가 세포 주기 체크포인트를 활성화시키고, 세포 복제 주기가 일시적으로 멈춘다 ("정지한다"). 상기의 정지는 세포에게 종종 그들이 계속 생존하고 증식하기에 충분할 정도로 그들의 DNA를 회복할 시간을 허용한다. 비정상적 증식 세포의 경우, 상기의 회복은 상기 세포를 사멸시키기에 충분한 DNA 손상을 유발하려는 노력을 훼손시킬 수 있기 때문에 바람직하지 못하다.
예를 들어, 겜자르(GEMZAR(등록상표)) (겜시타빈, 또는 2',2'-디플루오로-2'-데옥시시티딘)라고 칭하는 화학요법제는 합성 도중에 DNA로 혼입되어 DNA를 손상시킨다. 비회복 상태로 방치되면, 손상된 DNA는 일반적으로 생존 유지가 불가능해진다. 그러나, 다수의 표적화된 세포에서, 세포 주기 체크포인트는 부적당하게 만들어진 (또는 다르게는 손상된) DNA를 검출한다. 활성화된 세포 주기 체크포인트는 손상된 DNA가 회복되기에 충분한 시간 동안 세포 주기 정지를 촉발시킨다. 이것이 비정상적 증식 세포가 DNA-손상제, 예컨대 화학요법제, 방사선, 및 기타 요법의 세포-사멸 효과를 저지시킨다고 이론화되는 한 방식이다.
기타 DNA-손상제는 종양 세포를 S-기에서 정지시킨다. 종양 세포는 화학요법제가 투여되는 동안 S 기에서 정지됨으로써 간단히 특정 화학요법제에 저항한다는 것이 관찰되었다. 이때에는, 약물이 제거되자마자, DNA 손상이 회복되고, 세포 주기 정지가 멈추고, 세포가 나머지 세포 주기로 진행된다 (문헌 [Shi et al., Cancer Res . 61:1065-1072, 2001]). 기타 치료제는 G1 및 G2를 비롯한 다른 체크포인트에서 세포 주기 정지를 야기한다. 따라서, 다양한 DNA 손상 체크포인트의 억제는 세포가 치료상 유도된 DNA 손상을 회복하지 못하고, 표적화된 세포가 DNA 손상제에 감작하지 못하게 한다고 예상된다. 상기 감작화가 이번에는 상기 요법의 치료 지수를 증가시킨다고 예상된다.
세포 주기는 모든 진핵세포 종에 걸쳐서 기본 과정 및 조절 방식에 있어서 구조적 및 기능적으로 동일하다. 유사분열 (체세포) 세포 주기는 4개의 기: G1 (휴지)기, S (합성)기, G2 (휴지)기, M (유사분열)기로 이루어진다. G1, S, 및 G2 기는 총괄하여 세포 주기의 간기라고 칭한다. G1 기 도중에, 세포의 생합성 활동이 고속으로 진행된다. S 기는 DNA 합성이 개시될 때 시작되고, 세포의 핵 중 DNA 내용물이 복제되고, 2개의 동일한 세트의 염색체가 형성될 때 종결된다.
이어서 세포는 유사분열이 개시될 때까지 지속되는 G2 기로 진입한다. 유사분열에서, 염색체는 쌍을 이루고 분리되고, 2개의 새로운 핵이 형성되고, 각각 염색체 두 세트 중 하나를 함유하는 하나의 핵을 받는 2개의 딸세포로 세포가 분열되는 세포질분열이 일어난다. 세포질분열은 M 기를 종결시키며, 다음 세포 주기의 간기의 시작을 표시한다. 세포 주기 현상이 진행되는 순서는 단단히 통제되어서, 한 세포 주기 현상의 개시는 이전의 세포 주기 현상의 완료에 의존한다. 이는 한 세대의 체세포로부터 다음 세대로의 유전 물질의 복제 및 분열에서의 박진성을 준다.
세포 주기 체크포인트는 염색체 기작에서의 세포 주기 신호 또는 결함에 반응하여 순차적으로 작용하는 적어도 3종의 별개의 폴리펩티드 부류를 포함한다는 것이 보고되어 있다 (문헌 [Carr, Science , 271:314-315, 1996]). 제1 부류는 세포 주기에서의 DNA 손상 또는 이상을 검출 또는 탐지하는 단백질 족이다. 상기 센서는 모세혈관확장성조화운동불능 돌연변이 단백질 (Atm) 및 모세혈관확장성조화운동불능 Rad-관련 단백질 (Atr)을 포함한다. 제2 부류의 폴리펩티드는 검출자에 의해서 검출된 신호를 증폭 및 전달하고, Rad53 (문헌 [Alen et al. Genes Dev . 8:2416-2488, 1994]) 및 Chk1로 예시된다. 제3 부류의 폴리펩티드는 세포 반응, 예를 들어, 유사분열의 정지 및 세포자멸사를 매개하는 세포 주기 이펙터, 예컨대 p53을 포함한다.
세포 주기 체크포인트의 기능에 대한 현재의 다량의 지식은 종양 유래 세포주의 연구로부터 유래되었다. 많은 경우에, 종양 세포는 중요한 세포 주기 체크포인트를 잃는다 (문헌 [Hartwell et al., Science 266:1821-28, 1994]). 신생물 상태로의 세포의 발달에서 중요한 단계는 세포 주기 체크포인트 경로, 예컨대 p53과 관련된 것들을 비활성화시키는 돌연변이의 획득이라는 것이 보고되어 있다 (문헌 [Weinberg, Cell 81:323-330, 1995]; [Levine, Cell 88:3234-331, 1997]). 상기 세포 주기 체크포인트의 손실은 DNA 손상에도 불구하고 종양 세포를 복제시킨다.
무손상 세포 주기 체크포인트를 갖는 비암성 조직은 전형적으로는 단일 체크포인트 경로의 일시적인 분열로부터 단절된다. 그러나, 종양 세포는, 추가의 체크포인트의 교란이 특히 DNA 손상제에 대하여 그들을 민감하게 하는, 세포 주기 과정 을 제어하는 경로에 결함을 가진다. 예를 들어, 돌연변이 p53을 함유하는 종양 세포는 G1 DNA 손상 체크포인트 및 G2 DNA 손상 체크포인트를 유지하는 능력 양자 모두에서 불완전하다 (문헌 [Bunz et al., Science , 282:1497-501, 1998]). G2 체크포인트 또는 S 기 체크포인트의 개시를 표적으로 하는 체크포인트 억제제는 DNA 손상을 회복시키는 상기 종양 세포의 능력을 더 무력화시킬 것으로 예상되며, 따라서 방사선 및 전신 화학요법 양자 모두의 치료 지수를 강화시킬 후보이다 (문헌 [Gesner, Abstract at SRI Conference: Protein Phosphrylation and Drug Discovery World Summit, March 2003]).
DNA 손상 또는 DNA 복제에 대한 임의의 방해물의 존재 하에, 체크포인트 단백질 Atm 및 Atr은 세포 주기 정지에 이르게 되는 신호전달 경로를 개시한다. Atm은 이온화 방사선 (IR)에 반응하여 DNA 손상 체크포인트에서 일익을 담당하는 것으로 밝혀졌다. Atr은 이중가닥 DNA 손상, 단일가닥 DNA 손상을 야기하는 작용제, 및 DNA 방사 차단제에 의해서 자극된다.
Chk1은 DNA 손상 체크포인트 신호전달 경로에서 Atm 및/또는 Atr로부터 하위에 놓이는 단백질 키나제이다 (문헌 [Sanchez et al., Science , 277:1497-1501, 1997]; 미국 특허 제6,218,109호). 포유류 세포에서, Chk1은 이온화 방사선 (IR), 자외선 (UV), 및 히드록시우레아를 비롯한, DNA 손상을 야기하는 작용제에 반응하여 인산화된다 (문헌 [Sanchez et al., 상기]; [Lui et al., Genes Dev ., 14:1448-1459, 2000]). 포유류 세포에서 Chk1을 활성화시키는 상기의 인산화는 Atm (문헌 [Chen et al., Oncogene , 18:249-256, 1999]) 및 Atr (문헌 [Lui et al., 상기])에 의존한다. 또한, Chk1은 세포 주기 조절에서 중요하다고 알려진 유전자 산물인 wee1 (문헌 [O'Connell et al., EMBO J., 16:545-554, 1997]) 및 Pds1 (문헌 [Sanchez et al., Science , 286:1166-1171, 1999])을 둘 다 인산화시키는 것으로 밝혀졌다.
상기의 연구는 포유류 Chk1이 S 기에서의 정지에 이르게 되는 Atm 의존적 DNA 손상 체크포인트에서 일익을 담당한다는 것을 입증한다. DNA 합성의 완전성을 모니터링하는데 있어서의 Chk1의 역할에 중점을 두는 S 기 포유류 세포에서 Chk1의 역할이 최근에 밝혀졌다 (문헌 [Feijoo et al., J. Cell Biol ., 154:913-923, 2001]; [Zhao et al., PNAS U.S.A, 99:14795-800, 2002]; [Xiao et al., J Biol Chem., 278(24):21767-21773, 2003]; [Sorensen et al., Cancer Cell, 3(3):247-58, 2003]). Chk1은 cyclinA/cdk2 활성을 조절하는 Cdc25A를 인산화시킴으로써 S-기 정지를 야기한다 (문헌 [Xiao et al., 상기] 및 [Sorensen et al., 상기]). Chk1은 또한 세포가 G2로부터 유사분열로 진행될 때, cyclin-B/cdc2 (Cdk1으로도 알려짐)를 통상 탈인산화시키는 이중 특이성 포스파타제인 Cdc25C를 인산화 및 불활성화시킴으로써 G2 정지를 유발한다 (문헌 [Fernery et al., Science , 277:1495-7, 1997]; [Sanchez et al., 상기]; [Matsuoka et al., Science , 282:1893-1897, 1998]; 및 [Blasina et al., Curr . Biol ., 9:1-10, 1999]). 상기 두 경우에서, Cdk 활성의 조절은 세포 주기 정지를 유발하여 DNA 손상 또는 비복제된 DNA의 존재 하에 세포가 유사분열에 진입하지 못하게 한다.
추가 부류의 세포 주기 체크포인트 억제제는 G1 또는 G2/M 기에서 작동한다. UCN-01, 또는 7-히드록시스타우로스포린은 본래 단백질 키나제 C에 대하여 주효과를 갖는 비특이적 키나제 억제제로서 분리되었지만, 최근에는 Chk1의 활성을 억제하고 G2 세포 주기 체크포인트를 소멸시킨다고 밝혀졌다 (문헌 [Shi et al., 상기]). 따라서, UCN-01은 비선택적 Chk1 억제제이기 때문에, 고용량에서는 세포에 대하여 독성이다. 저용량에서는, 다수의 세포성 키나제를 비특이적으로 억제하고, 또한 G1 체크포인트를 억제한다 (문헌 [Tenzer et al., Curr . Med Chem . AntiCancer Agents , 3:35-46, 2003]).
UCN-01이 암 요법, 예컨대 방사선, 항암제 캄프토테신 (문헌 [Tenzer et al., 상기]), 및 겜시타빈 (문헌 [Shi et al., 상기])과 함께 사용되어 왔으나, 성과가 한정되어 있다. 또한, UCN-01은 아교모세포종 세포에서 테모졸로미드 (TMZ) 유발 DNA 불일치 회복 (MMR)의 효과를 강화시키기 위해서 사용되어 왔다 (문헌 [Hirose et al., Cancer Res ., 61:5843-5849, 2001]). 임상에서는, UCN-01이 예상만큼 효과적인 화학요법제가 아니었고, 이는 아마도 치료 계획의 부족 및 특히 중요한 분자 표적 확정의 부족으로 인한 것이다 (문헌 [Grant et al., Drug Resistance Updates , 6:15-26, 2003]). 따라서, Mack 등은 배양된 비소세포 폐암종 세포주에서 UCN-01에 의한 시스플라틴의 세포 주기-의존적 상승작용을 보고하였지만, UCN-01에 의해서 표적화된 중요한 세포 주기 체크포인트(들)를 특이성을 가지고 확인하지는 않았다. (문헌 [Mack et al., Cancer Chemother . Pharmacol ., 51(4):337-348, 2003]).
여러가지 다른 방책이 세포 주기에 영향을 미치는 화학요법제를 이용하는 치 료에 종양 세포를 감작시키기 위해서 존재한다. 예를 들어, 2-아미노-퓨린의 투여는 복수의 세포 주기 체크포인트 기작, 예컨대 미모신-유발 G1 정지 또는 히드록시우레아-유발 S 기 정지를 소멸시켜서, 세포가 유사분열로 진행되어 유사분열을 겪도록 한다 (문헌 [Andreassen et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A., 86:2272-2276, 1992]). 카페인, 메틸잔틴 또한 G2 체크포인트를 통한 진행을 매개하고, 그것에 의하여 세포사를 유발시킴으로써, DNA-손상제, 예컨대 시스플라틴 및 이온화 방사선의 세포독성을 강화시키기 위해서 사용해 왔다. (문헌 [Bracey et al., Clin . Cancer Res ., 3:1371-1381, 1997]). 그러나, 세포 주기 소멸을 이루기 위해서 사용하는 카페인의 용량은 임상적으로 허용가능한 수준을 초과하며, 실행가능한 치유적 옵션이 아니다. 추가로, Chk1 키나제에 대한 안티센스 뉴클레오티드를 토포이소머라제 억제제 BNP1350에 대한 민감성을 증가시키기 위해서 사용하였지만 (문헌 [Yin et al., Biochem . Biophys . Res . Commun ., 295:435-44, 2002]), 전형적으로 안티센스 치료 및 유전자 요법과 연관된 문제들을 나타내었다.
미국 특허 출원 제10/087,715호 및 미국 가특허 출원 제60/583,080호, 제60/585,292호, 및 제60/602,968호에 기재된 아릴- 및 헤테로아릴-치환된 우레아 화합물; 미국 특허 공보 제2004/0014765호, 미국 특허 공보 제US2003/199511호, 미국 특허 공보 제2004/0014765호, 및 WO 03/101444에 기재된 디아릴 우레아 화합물; 문헌 [Fan et al., Cancer Res . 55:1649-54. 1995]에 기재된 메틸잔틴 및 관련 화합물; WO 03/029241 및 WO 03/028731에 기재된 우레이도티오펜; WO 03/028724에 기재된 N-피롤로피리디닐 카르복스아미드; WO 01/57206 및 미국 특허 제6,211,164 호에 기재된 안티센스 Chk1 올리고뉴클레오티드; WO 00/16781에 기재된 Chk1 수용체 길항제; WO 03/037886에 기재된 헤테로방향족 카르복스아미드 유도체; WO 03/029242에 기재된 아미노티오펜; WO 03/004488에 기재된 (인다졸릴)벤즈이미다졸; 미국 특허 공보 제20040092535호 및 WO 04/018419에 기재된 벤즈이미다졸 퀴놀리논; WO 02/16326에 기재된 헤테로시클릭-히드록시이미노-플루오렌; 미국 특허 제6,495,586호에 기재된 시토네만 유도체, 예컨대 시토네민; WO 01/53274에 기재된 헤테로아릴벤즈아미드; WO 01/53268에 기재된 인다졸; 문헌 [Tenzer et al., 상기]에 기재된 인돌아카르바졸; WO 02/070515에 기재된 크로만 유도체; 문헌 [Schultz et al., J. Med . Chem ., Vol:2909-2919, 1999]에 기재된 폴론; WO 99/17769에 기재된 인데노피라졸; 문헌 [Sedlacek et al., Int J. Oncol ., 9:1143-1168, 1996]에 기재된 플라본; WO 98/53050에 기재된 세린 트레오닌 키나제의 펩티드 루프의 펩티드 유도체; WO 03/051838에 기재된 옥신돌; WO 2004/063198에 기재된 디아제피노인돌론; WO 2004/048343에 기재된 피리미딘; WO 2004/014876에 기재된 우레아 화합물; 및 WO 2003/091255에 기재된 피롤로카르바졸, 벤조푸로이소인돌, 및 아자시클로펜타플루오렌을 비롯한 Chk1 억제제가 개시되어 있다.
그러나, 당업계에는 Chk1의 효과적이고 선택적인 억제제가 여전히 요구되고 있다. 본 발명은 상기 및 기타의 요구를 다룬다.
발명의 개요
본 발명은 생화학적 및/또는 세포-기반 검정에서 예기치 않은 특성을 나타내는, 체크포인트 키나제 Chk1의 강력하고 선택적인 억제제에 관한 것이다. 본 Chk1 억제제는 비정상적 세포 증식을 수반하는 적응증을 치료하는데, 그리고 DNA 손상 또는 DNA 복제에서의 병변과 관련된 적응증의 치료에서 화학감작제 및 방사선감작제로서 유용하다.
따라서, 본 발명의 한 측면은 구조 화학식 I의 화합물을 제공하는 것이다. 무엇보다도, 상기 화합물은 유효량의 구조 화학식 I의 화합물을 Chk1의 억제가 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, Chk1의 억제 방법에 유용하다.
화학식 I의 화합물, 또는 그의 제약상 허용가능한 염, 프로드러그, 또는 용매화물은 하기의 구조 화학식을 가진다.
[화학식 I]
여기서 R1은 할로, C1 - 3알킬, CN, 또는 CF3이고;
R2는 수소, C1 - 3알킬, CN, OC1 - 3알킬, 할로, 또는 N(Rb)2이고, 여기서 Rb는, 독립적으로, 수소 또는 C1 - 3알킬이고;
R3는 하나의 고리 N-Ra 기 및 제2 고리 N-Ra 기, 고리 산소, 또는 고리 황을 함유하는 6- 또는 7-원 포화 헤테로시클릭 고리이고, 여기서 Ra는, 독립적으로, 수소, C1 - 3알킬, CH2CN, 또는 CH2CH2CN이고, 여기서 R3는 옥소(=O)로 임의로 치환되고;
R4는 수소, C1 - 3알킬, OC1 - 3알킬, SC1 - 3알킬, N(Rb)2, NRbC(=O)C1- 3알킬, 또는 하나의 N-Ra 기 및 임의로는 1 내지 3개의 C1 - 3알킬기로 치환된 고리를 포함하는 5- 또는 6-원 포화 헤테로시클릭 고리이거나;
또는 R2 및 R4는, 그들이 결합되어 있는 탄소와 함께, 5- 내지 7-원 포화 카르보시클릭 고리를 형성하고;
R5는 수소 또는 할로이되,
단, R2 및 R4 중 적어도 하나는 수소가 아니고, R5가 할로인 경우, R2 또는 R4는 수소이다.
본 발명의 또다른 측면은, 기타 용도 중에서, Chk1의 억제 방법에 사용할 수 있는 구조 화학식 II의 화합물, 또는 그의 제약상 허용가능한 염, 프로드러그, 또는 용매화물을 제공하는 것이다.
[화학식 II]
여기서 R1은 할로, C1 - 3알킬, CN, 또는 CF3이고;
R2는 수소, C1 - 3알킬, CN, OC1 - 3알킬, 할로, 또는 N(Rb)2이고, 여기서 Rb는, 독립적으로, 수소 또는 C1 - 3알킬이고;
R3는 하나의 고리 N-Ra 기 및 제2 고리 N-Ra 기, 고리 산소, 또는 고리 황을 함유하는 6- 또는 7-원 포화 헤테로시클릭 고리이고, 여기서 Ra는, 독립적으로, 수소, C1 - 3알킬, 또는 CH2CN이고, 여기서 R3는 임의로 옥소 (=O)로 치환되고;
R4는 수소, C1 - 3알킬, OC1 - 3알킬, 또는 할로이거나;
또는 R2 및 R4는, 그들이 결합되어 있는 탄소와 함께, 5- 내지 7-원 포화 카르보시클릭 고리를 형성하되,
단, R2 및 R4 중 적어도 하나는 수소가 아니다.
본 발명의 또다른 측면은 구조 화학식 I 또는 II의 하나 이상의 화합물을 포 함하는 제약 조성물, 및 생체내 또는 생체외에서 Chk1의 억제가 치료적 이익을 제공하거나 연구 또는 진단의 관심대상인 적응증의 치유적 치료에서 상기 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 더욱 또다른 측면은 구조 화학식 I 또는 II의 화합물을 화학요법제, 방사선요법제, 또는 둘 다와 조합하여 개체에 투여하는 것을 포함하는, 적응증에 대한 화학요법적 또는 방사선요법적 치료를 받는 대상체에서의 세포 감작 방법을 제공하는 것이다. 상기 방법으로 치료되는 비제한적인 적응증은 암이다.
본 발명의 또다른 측면은 비정상적 세포 증식의 억제 또는 예방 방법을 제공하는 것이다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 비정상적 증식 세포를 포함하는 세포 집단을, 상기 비정상적 증식 세포 중에서 세포 주기 정지를 실질적으로 동기화시키기에 충분한 양 및 시간으로 1종 이상의 Chk1 활성화제와 접촉시키는 것을 포함한다. 세포 집단에서 세포 주기 정지의 실질적인 동기화를 달성할 때, 상기 세포 집단을 세포 주기 정지를 실질적으로 소멸시키기에 충분한 양 및 시간으로 1종 이상의 Chk1 억제제와 접촉시킨다.
본 발명의 또다른 측면은
(a) 구조 화학식 I 또는 II의 화합물을 포함하는 제약 조성물;
(b) 상기 조성물이 비정상적 세포 증식을 수반하는 적응증의 치료에 유용하다는 것을 제공하는 패키지 삽입물; 및
(c) 용기
를 포함하는, 인간을 위한 제약용 제조품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 측면은
(a) 구조 화학식 I 또는 II의 화합물을 포함하는 제약 조성물;
(b) 상기 조성물이 DNA 병변 또는 DNA 복제와 관련된 적응증의 치료에서 화학감작제 또는 방사선감작제로서 유용하다는 것을 제공하는 패키지 삽입물; 및
(c) 용기
를 제공하는 것이다.
본 발명의 상기 및 기타 측면은 하기의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 화합물, 또는 그의 제약상 허용가능한 염, 프로드러그, 또는 용매화물은 구조 화학식 I을 가진다.
[화학식 I]
여기서 R1은 할로, C1 - 3알킬, CN, 또는 CF3이고;
R2는 수소, C1 - 3알킬, CN, OC1 - 3알킬, 할로, 또는 N(Rb)2이고, 여기서 Rb는, 독립적으로, 수소 또는 C1 - 3알킬이고;
R3는 하나의 고리 N-Ra 기 및 제2 고리 N-Ra 기, 고리 산소, 또는 고리 황을 함유하는 6- 또는 7-원 포화 헤테로시클릭 고리이고, 여기서 Ra는, 독립적으로, 수소, C1 - 3알킬, CH2CN, 또는 CH2CH2CN이고, 여기서 R3는 옥소(=O)로 임의로 치환되고;
R4는 수소, C1 - 3알킬, OC1 - 3알킬, SC1 - 3알킬, N(Rb)2, NRbC(=O)C1- 3알킬, 또는 하나의 N-Ra 기 및 임의로는 1 내지 3개의 C1 - 3알킬기로 치환된 고리를 포함하는 5- 또는 6-원 포화 헤테로시클릭 고리이거나;
또는 R2 및 R4는, 그들이 결합되어 있는 탄소와 함께, 5- 내지 7-원 포화 카르보시클릭 고리를 형성하고;
R5는 수소 또는 할로이되,
단, R2 및 R4 중 적어도 하나는 수소가 아니고, R5가 할로인 경우, R2 또는 R4는 수소이다.
바람직한 한 실시양태에서, 상기 화합물, 또는 그의 제약상 허용가능한 염, 프로드러그, 또는 용매화물은 구조 화학식 II를 가진다.
[화학식 II]
여기서 R1은 할로, C1 - 3알킬, CN, 또는 CF3이고;
R2는 수소, C1 - 3알킬, CN, OC1 - 3알킬, 할로, 또는 N(Rb)2이고, 여기서 Rb는, 독립적으로, 수소 또는 C1 - 3알킬이고;
R3는 하나의 고리 N-Ra 기 및 제2 고리 N-Ra 기, 고리 산소, 또는 고리 황을 함유하는 6- 또는 7-원 포화 헤테로시클릭 고리이고, 여기서 Ra는, 독립적으로, 수소, C1 - 3알킬, 또는 CH2CN이고, 여기서 R3는 임의로 옥소 (=O)로 치환되고;
R4는 수소, C1 - 3알킬, OC1 - 3알킬, 또는 할로이거나;
또는 R2 및 R4는, 그들이 결합되어 있는 탄소와 함께, 5- 내지 7-원 포화 카르보시클릭 고리를 형성하되,
단, R2 및 R4 중 적어도 하나는 수소가 아니다.
화학식 I 및 II의 화합물의 한 바람직한 실시양태에서, R1은 클로로, 메틸, CN, 또는 CF3이다. 또다른 바람직한 실시양태에서, R2는 수소, 메틸, 에틸, 클로로, 브로모, 디메틸아미노, 시아노, 또는 메톡시이다. 더욱 바람직한 실시양태에서, R2는 수소가 아니다.
화학식 I 및 II의 다른 바람직한 실시양태에서, R4는 메틸, 클로로, 플루오로, 메톡시, 이소프로폭시, 디메틸아미노, -SCH3, -NHC(=O)CH(CH3)2, -NHC(=O)CH3, 피롤리디닐, 또는 3,3-디메틸-피롤리디닐이다. 더욱 바람직한 실시양태에서, R4는 메틸, 클로로, 또는 메톡시이다. 더욱 또다른 바람직한 실시양태에서, R2 및 R4는, 그들이 결합되어 있는 탄소와 함께, 5-원 또는 6-원 포화 카르보시클릭 고리를 형성한다.
화학식 I 및 II의 더욱 또다른 바람직한 실시양태에서, R5가 할로인 경우, R4는 수소이다. 바람직한 실시양태에서, R5는 플루오로이다. 더욱 바람직한 실시양태에서, R5는 수소이다.
화학식 I 및 II의 한 실시양태에서, R1이 시아노인 경우, R2는 수소이고, R4는 바람직하게는 클로로 또는 메틸이다. 또다른 실시양태에서, R5는 플루오로이고, R4는 수소이고, R2는 메틸, 클로로, 또는 브로모이다.
화학식 I 및 II에서 바람직한 R3 기의 예는
를 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "C1 - 3알킬"이라는 용어는 1 내지 3개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 및 분지쇄 알킬기, 즉, 메틸, 에틸, n-프로필, 및 이소프로필 을 포함한다.
"할로"는 본원에서 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도로서 정의된다.
"시아노"는 -CN으로서 정의된다.
"트리플루오로메틸"은 -CF3를 의미한다고 정의된다.
약어 "Me"는 메틸, 즉, -CH3이다.
세포 주기 체크포인트를 활성화시키는 DNA-손상제는 일반적으로 본원에서 "체크포인트 활성화제"라고 칭한다. "Chk1" ("체크-원"이라고 발음)으로 지정된 체크포인트를 활성화시키는 DNA-손상제는 본원에서 "Chk1 활성화제"라고 칭한다. 마찬가지로, 상기 체크포인트의 억제제는 본원에서 각각 "체크포인트 억제제" 및 "Chk1 억제제"라고 칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 Chk1 억제제는 Chk1 단백질의 하나 이상의 세포 주기 체크포인트 활성을 적어도 부분적으로 소멸시킬 수 있는 화합물이다. 세포 주기 체크포인트의 소멸은, 세포 체크포인트 기작이 세포로 하여금 그가 정지해 있던 세포 주기 단계로부터 세포 주기에서의 다음의 단계로 넘어가거나, 세포로 하여금 세포사로 직접 넘어가도록 하기에 충분히 무력화되는 경우에 이루어진다. 세포 주기 체크포인트의 소멸은, 세포가 손상된 또는 불완전한 유전 물질을 다음의 세포 주기 단계로 운반하도록 하여, 세포사를 유발 또는 촉진시킨다. 세포사는 세포자멸사 및 유사분열 대변동을 비롯한 임의의 기작에 의해서 발생할 수 있다. 본 발명의 화합물은 Chk1 억제제이다.
Chk1 활성화제는 Chk1 키나제 활성을 활성화시키고, 따라서 적어도 부분적인 세포 주기 정지를 유발하는 능력을 갖는 임의의 공지된 또는 후에 발견되는 작용제를 포함한다. Chk1 활성화제는 세포 주기의 임의의 단계에서 세포 주기를 정지시킬 수 있는 작용제를 포함하며, 상기의 단계는 본원에서 상기 활성화제에 대한 "표적 단계"라고 칭할 수 있다. 표적 단계는 유사분열을 제외한 임의의 세포 주기 단계, 즉, 임의의 G1, S, 및 G2 기를 포함한다. 본 발명에 유용한 Chk1 활성화제는 DNA 손상제, 예컨대 화학요법제 및/또는 방사선을 포함한다. 방사선 Chk1 활성화제는 이온화 방사선을 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다. 이온화 방사선은 물체와 상호작용하여 이온 쌍을 생성할 수 있는 전자기적 또는 입자파 방사선을 포함한다. 이온화 방사선은 X선 및 감마선, 알파 및 베타 입자, 중성자 및 대전된 핵을 포함한다. 방사선은 자외선, 가시광선, 적외선 방사선, 마이크로파 방사선, 및 그의 혼합물을 포함한다. 실시예 8에 기재된 것과 같은 검정을 사용하여 작용제가 Chk1 활성화제인지의 여부를 결정할 수 있다.
"비정상적 세포 증식의 억제"는 전체적으로 비정상적 증식 세포가 증식하는 속도의 지연 또는 상기 증식의 제거를 의미한다. 상기 억제는 복제 속도 감소, 세포사 속도 증가, 또는 양자 모두로부터 기인할 수 있다. 세포사는 세포자멸사 및 유사분열 대변동을 비롯한 임의의 기작에 의해서 발생할 수 있다.
"비정상적 세포 증식의 예방"은 발생 이전에 비정상적 세포 증식을 억제하는 것 또는 그의 재발을 억제하는 것을 의미한다.
"생체내"는 동물 또는 인간 내와 같이 살아있는 대상체 내를 의미한다. 문 맥상, 작용제들을 비정상적으로 복제되는 세포의 증식을 지연 또는 제거하기 위해서 생체내에서 치료적으로 사용할 수 있다. 상기 작용제들은 또한 비정상적 세포 증식 또는 그와 연관된 증상의 조짐을 예방하기 위해서 예방제로서 생체내에서 사용할 수 있다.
"생체외"는 살아있는 대상체 외부를 의미한다. 생체외 세포 집단의 예는 세포 배양물 및 생물학적 샘플, 예컨대 인간 또는 동물로부터의 체액 또는 조직 샘플을 포함한다. 상기 샘플은 당업계에 주지된 방법에 의해서 수득할 수 있다. 예시적인 생물학적 체액 샘플은 혈액, 뇌척수액, 소변, 타액을 포함한다. 예시적인 조직 샘플은 종양 및 생검을 포함한다. 문맥상, 본 화합물은 치료적 및 실험적 양자 모두에 무수히 적용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "방사선감작제"는 인간 또는 기타 동물에게 치료 유효량으로 투여되어서, 전자기적 방사선에 대한 세포의 민감성을 증가시키고/시키거나 전자기적 방사선으로 치료가능한 질환의 치료를 촉진시키는 화합물을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "방사선"은 10-20 내지 100 미터 범위의 파장을 갖는 방사선을 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다.
"용기"라는 용어는 약품의 보관, 선적, 조제, 및/또는 취급에 적합한 임의의 저장소 및 그것을 위한 칸막이를 의미한다.
"패키지 삽입물"이라는 용어는 의사, 약사, 및 환자가 제품의 사용에 관하여 정보에 입각한 결정을 하는데 필요한 제품 투여 방법의 설명을 안정성 및 효능 데이터와 함께 제공하는, 제품에 동봉된 설명서를 의미한다. 패키지 삽입물은 일반적으로 약품에 대한 "라벨"로 본다.
본 발명은 구조 화학식 I 또는 II의 화합물의 가능한 모든 입체이성질체 및 기하이성질체를 포함한다. 본 발명은 라세미 화합물뿐만 아니라 광학 활성 이성질체를 포함한다. 구조 화학식 I 또는 II의 화합물이 단일 거울상이성질체로서 바람직한 경우에는, 최종 생성물의 분해에 의해서 또는 이성질상 순수한 출발 물질로부터의 입체특이적 합성 또는 키랄 보조 반응물의 사용에 의해서 상기를 수득할 수 있고, 예를 들어, 문헌 [Z. Ma et al., Tetrahedron : Asymmetry , 8(6), 883-888 (1997)]을 참고한다. 최종 생성물, 중간체, 또는 출발 물질의 분해는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해서 이룰 수 있다. 추가로, 구조 화학식 I 또는 II의 화합물의 호변이성질체가 가능한 경우에는, 본 발명은 상기 화합물의 모든 호변이성질 형태를 포함하고자 한다. 아래에 입증하는 바와 같이, 특정 입체이성질체는 화학요법 또는 방사선요법과 조합되어 Chk1을 억제하는 뛰어난 능력을 나타낼 수 있다.
구조 화학식 I 또는 II의 화합물의 프로드러그는 또한 본 발명의 방법에서의 화합물로서 사용할 수 있다. 화합물이 제형화 및/또는 투여에 적합한 형태로 유도된 후, 생체내에서 약물로서 방출되는 프로드러그 접근법이 일시적으로 (예를 들어, 생가역적으로) 화합물의 물리화학적 특성을 바꾸는데 성공적으로 이용된다는 것이 꽤 확립되어 있다 (문헌 [H. Bundgaard, Ed., "Design of Prodrugs," Elsevier, Amsterdam, (1985)]; [R.B. Silverman, "The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action," Academic Press, San Diego, chapter 8, (1992)]; [K.M. Hillgren et al., Med . Res . Rev ., 15, 83 (1995)] 참고).
본 발명의 화합물은 하나 이상의 관능기를 함유한다. 상기 관능기는, 바람직한 또는 필요한 경우, 프로드러그를 제공하도록 변형될 수 있다. 적합한 프로드러그는, 예를 들어, 산 유도체, 예컨대 아미드 및 에스테르를 포함한다. 당업자는 또한 N-옥시드를 프로드러그로서 사용할 수 있다는 것을 인식하게 된다.
본 발명의 화합물은 염으로서 존재할 수 있다. 본 발명의 화합물의 제약상 허용가능한 염이 일반적으로 본 발명의 방법에 바람직하다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "제약상 허용가능한 염"이라는 용어는 구조 화학식 I 또는 II의 화합물의 염 또는 쯔비터이온 형태를 가리킨다. 화학식 I 또는 II의 화합물의 염은 상기 화합물의 최종 단리 및 정제 도중에 또는 별도로 상기 화합물과 적합한 양이온을 갖는 산과의 반응에 의해서 제조할 수 있다. 제약상 허용가능한 적합한 양이온은 알칼리 금속 (예를 들어, 나트륨 또는 칼륨) 및 알칼리 토금속 (예를 들어, 칼슘 또는 마그네슘) 양이온을 포함한다. 또한, 염기성 중심을 함유하는, 구조 화학식 I 또는 II의 화합물의 제약상 허용가능한 염은 제약상 허용가능한 산으로 형성된 산 부가염이다. 제약상 허용가능한 염을 형성하는데 이용할 수 있는 산의 예는 무기산, 예컨대 염산, 브롬산, 황산, 및 인산, 및 유기산, 예컨대 옥살산, 말레산, 숙신산, 말론산, 및 시트르산을 포함한다. 본 발명의 화합물의 염의 비제한적 예는 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 히드로요오다이드, 술페이트, 비술페이트, 2-히드록시에탄술포네이트, 포스페이트, 히드로겐 포스페이트, 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포술포네이트, 시트레이트, 디글루코네이트, 글리세롤포스페이트, 헤미술페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 포르메이트, 숙시네이트, 말로네이트, 푸마레이트, 말레이트, 메탄술포네이트, 메시틸렌술포네이트, 나프틸렌술포네이트, 니코티네이트, 2-나프탈렌술포네이트, 옥살레이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼술페이트, 3-페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 트리클로로아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 글루타메이트, 비카보네이트, 파라톨루엔술포네이트, 운데카노에이트, 락테이트, 시트레이트, 타르트레이트, 글루코네이트, 벤젠 술포네이트, 및 p-톨루엔술포네이트 염을 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다. 또한, 본 발명의 화합물에 존재하는 이용가능한 아미노기는 메틸, 에틸, 프로필, 및 부틸 클로라이드, 브로마이드, 및 요오다이드; 디메틸, 디에틸, 디부틸, 및 디아밀 술페이트; 데실, 라우릴, 미리스틸, 및 스테릴 클로라이드, 브로마이드, 및 요오다이드; 및 벤질 및 페네틸 브로마이드로 사차화시킬 수 있다. 상기로 미루어보아, 본원에 나오는 본 발명의 화합물에 대한 임의의 언급은 구조 화학식 I 또는 II의 화합물뿐만 아니라 그의 제약상 허용가능한 염, 용매화물, 또는 프로드러그를 포함하기 위함이다.
본 발명의 화합물의 비제한적 예는:
1-[5-메틸-2-(4-메틸-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸피라진-2-일)-우레아
(LRMS (ES, 양성) m/e - 372.4)
1-[5-클로로-2-(4-메틸-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
(LRMS (ES, 양성) m/e - 392.4)
1-(5-시아노-피라진-2-일)-3-[2-(1,4-디메틸-피페라진-2-일메톡시)-5-메틸-페닐]-우레아
(LRMS (ES, 양성) m/e - 396.4)
1-[5-클로로-2-R-(1-메틸-피페라진-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
(LRMS (ES, 양성) m/e - 391.3)
1-[5-브로모-2-R-(4-메틸-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
(LRMS (ES, 양성) m/e - 438.0)
1-(5-시아노-피라진-2-일)-3-[5-메틸-2-R-(4-메틸-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-우레아
(LRMS (ES, 양성) m/e - 383.0)
1-[5-클로로-2-(4-메틸-[1,4]옥사제판-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
(LRMS (ES, 양성) m/e - 406.0)
1-[5-클로로-2-S-(5-옥소-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
(LRMS (ES, 양성) m/e - 392.2)
N-[2-클로로-4-[3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레이도]-5-(S-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-아세트아미드
(LRMS (ES, 양성) m/e - 435.0)
1-[5-클로로-3-플루오로-2-(S-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
(LRMS (ES, 양성) m/e - 396.3)
1-[5-메톡시-2-(S-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
(LRMS (ES, 양성) m/e - 374.3)
1-[5-메톡시-2-(S-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
(LRMS (ES, 양성) m/e - 358.3)
1-[4-클로로-2-(S-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
(LRMS (ES, 양성) m/e - 378.3)
1-[5-클로로-4-플루오로-2-(S-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
(LRMS (ES, 양성) m/e - 396.1)
1-[5-시아노-4-메틸-2-(S-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
(LRMS (ES, 양성) m/e - 383.3)
1-[5-클로로-4-디메틸아미노-2-(S-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
(LRMS (ES, 양성) m/e - 421.2)
N-[2-클로로-4-[3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레이도]-5-(S-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-이소부티르아미드
(LRMS (ES, 양성) m/e - 463.2)
1-(5-메틸-피라진-2-일)-3-[6-(S-모르폴린-2-일메톡시)-인단-5-일]-우레아
(LRMS (ES, 양성) m/e - 384.3)
1-[5-클로로-2-(4-시아노메틸-티오모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
(LRMS (ES, 양성) m/e - 433.0)
1-{5-클로로-2-[4-(2-시아노-에틸)-S-모르폴린-2-일메톡시]-페닐}-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
(LRMS (ES, 양성) m/e - 431.0)
1-[5-클로로-2-(S-모르폴린-2-일메톡시)-4-피롤리딘-1-일-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
(LRMS (ES, 양성) m/e - 447.2)
, 또는 그의 염, 용매화물 (예를 들어, 수화물), 또는 프로드러그이다.
본 발명의 화합물은 순수 화합물로서 치료상 투여할 수 있지만, 상기 화합물을 제약 조성물 또는 제형으로서 투여하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명은 화학식 I 또는 II의 화합물을, 그것에 대한 제약상 허용가능한 희석제 또는 담체와 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 또한 화학식 I 또는 II의 화합물을, 그것에 대한 제약상 허용가능한 희석제 또는 담체와 혼합하는 것을 포함하는, 제약 조성물의 제조 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명은 구조 화학식 I 또는 II의 화합물, 또는 그의 제약상 허용가능한 염, 프로드러그, 또는 용매화물을, 하나 이상의 제약상 허용가능한 담체 및, 임의로, 기타 치료적 및/또는 예방적 성분과 함께 포함하는 제약적 제형을 추가로 제공한다. 담체는 제형의 기타 성분과 혼화성이며 그것의 수령체에 대하여 해롭지 않다는 점에서 "허용가능"하다.
본 발명의 화합물은 예상외로 높은 효능을 나타낸다. 효능은 전형적으로는 특정 결과를 달성하는데 요구되는 화합물의 농도로서 표현된다. 효능이 클수록, 그것의 의도하는 기능을 수행하는데 화합물이 덜 요구된다. 시험관내 효능은 전형적으로는 IC50 값으로 표현되며 용량-반응 검정을 사용하여 측정된다. IC50 값은 효과가 없거나 최소 효과가 관찰되는 농도에서, 부분적인 효과가 관찰되는 더 높은 농도를 거쳐서, 최대 효과가 관찰되는 포화 농도까지를 비롯한, 일정 범위의 농도에 걸쳐서 관심 있는 화합물과 민감성 검정 시스템을 접촉시켜서 측정할 수 있다. 이론상, 억제제 화합물의 용량-반응 효과의 상기의 검정은 대수 단위로 그리는 경우에 농도의 함수로서 억제 정도를 표현하는 S자형 곡선으로서 기술될 수 있다. 상기 곡선은 또한 이론상 농도가 체크포인트 효소의 활성을, 검정에서 관찰되는 최소 및 최대 효소 활성 사이의 차의 50% 수준으로 감소시키기에 충분한 지점을 통과한다. 상기 농도는 50% 억제에서의 억제 농도 또는 IC50 값으로서 정의된다.
IC50 값은 당업자에게 주지된 종래의 생화학적 (무세포) 검정 기술 또는 세포-기반 검정 기술을 사용하여 측정할 수 있다. 상기 검정의 예는 아래 실시예 1에 제공된다.
바람직하게는, IC50 값은 수득된 각 값의 평균 (산술 평균, 또는 "평균")으로서 표현되는 IC50 값을 이용하여 적절한 검정을 적어도 2회 수행하여 수득한다. 더욱 바람직하게는, 검정은 3 내지 10회 (또는 그 이상) 반복하며, IC50 값은 수득된 값의 평균으로서 표현된다. 가장 바람직하게는, 검정은 당업자에게 공지된 통계법을 사용하여, 통계적으로 신뢰할만한 평균 IC50 값을 생성하기에 충분한 횟수로 수행한다.
본 발명의 화합물은 예상외로 높은 시험관내 효능에 상응하는, 예상외로 낮은 IC50 값을 나타낸다. 본 발명의 화합물은, 아래 실시예 1에 기재된 바와 같이 검정하는 경우, 약 200 nM 미만, 일부 실시양태에서는 약 150 nM 미만, 다른 실시양태에서는 약 100 nM 미만, 그 밖에서는 약 50 nM 미만, 그 밖에서는 약 10 nM 미 만, 그 밖에서는 약 5 nM 미만의 IC50 값을 나타낸다. 다른 실시양태에서는, 본 발명의 화합물은 약 0.1 nM 내지 약 5 nM의 IC50 값을 나타낸다.
본 발명의 화합물은 다른 단백질 키나제를 능가하는, Chk1 억제 선택성을 나타낸다. 선택성은 역부작용을 감소시키고/시키거나 치료 지수를 증가시키는데 유리할 수 있다.
"선택성"은 본원에서 "배수 선택성"으로서 표현된다. 일반적으로, 본원에서 사용되는 바와 같은 배수 선택성은 비교자 효소의 IC50으로 나눈, 비교 효소에 대한 시험 화합물의 IC50이다. 특히, 본원에서 사용되는 바와 같은 Chk1 억제제에 대한 배수 선택성은 비교자 효소에 대한 IC50으로 나눈 Chk1 (비교 효소)에 대한 Chk1 억제제 (시험 화합물)의 IC50이다. 본 발명의 화합물을 대조하여 측정할 수 있는 비교자 효소는 적어도 다음의 단백질 키나제: Cdc2, Chk2, CTAK, EphA1, EphA2, Erk1, FGFR1, FGFR4, IR, JNK1, c-Kit, p38알파, p38베타, p38델타, Ros, Rse, Rsk2, TrkA, TrkB, 단백질 키나제 A, 단백질 키나제 C, pp60v-src, 단백질 키나제 B/Akt-1, p38MapK, p70S6K, 칼슘 칼모듈린-의존적 키나제 II, 및 ab1 티로신 키나제를 포함한다.
비교자 효소에 대한 시험 화합물에서의 IC50 값을 측정하기 위한 검정은 실시예 2에 기재되어 있으며, 당업자에게 주지되어 있다. 본 발명의 화합물은 앞서 언급한 시험 단백질 키나제에 비해 약 20배 이상의 선택성을 나타낸다. 일부 실시 양태에서는, 본 발명의 Chk1 억제제는 앞서 언급한 시험 단백질 키나제에 비해 약 50배 이상의 선택성, 다른 실시양태에서는 약 75배 이상의 선택성, 다른 실시양태에서는 약 100배 이상의 선택성을 나타낸다.
본 발명의 화합물은 세포-기반 검정에서 예상외로 높은 효능을 나타낸다. Chk1 억제제의 세포-기반 효능을 측정하기 위해서, 비정상적 증식 세포를 수반하는 세포-기반 모델에서 DNA 손상제의 성장-억제 효과를 증가시키는데 요구되는 Chk1 억제제의 농도를 측정하는 검정이 개발되었다. 상기의 세포-기반 효능의 측정치는 본원에서 "ECTFS" 값으로서 표현되며, 여기서 "ECTFS"는 DNA 손상제의 성장-억제 효과에 대하여 비정상적 증식 세포 집단의 2배의 감작을 생성하는, Chk1 억제제의 유효 농도이다. ECTFS는 세포 성장의 90% 억제에 요구되는 DNA 손상제의 양을 절반만큼 감소시키는, Chk1 억제제의 농도인 것으로 계산된다. 출원인은 본 발명의 화합물이 예상외로 높은 세포-기반 효능에 상응하는, 예상외로 낮은 ECTFS 값을 나타낸다는 것을 발견하였다.
측정할 수 있는 또다른 변수는 Chk1 억제제 화합물에 대하여 LD50 (세포의 50%의 성장을 억제하는 화합물 단독 용량)에서 얻어지는 배수 감작화이다. 상기 두 가지 값인 ECTFS 및 LD50에서의 배수 감작화로 서로에 대하여 Chk1 억제제의 효능 및 독성 모두를 직접 등급화한다.
ECTFS 값을 측정하는데 유용한 검정의 예는 아래 실시예 3에 기재한다. 간략 하게는, 상기 검정은 HT29 인간 결장 암종 세포를 비정상적 증식 세포 집단으로서, 겜시타빈을 DNA 손상제/Chk1 활성화제로서, 그리고 본 발명의 화합물을 Chk1 억제제로서 사용한다. 비정상적 증식 세포 집단을 배양하고 적합한 성장 배지 내에서 성장시킨다. 이후, 세포를 일정 범위의 농도에 걸쳐서 DNA 손상제에 가한다. 소정의 시간 이후에, DNA 손상제를 제거하고, 세포를 일정 범위의 농도에 걸쳐서 그리고 소정의 기간 동안 Chk1 억제제에 가한다. 이어서 배양된 세포의 플레이트를 수확하고, 생존한 세포의 상대적인 개수를 센다. 데이터를 대조군으로서 Chk1 억제제 단독에 대하여 정규화한 후, DNA 손상제 농도 대 상대적인 세포 생존 (100%를 1.0으로 함)의 대수/대수 그래프를 그린다. 배수 감작화는 Chk1 억제제를 사용한 것과 사용하지 않는 것 사이에서, 사용하는 Chk1 억제제의 각 농도에 대하여 90% 성장 억제를 달성하는데 요구되는 DNA 손상제의 양의 차로부터 유도된다. 이때 상기 데이터는 Chk1 억제제 농도 대 배수 감작화의 그래프로 그리고, 이것으로부터 ECTFS를 계산한다.
바람직하게는 ECTFS 값은 검정을 적어도 2회 수행하여 수득하며, ECTFS 값은 수득한 각 값의 평균으로 표현한다. 더욱 바람직하게는, 검정은 3 내지 10회 (또는 그 이상) 반복하며, ECTFS 값은 수득한 값의 평균으로 표현한다. 가장 바람직하게는, 검정은 당업자에게 공지되어 있는 통계법을 사용하여, 통계적으로 신뢰할만한 평균 ECTFS 값을 생성하는데 필요한 횟수로 수행한다.
ECTFS 검정에 적용한 모든 화합물은 약 1000 nM 미만의 ECTFS 값을 나타내었다. 반대로, 이미 공지된 구조적으로 유사한 화합물은 약 11,000 nM의 ECTFS 값을 나타낸다. 일부 실시양태에서는, 본 발명의 화합물은 약 500 nM 미만, 그 밖에서는 약 300 nM 미만, 그 밖에서는 약 200 nM 미만, 그 밖에서는 약 150 nM 미만, 그 밖에서는 약 100 nM 미만, 그 밖에서는 약 50 nM 미만, 그 밖에서는 약 30 nM 미만, 그 밖에서는 약 20 nM 미만, 또는 약 10 nM 미만, 또는 다른 실시양태에서는 약 5 nM 미만의 ECTFS 값을 나타낸다.
본 발명에 사용하기에 적합한 화합물 및 제약 조성물은, 그것이 의도하는 목적을 달성하기 위하여 활성 성분이 유효량으로 투여되는 것들을 포함한다. 더욱 구체적으로는, "치료 유효량"은 적응증을 겪는 개체를 치료하거나, 적응증의 현 증상을 완화시키기에 충분한 양을 의미한다. 치료 유효량의 결정은, 특히 본원에 제공되는 상세한 개시내용으로 미루어보아, 충분히 당업자의 능력 이내이다.
Chk1 억제제에 더하여, 본 발명의 제약 조성물은, 제약 조성물의 단독 투여로 인하여 발생하거나, 그와 연관될 수 있는 역부작용을 감소시키기 위해서, 생물학적 활성제, 예컨대 시토킨, 림포킨, 성장 인자, 기타 조혈 인자, 또는 그의 혼합물을 포함하도록 제형화될 수 있다. 다르게는, 상기 생물학적 활성제는 원하는 치료 효과를 촉진시키기 위해서 본 발명의 제약 조성물에 포함될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물에 유용한 생물학적 보조 활성제는 M-CSF, GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL- 14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IFN, TNF, G-CSF, Meg-CSF, GM-CSF, 트롬보포이에틴, 줄기세포 인자, 에리트로포이에틴, Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, 및/또는 인간 안지오포이에틴-유사 폴리펩티드를 비롯한 안지오포이에틴, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 안지오제닌, 골형성 단백질-1 (BMP-1), BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15, BMP 수용체 IA, BMP 수용체 IB, 뇌유래 신경영양성 인자, 섬모 향신경성 인자, 섬모 향신경성 인자 수용체 시토킨-유발 호중성 화학주성 인자 1, 시토킨-유발 호중성 화학주성 인자 2, 시토킨-유발 호중성 화학주성 인자 2, 내피 세포 성장 인자, 엔도셀린 1, 표피 성장 인자, 상피-유래 호중성 유인물질, 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 4, FGF 5, FGF 6, FGF 7, FGF 8, FGF 8b, FGF 8c, FGF 9, FGF 10, 산성 FGF, 염기성 FGF, 아교세포주-유래 향신경성 인자 수용체 1, 아교세포주-유래 향신경성 인자 수용체 2, 성장 관련 단백질, 성장 관련 단백질, 성장 관련 단백질, 성장 관련 단백질, 헤파린 결합 표피 성장 인자, 간세포 성장 인자, 간세포 성장 인자 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 I, 인슐린-유사 성장 인자 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 II, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질, 각질형성세포 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 백혈병 억제 인자 수용체, 신경 성장 인자, 신경 성장 인자 수용체, 신경영양인자-3, 신경영양인자-4, 태반 성장 인자, 태반 성장 인자 2, 혈소판-유래 내피 세포 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자 A 사슬, 혈소판 유래 성장 인자 AA, 혈소판 유래 성장 인자 AB, 혈소판 유래 성장 인자 B 사슬, 혈소판 유래 성장 인자 BB, 혈소판 유래 성장 인자 수용체, 혈소판 유래 성장 인자 수용체, 전-B 세포 성장 자극 인자, 줄기세포 인자, 줄기세포 인자 수용체, 전환 성장 인자 (TGF), TGF, TGF 1, TGF 1.2, TGF 2, TGF 3, TGF 5, 잠복성 TGF 1, TGF, 결합 단백질 I, TGF 결합 단백질 II, TGF 결합 단백질 III, 종양 괴사 인자 수용체 유형 I, 종양 괴사 인자 수용체 유형 II, 우로키나제-유형 플라스미노겐 활성화제 수용체, 혈관 내피 성장 인자, 및 그의 키메라 단백질 및 생물학적 또는 면역학적 활성 단편을 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다.
구조 화학식 I 및 II의 화합물은 또한 치료적 사용 방법에서 화합물의 이로운 특성을 촉진 (또는 바람직하지 못한 특성을 완화)시키는 보조 부분에 콘쥬게이트 또는 연결될 수 있다. 상기 콘쥬게이트는 특정한 해부학적 부위 또는 관심 영역 (예를 들어, 종양)으로의 상기 화합물의 전달을 강화시키고, 표적 세포에서 상기 화합물의 치료적 농도의 유지를 가능케 하고, 상기 화합물의 약동학 및 약력학 특성을 변경시키고, 및/또는 상기 화합물의 치료 지수 또는 안전성 프로파일을 향상시킬 수 있다. 적합한 보조 부분은, 예를 들어, 아미노산, 올리고펩티드, 또는 폴리펩티드, 예를 들어, 항체 예컨대 모노클로날 항체 및 기타 조작된 항체; 및 표적 세포 또는 조직에서의 수용체에 대한 천연 또는 합성 리간드를 포함한다. 기타 적합한 보조제는 생체분포 및/또는 표적 세포에 의한 화합물의 흡수를 촉진시키는 지방산 또는 지질 부분을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Bradley et al., Clin . Cancer Res. 7:3229, 2001] 참고).
본 발명의 제형은 지적된 질환의 치료에 대한 표준 방식으로, 예컨대 경구로, 비경구로, 경점막으로 (예를 들어, 설하로 또는 구강 투여를 통해서), 국소적 으로, 경피로, 직장으로, 흡입 (예를 들어, 비강 또는 깊은 폐 흡입)을 통해서 투여될 수 있다. 비경구 투여는 정맥내, 동맥내, 복막내, 피하, 근육내, 경막내, 및 관절내를 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다. 비경구 투여는 또한 파우더젝트(POWDERJECT(등록상표)) (영국 옥스포드 소재의 파우더젝트 파마슈티컬스, 피엘씨(Powderject Pharmaceuticals, Plc))와 같은 고압 기술을 사용하여 수행할 수 있다.
경구 투여 및 구강 투여에 있어서, 상기 조성물은 통상의 방식으로 제형화된 정제 또는 로젠지의 형태일 수 있다. 예를 들어, 정제 및 캡슐제는 통상의 부형제, 예컨대 결합제 (예를 들어, 시럽, 아카시아, 젤라틴, 소르비톨, 트라가칸트, 전분 점액, 또는 폴리비닐피롤리돈), 충전제 (예를 들어, 락토스, 당, 미세결정질 셀룰로스, 옥수수-전분, 인산칼슘, 또는 소르비톨), 윤활제 (예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 탈크, 폴리에틸렌 글리콜 또는 실리카), 붕해제 (예를 들어, 감자 전분 또는 나트륨 전분 글리콜레이트), 또는 습윤화제 (예를 들어, 나트륨 라우릴 술페이트)를 함유할 수 있다. 정제는 당업계에 주지된 방법에 따라서 코팅할 수 있다.
다르게는, 본 발명의 화합물은 예를 들어, 수성 또는 유성 현탁액제, 용액제, 에멀션, 시럽, 또는 엘릭시르와 같은 경구 액체 제제로 혼입될 수 있다. 또한, 상기 화합물을 함유하는 제형은 사용하기 전에 물 또는 기타 적합한 비히클과의 구성을 위한 건조 생성물로서 존재할 수 있다. 상기 액체 제제는 통상의 첨가제, 예를 들어 현탁화제, 예컨대 소르비톨 시럽, 메틸 셀룰로스, 글루코스/당 시 럽, 젤라틴, 히드록시에틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 알루미늄 스테아레이트 겔, 및 수소화된 식용 지방; 유화제, 예컨대 레시틴, 소르비탄 모노올레이트, 또는 아카시아; 비수성 비히클 (식용유를 포함할 수 있음), 예컨대 아몬드 오일, 분획화된 코코넛 오일, 유성 에스테르, 프로필렌 글리콜, 및 에틸 알코올; 및 보존제, 예컨대 메틸 또는 프로필 p-히드록시벤조에이트 및 소르브산을 함유할 수 있다.
제제는 또한, 예를 들어, 통상의 좌제 베이스, 예컨대 코코아 버터 또는 기타 글리세리드를 함유하는 좌제로서 제형화될 수 있다. 흡입용 조성물은 전형적으로는 건조 분말로서 또는 통상의 추진제, 예컨대 디클로로디플루오로메탄 또는 트리클로로플루오로메탄을 사용하는 에어로졸의 형태로 투여될 수 있는 용액제, 현탁액제, 또는 에멀션의 형태로 제공될 수 있다.
국소 및 경피 제형은 통상의 수성 또는 비수성 비히클, 예컨대 점안제, 크림, 연고, 로션, 및 페이스트를 포함하거나, 약물첨가된 석고, 패치, 또는 막의 형태이다.
추가로, 본 발명의 조성물은 주사 또는 지속적 주입에 의한 투여용으로 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 유성 또는 수성 비히클 중 현탁액제, 용액제, 또는 에멀션의 형태일 수 있고, 제형화제, 예컨대 현탁화제, 안정화제, 및/또는 분산화제를 함유할 수 있다. 다르게는, 활성 성분은 사용하기 전에 적합한 비히클 (예를 들어, 무-발열원의 멸균수)과의 구성을 위한 분말 형태일 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 저장 제제로서 제형화될 수 있다. 상기의 장기 작 용성 제형은 이식에 의해서 (예를 들어, 피하로 또는 근육내로) 또는 근육내 주사에 의해서 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물은 적합한 중합체성 물질 (예를 들어, 수용성 중합체), 소수성 물질 (예를 들어, 허용가능한 오일 중 에멀션), 이온 교환 수지, 또는 난용성 유도체 (예를 들어, 난용성 염)와 함께 제형화될 수 있다.
수의학적 용도에 있어서, 화학식 I 또는 II의 화합물, 또는 그의 제약상 허용가능한 염, 프로드러그, 또는 용매화물은 통상의 수의학적 관례에 따라서 적합하게 허용가능한 제형으로서 투여된다. 수의사는 특정 동물에게 가장 적당한 투약 처방계획 및 투여 경로를 쉽게 결정할 수 있다. 본 화합물 및 방법에 의해서 치료가능한 동물은 애완동물, 가축, 공연용 동물, 및 동물원의 표본동물을 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다.
합성법
본 발명의 화합물은 하기의 합성 반응식에 의해서 제조할 수 있다. 우선, 본원에 기재된 Chk1 억제제를 제조하는데 사용되는 알콕시아릴아민은 여러가지 일반 합성 반응식에 의해서 제조할 수 있다. 예를 들어, 일반 반응식 1은 니트로페닐 에테르 생성물을 제공하기 위해서, 계내에서 형성되거나 독립적으로 제조 및 단리되는, 알코올의 활성화된 형태와 니트로페놀의 반응을 개괄한다. 표준 조건 하에서 에테르의 환원은 본 발명의 화합물을 생성하는데 사용되는 아릴아민을 제공한다.
다르게는, 강염기, 예컨대 수소화나트륨 또는 칼륨 비스(트리메틸실릴)아미드의 존재 하에 할로 니트로벤젠과 알코올의 반응 또한 일반 반응식 2에 예시하는 바와 같이 니트로아릴 에테르를 제공한다. 이어서 상기 에테르를 일반 반응식 1에 나타낸 바와 같이 환원시킨다.
아릴아민의 우레아로의 전환은 여러 합성 반응식 중 하나에 의해서 달성할 수 있다. 예를 들어, 아릴아민을 피라진 카르바메이트와 반응시켜서, 일반 반응식 3에 예시한 바와 같이 우레아를 수득할 수 있다.
다르게는, 일반 반응식 4에 약술하는 바와 같이, 아실 아지드의 열 유발 분해는 반응성 아릴 이소시아네이트를 생성하며, 이어서 이것을 아릴아민과 반응시켜서, 원하는 우레아를 수득한다.
일반 반응식 5에 예시한 또다른 접근법은 포스겐 또는 포스겐 등가물을 활용하여 2개의 아릴아민을 커플링시키고, 우레아를 제공한다.
본원에 기재된 합성에서 사용하는 약어는 다음과 같다: 시간 (h), 분 (min), 평방인치 당 파운드 (psi), 포화된 (sat'd), 물 (H2O), 탈이온화된 (DI), 이소프로필 알코올 (iPrOH), 탄소 상 백금 (Pt/C), 질소 (N2), 수소 (H2), 탄소 상 팔라듐 (Pd/C), 산화백금 (Pt2O), 마그네슘 술페이트 (MgSO4), 염산 (HCl), 디이소프로필 아조디카르복실레이트 (DIAD), 메틸렌 클로라이드 (CH2Cl2), 클로로포름 (CHCl3), 메탄올 (MeOH), 수산화암모늄 (NH4OH), 테트라히드로푸란 (THF), N-메틸피롤리돈 (NMP), 아세트산 (AcOH), NaOH (NaOH), EtOAc (EtOAc), 에탄올 (EtOH), 디메틸 술폭시드 (DMSO), 중수소화된 디메틸 술폭시드 (d6-DMSO), 탄산나트륨 (Na2CO3), 중수소화된 클로로포름 (CDCl3), 중탄산나트륨 (NaHCO3), 수소화나트륨 (NaH), TEA (TEA), 탄산세슘 (CS2CO3), 이산화탄소 (CO2), 수산화팔라듐 (Pd(OH)2), 황산 (H2SO4), 질산 (HNO3), 염화나트륨 (NaCl), 황산나트륨 (Na2SO4), 및 디메틸포름아미드 (DMF).
화합물의 제법
본 발명의 하기의 화합물을 앞서 개시한 일반 반응식을 사용하여 제조하였다. 본 발명의 추가의 화합물은 상기 일반 반응식을 사용하고, 특정 합성법에 따라서, 출발 물질의 적절한 선택에 의해서 제조할 수 있다.
화합물 1
1-[5-클로로-2-S-([1,4]옥사제판-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
단계 1: 2-아미노-5-메틸피라진. 아미노-말로노니트릴 p-톨루엔술포네이트 염 (20.0 g, 79 m㏖) 및 피루브알데히드 1-옥심 (6.88 g, 79 m㏖)을 플라스크 내에서 합쳤다. iPrOH (140 ㎖)를 첨가하고, 생성된 황색 슬러리를 실온에서 18 h 동안 교반하였고, 그 시간 도중에 황색 침전물이 축적되었다. 혼합물을 여과하고, 침전물을 iPrOH (2 × 50 ㎖) 및 DI H2O (20 ㎖)로 세척한 후, 동결건조시켜서 2-아 미노-3-시아노-5-메틸피라진 N-옥시드 (10.7 g)를 얻었다.
피라진 N-옥시드를 MeOH (22 ㎖) 및 AcOH (5 ㎖)에 현탁시켰다. 여기에, 5% Pt/C (1.6 g) 및 다르코(Darco) KB-B (8 g)를 조심스럽게 첨가하였다. 혼합물에 H2를 60 psi에서 18 h 동안 흡수시켰다. 반응을 25% NaOH (34 ㎖)로 켄칭시키고, N2로 30 min 동안 퍼지하였다. 혼합물을 습식 셀라이트 층을 통해서 여과하고, MeOH (4 × 100 ㎖)로 세척하였다. 여과액을 진공에서 농축시켜서 부피를 1/4이 되게 하였다. 여과액을 EtOAc (150 ㎖)로 희석하고, 5% NaOH (30 ㎖)로 세척하고, EtOAc (2 × 70 ㎖)로 역추출하였다. 유기층을 합치고, sat'd NaCl (20 ㎖)로 세척하고, 여과하고, 진공에서 농축시켜서 오렌지색의 점착성 고체 (5.16 g)를 얻었다.
단계 2: (5-메틸피라진-2-일)카르밤산 페닐 에스테르. 2-아미노-5-메틸피라진 (5.16 g, 47 m㏖)을 CH2Cl2 (52 ㎖)에 용해시키고, 교반하고, N2 하에 0℃로 냉각시켰다. 여기에, 피리딘 (4.8 ㎖, 59 m㏖)을 첨가한 후, 페닐 클로로포르메이트(6.2 ㎖, 59 m㏖)를 15 min에 걸쳐서 적가하여 침전물을 형성시켰다. 혼합물을 0℃에서 1 h 동안 교반하였다. 이어서 반응을 0.25 M HCl (40 ㎖) 및 무수 에테르 (50 ㎖)로 켄칭시키고, 0℃에서 30 min 동안 교반하였다. 침전물을 여과에 의해서 단리하고, DI H2O (20 ㎖) 및 에테르 (2 × 25 ㎖)로 세척하고, 진공 하에 건조시켜서, 생성물 (7.4 g)을 백색의 솜털상 분말로서 얻었다.
단계 3: (S)-2-히드록시메틸-[1,4]옥사제판-4-카르복실산 tert-부틸 에스테 르. 250 ㎖ 둥근바닥 플라스크에 (S)-(+)-벤질 글리시딜 에테르 (1.31 g, 7.9 m㏖), 3-벤질아미노-프로판-1-올 (1.3 g, 7.9 m㏖) 및 10 ㎖ EtOH를 첨가하였다. 혼합물을 40℃로 15 h 동안 가열하였다. 반응을 냉각시키고 진공에서 농축시키고, 생성된 유성 생성물을 추가의 정제 없이 사용하였다. 상기 디올을 250 ㎖ 둥근바닥 플라스크에 넣고, 75 ㎖ 건조 피리딘에 용해시켰다. 용액을 0℃로 냉각시키고, 톨루엔 술포닐 클로라이드 (5.27 g, 27.7 m㏖)를 한번에 첨가하였다. 반응 온도를 0℃에서 조심스럽게 유지하면서, 혼합물을 6 h 동안 교반하였다. 상기 저온의 반응물을 50 ㎖ sat'd NaHCO3 수용액으로 켄칭시켰다. 추가로 20 ㎖의 물을 첨가하고, 혼합물을 EtOAc 100 ㎖씩으로 3회 추출하였다. 합친 유기물을 Na2SO4로 건조시키고, 진공에서 농축시켰다. 이어서 상기 알코올을 25-50% 구배의 EtOAc 및 헥산을 용리액으로서 사용하여 칼럼 크로마토그래피에 의해서 정제하였다. 이로써 1.39 g의 토실 알코올을 황색 오일로서 수득하였다.
상기 알코올을 50 ㎖ DMF에 용해시키고, 0℃로 냉각시켰다. 상기 저온의 교반 혼합물에 조심스럽게 95 중량% NaH (0.29 g, 11.5 m㏖)를 첨가하였다. 반응을 0℃에서 15 min 동안 교반한 후, 천천히 실온으로 가온시키고, 6 h 교반하였다. 반응물을 조심스럽게 50 ㎖의 물로 켄칭시키고, EtOAc 50 ㎖씩으로 3회 추출하였다. 합친 유기물을 Na2SO4로 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 조 생성물을 EtOH에 녹이고, 파르(Parr) 수소화 장치에 넣었다. 또한 상기 용액에 10 중량% Pd/C (0.426 g, 0.30 m㏖) 및 2M HCl (2.1 ㎖)을 첨가하였다. 50 psi에서 2일 동 안 수소화를 실시하였고, 그 지점에서 LCMS 분석에 의하면 반응은 끝난 것으로 간주되었다. 상기 용액을 sat'd NaHCO3 수용액으로 중화시키고, CHCl3:iPrOH의 3:1 혼합물을 사용하여 추출하였다. 합친 유기물을 진공 하에 농축시키고, 조 생성물을 다음 단계에 이용하였다.
조 아미노 알코올을 100 ㎖ 건조 CH2Cl2에 용해시켰다. 상기 용액에 TEA (1.59 ㎖, 11.5 m㏖) 및 디-tert-부틸 디카보네이트 (5.74 g, 5.74 m㏖)를 첨가하였다. 상기 용액을 실온에서 18 h 동안 교반한 후, sat'd NaHCO3 수용액으로 켄칭시키고, CH2Cl2 50 ㎖씩을 사용하여 3회 추출하였다. 합친 유기물을 Na2SO4로 건조시키고, 진공에서 농축시켰다. 생성물을 25-50% 구배의 EtOAc/헥산을 사용하여 칼럼 크로마토그래피에 의해서 정제하였다. 이로써 0.240 g의 옥사자판 알코올을 황색 오일로서 수득하였다.
단계 4: (S)-2-(4-클로로-2-니트로-페녹시메틸)-[1,4]옥사제판-4-카르복실산 tert-부틸 에스테르. 50 ㎖ 둥근 바닥 플라스크에 옥사자판 알코올 (0.240 g, 1.03 m㏖), TEA (0.21 ㎖, 1.545 m㏖), 및 10 ㎖ 건조 CH2Cl2를 첨가하였다. 상기 용액을 0℃로 냉각시키고, 메탄 술포닐 클로라이드 (0.10 ㎖)를 적가하였다. 혼합물을 1.5 h 동안 0℃에서 교반한 후, 물로 갑자기 켄칭시켰다. 층을 분리하고, 수성층을 20 ㎖ CH2Cl2로 1회 추출하였다. 합친 유기물을 Na2SO4로 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 이어서 조 메실레이트를 5 ㎖ 건조 DMF에 용해시켰다. 상기 용 액에 Cs2CO3 (0.671 g, 2.06 m㏖) 및 4-클로로-2-니트로-페놀 (0.215 g, 1.24 m㏖)을 첨가하였다. 이어서 상기 밝은 황색 용액을 밤새 100℃로 가열하였다. 반응물을 실온으로 냉각시키고, 50 ㎖의 물로 켄칭시키고, EtOAc 50 ㎖씩으로 3회 추출하였다. 생성물을 10-35% 구배의 EtOAc/헥산을 사용하여 플래시 크로마토그래피에 의해서 정제하였다. 상기 순서의 단계로써 0.120 g의 니트로페닐 옥사자판을 밝은 황색 오일로서 수득하였다.
단계 5: 1-[5-클로로-2-([1,4]옥사제판-2-(S)-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아. 25 ㎖ 둥근 바닥 플라스크에 5 ㎖ MeOH 중 니트로페닐 옥사자판 (0.120 g, 0.31 m㏖) 및 Pt2O (0.007 g, 0.03 m㏖)를 넣었다. 헬륨 풍선을 부착하고, 흡입기를 사용하여 플라스크를 비우고, H2로 3회 백필링한 후, H2 하에 2 h 동안 교반하였다. 반응물을 셀라이트를 통해서 여과하고, 셀라이트 패드를 MeOH 20 ㎖씩으로 2회 세척하였다. 상기 용액을 진공에서 농축시켰다. 조 아닐린을 5 ㎖의 건조 DMF에 용해시켰다. 상기 용액에 TEA (0.005 ㎖, 0.34 m㏖) 및 (5-메틸피라진-2-일)카르밤산 페닐 에스테르 (0.07 g, 0.31 m㏖)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 18 h 교반하였다. 용매를 진공 하에 제거하고, 잔류물을 10 ㎖ EtOAc에 재용해시키고, sat'd NaHCO3 수용액으로 세척하였다. 유기물을 Na2SO4로 건조시키고, 감압에서 농축시켰다. 회색/갈색 잔류물을 3 ㎖ CH2Cl2로 덮고, 여기에 1 ㎖ 진한 트리플루오로아세트산을 첨가하였다. 산 첨가시, 모든 고체가 용해 되었다. 반응물을 실온에서 4 h 동안 교반하고, 이 때 용액이 pH 8에 도달할 때까지 sat'd NaHCO3 수용액을 첨가하였다. 혼합물을 CHCl3:iPrOH의 3:1 혼합물 10 ㎖씩으로 3회 추출하였다. 이어서 합친 유기물을 Na2SO4로 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 이어서 회백색 고체를 EtOAc 중 연화처리(trituration)하고, 중간 프릿화 필터를 통해서 여과하고, 50 ㎖의 EtOAc로 세척하였다. 백색 고체를 진공 하에 완전히 건조시켰다. 이 순서로 0.020 g의 원하는 우레아를 미세한 백색 분말로서 수득하였다.
화합물 2
1-[5-클로로-2-(R-모르폴린-3-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
단계 1: 3-히드록시메틸-S-모르폴린-4-카르복실산 tert-부틸 에스테르. 건 조 THF (40 ㎖) 중 모르폴린-3-R-4-디카르복실산 4-tert-부틸 에스테르 (1.00 g, 4.32 m㏖)의 냉각된 (0℃ 배쓰) 용액에 보란 (THF 중 4.76 ㎖의 1M 용액, 4.76 m㏖)을 15 min에 걸쳐서 질소 분위기 하에 적가하였다. 1 h 동안 교반한 후, 배쓰를 제거하고, 추가로 3 h 동안 주변 온도에서 계속 교반하였다. 이어서 아세트산 (14.3 ㎖의 1M 수용액, 14.3 m㏖)을 첨가하였다. 1 h 동안 교반한 후, 과량의 수성 포화 중탄산나트륨의 첨가에 의해서 용액을 중화시켰다. 디클로로메탄 (20 ㎖)을 첨가하고, 용액을 15 min 동안 교반한 후, 층을 분리하였다. 수성층을 CH2Cl2 (3 × 20 ㎖)로 추출하고, 합친 유기층을 건조 (MgSO4)시키고, 여과하였다. 여과된 용액을 농축시켜서 백색 고체 (0.46 g)가 되게 하였다.
단계 2: 3-(4-클로로-2-니트로-페녹시메틸)-R-모르폴린-4-카르복실산 tert-부틸 에스테르. 건조 THF (40 ㎖) 중 3-히드록시메틸-S-모르폴린-4-카르복실산 tert-부틸 에스테르 (0.13 g, 0.60 m㏖) 및 5-클로로-2-플루오로니트로벤젠 (0.11 g, 0.66 m㏖)의 냉각된 (-78℃ 배쓰) 교반 용액에 칼륨 비스(트리메틸실릴)아미드 (THF 중 2.4 ㎖의 0.5M 용액, 1.2 m㏖)를 15 min에 걸쳐서 질소 분위기 하에 적가하였다. 추가로 15 min 교반한 후, 수성 포화 염화암모늄 (10 ㎖)을 첨가하고, 배쓰를 제거하여, 용액을 주변 온도로 가온시켰다. 추가로 1 시간 동안 교반한 후, 물 (15 ㎖) 및 CH2Cl2 (10 ㎖)를 첨가하고, 5 min 동안 교반하고, 층을 분리하였다. 수성층을 CH2Cl2 (2 × 10 ㎖)로 추출하고, 합친 유기층을 건조 (MgSO4)시키고, 여과하였다. 여과된 용액을 농축시켜서 황색 오일 (0.26 g)이 되게 하고, 이것을 헥 산/EtOAc (1:1)로 용출시키는 칼럼 크로마토그래피에 의해서 정제하여 연황색 오일 (0.195 g)을 얻었다.
단계 3: 3-(2-아미노-4-클로로-페녹시메틸)-R-모르폴린-4-카르복실산 tert-부틸 에스테르. MeOH (4 ㎖) 중 3-(4-클로로-2-니트로-페녹시메틸)-R-모르폴린-4-카르복실산 tert-부틸 에스테르 (0.17 g, 0.46 m㏖)의 교반 용액에 Pt2O (0.020 g, 0.088 m㏖)를 첨가하였다. 플라스크를 비운 후, H2로 3회 반복하여 백필링하였다. 4 h 동안 교반한 후, 용액을 셀라이트 패드로 여과하고, 여과액을 농축시켜서 생성물을 황색 오일로서 얻었다.
단계 4: 3-{4-클로로-2-[3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레이도]-페녹시메틸}-R-모르폴린-4-카르복실산 tert-부틸 에스테르. 건조 DMF (2 ㎖) 중 상기 황색 오일 및 (5-메틸-피라진-2-일)-카르밤산 페닐 에스테르 (0.13 g, 0.57 m㏖)의 용액을 제조하고, TEA (0.074 ㎖, 0.53 m㏖)를 첨가하였다. 24 h 동안 교반한 후, 반응물을 감압 하에 농축시킨 후, 물 (10 ㎖) 및 EtOAc (10 ㎖)에 재용해시켰다. 15 min 동안 교반한 후, 층을 분리하고, 수성층을 EtOAc (2 × 10 ㎖)로 추출하고, 합친 유기층을 염수 (10 ㎖)로 세척한 후, 건조 (Na2SO4)시키고 여과하였다. 여과된 용액을 농축시킨 후, EtOAc/CH2Cl2 (1:1)로 용출시키는 칼럼 크로마토그래피에 의해서 정제하여 황색 오일 (0.8 g)을 얻었다.
단계 5: 1-[5-클로로-2-(R-모르폴린-3-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진- 2-일)-우레아. CH2Cl2 (6 ㎖) 중 3-{4-클로로-2-[3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레이도]-페녹시메틸}-R-모르폴린-4-카르복실산 tert-부틸 에스테르 (0.8 g)의 교반 용액에 트리플루오로아세트산 (3 ㎖)을 첨가하였다. 5 h 교반한 후, 상기 용액을 염기성이 될 때까지 탄산칼륨 수용액 (1M)으로 처리한 후, 30 min 동안 교반하였다. 층을 분리하고, 수성층을 CH2Cl2 (3 × 10 ㎖)로 추출하였다. 합친 유기층을 건조 (MgSO4)시키고, 여과하였다. 여과된 용액을 농축시킨 후, MeOH/CH2Cl2 (1:9)로 용출시키는 칼럼 크로마토그래피에 의해서 정제하여 담황색 고체 (0.0523 g)를 얻었다.
화합물 3
1-[2-(1,4-디메틸-피페라진-2-일메톡시)-5-메틸-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
단계 1: 1,4-디메틸-2-(4-메틸-2-니트로-페녹시메틸)-피페라진. 4-메틸-2- 니트로-페놀 (0.95 g, 6.20 m㏖), (1,4-디메틸-피페라진-2-일)-MeOH (0.98 g, 6.82 m㏖), 및 트리페닐포스핀 (1.79 g, 6.82 m㏖)을 THF 중 합치고, 5 min 동안 교반한 후, DIAD (1.38 g, 6.82 m㏖)로 처리하였다. 반응물을 밤새 교반하였다. 진공 하에 농축시켜서 오렌지색 오일을 얻었고, 이것을 EtOAc에 용해시키고, 2M HCl 수용액으로 추출하였다. 수성 세척물을 합치고, EtOAc로 세척하고, 염기성이 될 때까지 고체 NaOH로 처리하였다. 생성된 수성 혼합물을 EtOAc로 추출하고, 합친 유기 추출물을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공에서 농축시켜서 갈색 오일을 얻었다. 플래시 크로마토그래피 (CH2Cl2 중 1% MeOH)에 의해서 1.0 g의 원하는 아릴 에테르를 얻었다.
단계 2: 2-(1,4-디메틸-피페라진-2-일메톡시)-5-메틸-페닐아민. 1,4-디메틸-2-(4-메틸-2-니트로-페녹시메틸)-피페라진 (1.02 g, 3.65 m㏖)을 MeOH (75 ㎖)에 용해시키고, 혼합물이 혼탁해질 때까지, sat'd 염화암모늄 수용액으로 처리하였다. 아연 (0.24 g, 3.65 m㏖)을 첨가하였다. 생성된 따뜻한 반응 혼합물을 추가로 30 min 동안 교반하였고, 이때 LCMS는 출발 물질이 소모되었음을 나타내었다. 반응물을 EtOAc 및 수성 Na2CO3로 희석하고, 층을 분리하였다. 유기층을 NaCl 포화 용액으로 세척하고, 고체 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 혼합물을 여과하고 진공에서 농축시켜서, 원하는 아닐린을 얻었다.
단계 3: 1-[2-(1,4-디메틸-피페라진-2-일메톡시)-5-메틸-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아. 5-메틸-피라진-2-카르복실산 (691 ㎎, 5 m㏖)을 톨루엔 (15 ㎖) 중 교반하고, TEA (765 ㎖, 5.5 m㏖)에 이어서 디페닐포스포릴 아지드 (1.0 ㎖, 5.0 m㏖)로 처리하였다. 생성된 용액을 30 min 동안 교반한 후, 직접 사용하였다.
톨루엔 중 5-메틸-피라진-2-카르보닐 아지드 (1.0 m㏖) 용액을 90℃에서 10 min 동안 가열하였다. 반응 플라스크를 가열 배쓰에서 치우고, 갈색 용액을 2-(1,4-디메틸-피페라진-2-일메톡시)-5-메틸-페닐아민 (0.25 g, 1.0 m㏖)으로 처리하였다. 플라스크를 가열 배쓰로 되돌리고, 40℃에서 4 h 동안 가열하였다. 혼합물을 냉각시킨 후, 여과하여 생성물을 황갈색 분말로서 얻었다.
화합물 4
1-[4,5-디클로로-2-(S-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
단계 1: (S)-2-히드록시메틸-모르폴린-4-카르복실산 tert-부틸 에스테르. 500 ㎖ 플라스크에서 (S)-벤질 글리시딜 에테르 (15 g, 91.4 m㏖), MeOH (10 ㎖), 및 50 중량% NaOH (30 ㎖, 365 m㏖)를 합쳤다. 상기 혼합물에 2-아미노에틸술페이트 (25.8 g, 183 m㏖)를 나누어 첨가하였다. 상기 비균질 혼합물을 40℃로 가열하였고, 그 지점에서 용액이 균질해졌다. 온도를 40℃에서 4 h 동안 유지하였다. 반응물을 조금 냉각시키고, 추가의 고체 NaOH (14.6 g, 365 m㏖)를 50 ㎖ 톨루엔과 함께 첨가하였다. 이어서 상기 2상 용액을 65℃로 12 h 동안 가열하였다. 반응물을 실온으로 냉각시키고, 층을 분리하고 수성층을 75 ㎖의 톨루엔으로 1회 추출하였다. 합친 유기층을 1M HCl 75 ㎖씩으로 3회 세척하였다. 합친 수성층의 pH를 NaOH 수용액을 이용하여 pH 12로 조절하고, EtOAc 70 ㎖씩으로 4회 추출하였다. 합친 유기물을 Na2SO4로 건조시키고, 진공에서 농축시켜서 10.084 g의 원하는 모르폴린을 불투명한 오일로서 수득하였다.
조 모르폴린 생성물을 CH2Cl2 (100 ㎖) 및 TEA (12.1 ㎖, 87.5 m㏖)에 용해시키고, CO2 가스의 발생을 수반하는 디-tert-부틸 디카보네이트 (15.9 g, 73 m㏖)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 18 h 동안 교반한 후, 35 ㎖ sat'd NaHCO3 수용액으로 켄칭시켰다. 추가의 50 ㎖ 물을 첨가하고, 층을 분리하였다. 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 진공에서 농축시키고 플래시 크로마토그래피 (20% EtOAc/헥산)에 의해서 정제하여 원하는 N-Boc-O-벤질 모르폴린을 담황색 오일 (5.536 g)로서 얻었다.
정제된 이보호 모르폴린을 50 L 무수 EtOH에 용해시키고, Pd(OH)2 (1.26 g, 20 중량%, 1.8 m㏖)를 첨가하였다. 수소 풍선을 부착시키고, 플라스크를 흡입기를 사용하여 비우고, H2로 3회 백필링하였다. 반응물을 H2 하에 30 h 동안 교반하였다. 혼합물을 셀라이트로 여과하고, 셀라이트 패드를 EtOH로 완전히 헹궜다. 여과된 용액을 진공 하에 농축시켜서, 원하는 N-boc-모르폴린 알코올을 담백색 고체 (3.918 g)로서 수득하였다.
단계 2: 4,5-디클로로-2-니트로-페놀. 50 ㎖ CH2Cl2 중 3,4-디클로로페놀 (3.053 g, 18.7 m㏖)로 충전한 250 ㎖ 둥근바닥 플라스크를 얼음조에서 0℃로 냉각시켰다. 상기 교반 용액에 진한 H2SO4 (1.56 ㎖, 28.1 m㏖)를 첨가하였다. 용액이 혼탁해졌다. 상기 혼합물에 진한 HNO3 (1.2 ㎖, 18.7 m㏖)를 적가하고, 온도를 5℃ 미만으로 조심스럽게 유지하였다. 반응물을 30 min 동안 0℃에서 교반한 후, 얼음조로 냉각시키고 150 ㎖ H2O로 켄칭시켰다. 층을 분리하고, 수성층을 35 ㎖ CH2Cl2로 1회 추출하였다. 합친 유기물을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 진공 하에 농축시키고, 플래시 크로마토그래피 (용리액으로서 10% EtOAc/헥산)를 사용하여 정제하여 원하는 니트로페놀을 밝은 황색 고체 (1.793 g)로서 수득하였다.
단계 3: 1-[4,5-디클로로-2-(S-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아. 화합물 1, 단계 4 및 5에서의 절차에 따라, 4,5-디클로로-2-니트로-페놀 및 (S)-2-벤질옥시메틸-모르폴린-4-카르복실산 tert-부틸 에스테르를 사 용하여 제조하였다.
화합물 5
1-(5-시아노-피라진-2-일)-3-[5-메틸-2-(4-메틸-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-우레아
단계 1: 5-브로모-피라진-2-일아민. CH2Cl2 (200 ㎖) 중 피라진-2-일아민 (6.66 g, 70 m㏖) 용액을 0℃로 냉각시키고, N-브로모숙신아미드 (12.5 g, 70 m㏖)로 처리하고, 실온으로 가온시켰다. 생성된 반응 혼합물을 밤새 교반한 후, 추가의 CH2Cl2 (200 ㎖)로 희석시키고, 10% Na2CO3 수용액으로 세척하였다. 층을 분리하고, 유기층을 sat'd NaCl 수용액으로 세척한 후, 무수 MgSO4로 건조시키고 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 EtOAc (50 ㎖)에 녹이고, 생성물을 헥산 (300 ㎖)의 첨가에 의해서 침전시켰다. 침전물을 진공 하에 건조시켜서 5.57 g의 갈색 고체를 수득하였다.
단계 2: 5-아미노-피라진-2-카르보니트릴. 5-브로모-피라진-2-일아민을 DMF (15 ㎖) 중 구리 (I) 요오다이드 (1.3 g, 6.9 m㏖), 시안화칼륨 (0.44 g, 6.8 m㏖), 테트라키스 (트리페닐포스핀)팔라듐(0) (0.95 g, 0.83 m㏖), 및 18-크라운-6 (0.058 g, 0.22 m㏖)과 합쳤다. 생성된 혼합물을 40 min 동안 교반한 후, 환류 (155℃) 하에 2 h 동안 가열시켰다. 반응물을 실온으로 냉각시킨 후, 밤새 정치시켰다. 침전물을 여과에 의해서 분리하고, 여과액을 진공에서 농축시켜 건조시켰다. 오렌지색 잔류물을 EtOAc 및 헥산에 녹였고, 초기 침전물이 형성된 후, 여과에 의해서 분리하였다. 정치시, 추가의 침전물이 모액 내에 형성되었고, 이것을 여과에 의해서 수집하였다. 고체를 합쳐서 0.10 g의 밝은 오렌지색 고체를 수득하였다.
단계 3: 2-{2-[3-(5-시아노-피라진-2-일)-우레이도]-4-메틸-페녹시메틸}-모르폴린-4-카르복실산 tert-부틸 에스테르. 2-(2-아미노-4-메틸-페녹시메틸)-모르폴린-4-카르복실산 tert-부틸 에스테르 (0.087 g, 0.270 m㏖)를 2-아미노-4-메틸-페놀로부터 화합물 3, 단계 1 및 2의 방법에 따라서 2-히드록시메틸-모르폴린-4-카르복실산 tert-부틸 에스테르 (화합물 2, 단계 1에서의 절차에 따라서 상응하는 산을 사용하여 제조) 및 4-메틸-2-니트로-페놀을 사용하여 제조하였다. 이것을 트리포스겐 (0.029 g, 0.10 m㏖), 톨루엔 (2 ㎖) 및 허니그(Hunig) 염기 (0.15 ㎖, 0.86 m㏖)와 합치고, 실온에서 25 min 동안 교반하였다. 이어서 현탁액을 캐뉼러를 통해서, 5-아미노-피라진-2-카르보니트릴 (0.032 g, 0.27 m㏖), 및 THF (1 ㎖) 중 리튬 비스(트리메틸실릴)아미드 (0.27 m㏖)를 함유하는 저온 용액 (-78℃)으로 옮기고, 이것을 -78℃에서 30 min 동안 교반하였다. 반응물을 가온시킨 후, 16 h 동안 실온에서 교반하였다. 침전물이 형성되었고, 여과에 의해서 수집하여 원하는 생성물 (0.043 g)을 수득하였다.
단계 4: 1-(5-시아노-피라진-2-일)-3-[5-메틸-2-(모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-우레아. THF (2 ㎖) 중 2-{2-[3-(5-시아노-피라진-2-일)-우레이도]-4-메틸-페녹시-메틸}-모르폴린-4-카르복실산 tert-부틸 에스테르 (0.043 g, 0.0918 m㏖)의 슬러리를 디옥산 (4M, 0.11 ㎖) 중 HCl로 처리하고, 20 h 동안 교반하였다. 추가의 디옥산 (4M, 0.25 ㎖) 중 HCl을 첨가하고, 반응물을 50℃로 18 h 동안 가열하였다. 반응물을 냉각 및 농축시켰다. 생성된 고체를 에테르에 현탁시키고, 현탁액을 여과하고 공기건조시켜서 원하는 생성물을 HCl 염 (0.042 g)으로서 수득하였다.
단계 5: 1-(5-시아노-피라진-2-일)-3-[5-메틸-2-(4-메틸-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-우레아. MeOH (1 ㎖) 중 1-(5-시아노-피라진-2-일)-3-[5-메틸-2-(모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-우레아 히드로클로라이드 염 (0.0104 g, 0.129 m㏖) 용액을 0℃로 냉각시키고, 포름알데히드 수용액 (0.12 m㏖)에 이어서 소듐 트리아세톡시 보로히드라이드 (0.06 g, 0.292 m㏖)로 처리하였다. 반응물을 12 h 동안 교반한 후, 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 실리카에서 크로마토그래피 (CH2Cl2 중 2% MeOH)하여 생성물을 백색 고체로서 (0.014 g) 얻었다.
화합물 6
1-[5-클로로-2-([1,4]옥사제판-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
단계 1: 3-벤질-2-클로로메틸-[1,3]옥사제판. 3-벤질아미노-프로판-1-올 (14 g, 88.0 m㏖) 및 에피클로로히드린 (81.4 g, 880 m㏖) 용액을 40℃로 가열하였다. 3 h 동안 교반한 후, 반응물을 냉각시키고, 진공에서 증발시켜 과잉의 에피클로로히드린을 제거하였다. 황산 (10 ㎖)을 천천히 첨가한 후, 반응 플라스크를 150℃에서 예열한 오일 배쓰에 넣었다. 1 h 동안 교반을 진행한 후, 반응물을 실온으로 냉각시키고, 얼음을 첨가하여 켄칭시켰다. 혼합물을 10% Na2CO3 수용액을 이용하여 염기성 pH로 조절하고, EtOAc (3 × 300 ㎖)로 추출하였다. 합친 유기층을 무수 MgSO4로 건조시키고, 여과시키고, 감압 하에 건조시켰다. 생성된 잔류물을 플래시 크로마토그래피 (70:28:2 헥산/CH2Cl2/2M NH4OH aq)에 의해서 정제하여 5 g의 연황색 오일을 얻었다.
단계 2: 2-(4-클로로-2-니트로-페녹시메틸)-[1,3]옥사제판-3-카르복실산 tert-부틸 에스테르. DMSO (30 ㎖) 중 4-브로모-2-니트로-페놀 (1.39 g, 8.0 m㏖)의 교반 용액에 탄산칼륨 (2.76 g, 20.0 m㏖)에 이어서 3-벤질-2-클로로메틸-[1,3]옥사제판을 첨가하였다. 반응물을 60℃에서 12 h 동안 교반한 후, 실온으로 냉각시키고, EtOAc (200 ㎖) 및 10% Na2CO3 수용액 (200 ㎖)으로 희석시켰다. 층을 분리하고, 유기층을 염수로 세척하고, MgSO4로 건조시키고 진공에서 농축시켰다. 조 생성물을 플래시 크로마토그래피 (70:30 헥산/EtOAc)에 의해서 정제하여 480 ㎎의 연오렌지색 오일을 얻었다.
상기 오일을 CH2Cl2 (5 ㎖)에 녹이고, 얼음조에서 냉각시켰다. 알파 클로로 에틸 클로로포르메이트 (0.18 ㎖, 1.65 m㏖)를 첨가하였다. 반응물을 2 h 동안 교반한 후, 2N HCl 수용액을 첨가하였다. 교반을 10 min 동안 계속한 후, 혼합물을 농축시켜 건조시켰다. 생성된 잔류물을 MeOH에 녹이고, 2 h 동안 환류시켰다. 반응물을 감압 하에 농축시키고, 잔류물을 2N HCl 수용액 (75 ㎖)에 녹이고, EtOAc (2 × 50 ㎖)로 세척하였다. 수성층의 pH를 고체 NaOH의 첨가에 의해서 pH 11로 조절하였다. 생성된 염기성 용액을 EtOAc (2 × 50 ㎖)로 추출하고, 합친 유기층을 염수로 세척하고, MgSO4로 건조시켰다. 여과 및 진공에서의 농축에 의해서 240 ㎎의 생성물을 연황색 오일로서 얻었다.
상기 오일을 CH2Cl2 (3 ㎖)에 용해시킨 후, TEA (0.116 ㎖, 0.831 m㏖) 및 디-tert-부틸 디카보네이트 (0.181 g, 0.831 m㏖)로 처리하였다. 반응물을 실온에서 1 h 동안 교반한 후, 추가의 CH2Cl2 (100 ㎖)로 희석시키고, 10% Na2CO3 수용액 (100 ㎖)으로 세척하였다. 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과시키고 감압 하에 농축시켰다. 플래시 크로마토그래피 (7:3 헥산/EtOAc)를 사용하여 정제하여 252 ㎎의 생성물을 백색 발포체로서 얻었다.
단계 3: 2-(2-아미노-4-클로로-페녹시메틸)-[1,3]옥사제판-3-카르복실산 tert-부틸 에스테르. 2-(4-클로로-2-니트로-페녹시메틸)-[1,3]-옥사제판-3-카르복실산 tert-부틸 에스테르 (0.252 g, 0.65 m㏖)로부터, 화합물 3, 단계 2에서의 절차에 따라 제조하여 150 ㎎의 생성물을 맑은 오일로서 얻었다.
단계 4: 1-[5-클로로-2-([1,4]옥사제판-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아. 2-(2-아미노-4-브로모-페녹시메틸)-[1,3]옥사제판-3-카르복실산 tert-부틸 에스테르로부터, 화합물 2, 단계 4 및 화합물 5, 단계 4에서의 절차에 따라 제조하여 0.175 g의 생성물을 얻었다.
화합물 7
1-[5-메틸-2-(1-메틸-피페라진-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
단계 1: 3-히드록시메틸-4-메틸-피페라진-1-카르복실산 tert-부틸 에스테르. 200 ㎖의 1:1 H2O/디옥산과의 슬러리인 피페라진-2-카르복실산 (20 g, 154 m㏖)을 얼음조에서 냉각시키고, 고체 NaOH (11 g)로 처리한 후, 디옥산 중 디-tert-부틸 디카보네이트 (21.6 g, 99 m㏖e) 용액을 첨가 깔때기로부터 적가하였다. 반응물 pH를 반응의 진행 도중에 필요한 경우 pH>10으로 조절하였다. 생성된 혼합물을 3 h 동안 교반한 후, 균질해질 때까지 물로 희석시키고, pH가 2 내지 3이 될 때까지 진한 수성 HCl로 산성화시켰다. 상기 용액을 에테르로 세척한 후, pH가 6.5 내지 7이 될 때까지, pH를 NaOH로 조절하였다. 상기 용액을 며칠 정치시키고, 생성된 침전물을 여과에 의해서 수집하여 피페라진-1,3-디카르복실산 1-tert-부틸 에스테르를 백색 고체 (9.7 g)로서 얻었다.
CH3OH (100 ㎖) 중 피페라진-1,3-디카르복실산 1-tert-부틸 에스테르 (4.62 g, 20.0 m㏖)의 슬러리를 수성 포름알데히드 (40 m㏖) 및 포름산 (70 m㏖)으로 처 리한 후, 65℃에서 몇 시간 동안 가열하였다. HPLC에 의해서 완료하자마자, 반응을 냉각시키고, 진공에서 농축시켰다.
잔류물을 THF에 녹이고, 얼음조에서 냉각시킨 후, THF (19.0 m㏖) 중 수소화리튬알루미늄 용액으로 처리하였다. 1 h 후, 반응물을 실온으로 가온시키고, 추가로 30 min 동안 교반하였다. 이어서 반응물을 얼음조에서 냉각시키고, H2O (0.75 ㎖) 및 15% NaOH 수용액 (0.75 ㎖), 그리고 다시 H2O (3 × 0.75 ㎖)로 켄칭시켰다. 염을 여과에 의해서 제거하고, 여과액을 진공 하에 농축시켜서 조 생성물을 얻었다. 실리카 겔 (CH2Cl2 중 2.5% MeOH)로 크로마토그래피하여 생성물을 황색 오일 (0.70 g)로서 얻었다.
단계 2: 1-[5-메틸-2-(1-메틸-피페라진-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아. 화합물 3에서의 절차에 따라서, 3-히드록시메틸-4-메틸-피페라진-1-카르복실산 tert-부틸 에스테르를 사용하여, 그리고 화합물 5, 단계 4에서의 절차에 따라서 제조하였다.
화합물 8
1-(5-시아노-피라진-2-일)-3-[5-메틸-2-(모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-우레아
화합물 5, 단계 1 내지 4에서의 절차에 따라서 4-메틸-2-니트로-페놀을 사용하여 제조하였다.
화합물 9
1-[5-클로로-4-메틸-2-(S-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
화합물 4, 단계 1에서의 절차를 사용하여 제조한 2-히드록시메틸-S-모르폴린-4-카르복실산 tert-부틸 에스테르, 및 화합물 4, 단계 2에서의 절차에 따라서 제 조한 4-클로로-5-메틸-2-니트로-페놀을 사용하여, 화합물 1, 단계 4 및 5에서의 절차에 따라서 제조하였다.
화합물 10
1-[5-클로로-4-메틸-2-(R-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
화합물 4, 단계 1에서의 절차를 사용하여 (R)-벤질 글리시딜 에테르 산 tert-부틸 에스테르로부터 제조한 2-히드록시메틸-R-모르폴린-4-카르복실산, 및 화합물 4, 단계 2에서의 절차에 따라서 제조한 4-클로로-5-메틸-2-니트로-페놀을 사용하여, 화합물 1, 단계 4 및 5에서의 절차에 따라서 제조하였다.
화합물 11
1-[4,5-디클로로-2-(R-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
2-히드록시메틸-S-모르폴린-4-카르복실산 tert-부틸 에스테르 및 화합물 4, 단계 2에서의 절차에 따라서 제조한 4,5-디클로로-2-니트로-페놀을 사용하여, 화합물 1, 단계 4 및 5에서의 절차에 따라서 제조하였다.
화합물 12
1-[4,5-디메틸-2-(모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
2-히드록시메틸-S-모르폴린-4-카르복실산 tert-부틸 에스테르 및 화합물 4, 단계 2에서의 절차에 따라서 제조한 4,5-디메틸-2-니트로-페놀을 사용하여, 화합물 1, 단계 4 및 5에서의 절차에 따라서 제조하였다.
화합물 13
1-[4-클로로-5-메틸-2-(S-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
2-히드록시메틸-S-모르폴린-4-카르복실산 tert-부틸 에스테르 및 화합물 4, 단계 2에서의 절차에 따라서 제조한 5-클로로-4-메틸-2-니트로-페놀을 사용하여, 화합물 1, 단계 4 및 5에서의 절차에 따라서 제조하였다.
화합물 14
1-[5-시아노-2-(S-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
2-히드록시메틸-S-모르폴린-4-카르복실산 tert-부틸 에스테르 및 화합물 4, 단계 2에서의 절차에 따라서 제조한 4-히드록시-3-니트로-벤조니트릴을 사용하여, 화합물 1, 단계 4 및 5에서의 절차에 따라서 제조하였다.
화합물 15
1-[5-클로로-4-에틸-2-(S-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2- 일)-우레아
2-히드록시메틸-S-모르폴린-4-카르복실산 tert-부틸 에스테르 및 화합물 4, 단계 2에서의 절차에 따라서 제조한 4-클로로-5-에틸-2-니트로-페놀을 사용하여, 화합물 1, 단계 4 및 5에서의 절차에 따라서 제조하였다.
화합물 16
1-[5-클로로-4-메톡시-2-(S-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
2-히드록시메틸-S-모르폴린-4-카르복실산 tert-부틸 에스테르 및 화합물 4, 단계 2에서의 절차에 따라서 제조한 4-클로로-5-메톡시-2-니트로-페놀을 사용하여, 화합물 1, 단계 4 및 5에서의 절차에 따라서 제조하였다.
화합물 17
1-[5-디메틸아미노-2-(S-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
2-히드록시메틸-S-모르폴린-4-카르복실산 tert-부틸 에스테르 및 화합물 4, 단계 2에서의 절차에 따라서 제조한 4-디메틸아미노-2-니트로-페놀을 사용하여, 화합물 1, 단계 4 및 5에서의 절차에 따라서 제조하였다.
화합물 18
1-[5-브로모-4-메틸-2-S-(모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
화합물 4, 단계 2에서의 절차를 사용하여 제조한 4-브로모-5-메틸-2-니트로-페놀을 사용하여, 화합물 4에서의 절차에 따라서 제조하였다.
화합물 19
1-[5-메틸-2-(모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
화합물 2, 단계 1에서의 절차에 따라서 상응하는 산으로부터 제조한 2-히드 록시메틸-모르폴린-4-카르복실산 tert-부틸 에스테르를 사용하여, 화합물 3에서의 절차에 따라서 제조하였다.
화합물 20
1-[5-클로로-2-(모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
4-클로로-2-니트로-페놀 및 화합물 2, 단계 1에서의 절차에 따라서 상응하는 산으로부터 제조한 2-히드록시메틸-모르폴린-4-카르복실산 tert-부틸 에스테르를 사용하여, 화합물 3에서의 절차에 따라서 제조하였다.
화합물 21
1-[5-클로로-2-(S-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
4-클로로-2-니트로-페놀을 사용하여 화합물 4에서의 절차에 따라서 제조하였다.
화합물 22
1-[5-메틸-2-(S-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
(R)-벤질 글리시딜 에테르 및 4-메틸-2-니트로-페놀을 사용하여, 화합물 4에 서의 절차에 따라 제조하였다.
화합물 23
1-[5-클로로-2-(R-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
(R)-벤질 글리시딜 에테르 및 4-클로로-2-니트로-페놀을 사용하여, 화합물 4에서의 절차에 따라서 제조하였다.
화합물 24
1-[5-클로로-2-R-([1,4]옥사제판-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
(R)-2-히드록시메틸-[1,4]옥사제판-4-카르복실산 tert-부틸 에스테르를 사용하여, 화합물 1에서의 절차에 따라서 제조하였다.
화합물 25
1-[5-클로로-2-(1-메틸-피페라진-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
4-클로로-2-니트로-페놀을 사용하여, 화합물 7에서의 절차에 따라서 제조하였다.
화합물 26
1-[5-클로로-2-S-(1-메틸-피페라진-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
S-피페라진-2-카르복실산 및 4-클로로-2-니트로-페놀을 사용하여, 화합물 7에서의 절차에 따라서 제조하였다.
화합물 27
1-[5-클로로-4-메틸-2-S-([1,4]-옥사제판-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
화합물 4, 단계 2에서의 절차에 따라서 제조한 4-클로로-5-메틸-2-니트로-페놀을 사용하여, 화합물 1에서의 절차에 따라서 제조하였다.
화합물 28
1-[5-브로모-2-(S-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
4-브로모-2-니트로-페놀을 사용하여, 화합물 4에서의 절차에 따라서 제조하였다.
화합물 29
1-[5-브로모-2-R-(R-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
(R)-벤질 글리시딜 에테르 및 4-브로모-2-니트로-페놀을 사용하여, 화합물 4에서의 절차에 따라서 제조하였다..
화합물 30
1-[5-브로모-2-S-(4-메틸-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
4-브로모-2-니트로-페놀 및 화합물 2, 단계 4 및 화합물 5, 단계 4 및 5에서의 절차를 사용하여, 화합물 4에서의 절차에 따라서 제조하였다.
화합물 31
1-[5-브로모-2-([1,4]옥사제판-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
화합물 4, 단계 2에서의 절차에 따라서 제조한 4-브로모-2-니트로-페놀을 사용하여, 화합물 6에서의 절차에 따라서 제조하였다.
화합물 32
1-[5-브로모-2-(4-메틸-[1,4]옥사제판-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
4-브로모-2-니트로-페놀을 사용하여, 그리고 화합물 5, 단계 5에서의 절차에 의해서, 화합물 6에서의 절차에 따라서 제조하였다.
화합물 33
1-[5-클로로-2-S-(4-시아노메틸-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
1-[5-클로로-2-(S-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아 (0.189 g, 0.5 m㏖)를 DMF (2 ㎖)에 현탁시켰다. 탄산칼륨 (0.104 g, 0.75 m㏖) 및 브로모아세토니트릴 (0.035 ㎖, 0.5 m㏖)을 첨가하고, 반응 혼합물을 80℃로 8 h 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, H2O (10 ㎖)의 첨가에 의해서 켄칭시켰다. 생성된 고체를 여과에 의해서 수집하고, MeOH로부터 재결정화시켜서 생성물을 백색 분말 (0.072 g)로서 얻었다.
화합물 34
1-[5-클로로-2-(티오모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
화합물 2, 단계 2에서의 절차 (화합물 2, 단계 1에서의 절차에 따라서 티오모르폴린-2,4-디카르복실산 4-tert-부틸 에스테르로부터 수득한 2-히드록시메틸-티오모르폴린-4-카르복실산 tert-부틸 에스테르를 사용), 및 화합물 3, 단계 2 및 화합물 2, 단계 4 및 5에서의 절차에 따라서 제조하였다.
화합물 35
1-(5-메틸-피라진-2-일)-3-[3-S-(모르폴린-2-일메톡시)-5,6,7,8-테트라히드로-나프탈렌-2-일]-우레아
화합물 3, 단계 1에서의 절차 (화합물 2, 단계 1에서의 절차에 따라서 S-모르폴린-2,4-디카르복실산 4-tert-부틸 에스테르로부터 제조한 (S)-2-히드록시메틸-모르폴린-4-카르복실산 tert-부틸 에스테르 및 화합물 4, 단계 2에서의 절차에 따라서 제조한 3-니트로-5,6,7,8-테트라히드로-나프탈렌-2-올을 사용), 및 화합물 1, 단계 5에서의 절차에 따라서 제조하였다.
화합물 36
1-[5-클로로-2-S-(모르폴린-3-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
모르폴린-3-S-4-디카르복실산 4-tert-부틸 에스테르를 사용하여, 화합물 2에서의 절차에 따라서 제조하였다.
화합물 37
1-[5-메틸-2-R-(모르폴린-3-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
4-메틸-2-니트로-페놀을 사용하여, 화합물 2에서의 절차에 따라서 제조하였다.
화합물 38
1-[5-클로로-2-S-(모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-트리플루오로메틸-피라진-2-일)-우레아
미셀(Miesel) 미국 특허 제4,293,552호의 방법에 따라서 제조한 5-트리플루오로메틸-피라진-2-일아민 및 (S)-2-히드록시메틸-모르폴린-4-카르복실산 tert-부틸 에스테르를 사용하여, 화합물 1, 단계 2 내지 5에서의 절차에 따라서 제조하였다.
화합물 39
1-[4-클로로-5-메틸-2-S-(모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-시아노-피라진-2-일)-우레아
화합물 4, 단계 2에서의 절차에 따라서 3-클로로-4-메틸-페놀로부터 제조한 5-클로로-4-메틸-2-니트로-페놀을 사용하여, 화합물 5, 단계 1 내지 4에서의 절차에 따라서 제조하였다.
화합물 40
1-[5-클로로-4-메톡시-2-(S-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-시아노-피라진-2-일)-우레아
화합물 1, 단계 2에서의 절차 (화합물 5, 단계 1 및 2에서의 절차에 따라서 제조한 5-아미노-피라진-2-카르보니트릴을 사용) 및 화합물 1, 단계 4 및 5에서의 절차 (2-히드록시메틸-S-모르폴린-4-카르복실산 tert-부틸 에스테르 및 화합물 4, 단계 2에서의 절차에 따라서 제조한 4-클로로-5-메톡시-2-니트로-페놀을 사용)에 따라서 제조하였다.
화합물 41
1-[5-클로로-2-S-(모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-시아노-피라진-2-일)-우레아
화합물 1, 단계 2에서의 절차 (화합물 5, 단계 1 및 2에서의 절차에 따라서 제조한 5-아미노-피라진-2-카르보니트릴을 사용) 및 화합물 1, 단계 4 및 5에서의 절차 (2-히드록시메틸-S-모르폴린-4-카르복실산 tert-부틸 에스테르 및 4-클로로-2-니트로-페놀을 사용)에 따라서 제조하였다.
화합물 42
1-[5-클로로-2-S-(4-메틸-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-시아노-피라진- 2-일)-우레아
단계 1: 1-[5-클로로-2-(모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-시아노-피라진-2-일)-우레아. 화합물 1, 단계 2에서의 절차 (화합물 5, 단계 1 및 2에서의 절차에 따라서 제조한 5-아미노-피라진-2-카르보니트릴을 사용) 및 화합물 1, 단계 4 및 5에서의 절차 (2-히드록시메틸-S-모르폴린-4-카르복실산 tert-부틸 에스테르 및 4-클로로-2-니트로-페놀을 사용)에 따라서 제조하여 0.27 g의 생성물을 얻었다.
단계 2: 1-[5-클로로-2-(모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-시아노-피라진-2-일)-우레아 (0.276 g, 0.73 m㏖)를 DMF (5 ㎖)에 현탁시키고, 탄산칼륨 (0.15 g, 1.1 m㏖) 및 요오드화메틸 (0.046 ㎖, 0.73 m㏖)로 처리하였다. 혼합물이 균질해졌고, 실온에서 4 h 동안 교반하였다. 반응물을 물 (20 ㎖)을 첨가하여 켄칭시키고, CHCl3:iPrOH의 3:1 혼합물 (3 × 25 ㎖)로 추출하였다. 합친 유기층을 감압 하에 농축시키고, 잔류물을 EtOAc로 연화처리하였다. 여과하여 0.214 g의 생성물을 백색 고체로서 얻었다.
화합물 43
1-[5-클로로-2-(S-4-메틸-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아
1-[5-클로로-2-(S-4-메틸-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아를 사용하여, 화합물 42, 단계 2에서의 절차에 따라서 제조하였다.
치료법
본 발명의 화합물은 비정상적 세포 증식을 수반하는 질병을 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 화합물은 인간 및 기타 동물에서의 것들을 비롯한, 진핵 세포와 관련된 암 및 기타 세포 증식 적응증의 치료에 사용되는 방사선 및/또는 화학요법제의 치료 효과를 강화하기 위해서 사용할 수 있다. 일반적으로, 본 화합물은 암성 및 비암성 양자 모두의 비정상적 증식 세포를 억제한다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 관례상 항대사물질, 예를 들어, 메토트렉세이트, 겜시타빈, 또는 5-플루오로우라실 (5-FU)로 처리하는 종양의 치료를 강화시키기 위해서 사용할 수 있다.
본 발명의 화합물의 사용은 비정상적 증식 세포를 부분적으로 또는 완전히 퇴행시키며, 즉, 세포 집단으로부터 상기 세포를 감소 또는 제거시킬 수 있다. 예를 들어, 비정상적 증식 세포 집단이 종양 세포인 경우, 본 발명의 화합물은 종양 성장 속도를 지연시키고, 종양의 개수를 감소시키고, 및/또는 부분적 또는 완전한 종양 퇴행을 유발시키기 위해서 사용할 수 있다.
본 발명의 화합물은, 비정상적 세포 증식이 확인되지 않은 경우 또는 비정상적 세포 증식이 진행중인 경우이지 않지만, 비정상적 세포 증식이 의심 또는 예상되는 경우에 생체내 또는 생체외에서 사용할 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한, 비정상적 세포 증식을 미리 치료하여 상기의 재발을 예방 또는 억제하는 경우에도 사용할 수 있다.
본 발명의 한 방법은 치료 유효량의 본 Chk1 억제제를, 그것이 필요한 개체에, 화학요법제와 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 다르게는, 본 발명의 방법은 치료 유효량의 하나 이상의 본 Chk1 억제제를, 그것이 필요한 개체에, 암세포의 증식을 억제하는데 활성을 갖는 항체, 예를 들어, 헤르셉틴과 조합하여 투여하는 것을 포함한다.
따라서, 암은 화학요법제 또는 항체와 조합된 본 Chk1 억제제의 투여에 의해서 강화된 치료의 영향을 받기 쉽다. 본 발명에 의해서 치료가능한 암은 고형 종양을 특징으로 하는 암종 및 육종, 및 백혈병, 임파종, 및 전형적으로는 종양 덩어리가 없지만, 혈관계 또는 림프세망계에 분포되어 있는 기타 암을 비롯한 골수계 또는 림프계 암을 포함한다. 상기 암은, 예를 들어, 결장직장암, 두경부암, 췌장암, 유방암, 위암, 방광암, 외음암, 백혈병, 임파종, 흑색종, 신장 세포 암종, 난소암, 뇌암, 골육종, 및 폐암을 포함한다.
따라서, 본 발명의 화합물은 Chk1 활성에 의해서 매개되는 암에 유용하다. 더욱 특히, Chk1 활성은, 성인 및 소아 종양, 고형 종양/악성종양의 성장, 점액성 및 원형 세포 암종, 국부적으로 진행된 종양, 전이성 암, 유잉(Ewing) 육종을 비롯한 인간 연조직 육종, 림프 전이를 비롯한 암 전이, 편평 세포 암종 (특히 두경부), 식도 편평 세포 암종, 경구 암종, 다발성 골수종을 비롯한 혈액 세포 악성종양, 급성 림프구성 백혈병, 급성 항림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 및 털세포 백혈병을 비롯한 백혈병, 삼출 임파종 (체강 임파종), 가슴샘 임파종 폐암 (소세포 암종, 피부 T 세포 임파종, 호지킨(Hodgkin) 임파종, 비-호지킨 임파종, 부신피질암, ACTH-생성 종양, 비소세포암, 유방암 (소세포 암종 및 도관 암종 포함) 포함), 위장암 (위암, 결장암, 결장직장암, 및 결장직장 신생물과 연관된 폴립 포함), 췌장암, 간암, 비뇨기 암 (방광암, 예컨대 원발성 표재성 방광 종양, 방광의 침윤성 이행세포 암종, 및 근-침윤성 방광암 포함), 전립선암, 여성 생식관의 악성종양 (난소암종, 원발성 복막 상피 신생물, 자궁경부 암종, 자궁 내막암, 질암, 외음암, 자궁암 및 난포 내 고형 종양 포함), 남성 생식관의 악성종양 (고환암 및 음경암 포함), 신장암 (신장 세포 암종 포함), 뇌암 (본태성 뇌종양, 신경모세포종, 별아교세포성 뇌종양, 신경아교종, 및 중추신경계에서의 전이성 종양 세포 침윤 포함), 골암 (골종 및 골육종 포함), 피부 암 (악성 흑색종, 인간 피 부 각질형성세포의 종양 진행, 및 편평 세포암 포함), 갑상선암, 망막모세포종, 신경모세포종, 복막 삼출, 악성 흉막 삼출, 중피종, 윌름즈(Wilms) 종양, 담낭암, 영양모세포성 신생물, 혈관주위세포종, 및 카포시(Kaposi) 육종을 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는 암 형태와 연관되어 있다.
본 발명의 화합물은 또한 세포를 방사선감작시키는데 사용할 수 있다. 방사선으로 치료가능한 질환은 신생물 질환, 양성 및 악성 종양, 및 암세포를 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다. 방사선 치료는 전자기적 방사선, 예컨대 감마-방사선 (10-20 내지 10-13 m), X-선 방사선 (10-12 내지 10-9 m), 자외선 (10 ㎚ 내지 400 ㎚), 가시광선 (400 ㎚ 내지 700 ㎚), 적외선 방사선 (700 ㎚ 내지 1.0 ㎜), 및 마이크로파 방사선 (1 ㎜ 내지 30 ㎝)을 이용한다.
일부 암 치료 프로토콜은 현재 전자기적 방사선, 예를 들어, X-선에 의해서 활성화되는 방사선감작제를 이용한다. X-선-활성화 방사선감작제의 예는 메트로니다졸, 미소니다졸, 데스메틸미소니다졸, 피모니다졸, 에타니다졸, 니모라졸, 미토마이신 C, RSU 1069, SR 4233, EO9, RB 6145, 니코틴아미드, 5-브로모데옥시우리딘 (BUdR), 5-요오도데옥시우리딘 (IUdR), 브로모데옥시시티딘, 플루오로데옥시우리딘 (FUdR), 히드록시우레아, 시스플라틴, 및 그의 치료상 유효한 유사체 및 유도체를 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다.
암의 광역학 요법 (PDT)은 가시광선을 감작제의 방사선 활성화제로서 이용한다. 광역학 방사선감작제의 예는 헤마토포르피린 유도체, 포토프린(PHOTOFRIN(등 록상표)), 벤조포르피린 유도체, NPe6, 에티오포르피린주석 (SnET2), 페오보비드-a, 박테리오클로로필-a, 나프탈로시아닌, 프탈로시아닌, 프탈로시아닌아연, 및 상기의 치료상 유효한 유사체 및 유도체를 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다.
방사선감작제는 Chk1 억제제에 더하여 치료 유효량의 1종 이상의 화합물과 함께 투여될 수 있으며, 상기 화합물은 표적 세포에 대한 방사선감작제의 혼입을 촉진시키는 화합물, 표적 세포에 대한 치료제, 영양소, 및/또는 산소의 흐름을 조절하는 화합물, 추가의 방사선과 함께 또는 방사선 없이 종양에 작용하는 화학요법제, 또는 암 또는 기타 질환을 치료하기 위한 기타 치료상 유효한 화합물을 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다. 방사선감작제와 함께 사용할 수 있는 추가의 치료제 또는 방법의 예는 5-플루오로우라실 (5-FU), 류코보린, 산소, 카르보겐, 적혈구 수혈, 퍼플루오로카본 (예를 들어, FLUSOLW(등록상표)-DA), 2,3-DPG, BW12C, 칼슘 통로 차단제, 펜톡시필린, 항혈관신생 화합물, 히드랄라진, 및 L-BSO를 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다.
암을 치료하기 위해서 본 발명의 화합물과 병용할 수 있는 화학요법제는 알킬화제, 항대사물질, 호르몬 및 그의 길항제, 방사성동위원소, 항체, 뿐만 아니라 천연 생성물, 및 그의 조합을 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다. 예를 들어, 본 발명의 억제제 화합물은 항생제, 예컨대 독소루비신 및 기타 안트라시클린 유사체, 질소 머스타드, 예컨대 시클로포스파미드, 피리미딘 유사체, 예컨대 5-플루오로우라실, 시스플라틴, 히드록시우레아, 탁솔 및 그의 천연 및 합성 유도체 등과 함께 투여할 수 있다. 또다른 예로서, 혼합형 종양, 예컨대 종양이 생식샘자극호 르몬-의존성 및 생식샘자극호르몬-독립성 세포를 포함하는, 유방의 샘암종인 경우, 상기 화합물은 류프롤리드 또는 고세렐린 (LH-RH의 합성 펩티드 유사체)과 함께 투여될 수 있다. 기타 항신생물 프로토콜은 억제제 화합물과 함께 또다른 치료 양식, 예를 들어, 본원에서 "보조적 항신생물 양식"이라고도 칭하는 수술 또는 방사선의 사용을 포함한다. 본 발명에 유용한 추가의 화학요법제는 호르몬 및 그의 길항제, 방사성동위원소, 항체, 천연 생성물, 및 그의 조합을 포함한다. 본 발명의 화합물을 이용하는 방법에 유용한 화학요법제의 예는 하기 표에 나열한다.
| A) 알킬화제 i) 질소 머스타드 메클로레타민 시클로포스파미드 이포스파미드 멜팔란 클로로암부실 ii) 니트로소우레아 카르뮤스틴 (BCNU) 로뮤스틴 (CCNU) 세뮤스틴 (메틸-CCNU) iii) 에틸렌이민 / 메틸 -멜라민 트리에틸렌멜라민 (TEM) 트리에틸렌 티오포스포르아미드 (티오테파) 헥사메틸멜라민 (HMM, 알트레타민) iv) 알킬 술포네이트 부술판 v) 트리아진 다카르바진 (DTIC) | G) 천연 생성물 i) 항유사분열성 약물 ii) 탁산 파클리탁셀 빈카 알칼로이드 빈블라스틴 (VLB) 빈크리스틴 비노렐빈 탁소테르(Taxotere(등록상표)) (도세탁셀) 에스트라뮤스틴 에스트라뮤스틴 포스페이트 iii) 에피포도필로톡신 에토포시드 테니포시드 iv) 항생제 악티모마이신 D 다우노마이신 (루비도마이신) 독소루비신 (아드리아마이신) 미톡산트론이다루비신 블레오마이신 스플리카마이신 (미트라마이신) 미토마이신 C 닥티노마이신 아피디콜린 v) 효소 L-아스파라기나제 L-아르기나제 |
| B) 항대사물질 i) 폴산 유사체 메토트렉세이트 트리메트렉세이트 페메트렉시드 (다중표적화된 항폴린산제) ii) 피리미딘 유사체 5-플루오로우라실 플루오로데옥시우리딘 겜시타빈 시토신 아라비노시드 (AraC, 시타라빈) 5-아자시티딘 2,2'-디플루오로데옥시-시티딘 iii) 퓨린 유사체 6-메르캅토퓨린 6-티오구아닌 아자티오프린 2'-데옥시코포르마이신 (펜토스타틴) 에리트로히드록시노닐-아데닌 (EHNA) 플루다라빈 포스페이트 2-클로로데옥시아데노신 (클라드리빈, 2-CdA) | H) 방사선감작제 메트로니다졸 미소니다졸 데스메틸미소니다졸 피모니다졸 에타니다졸 니모라졸 RSU 1069 EO9 RB 6145 SR4233 니코틴아미드 5-브로모데옥시우리딘 5-요오도데옥시우리딘 브로모데옥시시티딘 |
| C) I형 토포이소머라제 억제제 캄프토테신 토포테칸 이리노테칸 | I) 기타 작용제 i) 백금 배위 복합체 시스플라틴 카르보플라틴 옥살리플라틴 안트라센디온 미톡산트론 ii) 치환된 우레아 히드록시우레아 iii) 메틸히드라진 유도체 N-메틸히드라진 (MIH) 프로카르바진 iv) 부신피질 억제제 미토탄 (o,p'-DDD) 아이노글루테티미드 |
| D) 생물 반응 변형제 G-CSF GM-CSF | J) 시토킨 인터페론 (α,β,γ) 인터류킨-2 |
| E) 분화제 레틴산 유도체 | K) 감광제 헤마토포르피린 유도체 포토프린(Photofrin(등록상표)) 벤조포르피린 유도체 Npe6 에티오포르피린주석 (SnET2) 페오보라이드-a 박테리오클로로필-a 나프탈로시아닌 프탈로시아닌 프탈로시아닌아연 |
| F) 호르몬 및 길항제 i) 아드레노코르티코스테로이드 /길항제 프레드니손 및 등가물 덱사메타손 아이노글루테티미드 ii) 프로게스틴 히드록시프로게스테론 카프로에이트 메드록시프로게스테론 아세테이트 메게스트롤 아세테이트 iii) 에스트로겐 디에틸스틸베스트롤 에티닐 에스트라디올 및 등가물 iv) 항에스트로겐 타목시펜 v) 안드로겐 테스토스테론 프로피오네이트 플루옥시메스테론 및 등가물 vi) 항안드로겐 플루타민 생식샘자극호르몬-방출 호르몬 유사체 류프롤리드 vii) 비스테로이드성 항안드로겐 플루타미드 | L) 방사선 X-선 자외선 감마 방사선 가시광선 적외선 방사선 마이크로파 방사선 |
특히 방사선감작제와 함께 유용한 화학요법제의 예는, 예를 들어, 캄프토테신, 카르보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 인터페론 (알파, 베타, 감마), 이리노테칸, 히드록시우레아, 클로르암부실, 5-플루오로우라실 (5-FU), 메토트렉세이트, 2-클로로아데노신, 플루다라빈, 아자시티딘, 겜시타빈, 페메트렉시드, 인터류킨 2, 이리노테칸, 도세탁셀, 파클리탁셀, 토포테칸, 및 상기의 치료상 유효한 유사체 및 유도체를 포함한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 화합물은 겜시타빈 단독과 또는 추가로 파클리탁셀과 조합시 유용하다. 본 발명의 화합물은 또한 페메트렉시드 단독과 또는 추가로 시스플라틴, 카르보플라틴, 또는 기타 플라틴과 조합시 유용하다. 본 Chk1 억제제는 또한 겜시타빈 및 페메트렉시드와 조합되어 투여될 수 있다.
겜시타빈과 조합되어 투여되는 본 Chk1 억제제는, 예를 들어, 췌장 암종, 자궁의 평활근육종, 골 육종, 전이성 비소세포 폐암, 사지 및 몸통 연조직 육종, 신장 세포암, 샘암종, 및 호지킨 질환의 치료에 유용할 수 있다. 페메트렉시드와 함께 투여되는 본 Chk1 억제제는 중피종의 치료에 유용할 수 있다.
본 발명의 화합물은 또한 비정상적 세포 증식을 특징으로 하는 염증성 질환, 질병, 또는 장애의 치료에 사용되는 약물의 효능을 강화시킬 수 있다. 본 발명의 화합물로 치료할 수 있는 염증성 질환의 예는 류마티스 관절염 (RA), 건선, 백반증, 베그너 육아종증, 전신-발병 소아 만성 관절염 (JCA), 및 전신 홍반 루푸스 (SLE)를 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다. 관절염, 베그너 육아종증, 및 SLE의 치료는 종종 면역억제성 요법, 예컨대 이온화 방사선, 메토트렉세이트, 및 시클로포스파미드의 사용을 수반한다. 상기 치료는 전형적으로는, 직접 또는 간접적으로, DNA 손상을 유발한다. 해를 입은 면역 세포 내의 Chk1 활성의 억제는 상기 세포가 상기 표준 치료에 의한 제어에 더욱 민감하도록 해 준다. 건선 및 백반증은 흔히 소랄렌과 조합하여 자외선 방사선 (UV)으로 치료한다. 본 발명의 화합물은 UV 및 소랄렌의 사멸 효과를 강화시키고, 본 치료 처방계획의 치료 지수를 증가시킨다. 일반적으로, 본 발명의 화합물은, 면역억제성 약물과 병용하는 경우, 염증성 질환 세포의 제어를 강화시킨다.
본 발명의 화합물은 또한 비정상적 증식 세포를 특징으로 하는 기타 비암성 질병의 치료 방법에 사용될 수 있다. 상기 질병은 죽상동맥경화증, 재협착증, 혈관염, 신장염, 망막병증, 신장 질환, 증식성 피부 장애, 건선, 켈로이드성 흉터, 광선각화증, 스티븐-존슨 증후군, 골다공증, 상피안내증식을 비롯한 눈의 과다증식성 질환, 증식성 유리체망막병증 (PVR), 당뇨망막병증, 혈관-증식성 질환, 비늘증, 및 유두종을 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다.
본 발명의 Chk1 억제제를 투여하는 바람직한 한 방법은 그 전체 개시사항이 참고로 포함되는, 2003년 9월 17일에 출원된 미국 가출원 일련번호 제60/503,925호에 기초한, 2004년 9월 17일에 출원된 키간(Keegan) 등의 PCT 출원 No. PCT/US2004/30806에 기재되어 있다. 비정상적 세포 증식을 억제하는 상기 방법은 Chk1 활성화제 (예를 들어, 화학요법제) 및 본 발명에 따른 Chk1 억제제의 스케줄링 투여를 포함한다. 상기 방법에서, 1종 이상의 Chk1 활성화제는 증식 세포에서 세포 주기 정지의 실질적인 동기화를 유도하기에 충분한 용량 및 시간으로 투여된다. 실질적인 기 동기화를 달성하자마자, 1종 이상의 Chk1 억제제를 투여하여 세포 주기 정지를 소멸시키고 치료적 세포사를 유발한다. 상기 방법은 임의의 Chk1 활성화제의 경우 유용하고, 비정상적 세포 증식을 수반한 암성 및 비암성 질병의 치료 또는 예방에 적용된다.
비정상적 증식 세포 집단은 본 발명의 1종, 또는 1종 초과의 Chk1 억제제와 접촉시킬 수 있다. 1종 초과의 Chk1 억제제를 사용하는 경우, 상기 Chk1 억제제는 숙달된 기능인, 예를 들어, 주치의 (인간 환자의 경우) 또는 실험실 실험자 (시험관내 또는 생체외 절차의 경우)에 의해서 결정된 바와 같은 동일 또는 상이한 방법 (예를 들어, 동시에 또는 순차적으로, 동일 또는 상이한 기간 동안, 또는 동일 또는 상이한 양식에 의함)을 사용하여 세포와 접촉시킬 수 있다.
비정상적 증식 세포 집단은 또한 1종 이상의 Chk1 활성화제와 접촉시킬 수 있다. 1종 초과의 Chk1 활성화제를 사용하는 경우, Chk1 활성화제는 일반적으로 상기 Chk1 억제제와 관련하여 기재된 바와 동일 또는 상이한 방법을 사용하여 세포와 접촉시킬 수 있다.
본 발명의 화합물은 생체외에서 세포 집단에 적용할 수 있다. 예를 들어, 본 화합물을 생체외에서 사용하여, 주어진 적응증, 세포 유형, 환자, 및/또는 기타 치료 변수에 있어서 Chk1 억제제를 투여하기 위한 최적의 스케줄 및/또는 용량에 관한 정보를 얻을 수 있다. 상기 정보는 실험 목적으로 또는 병원에서 생체내 치료를 위한 프로토콜을 결정하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물에 있어서 기타 생체외 용도는 당업자에게 명백해질 것이다.
당업자에 의해서 인식되듯이, 추가의 활성제 또는 부속제는 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있다. 당업자에 의해서 또한 인식되듯이, 치료에 대한 본원에서의 언급은 예방, 뿐만 아니라 만성 질환 또는 증상의 치료에도 연장된다.
치료에 사용하는데 필요한 본 발명의 화합물의 양은 치료할 질병의 성질, 및 환자의 연령 및 상태에 따라 바뀌고, 궁극적으로는 주치의 또는 수의사에 의해서 결정된다. 그러나, 일반적으로 성인 인간의 치료를 위해서 투여되는 용량은 전형적으로는 0.001 ㎎/㎏/1일 내지 약 100 ㎎/㎏/1일의 범위이다. 상기 용량은 단일 용량으로, 또는 적당한 간격, 예를 들어 1일 당 2, 3, 4 또는 그 이상의 서브용량으로 투여되는 복수 용량으로 투여될 수 있다. 실제로, 주치의는 개별 환자에 적합한 복용량 처방계획을 결정하며, 투약량은 특정 환자의 연령, 체중, 및 반응에 따라 바뀐다. 상기 투약량은 전형적인 평균의 경우이지만, 더 높은 또는 더 낮은 투약량이 마땅한 개별적인 경우가 있고, 상기는 본 발명의 범주 내에 속한다.
세포 집단과 임의의 용량의 본 Chk1 억제제의 접촉은 세포 주기 체크포인트의 실질적인 소멸을 달성하기에 충분한 시간 동안이다. 전형적으로는, 필수적이지는 않지만, 상기 시간은 다양한 인자에 따라 약 72시간 내지 약 96시간까지이다. 일부 실시양태에서, 주치의 또는 전문가에 의해서 결정되는 바와 같이 약 수주 또는 그 이상까지의 기간에 걸쳐서 Chk1 억제제를 투여하는 것이 바람직하거나 필요하다. 따라서, 본 Chk1 억제제는 전형적으로는 약 1시간 이하, 약 2시간 이하, 약 3시간 이하, 약 4시간 이하, 약 6시간 이하, 약 12시간 이하, 약 18시간 이하, 약 24시간 이하, 약 48시간 이하, 또는 약 72시간 이하 동안 투여될 수 있다. 당업자는 본원에 표현된 시간 범위가 단지 예시이며, 상기 범위 및 표현된 범위 내외의 서브범위 또한 본 발명의 범주 내에 속한다는 것을 인식한다.
본 발명의 Chk1 억제제는 복수의 용량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, Chk1 억제제는 4일 간격으로 1용량/1일로서 전달되는 4회 복용 (q4d×4); 3일 간격으로 1용량/1일로서 전달되는 4회 복용 (q3d×4); 5일 간격으로 1일 전달되는 1회 복용 (qd×5); 3주 동안 1회 복용/1주 (qwk3); 5일 복용, 2일 쉬고, 다시 5일 복용 (5/2/5); 또는 그 상황에 적당하다고 결정된 임의의 복용 처방계획의 빈도로 제공될 수 있다.
본 발명에 의해, 생화학적 및/또는 세포-기반 검정에서 예기치 않은 특성을 나타내는, 체크포인트 키나제 Chk1의 강력하고 선택적인 억제제를 제공할 수 있다.
실시예
1
Chk1
억제제의
IC
50
값의 측정
인간 Chk1 cDNA를 1998년 9월 4일에 출원된 국제 출원 공보 No. WO 99/11795에 이미 기재된 바와 같이 동정 및 클로닝하였다. 플래그(FLAG(등록상표)) 태그를 전장 Chk1의 아미노 말단과 함께 프레임 내 삽입하였다. 5' 프라이머는 EcoRI 부위, Kozak 서열을 함유하며, 또한 M2 항체 (미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마(Sigma))를 사용하는 친화성 정제를 위하여 플래그 태그를 암호화한다. 3' 프라이머는 SalI 부위를 함유한다. PCR-증폭된 절편을 EcoRI-SalI 절편 (캘리포니아주 칼스버드 소재의 인비트로겐(Invitrogen))으로서 pCI-Neo에 클로닝시킨 후, EcoRI-NotI 절편으로서 pFastBacI (메릴랜드주 베데스다 소재의 Gibco-BRL)에 서브클로닝시켰다. 재조합 배큘로바이러스를 Gibco-BRL Bac-대-Bac 메뉴얼에 기재된 바와 같이 제조하고, 플래그-표지된 Chk1 단백질의 발현을 위해서 CCM3 배지 (유타주 로간 소재의 하이클론 래버러토리즈(Hyclone Laboratories)) 중 성장시킨 Sf-9 세포를 감염시키기 위해서 사용하였다.
플래그-표지된 Chk1은 배큘로바이러스-감염된 SF9 세포의 동결 펠릿으로부터 정제하였다. 동결 세포 펠릿을 100 mM 트리스-HCl pH 7.5, 200 mM NaCl, 50 mM B- 글리세로포스페이트, 25 mM NaF, 4 mM MgCl2, 0.5 mM EGTA, 0.2% 트윈(TWEEN(등록상표))-20, 2 mM 소듐 바나데이트, 2 mM DTT, 및 프로테아제 억제제의 혼합물 (컴플리트 미니(Complete mini), 베링거 만하임(Boehringer Mannheim) 2000 카탈로그 #1836170)를 함유하는 동일 부피의 2X 용해 완충액과 혼합하였다. 이어서 세포를 다운스(dounce) 균질화기의 성긴 막자로 20회 다운싱하고, 1시간 동안 48,400×g로 원심분리시켰다. M2 친화성을 10개 칼럼 부피의 50 mM 글리신 pH 3.5에 이어서 20 mM 트리스 pH 7.5, 150 mM NaCl로 3회 번갈아서 그리고 트리스 NaCl 세척액을 마지막으로 미리세척하였다. 이어서 칼럼을 25개 칼럼 부피의 20 mM 트리스 pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% 트윈-20, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA 및 1X 완전 미니 프로테아제 정제로 세척하였다. 이어서 세정된 용해물을 4 h 동안 4℃에서 배치 중 M2 친화성 수지에 결합시켰다. 이어서 수지 및 용해물의 혼합물을 칼럼에 붓고, 그것을 통과한 유동물을 수집하였다. 수지를 10개 칼럼 부피의 20 mM 트리스 pH 7.5, 150 mM NaCl, 및 3 mM N-옥틸 글루코시드로 세척하였다. 이어서, 플래그-표지된 Chk1을 칼럼으로부터 0.5 ㎎/㎖ 플래그 펩티드 (시그마, 2000 카탈로그 # F-3290)를 함유하는 6개 칼럼 부피의 저온의 20 mM 트리스 pH 7.5, 150 mM NaCl, 3 mM N-옥틸 글루코시드로 용출시켰다. 3개 분획을 수집하였고, 플래그-표지된 Chk1의 존재에 대하여 분석하였다.
Chk1 키나제 활성용 검정은 100 ng 정제 플래그-Chk1 (150 pmol의 ATP/분), 20 ㎛ Cdc25C 펩티드 (H-leu-tyr-arg-ser-pro-ser-met-pro-glu-asn-leu-asn-arg- arg-arg-arg-OH) (서열 1), 4 ㎛ ATP, 2 μCi [32P]γ-ATP, 20 mM Hepes pH 7.2, 5 mM MgCl2, 0.1% NP40, 및 1mM DTT를 포함한다. 반응은 ATP-함유 반응 혼합물의 첨가에 의해서 개시하였고, 실온에서 10분 동안 수행하였다. 반응은 인산 (150 mM 최종 농도)의 첨가에 의해서 중지시켰고, 포스포셀룰로스 디스크에 옮겼다. 포스포셀룰로스 디스크는 150 mM 인산으로 5회 세척하고, 공기건조시켰다. 신틸레이션 액을 첨가하고, 디스크를 왈락(Wallac) 신틸레이션 계수기에서 계수하였다. 상기 분석물을 광범위한 농도의 Chk1 억제제 화합물의 존재 하에 인큐베이션시키고, 상기 화합물에 대한 IC50 값을 계산하였다. 상기 검정에 적용한 본 발명의 모든 화합물은 검정에서 약 200 nM 미만의 IC50 값을 나타내었다.
실시예
2
선택성
본 발명의 Chk1 억제제를, 비교 효소로서 Chk1 및 비교자 효소로서 하기의 단백질 키나제: Cdc2, Chk2, CTAK, EphA1, EphA2, Erk1, FGFR1, FGFR4, IR, JNK1, c-Kit. p38알파, p38베타, p38델타, Ros, Rse, Rsk2, TrkA, TrkB, 단백질 키나제 A, 단백질 키나제 C, pp60v-src, 단백질 키나제 B/Akt-1, p38MapK, p70S6K, 칼슘 칼모듈린-의존성 키나제 II, 및 ab1 티로신 키나제를 이용하여 선택성에 대하여 시험하였다.
화합물 대 Chk1의 IC50 값을 상기와 같이 측정하였다. 비교자 효소에 대한 상기 화합물의 IC50 값은 변형된 엘리사(ELISA) 절차 또는 형광 편광과 함께 독점 기술 플랫폼인 실렉트스마트(SelectSmart(등록상표)) (미국 워싱턴주 보텔 소재의 엠디에스 파르마 서비스(MDS Pharma Servies))를 사용하여 측정하였다. 시험한 모든 억제제는 시험한 비교자 효소에 비해 Chk1에 대한 20배 이상의 선택성을 나타내었다.
다르게는, 상기 키나제 각각에 대한 IC50을 측정하기 위한 검정은 본원에 양자 모두 참고로 포함된, 1995년 1월 23일에 출원된 PCT/US95/00912 및 미국 특허 공보 제2002-016521 A1호를 비롯한 문헌에 이미 기재되어 있다.
실시예
3
Chk1
억제제의
EC
TFS
값의 측정을 위한 세포-기반 검정
본 발명에 따른 Chk1 억제제의 세포-기반 효능은 겜시타빈에 대하여 HT29 인간 암종 세포주를 감작시키는 상기 화합물의 능력을 측정하여 평가하였다. 평균 ECTFS 값은 여러 실험 이후에 유도되었다. 이와 같이, 본 발명에 따른 Chk1 억제제는 본원에 기재된 방법에 의해서 합성되었다. 상기 화합물을 100% 디메틸 술폭시드 (DMSO) 내에 10 mM의 저장 농도로 용해시키고, -70℃에서 보관하였다. HT29 세포는 ATCC로부터 구하였고, 10% 소태아 혈청 (FCS)을 함유하는 RPMI, pen/strep, 글루타민 및 기타 보충물로 이루어지는 성장 배지 내에 유지하였다. 겜시타빈 히드로클로라이드는 Qventas로부터 구하였고, 인산염 완충 식염수 (PBS) 내에 50 mM 으로 용해시키고, -20℃에서 보관하였다. 3H-티미딘은 퍼킨-엘머(Perkin-Elmer)로부터 구하였다.
HT29 세포를 96 웰 세포 배양 플레이트 (코닝(Corning)) 상에 1.3×103개/웰의 밀도로 플레이팅하고, 밤새 유착시켰다. 다음날, 겜시타빈을 성장 배지 중 1.2 ㎖ 타이터 튜브즈(Titer Tubes(등록상표)) (바이오라드(BioRad)) 내에 초기에는 125배, 이어서 5배 희석액으로 희석시켰다. 일련의 최종 희석 농도는 11, 20, 4, 0.8, 0.16, 0.032, 6.4×10-3, 1.28×10-4, 및 5.12×10-5 nM이었다. 이어서 희석된 겜시타빈을 2시간 동안 세포에 첨가하였다. 이어서 겜시타빈을 세척해내고, 본 발명의 희석된 Chk1 억제제를 24시간 동안 세포에 첨가하였다. 성장 배지 중 초기의 1000배 희석액에 이어서, 본 발명에 따른 10 μM (DMSO 저장액) Chk1 억제제를 1.2 ㎖ 타이터 튜브즈에서 연속하여 3배 희석시켜서, 일련의 최종 희석액: 2.5, 0.83, 0.28, 0.09, 및 0.03 μM을 얻었다. 72시간 후, 각 웰의 세포를 12시간 동안 1 μMCi 3H-티미딘으로 표지한 후, -70℃에서 동결시켰다. 이어서 플레이트를 녹이고, 셀메이트(CellMate(등록상표)) 플레이트 수확기 (퍼킨 엘머)를 사용하여 96 웰 필터 플레이트 (밀리포어(Millipore)) 상에 수확하였다. 이어서 마이크로신트(Microscint(등록상표)) 20 (퍼킨 엘머) 30 ㎕를 첨가하고, 플레이트를 탑 카운트 플레이트 판독기 (퍼킨 엘머)에서 계수하였다. 데이터를 본 발명에 따른 Chk1 억제제 단독으로 처리한 세포에 대하여 정규화한 후; 겜시타빈 농도 (μM) 대 비교 세포 성장 (100%를 1.0으로 함)의 대수/대수 그래프로 그렸다. 90% 성장 억제에서의 증가된 배수 감작화는 사용한 Chk1 억제제의 각 농도에 대하여 유도하였고, 이어서 이것을 Chk1 억제제 농도 대 배수 감작화의 그래프로 그렸다. 이어서, ECTFS 값을 계산하였다.
상기 검정에 적용한 본 발명의 Chk1 억제제는 약 1000 nM 미만의 ECTFS 측정치를 가진다.
실시예
4
본 발명의
Chk1
억제제는 암 치료에 의해서 세포의 사멸을 증가시킴
본 발명의 화합물에 의한 Chk1의 억제가 표적화된 세포를 DNA-손상제의 사멸 효과에 대하여 감작시킨다는 것을 입증하기 위해서, 세포를 본 Chk1 억제제의 존재 하에 인큐베이션시키고, 방사선 또는 화학적 DNA-손상제에 노출시킬 수 있다. 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 웰 당 1000-2000개의 밀도로 플레이팅한 세포를 10% FBS를 함유하는 RMPI 1640, 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 중 18 h 동안 37℃에서 5% CO2로 가습화된 인큐베이터 내에서 성장시켰다. 시험한 화합물은 관심 있는 임의의 세포 또는 세포주, 예컨대 HeLa, ACHN, 786-O, HCT116, HCT15, SW620, HT29, Colo205, SK-MEL-5, SK-MEL-28, A549, H322, OVCAR-3, SK-OV-3, MDA-MB-231, MCF-7, PC-3, HL-60, K562, Bx-PC3, Mia-PaCa2, H810, H226, H2126, 및 MOLT4를 포함할 수 있다. 모든 세포주 명칭은 하기의 인간 세포주:
HeLa 자궁경부샘암종
ACHN 신장샘암종
786-O 신장샘암종
HCT116 결장 암종
SW620 결장 암종, 림프절 전이
HT-29 결장직장샘암종
Colo205 결장샘암종
SK-MEL-5 흑색종
SK-MEL-28 악성 흑색종
A549 폐암종
H322 기관지꽈리 암종
OVCAR-3 난소샘암종
SK-OV-3 난소샘암종
MDA-MB-231 유방샘암종
MCF-7 유방샘암종
PC-3 골전이로부터의 전립선샘암종
HL-60 급성 전골수성 백혈병
K562 만성 골수백혈병
MOLT4 급성 림프모세포성 백혈병; T-림프모세포
를 가리킨다.
세포는 화학요법 약물 단독 또는 화학요법 약물 및 Chk1 억제제를 함유하는 배지로 처리하였다. 세포를 대략 5일 동안 인큐베이션시킨 다음, 3H-티미딘 흡수 수준의 측정에 의해서 성장을 측정하였다. 화학요법 약물은 에토포시드, 독소루비신, 시스플라틴, 클로르암부실, 5-플루오로우라실 (5-FU)을 포함한다. 세포 성장을 비처리 대조군 세포의 90%까지 억제하는데 필요한 약물 농도를 GI90으로 정의한다.
본 발명의 화합물은 메토트렉세이트, 히드록시우레아, 2-클로로아데노신, 플루다라빈, 아자시티딘, 및 겜시티빈을 비롯한 추가의 항대사물질로 처리하여서, 거기서 상기 작용제의 사멸을 증가시키는 능력을 평가할 수 있다. 본 발명의 화합물은 겜시티빈과 조합된, HT29 결장직장 암종의 증가된 사멸을 평가함으로써 서로 비교할 수 있다.
또한, 방사선에 의한 사멸을 증가시키는 본 발명의 Chk1 억제제의 능력을 시험할 수 있다.
실시예
5
동물 모델에서의
Chk1
억제제 활성을 측정하기 위한 민감성 검정
하기의 민감성 검정은 설치류 종양 모델에서의 Chk1 억제제 활성을 측정하기 위해서 개발되었다. 특히, 상기의 검정은, 특히 종양 모델에서 Chk1 기능을 차단하기 위한 Chk1 억제제의 능력을 측정하고, 분자 표적에 대한 Chk1 억제제의 접근을 용이하게 하는 조건을 평가하는데 사용될 수 있다.
화학요법-유발 체크포인트를 소멸시키기 위한 선택적 Chk1 억제제의 능력은 세린 10에 대한 히스톤 H3 인산화 (H3-P), 유사분열-특이적 현상을 모니터링하여 유사분열 지수를 측정하는 정량적 면역형광 검정을 사용하여 측정하였다 (문헌 [Ajiro et al., J Biol Chem., 271:13197-201, 1996]; [Goto et al., J Biol Chem., 274:25543-9, 1999]). 검정 프로토콜은 다음과 같다. Chk1 활성화제 (본 연구에서는 화학요법제) 및/또는 Chk1 억제제로 처리 또는 비처리한 설치류로부터의 종양을 제거하고 파라핀에 침지시켰다. 종양을 6 마이크론 두께의 슬라이스로 절단하고, 유리 슬라이드 위에 마운팅하였다. 파라핀은 자일렌, 100% 에탄올, 95% 에탄올, 70% 에탄올 및 탈이온수를 이용한 3분의 연속 처리에 의해서 슬라이드로부터 제거하였다. 이어서 슬라이드를 10분 동안 10 mM 시트르산나트륨 내에서 95℃로 가열한 다음, 20분 냉각 단계를 거쳤다. 슬라이드를 30분 동안 블록(Block) 완충액 (0.05% 트리톤(Triton) X-100을 함유하는 인산염 완충 식염수 (PBST) 중 20% 정상 인간 혈청 및 2% 소혈청 알부민)으로 차단시켰다. 항포스포히스톤 H3 항체 (업스테이트 바이오테크(Upstate Biotech), 카탈로그 #06-570)를 블록 완충액 중 1:200 희석시키고, 1시간 동안 슬라이드와 함께 인큐베이션시켰다. 슬라이드를 PBST 중 5분 3회 세척하였다. 제2 항체인 당나귀 항토끼 로다민 (잭슨(Jackson), 카탈로그 #711-295-152)을 30분 동안 첨가하였다. 이어서 슬라이드를 PBST 중 2회 세척하고, 인산염 완충 식염수 (PBS) 중 75 μM의 0.1 μM/㎖ DAPI (시그마)를 첨가하고 30분 동안 염색하였다. 이어서 슬라이드를 PBST 중 2회 더 세척하고, 벡타쉴드(Vectashield) (벡터(Vector), 카탈로그 # H-1400)를 이용해서 마운팅하였다. 슬라이드를 형광 현미경을 사용하여 관측하였다. 전체 (DAPI 염색)에 대하여 H3-P 항체로 염색된 세포의 백분율을 메타모르프(Metamorph) 소프트웨어 (유니버설 이미징 코포레이션(Universal Imaging Corporation), 버전 4.6)를 사용하여 정량화하였다.
실시예
6
선택적
Chk1
억제제는
DNA
손상-유발된
G2
및 S 기 체크포인트를 소멸시킴
이전의 연구들은 선택적 Chk1 억제제가 DNA 손상-유발된 G2/M 및 S 기 체크포인트를 실질적으로 소멸시킨다는 것을 입증하였다. 전자에서, DNA 손상은 표적 단계가 G2 기인 이온화 방사선 (IR)에 의해서 유발되었다. 후자에서는, DNA 손상은 표적 단계가 S 기인 화학요법제에 의해서 유발되었다. 공개된 미국 특허 출원 공보 제2003/0069284호 및 거기에 인용된 참조문헌을 참고한다.
간략하게는, IR-유발된 G2 DNA 손상 체크포인트의 Chk1 억제제 소멸은 유사분열 지수 실험에 의해서 평가하였다. 대략 1×106개 HeLa 세포를 800 rad로 방사선조사하고, 7 h 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 상기의 세포가 기능적으로 p53 음성이기 때문에, 그들은 오로지 G2에서 정지한다. 이어서 노코다졸을 0.5 ㎍/㎖의 농도로 첨가하고, 15 h 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. (노코다졸의 첨가는 유사분열에서 G2 정지를 통하여 진행되는 세포를 트랩핑해서, 그들이 G1으로 더 진행하지 못하게 하고 M 기 세포를 정량화하기 위해서 고안됨.) 선택적 Chk1 억제제를 8 h 동안 첨가하고, 세포를 원심분리에 의해서 수확하고, PBS로 1회 세척한 후, 2.5 ㎖ 75 mM KCl에 재현탁시키고 다시 원심분리하였다. 이어서 세포를 3 ㎖의 갓 제조한 저온의 아세트산:MeOH (1:3) 중 고정시키고, 얼음에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 펠릿화하고, 고정액을 흡인하고, 세포를 0.5 ㎖의 PBS에 재현탁시켰다. 유사분열성 확산배양물을 100 ㎕의 고정된 세포를 유리 현미경 슬라이드 위에 피펫팅하고, 샘플에 1 ㎖의 고정액을 가득 부어서 제조하였다. 이어서 슬라이드를 공기건조시키고, 라이츠(Wrights) 염료 (미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마)로 염색한 다음, 물에서 1회 세척하고, 50% MeOH에서 1회 세척하였다. 농축 염색체의 존재 및 핵막의 부재가 유사분열 세포를 확인해 주었다. Chk1 억제제는 방사선의 존재 하에 유사분열 세포의 개수를 증가시켜서, IR-유발된 G2 정지의 소멸을 입증하였다. 상기 체크포인트 소멸은 CyclinB/cdc2의 활성을 강화시키고, 이것은 유사분열로의 세포의 진행에 필요하다. 따라서 IR에 이어서 Chk1 억제제로 처리한 세포는 손상된 DNA를 가지고 유사분열로 진행한다. 상기 실험은 Chk1이 IR-유발된 G2와 관련되어 있다는 가설을 확인해 준다.
실시예
7
Chk1
억제제는 이종이식 종양 모델에서
Chk1
활성화제의 존재 하에 종양 세포에 의해서 흡수됨
이종이식 종양 모델에서, 누드 마우스를 옆구리에 HT29 결장 암종 종양을 주입하고, 200 ㎣로 성장시켰다. 이어서 마우스를 비히클, 300 ㎎/㎏ Chk1 억제제, 20 ㎎/㎏ 겜시타빈으로 처리하거나, 3일 간격을 두고 1일 및 4일에 300 ㎎/㎏ Chk1 억제제 및 20 ㎎/㎏ 겜시타빈으로 2회 동시투여하였다. Chk1 억제제 및 겜시타빈의 동시투여에 의한 종양-보유 마우스의 치료는 겜시타빈 단독에 비하여 종양에서 4일 성장 지연을 이끌어 내었다.
종양 조직 속으로의 Chk1 억제제의 확산을 평가하기 위해서, Chk1 억제제의 혈장 및 조직 수치를 측정하였다. 알젯(Alzet) 펌프를 사용하여, 500 ㎎/㎏ Chk1 억제제를 HT29 종양-보유 마우스에게 연속식 전달 시스템으로 24시간의 기간에 걸쳐서 투여하였다. 혈장 샘플을 취한 후, 종양, 신장, 간, 비장, 및 폐를 취하였다. 1, 2, 4, 8, 및 24 h 시점에서 수집하였다. 조직을 추출하고, Chk1 억제제의 수준을 정량화하였다. 상기 실험은 Chk1 억제제가 정상 종양 조직으로 침투하여, 종양 조직 내에서 약 15 μM의 수준, 및 8 h에서 비장 조직 내에서 약 20 μM의 피크에 도달한다는 것을 입증하였다. 따라서, Chk1 억제제는 증식 세포에 의해서 쉽게 흡수되고, Chk1 활성화 화학요법제와 함께, 증식성 질환의 치료를 위한 요법으로서 유용하다.
실시예
8
Chk1
억제제 및
겜시타빈으로
처리한 종양의 용량 반응
겜시타빈 치료에 이은 Chk1 억제제의 효능 용량 및 용량-의존성 체크포인트 소멸이 항종양 활성과 상호관련되어 있는지의 여부를 측정하기 위해서, 용량 반응 실험을 수행하였다.
누드 마우스에 HT29 종양 세포를 주입하고, 종양을 10일 동안 발달시켰다. 개시시의 종양은 대략 100 ㎣였다. 동물을 MTD에서 겜시타빈 (160 ㎎/㎏)에 이어서 50 ㎎/㎏, 200 ㎎/㎏, 또는 400 ㎎/㎏에서의 Chk1 억제제로 처리하였다. 겜시타빈 예비처리 시간은 본 실험에서, 상기 유형의 종양에 대하여 상기 시점이 최적 이라고 가리키는 세포-기반 검정에 의해서 측정한 바와 같이 32 h였다. 각 치료 계획에서의 종양 부피의 분석은, 기재한 요법을 이용한 HT29 종양 보유 마우스의 치료가 겜시타빈 단독보다, 200 ㎎/㎏ 또는 400 ㎎/㎏ Chk1 억제제 + 겜시타빈의 경우에 종양 성장을 더 늦춘다는 것을 나타내며, 이는 또한 Chk1 억제제의 용량-의존성 효과를 나타낸다.
실시예
9
작용제가
Chk1
활성화제인지의 여부를 측정하기 위한 검정
작용제가 Chk1 활성화제인지의 여부를 측정하기 위해서, Chk1의 인산화 상태를 Chk1에서의 특이적 인산화 부위에 대한 포스포-특이적 항체를 사용하여 측정할 수 있다. 세린 317 및 345는 이온화 방사선, 자외선 방사선, 히드록시우레아, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 (MNNG), 테모졸아미드 및 겜시타빈을 이용한 세포의 처리 후에 인산화된다는 것을 보여준다. 문헌 [Liu et al., Genes Dev . 14:1448-1459, 2000]; [Zhao et al., Mol . Cell Biol . 21:4129-4139, 2001]; [Lopez-Girona et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U. S. A. 98:11289-11294, 2001]; [Guo et al., Genes Dev . 14:2745-2756, 2000]; [Gatei et al., J. Biol . Chem . 278:14806-14811, 2003]; [Ng et al., J Biol Chem. 279(10):8808-19, 2004]; [Wang et al., Natl Acad Sci U S A. 100(26):15387-92, 2003]; [Stojic et al., Genes Dev. 18(11):1331-44, 2004]. 상기 세린 부위는 상향 체크포인트 키나제인 Atm 및 Atr에 의해서 인산화된다. 문헌 [Liu et al., Genes Dev . 14 :1448-1459, 2000]; [Zhao et al. Mol . Cell Biol ., 21 :4129-4139, 2001].
후보 Chk1 활성화제에 반응하는 상기 부위의 인산화는 종양 세포의 웨스턴 블랏 또는 면역조직화학법에 의해서 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 하기의 절차를 사용하여, 겜시타빈이 세린 345 및 317에서 Chk1 활성화를 일으킨다는 것을 입증할 수 있다. HT29 세포를 20 μM 겜시타빈으로 2 h 동안 처리하였다. 겜시타빈을 세포 성장 배지로부터 세척해내고, 세포를 추가로 22 h 동안 인큐베이션시켰다. 단백질 용해물을 제조하고, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해서 분리하였다. 단백질을 PVDF 막으로 옮기고, 인산화된 세린 317 또는 345 (셀 시그널링(Cell Signalling))에 대하여 특이적인 안티세라 (셀 시그널링)로 탐지하였다. 웨스턴 블랏은 HT29 결장 암종 세포의 겜시타빈 처리가 세린 317 및 345 양자 모두의 인산화를 일으킨다는 것을 나타내었다.
실시예
10
Chk1
억제제에 반응하는
Chk1
활성을
모니터링하기
위한 검정
세린 296에서의 Chk1의 인산화가 겜시타빈을 이용한 종양 세포의 처리에 의해서 자극되고, 상기 부위에서의 인산화가 Chk1 억제제에 의해서 억제된다는 것이 발견되었다. 상기 부위에서의 인산화는 Atm 및 Atr을 억제하는 워트마닌(wortmannin)에 의해서 억제되지 않았다. 따라서, 세린 296의 인산화는 세린 317 및 345의 인산화와는 다르다. 또한, 상기 부위는 정제된 Chk1 제제에서 인산화된다는 것을 알게 되어서, 정제된 효소가 세린 296에서 그 자신 또는 기타 Chk1 분자를 인산화시킬 수 있음을 시사한다. 수렴하면, 상기 데이터는 세린 296에서의 인산화가 Chk1 자체에 의해서 수행된다는 것을 시사한다. 따라서, 상기 접근법을 사용하여 Chk1 활성화제에 반응하는, 종양에서의 Chk1 활성을 모니터링할 수 있다. 또한, 상기 접근법을 사용하여 Chk1 억제제에 의한 Chk1 활성화의 억제를 측정할 수 있다.
따라서, HT 29 세포를 20 μM 겜시타빈으로 2 h 동안 처리하였다. 겜시타빈을 세포 성장 배지로부터 세척해내고, 세포를 추가로 22 h 동안 인큐베이션시켰다. 단백질 용해물을 제조하고, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해서 분리하였다. 단백질을 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 막으로 옮기고, 인산화된 세린 296 (셀 시그널링)에 특이적인 안티세라 (셀 시그널링)로 탐지하였다. 웨스턴 블랏은 HT29 결장 암종 세포의 겜시타빈 처리가 세린 296의 인산화를 일으킨다는 것을 나타내었다. 또한, 15분 동안 선택적 Chk1 억제제로 처리한 HT29 세포는 세린 296 인산화를 나타내지 않았다. 상기 데이터는 세린 296 인산화가 Chk1 키나제에 의해서 수행됨을 시사한다.
실시예
11
동물 종양 모델
마우스에서 DNA 손상제에 의한 종양의 사멸을 강화시키기 위한 본 발명의 Chk1 억제제의 능력을 시험하기 위해서, 결장 종양 세포주를 사용하는 이종이식 종양 모델을 확립하였다. 5-플루오로우라실 (5-FU) 또는 겜시타빈을 DNA 손상제로서 사용할 수 있다. HT29 및 Colo205 (인간 결장 암종) 및 H460 및 Calu-6 (비소세포 암종) 세포를 사용하여 6-8주령 암컷 흉선 Balb/c (nu/nu) 마우스에서 이종이식 종양을 증식시킬 수 있다. 마우스를 무-발열원 조건 하에 층상류 캐비넷 내에 유지 시키고, 멸균 먹이 및 물을 임의로 공급하였다. 세포주를 5% CO2 가습화된 환경에서 10% FBS, 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 및 1.5 mM L-글루타민으로 보충한 RPMI 1640 배지 중 성장시켜서 서브융합시켰다. 단일 세포 현탁액을 CMF-PBS 중 제조하고, 세포 농도를 1×108개 세포/㎖로 조절하였다. 마우스를 오른쪽 옆구리 또는 오른쪽 다리에 총 1×107개 세포 (100 ㎕)로 피하 (s.c.) 접종시켰다.
마우스를 4개의 처리군으로 무작위추출 (5-15 마리 마우스/군)하고, 종양이 75-100 ㎤의 부피에 도달했을 때 (보통 접종 후 7-11일) 사용하였다. 종양을 버니어 캘리퍼스로 측정하고, 실험적으로 유도한 식: 종양 부피 (㎤)= 종양 길이 (㎝) × 종양 폭 (㎝) × 종양 깊이 (㎝)/3.3을 사용하여 종양 부피를 추정하였다. 처리는 i) 160 ㎎/㎏에서 겜시타빈의 100 ㎕ 복막내 (i.p.) 주입으로 이루어졌다. 종양 성장의 지연이 겜시타빈으로 처리한 마우스에서 관찰되었다. Chk1 억제제의 경구 투여와 조합된 160 ㎎/㎏ 겜시타빈 양자 모두를 이용한 마우스의 처리는 종양 부피를 감소시키고 수명을 연장할 것으로 예상된다. 종양 크기는 실험기간 동안 매일 모니터링하였다.
명백하게, 상기 나타낸 바와 같은 본 발명의 다수의 변경 및 변형이 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않고 행해질 수 있으며, 따라서, 그러한 제한은 첨부된 청구의 범위에 의해서 나타낼 때에만 부과되어야 한다.
Claims (6)
1-[2-(1,4-디메틸-피페라진-2-일메톡시)-5-메틸-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아,
1-[5-메틸-2-(1-메틸-피페라진-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아,
1-[5-클로로-2-(1-메틸-피페라진-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아, 또는
1-[5-클로로-2-S-(1-메틸-피페라진-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아인 화합물, 또는 그의 제약상 허용가능한 염.
1-(5-시아노-피라진-2-일)-3-[5-메틸-2-(4-메틸-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-우레아,
1-[5-브로모-2-S-(4-메틸-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아,
1-[5-클로로-2-S-(4-시아노메틸-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아,
1-[5-클로로-2-S-(4-메틸-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-시아노-피라진-2-일)-우레아, 또는
1-[5-클로로-2-(S-4-메틸-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2- 일)-우레아인 화합물, 또는 그의 제약상 허용가능한 염.
1-[5-클로로-2-(R-모르폴린-3-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아,
1-[4,5-디클로로-2-(S-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아,
1-(5-시아노-피라진-2-일)-3-[5-메틸-2-(모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-우레아,
1-[5-클로로-4-메틸-2-(S-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아,
1-[5-클로로-4-메틸-2-(R-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아,
1-[4,5-디클로로-2-(R-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아,
1-[4,5-디메틸-2-(모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아,
1-[4-클로로-5-메틸-2-(S-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아,
1-[5-시아노-2-(S-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아,
1-[5-클로로-4-에틸-2-(S-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아,
1-[5-클로로-4-메톡시-2-(S-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아,
1-[5-디메틸아미노-2-(S-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아,
1-[5-메틸-2-(모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아,
1-[5-클로로-2-(모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아,
1-[5-클로로-2-(S-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아,
1-[5-메틸-2-(S-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아,
1-[5-클로로-2-(R-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아,
1-[5-브로모-2-(S-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아,
1-[5-브로모-2-R-(R-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아,
1-(5-메틸-피라진-2-일)-3-[3-S-(모르폴린-2-일메톡시)-5,6,7,8-테트라히드 로나프탈렌-2-일]-우레아,
1-[5-클로로-2-S-(모르폴린-3-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아,
1-[5-메틸-2-R-(모르폴린-3-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아,
1-[5-클로로-2-S-(모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-트리플루오로메틸-피라진-2-일)-우레아,
1-[4-클로로-5-메틸-2-S-(모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-시아노-피라진-2-일)-우레아,
1-[5-클로로-4-메톡시-2-(S-모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-시아노-피라진-2-일)-우레아, 또는
1-[5-클로로-2-S-(모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-시아노-피라진-2-일)-우레아인 화합물, 또는 그의 제약상 허용가능한 염.
1-[5-클로로-2-(티오모르폴린-2-일메톡시)-페닐]-3-(5-메틸-피라진-2-일)-우레아인 화합물, 또는 그의 제약상 허용가능한 염.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 그의 제약상 허용가능한 염, 및 제약상 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함하는 제약 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 그의 제약상 허용가능한 염, 및 제약상 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함하는, 결장직장암, 두경부암, 췌장암, 유방암, 위암, 방광암, 외음암, 백혈병, 임파종, 흑색종, 신장 세포 암종, 난소암, 뇌암, 골육종, 또는 폐암 치료용 제약 조성물.
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