EA011287B1 - Производные гетероарилмочевины, пригодные для ингибирования chk1 - Google Patents

Abstract

Раскрыты замещенные соединения мочевины, пригодные для лечения болезней и патологических состояний, связанных с повреждением ДНК или нарушениями репликации ДНК. Раскрыты способы получения соединений и их применения в качестве терапевтических агентов, например, для лечения раковых и других заболеваний, которые характеризуются дефектами репликации ДНК, сегрегации хромосом или деления клеток.

Description

Область изобретения

Данное изобретение относится к соединениям, пригодным для ингибирования ферментов, которые сохраняют и восстанавливают целостность генетического материала. Более конкретно, настоящее изобретение относится к серии арил- и гетероарилзамещенных соединений мочевины, способам получения соединений и их применению в качестве терапевтических агентов, например, для лечения раковых и других заболеваний, которые характеризуются дефектами репликации дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), сегрегации хромосом или деления клеток.

Предпосылки создания изобретения

Большое количество болезней, патологических состояний и расстройств (в дальнейшем показания) характеризуются наличием аберрантно пролиферирующих клеток. В данном описании аберрантно пролиферирующие клетки (или аберрантная пролиферация клеток) подразумевает пролиферацию клеток, которая отличается от нормального, надлежащего или ожидаемого протекания. Например, аберрантная пролиферация клеток включает ненадлежащую пролиферацию клеток, при которой ДНК или другие компоненты клетки становятся поврежденными или дефектными. Аберрантной пролиферацией клеток также характеризуются клинические показания, вызванные, опосредованные или являющиеся результатом неадекватно высокого уровня деления клеток, неадекватно низкого уровня гибели клеток (например, апоптоза) или обоих этих факторов. Такие показания могут характеризоваться, например, однократной или множественной местной аномальной пролиферацией клеток, групп клеток или ткани(ей) и включать раковые (доброкачественные или злокачественные) и нераковые показания.

По определению, все виды рака (доброкачественные и злокачественные) включают некоторую форму аберрантной пролиферации клетки. Некоторые нераковые показания также включают аберрантную пролиферацию клеток. Примеры нераковых показаний, включающих аберрантную пролиферацию клеток, включают ревматоидный артрит, псориаз, витилиго, гранулематоз Вегенера и системную волчанку.

Один из подходов к лечению показаний, включающих аберрантную пролиферацию клеток, включает применение повреждающих ДНК агентов. Такие агенты разработаны, чтобы вызывать гибель аберрантно пролиферирующих клеток путем нарушения жизненно важных процессов в клетке, таких как метаболизм ДНК, синтез ДНК, транскрипция ДНК, и образование вытянутых микротрубочек. Они также могут действовать, например, вызывая повреждения в ДНК, которые нарушают структурную целостность хромосом. Повреждающие ДНК агенты разработаны и вводятся такими способами, чтобы вызвать максимальное повреждение и последующую гибель аберрантно пролиферирующих клеток с минимальным повреждением нормальных, здоровых клеток.

В настоящее время создано большое разнообразие повреждающих ДНК агентов, в том числе химиотерапевтические средства и облучение, тогда как другие находятся в стадии разработки. К сожалению, эффективность повреждающих ДНК агентов в лечении состояний, включающих аберрантную пролиферацию клеток, была ниже желательной, особенно при лечении рака. Селективность таких агентов в отношении аберрантно пролиферирующих клеток по сравнению со здоровыми клетками (иногда носит название терапевтического индекса) часто является пограничной.

Кроме того, все клетки располагают сенсорными и восстанавливающими механизмами, которые могут препятствовать действию повреждающих ДНК агентов. Такие сенсорные механизмы, которые называются сверочными точками клеточного цикла, помогают поддерживать порядок различных стадий репликации в клетке и гарантировать, что каждая стадия выполняется с высокой надежностью (Наг1\те11 е! а1., 8с1епсе, 246:629-634 (1989); \Уешег1 е! а1., Оеиез Эеу., 8:652 (1994)). Когда клетки обнаруживают повреждение ДНК, в том числе повреждение, целенаправленно вызываемое повреждающими ДНК агентами, некоторые сигнальные пути активируют сверочные точки клеточного цикла и цикл репликации клетки временно прекращается (остановки). Такая остановка дает клеткам время для восстановления ДНК, часто до степени, достаточной для дальнейшего выживания и пролиферации. В случае аберрантно пролиферирующих клеток такое восстановление является нежелательным, так как оно может препятствовать усилиям по индукции повреждения ДНК, достаточного для гибели таких клеток.

Например, химиотерапевтический агент под названием ΟΕΜΖΑΚ™ (гемцитабин или 2',2'-дифтор2'-дезоксицитидин) повреждает ДНК, встраиваясь в ДНК в ходе синтеза. Без восстановления поврежденная ДНК в целом будет неспособной поддерживать жизнь. Однако во многих клетках-мишенях сверочные точки клеточного цикла обнаруживают неправильно синтезированную (или другим способом поврежденную) ДНК. Активированные сверочные точки клеточного цикла запускают остановку клеточного цикла на время, достаточное для восстановления поврежденной ДНК. Это один способ, с помощью которого аберрантно пролиферирующие клетки теоретически могут воспротивиться губительному для клетки действию повреждающих ДНК агентов, например химиотерапевтических средств, облучения и других терапевтических средств.

Другие повреждающие ДНК агенты заставляют опухолевые клетки останавливаться в 8-фазе. Обнаружено, что опухолевые клетки сопротивляются некоторым химиотерапевтическим средствам, просто останавливаясь в 8-фазе во время введения химиотерапевтического средства. Затем, как только лекарство выводится, повреждение ДНК восстанавливается, остановка клеточного цикла прекращается и клетки

- 1 011287 прогрессируют через остальные стадии клеточного цикла (8Ы е! а1., Сапсег Рек. 61:1065-1072, 2001). Другие терапевтические средства вызывают остановку клеточного цикла в других сверочных точках, в том числе 01 и 02. Таким образом, ожидается, что ингибирование различных сверочных точек повреждениями ДНК помогает воспрепятствовать восстановлению терапевтически вызванного повреждения ДНК клетками и делает клетки-мишени чувствительными к повреждающим ДНК агентам. В свою очередь, ожидается, что такая сенсибилизация увеличит терапевтический индекс таких терапевтических средств.

С точки зрения основных процессов и способов регулирования клеточный цикл является структурно и функционально сходным для всех видов эукариот. Митотический (соматический) клеточный цикл состоит из четырех фаз: фаза 01 (интервал), фаза 8 (синтез), фаза 02 (интервал) и фаза М (митоз). Фазы 01, 8 и 02 вместе называются интерфазой клеточного цикла. В ходе фазы 01 биосинтетическая активность клетки прогрессирует с высокой скоростью. Фаза 8 начинается, когда начинается синтез ДНК, и заканчивается, когда содержание ДНК в клеточном ядре реплицируется и образуются два идентичных набора хромосом.

Далее клетка входит в фазу 02, которая продолжается до начала митоза. В ходе митоза образуется пара хромосом и два новых ядра, а также происходит цитокинез, в ходе которого клетка расщепляется на две дочерние клетки, каждая из которых получает одно ядро, содержащее один из двух наборов хромосом. Цитокинез завершает фазу М и обозначает начало интерфазы следующего клеточного цикла. Последовательность, в которой происходят события клеточного цикла, строго регулируется таким образом, что начало одного события клеточного цикла зависит от завершения предшествующего события клеточного цикла. Это позволяет достичь надежности удвоения и выделения генетического материала от одного поколения соматических клеток к следующему.

Сообщается, что сверочные точки клеточного цикла включают по крайней мере три четких класса полипептидов, которые действуют последовательно в ответ на сигналы клеточного цикла или дефекты в хромосомных механизмах (Сагг, 8с1епсе, 271:314-315, 1996). Первый класс представляет собой семейство белков, которые воспринимают или обнаруживают повреждение ДНК или аномалии клеточного цикла. Такие датчики включают мутантный белок атаксии-телеангиэктазии (А!т) и Раб-связанный белок атаксии-телеангиэктазии (А!г). Полипептиды второго класса амплифицируются и передают сигнал, обнаруженный детектором; примерами его представителей являются Раб53 (А1еп е! а1. 0епек Эеу. 8:2416-2488, 1994) и С11к1. Третий класс полипептидов включает эффекторы клеточного цикла, например, р53, которые опосредуют клеточную реакцию, например, остановку митоза и апоптоз.

Многое из текущего понимания функционирования сверочных точек клеточного цикла является результатом изучения линий опухолевых клеток. Во многих случаях опухолевые клетки утратили ключевые сверочные точки клеточного цикла (Наг1\ге11 е! а1., 8с1епсе 266:1821-28, 1994). Сообщается, что ключевой шаг в эволюции клеток до состояния новообразования заключается в приобретении мутаций, которые инактивируют пути сверочной точки клеточного цикла, например, включающие р53 (ХУешЬегд, Се11 81:323-330, 1995; Ьеуше, Се11 88:3234-331, 1997). Утрата таких сверочных точек клеточного цикла приводит к репликации опухолевых клеток, несмотря на повреждение ДНК.

Нераковая ткань, которая обладает интактными сверочными точками клеточного цикла, обычно защищена от временного нарушения единого пути сверочных точек. Однако в путях опухолевых клеток, управляющих продвижением клетки через клеточный цикл, присутствуют такие дефекты, что расстройство дополнительных сверочных точек делает их особенно чувствительными к повреждающим ДНК агентам. Например, опухолевые клетки, которые содержат мутантный р53, имеют дефекты как в сверочных точках повреждения 01 ДНК, так и в способности поддерживать сверочную точку для повреждения 02 ДНК (Βιιπζ е! а1., 8с1епсе, 282:1497-501, 1998). Ожидается, что ингибиторы сверочной точки, которые нацелены на инициацию сверочной точки 02 или сверочной точки 8-фазы, будут дополнительно нарушать способность таких опухолевых клеток восстанавливать повреждение ДНК и, таким образом, являются кандидатами на увеличение терапевтического индекса как для облучения, так и системной химиотерапии (0екпег, АЬйтас! а! 8Р1 СопГегепсе: Рто!еш Р1ю5р1югу1а1юп апб Эгид Эксоуегу \Уог1б 8иттй, Магсй 2003).

В присутствии повреждения ДНК или какого-либо препятствия для репликации ДНК сверочные точки белков А!т и Αίτ инициируют путь преобразования сигнала, который приводит к остановке клеточного цикла. Показано, что А!т играет роль в сверочной точке повреждения ДНК в ответ на действие ионизирующего излучения (1Р). Агенты, которые вызывают разрывы двухнитевой ДНК, разрывы однонитевой ДНК, и агенты, которые блокируют облучение ДНК, стимулируют А!г.

С1к1 представляет собой протеинкиназу, которая расположена в 5'-3' направлении по отношению к А!т и/или А!г в пути преобразования сигнала сверочной точки повреждения ДНК (8апс1^ е! а1., 8с1епсе, 277:1497-1501, 1997; патент США 6,218,109).

В клетках млекопитающих С1к1 фосфорилируется в ответ на действие агентов, которые вызывают повреждение ДНК, в том числе ионизирующего излучения (1Р), ультрафиолетового (ИУ) света и гидроксимочевины (8апс1^ е! а1., выше; Ьш е! а1., 0епек Эеу.. 14:1448-1459, 2000). Такое фосфорилирование, которое активизирует С1к1 в клетках млекопитающих, зависит от А!т (Сйеп е! а1., Опсодепе, 18:249-256,

- 2 011287

1999) и ΛίΓ (Ьш е! а1., выше). К тому же показано, что Сйк1 фосфорилирует как \тсс1 (О'Соппе11 е! а1., ЕМВО 1., 16:545-554, 1997), так и Рбз1 (Запсйех е! а1., Зс1епсе, 286:1166-1171, 1999), то есть генные продукты, которые важны для контроля клеточного цикла.

Эти исследования продемонстрировали, что Сйк1 млекопитающих играет роль в А!т-зависимой сверочной точке повреждения ДНК, ведущего к остановке в З фазе. Недавно была прояснена роль Сйк1 в 8 фазе клеток млекопитающих (Ееуоо е! а1., 1. Се11 Вю1., 154:913-923, 2001; 2йао е! а1., ΡΝΑ3 И.З.А, 99:14795-800, 2002; Х1ао е! а1., 1 Вю1 С1ет., 278(24):21767-21773, 2003; Зогепзеп е! а1., Сапсег Се11, 3(3):247-58, 2003), а именно, показана роль Сйк1 в мониторинге целостности синтеза ДНК. Сйк1 вызывает остановку в З-фазе путем фосфорилирования Сбс25А, который регулирует активность циклинаА/сб1к2 (Х1ао е! а1., выше и Зогепзеп е! а1., выше). Сйк1 также вызывает остановку 02 путем фосфорилирования и инактивации Сбс25С, фосфатазы с двойной специфичностью, которая в норме дефосфорилирует циклин-В/сбс2 (также известный как Сбк1) по мере прогресса клеток от 02 к митозу (Еегпегу е! а1., Заепсе, 277:1495-7, 1997; Запсйех е! а1., выше; Ма!зиока е! а1., Заепсе, 282:1893-1897, 1998; и В1азта е! а1., Сигг. Вю1., 9:1-10, 1999). В обоих случаях регулирование активности Сбк вызывает остановку клеточного цикла, чтобы воспрепятствовать вхождению клеток в фазу митоза при наличии повреждения ДНК или нереплицированной ДНК.

Дополнительные классы ингибиторов сверочных точек клеточного цикла действуют в фазе 01 или 02/М. υθΝ-01 или 7-гидроксистауроспорин, первоначально был выделен как неспецифический ингибитор киназы, действующий в основном на протеинкиназу С, но недавно было обнаружено, что он ингибирует активность Сйк1 и инактивирует сверочную точку клеточного цикла 02 (З1й е! а1, выше). Таким образом, поскольку υθΝ-01 является неселективным ингибитором Сйк1, в высоких дозах он токсичен для клеток. В низких дозах он неспецифически ингибирует многие клеточные киназы, а также ингибирует сверочную точку 01 (Теихег е! а1., Сигг. Меб Сйет. Апбсапсег Адеп!з, 3:35-46, 2003).

υθΝ-01 с ограниченным успехом применяли в сочетании с противораковыми средствами, такими как облучение, противораковый агент камптотецин (Тепхег е! а1., выше), и гемцитабин (ЗЫ е! а1., выше). Кроме того, υθΝ-01 использовали для того, чтобы потенцировать действие индуцированного темозоломидом (ТМ2) восстановление несоответствия ДНК (ММК) в клетках глиобластомы (Нйозе е! а1., Сапсег Кез., 61:5843-5849, 2001). В клинике υθΝ-01 не является таким эффективным химиотерапевтическим средством, как ожидалось, возможно из-за несоблюдения схемы лечения и отсутствия идентификации конкретных ключевых молекулярных мишеней (0гап! е! а1., Эгид Кез1з!апсе ирба!ез, 6:15-26, 2003). Поэтому Маск е! а1. сообщают о зависимой от клеточного цикла потенциации цисплатина агентом υθΝ-01 в культивированной клеточной линии немелкоклеточной карциномы легких, но не соотносят со специфической ключевой(ыми) сверочной(ыми) точкой(ами) клеточного цикла, на которую нацелен υθΝ-01 (Маск е! а1., Сапсег СйетоШег. Рйагтасок, 51(4):337-348, 2003).

Существует несколько других стратегий сенсибилизации опухолевых клеток к лечению с помощью химиотерапевтических средств, воздействующих на клеточный цикл. Например, введение 2-аминопурина инактивирует многочисленные механизмы сверочной точки клеточного цикла, такие как индуцированная мимозином остановка 01 или индуцированная гидроксимочевиной остановка в З-фазе, что позволяет клетке прогрессировать до митоза и через митоз (АпбЁсаззеп е! а1., Ргос №11 Асаб За ШЗА, 86:2272-2276, 1992). Производное метилксантина - кофеин также использовали для увеличения цитотоксичности повреждающих ДНК агентов, таких как цисплатин и ионизирующее излучение, путем опосредования прогресса через сверочную точку 02 и, таким образом, индукции гибели клеток (Вгасеу е! а1., Сйп. Сапсег Кез., 3:1371-1381, 1997). Однако доза кофеина, которую применяли, чтобы достичь инактивации клеточного цикла, превышала клинически приемлемые уровни и не является жизнеспособным терапевтическим вариантом. Кроме того, использовали антисмысловые нуклеотиды к киназе Сйк1 для повышения чувствительности к ингибитору топоизомеразы ΡΝΡ1350 (Уш е! а1., Вюсйет. Вюрйуз. Кез. Соттип., 295:435-44, 2002), но они продемонстрировали проблемы, обычно связанные с антисмысловой и генной терапией.

Раскрыты ингибиторы Сйк1, в том числе арил- и гетероарилзамещенные соединения мочевины, описанные в патентной заявке США 10/087715 и временных патентных заявках США 60/583080, 60/585292 и 60/602968; диарильные соединения мочевины, описанные в патентной публикации США 2004/0014765, патентной публикации США 2003/199511, патентной публикации США 2004/0014765 и АО 03/101444; метилксантины и родственные соединения, описанные в Еап е! а1., Сапсег Кез. 55:1649-54. 1995; уреидотифены, описанные в АО 03/029241 и АО 03/028731; Ν-пирролпиридинилкарбоксамиды, описанные в АО 03/028724; антисмысловые олигонуклеотиды Сйк1, описанные в АО 01/57206 и патенте США 6211164; антагонисты рецептора Сйк1, описанные в АО 00/16781; гетероароматические производные карбоксамида, описанные в АО 03/037886; аминотиофены, описанные в АО 03/029242; (индазолил)бензимидазолы, описанные в АО 03/004488; бензимидазолхинолиноны, описанные в патентной публикации США 20040092535 и АО 04/018419; гетероциклические гидроксииминофлуорены, описанные в АО 02/16326; производные сцитонемана (зсу!опетап), такие как сцитонемин (зсу!опетш), описанный в патенте США 6495586; гетероарилбензамиды, описанные в АО 01/53274; индазолы, описанные в АО 01/53268; индолакарбазолы, описанные в Тепхег е! а1., выше; производные хромана, описанные в АО 02/070515; пауллоны (раи11опез), описанные в Зс1ш11х е! а1., 1. Меб. Сйет., Уо1:2909-2919, 1999; инденопиразолы, описанные в АО 99/17769; флавоны, описанные в

- 3 011287

8еб1асек с1 а1., Ιηΐ 1. Опсо1., 9:1143-1168, 1996; производные пептидной петли серинтреонинкиназ, описанные в XV О 98/53050; оксиндолы, описанные в \УО 03/051838; диазепиноиндолоны, описанные в XVО 2004/063198; пиримидины, описанные в νϋ 2004/048343; соединения мочевины, описанные в νϋ 2004/014876; и пирролкарбазолы, бензофуроизоиндолы и азациклопентафлюорены, описанные в νϋ 2003/091255.

Однако в уровне техники по-прежнему существует потребность в эффективных и селективных ингибиторах С11к1. Данное изобретение направлено на удовлетворение этой и других потребностей.

Краткое описание изобретения

Данное изобретение относится к высокоактивным селективным ингибиторам сверочной точки киназы Сйк1, которые демонстрируют неожиданные свойства в биохимических и/или клеточных анализах. Данные ингибиторы С11к1 пригодны для лечения показаний, включающих аберрантную пролиферацию клеток, а также в качестве хемосенсибилизирующих и радиосенсибилизирующих агентов для лечения показаний, связанных с повреждением ДНК или нарушениями репликации ДНК.

Таким образом, один аспект настоящего изобретения состоит в обеспечении соединениями структурной формулы (I). Среди прочего, соединения пригодны для способа ингибирования С11к1, который включает стадию введения эффективного количества соединения структурной формулы (I) индивидууму, который в этом нуждается.

Соединения формулы (I), строение которых может быть выражено структурной формулой:

(I) к² где Я¹ представляет собой галоген, С1_-Залкил, СЫ или СТ₃;

Я² представляет собой водород, Ср3алкил, СЫ, ОС)-3алкил, галоген или Ы(Я^Ь)2, где Я^ь независимо представляет собой водород или С)_-3алкил;

Я³ представляет собой 6- или 7-членное насыщенное гетероциклическое кольцо, содержащее в кольце одну группу Ы-Я^а, а также содержащее в кольце вторую группу Ы-Я^а, атом кислорода или атом серы, где Я^а независимо представляет собой водород, С)_-3алкил, СН₂СЫ или СН₂СН₂СЫ и где Я³ необязательно замещен оксо(=О);

Я⁴ представляет собой водород, С!-3алкил, ОС1-3алкил, 8С1-3алкил, Ы(Я^Ь)2, ЫЯ^ЬС (=О) С!-3алкил или 5- или 6-членное насыщенное гетероциклическое кольцо, содержащее одну группу Ы-Я^а, причем кольцо необязательно замещено 1-3 группами С)-3алкил;

или Я² и Я⁴, взятые вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют 5-7членное насыщенное карбоциклическое кольцо;

и Я⁵ представляет собой водород или галоген, при условии, что по крайней мере один из Я² и Я⁴ не является водородом, и если Я⁵ представляет собой галоген, то Я² или Я⁴ представляет собой водород, или их фармацевтически приемлемые соли, пролекарства или сольваты.

Другой аспект настоящего изобретения представляет собой соединения структурной формулы (II), которые, среди прочего, могут применяться в способе ингибирования С11к1

(II) к² где Я¹ представляет собой галоген, С1_-3алкил, СЫ или СТ₃;

Я² представляет собой водород, Ср3алкил, СЫ, ОС1-3алкил, галоген или Ы(Я^Ь)2, где Я^ь независимо представляет собой водород или С)_-3алкил;

Я³ представляет собой 6- или 7-членное насыщенное гетероциклическое кольцо, содержащее в кольце одну группу Ы-Я^а, а также содержащее в кольце вторую группу Ы-Я^а, атом кислорода или атом серы, где Я^а независимо представляет собой водород, С1_-3алкил или СН₂СЫ, и где Я³ необязательно замещен оксо(=О);

Я⁴ представляет собой водород, С1_-3алкил, ОС)_-3алкил или галоген;

или Я² и Я⁴, взятые вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют 5-7членное насыщенное карбоциклическое кольцо;

при условии, что по крайней мере один из Я² и Я⁴ не является водородом, или их фармацевтически приемлемые соли, пролекарства или сольваты.

Другой аспект настоящего изобретения представляет собой фармацевтические композиции, которые содержат одно или несколько соединений структурной формулы (I) или (II), и применение таких композиций для лечения показания, где ингибирование С11к1 ίη νίνο или ех νίνο обеспечивает терапевтическое преимущество или является предметом исследовательского или диагностического интереса.

- 4 011287

Еще один аспект настоящего изобретения представляет собой способ сенсибилизации клеток у субъекта, проходящего курс химиотерапии или радиотерапии по поводу показания, который включает введение индивидууму соединения структурной формулы (I) или (II) в сочетании с химиотерапевтическим средством, радиотерапевтическим средством или обоими. Не ограничивающее показание, которое лечат с помощью такого способа, представляет собой рак.

Другой аспект настоящего изобретения представляет собой способ ингибирования или предупреждения аберрантной пролиферации клеток. В одном варианте способ включает обеспечение контакта популяции, которая содержит аберрантно пролиферирующие клетки, по крайней мере с одним активатором С11к1 в количестве и на протяжении периода времени, достаточного для того, чтобы в существенной мере синхронизировать остановку клеточного цикла у аберрантно пролиферирующих клеток. После достижения существенной меры синхронизации остановки клеточного цикла в популяции клеток обеспечивают контакт популяции клеток по крайней мере с одним ингибитором С11к1 в количестве и на протяжении периода времени, достаточного для того, чтобы в существенной мере отменить остановку клеточного цикла.

Другой аспект настоящего изобретения представляет собой промышленный продукт для фармацевтического применения у человека, который включает:

(a) фармацевтическую композицию, которая содержит соединение структурной формулы (I) или (II);

(b) вкладыш в упаковку, на котором указано, что композиция пригодна для лечения показаний, включающих аберрантную пролиферацию клеток; и (c) емкость.

Другой аспект настоящего изобретения представляет собой:

(a) фармацевтическую композицию, которая содержит соединение структурной формулы (I) или (II);

(b) вкладыш в упаковку, на котором указано, что композиция пригодна в качестве хемосенсибилизатора или радиосенсибилизатора для лечения показания, связанного с повреждениями ДНК или нарушением репликации ДНК;

(c) емкость.

Этот и другие аспекты настоящего изобретения будут понятны из следующего подробного описания.

Подробное описание

Соединения по настоящему изобретению имеет структурную формулу (I)

(I) к² где К¹ представляет собой галоген, С1_-3алкил, СЫ или СЕ₃;

К² представляет собой водород, С1-3алкил, СЫ, ОС1-3алкил, галоген или Ы(К^Ь)2, где К^Ь независимо представляет собой водород или С_1-3алкил;

К³ представляет собой 6- или 7-членное насыщенное гетероциклическое кольцо, содержащее в кольце одну группу N-4''. а также содержащее в кольце вторую группу Ы-К^а, атом кислорода или атом серы, где К^а независимо представляет собой водород, С_1-3алкил, СН₂СЫ или СН₂СН₂СЫ и где К³ необязательно замещен оксо(=О);

К⁴ представляет собой водород, С1-3алкил, ОС1-3алкил, 8С1-3алкил, Ы(К^Ь)2, ЫК^ЬС(=О)С1-3алкил или 5или 6-членное насыщенное гетероциклическое кольцо, содержащее одну группу Ы-К^а, причем кольцо необязательно замещено 1-3 группами С1-3алкил;

или К² и К⁴, взятые вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют 5-7членное насыщенное карбоциклическое кольцо;

и К⁵ представляет собой водород или галоген, при условии, что по крайней мере один из К² и К⁴ не является водородом, и если К⁵ представляет собой галоген, то К² или К⁴ представляет собой водород, или их фармацевтически приемлемые соли, пролекарства или сольваты.

В одном предпочтительном варианте соединения имеют структурную формулу (II)

(И) к² где К¹ представляет собой галоген, С_1-3алкил, СЫ или СЕ₃;

К² представляет собой водород, С1-3алкил, СЫ, ОС1-3алкил, галоген или Ы(К^Ь)2, где К^Ь независимо представляет собой водород или С_1-3алкил;

- 5 011287

Я³ представляет собой 6- или 7-членное насыщенное гетероциклическое кольцо, содержащее в кольце одну группу Ν-Я³, а также содержащее в кольце вторую группу Ν-Я³, атом кислорода или атом серы, где Я^а независимо представляет собой водород, С1_-3алкил или СН₂СК и где Я³ необязательно замещен оксо(=О);

Я⁴ представляет собой водород, С_1-3алкил, ОС_1-3алкил или галоген;

или Я² и Я⁴, взятые вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют 5-7членное насыщенное карбоциклическое кольцо;

при условии, что по крайней мере один из Я² и Я⁴ не является водородом, или их фармацевтически приемлемые соли, пролекарства или сольваты.

В одном предпочтительном варианте соединений формул (I) и (II) Я¹ представляет собой хлор, метил, СN или СР₃. В другом предпочтительном варианте Я² представляет собой водород, метил, этил, хлор, бром, диметиламино, циано или метокси. В более предпочтительных вариантах Я² не является во дородом.

В других предпочтительных вариантах формул (I) и (II) Я⁴ представляет собой метил, хлор, фтор, метокси изопропокси, диметиламино, -8СН₃, -МНС(=О)СН(СН₃)₂, -КНС(=О)СН₃, пирролидинил или 3,3диметилпирролидинил. В более предпочтительных вариантах Я⁴ представляет собой метил, хлор или метокси. Еще в одном предпочтительном варианте Я² и Я⁴, взятые вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют 5-членное или 6-членное насыщенное карбоциклическое кольцо.

В другом предпочтительном варианте формул (I) и (II), если Я⁵ представляет собой галоген, то Я⁴ представляет собой водород. В предпочтительном варианте Я⁵ представляет собой фтор. В более предпочтительных вариантах Я⁵ представляет собой водород.

В одном варианте формул (I) и (II), если Я¹ представляет собой циано, то Я² представляет собой водород и Я⁴ предпочтительно представляет собой хлор или метил. В другом варианте Я⁵ представляет собой фтор, Я⁴ представляет собой водород и Я² представляет собой метил, хлор или бром.

Примеры предпочтительных Я³ групп в формулах (I) и (II) включают, не ограничиваясь ими,

Х-(СН₂>2СМ

В данном описании термин С_1-3алкил включает алкильные группы с неразветвленной и разветвленной цепью, содержащие от одного до трех атомов углерода, т.е. метил, этил, н-пропил и изопропил.

Галоген в данном описании означает фтор, хлор, бром и йод.

Циано означает -СК

Трифторметил означает -СР₃.

Сокращение Ме означает метил, т.е. -СН₃.

- 6 011287

Повреждающие ДНК агенты, которые активируют сверочные точки клеточного цикла, в целом в данном описании обозначаются как «активаторы сверочных точек». Повреждающие ДНК агенты, которые активируют сверочную точку, обозначенные С111<1 (произносится как «чек-ван»), обозначают «активаторы С111<1». Подобным образом, ингибиторы таких сверочных точек в данном описании обозначаются ингибиторы сверочной точки и ингибиторы С11к1. соответственно.

В данном описании ингибиторы С11к1 представляют собой соединения, способные по крайней мере частично инактиваровать по крайней мере одну сверочную точку клеточного цикла белка С11к1. Инактивация сверочной точки клеточного цикла достигается, когда клеточный механизм сверочной точки в достаточной степени преодолен, чтобы позволить клетке прогрессировать от фазы клеточного цикла, в которой она остановилась, до следующей фазы клеточного цикла или перейти непосредственно к гибели клетки. Инактивация сверочной точки клеточного цикла позволяет клеткам нести поврежденный или несовершенный генетический материал на последующие фазы клеточного цикла, таким образом вызывая или способствуя гибели клетки. Гибель клетки может происходить по любому механизму, включая апоптоз и митотическую катастрофу. Соединения по изобретению представляют собой ингибиторы С11к1.

Активатор С11к 1 включает любой известный или открытый впоследствии агент, обладающий способностью активировать киназу Сйк1, и, таким образом, вызывать по крайней мере частичную остановку клеточного цикла. Активаторы С11к 1 включают агенты, способные останавливать клеточный цикл в какой-либо фазе клеточного цикла, и соответствующая фаза в данном описании может носить название фазы-мишени для такого активатора. Фазы-мишени включают любую из фаз клеточного цикла, кроме митоза, т.е. любую из фаз С1, 8 и 02. Пригодные активаторы С11к1 в соответствии с настоящим изобретением включают повреждающие ДНК агенты, например химиотерапевтические средства и/или облучение. Радиационные активаторы С11к1 включают, не ограничиваясь ими, ионизирующее излучение. Ионизирующее излучение означает электромагнитное облучение или облучение частицами, способное образовывать пары ионов при взаимодействии с веществом. Ионизирующее излучение включает рентгеновские и гамма-лучи, альфа- и бета-частицы, нейтроны и заряженные ядра. Облучение включает ультрафиолетовый свет, видимый свет, инфракрасное облучение, микроволновое облучение и комбинации этих видов. Для определения того, является ли конкретный агент активатором Сйк1, могут использоваться анализы, например, такие как описаны в примере 8.

Ингибирование аберрантной пролиферации клетки означает замедление скорости пролиферации аберрантно пролиферирующих клеток или полное прекращение такой пролиферации. Такое ингибирование может быть результатом снижения скорости репликации, повышения скорости гибели клеток или обоих этих факторов. Гибель клетки может происходить по любому механизму, включая апоптоз и митотическую катастрофу.

Предупреждение аберрантной пролиферации клеток означает ингибирование аберрантной пролиферация клеток до ее возникновения или ингибирование ее рецидива.

Ιη νίνο означает в пределах живого субъекта, например в пределах животного или человека. В данном контексте агенты могут использоваться терапевтически ίη νίνο, чтобы затормозить или прекратить пролиферацию аберрантно делящихся клеток. Агенты также могут использоваться ίη νίνο в качестве профилактического средства для предупреждения аберрантной пролиферации клеток или появления связанных с ней симптомов.

Ех νίνο означает за пределами живого субъекта. Примеры популяций клеток ех νίνο включают культуры клеток и биологические образцы, такие как образцы жидкости или ткани, полученные от человека или животных. Такие образцы могут быть получены способами, хорошо известными в уровне техники. Примеры образцов биологических жидкостей включают кровь, спинномозговую жидкость, мочу и слюну. Примеры образцов ткани включают опухоли и биопсию. В данном контексте предлагаемые соединения могут найти разнообразное применение как терапевтическое, так и экспериментальное.

Радиосенсибилизатор в данном описании означает соединение, которое вводят человеку или другому животному в терапевтически эффективном количестве, чтобы увеличить чувствительность клеток к электромагнитному облучению и/или способствовать лечению заболеваний, которые поддаются лечению электромагнитным облучением.

Излучение в данном описании включает, не ограничиваясь им, излучение с длиной волны в интервале 10^-20-100 м.

Термин емкость означает любое вместилище с крышкой, подходящее для хранения, доставки, отпуска и/или обращения с фармацевтическим продуктом.

Термин вкладыш в упаковку означает информацию, сопровождающую продукт, в которой приведено описание способа введения продукта, а также данные по безопасности и эффективности, необходимые для принятия информированного решения врачом, провизором и пациентом относительно применения продукта. Вкладыш в упаковку в общем рассматривается как этикетка фармацевтического продукта.

Настоящее изобретение включает все возможные стереоизомеры и геометрические изомеры соединений структурной формулы (Ι) или (ΙΙ). Настоящее изобретение включает не только рацемические соединения, но и отдельные оптически активные изомеры. Если желательно получение соединения струк

- 7 011287 турной формулы (I) или (II) в виде отдельного энантиомера, он может быть получен разделением конечного продукта или стереоспецифическим синтезом из изомерно чистого исходного материала или путем использования хирального вспомогательного реагента, например, см. Ζ. Ма е! а1., Тейайебтоп: Лкуштейу, 8(6), 883-888 (1997). Разделение конечного продукта, промежуточных соединений или исходного материала может быть достигнуто любым подходящим способом, известным из уровня техники. Дополнительно, в ситуациях, где возможно существование таутомеров соединений структурной формулы (I) или (II), настоящее изобретение предназначено включать все таутомерные формы соединений. Как продемонстрировано ниже, конкретные стереоизомеры могут демонстрировать исключительную способность ингибировать С11к1 в сочетании с лечением химиотерапевтическими или радиотерапевтическими средствами.

Пролекарства соединений структурной формулы (I) или (II) также могут использоваться в качестве соединения в способе по настоящему изобретению. Хорошо доказано, что подход с получением пролекарств, в котором получают соединение в форме, подходящей для введения в препарат и/или введения субъекту, из которого лекарственное средство в дальнейшем высвобождается ίη νίνο, успешно использовался для временного (например, обратимого в биологической системе) изменения физико-химических свойств соединения (см. Н. Випбдаагб, Еб., ЭеДдп οί Ргобгидк, ЕЕе^зег. ЛтЧегбат. (1985); К.В. 81кегтап, Тйе Огдашс Сйетщ1ту οί Эгид Эебдп апб Эгид Лсбоп, Лсабетк Ргекк, Еап Э1едо, сйар!ег 8, (1992); К.М. НШдтеп е! а1., Меб. Кек. Κν., 15, 83 (1995)).

Соединения по настоящему изобретению содержат одну или несколько функциональных групп. Функциональные группы, если это желательно или необходимо, могут быть изменены для получения пролекарства. Подходящие пролекарства включают, например, производные кислот, такие как амиды и эфиры. Специалисты в данной области также понимают, что в качестве пролекарства могут использоваться Ν-оксиды.

Соединения по изобретению могут существовать в виде солей. Фармацевтически приемлемые соли соединений по изобретению в целом являются предпочтительными в способах по изобретению. В данном описании термин фармацевтически приемлемые соли означает соли или цвиттерионные формы соединений структурной формулы (I) или (II). Соли соединений формулы (I) или (II) могут быть получены в ходе окончательного выделения и очистки соединений или отдельно путем реакции соединения с кислотой, имеющей подходящий катион. Пригодные фармацевтически приемлемые катионы включают катионы щелочных металлов (например, натрий или калий) и щелочно-земельных металлов (например, кальций или магний). Кроме того, фармацевтически приемлемые соли соединений структурной формулы (I) или (II), которые содержат основный центр, представляют собой кислотно-аддитивные соли, образованные с фармацевтически приемлемыми кислотами.

Примеры кислот, которые могут использоваться для получения фармацевтически приемлемых солей, включают неорганические кислоты, такие как хлористо-водородная, бромисто-водородная, серная и фосфорная, а также органические кислоты, такие как щавелевая, малеиновая, янтарная, малоновая и лимонная. Не ограничивающие примеры солей соединений по изобретению включают, не ограничиваясь ими, соли гидрохлорид, гидробромид, гидроиодид, сульфат, бисульфат, 2-гидроксиэтансульфонат, фосфат, гидрофосфат, ацетат, адипат, альгинат, аспартат, бензоат, бутират, камфорат, камфорсульфонат, цитрат, биглюконат, глицерофосфат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, формиат, сукцинат, малонат, фумарат, малеат, метансульфонат, мезитиленсульфонат, нафтиленсульфонат, никотинат, 2нафталинсульфонат, оксалат, памоат, пектинат, персульфат, 3-фенилпропионат, пикрат, пивалат, пропионат, трихлорацетат, трифторацетат, глутамат, бикарбонат, ундеканоат, лактат, цитрат, тартрат, глюконат, бензолсульфонат и п-толуолсульфонат. Кроме того, доступные аминогруппы в соединениях по изобретению могут быть кватернизованы с помощью метил-, этил-, пропил- и бутилхлоридов, -бромидов и -иодидов; диметил-, диэтил-, дибутил- и диамилсульфатов; децил-, лаурил-, миристил- и стерилхлоридов, -бромидов и -иодидов; а также бензил- и фенилэтилбромидов. В свете вышеизложенного любая ссылка на соединения по настоящему изобретению, приведенная в данном описании, предназначена включать соединения структурной формулы (I) или (II), а также их фармацевтически приемлемые соли, сольваты или пролекарства.

Неограничивающими примерами соединений по настоящему изобретению являются:

- 8 011287

- 9 011287

- 10 011287

- 11 011287

- 12 011287

- 13 011287

- 14 011287

- 15 011287

- 16 011287

- 17 011287

- 18 011287

- 19 011287

1-[5-метил-2-(4-метилморфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина (ЖХМС

- 20 011287 (электрораспыление, положительный) соотношение массы и заряда - 372,4)

1-[5-хлор-2-(4-метилморфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина (ЖХМС (электрораспыление, положительный) соотношение массы и заряда - 392,4)

1-(5-цианопиразин-2-ил)-3-[2-(1,4-диметилпиперазин-2-илметокси)-5-метилфенил]мочевина (ЖХМС (электрораспыление, положительный) соотношение массы и заряда - 396,4)

1-[5-хлор-2-К-(1-метилпиперазин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина (электрораспыление, положительный) соотношение массы и заряда - 391,3) (ЖХМС

1-[5-бром-2-К-(4-метилморфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина (электрораспыление, положительный) соотношение массы и заряда - 438,0) (ЖХМС

1-(5-цианопиразин-2-ил)-3-[5-метил-2-К-(4-метилморфолин-2-илметокси)фенил]мочевина (электрораспыление, положительный) соотношение массы и заряда - 383,0) (ЖХМС

- 21 011287

1-[5-хлор-2-(4-метил-[1,4]оксазепан-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина (ЖХМС (электрораспыление, положительный) соотношение массы и заряда - 406,0)

1-[5-хлор-2-8-(5-оксоморфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина (ЖХМС (электрораспыление, положительный) соотношение массы и заряда - 392,2)

Ы-[2-хлор-4-[3-(5-метилпиразин-2-ил)уреидо]-5-(§-морфолин-2-илметокси)фенил]ацетамид (ЖХМС (электрораспыление, положительный) соотношение массы и заряда - 435,0)

1-[5-хлор-3-фтор-2-(8-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина (ЖХМС (электрораспыление, положительный) соотношение массы и заряда - 396,3)

1-[5-метокси-2-(8-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина (ЖХМС (электрораспыление, положительный) соотношение массы и заряда - 374,3)

- 22 011287

1-[5-метокси-2-(8-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилииразин-2-ил)мочевина (ЖХМС (электрораспыление, положительный) соотношение массы и заряда - 358,3)

1-[4-хлор-2-(8-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина (ЖХМС (электро-

1-[5-хлор-4-фтор-2-(8-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина (ЖХМС (электрораспыление, положительный) соотношение массы и заряда - 396,1)

1-[5-циано-4-метил-2-(8-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина (ЖХМС (электрораспыление, положительный) соотношение массы и заряда - 383,3)

1-[5-хлор-4-диметиламино-2-(8-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина (ЖХМС (электрораспыление, положительный) соотношение массы и заряда - 421,2)

- 23 011287

Ы-[2-хлор-4-[3-(5-метилпиразин-2-ил)уреидо]-5-(8-морфолин-2-илметокси)фенил]изобутирамид (ЖХМС (электрораспыление, положительный) соотношение массы и заряда - 463,2)

1-(5-метилпиразин-2-ил)-3-[6-(8-морфолин-2-илметокси)индан-5-ил]мочевина (ЖХМС (электрораспыление, положительный) соотношение массы и заряда - 384,3)

1-[5-хлор-2-(4-цианометилтиоморфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина (ЖХМС (электрораспыление, положительный) соотношение массы и заряда - 433,0)

1-{5-хлор-2-[4-(2-цианоэтил)-8-морфолин-2-илметокси]фенил}-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина (ЖХМС (электрораспыление, положительный) соотношение массы и заряда - 431,0)

1-[5-хлор-2-(8-морфолин-2-илметокси)-4-пирролидин-1 -илфенил]-3 -(5-метилпиразин-2ил)мочевина (ЖХМС (электрораспыление, положительный) соотношение массы и заряда - 447,2)

- 24 011287

- 25 011287

- 26 011287

или их соли, сольваты (например, гидраты) или пролекарства.

Соединения по настоящему изобретению могут вводиться с терапевтической целью в виде неразведенных химических соединений, но предпочтительным является введение соединений в составе фармацевтической композиции или препарата. Поэтому настоящее изобретение предлагает фармацевтическую композицию, которая содержит соединение формулы (I) или (II) вместе с фармацевтически приемлемым наполнителем или носителем. Также предлагается способ приготовления фармацевтической композиции, который включает смешивание соединения формулы (I) или (II) с фармацевтически приемлемым наполнителем или носителем.

Соответственно, настоящее изобретение дополнительно предлагает фармацевтические препараты, содержащие соединение структурной формулы (I) или (II) или его фармацевтически приемлемую соль, пролекарство или сольват, вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями и, необязательно, другими терапевтическими и/или профилактическими ингредиентами. Носители приемлемы в смысле совместимости с другими ингредиентами препарата и нетоксичности для реципиента.

Соединения по изобретению демонстрируют неожиданно высокую активность. Активность обычно выражается как концентрация соединения, необходимая для достижения некоторого результата. Чем выше активность, тем менее количество соединения необходимо для осуществления им предусмотренной функции. Активность ίη νίΐτο обычно выражается в терминах значений Κ.'₅₀ и измеряется с использованием анализа «доза-реакция». Значения Κ.'₅₀ могут быть измерены путем обеспечения контакта чувствительной системы анализа с целевым соединением в интервале концентраций, в том числе концентраций, при которых наблюдается минимальный эффект или он вообще отсутствует, через более высокие концентрации, при которых наблюдается частичный эффект, к насыщающим концентрациям, при которых наблюдается максимальный эффект. Теоретически, такие анализы эффекта «доза-реакция» для соединений-ингибиторов могут быть описаны как сигмовидная кривая, выражающая степень ингибирования как функцию концентрации при нанесении на график с логарифмической шкалой. Теоретически кривая также проходит через точку, в которой концентрация является достаточной для снижения активности фермента сверочной точки до уровня, который составляет 50% различия между минимальной и максимальной активностью фермента, которая наблюдается в анализе. Эта концентрация определена как ингибиторная концентрация, которая позволяет достичь 50% ингибирования, или значение ТС₅₀.

Значения Κ.'₅₀ могут быть определены с использованием обычных биохимических (неклеточных) методов анализа или клеточных методов анализа, хорошо известных среднему специалисту в данной области. Пример такого анализа приведен в примере 1 ниже.

Предпочтительно, значения Κ.'₅₀ получают, выполняя соответствующий анализ по крайней мере дважды и выражая значение ТС₅₀, как среднюю величину (арифметическое среднее или среднее значение) полученных отдельных значений. Более предпочтительно, анализ повторяют от 3 до 10 (или более) раз и выражают значение КУ, как среднее полученных значений. Наиболее предпочтительно, количество повторений анализа должно быть достаточным для того, чтобы генерировать надежное со статистической точки зрения среднее значение КУ, с применением статистических методов, известных среднему специалисту в данной области.

Соединения по изобретению демонстрируют неожиданно низкие значения ТС₅₀, что соответствует неожиданно высокой активности ίη νίΐτο. Соединения по изобретению в анализах, описанных в примере 1 ниже, демонстрируют значения КУ, менее приблизительно 200 нМ, в некоторых вариантах менее приблизительно 150 нМ, в других вариантах менее приблизительно 100 нМ, в других - менее приблизительно 50 нМ, в других - менее приблизительно 10 нМ и в других - менее приблизительно 5 нМ. В других вариантах соединения по изобретению демонстрируют значения КУ, от приблизительно 0,1 до приблизительно 5 нМ.

Соединения по изобретению демонстрируют селективность ингибирования СПк I по сравнению с другими протеинкиназами. Селективность может быть преимуществом с точки зрения уменьшения неблагоприятных побочных эффектов и/или увеличения терапевтического индекса.

Селективность в данном описании выражается в кратных значениях. В целом, селективность, выраженная в кратных значениях, как используется в данном описании, представляет собой КУ, исследуемого соединения для сравниваемого фермента, деленное на ГС₅₀ фермента сравнения. В частности,

- 27 011287 селективность, выраженная в кратных значениях, для ингибитора С11к1. как используется в данном описании, это 1С₅₀ ингибитора Сбк1 (исследуемое соединение) для Сбк1 (сравниваемый фермент), деленное на 1С₅₀ для фермента сравнения. Ферменты сравнения, против которых могут исследоваться соединения по изобретению, включают по крайней мере следующие протеинкиназы: Сбс2, Сбк2, СТАК, ЕрбА1, ЕрбА2, Егк1, Е6ЕК1, Е6ЕК4, ΙΚ, ΊΝΚ1, с-Κίΐ, р38а1рба, р38Ье!а, р38бейа, Коз, Кзе, Кзк2, ТгкА, ТгкВ, протеинкиназа А, протеинкиназа С, рр60у-зтс, протеинкиназа В/Ак!-1, р38МарК, ρ7086Κ, кальмодулинзависимая киназа кальция ΙΙ, а также тирозинкиназа аЬ1.

Анализы для определения значений 1С₅₀ для исследуемого соединения против фермента сравнения описаны в примере 2 и хорошо известны средним специалистам в данной области. Соединения по изобретению демонстрируют по крайней мере 20-кратную селективность по сравнению с вышеупомянутыми протеинкиназами. В некоторых вариантах ингибиторы Сбк1 по настоящему изобретению демонстрируют по крайней мере 50-кратную селективность, в других вариантах - 75-кратную селективность, в других вариантах - по крайней мере 100-кратную селективность ингибирования С11к1 по сравнению с ингибированием вышеупомянутых исследованных протеинкиназ.

Соединения по изобретению демонстрируют неожиданно высокую активность в клеточных анализах. Для измерения клеточной активности ингибитора Сбк1 был разработан анализ, который позволяет измерять концентрацию ингибитора Сбк1, необходимую для усиления ингибирующего рост действия повреждающего ДНК агента в клеточной модели, включающей аберрантно пролиферирующие клетки. Такая мера клеточной активности выражается в данном описании как значение ЕС_ТВ8, где ЕС_ТВ8 представляет собой эффективную концентрацию ингибитора Сбк1, которая приводит к 2-кратной сенсибилизации популяции аберрантно пролиферирующих клеток к ингибирующему рост действию повреждающего ДНК агента. ЕС_ТВ8 вычисляется как концентрация ингибитора Сбк1, которая снижает количество повреждающего ДНК агента, необходимое для ингибирования роста 90% клеток наполовину. Заявители обнаружили, что соединения по изобретению демонстрируют неожиданно низкие значения ЕС_ТВ8, что соответствует неожиданно высокой клеточной активности.

Другой параметр, который может быть измерен, - повышение чувствительности в разы, достигнутое в дозе ЬО₅₀ (доза соединения, которая сама по себе ингибирует рост 50% клеток) для соединенияингибитора С11к1. Эти два значения, ЕС_ТВ8 и повышение чувствительности в разы при дозе ЬО₅₀ позволяют осуществить прямое ранжирование ингибиторов Сбк1 друг относительно друга как по активности, так и по токсичности.

Пример анализа, пригодного для измерения значений ЕС_ТВ8, описан в примере 3 ниже. Если коротко, в данном анализе в качестве популяции аберрантно пролиферирующих клеток используются клетки карциномы ободочной кишки человека НТ29, гемцитабин - как повреждающий ДНК агент/активатор С11к1 и соединение по изобретению - как ингибитор Сбк1. Популяцию аберрантно пролиферирующих клеток культивируют и позволяют расти в подходящей среде для культивирования. Впоследствии клетки подвергают действию повреждающего ДНК агента в различных концентрациях. По прохождении предварительно определенного периода времени повреждающий ДНК агент удаляют, и клетки подвергают действию ингибитора Сбк1 в различных концентрациях и на протяжении предварительно определенного периода времени. Далее собирают планшеты с культурой клеток и подсчитывают относительное количество выживших клеток. Данные нормализуют против применения только ингибитора Сбк1 в качестве контроля, а затем наносят на логарифмический график концентрацию повреждающего ДНК агента против относительного выживания клетки (100% равно 1,0). Кратное увеличение чувствительности определяют на основе разницы между количеством повреждающего ДНК агента, необходимым для достижения 90% ингибирования роста с ингибитором Сбк1 и без него для каждой используемой концентрации ингибитора С11к1. Затем эти данные наносят на график концентрации ингибитора Сбк1 против повышения чувствительности в кратных значениях, на основе которого вычисляют ЕС_ТВ8.

Предпочтительно, значения ЕС_ТВ8 получают путем проведения анализа по крайней мере дважды, с выражением значения ЕС_ТР8 как среднего полученных отдельных значений. Более предпочтительно, анализ повторяют от 3 до 10 (или более) раз и выражают значение ЕС_ТР8 как среднее полученных значений. Наиболее предпочтительно, количество повторений анализа должно быть достаточным для того, чтобы генерировать надежное со статистической точки зрения среднее значение ЕС_ТВ8 с применением статистических методов, известных среднему специалисту в данной области.

Все соединения, которые анализировали в анализе ЕС_ТР8, продемонстрировали значения ЕС_ТР8 менее приблизительно 1000 нМ. И наоборот, структурно подобные соединения, которые были известны ранее, продемонстрировали значения ЕС_ТВ8 около 11000 нМ. В некоторых вариантах соединения по настоящему изобретению продемонстрировали значения ЕС_ТВ8 менее приблизительно 500 нМ, в других менее приблизительно 300 нМ, в других - менее приблизительно 200 нМ, в других - менее приблизительно 150 нМ, в других - менее приблизительно 100 нМ, в других - менее приблизительно 50 нМ, в других - менее приблизительно 30 нМ и в других - менее приблизительно 20 нМ или менее приблизительно 10 нМ или в других вариантах - менее приблизительно 5 нМ.

Соединения и фармацевтические композиции, пригодные для использования по настоящему изобретению, включают такие, где активный ингредиент вводится в эффективном количестве для достиже- 28 011287 ния предусмотренной цели. Более конкретно, терапевтически эффективное количество подразумевает количество, достаточное для лечения индивидуума, страдающего от показания, или для облегчения присутствующих симптомов показания. Определение терапевтически эффективного количества находится в пределах компетенции специалиста в данной области, особенно в свете подробного раскрытия, приведенного в данном описании.

Кроме ингибитора С11к1 рецептуры фармацевтических композиций по изобретению могут включать биологически активные агенты, такие как цитокины, лимфокины, факторы роста, другие гематопоэтические факторы или их смеси с целью уменьшения нежелательных побочных эффектов, которые могут быть результатом или могут сопровождать введение фармацевтической композиции самой по себе. Альтернативно, такие биологически активные агенты могут быть включены в фармацевтические композиции по изобретению, чтобы способствовать достижению желательного терапевтического эффекта. Вспомогательные биологически активные агенты, пригодные для фармацевтических композиций по изобретению, включают, не ограничиваясь ими, М-С8Р, ОМ-С8Р, ΤΝΡ, Ш-1, Ш-2, Ш-3, Ш-4, Ш-5, Ш-6, Ш-7, Ш-8, Ш-9, ТЬ-10, Ш-11, Ш-12, ТЬ-13, Ш-14, ТЬ-15, Ш-16, Ш-17, ТЬ-18, ΦΝ, ΤΝΡ, О-С8Р, Ме§-С8Р, ОМ-С8Р, тромбопоэтин, фактор стволовых клеток, эритропоэтин, ангиопоэтины, в том числе Апд-1, Апд-2, Апд-4, Апд-Υ и/или человеческий ангиопоэтин-подобный полипептид, фактор роста эндотелия сосудов (УБОР), ангиогенин, костный морфогенный протеин-1 (ВМР-1), ВМР-2, ВМР-3, ВМР-4, ВМР-5, ВМР-6, ВМР-7, ВМР8, ВМР-9, ВМР-10, ВМР-11, ВМР-12, ВМР-13, ВМР-14, ВМР-15, ВМР рецептор !А, ВМР рецептор ГВ, полученный из мозга нейротрофный фактор, нейротрофный фактор ресничек, рецептор нейротрофного фактора ресничек, цитокининдуцирований хемотаксический фактор 1 нейтрофилов, цитокининдуцированый хемотаксический фактор 2 нейтрофилов, фактор роста эндотелиальных клеток, эндотелии 1, эпидермальный фактор роста, выделенный из эпителия аттрактант нейтрофилов, фактор роста фибробластов (РОР) 4, РОР 5, РОР 6, РОР 7, РОР 8, РОР 8Ь, РОР 8с, РОР 9, РОР 10, РОР кислый, РОР основный, рецептор 1 нейротрофного фактора, полученный из линии глиальных клеток, рецептор 2 нейротрофного фактора, полученный из линии глиальных клеток, связанный с ростом белок, гепаринсвязывающий эпидермальный фактор роста, фактор роста гепатоцитов, рецептор фактора роста гепатоцитов, инсулиноподобный фактор роста I, рецептор инсулиноподобного фактора роста, инсулиноподобный фактор роста II, белок, связывающийся с инсулиноподобным фактором роста, фактор роста кератиноцитов, ингибиторный фактор лейкемии, рецептор ингибиторного фактора лейкемии, фактор роста нервов, рецептор фактора роста нервов, нейротрофин-3, нейротрофин-4, фактор роста плаценты, фактор роста плаценты 2, полученный из тромбоцитов фактор роста эндотелиальных клеток, полученный из тромбоцитов фактор роста, цепь А фактора роста, полученного из тромбоцитов, полученный из тромбоцитов фактор роста АА, полученный из тромбоцитов фактор роста АВ, цепь В фактора роста, полученного из тромбоцитов, полученный из тромбоцитов фактор роста ВВ, рецептор полученного из тромбоцитов фактора роста, фактор, стимулирующий рост пре-В клеток, фактор стволовых клеток, рецептор фактора стволовых клеток, трансформирующий фактор роста (ТОР), ТОР, ТОР 1, ТОР 1,2, ТОР 2, ТОР 3, ТОР 5, латентный ТОР 1, ТОР связывающийся протеин I, ТОР связывающийся протеин II, ТОР связывающийся протеин III, рецептор опухолевого некротического фактора типа I, рецептор опухолевого некротического фактора типа II, рецептор активатора плазминогена урокиназного типа, фактор роста эндотелия сосудов, а также их химерные белки и биологически или иммунологически активные фрагменты.

Соединения структурных формул (I) и (II) также могут быть конъюгированы или связаны со вспомогательными фрагментами, которые придают полезное свойство (или ослабляют нежелательное свойство) соединениям в способе терапевтического применения. Такие конъюгаты могут улучшать доставку соединений в конкретную анатомическую область или целевой участок (например, опухоль), поддерживать длительное время терапевтические концентрации соединений в клетках-мишенях, изменять фармакокинетические и фармакодинамические свойства соединений и/или улучшать терапевтический индекс или профиль безопасности соединений. Пригодные вспомогательные фрагменты включают, например, аминокислоты, олигопептиды или полипептиды, например антитела, такие как моноклональные антитела и другие сконструированные антитела; а также природные или синтетические лиганды рецепторов в клетках- или тканях-мишенях. Другие подходящие вспомогательные фрагменты включают остатки жирных кислот или липидов, которые способствуют распределению в биологической системе и/или захвату соединения клетками-мишенями (см., например, Вгаб1еу е1 а1., С1ш. Сапсег Яе§. 7:3229, 2001).

Препараты по настоящему изобретению могут вводиться стандартным способом для лечения указанных болезней, например, перорально, парентерально, через слизистую оболочку (например, сублингвально или буккально), местно, трансдермально, ректально, путем ингаляции (например, назальной или глубоко в легкие). Парентеральное введение включает, не ограничиваясь ими, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшное, подкожное, внутримышечное, интратекальное и внутрисуставное. Парентеральное введение также может осуществляться с использованием техники высокого давления, например, РОАОЕЯГЕСТ™ (Ро\\'бег|ес1 РйагшасеиБсак, Р1с, Оксфорд, Англия).

Для перорального и буккального введения композиция может иметь форму таблеток или пастилок, полученных в обычной форме. Например, таблетки и капсулы могут содержать обычные вспомогательные вещества, например связующие агенты (такие как сироп, акациевая камедь, желатин, сорбит, трага- 29 011287 кантовая камедь, крахмальная слизь или поливинилпирролидон), наполнители (например, лактоза, сахар, микрокристаллическая целлюлоза, кукурузный крахмал, фосфат кальция или сорбит), смазывающие вещества (например, стеарат магния, стеариновая кислота, тальк, полиэтиленгликоль или диоксид кремния), дезинтегранты (например, картофельный крахмал или натрийкрахмалгликолят) или увлажняющие агенты (например, лаурилсульфат натрия). Таблетки могут быть покрыты оболочкой в соответствии со способами, хорошо известными из уровня техники.

Альтернативно, соединения по настоящему изобретению могут быть введены в жидкие препараты для перорального применения, например водные или масляные суспензии, растворы, эмульсии, сиропы или эликсиры. Кроме того, препараты, содержащие эти соединения, могут быть представлены как сухой продукт для разбавления водой или другим подходящим носителем перед использованием. Такие жидкие препараты могут содержать обычные добавки, например суспендирующие агенты, такие как сироп сорбита, метилцеллюлоза, сироп глюкозы/сахара, желатин, гидроксиэтилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, гель стеарата алюминия и гидрогенизированные пищевые жиры; эмульгирующие агенты, такие как лецитин, сорбитан моноолеат или акациевая камедь; неводные носители (которые могут включать пищевые масла), такие как миндальное масло, фракционированное кокосовое масло, эфиры масел, пропиленгликоль и этиловый спирт; а также консерванты, такие как метилили пропил-п-гидроксибензоат и сорбиновая кислота.

Препараты также могут иметь форму суппозиториев, например, содержать обычные суппозиторные основы, такие как масло какао или другие глицериды. Композиции для ингаляций обычно могут быть представлены в форме раствора, суспензии или эмульсии, которая может вводиться в виде сухого порошка или в форме аэрозоля, где используется обычный пропеллент, такой как дихлордифторметан или трихлорфторметан.

Препараты для местного и трансдермального введения содержат обычные водные или неводные носители, например глазные капли, кремы, мази, примочки и пасты, или иметь форму медицинского пластыря, наклейки или мембраны.

Кроме того, композиции по настоящему изобретению могут быть предназначены для инъекционного или инфузионного введения.

Препараты для инъекций могут иметь форму суспензий, растворов или эмульсий в масляном или водном растворителе и могут содержать вспомогательные вещества, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие средства. Альтернативно, активный ингредиент может иметь форму порошка для разбавления подходящим растворителем (например, стерильной апирогенной водой) перед использованием.

Композиция по настоящему изобретению также может иметь форму препарата-депо. Такие препараты пролонгированного действия могут вводиться имплантацией (например, подкожно или внутримышечно) или внутримышечной инъекцией. Соответственно, соединения по изобретению могут быть введены в препараты с подходящими полимерными материалами (например, водорастворимые полимеры), пригодными гидрофобными материалами (например, эмульсия в соответствующем масле), ионообменными смолами или слаборастворимыми производными (например, слаборастворимая соль).

Для ветеринарного применения соединение формулы (I) или (II) или его фармацевтически приемлемая соль, пролекарство или сольват вводится в виде соответствующего пригодного препарата в соответствии с обычной ветеринарной практикой. Ветеринар может легко определить схему введения и способ введения, который является наиболее подходящим для конкретного животного. Животные, которые подлежат лечению данными соединениями и способами, включают, не ограничиваясь ими, домашних животных, сельскохозяйственных животных, декоративных животных и виды, содержащиеся в зоопарках.

Методы синтеза

Соединения по данному изобретению могут быть получены в соответствии со следующими схемами синтеза. Во-первых, алкоксиариламины, которые используются для получения описанных в данном описании ингибиторов С11к1. могут быть получены по различным общим схемам синтеза. Например, на общей схеме 1 кратко представлены реакции нитрофенола с активированной формой спирта, образующейся ίη 811и или полученной и выделенной независимо, с получением нитрофенилового эфира в качестве продукта. Восстановление эфира в стандартных условиях дает ариламин, который используют для получения соединения по изобретению.

Общая схема 1

к В К

Альтернативно, реакция галогензамещенного нитробензола со спиртом в присутствии сильного основания, такого как гидрид натрия или бис(триметилсилил)амид калия, также дает нитроарильные эфиры, как проиллюстрировано на общей схеме 2. Затем указанные эфиры восстанавливают, как показано на общей схеме 1.

- 30 011287

Общая схема 2

Превращение ариламина в мочевину может быть осуществлено по одной из нескольких схем синтеза. Например, ариламин может вступать в реакцию с пиразинкарбаматом с получением мочевины, как проиллюстрировано на общей схеме 3.

Общая схема 3

Альтернативно, как показано на общей схеме 4, вызванное нагреванием разложение ацилазида дает реакционноспособный арилизоцианат, который далее вводят в реакцию с ариламином, получая целевую мочевину.

Общая схема 4

О

В другом подходе, проиллюстрированном на общей схеме 5, используется фосген или эквивалент фосгена для сочетания двух ариламинов и получения мочевины.

Общая схема 5

Сокращения, использованные в синтетической части данного описания, имеют следующие значения: ч (часы), мин (минуты), фунты на дюйм квадратный (фунт/дюйм²), насыщенный (насыщ.), вода (Н₂О), деминерализованная (ДМ), изопропиловый спирт (изо-РгОН), платина на угле (Ρΐ/С), азот (Ν₂), водород (Н₂), палладий на угле (Рб/С), оксид платины (РРО). сульфат магния (Мд8О₄), хлористоводородная кислота (НС1), диизопропилазодикарбоксилат (ДИАД), метиленхлорид (СН₂С1₂), хлороформ (СНС1₃), метанол (МеОН), гидроксид аммония (ΝΗ^Η), тетрагидрофуран (ТГФ), Ν-метилпирролидон (НМП), уксусная кислота (АсОН), гидроксид натрия (№ОН), этилацетат (ЕЮАс), этанол (ЕЮН), диметилсульфоксид (ДМСО), дейтерированный диметилсульфоксид (б₆-ДМСО), карбонат натрия (№₂СО₃), дейтерированный хлороформ (СОС1₃), бикарбонат натрия ^аНСО₃), гидрид натрия (№|Н), триэтаноламин (ТЕА), карбонат цезия (С8₈СО₃), диоксид углерода (СО₂), гидроксид палладия (Рб(ОН)₂), серная кислота (Н₂8О₄), азотная кислота (ΗNО₃), хлорид натрия (№С1), сульфат натрия (№ь8О₄) и диметилформамид (ДМФА).

Получение соединений

Следующие соединения по данному изобретению получают с использованием общих схем, раскрытых выше. Дополнительное количество соединения по изобретению может быть получено с использованием приведенных выше общих схем и следующих конкретных методик синтеза путем тщательного выбора исходных материалов.

Соединение 1

1-[5-Хлор-2-8-([1,4]оксазепан-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина

Стадия 1. 2-Амино-5-метилпиразин. В колбу помещают аминомалононитрила п-толуолсульфонатную соль (20,0 г, 79 ммоль) и пировиноградного альдегида 1-оксим (6,88 г, 79 ммоль). Добавляют изо-РгОН (140 мл) и полученную суспензию желтого цвета перемешивают при комнатной температуре в течение 18 ч, во время чего образуется осадок желтого цвета. Смесь фильтруют и осадок промывают изоРгОН (2x50 мл) и деминерализованной водой (20 мл), затем лиофилизируют с получением Ν-оксида 2

- 31 011287 амино-3-циано-5-метипиразина (10,7 г).

Ν-оксид пиразина суспендируют в МеОН (22 мл) и АсОН (5 мл). К полученной смеси осторожно добавляют 5% Ρί/С (1,6 г) и Эагсо КВ-В (8 г). Смеси дают абсорбировать Н₂ под давлением 60 фунт/дюйм² на протяжении 18 ч. Реакцию гасят 25% раствором ΝαΟΗ (34 мл) и продувают Ν₂ в течение 30 мин. Смесь фильтруют сквозь слой влажного целита и промывают метанолом (4x100 мл). Фильтрат упаривают в вакууме до 1/4 объема. Фильтрат разбавляют ЕЮАс (150 мл), промывают 5% раствором ΝαΟΗ (30 мл) и снова экстрагируют ЕЮАс (2x70 мл). Органические фракции объединяют и промывают насыщенным №1С1 (20 мл), фильтруют и упаривают в вакууме с получением оранжевого клейкого твердого вещества (5,16 г).

Стадия 2. (5-Метилпиразин-2-ил)карбаминовой кислоты фениловый эфир. 2-Амино-5метилпиразин (5,16 г, 47 ммоль) растворяют в СН₂С1₂ (52 мл), перемешивают и охлаждают до 0°С в атмосфере Ν₂. К полученной смеси добавляют пиридин (4,8 мл, 59 ммоль) с последующим добавлением фенилхлорформиата (6,2 мл, 59 ммоль) по каплям на протяжении 15 мин, что вызывает образование осадка. Смесь перемешивают при 0°С, выдерживая при этой температуре в течение 1 ч. Затем реакцию гасят 0,25М НС1 (40 мл) и безводным эфиром (50 мл) и перемешивают при температуре 0°С в течение 30 мин. Осадок отделяют фильтрованием, промывают деминерализованной водой (20 мл), эфиром (2x25 мл) и сушат в вакууме с получением продукта (7,4 г) в виде белого пушистого порошка.

Стадия 3. (8)-2-Гидроксиметил-[1,4]оксазепан-4-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир. В круглодонную колбу объемом 250 мл добавляют (8)-(+)-бензилглицидиловый эфир (1,31 г, 7,9 ммоль), 3бензиламинопропан-1-ол (1,3 г, 7,9 ммоль) и 10 мл ЕЮН. Смесь нагревают до 40°С, выдерживая при этой температуре в течение 15 ч. Реакционную смесь охлаждают и упаривают в вакууме и полученный маслянистый продукт используют без дополнительной очистки. Диол помещают в круглодонную колбу объемом 250 мл и растворяют в 75 мл сухого пиридина. Раствор охлаждают до 0°С и добавляют толуолсульфонилхлорид (5,27 г, 27,7 ммоль) в виде одной порции. Смесь перемешивают в течение 6 ч, тщательно выдерживая температуру реакции на отметке 0°С. Охлажденную реакционную смесь заливают 50 мл насыщенного водного раствора NаНСΟз. Добавляют еще 20 мл воды и смесь трижды экстрагируют порциями по 100 мл ЕЮАс. Объединенные органические фракции сушат над Νη₂8Ο₄ и упаривают в вакууме. Затем спирт очищают колоночной хроматографией с использованием градиента 25-50% ЕЮАс в гексане в качестве элюента. Получают 1,39 г тозилового спирта в виде желтого масла.

Спирт растворяют в 50 мл ДМФА и охлаждают до 0°С. К охлажденной смеси при перемешивании осторожно добавляют 95 мас.% ΝαΗ (0,29 г, 11,5 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при 0°С, выдерживая при этой температуре в течение 15 мин, затем дают медленно нагреться до комнатной температуры и перемешивают в течение 6 ч. Реакционную смесь осторожно гасят 50 мл воды и трижды экстрагируют порциями по 50 мл ЕЮАс. Объединенные органические фракции сушат над Νη₂8Ο₄ и упаривают в вакууме. Сырой продукт переносят в ЕЮН и помещают в аппарат Парра для гидрогенизации. Также добавляют к раствору 10 мас.% Рб/С (0,426 г, 0,30 ммоль) и 2М НС1 (2,1 мл). Гидрогенизацию проводят при давлении 50 фунт/дюйм² в течение 2 дней, и в этой точке анализ ЖХМС показывает завершение реакции. Раствор нейтрализуют насыщенным водным раствором NаНСΟз и экстрагируют с использованием смеси СНС1з:изо-РЮН (3:1). Объединенные органические фракции упаривают в вакууме, и сырой продукт переносят на следующую стадию.

Сырой аминоспирт растворяют в 100 мл сухого СН₂С1₂. К полученному раствору добавляют триэтаноламин (ТЕА, 1,59 мл, 11,5 ммоль) и ди-трет-бутилдикарбонат (5,74 г, 5,74 ммоль). Раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 18 ч, затем гасят насыщенным водным раствором NаНСΟ₃ и трижды экстрагируют СН2С12 порциями по 50 мл. Объединенные органические фракции сушат над Νη₂8Ο₄ и упаривают в вакууме. Продукт очищают колоночной хроматографией с использованием градиента ЕЮАс/гексан (25-50%). Получают 0,240 г оксазапанового спирта в виде желтого масла.

Стадия 4. (8)-2-(4-Хлор-2-нитрофеноксиметил)-[1,4]оксазепан-4-карбоновой кислоты третбутиловый эфир. В круглодонную колбу объемом 50 мл добавляют оксазапановый спирт (0,240 г, 1,03 ммоль), триэтаноламин (ТЕА, 0,21 мл, 1,545 ммоль) и 10 мл сухого СН2С12. Раствор охлаждают до 0°С и по каплям добавляют метансульфонилхлорид (0,10 мл). Смесь перемешивают в течение 1,5 ч при 0°С, после чего в охлажденном состоянии гасят водой. Фракции отделяют и водную фракцию один раз экстрагируют 20 мл СН₂С1₂. Объединенные органические фракции сушат над Νη₂8Ο₄ и упаривают в вакууме. Далее сырой мезилат растворяют в 5 мл сухого ДМФА. К полученному раствору добавляют ί.’8₂ί.Ό₃ (0,671 г, 2,06 ммоль) и 4-хлор-2-нитрофенол (0,215 г, 1,24 ммоль). Полученный раствор ярко-желтого цвета далее нагревают до 100°С, выдерживая при этой температуре в течение ночи. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, гасят 50 мл воды и трижды экстрагируют порциями по 50 мл ЕЮАс. Продукт очищают флэш-хроматографией с использованием градиента ЕЮАс/гексан (10-35%). Такая последовательность стадий дает 0,120 г нитрофенилоксазапана в виде ярко-желтого масла.

Стадия 5. 1-[5-Хлор-2-([1,4]оксазепан-2-(8)-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина. В круглодонную колбу объемом 25 мл помещают нитрофенилоксазапан (0,120 г, 0,31 ммоль) и Ρί2Ο (0,007 г, 0,03 ммоль) в 5 мл МеОН. Присоединяют баллон с гелием, воздух из колбы откачивают с помо- 32 011287 щью аспиратора и трижды наполняют колбу Н2, после чего перемешивают в атмосфере Н2 на протяжении 2 ч. Реакционную смесь фильтруют сквозь целит, дважды промывая слой целита порциями по 20 мл МеОН. Раствор упаривают в вакууме. Сырой анилин растворяют в 5 мл сухого ДМФА. К полученному раствору добавляют триэтаноламин (ТЕА, 0,005 мл, 0,34 ммоль) и (5-метилпиразин-2-ил)карбаминовой кислоты фениловый эфир (0,07 г, 0,31 ммоль). Полученную смесь перемешивают в течение 18 ч при комнатной температуре. Растворитель удаляют в вакууме, и остаток снова растворяют в 10 мл ЕЮАс и промывают насыщенным водным раствором ЫаНСО₃. Органические фракции сушат над Ыа₂8О₄ и упаривают при пониженном давлении. Серый/коричневый остаток заливают 3 мл СН₂С1₂ и к полученной смеси добавляют 1 мл концентрированной трифторуксусной кислоты. При добавлении кислоты все твердые вещества растворяются. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 4 ч, после чего добавляют насыщенный водный раствор ЫаНСО₃ до тех пор, пока рН раствора достигнет 8. Смесь трижды экстрагируют порциями по 10 мл смеси СНС1₃:изо-РгОН (3:1). Объединенные органические фракции затем сушат над Ыа₂8О₄ и упаривают в вакууме. Далее твердое вещество не совсем белого цвета растирают с ЕЮАс и фильтруют сквозь стеклянный фильтр со средним размером пор, промывая 50 мл ЕЮАс. Твердое вещество белого цвета тщательно сушат в вакууме. Такая последовательность стадий дает 0,020 г целевой мочевины в виде тонкого белого порошка. ¹Н-ЯМР (300 МГц, б₆-ДМСО) δ 10,83 (ушир.с, 1Н), 8,39 (дд, 1Н), 8,18 (с, 1Н) 8,04 (ушир.с, 1Н), 6,99 (дд, 1Н), 6,82 (д, 1Н), 4,25-3,98 (м, 2Н), 3,90-3,76 (м, 1Н), 3,38 (д, 1Н), 3,13-3,06 (м, 2Н), 3,00 (дд, 1Н), 2,54 (с, 3Н), 2,06-1,89 (м, 3Н). ЖХМС (электрораспыление, положительный) соотношение массы и заряда 392,3 (М+1).

Соединение 2

1-[5 -Хлор-2-(К-морфолин-3 -илметокси)фенил]-3-(5 -метилпиразин-2-ил)мочевина

Стадия 1. 3-Гидроксиметил-3-морфолин-4-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир. К охлажденному (баня, 0°С) раствору морфолин-3-К-4-дикарбоновой кислоты 4-трет-бутилового эфира (1,00 г, 4,32 ммоль) в сухом ТГФ (40 мл) в атмосфере азота по каплям добавляют боран (4,76 мл 1М раствора в ТГФ, 4,76 ммоль) на протяжении 15 мин. После перемешивания в течение 1 ч баню удаляют и перемешивание продолжают еще в течение 3 ч при комнатной температуре. Затем добавляют уксусную кислоту (14,3 мл 1М водного раствора, 14,3 ммоль). После перемешивания в течение 1 ч раствор нейтрализуют добавлением избытка насыщенного водного раствора бикарбоната натрия. Добавляют дихлорметан (20 мл) и раствор перемешивают в течение 15 мин, затем слои разделяют. Водную фракцию экстрагируют СН₂С1₂ (3x20 мл), объединенные органические фракции сушат (Мд8О₄) и фильтруют. Профильтрованный раствор упаривают до получения твердого вещества белого цвета (0,46 г).

Стадия 2. 3-(4-Хлор-2-нитрофеноксиметил)-11-морфолин-4-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир. При перемешивании к охлажденному (баня с температурой -78°С) раствору 3-гидроксиметил-3морфолин-4-карбоновой кислоты трет-бутилового эфира (0,13 г, 0,60 ммоль) и 5-хлор-2фторнитробензола (0,11 г, 0,66 ммоль) в сухом ТГФ (40 мл) в атмосфере азота по каплям добавляют бис(триметилсилил)амид калия (2,4 мл 0,5М раствора в ТГФ, 1,2 ммоль) на протяжении 15 мин. После перемешивания еще в течение 15 мин добавляют насыщенный водный раствор хлорида аммония (10 мл) и баню удаляют, давая раствору нагреться до комнатной температуры. После перемешивания в течение 1 ч добавляют воду (15 мл) и СН2С12 (10 мл), перемешивают в течение 5 мин и слои разделяют. Водную фракцию экстрагируют СН₂С1₂ (2x10 мл), объединенные органические фракции сушат (Мд8О₄) и фильтруют. Профильтрованный раствор упаривают до получения желтого масла (0,26 г), которое очищают колоночной хроматографией, элюируя смесью гексан/ЕЮАс (1:1) с получением светло-желтого масла (0,195 г).

Стадия 3. 3-(2-Амино-4-хлорфеноксиметил)-К-морфолин-4-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир. При перемешивании к раствору 3-(4-хлор-2-нитрофеноксиметил)-К-морфолин-4-карбоновой кислоты трет-бутилового эфира (0,17 г, 0,4 6 ммоль) в МеОН (4 мл) добавляют Р1₂О (0,020 г, 0,088 ммоль). Из колбы откачивают воздух, затем трижды заполняют ее Н₂. После перемешивания в течение 4 ч раствор фильтруют сквозь слой целита, и фильтрат упаривают с получением продукта в виде желтого масла.

Стадия 4. 3-{4-Хлор-2-[3-(5-метилпиразин-2-ил)уреидо] феноксиметил}-К-морфолин-4-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир. Готовят раствор желтого масла и (5-метилпиразин-2-ил)карбаминовой кислоты фенилового эфира (0,13 г, 0,57 ммоль) в сухом ДМФА (2 мл) и добавляют триэтаноламин (ТЕА, 0,074 мл, 0,53 ммоль). После перемешивания в течение 24 ч реакционную смесь упаривают при пониженном давлении, затем повторно растворяют в воде (10 мл) и ЕЮАс (10 мл). После перемешивания в

- 33 011287 течение 15 мин фракции разделяют, водную фракцию экстрагируют ЕЮАс (2x10 мл) и объединенные органические фракции промывают рассолом (10 мл), затем сушат (Иа₂8О₄) и фильтруют. Профильтрованный раствор упаривают, затем очищают колоночной хроматографией, элюируя смесью ЕЮАс/СН₂С1₂ (1:1) с получением желтого масла (0,8 г).

Стадия 5. 1-[5-Хлор-2-(К-морфолин-3-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина. При перемешивании к раствору 3-{4-хлор-2-[3-(5-метилпиразин-2-ил)уреидо]феноксиметил}-К.-морфолин-4карбоновой кислоты трет-бутилового эфира (0,8 г) в СН₂С1₂ (6 мл) добавляют трифторуксусную кислоту (3 мл). После перемешивания в течение 5 ч раствор обрабатывают водным раствором карбоната калия (1М) до основной реакции, после чего перемешивают в течение 30 мин. Фракции разделяют и водную фракцию экстрагируют СН₂С1₂ (3x10 мл). Объединенные органические фракции сушат (Мд8О₄) и фильтруют. Профильтрованный раствор упаривают, затем очищают колоночной хроматографией, элюируя смесью метанол/СН₂С1₂ (1:9), с получением твердого вещества бледно-желтого цвета (0,0523 г). ¹Н-ЯМР (300 МГц, б₆-ДМСО) δ 10,22 (с, 1Н), 9,96 (ушир.с, 1Н), 8,74 (с, 1Н), 8,28 (д, 1Н), 8,18 (с, 1Н), 7,04 (дд, 2Н), 3,94 (м, 3Н), 3,71 (ушир.д, 1Н), 3,43 (м, 1Н), 3,23 (м, 2Н), 3,34 (ушир.м, 2Н), 2,66 (ушир.м, 1Н), 2,43 (с, 3Н). ЖХМС (электрораспыление, положительный) соотношение массы и заряда 378,3 (М+1).

Соединение 3

1-[2-(1,4-Диметилпиперазин-2-илметокси)-5-метилфенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина

Стадия 1. 1,4-Диметил-2-(4-метил-2-нитрофеноксиметил)пиперазин. 4-Метил-2-нитрофенол (0,95 г, 6,20 ммоль), (1,4-диметилпиперазин-2-ил)-МеОН (0,98 г, 6,82 ммоль) и трифенилфосфин (1,79 г, 6,82 ммоль) помещают в ТГФ, перемешивают в течение 5 мин, затем обрабатывают ДИАД (1,38 г, 6,82 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи. Упаривание в вакууме дает оранжевое масло, которое растворяют в ЕЮАс и экстрагируют 2М водным раствором НС1. Водные смывы объединяют, промывают ЕЮАс и обрабатывают твердое вещество ИаОН до основной реакции. Полученную водную смесь экстрагируют ЕЮАс и объединенные органические экстракты сушат над Иа₂8О₄, фильтруют и упаривают в вакууме с получением коричневого масла.

Флэш-хроматография (1% МеОН в СН₂С1₂) дает 1,0 г целевого арильного эфира.

Стадия 2. 2-(1,4-Диметилпиперазин-2-илметокси)-5-метилфениламин. 1,4-Диметил-2-(4-метил-2нитрофеноксиметил)пиперазин (1,02 г, 3,65 ммоль) растворяют в МеОН (75 мл) и обрабатывают насыщенным водным раствором хлорида аммония до появления мутности. Добавляют цинк (0,24 г, 3,65 ммоль). Полученную теплую реакционную смесь перемешивают в течение еще 30 мин, после чего ЖХМС показывает, что исходный материал прореагировал. Реакционную смесь разбавляют ЕЮАс и водным раствором №ьСО₃ и фракции разделяют. Органическую фракцию промывают насыщенным раствором №1С1 и сушат над твердым безводным Ыа₂8О₄. Смесь фильтруют и упаривают в вакууме с получением целевого анилина.

Стадия 3. 1 -[2-( 1,4-Диметилпиперазин-2-илметокси)-5-метилфенил]-3 -(5-метилпиразин-2-ил)мочевина. 5-Метилпиразин-2-карбоновую кислоту (691 мг, 5 ммоль) перемешивают в толуоле (15 мл) и обрабатывают триэтаноламином (ТЕА, 765 мл, 5,5 ммоль) с последующим добавлением дифенилфосфорилазида (1,0 мл, 5,0 ммоль). Полученный раствор перемешивают в течение 30 мин, затем используют непосредственно на следующей стадии.

Раствор 5-метилпиразин-2-карбонилазида (1,0 ммоль) в толуоле нагревают до 90°С, выдерживая при этой температуре в течение 10 мин. Колбу с реакционной смесью снимают с нагревательной бани и раствор коричневого цвета обрабатывают 2-(1,4-диметилпиперазин-2-илметокси)-5-метилфениламином (0,25 г, 1,0 ммоль). Колбу снова помещают на нагревательную баню и нагревают до 40°С, выдерживая при этой температуре в течение 4 ч. Смеси дают остыть, затем фильтруют с получением продукта в виде порошка рыжеватого цвета.

Ή-ЯМР (400 МГц, С1)С1_;) δ 10,90 (с, 1Н), 8,4 (с, 1Н), 8,2 (м, 3Н), 6,8 (м, 2Н), 4,2 (дд, 1Н), 3,9 (т, 1Н), 3,1 (д, 1Н), 2,8 (ушир.д, 1Н), 2,6 (м, 2Н), 2,5 (с, 3Н), 2,4 (м, 1Н), 2,4 (с, 3Н), 2,3 (с, 3Н), 2,25 (м, 1Н), 2,2 (с, 3Н), 2,1 (м, 1Н). ЖХМС (ионизация электрораспылением, положительный) соотношение массы и заряда 385,30 (М+1).

- 34 011287

Соединение 4

1-[4,5-Дихлор-2-(8-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина

Стадия 1. (8)-2-Гидроксиметилморфолин-4-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир. В колбу объемом 500 мл помещают (8)-бензилглицидиловый эфир (15 г, 91,4 ммоль), МеОН (10 мл) и 50 мас.% ЫаОН (30 мл, 365 ммоль). К полученной смеси порциями добавляют 2-аминоэтилсульфат (25,8 г, 183 ммоль). Полученную гетерогенную смесь нагревают до 40°С, и в этой точке раствор становится гомогенным. Температуру поддерживают на отметке 40°С в течение 4 ч. Реакционную смесь слегка охлаждают и добавляют еще порцию твердого ЫаОН (14,6 г, 365 ммоль) вместе с 50 мл толуола. Затем двухфазный раствор нагревают до 65°С, выдерживая при этой температуре в течение 12 ч. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, фракции разделяют и водную фракцию один раз экстрагируют 75 мл толуола. Объединенные органические фракции трижды промывают порциями по 75 мл 1М НС1. рН объединенных водных фракций доводят до 12 с помощью водного раствора ЫаОН и экстрагируют четырежды порциями по 70 мл ЕЮАс. Объединенные органические фракции сушат над Ыа₂8О₄ и упаривают в вакууме с получением 10,084 г целевого морфолина в виде непрозрачного масла.

Сырой морфолин растворяют в СН₂С1₂ (100 мл) и триэтаноламине (ТЕА, 12,1 мл, 87,5 ммоль) и добавляют ди-трет-бутилдикарбонат (15,9 г, 73 ммоль), что сопровождается выделением газообразного СО₂. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 18 ч, затем гасят 35 мл насыщенного водного раствора ЫаНСО₃. Добавляют еще 50 мл воды и слои разделяют. Органическую фракцию сушат над безводным Ыа₂8О₄, упаривают в вакууме и очищают флэш-хроматографией (20% ЕЮАс/гексан) с получением целевого Ν-Вос-О-бензилморфолина в виде бледно-желтого масла (5,536 г).

Очищенный морфолин с двумя защитными группами растворяют в 50 л абсолютного ЕЮН и добавляют Рб(ОН)₂ (1,26 г, 20 мас .%, 1,8 ммоль). Присоединяют баллон с водородом, воздух из колбы откачивают с помощью аспиратора и трижды заполняют Н₂. Реакционную смесь перемешивают в атмосфере Н₂ в течение 30 ч. Смесь фильтруют сквозь целит, тщательно промывая слой броунмиллерита ЕЮН. Профильтрованный раствор упаривают в вакууме с получением целевого Ν-Ьос-морфолинового спирта в виде твердого вещества тускло-белого цвета (3,918 г).

Стадия 2. 4,5-Дихлор-2-нитрофенол. В круглодонную колбу объемом 250 мл помещают 3,4дихлорфенол (3,053 г, 18,7 ммоль) в 50 мл СН₂С1₂ и охлаждают до 0°С на ледяной бане. При перемешивании к раствору добавляют концентрированную Н₂8О₄ (1,56 мл, 28,1 ммоль). Раствор становится мутным. К полученной смеси по каплям добавляют концентрированную НЫО₃ (1,2 мл, 18,7 ммоль) и тщательно поддерживают температуру ниже 5°С. Реакционную смесь перемешивают в течение 30 мин при 0°С, затем охлаждают на ледяной бане и гасят 150 мл Н₂О. Фракции разделяют и водную фракцию один раз экстрагируют 35 мл СН₂С1₂. Объединенные органические фракции сушат над безводным Ыа₂8О₄, упаривают в вакууме и очищают с использованием флэш-хроматографии (10% ЕЮАс/гексан в качестве элюента) с получением целевого нитрофенола в виде твердого вещества ярко-желтого цвета (1,793 г).

Стадия 3. 1-[4,5-Дихлор-2-(8-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина. Получают в соответствии с методикой, описанной для соединения 1, стадии 4 и 5, с использованием 4,5дихлор-2-нитрофенола и (8)-2-бензилоксиметилморфолин-4-карбоновой кислоты трет-бутилового эфира. ^!Н-ЯМР (300 МГц, б₆-ДМСО) δ 10,42 (с, 1Н), 10,29 (с, 1Н), 8,93 (с, 1Н), 8,42 (с, 1Н), 8,21 (с, 1Н), 7,32 (с, 1Н), 4,18-3,41 (м, 5Н), 3,03-2,66 (м, 4Н), 2,38 (с, 3Н) ЖХМС (электрораспыление, положительный) соотношение массы и заряда 412,2 (М+1).

Соединение 5

1-(5-Цианопиразин-2-ил)-3-[5-метил-2-(4-метилморфолин-2-илметокси)фенил]мочевина

Стадия 1. 5-Бромпиразин-2-иламин. Раствор пиразин-2-иламина (6,66 г, 70 ммоль) в СН₂С1₂ (200 мл) охлаждают до 0°С, обрабатывают Ν-бромсукцинамидом (12,5 г, 70 ммоль) и дают нагреться до комнатной температуры. Полученную реакционную смесь перемешивают в течение ночи, затем разбав- 35 011287 ляют дополнительным количеством СН₂С1₂ (200 мл) и промывают 10% водным раствором Ыа₂СО₃.

Фракции разделяют и органическую фракцию промывают насыщенным водным раствором ЫаС1, после чего сушат над безводным Мд§О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Остаток переносят в ЕЮАс (50 мл) и продукт осаждают добавлением гексана (300 мл). Осадок сушат в вакууме с получением 5,57 г твердого вещества рыжеватого цвета.

Стадия 2. 5-Аминопиразин-2-карбонитрил. 5-Бромпиразин-2-ил:амин объединяют с иодидом меди (I) (1,3 г, 6,9 ммоль), цианидом калия (0,44 г, 6,8 ммоль), тетракис(трифенилфосфин)палладия(0) (0,95 г, 0,83 ммоль) и 18-краун-6 (0,058 г, 0,22 ммоль) в ДМФА (15 мл). Полученную смесь перемешивают в течение 40 мин, затем кипятят с обратным холодильником (155°С) в течение 2 ч. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, затем дают постоять в течение ночи. Осадок отделяют фильтрованием, и фильтрат упаривают до сухого состояния в вакууме. Остаток оранжевого цвета переносят в ЕЮАс и гексан и осадок, который образуется, отделяют фильтрованием. При стоянии происходит дальнейшее образование осадка из маточного раствора, который отделяют фильтрованием. Твердые вещества объединяют с получением 0,10 г твердого вещества ярко-оранжевого цвета.

Стадия 3. 2-{2-[3-(5-Цианопиразин-2-ил)уреидо]-4-метилфеноксиметил}морфолин-4-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир. 2-(2-Амино-4-метилфеноксиметил)морфолин-4-карбоновой кислоты третбутиловый эфир (0,087 г, 0,270 ммоль) получают из 2-амино-4-метилфенола в соответствии со способами, описанными для соединения 3, стадии 1 и 2, с использованием 2-гидроксиметилморфолин-4карбоновой кислоты трет-бутилового эфира (полученного в соответствии с методикой, описанной для соединения 2, стадия 1, с использованием соответствующей кислоты) и 4-метил-2-нитрофенола. Его объединяют с трифосгеном (0,029 г, 0,10 ммоль), толуолом (2 мл), основанием Ханига (0,15 мл, 0,8 6 ммоль) и перемешивают при комнатной температуре в течение 25 мин. Затем суспензию переносят с помощью канюли в холодный раствор (-78°С), содержащий 5-аминопиразин-2-карбонитрил (0,032 г, 0,27 ммоль) и бис(триметилсилил)амид лития (0,27 ммоль) в ТГФ (1 мл), который перемешивают при -78°С в течение 30 мин. Реакционной смеси дают нагреться, после чего перемешивают в течение 16 ч при комнатной температуре. Образовавшийся осадок отделяют фильтрованием с получением целевого продукта (0,043 г).

Стадия 4. 1-(5-Цианопиразин-2-ил)-3-[5-метил-2-(морфолин-2-илметокси)фенил]мочевина. Суспензию 2-{2-[3-(5-цианопиразин-2-ил)уреидо]-4-метилфеноксиметил}морфолин-4-карбоновой кислоты третбутилового эфира (0,043 г, 0,0918 ммоль) в ТГФ (2 мл) обрабатывают НС1 в диоксане (4М, 0,11 мл) и перемешивают в течение 20 ч. Добавляют дополнительное количество НС1 в диоксане (4М, 0,25 мл) и реакционную смесь нагревают до 50°С, выдерживая при этой температуре в течение 18 ч. Реакционную смесь охлаждают и упаривают. Полученное твердое вещество суспендируют в эфире, суспензию фильтруют и сушат на воздухе с получением целевого продукта в виде соли гидрохлорида (0,042 г).

Стадия 5. 1-(5-Цианопиразин-2-ил)-3-[5-метил-2-(4-метилморфолин-2-илметокси)фенил]мочевина. Раствор соли 1-(5-цианопиразин-2-ил)-3-[5-метил-2-(морфолин-2-илметокси)фенил]мочевины гидрохлорида (0,0104 г, 0,129 ммоль) в МеОН (1 мл) охлаждают до 0°С и обрабатывают водным раствором формальдегида (0,12 ммоль) с последующим добавлением триацетоксиборгидрида натрия (0,06 г, 0,292 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение 12 ч, затем упаривают в вакууме. Остаток хроматографируют на диоксиде кремния (2% МеОН в СН2С12) с получением продукта в виде твердого вещества белого цвета (0,014 г). 'Н-ЯМР (400 МГц, б₆-ДМСО) δ 10,90 (с, 1Н), 10 (ушир.с, 1Н), 8,9 (с, 1Н), 8,8 (с, 1Н), 8 (с, 1Н), 6,9 (м, 1Н), 6,8 (м, 1Н), 3,9 (м, 4Н), 3,6 (т, 1Н), 2,9 (д, 1Н), 2,7 (д, 1Н), 2,2 (с, 3Н), 2,1 (с, 3Н), 2 (т, 1Н), 1,8 (т, 1Н). ЖХМС (ионизация электрораспылением, положительный) соотношение массы и заряда 383,40 (М+1).

Соединение 6

ΝΗ

С1

1-[5-Хлор-2-([1,4]оксазепан-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина.

Стадия 1. 3-Бензил-2-хлорметил-[1,3]оксазепан. Раствор 3-бензиламинопропан-1-ола (14 г,

88,0 ммоль) и эпихлоргидрина (81,4 г, 880 ммоль) нагревают до 40°С. После перемешивания в течение 3 ч реакционную смесь охлаждают и избыток эпихлоргидрина удаляют выпариванием в вакууме. Медленно добавляют серную кислоту (10 мл), затем реакционную колбу помещают на предварительно нагретую масляную баню при температуре 150°С. Перемешивают в течение 1 ч, затем реакционной смеси дают остыть до комнатной температуры и гасят добавлением льда. рН смеси доводят до щелочной реакции с помощью 10% водного раствора №ьСО₃ и экстрагируют ЕЮАс (3x300 мл). Объединенные органические

- 36 011287 фракции сушат над безводным Мд§О₄, фильтруют и сушат при пониженном давлении. Полученный остаток очищают флэш-хроматографией (смесь гексан/СН₂С1₂/2М водного ΝΗ₄ΟΗ, 70:28:2) с получением 5 г светло-желтого масла.

Стадия 2. 2-(4-Хлор-2-нитрофеноксиметил)-[1,3]оксазепан-3-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир. При перемешивании к раствору 4-бром-2-нитрофенола (1,39 г, 8,0 ммоль) в ДМСО (30 мл) добавляют карбонат калия (2,76 г, 20,0 ммоль) с последующим добавлением 3-бензил-2-хлорметил[1,3]оксазепана. Реакционную смесь перемешивают при 60°С, выдерживая при этой температуре в течение 12 ч, после чего дают остыть до комнатной температуры и разбавляют ЕЮАс (200 мл) и 10% водным раствором №-ьСО₃, (200 мл). Фракции разделяют и органическую фракцию промывают рассолом, сушат над безводным Мд§О₄ и упаривают в вакууме. Сырой продукт очищают флэш-хроматографией (гексан/ЕЮАс, 70:30) с получением 480 мг масла светло-оранжевого цвета.

Масло переносят в СН2С12 (5 мл) и охлаждают на ледяной бане. Добавляют альфахлорэтилхлорформиат (0,18 мл, 1,65 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч, затем добавляют 2н водный раствор НС1. Перемешивание продолжают в течение 10 мин, затем смесь упаривают до сухого состояния. Полученный остаток переносят в МеОН и кипятят с обратным холодильником в течение 2 ч. Реакционную смесь упаривают при пониженном давлении, остаток переносят в 2н водный раствор НС1 (75 мл) и промывают ЕЮАс (2x50 мл). рН водной фракции доводят до 11 добавлением твердого вещества №ЮН. Полученный щелочной раствор экстрагируют ЕЮАс (2x50 мл), объединенные органические фракции промывают рассолом и сушат над Мд§О₄. Фильтрация и упаривание в вакууме дают 240 мг продукта в виде светло-желтого масла.

Масло растворяют в СН₂С1₂ (3 мл), затем обрабатывают триэтаноламином (ТЕА, 0,116 мл, 0,831 ммоль) и ди-трет-бутилдикарбонатом (0,181 г, 0,831 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч, после чего разбавляют дополнительным количеством СН2С12 (100 мл) и промывают 10% водным раствором №-ьС.'О₃, (100 мл). Органическую фракцию сушат над Мд§О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Очистку производят с использованием флэш-хроматографии (смесь гексан/ЕЮАс, 7:3) с получением 252 мг продукта в виде белой пены.

Стадия 3. 2-(2-Амино-4-хлорфеноксиметил)-[1,3]оксазепан-3-карбоновой кислоты трет-бутилового эфира. Получают из 2-(4-хлор-2-нитрофеноксиметил)-[1,3]оксазепан-3-карбоновой кислоты третбутилового эфира (0,252 г, 0,65 ммоль) в соответствии с методикой, описанной для соединения 3, стадия 2, с получением 150 мг продукта в виде прозрачного масла.

Стадия 4. 1-[5-Хлор-2-([1,4]оксазепан-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина. Получают из 2-(2-амино-4-бромфеноксиметил)-[1,3]оксазепан-3-карбоновой кислоты трет-бутилового эфира в соответствии с методикой, описанной для соединения 2, стадия 4, и соединения 5, стадия 4, с получением 0,175 г продукта. ^!Н-ЯМР (400 МГц, СЭС1₃), δ 8,65 (ушир.с, 1Н), 8,3 (с, 1Н), 8,25 (с, 1Н), 6,98 (дд, 1Н), 6,8 (д, 1Н), 4,08 (м, 3Н), 3,8 (м, 1Н), 3,35 (с, 1Н), 3,25 (д, 1Н), 3 (м, 3Н), 2,5 (с, 3Н), 1,98 (м, 2Н). ЖХМС (ионизация электрораспылением, положительный) соотношение массы и заряда 391,90 (М+1).

Соединение 7

ΝΗ

1-[5-Метил-2-(1-метилпиперазин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина

Стадия 1. 3-Гидроксиметил-4-метилпиперазин-1-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир. Пиперазин-2-карбоновую кислоту (20 г, 154 ммоль) в виде суспензии с 200 мл смеси Н₂О/диоксан (1:1) охлаждают на ледяной бане и обрабатывают твердым №ЮН (11 г) с последующим добавлением по каплям раствора ди-трет-бутилдикарбоната (21,6 г, 99 ммоль) в диоксане через воронку для добавления. При необходимости, рН реакционной смеси доводят до рН>10 в ходе реакции. Полученную смесь перемешивают в течение 3 ч, затем разбавляют водой до тех пор, пока она станет гомогенной, и подкисляют концентрированной водной НС1 до достижения значения рН в интервале 2-3. Раствор промывают эфиром, после чего рН корректируют с помощью №ЮН до достижения значения рН в интервале 6,5-7. Раствору дают постоять в течение нескольких дней, и образовавшийся осадок отделяют фильтрованием с получением пиперазин-1,3-дикарбоновой кислоты 1-трет-бутилового эфира в виде твердого вещества белого цвета (9,7 г).

Суспензию пиперазин-1,3-дикарбоновой кислоты 1-трет-бутилового эфира (4,62 г, 20,0 ммоль) в СН3ОН (100 мл) обрабатывают водным формальдегидом (40 ммоль) и муравьиной кислотой (70 ммоль), затем нагревают до 65°С, выдерживая при этой температуре в течение нескольких часов. Когда ВЭЖХ показывает завершение реакции, реакционной смеси дают остыть и упаривают в вакууме.

- 37 011287

Остаток переносят в ТГФ и охлаждают на ледяной бане, затем обрабатывают раствором литияалюминия-гидрида в ТГФ (19,0 ммоль). По прохождении 1 ч реакционной смеси дают нагреться до комнатной температуры и перемешивают еще в течение 30 мин. Далее реакционную смесь охлаждают на ледяной бане и заливают Н₂О (0,75 мл), 15% водным раствором ЫаОН (0,75 мл) и снова Н₂О (3x0,75 мл). Соли удаляют фильтрованием, и фильтрат упаривают в вакууме с получением сырого продукта. Хроматография на силикагеле (2,5% МеОН в СН₂С1₂) дает продукт в виде желтого масла (0,70 г).

Стадия 2. 1-[5-Метил-2-(1-метилпиперазин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина. Получают в соответствии с методикой, описанной для соединения 3, с использованием 3-гидроксиметил4-метилпиперазин-1-карбоновой кислоты трет-бутилового эфира, и методикой, описанной для соединения 5, стадия 4. Ή-ЯМР (400 МГц, б₆-ДМСО) δ 10,24 (ушир.с, 1Н), 10,1 (с, 1Н), 9,7 (ушир.с, 1Н), 9,42 (с, 1Н), 9,12 (с, 1Н), 8,2 (с, 1Н), 8,08 (с, 1Н), 6,91 (д, 1Н), 6,82 (д, 1Н), 4,6 (д, 1Н), 4,4 (м, 1Н), 4,1 (м, 1Н), 3,6 (м, 6Н), 3 (с, 3Н), 2,4 (с, 3Н), 2,2 (с, 3Н). ЖХМС (ионизация электрораспылением, положительный) соот-

1-(5-Цианопиразин-2-ил)-3-[5-метил-2-(морфолин-2-илметокси)фенил]мочевина Получают в соответствии с методиками, описанными для соединения 5, стадии 1-4, с использованием 4-метил-2нитрофенола. Ή-ЯМР (400 МГц, СЭ₃ОЭ), δ 8,80 (с, 1Н), 8,7 (с, 1Н), 7,9 (с, 1Н), 6,8 (м, 2Н), 4,2 (м, 4Н), 3,8 (м, 1Н), 3,6 (м, 1Н), 3,5 (м, 1Н), 3,2 (м, 2Н), 2,3 (с, 3Н). ЖХМС (ионизация электрораспылением, положительный) соотношение массы и заряда 369,30 (М+1).

Соединение 9

1-[5-Хлор-4-метил-2-(8-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина

Получают в соответствии с методикой, описанной для соединения 1, стадии 4 и 5, с использованием 2-гидроксиметил-8-морфолин-4-карбоновой кислоты трет-бутилового эфира, полученного в соответствии с методикой, описанной для соединения 4, стадия 1, и 4-хлор-5-метил-2-нитрофенола, полученного в соответствии с методикой, описанной для соединения 4, стадия 2. Ή-ЯМР (300 МГц, бб-ДМСО) δ 10,32 (с, 1Н), 10,21 (с, 1Н), 8,75 (с, 1Н), 8,29-8,10 (м, 2Н), 7,06 (д, 1Н), 7,18 (д, 1Н), 4,12-3,42 (м, 5Н), 3,29-2,63 (м, 4Н), 2,48 (с, 3Н), 2,25 (с, 3Н). ЖХМС (электрораспыление, положительный) соотношение массы и заряда 392,2 (М+1).

Соединение 10

1-[5-Хлор-4-метил-2-(Р-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина

Получают в соответствии с методикой, описанной для соединения 1, стадии 4 и 5, с использованием 2-гидроксиметил-Р-морфолин-4-карбоновой кислоты, полученной из (Р) - бензилглицидилового эфира кислоты трет-бутилового эфира в соответствии с методикой, описанной для соединения 4, стадия 1, и 4хлор-5-метил-2-нитрофенола, полученного в соответствии с методикой, описанной для соединения 4, стадия 2. Ή-ЯМР (300 МГц, б₆-ДМСО) δ 10,32 (с, 1Н), 10,21 (с, 1Н), 8,75 (с, 1Н), 8,29-8,10 (м, 2Н), 7,06 (д, 1Н), 7,18 (д, 1Н), 4,12-3,42 (м, 5Н), 3,29-2,63 (м, 4Н), 2,48 (с, 3Н), 2,25 (с, 3Н). ЖХМС (электрораспыление, положительный) соотношение массы и заряда 392,3 (М+1).

- 38 011287

Соединение 11

1-[4,5-Дихлор-2-(К-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина

Получают в соответствии с методикой, описанной для соединения 1, стадии 4 и 5, с использованием 2-гидроксиметил-8-морфолин-4-карбоновой кислоты трет-бутилового эфира и 4,5-дихлор-2нитрофенола, полученного в соответствии с методикой, описанной для соединения 4, стадия 2. ¹Н-ЯМР (300 МГц, б₆-ДМСО) δ 10,42 (с, 1Н), 10,29 (с, 1Н), 8,93 (с, 1Н), 8,42 (с, 1Н), 8,21 (с, 1Н), 7,32 (с, 1Н), 4,18-

3,41 (м, 5Н), 3,03-2,66 (м, 4Н), 2,38 (с, 3Н). ЖХМС (электрораспыление, положительный) соотношение массы и заряда 412,2 (М+1).

Соединение 12

1-[4,5-Диметил-2-(морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина

Получают в соответствии с методиками, описанными для соединения 1, стадии 4 и 5, с использованием 2-гидроксиметил-8-морфолин-4-карбоновой кислоты трет-бутилового эфира и 4,5-диметил-2нитрофенола, полученного в соответствии с методикой, описанной для соединения 4, стадия 2. ¹Н-ЯМР (300 МГц, б₆-ДМСО) δ 10,02 (с, 1Н), 9,89 (ушир.с, 1Н), 8,85 (ушир.с, 1Н), 8,27 (с, 1Н), 8,91 (с, 1Н), 6,84 (с, 1Н), 4,18-3,97 (м, 3Н), 3,69 (т, 1Н), 3,43-3,26 (м, 2Н), 2,97 (т, 2Н), 2,33 (с, 3Н), 2,18 (с, 2Н), 2,12 (с, 3Н). ЖХМС (электрораспыление, положительный) соотношение массы и заряда 372,3 (М+1).

Соединение 13

1-[4-Хлор-5-метил-2-(8-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина

Получают в соответствии с методиками, описанными для соединения 1, стадии 4 и 5, с использованием 2-гидроксиметил-8-морфолин-4-карбоновой кислоты трет-бутилового эфира и 5-хлор-4-метил-2нитрофенола, полученного в соответствии с методикой, описанной для соединения 4, стадия 2. ¹Н-ЯМР (300 МГц, б₆-ДМСО) δ 10,26 (с, 1Н), 8,82 (с, 1Н), 8,19 (с, 1Н), 8,17 (с, 1Н), 7,10 (с, 1Н), 4,21-3,96 (м, 2Н), 3,90-3,86 (м, 2Н), 3,54 (дт, 1Н), 2,98 (д, 1Н), 2,84 (т, 2Н), 2,36 (с, 3Н), 2,21 (с, 3Н). ЖХМС (электрораспыление, положительный) соотношение массы и заряда 392,1 (М+1).

Соединение 14

1-[5-Циано-2-(8-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина

Получают в соответствии с методикой, описанной для соединения 1, стадии 4 и 5, с использованием 2-гидроксиметил-8-морфолин-4-карбоновой кислоты трет-бутилового эфира и 4-гидрокси-3нитробензонитрила, полученного в соответствии с методикой, описанной для соединения 4, стадия 2. ¹НЯМР (300 МГц, б₆-ДМСО) δ 10,43 (ушир.с, 1Н), 10,30 (с, 1Н), 8,62 (ушир.с, 1Н), 8,53 (с, 1Н), 8,21 (с, 1Н), 7,48 (д, 1Н), 7,33 (д, 1Н), 4,20-4,11 (м, 2Н), 3,94-3,73 (м, 2Н), 3,51 (дт, 1Н), 3,00 (д, 1Н), 2,77-2,61 (м, 2Н).

- 39 011287

ЖХМС (электрораспыление, положительный) соотношение массы и заряда 369,2 (М+1). Соединение 15

1-[5-Хлор-4-этил-2-(8-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина

Получают в соответствии с методикой, описанной для соединения 1, стадии 4 и 5, с использованием 2-гидроксиметил-8-морфолин-4-карбоновой кислоты трет-бутилового эфира и 4-хлор-5-этил-2нитрофенола, полученного в соответствии с методикой, описанной для соединения 4, стадия 2. ¹Н-ЯМР (300 МГц, б₆-ДМСО) δ 10,33 (с, 1Н), 10,19 (с, 1Н), 8,66 (с, 1Н), 8,33-8,01 (м, 3Н), 7,05 (д, 1Н), 4,29-3,39 (м, 5Н), 3,29-2,91 (м, 2Н), 2,89-2,70 (м, 2Н), 2,58 (кв, 2Н), 2,49 (с, 3Н), 1,17 (т, 3Н). ЖХМС (электрораспыление, положительный) соотношение массы и заряда 406,1 (М+1).

Соединение16

1-[5-Хлор-4-метокси-2-(8-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина

Получают в соответствии с методиками, описанными для соединения 1, стадии 4 и 5, с использованием 2-гидроксиметил-8-морфолин-4-карбоновой кислоты трет-бутилового эфира и 4-хлор-5-метокси-2нитрофенола, полученного в соответствии с методикой, описанной для соединения 4, стадия 2. ¹Н-ЯМР (300 МГц, б₆-ДМСО) δ 10,11 (с, 1Н), 10,05 (ушир.с, 1Н), 8,64 (с, 1Н), 8,19 (с, 2Н), 6,91 (с, 1Н), 4,29 (с, 2Н), 4,16 (м, 1Н), 4,09 (д, 1Н), 3,87 (с, 3Н), 3,75 (т, 1Н), 3,44-3,17 (м, 2Н), 3,01 (т, 2Н), 2,39 (с, 3Н). ЖХМС (электрораспыление, положительный) соотношение массы и заряда 408,0 (М+1).

Соединение 17

1-[5-Диметиламино-2-(8-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина

Получают в соответствии с методикой, описанной для соединения 1, стадии 4 и 5, с использованием 2-гидроксиметил-8-морфолин-4-карбоновой кислоты трет-бутилового эфира и 4-диметиламино-2нитрофенола, полученного в соответствии с методикой, описанной для соединения 4, стадия 2. ¹Н-ЯМР (300 МГц, б₆-ДМСО) δ 10,11 (с, 1Н), 10,05 (ушир.с, 1Н), 8,69 (с, 1Н), 8,19 (с, 1Н), 7,75 (с, 1Н), 6,90 (д, 1Н), 6,34 (дд, 1Н), 4,05-3,81 (м, 4Н), 3,56 (т, 1Н), 3,14 (д, 1Н), 2,93 (д, 1Н), 2,80 (с, 6Н), 2,76-2,63 (м, 2Н),

2,41 (с, 3Н). ЖХМС (электрораспыление, положительный) соотношение массы и заряда 387,4 (М+1).

Соединение 18

1-[5-Бром-4-метил-2-3-(морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина

Получают в соответствии с методикой, описанной для соединения 4, с использованием 4-бром-5метил-2-нитрофенола, полученного в соответствии с методикой, описанной для соединения 4, стадия 2.

- 40 011287 ’Н-ЯМР (300 МГц, б₆-ДМСО) δ 10,31 (ушир.с, 1Н), 10,19 (с, 1Н), 8,63 (с, 1Н), 8,41 (с, 1Н), 8,20 (с, 1Н),

7,07 (с, 1Н), 4,13-3,94 (м, 3Н), 3,87-3,74 (м, 2Н), 3,52 (тд, 1Н), 3,00 (д, 1Н), 2,69 (т, 2Н), 2,42 (с, 1Н), 2,25 (с, 1Н). ЖХМС (электрораспыление, положительный) соотношение массы и заряда 438,20 (М+1).

Соединение 19

1-[5-Метил-2-(морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина

Получают в соответствии с методикой, описанной для соединения 3, с использованием 2гидроксиметилморфолин-4-карбоновой кислоты трет-бутилового эфира, полученного из соответствующей кислоты в соответствии с методикой, описанной для соединения 2, стадия 1. 'Н-ЯМР (400 МГц, СВзОО), δ 8,90 (с, 1Н), 8,6 (с, 1Н), 7,9 (с, 1Н), 6,9 (м, 2Н), 4,2 (м, 4Н), 3,8 (т, 1Н), 3,7 (с, 2Н), 3,5 (д, 1Н), 3,2 (м, 1Н), 2,6 (с, 3Н), 2,3 (с, 3Н). ЖХМС (ионизация электрораспылением, положительный) соотношение массы и заряда 358,20 (М+1).

Соединение 20

1-[5-Хлор-2-(морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина

Получают в соответствии с методикой, описанной для соединения 3, с использованием 4-хлор-2нитрофенола и 2-гидроксиметилморфолин-4-карбоновой кислоты трет-бутилового эфира, полученного из соответствующей кислоты в соответствии с методикой, описанной для соединения 2, стадия 1. 'НЯМР (400 МГц, СП₃ОП), δ 8,70 (с, 1Н), 8,5 (с, 1Н), 8,4 (с, 1Н), 7,05 (м, 1Н), 4,2 (м, 4Н), 3,8 (т, 1Н), 3,5 (д, 1Н), 3,2 (м, 2Н), 2,6 (с, 3Н). ЖХМС (ионизация электрораспылением, положительный) соотношение массы и заряда 378,50 (М+1).

Соединение 21

1-[5-Хлор-2-(8-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина

Получают в соответствии с методикой, описанной для соединения 4, с использованием 4-хлор-2нитрофенола. ¹Н-ЯМР (400 МГц, б₆-ДМСО) δ 10,35 (с, 1Н), 9,4 (ушир.с, 1Н), 8,55 (ушир.с, 1Н), 8,25 (м, 2Н), 7,22 (м, 2Н), 4,2 (м, 3Н), 4 (д, 1Н), 3,8 (т, 1Н), 3,4 (д, 1Н), 3,2 (д, 1Н), 2,8 (м, 1Н), 2,45 (с, 3Н). ЖХМС (ионизация электрораспылением, положительный) соотношение массы и заряда 378,30 (М+1). Соединение 22

1-[5-Метил-2-(5-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина

Получают в соответствии с методикой, описанной для соединения 4, с использованием (К)бензилглицидилового эфира и 4-метил-2-нитрофенола. ¹Н-ЯМР (400 МГц, б₆-ДМСО) δ 10,20 (с, 1Н), 10,1 (ушир.с, 1Н), 9,89 (ушир.с, 1Н), 9,5 (ушир.с, 1Н), 8,7 (с, 1Н), 8,3 (с, 1Н), 7,98 (с, 1Н), 6,9 (м, 1Н), 6,8 (м,

- 41 011287

1Н), 4 (м, 3Н), 3,42 (м, 2Н), 3,19 (м, 2Н), 3 (м, 2Н), 2,43 (с, 3Н), 2,25 (с, 3Н). ЖХМС (ионизация электрораспылением, положительный) соотношение массы и заряда 358,30 (М+1).

Соединение 23

1-[5-Хлор-2-(В-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина

Получают в соответствии с методикой, описанной для соединения 4, с использованием (В)бензилглицидилового эфира и 4-хлор-2-нитрофенола. ¹ Н-ЯМР (400 МГц, б₆-ДМСО) δ 10,45 (с, 1Н), 9,6 (ушир.с, 1Н), 9,3 (ушир.с, 1Н), 8,7 (ушир.с, 1Н), 8,3 (с, 1Н), 7,19 (м, 2Н), 4,2 (м, 2Н), 4 (д, 1Н), 3,84 (т, 1Н),

3,41 (д, 1Н), 3,21 (д, 1Н), 3,02 (м, 2Н), 2,5 (с, 3Н). ЖХМС (ионизация электрораспылением, положительный) соотношение массы и заряда 378,30 (М+1).

Соединение 24

С1

1-[5-Хлор-2-В-([1,4]оксазепан-2-илметокси)фенил]-3 -(5-метилпиразин-2-ил)мочевина

Получают в соответствии с методикой, описанной для соединения 1, с использованием (В)-2гидроксиметил-[1,4]оксазепан-4-карбоновой кислоты трет-бутилового эфира. ¹ Н-ЯМР (300 МГц, б₆ДМСО) δ 10,83 (ушир.с, 1Н), 8,39 (дд, 1Н), 8,18 (с, 1Н), 8,04 (ушир.с, 1Н), 6,99 (дд, 1Н), 6,82 (д, 1Н), 4,253,98 (м, 2Н), 3,90-3,76 (м, 1Н), 3,38 (д, 1Н), 3,13-3,06 (м, 2Н), 3,00 (дд, 1Н), 2,54 (с, 3Н), 2,06-1,89 (м, 3Н). ЖХМС (электрораспыление, положительный) соотношение массы и заряда 392,3 (М+1).

Соединение 25

1-[5-Хлор-2-(1 -метилпиперазин-2-илметокси)фенил]-3 -(5-метилпиразин-2-ил)мочевина

Получают в соответствии с методикой, описанной для соединения 7, с использованием 4-хлор-2нитрофенола. ^!Н-ЯМР (400 МГц, б-ДМСО) δ 10,35 (ушир.с, 1Н), 10,2 (с, 1Н), 9,84 (ушир.с, 1Н), 9,6 (с, 1Н), 8,31 (с, 1Н), 8,21 (с, 1Н), 7,08 (м, 2Н), 4,58 (д, 1Н), 4,42 (д, 1Н), 3,7 (м, 6Н), 3 (с, 3Н), 2,44 (с, 3Н). ЖХМС (ионизация электрораспылением, положительный) соотношение массы и заряда 391,40 (М+1).

Соединение 26

1-[5-Хлор-2-8-(1-метилпиперазин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина

Получают в соответствии с методикой, описанной для соединения 7, с использованием 8пиперазин-2-карбоновой кислоты и 4-хлор-2-нитрофенола. ¹Н-ЯМР (400 МГц, СЭзОЭ) δ 8,80 (с, 1Н), 8,28 (д, 2Н), 6,99 (с, 2Н), 4,17 (м, 3Н), 3,1 (д, 1Н), 2,92 (д, 2Н), 2,84 (т, 1Н), 2,5 (с, 3Н), 2,45 (м, 2Н), 2,42 (с, 3Н). ЖХМС (ионизация электрораспылением, положительный) соотношение массы и заряда 391,30 (М+1).

- 42 011287

Соединение 27

1-[5-Хлор-4-метил-2-8-([1,4]-оксазепан-2-илметокси)фенил]-3 -(5-метилпиразин-2-ил)мочевина

Получают в соответствии с методикой, описанной для соединения 1, с использованием 4-хлор-5метил-2-нитрофенола, полученного в соответствии с методикой, описанной для соединения 4, стадия 2. ¹Н-ЯМР (300 МГц, йб-ДМСО) δ 10,2 (с, 1Н), 8,62 (с, 1Н), 8,27 (с, 1Н), 8,24 (с, 1Н), 7,32 (м, 1Н), 7,18 (с, 1Н), 4,09-3,91 (м, 3Н), 3,90-3,79 (м, 1Н), 3,77-3,62 (м, 1Н), 3,14 (д, 1Н), 2,85 (м, 1Н), 2,73 (с, 2Н), 2,39 (с, 3Н), 2,27 (с, 1Н), 1,82-1,67 (м, 2Н). ЖХМС (электрораспыление, положительный) соотношение массы и заряда 406,2 (М+1).

Соединение 28

1-[5-Бром-2-(8-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина

Получают в соответствии с методикой, описанной для соединения 4, с использованием 4-бром-2нитрофенола. ^!Н-ЯМР (400 МГц, й₆-ДМСО), δ 10,30 (с, 1Н), 8,63 (ушир.с, 1Н), 8,43 (с, 1Н), 8,22 (с, 1Н), 7,15 (м, 1Н), 7,05 (д, 1Н), 4,08 (м, 3Н), 3,82 (м, 2Н), 3,47 (т, 1Н), 3,17 (с, 2Н), 3 (д, 1Н), 3,07 (с, 3Н), 2,68 (м, 2Н). ЖХМС (ионизация электрораспылением, положительный) соотношение массы и заряда 423,90 (М+1).

Соединение 29

1-[5-Бром-2-В-(В-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина

Получают в соответствии с методикой, описанной для соединения 4, с использованием (В)бензилглицидилового эфира и 4-бром-2-нитрофенола. 'Н-ЯМР (400 МГц, й₆-ДМС’О). δ 10,30 (ушир.с, 1Н), 8,65 (ушир.с, 1Н), 8,43 (с, 1Н), 8,25 (с, 1Н), 7,18 (дд, 1Н), 7,03 (д, 1Н), 4,03 (м, 2Н), 3,82 (м, 2Н), 3,52 (т, 2Н), 3,19 (д, 1Н), 3 (д, 1Н), 2,76 (м, 2Н), 2,43 (с, 3Н).

ЖХМС (ионизация электрораспылением, положительный) соотношение массы и заряда 443,90 (М+1).

Соединение 30

1-[5-Бром-2-8-(4-метилморфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина

Получают в соответствии с методикой, описанной для соединения 4, с использованием 4-бром-2нитрофенола, и методик, описанных для соединения 2, стадия 4, и соединения 5, стадии 4 и 5. ¹Н-ЯМР (400 МГц, СБС1з), δ 11,43 (ушир.с, 1Н), 9,02 (с, 1Н), 8,6 (с, 1Н), 8,33 (с, 1Н), 8,2 (с, 1Н), 7,12 (д, 1Н), 6,76

- 43 011287 (д, 1Н), 4 (м, 3Н), 3,8 (т, 1Н), 3,02 (д, 1Н), 2,73 (д, 1Н), 2,51 (с, 3Н), 2,3 (т, 1Н), 2,22 (с, 3Н), 2,08 (т, 1Н). Соединение 31

1-[5 -Бром-2-( [1,4] оксазепан-2-илметокси)фенил]-3-(5 -метилпиразин-2-ил)мочевина

Получают в соответствии с методикой, описанной для соединения 6, с использованием 4-бром-2нитрофенола, полученного в соответствии с методикой, описанной для соединения 4, стадия 2. ¹Н-ЯМР (400 МГц, СБС1з), δ 8,72 (ушир.с, 1Н), 8,48 (с, 1Н), 8,45 (с, 1Н), 7,11 (д, 1Н), 6,75 (д, 1Н), 4,02 (м, 3Н), 3,8 (м, 1Н), 3,21 (д, 1Н), 2,97 (м, 2Н), 2,51 (с, 3Н), 1,92 (ушир.м, 2Н). ЖХМС (ионизация электрораспылением, положительный) соотношение массы и заряда 436,00 (М+1).

Соединение 32

1-[5-Бром-2-(4-метил-[1,4]оксазепан-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина

Получают в соответствии с методикой, описанной для соединения 6, с использованием 4-бром-2нитрофенола, и методикой, описанной для соединения 5, стадия 5. ¹Н-ЯМР (400 МГц, СОС1₃), δ 8,25 (с, 1Н), 8,23 (с, 1Н), 7,1 (д, 1Н), 6,72 (д, 1Н), 4,19 (м, 1Н), 4 (м, 1Н), 3,95 (м, 2Н), 3,42 (ушир.с, 1Н), 3,02 (д, 1Н), 2,84 (м, 1Н), 2,62 (т, 1Н), 2,5 (с, 3Н), 2,4 (с, 3Н), 2 (м, 2Н). ЖХМС (ионизация электрораспылением, положительный) соотношение массы и заряда 451,90 (М+1).

Соединение 33

1-[5-Хлор-2-8-(4-цианометилморфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина

1-[5-Хлор-2-(8-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевину (0,189 г, 0,5 ммоль) суспендируют в ДМФА (2 мл). Добавляют карбонат калия (0,104 г, 0,75 ммоль) и бромацетонитрил (0,035 мл, 0,5 ммоль) и реакционную смесь нагревают до 80°С, выдерживая при этой температуре в течение 8 ч. Реакционной смеси дают остыть до комнатной температуры и гасят добавлением Н₂О (10 мл). Полученное твердое вещество отделяют фильтрованием и перекристаллизуют из МеОН с получением продукта в виде белого порошка (0,072 г). ¹Н-ЯМР (400 МГц, б₆-ДМСО) δ 10,46 (ушир.с, 1Н), 10,26 (ушир.с, 1Н), 8,63 (ушир.с, 1Н), 8,31 (д, 1Н), 8,17 (с, 1Н), 7,10 (д, 1Н), 7,03 (дд, 1Н), 4,14 (дд, 1Н), 4,09 (дд, 1Н), 3,96-4,01 (м, 1Н), 3,91-3,95 (м, 1Н), 3,81 (д, 1Н), 3,72 (д, 1Н), 3,64 (тд, 1Н), 2,95 (ушир.д, 1Н), 2,72 (ушир.д, 1Н), 2,43 (с, 3Н), 2,32 (тд, 1Н), 2,18 (т, 1Н). ЖХМС (ионизация электрораспылением, положительный) соотношение массы и заряда 417 (М+1).

Соединение 34

- 44 011287

1-[5-Хлор-2-(тиоморфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина

Получают в соответствии с методикой, описанной для соединения 2, стадия 2 (с использованием 2гидроксиметилтиоморфолин-4-карбоновой кислоты трет-бутилового эфира, полученного из тиоморфолин-2,4-дикарбоновой кислоты 4-трет-бутилового эфира в соответствии с методикой, описанной для соединения 2, стадия 1), и методиками, описанными для соединения 3, стадия 2, и соединения 2, стадии 4 и 5. ^!Н-ЯМР (400 МГц, б₆-ДМСО) δ 10,48 (ушир.с, 1Н), 10,27 (ушир.с, 1Н), 8,62 (ушир.с, 1Н), 8,31 (д, 1Н), 8,21 (с, 1Н), 7,12 (д, 1Н), 7,03 (дд, 1Н), 4,36 (т, 1Н), 4,12 (дд, 1Н), 3,24 (дд, 1Н), 3,10-3,17 (м, 1Н), 2,99 (дд, 1Н), 2,94-2,98 (м, 1Н), 2,89 (ддд, 1Н), 2,71 (ддд, 1Н), 2,46-2,48 (м, 1Н), 2,44 (с, 3Н). ЖХМС (ионизация электрораспылением, положительный) соотношение массы и заряда 394 (М+1).

Соединение 35

1-(5-Метилпиразин-2-ил)-3-[3-8-(морфолин-2-илметокси)-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ил]мочевина

Получают в соответствии с методикой, описанной для соединения 3, стадия 1 (с использованием (8)-2-гидроксиметилморфолин-4-карбоновой кислоты трет-бутилового эфира, полученного из 8-морфолин-2,4-дикарбоновой кислоты 4-трет-бутилового эфира в соответствии с методикой, описанной для соединения 2, стадия 1, и 3-нитро-5,6,7,8-тетрагидронафтален-2-ола, полученного в соответствии с методикой, описанной для соединения 4, стадия 2, и методикой, описанной для соединения 1, стадия 5. Ή-ЯМР (400 МГц, б,-ДМСО) δ 10,09 (ушир., 1Н), 10,05 (с, 1Н), 8,60 (ушир.с, 1Н), 8,17 (с, 1Н), 7,86 (с, 1Н), 6,68 (с, 1Н), 3,97 (м, 1Н), 3,89 (м, 1Н), 3,78 (м, 2Н), 3,31 (т, 1Н), 2,98 (д, 1Н), 2,63 (м, 6Н), 2,44 (м, 1Н), 2,41 (с,

3Н), 1, 68 (м, 4Н).

Соединение 36

1-[5-Хлор-2-8-(морфолин-3-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина

Получают в соответствии с методикой, описанной для соединения 2, с использованием морфолин3-8-4-дикарбоновой кислоты 4-трет-бутилового эфира. Ή-ЯМР (400 МГц, б₆-ДМСО) δ 10,22 (с, 1Н), 9,96 (ушир. 1Н), 8,74 (с, 1Н), 8,29 (д, 1Н), 8,18 (с, 1Н), 7,04 (м, 2Н), 3,94 (м, 3Н) 3,70 (ушир.д, 1Н), 3,42 (м, 1Н), 3,23 (м, 2Н), 2,83 (ушир.с, 2Н), 2,43 (с, 3Н).

Соединение 37

1-[5-Метил-2-Я-(морфолин-3-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина

Получают в соответствии с методикой, описанной для соединения 2, с использованием 4-метил-2нитрофенола. Ή-ЯМР (400 МГц, б-ДМСО) δ 10,08 (ушир.с, 1Н), 9,76 (ушир., 1Н), 8,17 (с, 1Н), 8,03 (д, 1Н), 6,90 (д, 1Н), 6,80 (д, 1Н), 3,88 (м, 3Н), 3,70 (ушир.д, 2Н), 3,41 (м, 1Н), 3,20 (м, 2Н), 2,82 (м, 2Н), 2,43 (с, 3Н), 2,24 (с, 3Н).

Соединение 38

1-[5-Хлор-2-8-(морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-трифторметилпиразин-2-ил)мочевина

- 45 011287

Получают в соответствии с методикой, описанной для соединения 1, стадии 2-5, с использованием 5-трифторметилпиразин-2-иламина, полученного в соответствии со способом М1е8е1, патент США 4293552, и (8)-2-гидроксиметилморфолин-4-карбоновой кислоты трет-бутилового эфира. Ή-ЯМР (б₆ДМСО) δ 10,85 (ушир.с, 1Н), 9,97 (ушир.с, 1Н), 9,11 (ушир.с, 1Н), 8,98 (ушир.с, 1Н), 8,73 (ушир.с, 1Н), 8,22 (ушир.с, 1Н), 7,08 (ушир.с, 1Н), 4,19-3,73 (м, 6Н), 3,32-2,98 (м, 4Н). ЖХМС (ионизация электрораспылением, положительный) соотношение массы и заряда 432 (М+1).

Соединение 39

1-[4-Хлор-5-метил-2-8-(морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-цианопиразин-2-ил)мочевина

Получают в соответствии с методиками, описанными для соединения 5, стадии 1-4, с использованием 5-хлор-4-метил-2-нитрофенола, полученного из 3-хлор-4-метилфенола в соответствии с методикой, описанной для соединения 4, стадия 2. Ή-ЯМР (300 МГц, СЭС1₃) δ 10,39 (ушир.с, 1Н), 9,05 (ушир.с, 1Н), 8,74 (с, 1Н), 8,68 (с, 1Н), 8,18 (с, 1Н), 6,91 (с, 1Н), 4,04 (м, 4Н), 3,78 (м, 1Н), 3,19 (д, 1Н), 2,97 (м, 2Н), 2,78 (м, 1Н), 2,36 (с, 3Н). ЬСМ8 (ионизация электрораспылением, положительный) соотношение массы и заряда 403,16 (М+1).

Соединение 40

1-[5-Хлор-4-метокси-2-(5-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-цианопиразин-2-ил)мочевина

Получают в соответствии с методикой, описанной для соединения 1, стадия 2 (с использованием 5аминопиразин-2-карбонитрила, полученного в соответствии с методиками, описанными для соединения 5, стадии 1 и 2), и методиками, описанными для соединения 1, стадии 4 и 5 (с использованием 2гидроксиметил-8-морфолин-4-карбоновой кислоты трет-бутилового эфира и 4-хлор-5-метокси-2нитрофенола, полученного в соответствии с методикой, описанной для соединения 4, стадия 2). ¹Н-ЯМР (300 МГц, б₆-ДМСО) δ 10,82 (с, 1Н), 9,93 (с, 1Н), 8,95 (с, 1Н), 8,81 (с, 1Н), 8,14 (с, 1Н), 6,93 (с, 1Н), 4,25 (с, 2Н), 4,13-3,98 (м, 2Н), 3,83 (с, 3Н), 3,61 (т, 1Н), 3,41-3,19 (м, 2Н),. 3,17-2,91 (м, 2Н). ЖХМС (электрораспыление, положительный) соотношение массы и заряда 419,1 (М+1).

Соединение 41

1-[5-Хлор-2-8-(морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-цианопиразин-2-ил)мочевина

Получают в соответствии с методикой, описанной для соединения 1, стадия 2 (с использованием 5аминопиразин-2-карбонитрила, полученного в соответствии с методиками, описанными для соединения 5, стадии 1 и 2), и методиками, описанными для соединения 1, стадии 4 и 5 (с использованием 2гидроксиметил-8-морфолин-4-карбоновой кислоты трет-бутилового эфира и 4-хлор-2-нитрофенола). ¹НЯМР (б₆-ДМСО) δ 10,97 (ушир.с, 1Н), 10,02 (ушир.с, 1Н), 9,05 (ушир.с, 1Н), 8,95 (с, 1Н), 8,85 (с, 1Н), 8,2 (с, 1Н), 7,10 (м, 1Н), 3,96-4,24 (м, 4Н), 3,68-3,78 (м, 2Н), 3,3 (м, 2Н), 3,0 (м, 2Н). ЖХМС (ионизация электрораспылением, положительный) соотношение массы и заряда 388 (М+1).

- 46 011287

Соединение 42

1-[5-Хлор-2-8-(4-метилморфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-цианопиразин-2-ил)мочевина

Стадия 1. 1-[5-Хлор-2-(морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-цианопиразин-2-ил)мочевина. Получают в соответствии с методикой, описанной для соединения 1, стадия 2 (с использованием 5аминопиразин-2-карбонитрила, полученного в соответствии с методиками, описанными для соединения 5, стадии 1 и 2), и методиками, описанными для соединения 1, стадии 4 и 5 (с использованием 2гидроксиметил-8-морфолин-4-карбоновой кислоты трет-бутилового эфира и 4-хлор-2-нитрофенола), с получением 0,27 г продукта.

Стадия 2. 1-[5-Хлор-2-(морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-цианопиразин-2-ил)мочевину (0,276 г, 0,73 ммоль) суспендируют в ДМФА (5 мл) и обрабатывают карбонатом калия (0,15 г, 1,1 ммоль) и метилиодидом (0,046 мл, 0,73 ммоль). Смесь становится гомогенной, и ее перемешивают при комнатной температуре в течение 4 ч. Реакцию гасят добавлением воды (20 мл) и экстрагируют смесью СНС1₃:изоРгОН 3:1 (3x25 мл). Объединенные органические фракции упаривают при пониженном давлении и остаток растирают с ЕЮАс. Фильтрование дает 0,214 г продукта в виде твердого вещества белого цвета. ¹НЯМР (300 МГц, бе-ДМСО) δ 11,01 (с, 1Н), 10,16 (с, 1Н), 8,86 (д, 2Н), 8,27 (д, 1Н), 8,17 (с, 1Н), 7,18 (м, 2Н), 4,25-4,06 (м, 2Н), 3,95 (м, 1Н), 3,83 (д, 1Н), 3,61 (т, 1Н), 2,89 (д, 1Н), 2,65 (д, 1Н), 2,18 (с, 3Н), 2,02 (тд, 1Н), 1,83 (т, 1Н). ЖХМС (электрораспыление, положительный) соотношение массы и заряда 403,0 (М+1).

Соединение 43

1-[5-Хлор-2-(8-4-метилморфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевина

Получают в соответствии с методикой, описанной для соединения 42, стадия 2 с использованием 1[5-хлор-2-(8-4-метилморфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевины. ¹Н-ЯМР (300 МГц, б₆-ДМСО) δ 10,54 (ушир.с, 1Н), 10,24 (с, 1Н), 8,73 (с, 1Н), 8,30 (с, 1Н), 8,27 (с, 1Н), 7,12-6,93 (м, 2Н), 4,17-3,81 (м, 4Н), 3,59 (т, 1Н), 3,91 (д, 1Н), 2,64 (д, 1Н), 2,43 (с, 3Н), 2,18 (с, 3Н), 2,03 (тд, 1Н), 1,82 (т, 1Н). ЖХМС (электрораспыление, положительный) соотношение массы и заряда 392,1 (М+1).

Терапевтические способы

Соединения по изобретению могут применяться для лечения патологических состояний, включающих аберрантную пролиферацию клеток. Например, соединения могут применяться для потенциации терапевтического действия радиотерапевтического и/или химиотерапевтического средства, применяемого в лечении различных видов рака и других показаний, связанных с пролиферацией клеток, в том числе эукариотических клеток, включая человека и других животных. В целом, данные соединения ингибируют аберрантную пролиферирацию клеток как раковой, так и нераковой природы. Например, соединения по изобретению могут использоваться для повышения эффективности лечения опухолей, которые обычно лечат антиметаболитом, например метотрексатом, гемцитабином или 5-фторурацилом (5-РИ).

Использование соединений по настоящему изобретению может приводить к частичному или полному регрессу аберрантно пролиферирующих клеток, т.е. к уменьшению количества или устранению таких клеток из клеточной популяции. Например, если популяция аберрантно пролиферирующих клеток представляет собой опухолевые клетки, соединения по изобретению могут применяться для замедления скорости роста опухоли, уменьшения количества опухолей и/или индукции частичного или полного регресса опухоли.

Соединения по настоящему изобретению могут применяться ίη νίνο или ех νίνο, если аберрантной пролиферации клеток не выявлено или аберрантная пролиферация клеток не продолжается, но если аберрантная пролиферация клетки подозревается или ожидается. Соединения по настоящему изобретению также могут применяться в случаях, когда аберрантную пролиферацию клеток лечили в прошлом с це

- 47 011287 лью предупреждения или ингибирования ее рецидива.

Один из способов по настоящему изобретению включает введение терапевтически эффективного количества представленного ингибитора С11к1 в комбинации с химиотерапевтическим средством индивидууму, который нуждается в этом. Альтернативно, способ по настоящему изобретению включает введение терапевтически эффективного количества по крайней мере одного представленного ингибитора С.'11к1 индивидууму, который нуждается в этом, в комбинации с антителом, например герцептином, который обладает способностью ингибировать пролиферацию раковых клеток.

Различные виды рака, таким образом, восприимчивы к усиленному лечению путем введения данного ингибитора 011(1 в комбинации с химиотерапевтическим средством или антителом. Виды рака, которые поддаются лечению в соответствии с настоящим изобретением, включают раковые новообразования и саркомы, которые характеризуются солидными опухолями, и виды рака миелоидной или лимфоидной системы, в том числе различные виды лейкозов, лимфомы, и другие виды рака, которые обычно не образуют большую массу опухоли, но распространяются в сосудистой или лимфоретикулярной системе. Такие виды рака включают, например, рак колоноректальной области, рак головы и шеи, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак желудка, рак мочевого пузыря, рак вульвы, лейкозы, лимфомы, меланому, почечно-клеточную карциному, рак яичников, рак мозга, остеосаркомы и рак легкого.

Соединения по настоящему изобретению, таким образом, пригодны при видах рака, опосредованных активностью 0111(1. Более конкретно, активность 011(1 связана с такими формами рака, как, не ограничиваясь ими, онкологические заболевания у детей и взрослых, рост солидных опухолей/злокачественных новообразований, слизеподобная и круглоклеточная карцинома, местнораспространенные опухоли, метастатический рак, саркомы мягких тканей человека, включая саркому Эвинга, метастазы рака, в том числе лимфатические метастазы, плоскоклеточная карцинома, в частности, головы и шеи, плоскоклеточная карцинома пищевода, карцинома ротовой полости, злокачественные новообразования кровяных клеток, в том числе множественная миелома, лейкозы, включая острый лимфоцитарный лейкоз, острый антилимфоцитарный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, хронический миелоцитный лейкоз, волосато-клеточный лейкоз, лимфома выпота (лимфома, локализованная в полости тела), тимическая лимфома, рак легкого (в том числе мелкоклеточная карцинома), Т-клеточная лимфома кожи, лимфома Ходжкина, неходжкинская лимфома, рак надпочечников, АКТГ-вырабатывающие опухоли, немелкоклеточный рак, рак молочной железы, в том числе мелкоклеточная карцинома, карцинома протоков, рак желудочно-кишечного тракта (в том числе рак желудка, рак ободочной кишки, рак колоноректальной области, полипы, связанные с новообразованиями колоноректальной области), рак поджелудочной железы, рак печени, рак мочевых путей (в том числе рак мочевого пузыря, включая первичную поверхностную опухоль мочевого пузыря, инвазивную переходно-клеточную карциному мочевого пузыря, проникающий в мышцы рак мочевого пузыря), рак предстательной железы, злокачественные новообразования репродуктивного тракта у женщин (карцинома яичника, первичные эпителиальные новообразования брюшной полости, карцинома шейки матки, рак эндометрия матки, рак влагалища, рак вульвы, рак матки и солидная опухоль в фолликуле яичника), злокачественные новообразования репродуктивного тракта у мужчин (рак яичка и рак пениса), рак почки (в том числе почечно-клеточная карцинома), рак мозга (в том числе внутренняя опухоль мозга), нейробластома, астроцитная опухоль мозга, глиома, инвазия метастатических опухолевых клеток в центральную нервную систему, рак кости (в том числе остеома и остеосаркома), рак кожи (в том числе злокачественная меланома, прогресс опухоли кератиноцитов кожи человека и плоскоклеточный рак), рак щитовидной железы, ретинобластома, нейробластома, перитонеальная эффузия, злокачественная плевральная эффузия, мезотелиома, опухоль Вильмса, рак желчного пузыря, трофобластное новообразование, гемангиоперицитома и саркома Капоши.

Соединение по настоящему изобретению также может применяться к радиосенсибилизированным клеткам. Болезни, которые поддаются лечению облучением, включают, не ограничиваясь ими, новообразования, доброкачественные и злокачественные опухоли, а также раковые клетки. В радиотерапии используется электромагнитное излучение, например гамма-лучи (10^-20-10^-13 м), рентгеновские лучи (10^-1210^-9 м), ультрафиолетовое излучение (10-400 нм), излучение в видимом спектре (400-700 нм), инфракрасное излучение (700 нм - 1,0 мм) и микроволновое излучение (1 мм - 30 см).

В некоторых из существующих в данное время протоколов лечения рака применяются радиосенсибилизаторы, которые активируются электромагнитным излучением, например рентгеновские лучи. Примеры активированных рентгеновскими лучами радиосенсибилизаторов включают, не ограничиваясь ими, следующие: метронидазол, мизонидазол, дезметилмизонидазол, пимонидазол, этанидазол, ниморазол, митомицин С, К8И 1069, 8К4233, Е09, КВ 6145, никотинамид, 5-бромдезоксиуридин (ВИбК), 5иоддезоксиуридин (ГОбК), бромдезоксицитидин, фтордезоксиуридин (ЕИбК), гидроксимочевина, цисплатин и их терапевтически эффективные аналоги и производные.

В фотодинамической терапии (ΡΌΤ) рака используют свет в видимой области как лучевой активатор сенсибилизирующего агента. Примеры фотодинамических радиосенсибилизаторов включают, не ограничиваясь ими, следующие: производные гематопорфирина, ΡНΟΤΟΕКIN®, производные бензопорфирина, ΝΡο6. этиопорфирин олова (8иЕТ2), феоборбид-а, бактериохлорофилл-а, нафталоцианины, фталоцианины, фталоцианин цинка, а также их терапевтически эффективные аналоги и производные.

- 48 011287

Кроме ингибитора С1к1, радиосенсибилизаторы могут вводиться в сочетании с терапевтически эффективным количеством одного или нескольких соединений, причем такие соединения включают, не ограничиваясь ими, соединения, которые способствуют инкорпорации радиосенсибилизаторов в клеткимишени, соединения, которые контролируют приток терапевтических средств, питательных веществ и/или кислорода к клеткам-мишеням, химиотерапевтические средства, которые действуют на опухоль с дополнительным облучением или без него, или другие терапевтически эффективные соединения для лечения рака или другого заболевания. Примеры дополнительных терапевтических агентов или способов, которые могут применяться в сочетании с радиосенсибилизаторами, включают, не ограничиваясь ими, 5фторурацил (5-Ρυ), лейковорин, кислород, карбоген, переливание эритроцитов, производные перфторуглерода (например, Ρ^υОЗО^А®-^Α), 2,3-ΌΡ0, ВА12С, блокаторы кальциевых каналов, пентоксифиллин, антиангиогенные соединения, гидралазин и Ь-ВЗО.

Химиотерапевтические средства, которые могут применяться в комбинации с соединением по настоящему изобретению для лечения рака, включают, не ограничиваясь ими, алкилирующие агенты, антиметаболиты, гормоны и их антагонисты, радиоизотопы, антитела, а также продукты природного происхождения и их комбинации. Например, ингибиторное соединение по настоящему изобретению может вводиться с антибиотиками, такими как доксорубицин и другие аналоги антрациклина, производными ипритного азота, такими как циклофосфамид, аналогами пиримидина, такими как 5-фторурацил, цисплатин, гидроксимочевина, таксол и его природные и синтетические производные и т.п. Как другой пример, в случае смешанных опухолей, таких как аденокарцинома молочной железы, где опухоли включают гонадотропинзависимые и гонадотропиннезависимые клетки, соединение может вводиться в комбинации с лейпролидом или гозерелином (синтетические аналоги пептида ЬН-КН). Другие протоколы лечения новообразований включают применение ингибиторного соединения с другой модальностью лечения, например хирургией или облучением, которые в данном описании также имеют название «вспомогательные антинеопластические модальности». Дополнительные химиотерапевтические средства, пригодные в соответствии с настоящим изобретением, включают гормоны и их антагонисты, радиоизотопы, антитела, продукты природного происхождения и их комбинации. Примеры химиотерапевтических средств, пригодных для способов применения соединений по настоящему изобретению, приведены в следующей таблице.

А) Алкилирующие агенты	6) Продукты природного
ί) Производные ипритного азота	происхождения
мехлорэтамин	ί) Антимитотические
циклофосфамид	лекарственные средства
ифосфамид	ίί) Таксаны
мелфалан	паклитаксел
хлорамбуцил	алкалоиды барвинка
ϋ) Производные нитрозомочевины	винбластин (УЪВ)
кармустин (ΒΟΝϋ)	винкристин
ломустин (ОСЬЮ)	винорельбин
семустин (метил-ССЫи)	Таксотер (доцетаксел)
ίίί) Этиленимин/Метил-меламин	эстрамустин
триэтиленмеламин (ТЕМ)	эстрамустина фосфат
триэтилентиофосфорамид	ίίί) Эпиподофилотоксины
(тиотепа)	этопозид
гексаметилмеламин (НММ,	тенипозид
альтретамин)	ίν) Антибиотики
ίν) Алкилсульфонаты	актиномицин 0
бусульфан	дауномицин (рубидомицин)
ν) Триазины	доксорубицин
дакарбазин (ВТ1С)	(адриамицин) митоксантрон идарубицин блеомицин спликамицин (митрамицин) митомицин С дактиномицин афидиколин ν) Ферменты Ь-аспарагиназа Ь-аргиназа

- 49 011287

В) Антиметаболиты ίί Аналоги фолиевой кислоты метотрексат триметрексат пеметрексед (антифолат со многими мишенями) ίί) Аналоги пиримидина 5-фторурацил фтордезоксиуридин гемцитабин цитозин арабинозид (АгаС, цитарабин) 5- азацитидин 2,2'-дифтордезокси-цитидин ίίί) Аналоги пурина 6- меркаптопурин 6-тиогуанин азатиоприн 2'-дезоксикоформицин (пентостатин) эритрогидроксинонил-аденин (ΕΗΝΑ) флударабина фосфат 2-хлордезоксиаденозин (кладрибин, 2-С0А)	Н) Радиосенсибилизаторы метронидазол мизонидазол десметилмизонидазол пимонидазол этанидазол ниморазол кзи Ю69 Е09 КВ 6145 5К4233 никотинамид 5 - бромдезоксиуридин 5-иоддезоксиуридин бромдезоксицитидин
С) Ингибиторы топоизомеразы типа	I) Разные агенты ί) Координационные комплексы платины цисплатин карбоплатин оксалиплатин антрацендион митоксантрон ίί) Замещенная мочевина гидроксимочевина ίίί) Производные метилгидразина Ν-метилгидразин (ΜΙΗ) прокарбазин ίν) Супрессанты коры надпочечников митотан (ο,ρ'-ϋϋϋ) аиноглутетимид
I камптотецин топотекан иринотекан
Ώ) Модификаторы биологической реакции С-СЗР (ЗМ-СЗР	Л Цитокины интерферон (а, β, у) интерлейкин-2

В) Средства, способствующие	К) Фотосенсибилизаторы производные гематопорфирина ΡΕοΡοίτίη производные бенэопорфирина Ире 6 олова этиопорфирин (ЗпЕТ2) феоборид-а бактериохлорофилл-а нафталоцианины фталоцианины цинка фталоцианины
дифференциации
производные ретиноевой кислоты
Р) Гормоны и антагонисты ί) Адренокортикостероиды/ антагонисты преднизон и эквиваленты дексаметазон аиноглутетимид ίί) Прогестины гидроксипрогестерона капроат медроксипрогестерона ацетат мегестрола ацетат ίίί) Эстрогены диэтилстильбестрол этинилэстрадиол и эквиваленты ίν) Антиэстроген тамоксифен ν) Андрогены тестостерона пропионат флуоксиместерон и эквиваленты νί) Антиандрогены флутамид аналоги гонадотропинвысвобождающего гормона лейпролид νίί) Нестероидные антиандрогенные средства	Ь) Излучение рентгеновские лучи УФ излучение гамма-лучи излучение в видимой области инфракрасное излучение микроволновое излучение
флутамид

Примеры химиотерапевтических средств, которые являются особенно пригодными в комбинации с радиосенсибилизаторами, включают, например, камптотецин, карбоплатин, цисплатин, даунорубицин, доксорубицин, интерферон (альфа, бета, гамма), иринотекан, гидроксимочевину, хлорамбуцил, 5- 50 011287 фторурацил (5-ЕИ), метотрексат, 2-хлораденозин, флударабин, азацитидин, гемцитабин, пеметрексед, интерлейкин 2, иринотекан, доцетаксел, паклитаксел, топотекан, а также их терапевтически эффективные аналоги и производные.

В соответствии с настоящим изобретением соединения по настоящему изобретению пригодны в комбинации с гемцитабином или в комбинации с гемцитабином и паклитакселом. Соединения по настоящему изобретению также полезны в комбинации с одним пеметрекседом или в комбинации с пеметрекседом и цисплатином, карбоплатином или другими соединениями платины. Данный ингибитор С11к1 также может вводиться в комбинации с гемцитабином и пеметрекседом.

Данный ингибитор С11к1 при введении в комбинации с гемцитабином может быть пригоден для лечения, например, карциномы поджелудочной железы, лейомиосаркомы матки, саркомы кости, метастатического немелкоклеточного рака легкого, саркомы мягких тканей туловища и конечностей, почечноклеточного рака, аденокарциномы и болезни Ходжкина. Данный ингибитор С11к1 при введении с пеметрекседом может быть пригоден для лечения мезотелиомы.

Соединения по настоящему изобретению также могут потенцировать эффективность лекарств, используемых в лечении воспалительных заболеваний, состояний или расстройств, которые характеризуются аберрантной пролиферацией клеток. Примеры воспалительных заболеваний, которые можно лечить соединениями по настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь ими, ревматоидный артрит (РА), псориаз, витилиго, гранулематоз Вегенера, системный ювенильный хронический артрит (ЮХА) и системную красную волчанку (СКВ). Лечение артрита, гранулематоза Вегенера и СКВ часто включает применение имуносупрессивной терапии, например ионизирующего излучения, метотрексата и циклофосфамида. Такое лечение обычно индуцирует, прямо или косвенно, повреждение ДНК. Ингибирование активности С11к1 в пределах иммунных клеток с нарушенной функцией делает такие клетки более чувствительными к контролю с помощью стандартных средств лечения. Псориаз и витилиго обычно лечат ультрафиолетовым облучением (УФ) в комбинации с псораленом. Соединения по настоящему изобретению увеличивают гибельное воздействие УФ и псоралена и увеличивают терапевтический индекс такой схемы лечения. В целом, соединения по настоящему изобретению усиливают контроль клеток, связанных с воспалительными заболеваниями, при использовании в сочетании с иммуносупрессорными лекарственными средствами.

Соединение по настоящему изобретению также может применяться в способах лечения других состояний нераковой природы, которые характеризуются аберрантной пролиферацией клеток. Такие состояния включают, не ограничиваясь ими, атеросклероз, рестеноз, васкулит, нефрит, ретинопатию, заболевание почек, пролиферативные расстройства кожи, псориаз, образование келлоидных рубцов, актинический кератоз, синдром Стивенса-Джонсона, остеопороз, гиперпролиферативные заболевания глаз, в том числе снижение размножения эпителиальных клеток, пролиферативную витреоретинопатию (ПВР), диабетическую ретинопатию, гемангио-пролиферативные заболевания, ихтиоз и папилломы.

Один предпочтительный способ введения ингибитора С11к1 по настоящему изобретению описан Кеедап е1 а1., заявка РСТ/И82004/30806, поданная 17 сентября 2004 г., которая основана на временной заявке США, серийный номер 60/503925, поданной 17 сентября 2003 г, раскрытие которой включено в данное описание путем ссылки во всей его полноте. Такие способы ингибирования аберрантной пролиферации клеток включают схему введения активатора С11к 1 (например, химиотерапевтический агент) и ингибитора С11к1 в соответствии с настоящим изобретением. В таком способе по крайней мере один активатор С11к1 вводят в дозе и на протяжении периода времени, достаточного для индукции существенной степени синхронизации остановки клеточного цикла в пролиферирующих клетках. По достижении существенной степени фазовой синхронизации вводят по крайней мере один ингибитор Сйк1, чтобы отменить остановку клеточного цикла и индуцировать терапевтическую гибель клеток. Способ будет пригодным с любым активатором С11к 1 и находит применение в лечении или профилактике состояний раковой и нераковой природы, включающих аберрантную пролиферацию клеток.

Может быть обеспечен контакт популяции аберрантно пролиферирующих клеток с одним или более ингибиторов С11к1 по изобретению. Если применяется более одного ингибитора Сйк1, контакт ингибиторов С11к1 с клетками может быть обеспечен с помощью одного и того же или разных способов (например, одновременно или последовательно, на протяжении периодов одинаковой или различной продолжительности или в одинаковых или различных модальностях), как определяется квалифицированным специалистом в данной области, например, лечащим врачом (в случае пациентов-людей) или экспериментатором в лаборатории (в случае процедуры ίη νίΐτο или ех νίνο).

Также может быть обеспечен контакт популяции аберрантно пролиферирующих клеток с одним или более активаторами С11к 1. Если применяется более чем один активатор Сйк1, контакт активаторов С11к1 с клетками может быть обеспечен с помощью одного и того же или разных способов, в целом, как описано в контексте ингибиторов С11к1 выше.

Соединения по настоящему изобретению могут быть применены к популяциям клеток ех νίνο. Например, данные соединения могут применяться ех νίνο, чтобы получить информацию, касающуюся оптимальной схемы введения и/или доз для введения ингибитора СНк1 при данном показании, типа клеток, пациента и/или другого параметра лечения. Эта информация может применяться для экспериментальных

- 51 011287 целей или в клинике для определения протоколов лечения ίη νίνο. Другие виды применения ех νίνο для соединений по настоящему изобретению будут понятны для специалистов в данной области.

Как будет понятно специалистам в данной области, дополнительные активные или вспомогательные агенты могут применяться в описанных здесь способах. Специалистам в данной области также будет понятно, что в данном описании ссылка на лечение охватывает профилактику, а также лечение диагностированных заболеваний или симптомов.

Количество соединения по изобретению, необходимое для применения в лечении, варьирует в зависимости от природы состояния, которое подлежит лечению, а также от возраста и состояния пациента, и, в конечном счете, определяется лечащим врачом или ветеринаром. Однако, в целом, дозы для введения при лечении взрослого человека обычно находятся в интервале от 0,001 до приблизительно 100 мг/кг в сутки. Доза может вводиться в виде единой дозы или разделенной на несколько приемов с введением через соответствующие промежутки времени, например два, три, четыре или более приемов в сутки. На практике врач определяет режим дозирования, подходящий для конкретного пациента, и дозы варьируют в зависимости от возраста, массы тела и реакции конкретного пациента. Указанные выше дозы представляют собой примерные значения для среднего случая, но существуют индивидуальные случаи, когда уместными являются более высокие или более низкие дозы, и они находятся в пределах настоящего изобретения.

Контакт популяции клеток с представленным ингибитором СНк1 в любой дозе производится на протяжении периода времени, достаточного для достижения существенной степени инактивации сверочной точки клеточного цикла. Обычно, хотя и не обязательно, такие периоды времени включают периоды длительностью до приблизительно 72 ч или до приблизительно 96 ч, в зависимости от различных факторов. В некоторых вариантах желательно или необходимо вводить ингибитор СНк1 на протяжении периода длительностью до нескольких недель или более, что определяется лечащим врачом или специалистом. Таким образом, данный ингибитор СНк 1 обычно может вводиться на протяжении периода длительностью приблизительно до 1 ч, приблизительно до 2 ч, приблизительно до 3 ч, приблизительно до 4 ч, приблизительно до 6 ч, приблизительно до 12 ч, приблизительно до 18 ч, приблизительно до 24 ч, приблизительно до 48 ч или приблизительно до 72 ч. Специалисты в данной области будут понимать, что приведенные в данном описании промежутки времени являются только примерными и промежутки и поддиапазоны в пределах и за пределами приведенных в данном описании также находятся в пределах изобретения.

Ингибиторы СНк1 по настоящему изобретению могут вводиться в виде множественных доз. Например, ингибитор С.'11к1 может вводиться с частотой: четыре дозы по одной дозе в сутки с промежутками четыре дня (каждые 4 дня х 4); четыре дозы по одной дозе в сутки с трехдневными промежутками (каждые 3 дня х 4); одна доза в сутки с пятидневными промежутками (каждые 5 дней); одна доза в неделю в течение трех недель (каждые 3 недели); пять ежедневных доз с отдыхом в течение двух дней, и еще пять ежедневных доз (5/2/5); или любая схема введения, которая определена как пригодная в соответствующих обстоятельствах.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Определение значений Κ.’₅₀ ингибиторов СНк1.

кДНК С.'11к1 человека идентифицируют и клонируют, как было описано ранее в международной публикации заявки νΟ 99/11795, поданной 4 сентября 1998 г. Метку ЕЬЛС® вставляют в каркас с аминоконцом полной длины С.'11к1. 5'-Праймер содержит сайт ΕοοΚΙ, последовательность Козака, а также кодирует метку ЕЬЛС® для афинной очистки с использованием антитела М2 (81дта, 81. Εοιιίδ. МО). 3'Праймер содержит сайт 8аН. ПЦР-амплифицированный фрагмент клонируют в ρθ-№ο как фрагмент ΕοοΚ1-8αΠ (^йгодеп, Карлсбад, СА), затем субклонируют как фрагмент ΕοοΕΙ-ΝοΐΣ в рЕайВай (ΌίΕοοВВЕ, ВеШекба, ΜΌ). Рекомбинантный бакуловирус получают как описано в руководстве ΟίΕοο-ΒΒΕ Васΐο-Вас и используют для инфицирования клеток 8£-9, выращенных в среде ССМ3 (^аЬο^аIο^^е8 НуС^пе, Βο^ι-ιη, ИТ) для экспрессии меченного ЕЬЛб® белка СНк1.

Меченный ЕЬЛС® СНк1 очищают от замороженных гранул инфицированных бакуловирусом клеток 8Е9. Замороженные гранулы клеток смешивают с равным объемом 2х буфера лизиса, содержащего 100 мМ Трис-НС1, рН 7,5, 200 мМ №С1, 50 мМ В-глицерофосфата, 25 мМ Ν;Ε, 4 мМ МдС1₂, 0,5 мМ ЭГТА, 0,2% Твин®-20, 2 мМ ванадата натрия, 2 мМ дитиотрейтола (ΌΤΤ), и коктейлем ингибиторов протеазы (Сстр1е1е тшц Вοейπηде^ МаппНеип 2000 кат. #1836170). Затем клетки измельчают свободным пестиком гомогенизатора Οοιιι^ (20 раз) и центрифугируют при 48400 д в течение 1 ч. Аффинный М2 предварительно промывают 10 объемами колонки 50 мМ глицина рН 3,5 с последующим 20 мМ Трис рН 7,5, трижды перемежая 150 мМ №С1, и в конце промывают Трис №С1. Затем колонку промывают 25 объемами колонки 20 мМ Трис рН 7,5, 150 мМ №С1, 0,1% Твин®-20, 1 мМ ЭГТА, 1 мМ ЭДТА и 1х полными минитаблетами протеазы. Очищенный лизат затем связывают, с аффинной смолой М2 в серии при 4°С на протяжении 4 ч. Затем смесь смолы и лизата выливают на колонку и собирают элюат. Смолу промывают 10 объемами колонки 20 мМ Трис рН 7,5, 150 мМ №1С1 и 3 мМ Ν-октилглюкозида. Далее меченный ЕЬЛС® СНк1 элюируют из колонки с помощью 6 объемов колонки холодного 20 мМ Трис рН 7,5,

- 52 011287

150 мМ №С1, 3 мМ Ν-октилглюкозида, содержащего 0,5 мг/мл РЬАС® пептида (Е1дта, 2000 кат. # Р3290). Три собранные фракции анализируют на предмет присутствия РЬАС-меченного С11к1.

Анализ активности киназы СИк1, который включает 100 нг очищенного РЬАС®-Сйк1 (150 пмоль АТФ/мин), 20 мкм пептида Сбс25С (Н-1еи-!уг-агд-кег-рго-кег-те!-рго-д1и-акп-1еи-акп-агд-агд-агд-агд-ОН) (ЕЕС) ГО 1), 4 мкм АТФ, 2 мкКи ^[32Р]у-АТФ, 20 мМ Нерек рН 7,2, 5 мМ МдС1₂, 0,1% ΝΡ40 и 1 мМ дитиотрейтола (ЭТТ). Реакции инициируют добавлением АТФ-содержащей реакционной смеси и проводят при комнатной температуре в течение 10 мин. Реакции останавливают добавлением фосфорной кислоты (конечная концентрация 150 мМ) и перемещают реакционную смесь в фосфоцеллюлозные диски. Фосфоцеллюлозные диски промывают пять раз 150 мМ фосфорной кислоты и сушат на воздухе. Добавляют сцинтилляционную жидкость и диски считывают на счетчике сцинтилляции \Уа11ас. Анализ инкубируют в присутствии широкого интервала концентраций соединения-ингибитора С11к1 и вычисляют значение ГС50 для соединения. Все проанализированные соединения по изобретению продемонстрировали в анализе значения Κ'.'₅₀ менее приблизительно 200 нМ.

Пример 2. Селективность.

Ингибиторы С11к1 по настоящему изобретению анализировали на предмет селективности с использованием С11к1 в качестве сравниваемого фермента и следующих протеинкиназ в качестве ферментов сравнения: Сбс2, СИк2, СТАК, ЕрЬА.1, ЕрИА2, Егк1, РСРК.1, РСРК4, Ш, 1ΝΚ1, С-Кй, р38а1рИа, р38Ье!а, р38бе1!а, Кок, Кке, Ккк2, ТгкА, ТгкВ, протеинкиназа А, протеинкиназа С, рр60у-кгс, протеинкиназа В/Ак11, р38МарК, р70Е6К, кальций кальмодулин-зависимая киназа II и тирозинкиназа аЬ1.

Значение Κ'.'₅₀ соединения против СИк 1 измеряли, как изложено выше. Значение Κ'.'₅₀ соединения против сравниваемых ферментов измеряли с использованием патентованной технологической платформы 8е1ес!8тай™ (МЭЕ РИагта Зетек, Во!йе11, Вашингтон, США) с модифицированной методикой ЕЫ8А или поляризационной флуоресценцией. Все проанализированные ингибиторы продемонстрировали 20-кратную селективность ингибирования СИк1 по сравнению с ферментами сравнения.

Альтернативно, анализы для определения Κ'.'₅₀ для каждой из указанных киназ были ранее описаны в литературе, в том числе патентная публикация США 2002-016521 А1 и РСТ/И895/00912, поданная 23 января 1995 г, обе из которых включены в данное описание путем ссылки.

Пример 3. Клеточный анализ для определения значений ЕС_РР8 ингибиторов СИк1.

Клеточную активность ингибиторов СИк1 по изобретению оценивали, измеряя способность соединения сенсибилизировать линию клеток карциномы человека НТ29 к гемцитабину. Среднее значение ЕС_ТРЗ было получено в ходе многократных экспериментов. Таким образом, ингибитор СИк1 по изобретению синтезируют описанными здесь способами. Соединение растворяют в 100% диметилсульфоксиде (ДМСО) в концентрации запасного раствора 10 мМ и хранят при -70°С. Клетки НТ29 получают от АТСС и содержат в среде для выращивания, состоящей из КРМк содержащего 10% эмбриональной сыворотки теленка (РСЕ), пенициллин/стремптомицин, глутамин и другие добавки.

Гидрохлорид гемцитабина получают от ОгеШак и растворяют в буферизованном фосфатом солевом растворе (ФБР) в концентрации 50 мМ и хранят при -20°С. ^3Н-Тимидин получают от Регкш-Е1тег.

Клетками НТ29 покрывают 96-луночные планшеты (Согшпд) для культуры клеток с плотностью 1,3 χ 10³ на лунку и дают прикрепиться в течение ночи. На следующий день гемцитабин изначально разбавляют в 125 раз с последующими 5-кратными разведениями в 1,2 мл Тйег ТиЬек™ (ВюКаб) в среде культивирования. Концентрации заключительных серий разведения составляют: 11, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 6,4χ10^-3, 1,28χ10^-4 и 5,12χ10^-5 нМ. Затем разбавленный гемцитабин добавляют к клеткам на период 2 ч. Затем гемцитабин вымывают и к клеткам добавляют разбавленный ингибитор СИк1 по изобретению на период 24 ч. После начального 1000-кратного разведения в среде культивирования 10 мкМ (запасной раствор в ДМСО) ингибитора СИк1 по изобретению серийно разводят в 3 раза в 1,2 мл Тйег ТиЬек™, получая серии конечного разведения: 2,5, 0,83, 0,28, 0,09 и 0,03 мкМ. Через 72 ч клетки в каждой лунке метят 1 мкМКи ^3Н-тимидином на протяжении 12 ч, затем замораживают при -70°С. Затем планшеты размораживают и собирают на 96-луночные фильтровальные планшеты (М1Шроге) с использованием харвестера для планшетов Се11 Ма!е™ (Регкш Е1тег). После чего добавляют 30 мкл Мкгоксш!™ 20 (Регкш Е1тег), и планшеты считывают на устройстве для считывания планшетов Тор Соип! (Регкш Е1тег). Данные нормализуют к клеткам, обработанным только ингибитором СИк1 по изобретению; затем наносят на логарифмический график концентрации гемцитабина (мкМ) против относительного роста клеток (100% равно 1,0). Кратное увеличение сенсибилизации при ингибировании роста 90% получают для каждой используемой концентрации ингибитора СИк1, которое затем наносят на график концентрации ингибитора СИк1 против кратной сенсибилизации. Затем вычисляют значение ЕС_РРз.

Ингибиторы СИк1 по настоящему изобретению, которые были проанализированы, продемонстрировали измеренные значения ЕС_РРз менее приблизительно 1000 нМ.

Пример 4. Ингибиторы СИк1 по настоящему изобретению увеличивают гибель клеток под действием противораковых средств.

Для демонстрации того, что ингибирование СИк1 соединением по настоящему изобретению делает клетки-мишени чувствительными к гибельному действию повреждающих ДНК агентов, клетки могут

- 53 011287 инкубироваться в присутствии данного ингибитора С11к1 и подвергаться облучению или действию химического повреждающего ДНК агента. Клетки помещают на планшеты с плотностью 1000-2000 на лунку в 96-луночных планшетах для микротитрования и культивируют в среде ΚΜΡΙ 1640, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина в течение 18 ч при 37°С в увлажненном инкубаторе с 5% СО₂. Исследуемые клетки могут включать любые целевые клетки или линии клеток, такие как НеЬа, АСНЫ, 786-0, НСТ116, НСТ15, 8\620, НТ29, Со1о205, 8К-МЕЬ-5, 8К-МЕЬ-28, А549, Н322, ОУСАК-3, 8К-ОУ-3, МИА-МВ-231, МСЕ-7, РС-3, НЬ-60, К562, Вх-РСЗ, М1аРаСа2, Н810, Н226, Н2126 и МОЬТ4. Все обозначения линий клеток ссылаются на следующие линии клеток человека:

НеЬа

Аденокарцинома шейки матки

АСИИ

Аденокарцинома почек

786-0

Аденокарцинома почек

НСТ116

Карцинома ободочной кишки

НТ-29

Карцинома ободочной лимфатическом узле Аденокарцинома коломо-ректальной кишки, метастаз области

Со1о205

Аденокарцинома ободочной кишки

ЗК-МЕЬ-5

Меланома

ЗК-МЕЬ-28

Злокачественная меланома

А54 9

Карцинома легкого

Н322

Бронхоальвеолярная карцинома

ОХ^ГСДК-3

Аденокарцинома яичника

3ΚΌν-3

Аденокарцинома яичника

ΜΌΑ-ΜΒ-231

Аденокарцинома молочной железы

МСК-7

Аденокарцинома молочной железы

РС-3 предстательной

НЬ-60

Аденокарцинома метастаза в кость Острый промиелоцитный лейкоз железы, из

К562

МОЬТ4

Хронический миелогенный лейкоз

Острый лимфобластный лейкоз; Т-лимфобласт

Клетки обрабатывают средами, содержащими отдельно химиотерапевтические лекарственные средства или химиотерапевтические лекарственные средства и ингибитор С11к1. Клетки инкубируют приблизительно в течение 5 дней перед измерением роста путем определения уровней захвата 3Н-тимидина. Химиотерапевтические лекарственные средства включают этопозид, доксорубицин, цисплатин, хлорамбуцил, 5-фторурацил (5-ЕИ). Концентрацию лекарственного средства, необходимую для ингибирования роста клеток до 90% контрольных необработанных клеток, определяли как Ш₉₀.

Соединения по настоящему изобретению могут быть исследованы с дополнительными антиметаболитами, в том числе метотрексатом, гидроксимочевиной, 2-хлораденозином, флударабином, азацитидином и гемцитабином, чтобы оценить их способность увеличивать гибельное действие агентов. Может быть проведено сравнение соединений по настоящему изобретению друг с другом путем оценки усиления гибели карциномы колоноректальной области НТ29 в комбинации с гемцитабином.

Кроме того, может быть проанализирована способность ингибиторов С11к1 по изобретению увеличивать гибель под действием облучения.

Пример 5. Чувствительный анализ для измерения активности ингибитора С11к1 в моделях на живот ных.

Следующий чувствительный анализ был разработан, чтобы измерить активность ингибитора СЕк1 на моделях опухоли у грызунов. В частности, испытание может применяться, среди прочего, для измерения способности ингибитора СЕк1 блокировать функцию СЕк1 на модели опухоли и создания возможности оценки условий, которые облегчают доступ ингибитора С11к1 к молекулярной мишени.

Способность селективных ингибиторов С11к1 инактивировать индуцированную химиотерапией сверочную точку измеряют с использованием количественного иммунофлуоресцентного анализа, где митотический индекс измеряется путем контроля фосфорилирования гистона Н3 на серине 10 (Н3-Р), специфическое для митоза событие (Адго е! а1., I Вю1 СЕеш., 271:13197-201, 1996; Со1о е! а1., I Вю1 СЕеш., 274:25543-9, 1999). Протокол испытания является таким, как указано ниже. Опухоли грызунов, леченных или нелеченных активатором СЕк1 (в данном исследовании химиотерапевтический агент) и/или ингибитором СЕк1, иссекают и фиксируют в парафине. Опухоли нарезают на толстые срезы (6 мкм) и фиксируют на предметных стеклах. Парафин удаляют со стекол с помощью последовательной обработки (3 мин) ксиленом, 100% этанолом, 95% этанолом, 70% этанолом и деминерализированной водой. Затем стекла нагревают до 95°С в 10 мМ растворе цитрата натрия в течение 10 мин, затем следует стадия охлаждения длительностью 20 мин. Стекла блокируют в течение 30 мин блокирующим буфером (20% нормальной сыворотки человека и 2% альбумина бычьей сыворотки в буферизованном фосфатом солевом растворе,

- 54 011287 содержащем 0,05% Тритона Х-100 (ФБРТ)).

Антифосфогистон Н3 антитело (Ир81а1е Вю!есб, кат. #06-570) разбавляют 1:200 в блокирующем буфере и инкубируют с предметными стеклами на протяжении одного часа. Стекла промывают 3 раза по 5 мин в ФБРТ. Вторичное антитело, ослиный антикроличий родамин (1аск§оп, кат. #711-295-152), добавляют в течение 30 мин. Затем стекла дважды промывают ФБРТ и добавляют 75 мкМ 0,1 мкМ/мл дигидрохлорида 4,6-диамидино-2-фенилиндола (ДАПИ, 81дта) в буферизованном фосфатом солевом растворе (ФБР) и дают окрашиваться в течение 30 минут. Далее стекла еще два раза промывают ФБРТ и монтируют с помощью Уес1а§Ые1б (Уес!ог, кат. # Н-1400). Стекла рассматривают, используя флуоресцентную микроскопию. Процент клеток, окрашенных антителом Н3-Р, относительно общего количества (окрашенных ДАПИ) клеток количественно определяют, используя программное обеспечение Ме1атогр11 (ишуег8а1 1тадшд Согрогайои, Уешюп 4.6).

Пример 6. Селективные ингибиторы Сбк1 инактивируют сверочные точки С2 и 8 фазы, индуцированные повреждением ДНК.

Предыдущие исследования продемонстрировали, что селективные ингибиторы Сбк1 в существенной мере инактивируют индуцированные повреждением ДНК сверочные точки С2/М и 8 фазы. В первом случае повреждение ДНК индуцируется ионизирующим излучением (ΙΚ), фазой-мишенью для которого является фаза С2. В последнем случае повреждение ДНК индуцируется химиотерапевтическими агентами, фазой-мишенью для которых является фаза 8. См. опубликованную патентную заявку США 2003/00692 84 и цитируемые в ней ссылки.

Если коротко, инактивация ингибитором Сбк1 индуцированной ионизирующим излучением сверочной точки повреждения ДНК С2 анализируют с помощью экспериментов на основе митотического индекса. Приблизительно 1х10⁶ клеток НеЬа облучают дозой 800 рад и инкубируют в течение 7 ч при температуре 37°С. Поскольку такие клетки являются функционально негативными р53, они останавливаются исключительно в фазе С2. Затем добавляют нокодазол до концентрации 0,5 мкг/мл и инкубируют в течение 15 ч при температуре 37°С. (Добавление нокодазола предназначено улавливать клетки, которые прогрессируют сквозь остановку С2 в митоз, предупреждая их дальнейший прогресс до С1 и создавая возможность количественного определения клеток в фазе М). Селективный ингибитор Сбк 1 добавляют на 8 ч и клетки собирают центрифугированием, один раз промывают ФБР, затем повторно суспендируют в 2,5 мл 75 мМ КС1 и снова центрифугируют. Далее клетки фиксируют в 3 мл свежеприготовленной холодной смеси уксусная кислота/МеОН (1:3) и инкубируют на льду в течение 20 мин. Клетки гранулируют, раствор для фиксации удаляют и клетки ресуспендируют в 0,5 мл ФБР. Препараты клеток в фазе митоза готовят путем переноса 100 мкл фиксированных клеток на предметное стекло микроскопа, образец заливают 1 мл раствора для фиксации. Затем стекла сушат на воздухе, окрашивают красителем \νπ§1ιΐ5 (81дта, 81. Ьошз, МО) в течение 1 мин, после чего один раз промывают водой и один раз промывают 50% МеОН. Клетки в фазе митоза обнаруживают по наличию уплотнения хромосом и отсутствию ядерного конверта. Ингибиторы Сбк1 приводят к увеличению числа митотических клеток в присутствии облучения, таким образом, демонстрируя отмену ΙΚ-индуцированной остановки С2. Такая инактивация сверочной точки приводит к усилению активности циклина-В/сбс2, необходимой для прогресса клеток до митоза. Таким образом, клетки, обработанные ΙΚ и затем ингибитором Сбк1, прогрессируют до митоза с поврежденной ДНК. Эти эксперименты подтверждают гипотезу об участии С11к1 в ΙΚиндуцированном С2.

Пример 7. Ингибитор С11к1 захватывается опухолевыми клетками в присутствии активатора Сбк 1 на модели ксенотрансплантата опухоли.

В модели ксенотрансплантата опухоли голым мышам в бок прививают опухоли карциномы ободочной кишки НТ29 и дают вырасти до 200 мм³. Затем мышам вводят растворитель, 300 мг/кг ингибитора Сбк1, 20 мг/кг гемцитабина, или совместно вводят 300 мг/кг ингибитора С11к1 и 20 мг/кг гемцитабина дважды, с промежутком три дня, в дни 1 и 4. Лечение несущих опухоль мышей совместным введением ингибитора С11к1 и гемцитабина приводит к четырехдневной задержке роста опухолей по сравнению с применением одного только гемцитабина.

Чтобы оценить диффузию ингибиторов С11к1 в ткань опухоли, измеряли уровни ингибитора С11к1 в плазме и ткани. С помощью насоса А1хе1 500 мг/кг ингибитора Сбк1 вводят несущим опухоль мышам НТ29 в системе непрерывной доставки на протяжении 24 ч. Отбирают образцы плазмы, после чего извлекают опухоли, почки, печень, селезенку и легкие. Образцы отбирают через 1, 2, 4, 8 и 24 ч. Ткани извлекают и осуществляют количественное определение уровней ингибитора Сбк1. Этот эксперимент демонстрирует, что ингибитор С11к1 проникает в нормальную и опухолевую ткань, достигая уровня приблизительно 15 мкМ в опухолевой ткани и достигая пиковых значений в ткани селезенки в точке 8 ч на уровне приблизительно 20 мкМ. Таким образом, ингибиторы С11к1 легко захватываются пролиферирующими клетками и являются пригодными в сочетании с активирующими С11к1 химиотерапевтическими агентами как терапевтические средства для лечения пролиферативных заболеваний.

Пример 8. Зависимость «доза-реакция» для опухолей, леченных ингибиторами С11к1 и гемцитабином.

Чтобы определить эффективную дозу ингибитора С11к1 после лечения гемцитабином, а также про

- 55 011287 верить, коррелирует ли дозозависимая инактивация сверочной точки с противоопухолевой активностью, проведен эксперимент изучения зависимости «доза-реакция».

Голым мышам прививают клетки опухоли НТ29 и опухолям дают развиваться в течение 10 дней. В начале эксперимента объем опухоли составляет приблизительно 100 мм³. Животных лечили гемцитабином в максимально переносимой дозе (ΜΤΌ, 160 мг/кг) с последующим введением ингибитора С11к1 в дозах 50, 200 или 400 мг/кг. Длительность предварительного лечения гемцитабином в данном эксперименте составляет 32 ч, что определяется клеточным анализом, который показал данную временную точку как оптимальную для этого вида опухоли. Анализ объема опухоли в каждой из указанных схем лечения показывает, что лечение мышей, несущих опухоль НТ29, описанной схемой замедляет рост опухоли в большей степени, чем применение только гемцитабина, причем введение ингибитора С11к1 в дозе 200 мг/кг или 400 мг/кг плюс гемцитабина снова демонстрирует дозозависимое действие ингибитора С11к1.

Пример 9. Анализ для определения того, является ли агент активатором С11к1.

Для определения того, является ли агент активатором С11кР состояние фосфорилирования С11к1 может быть измерено с использованием фосфо-специфических антител к специфическим сайтам фосфорилирования на Скк1. Показано, что остатки серина 317 и 345 фосфорилируются после обработки клеток ионизирующим излучением, ультрафиолетовым излучением, гидроксимочевиной, Ы-метил-М'-нитро-Мнитрозогуанидином (ΜΝΝ6), темозоламидом и гемцитабином. Ьш е! а1., Сепек Όβν. 14:1448-1459, 2000; 2йао е! а1., Мо1. Се11 Βίο1. 21:4129-4139, 2001; Ьорех-Сйопа е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8с1. И.8.А. 98:1128911294, 2001; Сио е! а1., Сепек Эе\. 14:2745-2756, 2000; Са!е1 е! а1., I. Вю1. Сйет. 278:14806-14811, 2003; Ν§ е! а1., I Вю1 Сйет. 279(10): 8808-19, 2004; Аапд е! а1., Ыа!1 Асаб δα И.8.А. 100(26) :15387-92, 2003; 81орс е! а1., Сенек Эе^'. 18(11): 1331-44, 2004. Такие сериновые сайты фосфорилируются киназами сверочной точки, расположенными в направлении 3'-5', А!т и А!г. Ьш е! а1., Сепек Эе^'. 14:1448-1459, 2000; /Рао е! а1. Мо1. Се11 Вю1., 21:4129-4139, 2001).

Фосфорилирование этих сайтов в ответ на действие кандидата с предполагаемой активностью активатора С.'11к1 может контролироваться с помощью вестерн-блоттинга или иммуногистохимии опухолевых клеток. Например, следующая процедура может применяться для демонстрации того, что гемцитабин приводит к активации С11к1 в серине 345 и 317. Клетки НТ29 обрабатывают 20 мкМ гемцитабина в течение 2 час. Гемцитабин вымывают из сред культивирования, и клетки инкубируют еще в течение 22 ч. Белковые лизаты готовят и отделяют с помощью гель-электрофореза на лаурилсульфате-полиакриламиде натрия. Белки перемещают на поливинилиденфторидные мембраны и зондируют антисывороткой (Се11 81дпа1тд), специфичной для фосфорилированного серина 317 или 345 (Се11 81дпа1шд). Вестерн-блоттинг показывает, что обработка гемцитабином клеток карциномы ободочной кишки НТ29 приводит к фосфорилированию как остатка серина 317, так и 345.

Пример 10. Анализ отслеживания активности С11к1 в ответ на воздействие ингибитора С11к1.

Было обнаружено, что фосфорилирование С11к1 по остатку серина 296 стимулируется обработкой опухолевых клеток гемцитабином и что фосфорилирование по этому сайту ингибируется ингибиторами С11к1. Фосфорилирование по этому сайту не ингибируется вортманнином, который ингибирует А!т и Л1г. Таким образом, фосфорилирование серина 296 отличается от фосфорилирования остатков серина 317 и 345. Кроме того, обнаружено, что данный сайт фосфорилируется в препаратах очищенного СНкР указывая на то, что очищенный фермент способен фосфорилировать сам себя или другие молекулы С11к1 по остатку серина 296. Взятые вместе, эти данные свидетельствуют о том, что фосфорилирование по серину 296 осуществляется непосредственно С11к1. Таким образом, данный подход может применяться для отслеживания активности С11к1 в опухолях в ответ на воздействие активаторов С11к1. В дальнейшем этот подход может применяться для того, чтобы измерить ингибирование активации С11к1 ингибиторами СЬк1.

Таким образом, клетки НТ29 обрабатываются 20 мкМ гемцитабина в течение 2 ч. Гемцитабин вымывают из сред культивирования, и клетки инкубируют еще в течение 22 час. Белковые лизаты готовят и отделяют с помощью гель-электрофореза на лаурилсульфате-полиакриламиде натрия. Белки перемещают на поливинилиденфторидные мембраны и зондируют антисывороткой (Се11 81дпа1тд), специфичной для фосфорилированного серина 296 (Се11 81дпа1шд). Вестерн-блоттинг показывает, что обработка гемцитабином клеток карциномы ободочной кишки НТ29 приводит к фосфорилированию серина 296. Кроме того, клетки НТ29, обработанные селективными ингибиторами С11к1 в течение 15 мин, не показывают фосфорилирования серина 296. Эти данные свидетельствуют, что фосфорилирование серина 296 выполняется киназой С11к1.

Пример 11. Модели опухолей на животных.

Чтобы изучить способность ингибиторов С11к1 по изобретению увеличивать гибель опухолей под действием повреждающих ДНК агентов у мышей, созданы модели ксенотрансплантата опухоли с использованием линий клеток опухолей ободочной кишки. 5-Фторурацил (5-БИ) или гемцитабин могут применяться в качестве повреждающих ДНК агентов. Клетки НТ29 и Со1о205 (карцинома ободочной кишки человека), а также Н460 и Са1и-6 (немелкоклеточная карцинома) могут применяться для разведения ксенотрансплантатов опухолей у самок тимусных мышей Ва1Ь/с (пи/пи) в возрасте 6-8 недель. Мышей содержат в кабинете с ламинарным током воздуха в свободных от патогенов условиях и кормят сте- 56 011287 рильной пищей и водой аб 11Ь1!ит. Линии клеток выращивают до субслияния в средах РРМ1 1640 с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и

1,5 мМ Ь-глутамина во влажной среде с 5% СО₂. Суспензии отдельных клеток готовят в СМЕ (циклофосфамид/метотрексат/5-фторурацил)-ФБР и концентрацию клеток доводят до 1 х 10⁸ клеток/мл. Мышам подкожно (п/к) в правый бок или правую лапу инокулируют общее количество 1х 10⁷ клеток (100 мкл).

Мышей случайным образом распределяют (5-15 мышей/группу) в четыре группы лечения и используют, когда объем опухоли достигает 75-100 см³ (обычно 7-11 дней после инокуляции). Опухоли измеряют кронциркулем, и объем опухоли оценивают, используя эмпирически полученную формулу: объем опухоли (см³)=длина опухоли (см)хширина опухоли (см)хглубина опухоли (см)/3,3. Лечение состоит из ί) 100 мкл внутрибрюшинной инъекцией гемцитабина в дозе 160 мг/кг. Задержка роста опухоли наблюдается у мышей, получающих гемцитабин. Ожидается, что лечение мышей 160 мг/кг гемцитабина в комбинации с пероральным введением ингибиторов С1 к1 будет сокращать объем опухоли, а также продлевать жизнь. Размер опухоли отслеживают через день на протяжении эксперимента.

Очевидно, что разнообразные модификации и вариации описанного выше изобретения могут быть осуществлены без выхода за концепцию и рамки изобретения, и, таким образом, изобретение должно ограничиваться только прилагающейся формулой изобретения.

Claims (9)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Соединение, представляющее собой 1-[5-хлор-2-8-([1,4]оксазепан-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевину, 1-[5-хлор-2-([1,4]оксазепан-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевину, 1-[5-хлор-2-Р-([1,4]оксазепан-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевину, 1-[5-хлор-4-метил-2-8-([1,4]оксазепан-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевину, 1-[5 -бром-2-([1,4] оксазепан-2-илметокси)фенил]-3-(5 -метилпиразин-2-ил)мочевину, 1-[5-бром-2-(4-метил-[1,4]оксазепан-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевину, или его фармацевтически приемлемая соль.
2. 2. Соединение, представляющее собой 1-[2-(1,4-диметилпиперазин-2-илметокси)-5-метилфенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевину, 1-[5-метил-2-(1-метилпиперазин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевину, 1-[5-хлор-2-(1-метилпиперазин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевину, 1-[5-хлор-2-8-(1-метилпиперазин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевину, или его фармацевтически приемлемая соль.
3. 3. Соединение, представляющее собой 1-(5-цианопиразин-2-ил)-3-[5-метил-2-(4-метилморфолин-2-илметокси)фенил]мочевину, 1-[5-бром-2-8-(4-метилморфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевину, 1-[5-хлор-2-8-(4-цианометилморфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевину, 1-[5-хлор-2-8-(4-метилморфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-цианопиразин-2-ил)мочевину, 1-[5-хлор-2-(8-4-метилморфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевину, или его фармацевтически приемлемая соль.
4. 4. Соединение, представляющее собой

   1-[5 -хлор-2-(Р-морфолин-3 -илметокси)фенил]-3-(5 -метилпиразин-2-ил)мочевину, 1-[4,5-дихлор-2-(8-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевину, 1-(5-цианопиразин-2-ил)-3-[5-метил-2-(морфолин-2-илметокси)фенил]мочевину, 1-[5-хлор-4-метил-2-(8-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевину, 1-[5-хлор-4-метил-2-(Р-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевину, 1-[4,5-дихлор-2-(Р-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевину, 1-[4,5-диметил-2-(морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевину, 1-[4-хлор-5-метил-2-(8-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевину, 1-[5-циано-2-(8-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевину, 1-[5-хлор-4-этил-2-(8-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевину, 1-[5-хлор-4-метокси-2-(8-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевину, 1-[5-диметиламино-2-(8-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевину, 1-[5-метил-2-(морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевину, 1-[5-хлор-2-(морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевину, 1-[5-хлор-2-(8-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевину, 1-[5-метил-2-(8-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевину, 1-[5-хлор-2-(Р-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевину, 1-[5-бром-2-(8-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевину, 1-[5-бром-2-Р-(Р-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевину, 1-(5-метилпиразин-2-ил)-3-[3-8-(морфолин-2-илметокси)-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2- 57 011287 ил]мочевину,

   1-[5-хлор-2-8-(морфолин-3-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевину,

   1-[5-метил-2-В-(морфолин-3-илметокси)фенил]-3-(5-метилпиразин-2-ил)мочевину,

   1-[5-хлор-2-8-(морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-трифторметилпиразин-2-ил)мочевину,

   1-[4-хлор-5-метил-2-8-(морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-цианопиразин-2-ил)мочевину,

   1-[5-хлор-4-метокси-2-(8-морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5-цианопиразин-2-ил)мочевину,

   1-[5-хлор-2-8-(морфолин-3-илметокси)фенил]-3-(5-цианопиразин-2-ил)мочевину, или его фармацевтически приемлемая соль.
5. 5. Соединение, представляющее собой 1-[5-бром-4-метил-2-8-(морфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5метилпиразин-2-ил)мочевину, или его фармацевтически приемлемая соль.
6. 6. Соединение, представляющее собой 1-[5-хлор-2-(тиоморфолин-2-илметокси)фенил]-3-(5метилпиразин-2-ил)мочевину, или его фармацевтически приемлемая соль.
7. 7. Фармацевтическая композиция, включающая соединение по любому из пп.1-6 или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый разбавитель или носитель.
8. 8. Применение соединения по любому из пп.1-6 или его фармацевтически приемлемой соли в терапии.
9. 9. Применение соединения по любому из пп.1-6 или его фармацевтически приемлемой соли для лечения рака ободочной и прямой кишки, рака головы и шеи, рака поджелудочной железы, рака молочной железы, рака желудка, рака мочевого пузыря, рака вульвы, лейкоза, лимфомы, меланомы, почечноклеточной карциномы, рака яичника, рака мозга, остеосаркомы или рака легкого.