PT1869020E - Derivados de heteroaril-ureia úteis para a inibição de chk1 - Google Patents

Description

ΡΕ1869020 1

DESCRIÇÃO

"DERIVADOS DE HETEROARIL-UREIA ÚTEIS PARA A INIBIÇÃO DE CHKl"

Campo da Invenção A presente invenção diz respeito a compostos úteis para a inibição de enzimas que mantêm e reparam a integridade de material genético. Mais particularmente, a presente invenção diz respeito a 1-[5-bromo-4-metil-2-S--(morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)--ureia e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, e seu uso como agentes terapêuticos, por exemplo, no tratamento de cancro e outras doenças caracterizadas por defeitos na replicação do ácido desoxirribonucleico (DNA), segregação de cromossoma ou divisão celular.

Antecedentes da Invenção

Uma grande variedade de doenças, condições e desordens (daqui em diante "indicações") são caracterizadas como envolvimento de células de proliferação aberrante.

Conforme aqui usado, "células de proliferação aberrante" (ou "proliferação celular aberrante") significa proliferação celular que se desvia do curso normal, próprio ou esperado. Por exemplo, a proliferação celular aberrante inclui proliferação inapropriada de células em que o DNA ou 2 ΡΕ1869020 outros componentes celulares se tornaram prejudiciais ou defectivos. A proliferação celular aberrante também caracteriza indicações clinicas causadas por, mediadas por ou resultando em niveis inapropriadamente altos de divisão celular, niveis inapropriadamente baixos de morte celular (e.g., apoptose), ou ambos. Tais indicações podem ser caracterizadas, por exemplo, por proliferações anormais locais isoladas ou múltiplas de células, grupos de células ou tecido(s), e incluem indicações cancerosas (benignas ou malignas) e não cancerosas.

Por definição, todos os cancros (benignos e malignos) envolvem alguma forma de proliferação celular aberrante. Algumas indicações não cancerosas também envolvem proliferação celular aberrante. Exemplos de indicações não cancerosas envolvendo proliferação celular aberrante incluem vitiligo, granulomatose de Wegener e lúpus agudo disseminado.

Uma aproximação às indicações de tratamento envolvendo células que se proliferam aberrantemente envolve o uso de agentes que danificam o DNA. Estes agentes são desenhados para matar células que se proliferam aberrantemente pela ruptura de processos celulares vitais tais como metabolismo de DNA, síntese de DNA, transcrição de DNA e formação do fuso de microtúbulo. Eles também podem operar, por exemplo, por introdução de lesões no DNA que perturbam a integridade estrutural cromossómica. Os agentes que danificam o DNA são desenhados e administrados por caminhos 3 ΡΕ1869020 que tentam induzir lesão ou dano máximo e consequente morte celular em células de proliferação aberrante com um dano mínimo para células normais saudáveis.

Uma grande variedade de agentes que danificam o DNA tem sido desenvolvida até à data, incluindo quimio-terapêuticos e radiação, e outros estão em desenvolvimento. Desafortunadamente, a eficácia de agentes que danificam o DNA no tratamento de condições que envolvem proliferação celular aberrante tem sido menos que a desejada, particularmente, no tratamento do cancro. A selectividade de tais agentes dirigida a células de proliferação aberrante sobre as células saudáveis (algumas vezes referida como índice terapêutico) é muitas vezes marginal.

Além disso, todas as células têm sensibilidade e reparam mecanismos que podem funcionar em propósitos cruzados relativamente a agentes que danificam o DNA. Tais mecanismos sensores, chamados «checkpoints» (ou pontos de verificação) do ciclo celular, ajudam a manter a ordem das várias fases de replicação celular e a assegurar que cada passo é executado com alta fidelidade (Hartwell et ai., Science, 246 (1989) 629-634; Weiner et al., Genes Dev., 8 (1994) 652) . Quando as células detectam o dano no DNA, incluindo dano propositadamente induzido por agentes que danificam o DNA, certos caminhos de sinalização activam os «checkpoints» do ciclo celular e o ciclo de replicação celular cessa temporariamente («arrests», "pontos de restrição" ou "pontos de paragem"). Esta restrição concede 4 ΡΕ1869020 às células tempo para reparar o seu DNA, muitas vezes até um grau suficiente para permitir-lhes continuar a sobreviver e proliferar. No caso de células de proliferação aberrante, a sua reparação não é querida, visto que pode enfraquecer os esforços para induzir dano no DNA suficiente para matar tais células.

Por exemplo, o agente quimioterapêutico chamado GEMZAR™ (gemcitabina ou 2',2'-difluoro-2'-desoxicitidina) danifica o DNA por incorporação dele próprio no interior do DNA durante a síntese. Deixado por reparar, o DNA danificado geralmente torna-se incapaz de vida sustentada. Em muitas células tornadas alvos, contudo, os «checkpoints» do ciclo celular detectam o DNA inadequadamente feito (ou de outra maneira danificado). Os «checkpoints» do ciclo celular activados disparam a restrição do ciclo celular durante um tempo suficiente para permitir ao DNA danificado ser reparado. Isto é um caminho no qual as células de proliferação aberrante teoricamente resistem ao efeito de morte celular dos agentes que danificam o DNA tais como quimioterapêuticos, radiação e outras terapias.

Outros agentes que danificam o DNA causam às células de tumor a restrição na fase S. Foram observadas células de tumor a resistir a certos quimioterapêuticos simplesmente por restrição na fase S ainda que o agente quimioterapêutico esteja a ser administrado. Então, logo que a droga é removida, o dano no DNA é reparado, a restrição do ciclo celular cessa e as células progridem ao 5 ΡΕ1869020 longo do resto do ciclo celular (Shi et al., Câncer Res.f 61 (2001) 1065-1072). Outros agentes terapêuticos causam a restrição do ciclo celular noutros «checkpoints», incluindo G1 e G2. Quanto à inibição de vários «checkpoints» de dano no DNA espera-se, por conseguinte, que assista na prevenção das células em relação à reparação de dano no DNA terapeuticamente induzido e que sensibilize as células tornadas alvo para agentes que danificam o DNA. De tal sensibilização por sua vez espera-se que aumente o indice terapêutico destas terapias. O ciclo celular é estruturalmente e funcionalmente o mesmo no seu processo básico e modo de regulação através de todas as espécies eucarióticas. O ciclo celular mitótico (somático) consiste de quatro fases: A fase G1 («gap» ou intervalo), a fase S (síntese), a fase G2 («gap» ou intervalo) e a fase M (mitose) . As fases Gl, S e G2 são colectivamente referidas como interfase do ciclo celular. Durante a fase Gl, as actividades biossintéticas da célula progridem a velocidade alta. A fase S começa quando a síntese de DNA se inicia e termina quando o conteúdo de DNA do núcleo da célula foi replicado e dois conjuntos idênticos de cromossomas estão formados. A célula em seguida entra na fase G2, a qual continua até começar a mitose. Na mitose, os cromossomas emparelham e separam-se, formam-se dois novos núcleos e ocorre a citocinese na qual a célula se separa em duas células filhas recebendo cada uma um núcleo contendo um dos 6 ΡΕ1869020 dois conjuntos de cromossomas. A citocinese termina a fase M e marca o começo da interfase do ciclo celular seguinte. A sequência na qual os eventos do ciclo celular prosseguem está estritamente regulada, tal que o inicio de um evento do ciclo celular está dependente do completamento do evento de ciclo celular anterior. Isto permite a fidelidade na duplicação e segregação de material genético de uma geração de células somáticas para a seguinte.

Tem sido relatado que os «checkpoints» do ciclo celular compreendem pelo menos três classes distintas de polipéptidos, os quais actuam sequencialmente em resposta a sinais do ciclo celular ou defeitos em mecanismos cromossómicos (Carr, Science, 271 (1996) 314-315) . A primeira classe é uma familia de proteinas que detectam ou sentem o dano ou anormalidades do DNA no ciclo celular. Estes sensores incluem proteína Atm (Ataxia-telangiectasia Mutated) e proteína Atr (Ataxia-Telangiectasia Rad-related). A segunda classe de polipéptidos amplifica e transmite o sinal detectado pelo detector e é exemplificada por Rad53 (Alen et al., Genes Dev., 8 (1994) 2416-2488) e Chkl. Uma terceira classe de polipéptidos inclui efectores do ciclo celular, tal como p53, que medeiam uma resposta celular, por exemplo, paragem da mitose e apoptose.

Muito do entendimento corrente da função dos checkpoints do ciclo celular foram derivados a partir do estudo de linhas celulares derivadas de tumor. Em muitos casos, as células de tumor perderam checkpoints-chaves do 7 ΡΕ1869020 ciclo celular (Hatwell et al., Science, 266 (1994) 1821--28). Foi relatado que um passo-chave na evolução de células para um estado neoplásico é a aquisição de mutações que inactivam caminhos de checkpoint do ciclo celular, tais como os que envolvem p53 (Weinberg, Cell, 81 (1995) 323--330; Levine, Cell, 88 (1997) 3234-331). A perda destes checkpoints do ciclo celular resulta na replicação de células de tumor não obstante o dano no DNA. O tecido não canceroso, o qual tem checkpoints do ciclo celular intactos, tipicamente é isolado do rompimento temporário de um caminho de checkpoint único. As células de tumor, contudo, têm defeitos em caminhos que controlam a progressão do ciclo celular tal que a perturbação de checkpoints adicionais as tornam particularmente sensiveis a agentes que danificam o DNA. Por exemplo, células de tumor que contêm p53 mutante são defectivas não só no checkpoint de dano do DNA de G1 mas também na capacidade de manter o checkpoint de dano do DNA de G2 (Bunz et al., Science, 282 (1998) 1497-501). Dos inibidores de checkpoint que têm por alvo a iniciação do checkpoint de G2 ou o checkpoint da fase S espera-se que além disso enfraqueçam a capacidade destas células de tumor repararem o dano no DNA e, por conseguinte, são candidatos para aumentar o índice terapêutico não só da radiação mas também da quimioterapia sistémica (Gesner, Abstract at SRI Conference: Protein Phosphorylation and. Drug Discovery World Summit, Março de 2003) . ΡΕ1869020

Na presença de dano no DNA ou qualquer impedimento à replicação do DNA, as proteínas Atm e Atr do checkpoint iniciam um caminho de transdução do sinal conduzindo à restrição ou paragem do ciclo celular. Foi mostrado que a Atm desempenha um papel num checkpoint de dano do DNA em resposta à radiação ionizante (RI). A Atr é estimulada por agentes que causam roturas no DNA de dupla espiral, roturas no DNA de espiral única, e agentes que bloqueiam radiação no DNA.

Chkl é uma proteína-cinase que se encontra a jusante da Atm e/ou Atr no caminho de transdução do sinal de checkpoint de dano do DNA (Sanchez et ai., Science, 277 (1997) 1497-1501; Pat. dos E.U.A. N° 6 218 109). Em células de mamífero, Chkl é fosforilada em resposta a agentes que causam dano no DNA incluindo radiação ionizante (RI), luz ultravioleta (UV) e hidroxiureia (Sanchez et ai., supra; Lui et ai., Genes Dev., 14 (2000) 1448-1459). Esta fosforilação que activa Chkl em células de mamífero depende de Atm (Chen et ai., Oncogene, 18 (1999) 249-256) e Atr (Lui et ai., supra). Além disso, Chkl tem sido mostrada a fosforilar não só weel (0'Connell et ai., EMBO J., 16 (1997) 545-554) mas também Pdsl (Sanchez et ai., Science, 286 (1999) 1166-1171), produtos de gene conhecidos por serem importante no controlo do ciclo celular.

Estes estudos demonstram que Chkl de mamífero desempenha um papel no checkpoint de dano do DNA dependente de Atm conduzindo à restrição ou paragem na fase S. Um 9 ΡΕ1869020 papel para Chkl nas células de mamífero na fase S foi recentemente elucidado (Feijoo et al., J. Cell Biol., 154 (2001) 913-923; Zhao et al., PNAS U.S.A., 99 (2002) 14795-800; Xiao et al., J. Biol. Chem., 278(24) (2003) 21767-21773; Sorensen et al., Câncer Cell, 3(3) (2003) 247-58) esclarecendo com ênfase o papel de Chkl na monitorização da integridade da síntese de DNA. Chkl invocam uma restrição ou paragem na fase S por fosforilação de Cdc25A, que regula a actividade de ciclina A/cdk2 (Xiao et al., supra e Sorensen et al., supra). Chkl também invoca uma restrição ou paragem em G2 por fosforilação e inactivação de Cdc25C, a fosfatase de especificidade dual que normalmente desfosforila ciclina-B/cdc2 (também conhecida por Cdkl) quando as células progridem da G2 para a mitose (Fernery et al., Science, 277 (1997) 1495-7; Sanchez et al., supra; Matsuoka et al., Science, 282 (1998) 1893-1897; e Blasina et al., Curr. Biol., 9 (1999) 1-10). Em ambos os casos, a regulação da actividade de Cdk induz uma restrição ou paragem do ciclo celular para prevenir as células de entrarem na mitose na presença de dano no DNA ou DNA não replicado.

Classes adicionais de inibidores de checkpoint do ciclo celular operam em qualquer fase G1 ou G2/M. UCN-01, ou 7-hidroxistaurosporina, originalmente foi isolada como um inibidor de cinase não específico tendo o seu principal efeito na proteína-cinase C, mas recentemente foi verificado que inibe a actividade de Chkl e anula o checkpoint do ciclo celular G2 (Shi et al., supra). Por 10 ΡΕ1869020 conseguinte, porque UCN-01 é um inibidor de Chkl não selectivo, ele é tóxico para células em altas doses. Em baixas doses, ele não especificamente inibe muitas cinases celulares e também inibe o checkpoint da G1 (Tenzer et al., Curr. Med. Chem. AntiCancer Agents, 3 (2003) 35-46). UCN-01 tem sido usada em conjunção com terapias do cancro, tais como radiação, o agente anticancro camptotecina (Tenzer et al., supra), e gemcitabina (Shi et al., supra), com sucesso limitado. Em aditamento, UCN-01 tem sido usada para potenciar os efeitos da reparação dos desemparelhamentos (RDE ou MMR) de DNA induzidos por temozolomida (TMZ) em células de glioblastoma (Hirose et al., Câncer Res., 61 (2001) 5843-5849). Na clinica UCN-01 não é um quimioterapêutico eficaz como esperado, possivelmente devido a uma falha na calendarização do tratamento e a uma falta de identificação de alvos moleculares-chave (Grant et al., Drug Resistance Updates, 6 (2003) 15-26). Por conseguinte, Mack et al. reportam a potenciação dependente do ciclo celular da cisplatina por UCN-01 numa linha celular do carcinoma do pulmão de não pequenas células, mas não identificam com especificidade o ou os checkpoints do ciclo celular tidos como alvo por UCN-01. (Mack et al., Câncer Chemoter. Pharmacol., 51(4) (2003) 337-348) . Várias outras estratégias existem para a sensibilização de células de tumor ao tratamento com quimioterapêuticos que afectam o ciclo celular. Por 11 ΡΕ1869020 exemplo, a administração de 2-aminopurina anula os mecanismos de checkpoint de múltiplos ciclos celulares, tal como a restrição ou paragem de G1 induzida por mimosina ou restrição ou paragem da fase S induzida por hidroxiureia, permitindo à célula progredir para e através da mitose (Andreassen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 86 (1992) 2272-2276). Cafeína, uma metilxantina, tem também sido usada para aumentar a citotoxicidade de agentes que danificam o DNA, tais como cisplatina e radiação ionizante, por mediação da progressão através do checkpoint G2 e por esse meio induzindo a morte celular. (Bracey et al., Clin. Câncer Res., 3 (1997) 1371-1381). Contudo, a dose de cafeína para conseguir o anulamento do ciclo celular excede os níveis clinicamente aceitáveis e não é viável a opção terapêutica. Adicionalmente, nucleótidos anti-sentido para a cinase Chkl foram usados para aumentar a sensibilidade ao inibidor de topoisomerase BNP1350 (Yin et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 295 (2002) 435-44), mas demonstram problemas tipicamente associados com tratamento anti--sentido e terapia de gene.

Foram revelados inibidores de Chkl, incluindo compostos de ureia substituída com arilo e heteroarilo descritos em Pedido de Patente dos E.U.A. com o N° de Série 10/087 715 e Pedidos de Patente Provisórios dos E.U.A. Nos 60/583 080, 60/585 292, e 60/602 968; compostos de diaril--ureia descritos na Publicação da Patente dos E.U.A. N° 2004/0014765, Publicação da Patente dos E.U.A. N° US2003/199511, Publicação da Patente dos E.U.A. N° 12 ΡΕ1869020

2004/0014765 e WO 03/101444; metilxantinas e compostos relacionados descritos em Fan et al., Câncer Res., 55 (1995) 1649-54; ureidotiofenos descritos em WO 03/029241 e WO 03/028731; N-pirrolopiridinil-carboxamidas descritas em WO 03/028724; oligonucleótidos de Chkl anti-sentido descritos em WO 01/57206 e Pat. dos E.U.A. N° 6 211 164; antagonistas do receptor de Chkl descritos em WO 00/16781; derivados de carboxamida heteroaromáticos descritos em WO

03/037886; aminotiofenos descritos em WO 03/029242; (indazolil)benzimidazoles descritos em WO 03/004488; benzimidazole-quinolinonas descritas nas Publicações da Patente dos E.U.A. N° 20040092535 e WO 04/018419; heterociclico-hidroxiimino- -fluorenos descritos em WO 02/16326; derivados de scytoneman, tais como scytonemin, descritos em Pat. dos E.U.A. N° 6 495 586; heteroaril-benzamidas descritas em WO 01/53274; indazoles descritos em WO 01/53268; indolocarbazoles descritos em Tenzer et al., supra; derivados de cromano descritos em WO 02/070515; paulonas descritas em Schultz et al., J. Med. Chem., Vol: (1999) 2909-2919; indenopirazoles descritos em WO 99/17769; flavonas descritas em Sedlacek et al., int. J. Oncol., 9 (1996) 1143-1168; derivados de péptido de ansa de péptido de serina-treonina-cinases descritos em WO 98/53050; oxindoles descritos em WO 03/051838; diazepinoindolonas descritas em WO 2004/063198; pirimidinas descritas em WO 2004/048343; compostos de ureia descritos em WO 2004/014876; e pirrolocarbazoles, benzofuroisoindoles e azaciclopentafluorenos descritos em WO 2003/091255. 13 ΡΕ1869020

Contudo, permanece uma necessidade na técnica de inibidores de Chkl eficazes e selectivos. A presente invenção dirige-se a estas e outras necessidades.

Sumário da Invenção A presente invenção diz respeito a inibidores potentes e selectivos da cinase Chkl do checkpoint que exibem propriedades inesperadas em ensaios bioquímicos e/ou à base de células. Os inibidores de Chkl presentes são úteis no tratamento de indicações envolvendo proliferação celular aberrante, e os agentes quimiossensibilizantes e radiossensibilizantes no tratamento de indicações relacionadas com dano no DNA ou lesões na replicação do DNA.

Por conseguinte, a presente invenção proporciona um composto que é 1-[5-bromo-4-metil-2-S-(morfolin-2-il-metoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-ureia e seus sais farmaceuticamente aceitáveis. Entre outras coisas, os compostos são úteis num método de inibição de Chkl compreendendo um passo de administração de uma quantidade eficaz de 1-[5-bromo-4-metil-2-S-(morfolin-2-ilmetoxi)--fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-ureia ou um seu sal farmaceuticamente aceitável a um indivíduo com necessidade dele.

Um outro aspecto da presente invenção é proporcionar composições farmacêuticas compreendendo l-[5--bromo-4-metil-2-S-(morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil- 14 ΡΕ1869020 -pirazin-2-il)-ureia, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, e o uso das composições num tratamento terapêutico de uma indicação, em que a inibição de Chkl, in vivo ou ex vivo, proporciona um beneficio terapêutico ou é de interesse para investigação ou diagnóstico.

Ainda um outro aspecto da presente invenção é proporcionar um método de sensibilização de células num indivíduo sujeito a um tratamento quimioterapêutico ou radioterapêutico para uma indicação compreendendo a administração de 1-[5-bromo-4-metil-2-S-(morfolin-2-il-metoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-ureia ou um seu sal farmaceuticamente aceitável em combinação com um agente de quimioterapêutica, um agente de radioterapêutica, ou ambos, ao indivíduo. Uma indicação não limitante tratada por este método é um cancro.

Um outro aspecto da presente invenção é proporcionar um método de inibição ou prevenção de proliferação celular aberrante. Numa incorporação, o método compreende o contacto de uma população celular compreendendo células que proliferam de modo aberrante com pelo menos um activador de Chkl numa quantidade e durante um tempo suficiente para sincronizar substancialmente a restrição ou paragem do ciclo celular entre as células que proliferam de modo aberrante. Ao alcançar sincronização substancial da restrição ou paragem do ciclo celular na população celular, a população celular contacta com pelo menos um inibidor de Chkl numa quantidade e durante um 15 ΡΕ1869020 tempo suficiente para substancialmente anular a restrição ou paragem do ciclo celular.

Um outro aspecto da presente invenção é proporcionar um artigo de fabrico para uso farmacêutico humano compreendendo: (a) uma composição farmacêutica compreendendo 1— [5 — -bromo-4-metil-2-S-(morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil--pirazin-2-il)-ureia ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; (b) uma inserção em embalagem com a condição de que a composição seja útil no tratamento de indicações envolvendo proliferação celular aberrante; e (c) um recipiente.

Um outro aspecto da presente invenção é proporcionar: (a) uma composição farmacêutica compreendendo l-[5--bromo-4-metil-2-S-(morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil--pirazin-2-il)-ureia ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; (b) uma inserção em embalagem com a condição de que a composição seja útil como quimiossensibilizante ou radios-sensibilizante num tratamento de uma indicação relacionada com lesões no DNA ou replicação do DNA; (c) um recipiente. 16 ΡΕ1869020

Estes e outros aspectos da presente invenção tornar-se-ão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada.

Descrição Detalhada 0 composto da presente invenção 1-[5-bromo-4--metil-2-S-(morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin--2-il)-ureia tem a fórmula de estrutura:

Os agentes que danificam o DNA que activam checkpoints do ciclo celular geralmente são aqui referidos como "activadores de checkpoint". Os agentes que danificam o DNA que activam o checkpoint designado "Chkl" (pronunciado "check-one" ou "check-um") são aqui referidos como "activadores do Chkl". De modo semelhante, os inibidores de tais checkpoints são aqui referidos como "inibidores de checkpoint" e "inibidores do Chkl," respectivamente.

Conforme aqui usado, os inibidores do Chkl são compostos que são capazes de pelo menos parcialmente anular a actividade de pelo menos um checkpoint do ciclo celular 17 ΡΕ1869020 da proteína Chkl. O anulamento de um checkpoint do ciclo celular é alcançado quando o mecanismo do checkpoint celular é suficientemente superado para permitir à célula passar da fase de ciclo celular na qual está parada para a fase seguinte no ciclo celular ou para permitir à célula passar directamente à morte celular. O anulamento de um checkpoint do ciclo celular permite às células carregar material genético danificado ou imperfeito para as subsequentes fases do ciclo celular, induzindo ou promovendo por esse meio a morte celular. A morte celular pode ocorrer por qualquer mecanismo, incluindo apoptose e catástrofe mitótica. Os compostos da invenção são inibidores de Chkl. O activador de Chkl inclui qualquer agente conhecido ou descoberto depois tendo a capacidade para activar a actividade da cinase Chkl, e assim induzir restrição ou paragem do ciclo celular pelo menos parcial. Os activadores do Chkl incluem agentes capazes de restrição ou paragem do ciclo celular em qualquer fase do ciclo celular, fase essa que pode aqui ser referida como "fase alvo" para o activador. As fases alvos incluem qualquer uma das fases do ciclo celular excepto a mitose, isto é, qualquer das fases Gl, S e G2. Os activadores do Chkl úteis na invenção incluem agentes que danificam o DNA, tais como agentes de quimioterapêutica e/ou radiação. Os activadores do Chkl de radiação incluem, mas sem constituir limitação, radiação ionizante. A radiação ionizante inclui radiação electromagnética ou particulada capaz de produzir pares de iões por interacção com água. A radiação ionizante inclui 18 ΡΕ1869020 raios X e gama, partículas alfa e beta, neutrões e núcleos carregados. A radiação inclui luz ultravioleta, luz visível, radiação infravermelha, radiação de microondas suas misturas. Ensaios tais como os descritos no Exemplo 8 podem ser usados para determinar se um agente é um activador de Chkl. "Inibição da proliferação celular aberrante" significa o retardamento da velocidade à qual as células que proliferam de modo aberrante proliferam ou a eliminação de tal proliferação completamente. Esta inibição pode resultar ou de uma velocidade de replicação diminuída, uma velocidade aumentada de morte celular, ou ambas. A morte celular pode ocorrer por qualquer mecanismo, incluindo apoptose e catástrofe mitótica. "Prevenção da proliferação celular aberrante" significa inibição da proliferação celular aberrante antes da ocorrência, ou inibição da sua recorrência. "In vivo" significa no interior de um indivíduo vivo, como no interior de um animal ou um humano. Neste contexto, podem ser usados agentes terapeuticamente in vivo para retardar ou eliminar a proliferação de células que se replicam de modo aberrante. Os agentes também podem ser usados in vivo como um profiláctico para prevenir a proliferação celular aberrante ou a manifestação de sintomas associados com ela. 19 ΡΕ1869020 "Εκ vivo" significa o exterior de um indivíduo vivo. Exemplos de populações de células ex vivo incluem culturas de células e amostras biológicas tais como amostras de fluido ou tecido de humanos ou animais. Tais amostras podem ser obtidas por métodos bem conhecidos na técnica. Amostras exemplares de fluido biológico incluem sangue, fluido cerebrospinal, urina, saliva. Amostras exemplares de tecido incluem tumores e biópsias. Neste contexto, os compostos presentes podem estar em numerosas aplicações, não só terapêuticas mas também experimentais. "Radiossensibilizador", conforme aqui usado, significa um composto, administrado a um humano ou outro animal, numa quantidade terapeuticamente eficaz para aumentar a sensibilidade de células a radiação electromagnética e/ou para promover o tratamento de doenças tratáveis com radiação electromagnética. "Radiação" conforme aqui usado inclui, mas sem constituir limitação, radiação tendo comprimentos de onda no intervalo de 1CT20 a 100 metros. O termo "recipiente" significa qualquer receptá-culo e seu fecho adequado para armazenar, transportar, dispensar e/ou manusear um produto farmacêutico. O termo "inserção de embalagem" significa informação que acompanha o produto que proporciona uma descrição de como administrar o produto, em conjunto com os dados de 20 ΡΕ1869020 segurança e eficácia para permitir ao médico, farmacêutico e paciente tomar uma decisão informada relativamente ao uso do produto. O inserto de embalagem geralmente é olhado como a "etiqueta" para um produto farmacêutico. O composto da invenção pode ser obtido quer por resolução do produto final quer por síntese estereospecifi-ca a partir de ou material de partida isomericamente puro ou o uso de um reagente auxiliar quiral, por exemplo, ver Z. Ma et al., Tetrahedron: Asymmetry, 8 (6) (1997) 883-888. A resolução do produto final, um intermediário ou um material de partida pode ser alcançada por qualquer método adequado conhecido na técnica. Como demonstrado abaixo, os estereoisómeros específicos podem exibir uma capacidade excepcional para inibir Chkl na combinação com tratamentos quimioterapêuticos ou radioterapêuticos. 1-[5-Bromo-4-metil-2-S-(morfolin-2-ilmetoxi)-fe-nil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-ureia pode existir na forma de sais. Os sais farmaceuticamente aceitáveis de l-[5--bromo-4-metil-2-S-(morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil--pirazin-2-il)-ureia geralmente são preferidos nos métodos da invenção. Conforme aqui usado, o termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" refere-se a sais ou formas zwitte-riónicas do composto. Os sais podem ser preparados durante o isolamento e purificação finais dos compostos ou separadamente por reacção do composto com um ácido tendo um catião adequado. Os catiões farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem catiões de metal alcalino (e.g., sódio ou 21 ΡΕ1869020 potássio) e metal alcalino-terroso (e.g., cálcio ou magnésio). Em aditamento, os sais farmaceuticamente aceitáveis de 1-[5-bromo-4-metil-2-S-(morfolin-2-ilmetoxi)--fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-ureia são sais de adição de ácido formados com ácidos farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos de ácidos que podem ser empregues para formar sais farmaceuticamente aceitáveis incluem ácidos inorgânicos tais como clorídrico, bromídrico, sulfúrico e fosfórico, e ácidos orgânicos tais como oxálico, maleico, succínico, malónico e cítrico. Exemplos não limitantes de sais de compostos da invenção incluem, mas sem constituir limitação, sais hidrocloreto, hidrobrometo, hidroiodeto, sulfato, bissulfato, 2-hidroxietanossulfonato, fosfato, hidrogenofosfato, acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, butirato, canforato, canforsulfonato, citrato, digluconato, glicerolfosfato, hemissulfato, heptanoato, hexanoato, formato, succinato, malonato, fumarato, maleato, metanossulfonato, mesitilenossulfonato, naftilenossulfona-to, nicotinato, 2-naftalenossulfonato, oxalato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, picrato, pivala-to, propionato, tricloroacetato, trifluoroacetato, glutama-to, bicarbonato, para-toluenossulfonato, undecanoato, lactato, citrato, tartarato, gluconato, benzenossulfonato e p-toluenossulfonato. Em aditamento, grupos amino disponíveis no composto da invenção podem ser quaternizados com cloretos, brometos e iodetos de metilo, etilo, propilo e butilo ; sulfatos de dimetilo, dietilo, dibutilo e diamilo; cloretos, brometos e iodetos de decilo, laurilo, miristilo e estearilo; e brometos de benzilo e fenetilo. À luz do 22 ΡΕ1869020 precedente, qualquer referência a compostos da presente invenção que aqui apareça tem a intenção de incluir l—[5 — bromo-4-metil-2-5-(morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-ureia bem como seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Os compostos da presente invenção podem ser terapeuticamente administrados na forma de composto puro, mas é preferível administrar os compostos na forma de uma composição ou formulação farmacêutica. Por conseguinte, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo 1-[5-bromo-4-metil-2-S-(morfolin-2-ilmetoxi)--fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-ureia ou um seu sal farma-ceuticamente aceitável em conjunto com um seu diluente ou agente de suporte farmaceuticamente aceitável. É também proporcionado um processo de preparação de uma composição farmacêutica compreendendo a mistura de 1-[5-bromo-4-metil--2-5-(morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)--ureia ou um seu sal farmaceuticamente aceitável com um seu diluente ou agente de suporte farmaceuticamente aceitável.

De acordo com isto, a presente invenção proporciona ainda formulações farmacêuticas compreendendo l—[5— bromo-4-metil-2-5-(morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-ureia ou um seu sal farmaceuticamente aceitável em conjunto com um ou mais agentes de suporte farmaceuticamente aceitáveis e, facultativamente, outros ingredientes terapêuticos e/ou profilácticos. Os agentes de suporte são "aceitáveis" no sentido de serem compatíveis 23 ΡΕ1869020 com os outros ingredientes da formulação e não deletérios para o seu recipiente.

Os compostos da invenção exibem inesperadamente alta potência. A potência tipicamente é expressa como a concentração de um composto requerida para alcançar um certo resultado. Quanto maior a potência, menos é o composto requerido para realizar a sua função pretendida. A potência in vitro tipicamente é expressa em termos de valores CI50 e medida usando um ensaio de resposta à dose. Os valores Cl50 podem ser medidos contactando um sistema de ensaio sensível com um composto de interesse ao longo de um intervalo de concentrações, incluindo concentrações às quais nenhum efeito ou um efeito mínimo é observado, até concentrações mais altas às quais um efeito parcial é observado, até concentrações de saturação às quais é observado um efeito máximo. Teoricamente, tais ensaios do efeito de resposta à dose de compostos inibidores podem ser descritos como uma curva sigmoidal expressando um grau de inibição como uma função da concentração quando em gráfico numa escala log. A curva também passa teoricamente por um ponto no qual a concentração é suficiente para reduzir a actividade da enzima do checkpoint até um nível que é 50% da diferença entre actividade mínima e máxima da enzima observada no ensaio. Esta concentração é definida como a Concentração Inibitória em inibição de 50% ou valor ΟΙ50.

Os valores CI5o podem ser determinados usando técnicas de ensaio bioquímico (acelular) convencionais ou 24 ΡΕ1869020 técnicas de ensaio à base de células bem conhecidas dos peritos vulgares na técnica. Um exemplo de um tal ensaio é proporcionado no Exemplo 1 abaixo.

Preferivelmente, os valores CI50 são obtidos pela realização do ensaio relevante pelo menos duas vezes, com o valor CI50 expresso como a média (média aritmética, ou "média") dos valores individuais obtidos. Mais preferivelmente, o ensaio é repetido de 3 a 10 (ou mais) vezes, com o valor CI50 expressado como a média dos valores obtidos. Ainda mais preferivelmente, o ensaio é realizado um número de vezes suficiente para gerar um valor CI50 médio estatisticamente de confiança, usando métodos estatísticos conhecidos dos peritos vulgares na técnica.

Os compostos da invenção exibem inesperadamente baixos CI5o, correspondentes a inesperadamente alta potência in vitro.

Os compostos da invenção exibem selectividade para a inibição de Chkl em relação a outras proteínas-cinases. A selectividade pode ser vantajosa na redução de efeitos secundários adversos e/ou no aumento do índice terapêutico. A "selectividade" é aqui expressa como "selectividade em múltiplos". Em geral, a selectividade em múltiplos, conforme aqui usado, é a CI50 de um composto de teste para uma enzima de comparação dividida pela CI50 de 25 ΡΕ1869020 uma enzima comparadora. Em particular, a selectividade em múltiplos para um inibidor de Chkl, conforme aqui usada, é a CI50 de um inibidor de Chkl (um composto de teste) para Chkl (a enzima de comparação) dividida pela CI50 para uma enzima comparadora. As enzimas comparadoras contra as quais os compostos da invenção podem ser medidos incluem pelo menos as seguintes proteina-cinases: Cdc2, Chk2, CTAK, EphAl, EphA2, Erkl, FGFRl, FGFR4, IR, JNKl, C-Kit, p38alfa, p38beta, p38delta, Ros, Rse, Rsk2, TrkA, TrkB, proteína--cinase A, proteina-cinase C, pp60v-src, proteina-cinase B/Akt-1, p38MapK, p70S6K, cinase II dependente de calmodulina cálcica e tirosina-cinase abl.

Os ensaios para a determinação de valores CI50 para um composto de teste contra uma enzima comparadora são descritos no Exemplo 2 e são bem conhecidos dos peritos vulgares na técnica.

Os compostos da invenção exibem inesperadamente alta potência num ensaio à base de células. Para medir a potência à base de células de um inibidor de Chkl, foi desenvolvido um ensaio que permite medir a concentração de inibidor de Chkl requerida para aumentar os efeitos de inibição de crescimento de um agente que danifica o DNA num modelo à base de células envolvendo células que proliferam de modo aberrante. Esta medição de uma potência à base de células é expressa aqui como um valor "ecTfs% onde "ECTfs" é a Concentração Eficaz de inibidor de Chkl que produz uma Sensibilização Duas-Vezes de uma população de células que 26 ΡΕ1869020 proliferam de modo aberrante aos efeitos de inibição de crescimento de um agente que danifica o DNA. ECTfs é calculada para ser a concentração de inibidor de Chkl que reduz a quantidade de agente que danifica o DNA requerida para inibição de 90% de crescimento celular por metade. Os requerentes encontraram que os compostos da invenção exibem inesperadamente valores baixos de ECTfs/ correspondendo a potência à base de células inesperadamente alta.

Um outro parâmetro que pode ser medido é a sensibilização em múltiplos alcançada na LD50 (a dose de composto isolado que inibe o crescimento de 50% das células) para o composto inibidor de Chkl. Estes dois valores, ECTfs e sensibilização em múltiplos na LD50, permitem a graduação directa de ambas as potência e toxicidade de inibidores do Chkl relativamente uma à outra.

Um exemplo de um ensaio útil para medir valores ECtfs está descrito no Exemplo 3 abaixo. Brevemente, este ensaio usa células de carcinoma do cólon humano HT29 como a população de células que proliferam de modo aberrante, gemcitabina como o agente que danifica o DNA/activador de Chkl, e um composto da invenção como o inibidor de Chkl. A população de células que proliferam de modo aberrante é cultivada e permitida crescer num meio de crescimento adequado. Subsequentemente, as células são sujeitas ao agente que danifica o DNA ao longo de um intervalo de concentrações. Após um intervalo de tempo predeterminado, o agente que danifica o DNA é removido, e as células são 27 ΡΕ1869020 sujeitas a um inibidor de Chkl ao longo de um intervalo de concentrações e para um intervalo de tempo predeterminado. As placas de células cultivadas são em seguida colhidas e o número relativo de células sobreviventes é contado. Os dados são normalizados contra o inibidor de Chkl isolado como controlo, e em seguida representados num gráfico log/log de concentração de agente que danifica o DNA contra sobrevivência de células relativa (100% de igualização 1,0). A sensibilização em múltiplos é derivada da diferença entre a quantidade de agente que danifica o DNA requerida para alcançar inibição do crescimento de 90% com e sem inibidor de Chkl para cada concentração de inibidor de Chkl usado. Estes dados são em seguida representados num gráfico de concentração de inibidor de Chkl contra sensibilização em múltiplos, a partir do que é calculada a ECTFS.

Preferivelmente os valores de ECTFS são obtidos pela realização do ensaio pelo menos duas vezes, com o valor ECtfs expresso como a média dos valores individuais obtidos. Mais preferivelmente, o ensaio é repetido de 3 a 10 (ou mais) vezes, com o valor ECtfs expresso como a média dos valores obtidos. Ainda mais preferivelmente, o ensaio é realizado um número de vezes necessário para gerar uma média estatisticamente de confiança do valor ECTFs, usando métodos estatísticos conhecidos dos peritos vulgares na técnica.

Todos os compostos que foram sujeitos a um ensaio ECtfs exibiram valores ECTFS inferiores a cerca de 1000 nM. 28 ΡΕ1869020

Em contraste, compostos estruturalmente semelhantes que foram previamente conhecidos exibem valores ECtfs cerca de 11,000 nM.

Os compostos e composições farmacêuticas adequadas para uso na presente invenção incluem aqueles em que o ingrediente activo é administrado numa quantidade eficaz para alcançar o seu propósito pretendido. Mais especifi-camente, a "quantidade terapeuticamente eficaz" significa uma quantidade suficiente para tratar um indivíduo sofrendo de uma indicação, ou para aliviar os sintomas existentes da indicação. A determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz está bem dentro da capacidade dos peritos na técnica, especialmente à luz da revelação detalhada aqui proporcionada.

Em adição ao inibidor de Chkl (1-[5-bromo-4--metil-2-S-(morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin--2-il)-ureia ou um seu sal farmaceuticamente aceitável), as composições farmacêuticas da invenção podem ser formuladas para incluirem agentes biologicamente activos, tais como citocinas, linfocinas, factores de crescimento, outros factores hematopoiéticos, ou suas misturas, para reduzir efeitos secundários adversos que podem ter origem em, ou serem associados com, a administração da composição farmacêutica isolada. Alternativamente, tais agentes biologicamente activos podem ser incluídos na composição farmacêutica da invenção para promover um efeito terapêutico desejado. Agentes biologicamente activos adjuvantes úteis 29 ΡΕ1869020 em composições farmacêuticas da invenção incluem, mas sem constituir limitação, M-CSF, GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IFN, TNF, G-CSF, Meg-CSF, GM-CSF, trombopoietina, factor da célula estami-nal, eritropoietina, angiopoietinas, incluindo Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, e/ou o polipéptido do tipo angiopoietina humana, factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), angiogenina, proteína morfogénica óssea-1 (BMP-1), BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15, receptor da BMP IA, receptor da BMP IB, factor neurotrófico derivado do cérebro, factor neutrófico ciliar, receptor do factor neutrófico ciliar factor quimiotático de neutrófilo induzido por citocina 1, factor quimiotático de neutrófilo induzido por citocina 2, factor quimiotático de neutrófilo induzido por citocina 2, factor de crescimento da célula endotelial, endotelina 1, factor de crescimento epidérmico, atractor de neutrófilo derivado de epitélio, factor de crescimento de fibroblasto (FGF) 4, FGF 5, FGF 6, FGF 7, FGF 8, FGF 8b, FGF 8c, FGF 9, FGF 10, FGF acídico, FGF básico, receptor do factor neutrófico derivado da linha celular glial 1, receptor do factor neutrófico derivado da linha celular glial 2, proteína relacionada com o crescimento, proteína relacionada com o crescimento, proteína relacionada com o crescimento, proteína relacionada com o crescimento, factor de crescimento epidérmico que se liga a heparina, factor de crescimento de hepatócito, receptor do factor de crescimento de hepatócito, factor de crescimento 30 ΡΕ1869020 do tipo insulina I, receptor do factor de crescimento do tipo insulina, factor de crescimento do tipo insulina II, proteína que se liga ao factor de crescimento do tipo insulina, factor de crescimento de queratinócito, factor inibidor de leucemia, receptor do factor inibidor de leucemia, factor de crescimento do nervo, receptor do factor de crescimento do nervo, neurotrofina-3, neurotrofina-4, factor de crescimento da placenta, factor de crescimento da placenta 2, factor de crescimento da célula endotelial derivado de plaqueta, factor de crescimento derivado de plaqueta, cadeia do factor de crescimento derivado de plaqueta A, factor de crescimento derivado de plaqueta AA, factor de crescimento derivado de plaqueta AB, cadeia do factor de crescimento derivado de plaqueta B, factor de crescimento derivado de plaqueta BB, receptor do factor de crescimento derivado de plaqueta, receptor do factor de crescimento derivado de plaqueta, factor de estimulação de crescimento da pré-célula B, factor da célula estaminal, receptor do factor da célula estaminal, factor de crescimento de transformação (TGF) , TGF, TGF 1, TGF 1.2, TGF 2, TGF 3, TGF 5, TGF 1 latente, proteina de ligação a TGF I, proteína de ligação a TGF II, proteína de ligação a TGF III, receptor do factor de necrose tumoral tipo I, receptor do factor de necrose tumoral tipo II, receptor do activador de plasminogénio tipo urocinase, factor de crescimento vascular endotelial, e proteínas quiméricas e seus fragmentos biologicamente ou imunologicamente activos. A 1-[5-bromo-4-metil-2-S-(morfolin-2-ilmetoxi)- 31 ΡΕ1869020 -fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-ureia, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, também pode ser conjugada ou ligada a porções auxiliares que promovem uma propriedade benéfica (ou mitigar uma propriedade indesejável) dos compostos num método de uso terapêutico. Tais conjugados podem aumentar a entrega dos compostos a um sitio anatómico particular ou região de interesse (e.g., um tumor), possibilitar concentrações terapêuticas sustentadas dos compostos em células alvos, alterar propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas dos compostos, e/ou melhorar o índice terapêutico ou perfil de segurança dos compostos. As porções auxiliares adequadas incluem, por exemplo, aminoácidos, oligopéptidos ou polipéptidos, e.g., anticorpos tais como anticorpos monoclonais e outros anticorpos de engenharia; e ligandos a receptores naturais ou sintéticos em células ou tecidos alvos. Outros auxiliares adequados incluem porções de ácido gordo ou lípidos que promovem a biodistribuição e/ou a captação do composto por células alvos (ver, e.g., Bradley et al., Clin. Câncer Res., 7 (2001) 3229).

As formulações da presente invenção podem ser administradas de uma maneira padrão para o tratamento das doenças indicadas, tais como oralmente, parentericamente, transmucosamente (e.g., sublingualmente ou via administração bucal), topicamente, transdermicamente, rectalmente, via inalação (e.g., inalação nasal ou no pulmão profundo). A administração parentérica inclui, mas sem constituir limitação intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, 32 ΡΕ1869020 subcutânea, intramuscular, intratecal e intra-articular. A administração parentérica também pode ser conseguida usando uma técnica de alta pressão, como POWDERJECT™ (Powderject Pharmaceuticals, Plc, Oxford, Inglaterra).

Para administração oral e para administração bucal, a composição pode estar na forma de comprimidos ou pastilhas formuladas de uma maneira convencional. Por exemplo, comprimidos e cápsulas podem conter excipientes convencionais tais como agentes de ligação (por exemplo, xarope, acácia, gelatina, sorbitol, tragacanta, mucilagem de amido ou polivinilpirrolidona), agentes de enchimento (por exemplo, lactose, açúcar, celulose microcristalina, amido de mais, fosfato de cálcio ou sorbitol), lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, ácido esteárico, talco, polietilenoglicol ou sílica), desintegrantes (por exemplo, amido de batata ou glicolato de amido e sódio), ou agentes molhantes (por exemplo, sulfato de laurilo e sódio). Os comprimidos podem ser revestidos de acordo com métodos bem conhecidos na técnica.

Alternativamente, os compostos da presente invenção podem ser incorporados em preparações líquidas orais tais como suspensões, soluções, emulsões, xaropes ou elixires, aquosos ou oleosos, por exemplo. Além disso, as formulações contendo estes compostos podem ser apresentadas na forma de um produto seco para constituição com água ou outro veiculo adequado antes do uso. Tais preparações líquidas podem conter aditivos convencionais, por exemplo 33 ΡΕ1869020 agentes de suspensão, tais como xarope de sorbitol, metil-celulose, glucose/xarope de açúcar, gelatina, hidroxietil-celulose, hidroxipropilmetilcelulose, carboximetilcelulose, gel de estearato de alumínio e gorduras hidrogenadas comestíveis; agentes de emulsionamento, tais como lecitina, monooleato de sorbitano ou acácia; veículos não aquoso (os quais podem incluir óleos comestíveis), tais como óleo de amêndoa, óleo de coco fraccionado, ésteres oleosos, propilenoglicol e álcool etílico; e conservantes, tais como p-hidroxibenzoato de metilo ou propilo e ácido sórbico.

As preparações também podem ser formuladas na forma de supositórios, e.g., contendo bases de supositório convencionais, tais como manteiga de cacau ou outros glicéridos. As composições para inalação tipicamente podem ser proporcionadas na forma de uma solução, suspensão ou emulsão que pode ser administrada na forma de um pó seco ou na forma de um aerossol usando um propulsor convencional, tal como diclorodifluorometano ou triclorofluorometano.

As formulações tópicas e transdérmicas compreendem veículos aquosos ou não aquosos convencionais, tais como gotas para os olhos, cremes, pomadas, loções e pastas, ou estão na forma de um penso adesivo, emplastro ou membrana.

Adicionalmente, as composições da presente invenção podem ser formulados para administração por injecção ou infusão contínua. As formulações para injecção 34 ΡΕ1869020 podem estar na forma de suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes de formulação, tais como agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão. Alternativamente, o ingrediente activo pode estar em forma de pó para constituição com um veículo adequado (e.g., água estéril, livre de pirogénios) antes de usar.

Uma composição da presente invenção também pode ser formulada na forma de uma preparação de depósito. Tais formulações de actuação longa podem ser administradas por implantação (por exemplo, subcutaneamente ou intramuscularmente) ou por injecção intramuscular. De acordo com isto, os compostos da invenção podem ser formulados com materiais poliméricos adequados (e.g., polímeros solúveis em água) materiais hidrofóbicos (e.g., uma emulsão num óleo aceitável), resinas de permuta iónica ou derivados escassamente solúveis (e.g., um sal escassamente solúvel).

Para uso veterinário, 1-[5-bromo-4-metil-2-S--(morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)--ureia, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, é administrado na forma de uma formulação adequadamente aceitável de acordo com a prática veterinária normal. O veterinário pode prontamente determinar o regime de dosagem e via de administração que for a mais apropriada para um animal particular. Os animais tratáveis pelos compostos e métodos presentes incluem, mas sem constituir limitação, 35 ΡΕ1869020 animais de estimação, animais de exploração pecuária, animais de espectáculo e espécimes de zôo. Métodos de Síntese

Os compostos da presente invenção podem ser preparados pelos seguintes esquemas de síntese. Primeiro, as alcoxiarilaminas usadas para preparar os inibidores de Chkl aqui descritos podem ser preparados por diferentes esquemas de síntese gerais. Por exemplo, o Esquema Geral 1 sumaria a reacção de um nitrofenol com uma forma activada de um álcool, formada in situ ou preparada e isolada independentemente, para proporcionar um produto éter nitrofenílico. A redução do éter sob condições padrão proporciona uma arilamina que é usada para produzir um composto da invenção.

Esquema Geral 1 OH Or’ 0*R*

R R R

Alternativamente, a reacção de um halonitro-benzeno com um álcool na presença de uma base forte, tal como hidreto de sódio ou bis(trimetilsilil)amideto de potássio, também produz éteres nitroarílicos, conforme ilustrado no Esquema Geral 2. Estes éteres são em seguida reduzidos conforme indicado no Esquema Geral 1. ΡΕ1869020 36

Esquema Geral 2

0*N

R 02N. 0·* b

R A conversão de uma arilamina a uma ureia pode ser alcançado por um de vários esquemas de síntese. Por exemplo, uma arilamina pode reagir com um carbamato de pirazina para produzir uma ureia conforme ilustrado no

Esquema Geral 3.

Esquema Geral 3

Alternativamente, conforme delineado no Esquema Geral 4, a decomposição induzida por calor de um azoteto de acilo produz um isocianato de arilo reactivo o qual em seguida é deixado a reagir com uma arilamina para produzir a ureia desejada.

Esquema Geral 4

37 ΡΕ1869020

Uma outra aproximação, ilustrada no Esquema Geral 5, utiliza fosgénio ou um equivalente de fosgénio para acoplar duas arilaminas e proporcionar uma ureia.

Esquema Geral 5

As abreviaturas usadas nas sínteses aqui descritas são: h (h), min (min), libra por polegada quadrada (psi), saturada (sata), água (H20), desionizada (Dl), álcool isopropílico (iPrOH), platina sobre carbono (Pt/C), azoto (N2), hidrogénio (H2), paládio sobre carbono (Pd/C), óxido de platina (Pt20), sulfato de magnésio (MgS04), ácido clorídrico (HC1), azodicarboxilato de diisopropilo (DIAD), cloreto de metileno (CH2C12), clorofórmio (CHCI3), metanol (MeOH), hidróxido de amónio (NH4OH), tetra-hidrofurano (THF), N-metilpirrolidona (NMP), ácido acético (AcOH), NaOH (NaOH), EtOAc (EtOAc), etanol (EtOH), dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilsulfóxido deuterado (d6-DMSO), carbonato de sódio (Na2C03), clorofórmio deuterado (CDC13), bicarbonato de sódio (NaHC03), hidreto de sódio (NaH), TEA (TEA), carbonato de césio (Cs2C03), dióxido de carbono (C02), hidróxido de paládio (Pd(OH) 2), ácido sulfúrico (H2SO4) , ácido nítrico (HN03), cloreto de sódio (NaCl), sulfato de sódio (Na2S04), e dimetilformamida (DMF). 38 ΡΕ1869020

Preparação de Compostos

Os seguintes compostos da presente invenção foram preparados usando os esquemas gerais revelados acima.

Composto de Referência 1

/ s ( NH y

o

Ci 1-[5-Cloro-2-S-([1,4]oxazepan-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-ureia

Passo 1: 2-Amino-5-metilpirazina

Sal p-toluenossulfonato de aminomalononitrilo (20,0 g, 79 mmol) e 1-oxima de piruvaldeido (6,88 g, 79 mmol) foram combinados num balão. iPrOH (140 mL) foi adicionado, e a pasta amarela resultante foi deixada em agitação à temperatura ambiente durante 18 h, tempo durante o qual se acumulou um precipitado amarelo. A mistura foi filtrada e o precipitado foi lavado com iPrOH (2x50 mL) e H20 Dl (20 mL), em seguida liofilizada para dar N-óxido de 2-amino-3-ciano-5-metilpirazina (10,7 g) . O N-óxido de pirazina foi suspenso em MeOH (22 mL) e AcOH (5 mL). A isto, Pt 5%/C (1,6 g) e Darco KB-B (8 g) foram cuidadosamente adicionados. A mistura foi deixada a absorver H2 a 60 psi durante 18 h. A reacção foi 39 ΡΕ1869020 extinta com NaOH 25% (34 mL) e purgada com N2 durante 30 min. A mistura foi filtrada através de um leito de Celite molhada e lavada com MeOH (4x100 mL). O filtrado foi concentrado em vácuo até um quarto do volume. O filtrado foi diluido com EtOAc (150 mL) e lavado com NaOH 5% (30 mL) e reextraido com EtOAc (2x70 mL). As camadas orgânicas foram combinadas e lavadas com NaCl sat° (20 mL), filtradas e concentradas em vácuo para dar um sólido pegajoso laranja (5,16 g) .

Passo 2: Éster de fenilo do ácido (5-metilpirazin-2-il)- carbâmico 2-Amino-5-metilpirazina (5,16 g, 47 mmol) foi dissolvida em CH2C12 (52 mL), agitada e arrefecida até 0 °C sob n2, A isto, piridina (4,8 mL, 59 mmol) foi adicionada seguido por cloroformato de fenilo (6,2 mL, 59 mmol) , gota a gota, ao longo de 15 min, causando a formação de um precipitado. A mistura foi agitada a 0 °C durante 1 h. Em seguida a reacção foi extinta com HC1 0,25 M (40 mL) e éter anidro (50 mL), e agitada O o O durante 30 min. 0 precipitado foi isolado por filtração, lavado com h2o Dl (20 mL) e éter (2x25 mL), e seco sob vácuo para dar 0 produto (7,4 g) na forma de um pó fofo.

Passo 3: Éster de terc-butilo do ácido (S)-2-hidroximetil-[1,4]oxazepano-4-carboxílico A um balão de fundo redondo de 250 mL foram adicionados éter (S)-(+)-benzilico e glicidilico, (1,31 g, 7,9 mmol), 3-benzilamino-propan-l-ol (1,3 g, 7,9 mmol) e 40 ΡΕ1869020 10 mL EtOH. A mistura foi aquecida até 40 °C durante 15 h. A reacção foi arrefecida e concentrada em vácuo e o produto oleoso resultante foi usado sem purificação posterior. O diol foi colocado num balão de fundo redondo de 250 mL e dissolvido em 75 mL de piridina seca. A solução foi arrefecida até 0 °C e cloreto de toluenossulfonilo (5,27 g, 27,7 mmol) foi adicionado numa porção. A mistura foi agitada durante 6 h, mantendo cuidadosamente a temperatura de reacção a 0 °C A reacção fria foi extinta com 50 mL solução aquosa saturada de NaHC03. Um adicional de 20 mL de água foi adicionado e a mistura foi extraída três vezes com porções de 100 mL de EtOAc. As fases orgânicas foram secas sobre Na2S04 e concentradas em vácuo. O álcool em seguida foi purificado por cromatografia em coluna usando um gradiente de 25-50% de EtOAc e hexanos como eluente. Isto rendeu 1,39 g de álcool tosílico na forma de um óleo amarelo.

0 álcool foi dissolvido em 50 mL de DMF e arrefecido até 0 °C. À mistura agitada fria foi cuidadosamente adicionado NaH 95% (m/m) (0,29 g, 11,5 mmol). A reacção foi agitada a 0 °C durante 15 min, em seguida deixada aquecer lentamente até à temperatura ambiente e agitada 6 h. A reacção foi cuidadosamente extinta com 50 mL de água e extraída três vezes com porções de 50 mL de EtOAc. As fases orgânicas foram secas sobre Na2S04 e concentradas sob vácuo. O produto cru foi recebido em EtOH e colocado num aparelho Parr de hidrogenação. Também adicionados à solução foram Pd 10% (m/m)/C (0,426 g, 0,30 mmol) e HC1 2 M 41 ΡΕ1869020 (2,1 mL). A hidrogenação foi feita a 50 psi durante 2 dias momento em que a reacção foi considerada feita por análise de LCMS. A solução foi neutralizada com solução aquosa saturada de NaHC03 e extraída usando uma mistura 3:1 de CHCl3:iPrOH. As fases orgânicas foram concentradas sob vácuo e o produto cru foi levado ao passo seguinte. O aminoálcool cru foi dissolvido em 100 mL de CH2C12 seco. A esta solução foram adicionados TEA (1,59 mL, 11,5 mmol) e dicarbonato de di-terc-butilo (5,74 g, 5,74 mmol). A solução foi agitada à temperatura ambiente durante 18 h, em seguida extinta com solução aquosa saturada de NaHC03 e extraída três vezes usando porções de 50 mL de CH2C12. As fases orgânicas foram secas sobre Na2S04 e concentradas em vácuo. O produto foi purificado por cromatografia em coluna usando um gradiente de 25-50% de EtOAc/hexanos. isto rendeu 0,240 g do álcool de oxazapano na forma de um óleo amarelo.

Passo 4: Éster de terc-butilo do ácido (S)-2-(4-cloro-2- -nitro-fenoximetil)-[1,4]oxazepano-4-carboxílico A um balão de fundo redondo de 50 mL foram adicionados álcool de oxazapano (0,240 g, 1,03 mmol), TEA (0,21 mL, 1, 545 mmol), e 10 mL de CH2C12 seco. A solução foi arrefecida até 0 °C e cloreto de metanossulfonilo

(0,10 mL) foi adicionado gota a gota. A mistura foi agitada durante 1,5 h a 0 °C e em seguida extinta e arrefecida com água. As camadas foram separadas e a camada aquosa foi extraída uma vez com 20 mL de CH2C12. As fases orgânicas foram secas sobre Na2S04 e concentradas sob vácuo. O 42 ΡΕ1869020 mesilato cru em seguida foi dissolvido em 5 mL de DMF crua. A esta solução foi adicionado CS2CO3 (0,671 g, 2,06 mmol) e 4-cloro-2-nitro-fenol (0,215 g, 1,24 mmol). Esta solução amarela brilhante em seguida foi aquecida até 100 °C ao longo da noite. A reacção foi arrefecida até à temperatura ambiente, extinta com 50 mL de água e extraída três vezes com porções de 50 mL de EtOAc. O produto foi purificado por cromatografia flash usando um gradiente de 10-35% de EtOAc/hexanos. Esta sequência de passos produziu 0,120 g do nitrofeniloxazapano na forma de um óleo amarelo brilhante.

Passo 5: 1-[5-Cloro-2-([1,4]oxazepan-2-(S)-ilmetoxi)- -fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-ureia

Num balão de fundo redondo de 25 mL foram colocados nitrofenil-oxazapano (0,120 g, 0,31 mmol) e Pt20 (0,007 g, 0,03 mmol) em 5 mL de MeOH. Foi fixado um balão de hélio, o balão foi evacuado usando um aspirador, voltado a encher com H2 três vezes e em seguida deixado em agitação sob H2 durante 2 h. A reacção foi filtrada através de Celite, lavando a almofada de Celite duas vezes com porções de 20 mL de MeOH. A solução foi concentrado em vácuo. A anilina crua foi dissolvida em 5 mL de dmf seca. A esta solução foram adicionados TEA (0,005 mL, 0,34 mmol) e éster de fenilo do ácido (5-metilpirazin-2-il)carbâmico (0,07 g, 0,31 mmol). Esta mistura foi agitada 18 h à temperatura ambiente. O solvente foi removido sob vácuo e o resíduo foi redissolvido em 10 mL de EtOAc e lavado com solução aquosa saturada de NaHC03, As fases orgânicas foram secas sobre Na2S04 e concentradas a pressão reduzida. O resíduo cinzento/castanho foi coberto com 3 mL de CH2C12 e a isto 43 ΡΕ1869020 foi adicionado 1 mL de ácido trifluoroacético concentrado. Na adição de ácido todos os sólidos se dissolveram. A reacção foi agitada à temperatura ambiente durante 4 h momento em que solução aquosa saturada de NaHCCt é adicionada até que a solução alcance pH 9, A mistura foi extraída três vezes com porções de 10 mL de uma mistura 3:1 de CHCl3:iPrOH. As fases orgânicas foram em seguida secas sobre Na2S04 e concentradas sob vácuo. Os sólidos esbranquiçados em seguida foram triturados em EtOAc e filtrados através de um meio de filtro esmerilado, lavando com 50 mL de EtOAc. O sólido branco foi completamente seco sob vácuo. Esta sequência produziu 0,020 g da ureia desejada na forma de um pó branco fino. ^-NMR (300 MHz, de-DMSO) δ: 10,83 (br s, 1H) , 8,39 (dd, 1H) , 8,18 (s, 1H) 8,04 (br s, 1H), 6,99 (dd, 1H), 6,82 (d, 1H), 4,25-3,98 (m, 2H), 3,90-3, 76 (m, 1H), 3,38 (d, 1H), 3,13-3,06 (m, 2H), 3,00 (dd, 1H), 2,54 (s, 3H), 2,06-1,89 (m, 3H). LCMS (ES, positiva) m/e 392,3 (M+l).

Composto de Referência 2

1-[4,5-Dicloro-2-(S-morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil- -pirazin-2-il)-ureia 44 ΡΕ1869020

Passo 1: Éster de terc-butilo do ácido (S)-2-hidroximetil- -morfolina-4-carboxílico

Num balão de 500 mL foram combinados éter (S)--benzílico e glicidílico (15 g, 91,4 mmol), MeOH (10 mL), e NaOH 50% (m/m) (30 mL, 365 mmol). A esta mistura foi adicionado sulfato de 2-aminoetilo (25,8 g, 183 mmol) em porções. Esta mistura heterogénea foi aquecida até 40 °C momento em que a solução se tornou homogénea. A temperatura foi mantida a 40 °C durante 4 h. A reacção foi arrefecida ligeiramente e NaOH sólido adicional (14,6 g, 365 mmol) foi adicionado em conjunto com 50 mL de tolueno. A solução bifásica em seguida foi aquecida até 65 °C durante 12 h. A reacção foi arrefecida até à temperatura ambiente, as camadas foram separadas e a camada aquosa foi extraída uma vez com 75 mL de tolueno. AS camadas orgânicas combinadas foram lavadas três vezes com porções de 75 mL de HC1 1 Μ. O pH das camadas aquosas combinadas foi ajustado para pH 12 com solução aquosa de NaOH e extraída quatro vezes com porções de 70 mL de EtOAc. As fases orgânicas foram secas sobre Na2S04 e concentradas em vácuo para produzirem 10,084 g da desejada morfolina na forma de um óleo opaco. O produto de morfolina cru foi dissolvido em CH2CI2 (100 mL) e TEA (12,1 mL, 87,5 mmol) e dicarbonato de di-terc-butilo (15,9 g, 73 mmol) foram adicionados acompanhados pela formação de gás C02. A reacção foi agitada à temperatura ambiente durante 18 h, em seguida extinta com 35 mL de solução aquosa saturada de NaHC03. Um adicional de 45 ΡΕ1869020 50 mL de água foi adicionado e as camadas foram separadas. A camada orgânica foi seca sobre Na2S04 anidro, concentrada em vácuo e purificada por cromatografia flash (20% de EtOAc/hexano) para dar a desejada N-Boc-O-benzil-morfolina na forma de um óleo amarelo pálido (5,536 g). A morfolina desprotegida purificada foi dissolvida em 50 L de EtOH absoluto e Pd(OH)2 (1,26 g, 20% (m/m), 1,8 mmol) foi adicionado. Um balão de hidrogénio foi fixado e o balão foi evacuado usando um aspirador e voltado a encher com H2 três vezes. A reacção foi agitada sob H2 durante 30 h. A mistura foi filtrada sobre Celite, lavando a almofada de Celite completamente com EtOH. A solução filtrada foi concentrada sob vácuo para produzir do desejado álcool da N-boc-morfolina na forma de um sólido branco pálido (3,918 g).

Passo 2: 4,5-Dicloro-2-nitro-fenol

Um balão de fundo redondo de 250 mL carregado com 3,4-diclorofenol (3, 053 g, 19,7 mmol) em 50 mL de CH2C12 foi arrefecido até 0 °C num banho de gelo. À solução agitada foi adicionado H2S04 concentrado (1,56 mL, 29,1 mmol). A solução tornou-se turva. A esta mistura foi adicionado HN03 concentrado (1,2 mL, 19,7 mmol), gota a gota e cuidadosamente para manter a temperatura abaixo 5 °C. A reacção foi agitada durante 30 min a 0 °C, em seguida arrefecida com um banho de gelo e extinta com 150 mL de H20. As camadas foram separadas e a camada aquosa 46 ΡΕ1869020 foi extraída uma vez com 35 mL de CH2CI2. As fases orgânicas foram secas sobre Na2SC>4 anidro, concentradas sob vácuo e purificadas usando cromatografia flash (10% de EtOAc/hexanos como eluente) para produzirem o desejado ni-trofenol na forma de um sólido amarelo brilhante (1,793 g) .

Passo 3: 1-[4,5-Dicloro-2-(S-morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]- -3-(5-metil-pirazin-2-il)-ureia

Preparada de acordo com o procedimento para o Composto de Referência 1, Passos 4 e 5, usando 4,5-dicloro--2-nitro-fenol e éster de terc-butilo do ácido (S)—2— -benziloximetil-morfolina-4-carboxílico. 1H-NMR (300 MHz, de-DMSO) δ: 10,42 (s, 1H) , 10,29 (s, 1H), 8,93 (s, 1H), 8,42 (s, 1H), 8,21 (s, 1H), 7,32 (s, 1H), 4,18-3,41 (m, 5H) , 3,03-2, 66 (m, 4H) , 2,38 (s, 3H) LRMS (ES, positiva) m/e 412,2 (M+l).

Composto 1

1-[5-Bromo-4-metil-2-S-(morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5--metil-pirazin-2-il)-ureia

Preparado de acordo com o procedimento para o 47 ΡΕ1869020

Composto de Referência 2, usando 4-bromo-5-metil-2-nitro--fenol, preparado usando o procedimento para o Composto de Referência 2, Passo 2. 1H-NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ: 10,31 (br s, 1H), 10,19 (s, 1H), 8,63 (s, 1H), 8,41 (s, 1H) , 8,20 (S, 1H), 7,07 (s, 1H), 4,13-3,94 (m, 3H) , 3, 87-3, 74 (m, 2H), δ 3,52 (td, 1H), 3,00 (d, 1H), 2,69 (t, 2H), 2,42 (s, 1H), 2,25 (s, 1H). LRMS (ES, positiva) m/e 439,2,0 (M+l). Métodos Terapêuticos

Os compostos da invenção podem ser usados para tratar condições envolvendo proliferação celular aberrante. Por exemplo, os compostos podem ser usados para potenciar os efeitos terapêuticos de radiação e/ou um agente de quimioterapêutica usado no tratamento de cancros e outras indicações de proliferação celular envolvendo células euca-rióticas, incluindo aquelas em humanos e outros animais. Em geral, os compostos presentes inibem células que proliferam de modo aberrante, não só cancerosas mas também não cancerosas. Por exemplo, os compostos da invenção podem ser usados para acentuar o tratamento de tumores habitualmente tratados com um antimetabolito, e.g., metotrexato, gemci-tabina ou 5-fluorouracil (5-FU). O uso de compostos da presente invenção pode resultar numa parcial ou completa regressão de células que proliferam de modo aberrante, isto é, a redução ou eliminação de tais células de uma população celular. Por 48 ΡΕ1869020 exemplo, quando a população de células que proliferam de modo aberrante é de células de tumor, os compostos da invenção podem ser usados para retardar a velocidade de crescimento do tumor, diminuir o número de tumores, e/ou induzir parcial ou completa regressão do tumor.

Os compostos da presente invenção podem ser usados in vivo ou ex vivo quando nenhuma proliferação celular aberrante tenha sido identificada ou quando nenhuma proliferação celular aberrante tenha começado, mas quando a proliferação celular aberrante é suspeita ou esperada. Os compostos da presente invenção também podem ser usados quando a proliferação celular aberrante tenha sido previamente tratada de maneira a prevenir ou inibir a recorrência do mesmo.

Um método da presente invenção compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de Chkl presente, em combinação com um agente de quimioterapêutica, a um indivíduo com necessidade dele. Alternativamente, um método da presente invenção compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um inibidor de Chkl presente a um indivíduo com necessidade dele, em combinação com um anticorpo, e.g., herceptina, que tem actividade na inibição da proliferação de células cancerosas.

Os cancros, por conseguinte, são susceptíveis à 49 ΡΕ1869020 acentuação do tratamento por administração de um inibidor de Chkl presente em combinação com um agente de quimio-terapêutica ou um anticorpo. Os cancros tratáveis pela presente invenção incluem carcinomas e sarcomas que são caracterizados por tumores sólidos, e cancros dos sistemas mielóide e linfóide, incluindo leucemias, linfomas, e outros cancros que tipicamente têm falta de uma massa de tumor, mas são distribuídos nos sistemas vascular e linfor-reticular. Estes cancros incluem, por exemplo, cancros colorrectais, cancros da cabeça e pescoço, cancros pancre-áticos, cancros da mama, cancros gástricos, cancros da bexiga, cancros vulvares, leucemias, linfomas, melanomas, carcinomas da célula renal, cancros do ovário, cancros do cérebro, osteossarcomas e cancros do pulmão.

Os compostos da presente invenção, por conseguinte, são úteis em cancros mediados por actividade de Chkl. Mais particularmente, a actividade de Chkl está associada com formas de cancro incluindo, mas sem constituir limitação, oncologia do adulto e pediátrica, crescimento de tumores sólidos/malignidades, carcinoma mixóide e da célula redonda, tumores avançados localmente, cancro metastático, sarcomas do tecido mole humano, incluindo sarcoma de Ewing, metástases de cancro, incluindo metás-tases linfáticas, carcinoma da célula escamosa, particularmente de te cabeça e pescoço, carcinoma esofágico da célula escamosa, carcinoma oral, malignidades da célula do sangue, incluindo mieloma múltiplo, leucemias, incluindo leucemia 50 ΡΕ1869020 linfocítica aguda, leucemia antilinfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielocítica crónica, e leucemia da célula cabeluda, linfomas de efusão (linfomas baseados na cavidade corporal), linfoma timico, cancro do pulmão (incluindo carcinoma de pequenas células, linfoma da célula T cutânea, linfoma de Hodgkin, linfoma não de Hodgkin, cancro do córtex supra-renal, tumores produzindo ACTH, cancros de não pequenas células, cancro da mama, incluindo carcinoma de pequenas células e carcinoma ductal), cancros gastrointestinais (incluindo cancro do estômago, cancro do cólon, cancro colorrectal e pólipos associados com neoplasia colorrectal), cancro pancreático, cancro do fígado, cancros urológicos (incluindo cancro da bexiga, tais como tumores da bexiga superficiais primários, carcinoma da célula invasiva transicional da bexiga, e cancro da bexiga invasivo do músculo), cancro da próstata, malignidades do tracto genital feminino (incluindo carcinoma do ovário, neoplasmas epiteliais peritoneais primários, carcinoma cervical, cancros endometriais uterinos, cancro vaginal, cancro da vulva, cancro uterino e tumores sólidos no folículo do ovário), malignidades do tracto genital masculino (incluindo cancro testicular e cancro peniano), cancro do rim (incluindo carcinoma da célula renal, cancro do cérebro (incluindo tumores do cérebro intrínsecos, neuroblastoma, tumores do cérebro astrocí-ticos, gliomas e invasão da célula de tumor metastático no sistema nervoso central), cancros ósseos (incluindo 51 ΡΕ1869020 osteomas e osteossarcomas), cancros da pele (incluindo melanoma maligno, progressão de tumor de queratinócitos da pele humana e cancro da célula escamosa), cancro da tiróide, retinoblastoma, neuroblastoma, efusão peritoneal, efusão pleural maligna, mesotelioma, tumores de Wilms, cancro da vesícula biliar, neoplasmas trofoblásticos, hemangiopericitoma e sarcoma de Kaposi.

Um composto da presente invenção também podem ser usado para radiossensibilizar células. As doenças tratáveis com radiação incluem, mas sem constituir limitação, doenças neoplásicas, tumores benignos e malignos, e células cancerosas. O tratamento de radiação emprega radiação electromagnética tal como radiação gama (10 20 a 1CT13 m), radiação de raios X (10 12 a 10“9 m), luz ultravioleta (10 nm a 400 nm), lux visível (400 nm a 700 nm), radiação infravermelha (700 nm a 1,0 mm) e radiação de microondas (1 mm a 30 cm) .

Alguns protocolos de tratamento de cancro empregam correntemente radiossensibilizadores activados por radiação electromagnética, e.g., raios X. Exemplos de radiossensibilizadores activados por raios X incluem, mas sem constituir limitação, os seguintes: metronidazole, misonidazole, desmetilmisonidazole, pimonidazole, etanida-zole, nimorazole, mitomicina C, RSU 1069, SR 4233, E09, RB 6145, nicotinamida, 5-bromodesoxiuridina (BUdR), 5-iodo-desoxiuridina (IUdR), bromodesoxicitidina, fluorodesoxi- 52 ΡΕ1869020 uridina (FUdR), hidroxiureia, cisplatina e seus análogos e derivados terapeuticamente eficazes. A terapia fotodinâmica (tfd) de cancros emprega luz visível como activador de radiação do agente de sensibilização. Exemplos de radiossensibilizadores fotodi-nâmicos incluem os seguintes, mas sem constituir limitação: derivados de hematoporfirina, PHOTOFRIN , derivados de benzoporfirina, NPe6, etioporfirina de estanho (SnET2), feoborbide-a, bacterioclorofila-a, naftalocianinas, ftalo-cianinas, ftalocianina de zinco e análogos e derivados terapeuticamente eficazes do mesmo.

Os radiossensibilizadores podem ser administrados em conjunção com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais compostos em adição ao inibidor de Chkl, tais compostos incluindo, mas sem constituir limitação, compostos que promovem a incorporação de radiossensibilizadores para as células alvos, compostos que controlam o fluxo de agentes terapêuticos, nutrientes e/ou oxigénio às células alvos, agentes de quimioterapêutica que actuam no tumor com ou sem radiação adicional, ou outros compostos terapeuticamente eficazes para o tratamento do cancro ou outra doença. Exemplos de agentes ou métodos terapêuticos adicionais que podem ser usados em conjunção com radiossensibilizadores incluem, mas sem constituir limitação, 5-fluorouracil (5—FU), leucovorina, oxigénio, carbogénio, transfusões de glóbulos vermelhos, perfluorocarbonetos 53 ΡΕ1869020 (e.g., FLUOSOLW®-DA), 2,3-DPG, BW12C, bloqueadores do canal de cálcio, pentoxifilina, compostos anti-angiogénese, hidralazina e L-BSO.

Agentes quimioterapêuticos que podem ser usados em combinação com um composto da presente invenção para tratar um cancro incluem, mas sem constituir limitação, agentes de alquilação, antimetabolitos, hormonas e seus antagonistas, radioisótopos, anticorpos, bem como produtos naturais, e suas combinações. Por exemplo, um composto inibidor da presente invenção pode ser administrado com antibióticos, tais como doxorrubicina e outros análogos de antraciclina, mostardas de azoto, tais como ciclofosfamida, análogos de pirimidina tais como 5-fluorouracil, cispla-tina, hidroxiureia, taxol e seus derivados naturais e sintéticos, e semelhantes. Como outro exemplo, no caso de tumores mistos, tais como adenocarcinoma da mama, onde os tumores incluem células dependentes de gonadotropina e células dependentes de gonadotropina, o composto pode ser administrado em conjunção com leuprolide ou goserelina (análogos péptidos sintéticos de LH-RH). Outros protocolos antineoplásicos incluem o uso de um composto inibidor com uma outra modalidade de tratamento, e.g., cirurgia ou radiação, também aqui referido como "modalidades antineoplásicas adjuntas". Agentes quimioterapêuticos adicionais úteis na invenção incluem hormonas e seus antagonistas, radioisótopos, anticorpos, produtos naturais e suas combinações. Exemplos de agentes quimioterapêuticos 54 ΡΕ1869020 úteis nos métodos que empregam compostos da presente invenção são listados no quadro seguinte.

Quadro 1 A) Agentes de alquilação G) Produtos naturais i) Mostardas de azoto i) Drogas antimitóticas mecloretamina ii) Taxanos ciclofosfamida paclitaxel ifosfamida alcaloides vinca melfalano vinblastina (VLB) clorambucil vincristina ii) Nitroso-ureias vinorelbina carmustina (BCNU) Taxotere® (docetaxel) lomustina (CCNU) estramustina semustina (metil-CCNU) fosfato de estramustina iii) Etilenoimina/Metil-melamina iii) Epipodofilotoxins trietilenomelamina (TEM) etoposide trietileno-tiofosforamida teniposide (tiotepa) iv) Antibióticos hexametilmelamina (HMM, altre- actimomicina D tamina) daunomicina (rubidomicina) iv) Sulfonatos de alquilo doxorrubicina (adriamicina) bussulfano mitoxantroneidarrubicina v) Triazinas bleomicina dacarbazina (DTIC) esplicamicina (mitramicina) mitomicina C dactinomicina afidicolina v) Enzimas L-asparaginase L-arginase ΡΕ1869020 55 (continuação)

Quadro 1 B) Antimetabolitos H) Radiossensibilizadores i) Análogos de ácido fólico metronidazole metotrexato misonidazole trimetrexato desmetilmisonidazole pemetrexed (antifolato multi- pimonidazole -alvo) etanidazole ii) Análogos de pirimidina nimorazole 5-fluorouraci1 RSU 1069 fluorodesoxiuridina E09 gemcitabina RB 6145 citosina arabinósido (AraC, SR4233 citarabina) nicotinamida 5-azacitidina 5-bromodesoxiuridina 2,2'-difluorodesoxi-citidina 5-iododesoxiuridina iii) Análogos de purina bromodesoxicitidina 6-mercaptopur ina 6-tioguanina azatioprina 2'-desoxicoformicina (pentostatina) eritro-hidroxinonil-adenina (EHNA) fosfato de fludarabina 2-clorodesoxiadenosina (cladribina, 2-CdA) ΡΕ1869020 56 (continuação)

Qoãdro 1 C) Inibidores da topoisomerase tipo I) Agentes variados I camptotecina topotecano irinotecano i) Complexos de coordenação de platina cisplatina carboplatina oxaliplatina antracenediona mitoxantron ii) Ureia substituída hidroxiureia iii) Derivados de metil-hidrazina N-metil-hidrazina (MIH) procarbazina iv) Supressor adrenocortical mitotano (ο,ρ'-DDD) ainoglutet imida D) Modificadores da resposta J) Citocinas biológica G-CSF GM-CSF interferão (α, β, λ) interleucina-2 E) Agentes de diferenciação derivados de ácido retinóico K) Fotossensibilizadores Derivados de hematoporfirina Fotofrina® Derivados de benzoporfirina Npe6 Eetioporfirina de estanho (SnET2) feoboride-a bacterioclorofila-a naftalocianinas ftalocianinas ftalocianinas de zinco ΡΕ1869020 57 (continuação)

Quadro 1 F) Hormonas e antagonistas L) Radiação i) Adrenocorticosteróides/- raios X antagonistas luz ultravioleta prednisona e equivalentes radiação gama dexametasona luz visível ainoglutetimida radiação infra-vermelha ii) Progestinas radiação de microondas caproato de hidroxiprogesterona acetato de medroxiprogesterona acetato de megestrol iii) Estrogénios dietilstilbestrol etinil-estradiol e equivalentes iv) Antiestrogénio tamoxifeno v) Androgénios propionato de testosterona fluoximasterona e equivalentes vi) Antiandrogénios flutamida análogos da hormona de líber- tação de gonadotropina leuprolide vii) Antiandrogénios não esteróides flutamida

Exemplos de agentes quimioterapêuticos que são particularmente úteis em conjunção com radiossensibiliza-dores incluem, por exemplo, camptotecina, carboplatina, cisplatina, daunorrubicina, doxorrubicina, interferão (alfa, beta, gama), irinotecano, hidroxiureia, clorambucil, 58 ΡΕ1869020 5-fluorouracil (5-FU), metotrexato, 2-cloroadenosina, flu-darabina, azacitidina, gemcitabina, pemetrexed, interleu-cina 2, irinotecano, docetaxel, paclitaxel, topotecano e análogos e derivados terapeuticamente eficazes dos mesmos.

De acordo com a presente invenção, os compostos da presente invenção são úteis em combinação com gemcitabina, isolados ou ainda com paclitaxel. Os compostos da presente invenção também são úteis em combinação com pemetrexed, isolados ou ainda com cisplatina, carboplatina ou outras platinas. Um inibidor de Chkl presente também pode ser administrado em combinação com gemcitabina e pemetrexed .

Um inibidor de Chkl presente administrado em combinação com gemcitabina pode ser útil no tratamento de, por exemplo, carcinoma pancreático, liomiossarcoma do útero, sarcoma ósseo, cancro do pulmão de não pequenas células metastático, sarcoma do tecido mola da extremidade e tronco, cancro da célula renal, adenocarcinoma e doença de Hodgkin. Um inibidor de Chkl presente administrado com pemetrexed pode ser útil no tratamento de mesotelioma.

Os compostos da presente invenção também podem potenciar a eficácia de drogas usadas no tratamento de doenças, condições ou desordens inflamatórias caracteriza-das por proliferação celular aberrante. Exemplos de doenças inflamatórias que podem ser tratadas com compostos da presente invenção incluem, mas sem constituir limitação, 59 ΡΕ1869020 artrite reumatóide (AR), psoríase, vitiligo, granulomatose de Wegener, artrite crónica juvenil (ACJ) de inicio sistémico, e lúpus eritematoso agudo disseminado (LEAD). O tratamento de artrite, granulomatose de Wegener e LEAD muitas vezes envolve o uso de terapias imunossupressoras, tais como radiação ionizante, metotrexato e ciclofosfamida. Tais tratamentos tipicamente induzem, quer directamente quer indirectamente, dano no DNA. A inibição de actividade de Chkl no interior das células imunes que se ofendem tornam as células mais sensíveis ao controlo por estes tratamentos padrão. Psoríase e vitiligo comummente são tratados com radiação ultravioleta (UV) em combinação com um psoraleno. Os compostos da presente invenção aumentam o efeito matador dos UV e um psoraleno, e aumentam o índice terapêutico deste regime de tratamento. Em geral, os compostos da presente invenção potenciam o controlo de célula da doença inflamatória quando usados em combinação com drogas imunossupressivas. 0 composto da presente invenção também pode ser usado em métodos de tratamento de outras condições não cancerosas caracterizadas por células que proliferam de modo aberrante. Tais condições incluem, mas sem constituir limitação, aterosclerose, restenose, vasculite, nefrite, retinopatia, doença renal, desordens proliferativas da pele, psoríase, cicatrização quelóide, queratose actínica, síndrome de Stevens-Johnson, osteoporose, doenças hiper-proliferativas do olho incluindo atrofia epitelial, vitre-oeretinopatia proliferativa (VRP), retropatia diabética, doenças hemangio-proliferativas, ictiose e papilomas. 60 ΡΕ1869020

Um método preferido de administração de um inibidor de Chkl da presente invenção é descrito em Keegan et al., pedido PCT N° PCT/US2004/30806, apresentado em 17 de Setembro de 2004, que se baseia no Pedido Provisório nos E.U.A. com o N° de Série 60/503 925, apresentado em 17 de Setembro de 2003, cuja inteira revelação é aqui incorporada por referência. Tais métodos para a inibição da proliferação celular aberrante envolvem a administração calendarizada de um activador de Chkl (e.g., um agente de quimioterapêutica) e um inibidor de Chkl de acordo com a presente invenção. Neste método, pelo menos um activador de Chkl é administrado numa dose e durante um tempo suficiente para induzir substancial sincronização da restrição ou paragem do ciclo celular nas células em proliferação. Ao alcançar a fase de sincronização substancial, pelo menos um inibidor de Chkl é administrado para anular a restrição ou paragem do ciclo celular e induzir morte celular terapêutica. 0 método é útil com qualquer activador de Chkl, e encontra aplicação no tratamento ou prevenção de condições cancerosas e não cancerosas envolvendo proliferação celular aberrante.

Os inibidores do Chkl da presente invenção podem ser administrados ao longo de uma pluralidade de doses. Por exemplo, o inibidor de Chkl pode ser dado numa frequência de: quatro doses entregues na forma de uma dose por dia em intervalos de quatro dias (q4d x 4); quatro doses entregues na forma de uma dose por dia em intervalos de três dias 61 ΡΕ1869020 (q3d x 4); uma dose entregue por dia em intervalos de cinco dias (qd x 5), uma dose por semana durante três semanas (qwk3); cinco doses diárias, com dois dias de descanso, e outras cinco doses diárias (5/2/5); ou, qualquer regime de dose determinado para ser apropriado para a circunstância.

Exemplos Exemplo 1

Determinação de Valores CI50 de Inibidores de Chkl

Chkl cDNA humana foi identificada e clonada conforme previamente descrito em Publicação do Pedido Internacional N° wo 99/11795, apresentado em 4 de Setembro de 1998. Uma etiqueta FLAG foi inserida na moldura com o terminal amino da Chkl de comprimento completo. O «primer» 5' contém um sitio EcoRl, uma sequência Kozak, e também codifica uma etiqueta FLAG para purificação por afinidade usando o anticorpo M2 (Sigma, St. Louis, Mo.). O «primer» 3' contém um sitio Sall. O fragmento amplificado por PCR foi clonado em pCl-Neo como um fragmento EcoRl-SalI (Invitrogen, Carlsbad, Calif.), em seguida subclonado como um fragmento EcoRl-Notl em pFastBacl (Gibco-BRL, Betesda, Md.). Baculovirus recombinante foi preparado conforme descrito no manual Bac-to-Bac de Gibco-BRL manual e usado para infectar células Sf-9 crescidas em meio CCM3 (HyClone Laboratories, Logan, Utah) para expressão de proteína Chkl etiquetada com FLAG .

Chkl etiquetada com FLAG® foi purificada a partir 62 ΡΕ1869020 de péletes congelados de células SF9 infectadas com baculovírus. Péletes de células congeladas foram misturados com um volume igual de tampão de lise 2X contendo Tris-HCl 100 mM pH 7,5, NaCl 200 mM, B-glicerofosfato 50 mM, NaF 25 mM, MgCl2 4 mM, EGTA 0,5 mM, TWEEN®-20 0,2%, vanadato de sódio 2 mM, DTT 2 mM, e a coqueteil de inibidores de protease (Complete mini, Boehringer Mannheim 2000, n° de catálogo 1836170). As células em seguida foram tratadas 20 vezes com o pilão livre de um homogeneizador Dounce e centrifugadas a 48 400xg durante 1 hora. Na afinidade com M2 houve pré-lavagem com 10 volumes de coluna de glicina 50 mM pH 3,5 seguido por Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM alternando três vezes e finalizando com uma lavagem com Tris NaCl. A coluna em seguida foi lavada com 25 volumes de coluna de Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, TWEEN®-20 0, 1%, EGTA 1 mM, EDTA 1 mM e mini comprimidos de protease completos IX. 0 lisado clarificado em seguida foi ligado a resina de afinidade M2 em lote a 4 °C durante 4 h. A mistura de resina e lisado em seguida foi vertida numa coluna e o fluxo recolhido até ao fim. A resina foi lavada com 10 volumes de coluna de Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM e N-octil-glucósido 3 mM. Chkl etiquetada com FLAG em seguida foi eluida da coluna com 6 volumes de coluna de Tris 20 mM pH 7,5 frio, NaCl 150 mM, N-octil-glucósido 3 mM contendo péptido FLAG® mg/mL (Sigma, 2000 Catalog #F-3290). Três fracções foram recolhidas e analisadas à presença de Chkl etiquetada com FLAG. 63 ΡΕ1869020 O ensaio para a actividade da cinase Chkl que inclui 100 ng FLAG -Chkl purificada (150 pmol de ATP/min), péptido Cdc25C 20 pm (H-leu-tyr-arg-ser-pro-ser-met-pro-glu-asn-leu-asn-arg-arg-arg-arg-OH) (SEQ ID NO: 1), ATP 4 μΜ, [32Ρ]γ-ΑΤΡ 2 pCi, Hepes 20 mM pH 7,2, MgCl2 5 mM, NP40 0,1% e DTT 1 mM. As reacções foram iniciadas pela adição de mistura reaccional contendo ATP e realizadas à temperatura ambiente durante 10 min. As reacções foram terminadas pela adição de ácido fosfórico (concentração final de 150 mM) e transferidas para discos de fosfocelulose. Os discos de fosfocelulose foram lavados cinco vezes com ácido fosfórico 150 mM e secos ao ar. Fluido de cintilação foi adicionado e os discos foram contados num contador de cintilação Wallac. O ensaio foi incubado na presença de uma larga gama de concentrações de composto inibidor de Chkl e um valor de Ci5o para o composto foi calculado. Todos os compostos da invenção sujeitos ao ensaio exibiram valores CI50 no ensaio inferiores a cerca de 200 nM.

Exemplo 2 Selectividade

Os inibidores do Chkl da presente invenção foram testados à selectividade, com Chkl como a enzima de comparação e as seguintes proteina-cinases como enzimas comparadoras: Cdc2, Chk2, CTAK, EfAl, EfA2, Erkl, FGFR1, FGFR4, IR, JNKl, c-Kit, p38alfa, p38beta, p38delta, Ros, Rse, Rsk2, TrkA, TrkB, proteina-cinase A, proteína-cinase -64 - ΡΕ1869020 C, pp60v-src, proteína-cinase B/Akt-l, p38MapK, p70S6K, cinase II dependente de cálcio-calmodulina e tirosina-cinase abl. O valor CI50 de um composto versus Chkl foi medido conforme descrito acima. O valor CI50 do composto contra enzima comparadoras foi medido usando a plataforma de tecnologia proprietária SelectSmart™ (MDS Pharma Servies, Botell, Washington, USA) com ou um procedimento ELISA modificado ou polarização de fluorescência. Os inibidores testados mostraram uma selectividade pelo menos de 20 vezes para Chkl sobre as enzimas comparadoras testadas.

Alternativamente, ensaios para a determinação de CI50 para cada uma destas cinases foram previamente descritos na literatura, incluindo a Publicação da Patente dos E.U.A. N° 2002-016521 Al, e PCT/US95/00912, apresentado em 23 de Janeiro de 1995.

Exemplo 3

Ensaio À Base em Células para a Determinação de Valores eCtfs de Inibidores de Chkl A potência à base de células de inibidores do Chkl de acordo com a invenção foi avaliada medindo a capacidade do composto para sensibilizar a linhagem celular de carcinoma humano HT29 a gemcitabina. Um valor médio de 65 ΡΕ1869020 ECtfs foi derivado dos seguintes múltiplos experimentos. Assim, um inibidor de Chkl de acordo com a invenção foi sintetizado por métodos aqui descritos. O composto foi dissolvida em dimetilsulfóxido (DMSO) 100% a uma concentração de estoque 10 mM e guardado a -70 °C. Células HT29 foram obtidas na ATCC e mantidas em meio de crescimento consistindo de RPMI contendo soro bovino fetal (SBF) 10%, pen/strep, glutamina e outros suplementos. Hidrocloreto de gemcitabina foi obtido em Qventas e dissolvido em salina tamponada por fosfato (PBS) a 50 mM e guardado a -20 °C. 3H-timidina foi obtida em Perkin-Elmer. Células HT29 foram colocadas em placas de cultura de células de 96 cavidades (Corning) a uma densidade de l,3xl03 por cavidade e deixadas a aderir ao longo da noite. No dia seguinte, a gemcitabina foi inicialmente diluida 125 vezes, seguido por diluições 5 vezes em Titer Tubes™ (BioRad) de 1,2 mL em meio de crescimento. As concentrações em série da diluição final foram: 11, 20, 4, 0,8, 0,16, 0, 032, 6,4xl0“3, l,28xl0“4 e 5,12xl0~5 >nM. A gemcitabina diluida em seguida foi adicionada às células durante 2 horas. A gemcitabina em seguida foi eliminada por lavagem e o inibidor de Chkl diluído da invenção foi adicionado às células durante 24 horas. A seguir a uma diluição inicial de 1000 vezes em meio de crescimento, um inibidor de Chkl 10 μΜ (estoque de DMSO) de acordo com a invenção foi serialmente diluído 3 vezes em Titer Tubes™ de 1,2 mL, produzindo uma série de diluição final de: 2,5, 0,83, 0,28, 66 ΡΕ1869020 0,09, e 0,03 μΜ. Setenta e duas horas mais tarde, as células em cada cavidade foram rotuladas com 3H-timidina 1 pMCi durante 12 horas, em seguida congeladas a -70 °C. As placas em seguida foram descongeladas e colhidas em placas de filtro de 96 cavidades (Millipore) usando um colhedor de placa Cell Mate™ (Perkin Elmer). Microscint™ 20 (Perkin Elmer) em seguida 30 pL foi adicionado e as placas foram contadas num leitor de placa Top Count (Perkin Elmer). Os dados foram normalizados para células tratadas com o inibidor de Chkl de acordo com a invenção isolado; em seguida representados em gráfico log/log de concentração de gemcitabina (μΜ) contra crescimento celular relativo (100% igualizando 1,0). Múltiplos da sensibilização aumentada a 90% de inibição do crescimento foram derivados para cada concentração de inibidor de Chkl usado, o qual em seguida foi representado em gráfico de concentração de inibidor de Chkl contra múltiplos de sensibilização. O valor ECTfs em seguida foi calculado.

Os inibidores do Chkl da presente invenção que foram sujeitos ao ensaio mediram valores de ECtfs inferiores a cerca de 1000 nM.

Exemplo 4

Inibidores de Chkl da Presente Invenção Aumentam a Morte de Células por Tratamentos de Cancro

Para demonstrar que a inibição de Chkl por um composto da presente invenção sensibiliza células feitas 67 ΡΕ1869020 alvos para o efeito de morte de agentes que danificam o DNA, as células podem ser incubadas na presença de um inibidor de Chkl presente e expostas quer a irradiação quer a agente químico que danifica o DNA. As células colocadas em placas a uma densidade de 1000-2000 por cavidade em placas de microtitulação de 96 cavidades são crescidas em RMPI 1640 contendo FBS 10%, penicilina 100 U/mL e estreptomicina 100 pg/mL durante 18 h a 37 °C num incubador humidificado com CO2 5%. As células testadas podem incluir quaisquer células ou linhagens celulares de interesse, tais como HeLa, ACHN, 786-0, HCT116, HCT15, SW620, HT29, Colo205, SK-MEL-5, SK-MEL-28, A549, H322, OVCAR-3, SK-OV-3, MDA-MB-231, MCF-7, PC-3, HL-60, K562, Bx-PC3, Mia-PaCa2, H810, H226, H2126, e MOLT4. Todas as designações de linhagem celular referem-se às seguintes linhagens celulares humanas: HeLa adenocarcinoma cervical ACHN adenocarcinoma renal 786-0 adenocarcinoma renal HCT116 carcinoma cólon SW620 carcinoma cólon, metástase de nó de linfa HT-29 adenocarcinoma colorrectal Colo205 adenocarcinoma do cólon SK-MEL-5 melanoma SK-MEL-28 melanoma maligno A54 9 carcinoma do pulmão H322 carcinoma broncoalveolar OVCAR-3 adenocarcinoma do ovário 68 ΡΕ1869020 SK-OV-3 adenocarcinoma do ovário MDA-MB-231 adenocarcinoma da mama MCF-7 mama adenocarcinoma PC-3 adenocarcinoma da próstata, da metástase óssea HL-60 leucemia promielocitica aguda K562 leucemia mielogénica crónica

MOLT4 leucemia linfoblástica aguda; linfoblasto T

As células são tratadas com meio contendo drogas quimioterapêuticas isoladas ou drogas quimioterapêuticas e um inibidor de Chkl. As células são incubadas durante aproximadamente 5 dias antes do crescimento ser medido por determinação de niveis de captação de 3H-timidina. As drogas quimioterapêuticas incluem etoposide, doxorrubicina, cisplatina, clorambucil, 5-fluorouracil (5—FU). A concentração de droga necessária para inibir o crescimento celular até 90% de células de controlo não tratadas é definida como a Gigo.

Os compostos da presente invenção podem ser testados com antimetabolitos adicionais, incluindo metotrexato, hidroxiureia, 2-cloroadenosina, fludarabina, azacitidina e gemcitibina para avaliar a sua capacidade para aumentar a morte dos agentes. Os compostos da presente invenção podem ser comparados a um outro pela avaliação da morte aumentada do carcinoma colorrectal HT29 em combinação com gemcitibina.

Em aditamento, a capacidade dos inibidores do 69 ΡΕ1869020

Chkl da invenção para aumentar a morte por radiação pode ser testada.

Exemplo 5

Ensaio Sensível para Medir a Actividade do Inibidor de Chkl em Modelos Animais 0 ensaio sensível seguinte foi desenvolvido para medir a actividade do inibidor de Chkl em modelos de tumor de roedor. Em particular, o ensaio pode ser usado, inter alia, para medir a capacidade de um inibidor de Chkl para bloquear a função da Chkl no modelo de tumor, e para permitir a avaliação de condições que facilitam o acesso do inibidor de Chkl ao alvo molecular. A capacidade de inibidores selectivos da Chkl anularem um checkpoint induzido por quimioterapia é medida usando um ensaio de imunofluorescência quantitativo que mede o índice mitótico por monitorização da fosforilação de histona H3 na serina 10 (H3-P), um evento específico da

mitose (Ajiro et al., J. Biol. Chem., 271 (1996) 13197-201; Goto et al., J. Biol. Chem., 274 (1999) 25543-9. O protocolo do ensaio é como segue. Tumores de roedores tratados ou não tratados com activador de Chkl (no estudo presente, o agente de quimioterapia) e/ou inibidor de Chkl, são excisados e embebidos em parafina. Os tumores são cortados em lâminas de 6 micrómetros de espessura e montadas sobre lamelas de vidro. A parafina é removida das lamelas por tratamentos sucessivos de 3 minutos com xileno, 70 ΡΕ1869020 etanol 100%, etanol 95%, etanol 70% água e desionizada. As lamelas são em seguida aquecidas a 95 °C em citrato de sódio 10 mM durante 10 min seguido por um passo de

arrefecimento de 20 minutos. As lamelas são bloqueadas durante 30 min com tampão de bloqueamento (soro humano normal 20% e albumina de soro bovino 2% em salina tamponada por fosfato contendo Triton X-100 0,05% (PBST)). O anticorpo antifosfo-histona H3 (Upstate Biotech, Cat. #06-570) é diluido 1:200 no tampão bloqueante e incubado com as lamelas durante uma hora. As lamelas são lavadas 3 vezes durante 5 min em PBST. O anticorpo secundário, rodamina anticoelho de burro (Jackson, cat #711-295-152) é adicionado durante 30 min. As lamelas são em seguida lavadas duas vezes em PBST e 75 μΜ de DAPI 0,1 μΜ/mL (Sigma) em salina tamponada por fosfato (PBS) é adicionado e deixado a corar durante 30 min. As lamelas são em seguida lavadas mais duas vezes em PBST e montadas com Vectashield (Vector, cat #H-1400). As lamelas são visionadas usando microscopia de fluorescência. A percentagem de células coradas com anticorpo H3-P relativamente ao total de células (coradas em DAPI) são quantificadas usando software Metamorf (Universal Imaging Corporation, Versão 4.6).

Exemplo 6

Inibidores Selectivos de Chkl Anulam Checkpoints da Fase G2 e S Induzidos por Dano no dna

Estudos prévios demonstraram que inibidores selectivos de Chkl anulam substancialmente checkpoints da 71 ΡΕ1869020 fase G2/M e S induzidos por dano no DNA. No inicio, o dano no DNA é induzido por radiação ionizante (RI), cuja fase alvo é a fase G2. Por último, o dano no DNA é induzido por agentes quimioterapêuticos cuja fase alvo é a fase S. Ver Publicação do Pedido de Patente dos E.U.A. 2003/0069284 e referências ai citadas.

Brevemente, o anulamento por inibidor de Chkl do checkpoint de dano do DNA G2 induzido por RI é avaliado por experimentos de índice mitótico. Aproximadamente lxlO6 células HeLa são irradiadas com 800 rads e incubadas durante 7 h a 37 °C. Devido a estas células serem funcionalmente p53 negativas, elas são paradas exclusivamente em G2. Nocodazole em seguida é adicionado a uma concentração de 0,5 pg/mL e incubadas durante 15 h a 37 °C (a adição de nocodazole é desenhada para aprisionar células que progridem através da restrição ou paragem em G2 na mitose evitando por conseguinte a sua progressão para G1 e permitindo a quantificação de células da fase M). Um inibidor selectivo de Chkl é adicionado durante 8 h, e as células são colhidas por centrifugação, lavadas uma vez com PBS, em seguida ressuspensas em 2,5 mL de KC1 75 mM e centrifugadas outra vez. As células são em seguida fixadas em 3 mL de ácido acético:MeOH (1:3) recentemente preparado frio e incubadas sobre gelo durante 20 min. As células são peletizadas, a solução de fixação é aspirada e as células são ressuspensas em 0,5 mL de PBS. Os espalhamentos mitóticos são preparados por pipetagem de 100 pL de células 72 ΡΕ1869020 fixadas para uma lamela de vidro de microscópio e inundando a amostra com 1 mL de solução fixadora. As lamelas são em seguida secas ao ar, coradas com corante Wrights (Sigma, St. Louis, Mo.) durante 1 minuto, seguido por uma lavagem em água e uma lavagem em MeOH 50%. A presença de cromossomas condensados e a falta de envelope nuclear identificou células mitóticas. Os inibidores do Chkl resultam num aumento no número de células mitóticas na presença de irradiação, por conseguinte demonstrando o anulamento da restrição em G2 induzida por RI. Este anulamento do checkpoint resulta num aumento na actividade de ciclina B/cdc2, que é requerida para a progressão de células para a mitose. As células tratadas com RI seguido por inibidor de Chkl por conseguinte progridem para a mitose com DNA danificado. Estes experimentos confirmam a hipótese de que Chkl está envolvido na G2 induzida por RI.

Exemplo 7

Inibidor de Chkl é Captado por Células de Tumor na Presença de Activador de Chkl num Modelo de Tumor de Xenoenxerto

Num modelo de tumor de xenoenxerto, ratos nus (ou nude) são enxertados com tumores de carcinoma do cólon HT29 no flanco e deixados crescer até 200 mm3. Os ratos são em seguida tratados com ou veiculo, 300 mg/kg de inibidor de Chkl, 20 mg/kg de gemcitabina ou co-administrado com 300 mg/kg de inibidor de Chkl e 20 mg/kg de gemcitabina duas vezes, três dias de intervalo nos Dias 1 e 4. O 73 ΡΕ1869020 tratamento de ratos suportando tumor por co-administração de inibidor de Chkl e gemcitabina resulta num atraso de crescimento de quatro dias nos tumores comparando com a gemcitabina isolada.

Para avaliar a difusão de inibidores do Chkl no tecido do tumor, são medidos os niveis no plasma e tecido. Usando uma bomba de Alzet, inibidor de Chkl 500 mg/kg é administrado a ratos suportando tumor HT29 num sistema de entrega continua ao longo de um período de 24 horas. São tomadas amostras de tumor, em seguida são colhidos tumores, rim, fígado, baço e pulmão. Os momentos são considerados às 1, 2, 4, 8 e 24 h. Os tecidos são extraídos e os níveis de inibidor de Chkl são quantificados. Este experimento demonstra que um inibidor de Chkl que penetra no interior de tecido normal e de tumor, alcança um nível de cerca de 15 μΜ no tecido de tumor, e níveis de pico no baço às 8 h cerca de 20 μΜ. Por conseguinte, os inibidores do Chkl foram prontamente captados pelas células proliferantes e são úteis, em conjunção com agentes quimioterapêuticos de activação de Chkl, como terapias para o tratamento de doenças proliferativas.

Exemplo 8

Resposta à Dose de Tumores Tratados com Inibidores de Chkl e Gemcitabina

Para determinar uma dose eficaz de inibidor de Chkl a seguir a tratamento com gemcitabina e se o 74 ΡΕ1869020 anulamento do checkpoint dependente da dose se correlaciona com a actividade antitumor, um experimento de resposta à dose é realizado.

Ratos nus são enxertados com células de tumor HT29 e os tumores são deixados a desenvolver durante 10 dias. Os tumores no inicio eram aproximadamente de 100 mm3. Os animais foram tratados com gemcitabina na DMT (160 mg/kg) seguido por inibidor de Chkl a 50 mg/kg, 200 mg/kg ou 400 mg/kg. O tempo de pré-tratamento com gemcitabina é 32 h neste experimento conforme determinado por um ensaio à base de células que indicou este intervalo como óptimo para este tipo de tumor. A análise do volume de tumor em cada regime de tratamento indicou que o tratamento de ratos suportando o tumor HT29 com a terapia descrita abranda o crescimento do tumor mais do que com a gemcitabina isolada, com inibidor de Chkl quer a 200 mg/kg quer a 400 mg/kg mais gemcitabina de novo mostrando efeitos dependentes da dose do inibidor de Chkl.

Exemplo 9

Ensaio para Determinar Se um Agente é um Activador de Chkl

Para determinar se um agente é um activador de Chkl, o estado de fosforilação de Chkl pode ser medido usando anticorpos fosfo-especificos para sítios de fosforilação específicos na Chkl. Serinas 317 e 345 têm sido mostradas a ser fosforiladas após tratamento de células com radiação ionizante, radiação ultravioleta, 75 ΡΕ1869020 hidroxiureia, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), temozolamida e gemcitabina. Liu et al., Genos Dev., 14 (2000) 1448-1459; Zhao et al., Mol. Cell Blol., 21 (2001) 4129-4139; Lopez-Girona et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 98 (2001) 11289-11294; Guo et al., Genos Dev., 14 (2000) 2745-2756; Gatei et al., J. Biol. Chem., 278 (2003) 14806-14811; Ng et al., J. Biol. Chem., 279 (10) (2004) 8808-19; Wang et al., Natl. Acad. Sei. USA, 100(26) (2003) 15387-92; Stojic et al., Genos Dev., 18(11) (2004) 1331-44.

Estes sítios de serina são fosforilados por cinases do checkpoint a montante, Atm e Atr. Liu et al., Genos Dev., 14 (2000) 1448-1459; Zhao et al., Mol. Cell. Biol., 21 (2001) 4129-4139. A fosforilação destes sítios em resposta a um activador de Chkl candidato pode ser monitorizada por Western blot ou imuno-histoquímica de células de tumor. Por exemplo, o seguinte procedimento pode ser usado para demonstrar que gemcitabina resulta na activação de Chkl em serina 345 e 317. As células HT29 são tratadas com gemcitabina 20 μΜ durante duas horas. A gemcitabina é eliminada por lavagem do meio de crescimento celular e as células são incubadas durante 22 h adicionais. Os lisados de proteína são preparados e separados por SDS-electro-forese em gel de poliacrilamida. As proteínas são transferidas para membranas de PVDF e sondadas com anti-soro (Cell Signalling) específico para serina fosforilada 317 ou 345 (Cell Signalling). Western blots mostram que o 76 ΡΕ1869020 tratamento com gemcitabina de células de carcinoma do cólon HT29 resulta na fosforilação de ambas as serinas 317 e 345.

Exemplo 10

Ensaio para Monitorizar a Actividade de Chkl em Resposta a um Inibidor de Chkl

Foi encontrado que a fosforilação de Chkl em serina 296 é estimulada por tratamento de células de tumor com gemcitabina, e que a fosforilação neste sítio é inibida por inibidores da Chkl. A fosforilação neste sítio não é inibida por wortmanina, a qual inibe Atm e Atr. Por conseguinte, a fosforilação de serina 296 é distinta da fosforilação em serinas 317 e 345. Em aditamento, foi encontrado que este sítio é fosforilado em preparações de Chkl purificadas, sugerindo que a enzima purificada é capaz de se fosforilar a si própria ou outras moléculas Chkl em serina 296. Tomados em conjunto, estes dados sugerem que a fosforilação em serina 296 é realizada pela própria Chkl. Por conseguinte, esta aproximação pode ser usada para monitorizar a actividade de Chkl em tumores em resposta a activadores da Chkl. Além disso, esta aproximação pode ser usada para medir a inibição a activação de Chkl por inibidores da Chkl.

Exemplo 11

Modelos de Tumor Animal

Para testar a capacidade dos inibidores de Chkl da invenção aumentarem a morte de tumores por agentes que 77 ΡΕ1869020 danificam o DNA em ratos, são estabelecidos modelos de tumor de xenoenxertos usando linhagem celulares de tumor do cólon. 5-Fluorouracil (5-FU) ou gemcitabina podem ser usados como agentes que danificam o DNA. Células HT29 e Colo205 (carcinoma do cólon humano) e H460 e Calu-6 (carcinoma de não pequena célula) podem ser usadas para propagar tumores de xenoenxerto em ratos Balb/c (nu/nu) timicos fêmeas de 6-8 semanas de idade. Os ratos são mantidos num gabinete de fluxo de ar laminar sob condições livres de patógenos e alimentados com comida estéril e água ad libitum. As linhagens celulares são crescidas até à subconfluência em meio RPMI 1640 suplementado com FBS 10%, penicilina 100 U/mL, estreptomicina 100 pg/mL e L-glutamina 1,5 mM num ambiente humidificado de C02 5%. Suspensões de célula única são preparadas em CMF-PBS, e a concentração celular é ajustada para lxlO8 células/mL. Os ratos são inoculados subcutaneamente (s.c.) no flanco direito ou perna direita com um total de lxlO7 células (100 pL) .

Os ratos são aleatorizados (5-15 ratos/grupo) em quatro grupos de tratamento e usados quando os tumores alcançam um volume de 75-100 cm3 (usualmente 7-11 dias pós--inoculação). Os tumores são medidos com craveiras e os volumes dos tumores são estimados usando a fórmula derivada empiricamente: volume de tumor (cm3) = comprimento do tumor (cm) x largura do tumor (cm) x profundidade do tumor (cm) / 3,3. O tratamento consiste em i) injecção intraperitoneal (i.p.) de 100 pL de gemcitabina a 160 mg/kg. Um atraso no crescimento do tumor é observado nos ratos tratados com 78 ΡΕ1869020 gemcitabina. O tratamento de ratos com ambos 160 mg/kg de gemcitabina em combinação com administração oral de inibidores da Chkl é esperado reduzir os volumes de tumor e prolongar a vida. O tamanho do tumor é monitorizado em todos os outros dias durante a duração do experimento.

Lisboa, 17 de Dezembro de 2010

Claims (5)

1. ΡΕ1869020 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um composto que é 1-[5-bromo-4-metil-2-S-(morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-ureia ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
2. 2. Uma composição farmacêutica compreendendo o composto de acordo com a Reivindicação 1, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, e um diluente ou agente de suporte farmaceuticamente aceitável.
3. 3. Um composto de acordo com a Reivindicação 1, ou um seu sal f armaceuticamente aceitável, para uso em terapia.
4. 4. Um composto de acordo com a Reivindicação 1, ou um seu sal f armaceuticamente aceitável, para uso no tratamento de um cancro colorrectal, um cancro da cabeça e pescoço, um cancro pancreático, um cancro da mama, um cancro gástrico, um cancro da bexiga, um cancro vulvar, uma leucemia, um linfoma, um melanoma, um carcinoma da célula renal, um cancro do ovário, um cancro do cérebro, um osteossarcoma ou um cancro do pulmão.
5. 5. Uso de um composto de acordo com a Reivindicação 1, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, no fabrico de um medicamento para o tratamento de um cancro colorrectal, um cancro da cabeça e pescoço, um cancro pan- 2 ΡΕ1869020 creático, um cancro da mama, um cancro gástrico, um cancro da bexiga, um cancro vulvar, uma leucemia, um linfoma, um melanoma, um carcinoma da célula renal, um cancro do ovário, um cancro do cérebro, um osteossarcoma ou um cancro do pulmão. Lisboa, 17 de Dezembro de 2010 1 ΡΕ1869020 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição WO 0218328 A !JS84ã5566:B WO 8153274 A WO 8153288 A WO 82878515 A WO 9917768 A WO §853058 A WO 82051838 A W0 2DÕ4S631S6A WO 2904648343 A WO 2804014876 A WO 2S0339125S  US20843S88SW US 50382503 P WO 9311705 A USS302G1&S21 AI 059578912 W US 23830088234 A GSS2181S3S US6S7715 US 58-306© P US88SS5292P US6QS02368P 0620048054785 A US2SS319SS11 A WO 031Q1444 A WO 03S23241 A WO 03828731 A \mwmmh WO 015728® A US 8211184 B WO 0018781 A WO 03037886 A WO 0307373? A WO 83004488 A US 28840082535 A WO 04818413 A Literatura que não e de patentes citada na Descrição * MartweH ei «L Sdene1 1989, sol 246, 623-634 * Waífssd ei at. Oefies 01v,, 1934, sal. 8,552 * Siíí «£ ai CmosrRest, 2061, voi, 65, 1885-5&72 » Cair. Scie/κ», 1938, vai 271. 514-255 * Ates «S ai Genes Os··'.., 1984, «si. 8. 2456-2468 * HattweB st aL Soeaae 1984, ·«& 265. 1821-28 » Wsínbeig, Ceit 1935, sol. 81,323-330 * Lsvifis. Cat 1:807, sal 66,3234-331 * Bunxet aL Scàmos, 1 986, sai 262,5497-5Q1 * Gesaer. AOssací ai SR# Cmésmtae: Pmidn Pisas- Dfng Q&o&my »»f Stmrti Msícb 2933 * SandMtz st sí, ScteK», 1S37, vci277,1497-5501 » Las si aí. Gases S»v., 2860, vsi. 14. 1446-1459 * CftenataL Qiccsgsiff, 1993,^:4 18,243-256 * ÍTConi»» si si BmOJ„ 1837, vsi 16, 545-554 * Feíjos ei ai J. Ceí SM, 2031. vcã 154. 313-323 « Zftaoei a), PM4S USA. 2632, vai 99 14735-600 * Xiaa et si. J Bid Cmir,... 2803. voL 276 {241, 25787-21773 * Sorsiissn et ei CasseerCstè, 2083, vdí '3 j3>. 247-58 * Famsiy etsí. Sãsrase, 5997, sai 277,1435-7 * tfaUttof» et ai. Sdenee. 1836, sal. 282,1633-1697 * Btasiea at st. Cmz SM, í§88, vsl. 9,1-16 * Tesasr st et, Ciw: me G,tefa AnSCancg? Agem, 2303, vai. 3, 65-46 * Miros«ei^OafíoeiRgs.,2Q01,vGÍS1,5643-5S^ * Oíantei si O&g SesMasea Vçdtoíes. 2303, vai. 8, 15-28 * Maek «t al, €smer Qfsemc&isr, PtsamaBot., 2003, ¥0L 51 Ηϊ< 337-348 * Andieasssn ei aí. ProcNaiiÁcadãáLISA, 1332, vai 66,2272-2276 * Bracey st aí, Om, Cssmr 8s&., 1997, vâL 3, 1371-1381 * ¥to«tal. Skk&bbj, S<£^Wí's Rss, Ccmmxs.. 2382, «si 295,435-44 1 Saflctezei aL Ss®x», 5383, vel286,1168-1171 2 ΡΕ1869020 * Fa» et ai Câncer 1δ§5,*Ά5§> 194S-54 * SeMíi si ai, J. Sdsd. Osont, 1838, vsi, 280S-281 * Sediacek si ai MJ. OactX., 19S&. vsf. 9, 1 143-1 18S * Z, Ma et aS, Tetrafoeâma: Asymne&y:. 19&7, vol S (€}, 883-SS8 * Braíífey m sL CSí). Cmcer Res., 2501 < ¥DÍ. 7, 3229 * Ajiro st A JSiai Chem., 1986, và 2? 113137-281 * fiais st: si J SM Ctosm, 1S88, ®jt 274, 2SS434J * Lísí et ai s3«tss ©ei?., 2800, vd. 14, 1443-1458 * Zhas et ai AM Ce? SM, 220¾. vA 21.4128-4138 * Lepesafiirona st ai P®& fM·. Acsú. Sa. íi, S, A,, 2MVvAS5, 112S§-1:1294 * 6«o et ai Gexes Dev., 7S. vsi 14, 2745-27® * Sstsi et ai, I SM, Chasi, 203$. vA 278, 14885-14311 * Mg st ai. J Sís? Citem* 2004, v<â. 279 i, 1:01,88SS-18 » Waag «t ai, Ívaií'Ttessí S& V S A, 2003, v«i:, 100 :72:81,15387-92 * SiBjíC St 31, ©esses Dev,< 2004,VOS. 18(11), 1331-44