KR20090029814A - 메갈린 활성의 조절을 통한 안질환의 치료 방법 및 조성물 - Google Patents

Abstract

가역적 야맹증을 초래하는 화합물은 시각 주기의 경로가 진행되는 동안 축적되는 폐기 산물의 과생성과 연관된 안구 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 황반 변성 및 이영양증을 치료하거나 그러한 안구 질환된 연관된 증상을 경감시키기 위해 상기 화합물 및 이들의 유도체를 사용하는 방법 및 조성물이 제공된다. 그러한 화합물 및 이들의 유도체는 단독 작용제 요법으로 사용되거나 기타 작용제 또는 요법과 조합되어 사용될 수 있다.

Description

메갈린 활성의 조절을 통한 안질환의 치료 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING OPHTHALMIC CONDITIONS VIA MODULATION OF MEGALIN ACTIVITY}

상호 참조

본원은 2006년 6월 22일에 출원된, 미국 가특허 출원 제 60/805,586호에 대한 우선권을 주장하며, 상기 특허 문헌의 전체내용은 참고문헌으로서 본원에 포함된다.

발명의 배경

척추동물 망막은 2가지 형태의 광수용체 세포, 간상세포(rods)와 원추세포(cones)를 포함하고 있다. 간상세포는 낮은 강도의 빛 조건하에서 시각(vision)과 관련하여 예민해진다. 원추세포는 덜 민감하며, 매우 일시적이고 공간적 분해능으로 시각을 제공하며, 색 인지를 가능하게 한다. 일광 조건하에서, 간상세포 반응은 포화되고 시각은 원추세포에 의해 전체적으로 조절된다. 두 가지 세포 유형은 여러 겹으로 싸인 막성판(membranous discs)을 포함하는 외절(outer segment)로 불리는 구조를 포함하고 있다. 시각 전달(Visual transduction) 반응은 이러한 판의 표면에서 일어난다. 시각에서 제 1단계는 옵신-색소 분자(로돕신)에 의한 광자의 흡수인데, 발색단의 11-시스에서 올-트랜스로의 이성질화를 포함한다. 광 민 감도가 회복될 수 있기 전에, 결과적으로 생성된 올-트랜스-레티날은 망막에 인접한 세포들의 단일 층인, 망막 색소 상피(RPE)에서 일어나는 다-효소 과정에서 11-시스-레티날로 다시 전환되어야만 한다.

현재까지, 안구 질환에 대한 치료 옵션은 제한되어 있는데, 특히 망막 및/또는 황반(macula)과 관련된 안구 질환의 경우에 그러하다.

발명의 요약

포유동물의 눈 안의 망막 및/또는 망막 색소 상피 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성을 조절하는 유효량의 작용제(agenst)를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물의 눈에서 안질환을 치료하기 위한 방법 및 조성물이 개시된다.

한 구체예에서, 눈 안의 상기 망막 및/또는 망막 색소 상피 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원은 메갈린, 메갈린-관련 단백질, LRP, 또는 LRP-관련 단백질이다. 또 다른 구체예에서, 눈 안의 상기 망막 및/또는 망막 색소 상피 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원은 메갈린, 또는 메갈린-관련 단백질이다. 추가 구체예에서, 눈 안의 상기 망막 및/또는 망막 색소 상피 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원은 메갈린이다. 추가 구체예에서, 눈 안의 상기 망막 및/또는 망막 색소 상피 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원은 LRP, 또는 LRP-관련 단백질이다. 추가 구체예에서, 눈 안의 상기 망막 및/또는 망막 색소 상피 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원은 LRP이다. 한 구체예에서, 눈 안의 상기 망막 및/또는 망막 색소 상피 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원은 메갈린-관련 단백질이다. 추가 구체예에서, 눈 안의 상기 망막 및/또는 망막 색소 상피 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원은 LRP-관련 단백질이다. 또 다른 구체예에서, 눈 안의 상기 망막 및/또는 망막 색소 상피 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원은 도 3에 나열된 펩티드 서열을 포함하는 단백질이다.

한 구체예에서, 포유동물의 눈 안의 상기 망막 및/또는 망막 색소 상피 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원은 레티노이드 결합 단백질 수용체이다. 또 다른 구체예에서, 포유동물의 눈 안의 상기 망막 및/또는 망막 색소 상피 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원은 RBP 및/또는 IRBP 수용체이다. 또 다른 구체예에서, 포유동물의 눈 안의 상기 망막 및/또는 망막 색소 상피 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원은 STRA6 또는 STRA6-관련 단백질이다. 또 다른 구체예에서, 포유동물의 눈 안의 상기 망막 및/또는 망막 색소 상피 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원은 STRA6이다. 또 다른 구체예에서, 포유동물의 눈 안의 상기 망막 및/또는 망막 색소 상피 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원은 STRA6-관련 단백질이다.

LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원은 눈 안의 RPE 세포의 하부막(basal membrane)과 상부막(apical membrane) 상에 존재한다. 몇몇 구체예에서, RPE 세포의 하부막 상의 수용체는 눈 안의 RPE 세포의 상부막 상의 수용체와 동일하지 않다. 몇몇 구체예에서, RPE 세포의 하부막 상의 수용체는 RPE 세포의 상부막 상의 수용체와 동일하다. 몇몇 구체예에서, 작용제는 눈 안의 RPE 세포의 하부막 상의 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성을 변화시킨다. 몇몇 구체예에서, 작용제는 RPE 세포의 상부막 상의 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성을 변화시킨다. 몇몇 구체예에서, 작용제는 RPE 세포의 하부막 상의 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성을 변화시키고 RPE 세포의 상부막 상의 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성을 변화시키지 아니한다. 몇몇 구체예에서, 작용제는 RPE 세포의 하부막 상의 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성을 변화시키고 RPE 세포의 상부막 상의 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성을 변화시킨다.

몇몇 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 비타민-결합 단백질, 지질 단백질, 면역- 및 스트레스-관련 단백질, 스테로이드 호르몬 결합 단백질, 호르몬 및 전구체, 펩티드, 효소 및 효소 억제자, 알부민, 락토페린, 헤모글로빈, 후각자극물질-결합 단백질, 트랜스씨레틴; 약물 및 독소, RAP, 칼슘(Ca²⁺), 또는 시토크롬 c에 대한 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 결합이다.

몇몇 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 비타민-결합 단백질, 운반 단백질, 지질 단백질, 면역- 및 스트레스-관련 단백질, 스테로이드 호르몬 결합 단백질, 호르몬 및 전구체, 펩티드, 효소 및 효소 억제자, 알부민, 락토페린, 헤모글로빈, 후각자극물질-결합 단백질, 트랜스씨레틴; 약물 및 독소, RAP, 칼슘 (Ca²⁺), 또는 시토크롬 c에 대한 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 결합이다.

몇몇 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 비타민-결합 단백질, 지질 단백질, 면역- 및 스트레스-관련 단백질, 스테로이드 호르몬 결합 단백질, 호르몬 및 전구체, 펩티드, 효소 및 효소 억제자, 알부민, 락토페린, 헤모글로빈, 후각자극물질-결합 단백질, 트랜스씨레틴; 다염기성 약물 및 독소, RAP, 칼슘(Ca²⁺), 또는 시토크롬 c에 대한 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 결합이다.

한 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 레티놀, 레티날, 레티놀-RBP 복합체, 레티놀-RBP-TTR 복합체, 광수용체간 레티노이드 결합 단백질(IRBP), 레티놀-IRBP 복합체, 레티날-IRBP 복합체, 트랜스코발라민-비타민 B12, 트랜스코발라민-비타민 B12 결합 단백질, 비타민-D-결합 단백질, 아포리포단백질 B, 아포리포단백질 E, 아포리포단백질 J/클러스테린, 아포리포단백질 H; 면역글로불린 경쇄, PAP-1, β2-마이크로글로불린; 성 호르몬 결합 단백질-에스트로겐, 안드로겐 결합 단백질-안드로겐; 부갑상선 호르몬, 인슐린, 표피 성장 인자, 프로락틴, 씨로글로불린; 플라스미노겐 활성인자억제자-1(PAI-1), 유로키나아제-PAI-1, tPA-PAI-1, 프로-유로키나아제, 리포프로테인 리파아제, 플라스미노겐, β-아밀라아제, β1-마이크로글로불린, 리소자임; 알부민, 락토페린, 헤모글로빈, 후각자극물질-결합 단백질, 트랜스씨레틴; 아미노글리코시드, 폴리믹신 B, 아프로티닌, 트리코산틴, 젠타마이신; RAP, Ca²⁺, 또는 시토크롬 c에 대한 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 결합이다.

한 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 약물 및 독소에 대한 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 결합이다. 한 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 다염기성 약물 및 독소에 대한 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 결합이다. 또 다른 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 양이온성 약물 및 독소에 대한 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 결합이다. 또 다른 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 양이온성 아민 약물 및 독소에 대한 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 결합이다. 한 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 항균제(antibacterials), 항정신병제, 항우울제, 항부정맥제, 항협심증제, 식욕감퇴제, 또는 콜레스테롤 저하제에 대한 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 결합이다.

한 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 아미노글리코시드 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 결합이다. 또 다른 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 아베카신, 젠타마이신, 카나마이신, 네오마이신, 파라마이신, 리보스타마이신, 리비도마이신, 아미카신, 디베카신, 부타카신, 토브라마이신, 스트렙토마이신, 디히드로스트롭토마이신(dihydrostroptomycin), 시소미신(sisomicin), 베르다미신, 네틸미신, 또는 부티카신에 대한 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 결합이다. 또 다른 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 아베카신, 젠타마이신, 또는 카나마이신에 대한 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 결합이다. 또 다른 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 젠타마이신에 대한 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 결합이다.

또 다른 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 항말라리아제, 항생 약물, 항결핵 약물, 항진균 약물, CNS 약물, 심혈관 약물, 항신생물 약물, 피부(dermatological) 약물, 항염증 약물, 면역조절 약물, 경구 피임제, 부갑상선 호르몬, 데페록사민(deferoxamine), 니아신, 와파린(warfarin), 또는 교감신경흥분(sympathomimetic) 약물에 대한 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 결합이다.

또 다른 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 클로로퀸, 퀴닌, 아미노글리코시드, 스파르소마이신, 클리오퀴놀, 에탐부톨, 미코나졸, 페노티아진, 클로르프로마진, 아미트리프탈린, 리세르지드(lysergide), 니페디핀, 아미오다론, 5-플루오로우라실, 타목시펜, 카무스틴, 클로람부실, 시스-플래티늄(cis-platinum), 마이토테인, 니트로겐 머스타드, 니트로소 우레아, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 독소루비신, 에트레티네이트, 칸타크산틴, 이소트레티노인, 코르티코스테로이드, 이부프로펜, 인도메타신, 페닐부타존, 틸로론(항바이러스) 알파 인터페론, 경구 피임제, 클로미펜, 데페록사민, 니아신, 와파린, 디피베프린, 페닐에프린, 또는 에피네프린에 대한 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 결합이다.

또 다른 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 비타민-결합 단백질에 대한 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 결합이다. 또 다른 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 레티노이드 결합 단백질에 대한 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 결합이다. 추가 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 레티놀, RBP, 레티놀-RBP 복합체, 레티놀-RBP-TTR 복합체, IRBP, 또는 레티놀-IRBP 복합체에 대한 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 결합이다. 추가 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 레티놀, 레티놀-RBP 복합체, 또는 레티놀-RBP-TTR 복합체에 대한 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 결합이다. 추가 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 IRBP 또는 레티놀-IRBP 복합체에 대한 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 결합이다. 추가 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 IRBP, 레티놀-IRBP 복합체, 또는 레티날-IRBP 복합체에 대한 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 결합이다.

한 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 비타민-결합 단백질, 지질단백질, 면역- 및 스트레스-관련 단백질, 스테로이드 호르몬 결합 단백질, 호르몬 및 전구체, 펩티드, 효소 및 효소 억제자, 알부민, 락토페린, 헤모글로빈, 후각자극물질-결합 단백질, 트랜스씨레틴; 약물 및 독소, RAP, 칼슘 (Ca²⁺), 또는 시토크롬 c의 트랜스시토시스(transcytosis)이다.

한 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 비타민-결합 단백질, 지질단백질, 면역- 및 스트레스-관련 단백질, 스테로이드 호르몬 결합 단백질, 호르몬 및 전구체, 펩티드, 효소 및 효소 억제자, 알부민, 락토페린, 헤모글로빈, 후각자극물질-결합 단백질, 트랜스씨레틴; 다염기성 약물 및 독소, RAP, 칼슘(Ca²⁺), 또는 시토크롬 c의 트랜스시토시스이다.

또 다른 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 레티놀, 레티놀-RBP 복합체, 레티놀-RBP-TTR 복합체, 광수용체간 레티노이드 결합 단백질(IRBP), 레티놀-IRBP 복합체, 트랜스코발라민-비타민 B12, 트랜스코발라민-비타민 B12 결합 단백질, 비타민-D-결합 단백질, 아포리포단백질 B, 아포리포단백질 E, 아포리포단백질 J/클러스테린, 아포리포단백질 H; 면역글로불린 경쇄, PAP-1, β2-마이크로글로불린; 성 호르몬 결합 단백질-에스트로겐, 안드로겐 결합 단백질-안드로겐; 부갑상선 호르몬, 인슐린, 표피 성장 인자, 프로락틴, 씨로글로불린; 플라스미노겐 활성인자억제자-1(PAI-1), 유로키나아제-PAI-1, tPA-PAI-1, 프로-유로키나아제, 리포프로테인 리파아제, 플라스미노겐, β-아밀라아제, β1-마이크로글로불린, 리소자임; 알부민, 락토페린, 헤모글로빈, 후각자극물질-결합 단백질, 트랜스씨레틴; 아미노글리코시드, 폴리믹신 B, 아프로티닌, 트리코산틴, 젠타마이신; RAP, Ca²⁺, 또는 시토크롬 c의 트랜스시토시스이다.

한 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 약물 및 독소의 트랜스시토시스이다. 한 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 다염기성 약물 및 독소의 트랜스시토시스이다. 또 다른 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 양이온성 약물 및 독소의 트랜스시토시스이다. 또 다른 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 양이온성 아민 약물 및 독소의 트랜스시토시스이다. 한 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 항균제, 항정신병제, 항우울제, 항부정맥제, 항협심증제, 식욕감퇴제, 또는 콜레스테롤 저하제의 트랜스시토시스이다.

한 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 아미노글리코시드의 트랜스시토시스이다. 또 다른 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 아베카신, 젠타마이신, 카나마이신, 네오마이신, 파라마이신, 리보스타마이신, 리비도마이신, 아미카신, 디베카신, 부타카신, 토브라마이신, 스트렙토마이신, 디히드로스트롭토마이신, 시소미신, 베르다미신, 네틸미신, 또는 부티카신의 트랜스시토시스이다. 또 다른 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 아베카신, 젠타마이신, 또는 카나마이신의 트랜스시토시스이다. 또 다른 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 젠타마이신의 트랜스시토시스이다.

또 다른 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 항말라리아제, 항생 약물, 항결핵 약물, 항진균 약물, CNS 약물, 심혈관 약물, 항신생물 약물, 피부 약물, 항염증 약물, 면역조절 약물, 경구 피임제, 부갑상선 호르몬, 데페록사민, 니아신, 와파린, 또는 교감신경흥분 약물의 트랜스시토시스이다. 또 다른 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 항생 약물의 트랜스시토시스이다.

또 다른 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 클로로퀸, 퀴닌, 아미노글리코시드, 스파르소마이신, 클리오퀴놀, 에탐부톨, 미코나졸, 페노티아진, 클로르프로마진, 아미트리프탈린, 리세르지드, 니페디핀, 아미오다론, 5-플루오로우라실, 타목시펜, 카무스틴, 클로람부실, 시스-플래티늄, 마이토테인, 니트로겐 머스타드, 니트로소 우레아, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 독소루비신, 에트레티네이트, 칸타크산틴, 이소트레티노인, 코르티코스테로이드, 이부프로펜, 인도메타신, 페닐부타존, 틸로론(항바이러스) 알파 인터페론, 경구 피임제, 클로미펜, 데페록사민, 니아신, 와파린, 디피베프린, 페닐에프린, 또는 에피네프린의 트랜스시토시스이다.

한 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 레티놀, 레티놀-RBP 복합체, 레티놀-RBP-TTR 복합체, 또는 레티놀-IRBP 복합체의 트랜스시토시스이다.

한 구체예에서, 상기 트랜스시토시스는 엑소시토시스(exocytosis)이다. 또 다른 구체예에서, 상기 트랜스시토시스는 엔도시토시스(endocytosis)이다.

또 다른 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 레티놀, 레티놀-RBP 복합체, 레티놀-RBP-TTR 복합체, 또는 레티놀-IRBP 복합체를 상피를 통과하여 적어도 하나의 망막 색소 상피 세포로 운반하는 것이다.

한 구체예에서, 상기 작용제는 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성을 증가시킨다. 또 다른 구체예에서, 상기 작용제는 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성을 감소시킨다.

한 구체예에서, 상기 작용제는 망막 색소 상피 세포의 하부막 상의 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 결합한다. 또 다른 구체예에서, 상기 작용제는 망막 색소 상피 세포의 상부막 상의 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 결합한다.

한 구체예에서, 상기 작용제는 레티놀-결합 단백질에 결합한다. 또 다른 구체예에서, 상기 작용제는 트랜스씨레틴에 결합한다. 또 다른 구체예에서, 상기 작용제는 광수용체간 레티노이드 결합 단백질(IRBP)에 결합한다.

한 구체예에서, 상기 작용제는 망막 및/또는 망막 색소 상피 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 발현을 변화시킨다. 다른 구체예들에서, 상기 작용제는 망막 및/또는 망막 색소 상피 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 발현을 감소시킨다. 다른 구체예들에서, 상기 작용제는 상기 망막 및/또는 망막 색소 상피 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 발현을 증가시킨다.

한 구체예에서, 상기 작용제는 항체, 폴리펩티드, 핵산, 폴리핵산, 폴리머, 수용체 연관 단백질(RAP)(내포성(endocytic) 수용체의 생합성 및 세포내 운반을 보조하도록 특별히 디자인된 샤페론의 한 유형) 또는 이의 단편, 저 분자량 유기 화합물, 비타민-결합 단백질, 지질단백질, 면역- 및 스트레스-관련 단백질, 스테로이드 호르몬 결합 단백질, 호르몬 및 전구체, 펩티드, 효소 및 효소 억제자, 알부민, 락토페린, 헤모글로빈, 후각자극물질-결합 단백질, 트랜스씨레틴; 다염기성 약물 및 독소, RAP, 칼슘(Ca²⁺), 칼슘 스캐빈저, 환원제 및 시토크롬 c 중에서 선택된다. 한 구체예에서, 상기 작용제는 항체, 폴리펩티드, 핵산, 폴리핵산, 폴리머, 수용체 연관 단백질(RAP) 또는 이의 단편, 저 분자량 유기 화합물, 비타민-결합 단백질, 지질단백질, 면역- 및 스트레스-관련 단백질, 스테로이드 호르몬 결합 단백질, 호르몬 및 전구체, 펩티드, 효소 및 효소 억제자, 알부민, 락토페린, 헤모글로빈, 후각자극물질-결합 단백질, 트랜스씨레틴; 약물 및 독소, RAP, 칼슘(Ca²⁺), 칼슘 스캐빈저, 환원제 및 시토크롬 c 중에서 선택된다. 또 다른 구체예에서, 상기 작용제는 항체, 폴리펩티드, 핵산, 폴리핵산, 폴리머, 수용체 연관 단백질(RAP) 또는 이의 단편, 저 분자량 유기 화합물, 레티놀, 레티놀-RBP 복합체, 레티놀-RBP-TTR 복합체, 광수용체간 레티노이드 결합 단백질(IRBP), 레티놀-IRBP 복합체, 트랜스코발라민-비타민 B12, 트랜스코발라민-비타민 B12 결합 단백질, 비타민-D-결합 단백질, 아포리포단백질 B, 아포리포단백질 E, 아포리포단백질 J/클러스테린, 아포리포단백질 H; 면역글로불린 경쇄, PAP-1, β2-마이크로글로불린; 성 호르몬 결합 단백질-에스트로겐, 안드로겐 결합 단백질-안드로겐; 부갑상선 호르몬, 인슐린, 표피 성장 인자, 프로락틴, 씨로글로불린; 플라스미노겐 활성인자억제자-1(PAI-1), 유로키나아제-PAI-1, tPA-PAI-1, 프로-유로키나아제, 리포프로테인 리파아제, 플라스미노겐, β-아밀라아제, β1-마이크로글로불린, 리소자임; 알부민, 락토페린, 헤모글로빈, 후각자극물질-결합 단백질, 트랜스씨레틴; 아미노글리코시드, 폴리믹신 B, 아프로티닌, 트리코산틴, 젠타마이신; RAP, RAP 단편, Ca2+, 칼슘 스캐빈저, 환원제 또는 시토크롬 c이다.

한 구체예에서, 상기 작용제는 항체이다. 또 다른 구체예에서, 상기 작용제는 폴리펩티드이다. 또 다른 구체예에서, 상기 작용제는 핵산이다. 또 다른 구체예에서, 상기 작용제는 폴리핵산이다. 또 다른 구체예에서, 상기 작용제는 폴리머이다. 또 다른 구체예에서, 상기 작용제는 아미노글리코시드 또는 이의 유도체이다. 또 다른 구체예에서, 상기 작용제는 RAP 또는 이의 단편이다. 추가 구체예에서, 상기 작용제는 저 분자량 유기 화합물이다.

또 다른 구체예에서, 상기 작용제는 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 도메인이다. 또 다른 구체예에서, 상기 작용제는 메갈린의 도메인이다. 또 다른 구체예에서, 상기 작용제는 레티노이드 결합 단백질의 단편이다. 또 다른 구체예에서, 상기 작용제는 메갈린의 단편이다.

한 구체예에서, 상기 작용제의 유효량은 상기 포유동물에게 전신적으로 투여된다. 또 다른 구체예에서, 상기 작용제의 유효량은 상기 포유동물에게 경구적으로 투여된다. 또 다른 구체예에서, 상기 작용제의 유효량은 상기 포유동물에게 정맥내로 투여된다. 추가 구체예에서, 상기 작용제의 유효량은 상기 포유동물에게 안구적으로 투여된다. 추가 구체예에서, 상기 작용제의 유효량은 이온토포레시스(iontophoresis)로 투여된다. 또 다른 구체예에서, 상기 작용제의 유효량은 상기 포유동물에게 주사로 투여된다.

한 구체예에서, 상기 포유동물은 인간이다.

또 다른 구체예에서, 포유동물의 눈 안의 망막 및/또는 망막 색소 상피 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성을 조절하는 유효량의 작용제를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 포유동물의 눈에서 안질환을 치료하기 위한 방법은 상기 유효량의 작용제의 다중 투여(multiple administrations)를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 다중 투여 시간 간격은 1주 이상이다. 또 다른 구체예에서, 다중 투여 시간 간격은 1일 이상이다. 추가 구체예에서, 화합물은 1일 기준으로 포유동물에게 투여된다.

한 구체예에서, 상기 방법은 추가로 산화질소 생성 유도제(inducer), 항염증제, 생리학적으로 허용되는 항산화제, 생리학적으로 허용되는 미네랄, 음으로 하전된 포스포리피드, 카로티노이드, 스타틴, 항혈관신생 약물, 매트릭스 메탈로프로테나아제 억제자, 13-시스-레티노산, 또는 화학식 (A)의 구조를 갖는 화합물로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 추가 작용제를 시술하는 단계를 포함한다:

상기 화학식 (A)에서,

X₁은 NR², O, S, CHR²으로 구성된 군에서 선택되고;

R¹은 (CHR²)x-L¹-R³인데, 여기서

x는 0, 1, 2, 또는 3이며; L¹은 단일 결합 또는 -C(O)-이고;

R²는 H, (C₁-C₄)알킬, F, (C₁-C₄)플루오로알킬, (C₁-C₄)알콕시, -C(O)OH, -C(O)-NH₂, -(C₁-C₄)알킬아민, -C(O)-(C₁-C₄)알킬, -C(O)-(C₁-C₄)플루오로알킬, -C(O)-(C₁-C₄)알킬아민, 및 -C(O)-(C₁-C₄)알콕시로 구성된 군에서 선택된 부분이며;

R³는 H 또는 (C₂-C₇)알케닐, (C₂-C₇)알키닐, 아릴, (C₃-C₇)시클로알킬, (C₅-C₇)시클로알케닐, 및 헤테로고리(heterocycle)로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기들로 치환되거나 비치환된 부분이다.

한 구체예에서, 화학식 (A)의 화합물, 또는 이의 활성 대사산물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 전구약물 또는 용매화물은 x가 0이고 L¹이 단일 결합인 경우, R³가 H가 아닌 것을 조건으로 한다. 한 구체예에서, 추가의 작용제는 산화질소 생성 유도제이다. 한 구체예에서, 상기 산화질소 생성 유도제는 시트룰린, 오르니틴, 니트로소화된(nitrosated) L-아르기닌, 니트로실화된(nitrosylated) L-아르기닌, 니트로소화된 N-히드록시-L-아르기닌, 니트로실화된 N-히드록시-L-아르기닌, 니트로소화된 L-호모아르기닌 및 니트로실화된 L-호모아르기닌 중에서 선택된다.

한 구체예에서, 상기 추가 작용제는 항염증제이다. 또 다른 구체예에서, 상기 추가 작용제는 비-스테로이드 항염증 약물, 리포프로테인옥시게나아제 억제자, 프레드니손, 덱사메타손, 및 시클로옥시게나아제 억제자 중에서 선택된 항염증제이다.

한 구체예에서, 상기 추가 작용제는 1종 이상의 생리학적으로 허용되는 항산화제이다. 또 다른 구체예에서, 상기 추가 작용제는 비타민 C, 비타민 E, 베타-카로틴, 코엔자임 Q, 및 4-히드록시-2,2,6,6-테트라메틸피페라딘-N-옥실 중에서 선택된 생리학적으로 허용되는 항산화제이다.

한 구체예에서, 상기 추가 작용제는 1종 이상의 생리학적으로 허용되는 미네랄이다. 또 다른 구체예에서, 상기 추가 작용제는 아연(II) 화합물, Cu(II) 화합물, 및 셀레늄(II) 화합물 중에서 선택된 생리학적으로 허용되는 미네랄이다.

한 구체예에서, 상기 추가 작용제는 음으로 하전된 포스포리피드이다. 또 다른 구체예에서, 상기 음으로 하전된 포스포리피드는 포스파티딜글리세롤이다.

또 다른 구체예에서, 상기 추가 작용제는 카로티노이드이다. 또 다른 구체예에서, 상기 추가 작용제는 루테인 및 제아잔틴 중에서 선택된 카로티노이드이다.

또 다른 구체예에서, 상기 추가 작용제는 스타틴이다. 또 다른 구체예에서, 상기 추가 작용제는 로수바스타틴, 피티바스타틴, 심바스타틴, 프라바스타틴, 세리바스타틴, 메바스타틴, 벨로스타틴, 플루바스타틴, 컴팩틴(compactin), 로바스타틴, 달바스타틴, 플루인도스타틴(fluindostatin), 아토르바스타틴, 아토르바스타틴 칼슘, 및 디히드로컴팩틴 중에서 선택된 스타틴이다.

한 구체예에서, 상기 추가 작용제는 항혈관신생 약물이다. 한 구체예에서, 상기 추가 작용제는 루파브(Rhufab) V2, 트립토파닐-tRNA 합성효소, 항-VEGF 페길화(pegylated) 앱타머, 스퀄라민(squalamine), 아네코르타브 아세테이트(anecortave acetate), 콤브레타스타틴 A4 전구약물, 마쿠젠(Macugen^TM), 미페프리스톤(mifepristone), 서브테논 트리암시놀론 아세토나이드, 유리체내(intravitreal) 결정성 트리암시놀론 아세토나이드, AG3340, 플루오시놀론 아세토나이드, 및 VEGF-트랩(VEGF-Trap) 중에서 선택된 항혈관신생 약물이다. 페갑타니브 나트륨(Pegaptanib 나트륨) 주입은 습성(wet) AMD의 치료를 위한 FDA에 의해 허가된 항-VEGF 억제자이고 상표명 마쿠젠(Macugen^TM)으로 판매된다.

또 다른 구체예에서, 상기 추가 작용제는 매트릭스 메탈로프로테나아제 억제자이다. 또 다른 구체예에서, 상기 추가 작용제는 메탈로프로테나아제의 조직 억제자, α2-매크로글로불린, 테트라사이클린, 히드록사메이트, 킬레이터, 합성 MMP 단편, 숙시닐머캅토퓨린, 포스포나미데이트(phosphonamidate), 및 히드록사민산(hydroxaminic acid) 중에서 선택된 매트릭스 메탈로프로테나아제 억제자이다.

한 구체예에서, 상기 추가 작용제는 13-시스-레티노산이다.

한 구체예에서, 상기 추가 작용제는 화학식 (A)의 구조를 갖는다:

상기 화학식 (A)에서,

X₁은 NR², O, S, CHR²으로 구성된 군에서 선택되고;

R¹은 (CHR²)x-L¹-R³인데, 여기서

x는 0, 1, 2, 또는 3이며; L¹은 단일 결합 또는 -C(O)-이고;

R²는 H, (C₁-C₄)알킬, F, (C₁-C₄)플루오로알킬, (C₁-C₄)알콕시, -C(O)OH, -C(O)-NH₂, -(C₁-C₄)알킬아민, -C(O)-(C₁-C₄)알킬, -C(O)-(C₁-C₄)플루오로알킬, -C(O)-(C₁-C₄)알킬아민, 및 -C(O)-(C₁-C₄)알콕시로 구성된 군에서 선택된 부분이며;

R³는 H 또는 (C₂-C₇)알케닐, (C₂-C₇)알키닐, 아릴, (C₃-C₇)시클로알킬, (C₅-C₇)시클로알케닐, 및 헤테로고리로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기들로 치환되거나 비치환된 부분이다.

또 다른 구체예에서, 화학식 (A)의 화합물, 또는 이의 활성 대사산물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 전구약물 또는 용매화물은 x가 0이고 L¹이 단일 결합인 경우, R³가 H가 아닌 것을 조건으로 한다. 또 다른 구체예에서, X₁은 NR²인데, 여기서 R²는 H 또는 (C₁-C₄)알킬이다. 또 다른 구체예에서, x는 0이다. 추가 구체예에서, x는 1이고 L¹은 -C(O)-이다. 또 다른 구체예에서, R³는 치환되거나 비치환된 아릴이다. 아직 또 다른 구체예에서, R³는 치환되거나 비치환된 헤테로아릴이다. 추가 구체예에서, X₁은 NH이고 R³는 치환되거나 비치환된 아릴이다. 추가 구체예에서, 상기 아릴 기는 1개의 치환기를 갖는다. 아직 추가의 구체예에서, 상기 치환기는 할로겐, OH, O(C₁-C₄)알킬, NH(C₁-C₄)알킬, O(C₁-C₄)플루오로알킬, 및 N[(C₁-C₄)알킬]₂ 중에서 선택된 부분이다. 추가 구체예에서, 상기 치환기는 OH이다. 또 다른 구체예에서, 상기 아릴은 페닐이다.

한 구체예에서, 상기 추가 작용제는

; 또는 이의 활성 대사산물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 전구약물 또는 용매화물이다.

또 다른 구체예에서, 상기 추가 작용제는 4-히드록시페닐레틴아미드; 4-메톡시페닐레틴아미드; 또는 이의 활성 대사산물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 전구약물 또는 용매화물이다.

추가 구체예에서, 2종 이상의 작용제가 함께 투여된다. 추가 구체예에서, 2종 이상의 작용제가 별개로 투여된다. 몇몇 구체예에서, 2종 이상의 작용제는 동일 약제학적 조성물로 투여된다. 몇몇 구체예에서, 2종 이상의 작용제는 별개의 약제학적 조성물로 투여된다. 몇몇 구체예에서, 본원에 기술된 방법은 상기 추가 작용제의 선 투여(prior administration)를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 본원에 기술된 방법은 상기 추가 작용제의 후속 투여(subsequent administration)를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 본원에 기술된 방법은 상기 추가 작용제의 선 투여 및 후속 투여 둘 모두를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 상기 방법은 추가로 상기 포유동물에게 체외 유동술(extracorporeal rheopheresis), 제한된 망막 전위술(limited retinal translocation), 광역동요법(photodynamic therapy), 드루젠 레이저조사(drusen lasering), 황반 원공 수술(macular hole surgery), 황반 전위 수술, 파이-모션(Phi-Motion), 양성자 빔 치료, 망막 박리(Retinal Detachment) 및 유리체 수술(Vitreous Surgery), 공막 돌륭(Scleral Buckle), 황반하 수술(Submacular Surgery), 동공경유온열요법(Transpupillay Thermotherpy), 광계 I 요법, 미세전류 자극, RNA 간섭, 안구 약물의 투여, 예컨대 포스포린 아이오디드 또는 에코치오페이트(echothiophate) 또는 탄산탈수효소 억제자(carbonic anhydrase inhibitors), 마이크로칩 이식, 줄기 세포 요법, 유전자 대체 요법, 리보자임 유전자 요법, 광수용체/망막 세포 이식, 레이저 광응고, 및 침술 중에서 선택된 요법을 시술하는(administrating) 단계를 포함한다.

한 구체예에서, 상기 방법은 추가로 포유동물의 눈에서 두루젠의 형성을 모니터링하는 단계를 포함한다. 추가 구체예에서, 상기 방법은 추가로 자발형광(autofluorescence)에 의해 상기 포유동물의 눈에서 리포푸신(lipofuscin)의 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 추가 구체예에서, 상기 방법은 상기 포유동물의 눈에서 시력(visual acuity)을 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 상기 포유동물의 눈에 대한 시야 검사(visual field examination)를 수행하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 시야 검사는 시계 검사(visual field exam.)이다.

또 다른 구체예에서, 상기 방법은 상기 포유동물의 눈에서 N-레티닐이덴-포스파티딜에탄올아민, 디히드로-N-레티닐이덴-N-레티닐-포스파티딜에탄올아민, N-레티닐이덴-N-레티닐-포스파티딜에탄올아민, 디히드로-N-레티닐이덴-N-레티닐-에탄올아민, 및/또는 N-레티닐이덴-포스파티딜에탄올아민의 자발형광을 측정하는 추가로 단계를 포함한다.

한 구체예에서, 상기 안과 질환은 황반 변성이다. 또 다른 구체예에서, 상기 황반 변성은 연소성(juvenile) 황반 변성이다. 또 다른 구체예에서, 상기 연소성 황반 변성은 스타가르트 질병이다. 또 다른 구체예에서, 상기 황반 변성은 건성형 연령-관련 황반 변성. 아직 또 다른 구체예에서, 상기 황반 변성은 추체-간체 이영양증(cone-rod dystrophy)이다.

한 구체예에서, 상기 안과 질환은 약물-관련 또는 약물-유도 망막증이다.

한 구체예에서, 인간은 스타가르트 질병에 대한 돌연변이 ABCA4 대립유전자의 보인자이거나 돌연변이 ELOV4 유전자를 지닌다.

또 다른 구체예에서, 상기 방법은 상기 포유동물이 돌연변이 ABCA4 대립유전자의 보인자이거나 스타가르트 질병에 대한 돌연변이 ELOV4 대립유전자를 지니는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.

한 구체예에서, 상기 작용제의 투여는 광-유발 손상으로부터 상기 포유동물의 눈을 보호한다.

또 다른 구체예에서, 상기 안과 질환은 지도형 위축 및/또는 광수용체 변성의 확산이다.

또 다른 구체예에서, 본원에 기술된 상기 방법은 망막 변성에 대한 추가의 치료제를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 상기 인간은 스타가르트 질병, 열성 망막 색소변증, 열성 추체-간체 이영양증, 건성 연령관련 황반변성, 삼출성(exudative) 연령관련 황반변성, 추체-간체 이영양증, 망막색소변성증(retinitis pigmentosa), 리포푸신-계열 망막 변성(lipofuscin-based retinal degeneration), 광수용체 변성, 및 지도형 위축 중에서 선택된 안과 질환 또는 형질(trait)을 지닌다.

한 구체예에서, 본원에 기술된 상기 방법은 상기 포유동물의 읽기 속도 및/또는 읽기 예민도(reading acuity)를 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본원에 기술된 방법은 상기 포유동물의 눈에서 암점(scotoma)의 개수 및/또는 크기를 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 아직 또 다른 구체예에서, 본원에 기술된 방법은 상기 포유동물의 눈에서 국소 퇴화 병소(lesions)의 크기 및 개수를 측정하는 단계를 추가로 포함한다.

한 구체예에서, 눈 안의 망막 및/또는 레티놀 색소 상피 세포의 LDL 수용체 유전자 패밀리의 활성은 상기 망막 색소 상피로부터 피로푸신의 제거이다. 또 다른 구체예에서, 메갈린의 활성은 망막 색소 상피로부터의 리포푸신의 제거이다. 추가 구체예에서, 상기 작용제는 망막 색소 상피로부터의 리포푸신 제거를 증가시킨다.

또 다른 구체예에서, 본원에서 포유동물의 눈 안의 망막 색소 상피 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성을 조절하는 유효량의 작용제; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 소개된다. 또 다른 구체예에서, 본원에서 포유동물의 눈 안의 망막 색소 상피 세포내의 메갈린의 활성을 조절하는 유효량의 작용제; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 소개된다. 추가 구체예에서, 상기 약제학적 조성물은 안과학적 투여에 적합한 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

본원에 기술된 방법 및 조성물의 다른 목적, 특징 및 이점들이 하기 상세한 설명으로부터 자명해 질 것이다. 그러나 본 발명의 정신 및 영역 내에서 다양한 변형 및 수정이 이 상세한 설명으로부터 당업계의 통상의 기술자에게 자명할 것이기 때문에, 상세한 설명 및 특정 실시예는, 비록 특정 구체예들이 제시되어 있기는 하지만, 단지 예시의 일환으로 제시된 것임이 이해되어야 한다.

특허, 특허 출원, 및 공개문헌을 포함한, 본원에서 인용된 모든 참조문헌들은, 이들의 전체내용이 참조문헌으로써 여기에 통합된다.

도 1. 대표적인 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 도시한다.

도 2. 인간 및 래트 안구 조직에서 LDL 수용체, 메갈린의 검출을 도시한다. (A) 정제된 메갈린(래트 신장 유래)에 대해 생성된 항체를 이용하여 래트 및 인간 조직으로부터 제조된 추출물에서 메갈린-면역반응 단백질을 검출하였다. 래트 신장으로부터 제조된 단백질 추출물을 이 연구를 위한 양성 대조군으로 사용하였다. 면역블롯 분석은 래트 신장에서 적절한 분자 크기 밴드(래트 K, 6㎍, 레인 1)와 래트 망막(Ret, 60㎍, 레인 2), 래트 RPE(46㎍, 레인 3) 및 인간 RPE(20 ㎍, 레인 4)에서 동일한 분자 크기의 대응되는 밴드를 보여준다. 이합체(Mr ~ 670 kDa)와 단량체(Mr ~ 335 kDa) 형태 둘 모두로 존재하는, 씨로글로불린를 크기 표준으로 사용하였다. (B) RT-PCR 분석에 의한 래트 RPE 및 망막에서 메갈린의 상대적 발현의 측정. 조직 오염의 가능성을 미연에 방지하기 위해 래트 RPE 및 망막의 2개의 분리 제조물을 분석하였다. 각 제조물 내에서, 4개의 샘플을 분석하였다(샘플당 1-2㎍의 총 RNA를 사용하였음). 데이터는 RPE에서 메갈린의 발현이 망막에서의 이의 발현에 비해 ~ 15배 더 높음을 보여주었다.

도 3. N-글리코시다아제 F(PNGase F)로 처리 즉시 나타난 안구 메갈린의 분자 크기에서 감소를 도시한다. 메갈린은 심하게 글리코실화된 것으로 공지되어 있다. PNGase F를 이용한 메갈린의 처리는 결합된 글리칸(glycans)이 상기 단백질로부터 제거되기 때문에 단백질 크기에서의 감소를 초래하는 것으로 드러났다. 래트 눈 샘플을 PNGase F로 처리하였다(패널 A에서 "+"로 표기됨). 대조 샘플은 미처리된 상태로 두었다(패널 A에서 "-"로 표기됨). 샘플을 항-메갈린 IgG로 프로빙하였다. 래트 신장 조직을 대조군으로 사용하였다. 데이터는 PNGase F 처리 후 메갈린 분자 크기에서 감소를 보여준다. 처리 및 비처리 샘플 둘 모두로부터의 밴드들을 제한된 단백질 가수분해에 뒤이어 펩티드 서열분석을 거치게 하였다. 상기 두 샘플들의 펩티드 프로파일은 동일하였다(패널 B). 상기 펩티드들 중 하나에 대한 MS/MS 분석은 메갈린에 특유한 서열을 밝혀내었다(패널 C).

도 4. 래트 RPE에서 메갈린-면역반응 단백질의 펩티드 서열분석을 도시한다. 도 3에서 확인된 상기 메갈린 면역반응 단백질을 아크릴아미드 겔로부터 잘라내고 트립신 처리에 의한 제한된 단백질 가수분해를 겪게 하였다. 그 결과 얻어진 펩티드를 액체 크로마토그래피로 분리하고 전자분사 질량분석기 상에서의 충돌-유도 이온화로 분석하였다. 서열분석된 펩티드는, 메갈린(접근 번호: NM 030827.1, GI: 13562118)으로도 공지된, 저밀도 리포프로테인 수용체-관련 단백질 2와 동일한 단백질 확인되었다.

도 5. 메갈린의 세포내점유위치(cytolocalization)를 결정하기 위해서 사용되었으며, 수용체-블로킹 실험에서 홀로-레티노이드(holo-retinoid) 결합 단백질의 흡수에 있어서 메갈린 및 기타 리포프로테인 수용체의 역할을 결정하기 위해 사용된 인간 RPE 세포 배양 시스템을 도시한다. 인간 RPE 세포를 배양하기 위해 사용된 장치의 도식 대표도가 패널 A에 제시되어 있다. RPE 세포는 원통형 용기의 하부에 위치한 투과성, 라미닌-함유 막상에 파종된다. 상기 용기 상단부에서 개방은 상부 배지(apical media)를 통한 RPE 세포 단일 층의 상부 표면(upper surface)에 대한 접근을 허용한다. 이 유닛은 하부 배지를 통한 RPE의 하부 표면(lower surface)에 대한 접근을 제공하는 더 큰 원통형 용기에 장치된다. 전자 현미경에 의한 분석은 이러한 방식으로 배양된 RPE 세포가 상부 과정(apical processes)을 거쳐 상부 챔버(apical chamber)로 적절하게 편극화된다는 증거를 밝혀내었다(패널 B).

도 6. 인간 RPE에서 메갈린의 세포내점유위치를 도시한다. 인간 RPE 배양물에서 메갈린 면역반응성에 대한 페이싱(en face) 공초점 이미지가 도시되어 있다. 메갈린 면역반응성은 녹색 형광으로 나타난다. 패널은 상부 RPE 세포 표면에서 출발하여(좌상단) 하부 표면에서 종료되는(우하단) 일련의 1 μm 절편을 보여준다. 염색 패턴은 메갈린의 상부-측부(apical-lateral) 점유위치를 제시한다. Z-축 분포 상태의 재구성은 현저한 상부-측부 점유위치(하단부 패널)를 확신시킨다. 하부 표면에서 관찰되는 메갈린은 매우 드물다.

도 7. 인간 RPE에서 RBP-레티놀의 메갈린-매개 흡수를 도시한다. RPE 세포는 기본적으로 혈액 순환으로부터 RBP-레티놀을 흡수한다. 또한, RPE 세포는 RBP를 합성하고 이들 세포의 상부극(apical pole)을 가로질러 분비하는 것으로 알려져 있다. 항체 블로킹 실험을 수행하여 메갈린이 이러한 과정에서 소정 역할을 담당하고 있는지를 결정하였다. 메갈린-특이적 항체를 RPE 세포 배양물의 첨방에 첨가하였다. 대조 샘플은 동등한 농도의 사전-면역 래빗 IgG를 주입받았다. 항체 처치 기간(4℃에서 2시간)이 경과된 후, RBP-레티놀(10 μM)을 상부(패널 A 및 B) 또는 하부(패널 C 및 D) 배지에 첨가하였다. RBP-레티놀 흡수 정도를 세포내 올-트랜스 레티닐 에스테르(atRE) 및 올-트랜스 레티놀(atROL)의 HPLC 정량으로 평가하였다. 용리 피크에 대한 UV-vis 분광학은 atRE 및 atROL의 존재를 확신시켰다(인세트, 패널 A). 상부 배지로부터의 RBP-레티놀의 흡수는 하부 배지로부터의 흡수보다 ~3.5-배 더 높았다(패널 E에서 흑색 막대와 적색 막대를 비교하라). 메갈린-특이적 항체의 RPE 세포의 사전-처치는 상부(패널 B) 및 하부(패널 D) RBP-레티놀 흡수를 모두 억제하였다(패널 E, 각각, 40%와 60% 억제). 이러한 데이터는 RPE 세포에서 RBP-레티놀의 흡수에 메갈린을 관련시킨다.

도 8. 저밀도 리포프로테인 수용체-관련 단백질(LRP) 및 메갈린에 의한 광수용체간 레티노이드 결합 단백질(IRBP)의 흡수를 도시한다. 인간 RPE에서 발현을 탐침하기 위해 LRP의 중쇄에 특이적인 항체(Mr ~ 585 kDa)를 사용하였다. 면역조직화학 연구는 LRP가 RPE 세포의 상부 표면에서 현저하게 발현된다는 것을 보여주 었다(패널 A). 면역블롯 분석은 LRP 및 메갈린 항체가 서로 교차-반응하지 아니한다는 것을 입증하였다(패널 B). 메갈린과 LRP의 상부 점유위치(각각, 도 6 및 8을 참조)는, 이러한 단백질들이 IRBP-레티놀의 흡수에 소정 역할을 담당할 수 있는지 여부를 결정하기 위한 자극을 제공하였다. RPE 세포 배양물을 IRBP-레티놀(10μM)의 상부 적용에 앞서 4℃에서 2시간 동안 사전-면역 래빗 IgG(패널 C), 메갈린 IgG(패널 D), 또는 LRP IgG(패널 E) 중 어느 하나로 사전-처치하였다. IRBP-레티놀 흡수 정도를 세포내 올-트랜스 레티닐 에스테르(atRE)에 대한 HPLC 정량으로 평가하였는데, 상기 에스테르는 uv-vis 분광학(인세트, 패널 C)에 의해 확증되었다. 이러한 데이터는 메갈린 및 LRP IgG 둘 모두에 의한 IRBP-레티놀의 유의적인 억제를 나타낸다(패널 F, 각각 30%와 40% 억제).

도 9. 인간 RPE에서 수용체-연관 단백질(RAP)의 세포내점유위치를 도시한다. RAP는 메갈린을 포함한, LDL 수용체 패밀리의 몇몇 구성원들에 대한 분자 샤페론으로서 기능하는 ~39-kDa 소포체(ER)-거주 단백질이다. 인간 RPE의 배양물 내의 다른 LDL 수용체의 발현을 탐침하기 위해 인간 RAP에 대한 항체를 사용하였다. 하부 표면(오른쪽 하단)을 향한 상부 RPE 세포 표면(왼쪽 상단)으로부터의 연속 절제는 RPE의 모든 표면에 대한 RAP 면역반응성(녹색 형광)을 보여준다. RPE 세포 단일층을 통한 횡 절단은 RPE 플라즈마 막에 대한 강도 높은 RAP-면역반응성을 보여준다. RAP는 ER내에 위치를 점유하고 있고(RPE 세포 내부의 면역반응성을 주목 바람); 그리하여, 하부 RAP-면역반응성의 발견은 하부 RPE 표면에 RAP-연관 LDL 수용체의 존재를 시사한다.

도 10. RPE내의 신규한 저밀도 리포프로테인 수용체-관련 단백질의 동정 및 펩티드 서열분석을 도시한다. 메갈린과의 교차-반응성도 입증된, 인간 RAP에 대한 항체를 사용하여 래트 RPE내의 추가 LDL 수용체의 발현을 탐침하였다. 면역블롯은 래트 RPE내 2개의 단백질을 보여주었다(패널 A, 레인 2). 분자량이 더 큰 단백질은 메갈린과 일치하였다(래트 신장 내의 메갈린과 비교, 레인 1). 분자량이 더 적은 단백질(패널 A에서 적색 별표)을 펩티드 서열분석에 사용하여 이의 밀도를 구하였다. 풀 스캔 질량 분광학은 펩티드(MH + = 1650)를 검출하였는데, 단편화에 대한 질량 분광계에서 분리되었다(패널 B). 이 펩티드에서 생성된 일련의 Y- 및 B-이온들은 LDL 패밀리 구성원들에서 고도로 보존된 서열을 생성하였다(FWTD, 패널 C). YWTD와 FWTD 모티프가 LDL 수용체 내의 다수의 탠덤 반복부(multiple tandem repeat)로 발견되었으며 이러한 단백질의 베타-프로펠러 구조를 형성할 것으로 예상되었다. 메갈린의 위상 도표가 일예로 제공된다(패널 D). 결과는 단백질 데이터베이스에 관하여 소화물(digest)로부터의 전체 MS/MS 스펙트럼의 스크리닝은 절단된 단백질을 370 kDa의 질량을 지니는 저밀도 리포프로테인 수용체-관련 단백질 2 이소형(isoform)으로 식별되었다는 것을 보여준다(접근 번호: XM 130308.3). 인간 RAP에 대한 항체를 이용한 면역조직화학 분석을 이용하여 인간 RPE내 메갈린 이소형의 세포내점유위치를 결정하였다. 데이터는 현저한 하부외측(basolateral) 위치점유를 제시한다(패널 E에서 화살표로 지적됨). 패널 E에서 역삼각형은 RPE의 상부 극에서의 메갈린 발현을 제시한다.

도 11. RAP에 의한 인간 RPE내 RBP-레티놀의 하부 흡수의 억제를 도시한다. 순환으로부터의 RBP-레티놀의 흡수는 RPE의 하부 표면에서 일어난다. 하부 RPE 플라즈마 막 상의 RAP-연관 LDL 수용체를 밝혀낸, 세포내점유위치 연구는 이러한 수용체들이 RBP-레티놀의 하부 흡수에 소정 역할을 할 수 있는지 여부를 결정하기 위한 동기를 제공하였다. RAP는 이러한 수용체들 상에 존재하는 리간드 결합 도메인에 결합함으로써 LDL 수용체를 위한 샤페론으로서 역할한다. 따라서, RAP는 리간드 결합 길항제로 활용될 수도 있다. RAP를 RPE 세포 배양물의 하부 챔버에 첨가하였다. 대조 샘플은 동등한 농도의 사전-면역 래빗 IgG를 받았다. 항체 처치 기간 경과 후(4℃에서 2시간), RBP-레티놀(10 μM)을 하부 미디어에 첨가하였다. RBP-레티놀 흡수의 정도를 세포내 올-트랜스 레티닐 에스테르(atRE) 및 (atROL)의 HPLC 정량으로 평가하였다. 용리 피크의 UV-vis 분광학은 atRE 및 atROL의 존재를 확신시켰다(인세트, 패널 A). 사전-면역 IgG로 처치된 RPE 세포는 atROL의 강한 흡수와 에스테르화를 보여주었다(패널 A). 대조적으로, RAP(패널 B)로 사전-처치된 RPE 세포는 상당히 감소된 RBP-레티놀 흡수를 나타내었다. 데이터의 평가는 RAP에 의한 RBP-레티놀 흡수의 47% 억제를 나타냈다(패널 C).

도 12. 상이한 혈청 RBP-레티놀 수준을 지니는 마우스로부터의 안구 컵(eye cup)내 메갈린 단백질 수준을 도시한다. LDL 수용체는 RBP-레티놀의 RPE내로의 흡수에 작용한다. RBP 녹아웃 마우스 및 MPR-처치된 마우스는 더 낮은 혈청 RBP-레티놀 수준을 지녔다. 이러한 마우스로부터의 아이컵 조직 내 메갈린의 발현이 면역블롯에 의해 시험되었다. 마우스 아이컵의 막 분획을 야생형 마우스(WT), RBP 녹아웃 마우스 (RBP-/-), ABCR 널 마우스(abcr-/-) 및 MPR-처치 마우스(MPR)로부터 제조하였다. 2개의 면역반응성 밴드가 검출되었다(도면에서 흰색 화살표로 지적됨). 데이터는 연령-일치(age-matched) 야생형 및 abcr 녹아웃 마우스와 비교하여 RBP 녹아웃 마우스 및 MPR-처치 마우스에서 두 단백질들의 발현이 감소되었음을 보여준다.

도 13. 인간 RPE내로의 RBP- 및 IRBP-레티놀의 흡수를 도시한다. 홀로-RBP 및 IRBP는 형광 프로브(Alexa Fluor 488)로 공유결합적으로 라벨링되었다. 상기 라벨링된 단백질(RBP^* 및 IRBP^*)을 RPE 세포배양 시스템의 하부(RBP^*) 또는 상부(IRBP^*) 구획에 첨가하였다. 37℃에서 1시간의 인큐베이션후, 배지를 제거하고, 세포를 전체적으로 세척하고 조직 샘플을 형광 현미경으로 분석하였다. 데이터는 엔도시토시스 메커니즘의 존재를 제시하는, RPE 세포내로의 RBP^* 및 IRBP^* 둘 모두의 현저한 흡수를 보여준다.

도 14. RAP가 RBP-레티놀의 하부 흡수 및 IRBP-레티놀의 상부 흡수를 저해한다는 것을 도시한다. RPE 세포에 의한 IRBP^* 및 RBP^*의 흡수를 LDL 수용체 길항제, RAP로 처리하기 전(패널 A 및 B, 각각)과 후(패널 D 및 E, 각각)로 모니터링하였다. RAP 처치는 RBP^*의 하부 흡수와 IRBP^*의 상부 흡수를 완전히 억제하였다. 이러한 데이터는 흡수 과정이 LDL 수용체에 의해 매개된다는 것을 제시한다. 레티놀이 또한 RPE 세포내로 진입되는지를 확인하기 위해, 세포를 세척하고, 수집하고, HPLC로 레티노이드 함량에 대해 분석하였다. 레티놀의 RPE 세포로의 흡수는 결과 적으로 레티닐 에스테르 형성을 가져오는 급속한 에스테르화를 초래한다. 레티닐 에스테르의 정량은 RPE 세포가 정말 실제로 레티놀을 내부화(internalization)시키고 이것을 레티닐 에스테르로 에스테르화한다는 것을 보여준다(패널 C). RAP 사전-처치는 레티닐 에스테르 함량으로 측정할 때 레티놀 흡수에서 ~50% 감소를 초래하였다(패널 F).

도 15. IRBP-레티놀로부터의 CRBP로의 레티놀의 전이가 RBP-레티놀로부터의 전이보다 더 빠른 속도로 진행됨을 도시한다. RBP-레티놀과 비교하였을 때 더 빨라진 IRBP-레티놀로부터의 레티놀 흡수 속도(참조: 도 14, 패널 C)는 IRBP-레티놀로부터 세포내 레티놀 억셉터, 세포성 레티놀 결합 단백질(CRBP)로의 레티놀 전이가, 더 빠른 속도로 진행될 수 있다는 것을 시사하였다. 이러한 가능성을 다루기 위해, 본 발명자들은 동일 몰농도의 CRBP(10μM)와 함께 IRBP-레티놀 또는 RBP-레티놀을 인큐베이션하였으며 참조 스펙트럼으로 진정 CRBP-레티놀을 이용하여 스펙트럼 편이를 모니터링하였다. CRBP-레티놀의 여기 스펙트럼(패널 A와 B에서 점선)은 IRBP-레티놀(패널 A에서 적색 자취) 또는 RBP-레티놀(패널 B에서 녹색 자취) 중 어느 하나의 스펙트럼과 독특한 차이가 있다. 37℃에서 1분간 인큐베이션후, IRBP-레티놀의 여기 스펙트럼에서 명백한 시프트가 존재하였는데, 이는 IRBP로부터 CRBP로 레티놀의 전이를 의미한다. 대조적으로, RBP-레티놀의 여기 스펙트럼에서의 편이는 CRBP와의 인큐베이션 2시간 경과 후에도 관찰되지 아니하였다.

도 16. RBP-레티놀 및 IRBP-레티놀의 흡수에 관한 이론적 모델을 도시한다. 하부 RPE로부터의 RBP-레티놀의 흡수 및 연이은 CRB와의 결합은 리소좀 경로를 통 한 RBP 단백질의 분해를 요한다. 대조적으로, 레티놀의 IRBP 레티놀로부터의 CRBP에 대한 결합은 레티놀이 IRBP로부터 직접적으로 CRBP로 전이됨에 따라 단백질 분해에 앞서 진행될 수 있다.

[발명의 상세한 설명]

척추동물 시각의 2가지 근본적인 과정들이 광 인식을 지탱한다: 광신호의 광수용체 세포 내부에서의 화학적 변화로의 변형 및 망막 색소 상피 세포(RPE)과 관여하는 재생성 과정. 시각 색소 발색단의 이성질화(11-시스 레티날에서 올-트랜스 레티날로의 이성질화)는 총괄적으로 광전도(phototransduction)로 명명된, 일련의 반응들을 촉발시킨다. 광 민감도가 회복될 수 있게 되기 전에, 그 결과 생성된 올-트랜스-레티날은 옵신 아포단백질로부터 분리되어야 하며 11-시스-레티날로 이성질화되어야 한다. 광분해 생성물, 올-트랜스 레티날은 제일 먼저 광수용체 내에서 올-트랜스 레티놀로 환원되고, 그런 다음 시각 주기에 따라 지칭되는 효소 과정에서 RPE내에서 11-시스 레티날로 다시 전환된다[Rando, R.R. The Biochemistry of the Visual Cycle. Chem. Rev. 101, 1881-1896, 2001]. 광수용체는 망막하부 공간에 의해 RPE의 상부 표면으로부터 분리되는데, 광수용체간 매트릭스(IPM)로 지칭되는 특수화된 세포외 물질을 함유한다. IPM은 부착, 대식작용, 외절 안정도, 영양분 교환, 발달, 및 시각 주기에서의 비타민 A 트래피킹을 포함하는, 광수용체와 RPE 사이의 중요 상호작용을 매개한다.

비타민 A는 혈액 내를 순환하며 올-트랜스 레티놀 형태로 눈에 들어간다. 이 형태는 망막 색소 상피(RPE) 세포의 하부막에 의해 상기 순환으로부터 흡수되 며, 상기 RPE는 효소적으로 올-트랜스 레티놀을 올-트랜스 레티닐 에스테르로 전환시킨다. RPE는 올-트랜스 레티놀 에스테르의 11-시스 레티날로의 전환에 필요한 효소 기구를 포함한다. 후자 레티노이드는 망막 내에서 RPE로부터 광수용체 외절(POS)로 운반되며, 망막에서 상기 레티노이드는 옵신과 결합하여 로돕신을 형성한다.

RPE와 광수용체 사이에서 일어나는 중요한 상호작용은 시각 주기에서의 레티노이드의 교환이다. 광수용체간 레티노이드-결합 단백질(IRBP)인, 광수용체 분비 당단백질은, IPM 내부에서 레티노이드를 용매화시키고, RPE로의 올-트랜스 레티놀의 운반을 타겟팅하고, RPE로부터 11-시스 레티날의 방출을 촉진하고, 외절로의 이의 운반을 타겟팅함으로써 시각 주기에 참여한다. IRBP는 대략 140 kDa의 분자량을 갖는 당단백질이다. 아미노산 서열 및 cDNA는 공지되어 있다. RPE와 IPM 사이에서 레티노이드의 트래피킹은 수용체 매개 트랜스시토시스에 의해 매개된다. IRBP 및/또는 IRBP-레티놀 복합체 및/또는 IRBP-레티날 복합체는 예를 들어, RPE 세포의 상부막 상의 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원과 같은, 수용체 단백질에 결합한다. 몇몇 구체예에서, IRBP 및/또는 IRBP-레티놀 복합체 및/또는 IRBP-레티날 복합체에 결합하는 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원은, 예를 들어, 메갈린 또는 메갈린-관련 단백질이다.

RPE는 레티날-혈액 장벽의 부분을 형성하며 또한 광수용체 세포의 기능을 지지한다. RPE 세포층은 영양분과 폐기물 운반뿐만 아니라, RPE 세포의 (산성) 리소좀 기구 내부에서 셰드(shed) POS의 식세포작용 및 식세포이입된(phagocytozed) POS의 분해/가공과 같은 기능을 수행하는 광수용체를 위한 지지체로서 역할한다. 그러나 이 가공과정은 망막의 향산화성(prooxidant) 환경에 의해 불안정하게 되며, 과산화된 지질 및 단백질 잔기들의 복합 폴리머인, 리포푸신의 리로좀내 형성 및 축적에 관여하게 된다. RPE내의 산화 사건은 연령-관련 황반 변성(AMD)과 같은 질병 상태와 연관되어 있다.

AMD의 발병은 RPE내의 리포푸신의 축적 및 RPE 내부와 주위에 복잡하고 독성 있는 생화학물질(독소)의 축적과 연관되어 있다. 눈에 이러한 망막독성(retinotoxic) 화합물의 축적은 AMD의 병인론에서 공지된 가장 중요한 위험 인자들 중 하나이다. 적어도 일부 형태의 황반 변성에서, RPE내의 리포푸신의 축적은 간상세포의 소모성 외절(spent outer segment)의 식세포작용에 일부 기인한다. 망막독성 화합물은 간상세포 광수용체 외절의 디스크를 형성한다. 상기 디스크 내의 망막독성 화합물은 RPE로 운반되는데, 여기서 이들은 추가로 POS의 식세포작용을 손상시키고 RPE의 아폽토시스를 유발한다. 낮시간 시력에 필수적인 간상 세포를 포함하는, 광수용체 세포는 RPE 보조를 잃거나 사멸된다.

간상세포 외절의 디스크에서 형성된 망막독성 화합물 중 하나는 N-레티닐이덴-N-레티닐에탄올아민(A2E)이며, 이 화합물은 망막독성 리포푸신의 중요한 성분이다. A2E는 보통 디스크 내에서 형성되나, 식세포작용 발생시 RPE 기능을 손상시키지 아니하는 소량으로 형성된다. 그러나 특정 생리학적 조건에서, 외절이 대식되는(phagocytosed) 경우 RPE가 "중독(poisoned)"될 정도로 너무나 많은 A2E가 상기 디스크 내에 축적될 수 있다. A2E는 리소좀내 pH를 상승시킴으로써 시험관내에서 RPE 세포의 리소좀 분해 작용을 손상시키는 것으로 드러났다.

A2E는 간상세포 시각 주기의 중간생성물들 중 하나인, 올-트랜스-레티날로부터 생산된다. 정상 시각 주기 동안, 올-트랜스-레티날은 간상세포 외절 디스크 안쪽에서 생산된다. 올-트랜스-레티날은 상기 디스크 막의 구성성분인, 포스파티딜에탄올아민(PE)과 반응하여 N-레티닐이덴-PE를 형성할 수 있다. 간상세포 외절 디스크의 막에 위치한 ATP-결합 카세트 운반체인, 림(Rim) 단백질(RmP)은 이후 상기 디스크로부터 올-트랜스-레티날 및/또는 N-레티닐이덴-PE를 간상세포 외절 세포질로 운반한다. 상기 세포질 환경에서는 N-레티닐이덴-PE의 가수분해가 선호된다. 올-트랜스-레티날은 간상세포 세포질에서 올-트랜스-레티놀로 환원된다. 올-트랜스-레티놀은 이후 간상세포 외절 플라즈마 막을 거쳐 세포외 공간으로 이동되며 RPE의 세포에 의해 흡수된다. 올-트랜스-레티놀은 일련의 반응을 거쳐 11-시스-레티날로 전환되며, 이것은 광수용체로 되돌아오며 시각 주기가 연속된다.

RmP에서의 결함은 디스크로부터 올-트랜스-레티날의 제거를 방해함으로써 시각 주기를 붕괴시킬 수 있다. 스타르가르트병으로 불리는 열성형 황반 변성에서, RmP를 엔코딩하는 유전자, abcr이 돌연변이되어 있고, 상기 운반체는 작동불능이다. 그 결과, 올-트랜스-레티날 및/또는 N-레티닐이덴-PE는 상기 디스크에 갇히게 된다. N-레티닐이덴-PE는 이후 또 다른 올-트랜스-레티날 분자와 반응하여 A2E를 형성할 수 있다. 상기에 언급한 바와 같이, 일부 A2E는 심지어 정상 조건하에서도 형성된다; 그러나, 결함 운반체로 인해 디스크 내부에 이의 전구체가 축적될 때 이의 생성이 상당히 증가되고, 그에 따라 황반 변성이 초래될 수 있다.

다른 유형의 황반 변성이 또한 리포푸신 축적으로 귀결되는 병리(pathologies)로부터 야기될 수 있다. 염색체 6-연관 상염색체성 우성 황반 이영양증으로 알려진, 스타르가르트병의 우성형태가 매우 긴 사슬 지방산-4, ELOV4의 신장을 엔코딩하는 유전자에서의 돌연변이에 의해 유발된다.

광수용체 외절의 고도로 조직화된 막성 디스크들은 이들의 형성을 위해 지질단백질, 콜레스테롤, 인지질을 필요로 한다. RPE는 망막내에서 이러한 지질, 지질단백질 및 콜레스테롤의 항상성유지에 관여할 수 있다. RPE는 LDL 수용체 유전자 패밀리의 구성원과 같은, 수용체 단백질을 소유하는데, 상기 수용체 단백질은 지질단백질과 지질을 비롯한, 손상/과산화된 지질단백질과 지질을 흡수하며, 이 흡수는 비타민 E 결핍이 발생하는 동안 RPE 및 대동맥 내피(aortic endothelium)에서 또는 동맥경화발생(atherogenesis)이 진행되는 동안 대식세포에서 축적되는 식으로 일어난다[Hayes et al. Retinal Pigment Epithelium Possesses Both LDL and Scavenger Receptor Activity. IOVS, vol. 30, no. 2, 225-232, 1989]. 과산화된 지질단백질의 흡수는 정상 RPE 작동의 붕괴를 두드러지게 하고/하거나 가속화하며 AME의 대식세포작용에 기여할 수 있다. 산화된 저밀도 리포프로테인은 RPE 세포에서 광수용체 외절 식세포작용을 억제하는 것으로 드러났다[Gordiyenko et al. RPE Cells Internalize Low-Density Lipoprotein (LDL) and Oxidixed LDL (oxLDL) in Large Quantities in vitro and in vivo. IOVS, vol. 45, no. 8, 2822-2829, 2004]. RPE는 생체내 조건에서 LDL을 내부화할 수 있으며 LDL 침전물을 축적시킬 수 있다. 혈장 LDL은 예를 들어, 비타민 E를 비롯한 산화된 LDL과 같은 기타 분자들을 나르 면서 매우 효율적으로 RPE에 운반될 수 있다는 것이 밝혀져 있다. LDL은 또한 RPE의 리소좀내로 A2E를 운반하기 위한 비히클인 것으로 드러났다[Schutt et al. IOVS, vol. 41, no. 8, 2303-2308, 2000]. 산화된 지질단백질의 내부화는 또한 예를 들어, LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원과 같은 수용체 단백질에 의해서 산화된 리포프로테인 분자의 표면에서 산화된 인지질의 인지 및 이에 대한 결합을 통해서 일어날 수 있다. 한 구체예에서, 포유동물의 눈 안의 망막 및/또는 망막 색소 상피 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성을 조절하는 유효량의 작용제를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물의 눈에서 안질환을 치료하기 위한 방법 및 조성물이 제공되는데, 여기서 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 지질단백질 및/또는 산화된 지질단백질의 흡수이다.

척추동물 눈의 해부학적 구조, 로돕신의 재생성에 관한 시각 주기, 및 A2E-옥시란(oxiranes)의 생합성과 관련한 추가 정보는, 미국 특허출원 제 11/150,641호(2005년 6월 10일 출원), PCT 국제출원 US 2005/29455호(2005년 8월 17일 출원); 미국 특허출원 제 11/258,504(2005년 10월 25일 출원); 미국 특허출원 제 11/296,909(2005년 12월 8일 출원); 및 미국 특허출원 제 11/267,395호(2005년 11월 4일 출원)에 제공되어 있으며, 이들 특허문헌의 교시내용 이의 전부가 참고문헌으로 본원에 통합된다.

황반 또는 망막 변성 및 이영양증

황반 변성증(망막 변성증이라고도 칭함)은 망막의 중심 부분인 황반이 퇴화되는 안구 질환이다. 황반 변성증 환자의 약 85∼90%는 "건성(dry)"(위축성 또는 비 신생 혈관 생성) 형이다. 건성형 황반 변성증에 있어서, 망막의 퇴화는 "드루젠"이라고 알려진, 황반 밑에 작은 황색 침전물이 형성되는 것과 관련이 있으며; 또한, RPE에 리포푸신의 축적은 광수용체 변성과 지도형 위축을 유발한다. 이러한 현상은 황반의 박화(thinning) 및 건조(drying)를 유발한다. 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성을 조절하는 1종 이상의 작용제, 예를 들어, 메갈린-조절제를 포유동물에게 투여하는 것은 상기 포유동물의 눈에서 광수용체 변성 및/또는 지도형 위축의 발생을 감소시키거나, 광수용체 변성 및/또는 지도형 위축의 확산을 제한할 수 있다.

"습윤(Wet)" 형 황반 변성증에 있어서는, 새로운 혈관이 형성되어(즉, 신생 혈관 생성), 망막 조직, 특히, 황반 밑에 존재하는 망막 조직(인간의 예리한 중심 시력을 담당하는 망막의 일부)에 대한 혈액 공급이 개선된다. 신생 혈관은 쉽게 손상되며, 때로는 파열되어 출혈을 일으켜, 주위 조직까지 손상시킨다. 습윤 황반 변성증은 전체 황반 변성증 환자 중 약 10%에서만 발생하지만, 황반 변성증-관련 실명 원인의 대략 90%를 차지한다. 혈관 내피 세포 성장 인자 또는 VEGF라고도 불리는 성장 촉진 단백질은 눈 안에서 혈관의 비정상적 성장을 유도한다. 이러한 발견은 VEGF를 억제 또는 차단하는 약물에 관한 실험을 통한 연구에 박차를 가하여 왔다. 연구 결과, 항-VEGF 제제는 비정상적인 혈관 성장을 차단 및 예방하는데 사용될 수 있음을 알게 되었다. 이러한 항-VEGF 제제는 VEGF 자극을 중단 또는 억제하여, 혈관의 성장을 저하시킨다. 이러한 항-VEGF 제제는 또한 혈관 신생을 성공적으로 억제하거나 또는 VEGF가 망막 밑에 있는 혈관을 성장시키지 못하도록 만들 뿐만 아니라, 혈관이 새는 것도 막을 수 있다. 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성을 조절하는 1종 이상의 작용제, 예를 들어, 메갈린-조절제를 포유동물에게 투여하는 것은 상기 포유동물의 눈에서 습윤형 연령-관련 황반 변성증의 형성을 감소시키거나, 이의의 확산을 제한할 수 있다. 유사하게, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성을 조절하는 작용제, 예를 들어, 메갈린-조절제를 사용하여 포유동물의 눈에서 맥락막 신생혈관형성(choroidal neovascularization) 및 황반 밑의 비정상정 혈관 형성을 치료할 수 있다.

스타르가르트 질환은 유년기에 발병하는 황반 변성증의 퇴행성 형태인 것으로 유명한 황반 이영양증이다. Rim 단백질(RmP)에 대한 인간 ABCA4 유전자에서의 돌연변이가 스타가르트 질병에 관여한다. 조직학적으로, 스타가르트 질병은 RPE 세포에 리포푸신 색소 과립이 침전되는 것과 연관이 있다. AMD에서 우세한 돌연변이가 여전히 불확실하지만, ABCA4에서 돌연변이는 열성 망막 색소변증, 열성 추체-간체 이영양증, 및 비-삼출성 연령관련 황반변성과도 연루되어 있다. 스타르가르트 질환과 유사하게, 이러한 질병들도 간상체의 암 순응 과정의 지연과 관련되어 있다. AMD와 일부 망막색소변성증 환자에 있어서, RPE 세포 내에 리포푸신이 현저하게 침착되는 것이 관찰된다. 또한, 스타가르트 질병의 상염색체 우성형은 ELOV4 유전자에서의 돌연변이로 야기된다.

또한, 어린이, 10대 청소년 또는 성인들에게 발병하는 황반 변성증[일반적으로 초기 발병 또는 연소기 황반 변성증이라고 함]에는 몇 가지 유형이 있다. 이러 한 유형 중 다수는 유전적이며, 황반 변성증이라기보다는 황반 이영양증으로 간주된다. 황반 이영양증의 몇몇 예에는 다음과 같은 것들이 포함된다: 추체-간체 이영양증(Cone-Rod Dystrophy), 각막 이영양증, 푸 이영양증(Fuch's Dystrophy), 소르스비 황반 이영양증(Sorsby's Macular Dystrophy), 베스트병(Best 질환) 및 연소기 망막 층간 분리(Juvenile Retinoschisis), 그리고 스타르가르트 질환.

안구 조직에서 레티놀 흡수

레티노이드(비타민 A와 이의 유사체)는 정상 재생산, 정상 면역성, 정상 성장 및 세포 분화, 및 정상 시력을 포함하는 다수의 필수적 생리 과정을 유지하는데 요구된다. 체내에 존재하는 모든 레티노이드는 음식으로부터 획득되어야 한다. 다른 식이성 지질과 더불어, 비타민-A가 풍부한 음식을 흡수한 후, 식이성 레티노이드(레티닐 에스테르로 변형됨)는 킬로미크론(chylomicrons)으로 패키징되며 간 성상 세포(hepatic stellate cells)에 저장된다.

레티노이드에 대한 신체의 요구를 충족시키기 위해, 간은 21 kDa 단백질인, 레티놀-결합 단백질(RBP)에 결합된 레티놀을 분비한다. 레티놀-RBP는 55kDa 단백질인, 트랜스씨레틴(tranthyretin, TTR)과의 1:1 몰 복합체로 발견된다. 레티놀-RBP 홀로단백질이 간외 표적 조직, 예컨대 눈으로 운반될 수 있게 되기 전에, 이것은 트랜스씨레틴(TTR)과 결합하여야 한다[Zanotti and Bemi, Vitam. Horm., 69:271-95 (2004)]. 이러한 2차 복합체는 레티놀이 연장된 기간 동안 순환 내에서 유지되게 한다. TTR과의 결합은 간세포에서 RBP가 방출되는 것을 촉진하며, RBP의 사구체 여과와 신장 대사작용을 막는다.

트랜스씨레틴에 결함이 있는 생쥐종은 생존가능하며 번식 능력이 있지만, 상당히 부족한 혈청 레티놀, 레티놀-결합 단백질, 및 갑상선 호르몬 수준을 나타내는데, 이는 트랜스씨레틴이 순환하는 혈장에서 이러한 대사산물을 정상 수준으로 유지하는데 역할한다는 것을 확신시킨다[Episkopou et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90, 2375-2379]. 더욱이, 신장에 의한 트랜스씨레틴 재흡수는 리포프로테인 수용체 메갈린에 의해 매개된다[Sousa et al., J Biol Chem, 2000, 275, 38176-38181]. 이 흡수는 소변으로 호르몬이 소시되는 것을 막는 수단으로서 역할한다.

gp330으로도 공지된 메갈린은 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원이며 근위세뇨관(proximal tubule) 세포내 엔도시토시스 경로에 자리한다. 메갈린은 세뇨액(tubular fluid)에서 나온 단백질의 흡수를 위한 스캐빈저 수용체로 역할하는 600 kDa의 막-결합 엔도시토시스 단백질(이의 당화된 형태로)이다[Christensen et al., J. Am. Soc. Nephrol. 10: 2224-2236, 1999]. 고 친화도로 메갈린에 결합하는 리간드를 중에는, 비타민 운반 단백질, 예를 들어, 레티노이드 결합 단백질, 예컨대, 레티놀 결합 단백질(RBP)과 광수용체간 레티노이드 결합 단백질(IRBP)이 있다. 메갈린은 근위 세뇨관 세포내에서 엔도시토시스 경로에서 가장 풍부한 엔도시토시스 수용체 단백질이며 사구체 초여과물로부터, RBP를 포함하는, 단백질의 엔도시토시스 흡수에 관여한다.

레티놀-RBP-TTR 복합체는 표적 조직으로 운반되고, 여기서 레티놀은 흡수되거 다양한 세포 과정을 이용하게 된다. RBP-TTR 복합체에 의한 순환을 통한 세포로의 레티놀의 전달은 세포와 조직이 레티놀을 얻는 주요 경로이다. 신체에서 다 른 조직과 달이, 눈은 식후(postprandial) 레티놀을 매우 적게 받아들인다. 눈은 정상 시각 색소 형성을 위해 필요한 레티노이드를 획득하기 이한 이의 주요 수단으로서 RBP에 결합된 레티놀에 의존하여야 한다[Vogel et al., Biochemistry, 2002, 41, 15360-15368].

레티놀 결합 단백질(RBP)

레티놀 결합 단백질, 또는 RBP는 대략 21 kD의 분자량을 갖는 단일의 폴리펩티드 사슬이다. RBP는 클로닝 및 시퀀싱되었으며, 이의 아미노산 서열이 확인되었다[Colantuni et al., Nuc. Acids Res., 11:7769-7776 (1983)]. RBP의 3차원 구조를 통하여, 지용성 비타민인 레티놀에 결합하여 이를 보호하도록 디자인된 특수한 소수성 포켓(소수성pocket)을 밝혀내었다[Newcomer et al., EMBO J., 3:1451-1454 (1984)]. 혈장에서, 혈장 RBP의 약 95%는 트랜스씨레틴(TTR)과 1:1의 몰/몰 비로 결합하는데, 여기서 혈장 비타민 A의 거의 대부분은 RBP에 결합되어 있다. TTR은 54,980의 분자량을 지니며 잘 규명된 4개의 동일한 소단위체들로 구성된 혈장 단백질이다. X-선 회절법에 의해 밝혀진, 완전한 3차원 구조는 사면체 형태로 배열된 넓은 베타-시트를 나타내었다[Blake et al., J. Mol. Biol., 121:339-356 (1978)]. TTR과 RBP-레티놀의 복합체 형성 과정은 레티놀이 사구체를 통해 여과되는 것을 감소시켜, 혈장 내 레티놀 및 RBP의 반감기를 약 3배 정도 증가시키는 것으로 파악된다.

망막 및 RPE 세포와 같은, 세포내에서 복합체를 형성한 레티놀-RBP-TTR 형태로부터 레티놀 흡수는 표적 세포 상에서, 예를 들어, LDL 수용체 유전자 패밀리 구 성원과 같은, 세포내 수용체에 대한 RBP의 결합에 의해 일어난다. 몇몇 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원은 메갈린 또는 메갈린-관련 단백질이다. 몇몇 구체예에서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원은 메갈린이다. 이 상호작용은 RBP-수용체 복합체의 엔도시토시스과 상기 복합체에서 연이은 레티톨의 방출, 또는 세포내 레티놀 결합 단백질(CRBP)에 대한 레티놀의 결합, 및 세포에 의한 혈장으로의 apoRBP의 연이은 방출을 유도한다. 다른 경로가 레티놀의 세포내 진입을 위한 대안적인 메커니즘으로 고려되는데, 이에는 세포내로 레티놀이 단독으로 흡수되는 것을 포함한다[검토를 위해 다음 문헌 참조: Blomhoff (1994)].

신장에서, RBP는 비아코어(BIAcore) 실험에 의해 정제된 메갈린에 결합하며 레티노이드 결합 단백질과 레티놀은 메갈린-결함 마우스의 소변에서 발견되나 대조군 마우스에서는 발견되지 아니한다는 것이 밝혀졌다[Christensen EI. et al. J. Am. Soc. Nephrol. 10:685-695, 1999]. 내생성 RBP는 면역조직화학에 의해 대조군 생쥐의 근위 세뇨관에서 확인되었으나 메갈린 녹아웃 마우스에서는 확인되지 아니하였다. 예를 들어, 망막과 RPE와 같은 다른 조직도 메갈린 또는 메갈린-관련 단백질을 발현하며 RBP 결합과 RBP 내부화가 가능하다.

A2E[리포푸신의 주요 형광발광단(fluorophore)]가 시각-주기 레티노이드, 올-트랜스-레티날데히드(A2E의 전구체)의 과도한 생성에 기인하는 연령-관련 황반 변성과 스타가르트 질병을 포함하는, 황반 변성 또는 망막 변성 또는 이영양증에서 형성된다. 그러므로 망막과 RPE에서 비타민 A, 11-시스-레티날 및 올-트랜스 레티날이 감소되는 양은 A2E 및 리포푸신 생성(build-up)을 감소시키는데 유익할 것이 며, 연령-관련 황반 변성의 치료에 유익할 것이다.

혈청 레티놀 수준의 감소는 안구 질환의 치료를 위하여 고려되는 한가지 접근법이다. 안구 질환의 치료를 위한 또 다른 접근법은 안구 조직내로의 레티놀의 흡수를 조절하는 것이다. 한 접근법에서, 망막 및/또는 RPE 세포에서 발현되는 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성이 작용제로 조절되는데, 레티놀, 레티놀-RBP, 및/또는 레티놀-RBP-TTR 복합체가 상기 수용체(들)에 결합하는 것이 방해되고, 그로 인해 RPE 및/또는 망막으로의 레티노이드의 진입이 억제되는 그러한 방식으로 조절된다.

또 다른 접근법에서, 망막 및/또는 RPE 세포에서 발현되는 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성은 레티놀, 레티놀-RBP, 레티놀-RBP-TTR 및/또는 레티놀-IRBP 복합체가 상기 수용체(들)에 결합되는 것이 방해되는 그러한 방식으로 조절된다. 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 대한 레티놀, 레티놀-RBP, 레티놀-RBP-TTR 및/또는 레티놀-IRBP 복합체 결합 억제는 시각 주기를 붕괴시킬 수 있다. 시각 주기의 붕괴는 특정 안구 질환에서 망막 및/또는 RPE 세포내에 존재하는 독성 화학물질의 양 또는 이의 축적을 감소시킬 수 있다.

망막 및 망막 색소 상피(RPE) 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리에 속하는 수용체 단백질이 본원에서 식별된다. 한 구체예에서, LDL 수용체 유전자 패밀리에 속하는 한 수용체 단백질은 레티노이드 결합 단백질 수용체이다. 몇몇 구체예에서, 상기 수용체 단백질은 메갈린이다. 몇몇 구체예에서, 상기 수용체 단백질은 메갈린-관련 단백질이다. 몇몇 구체예에서, 상기 수용체 단백질은 LRP이다. 몇몇 구체예에서, 상기 수용체 단백질은 LRP-관련 단백질이다. 몇몇 구체예에서, 상기 수용체 단백질은 STRA6 또는 STRA6-관련 단백질이다. 몇몇 구체예에서, 수용체 단백질은 STRA6이다. 몇몇 구체예에서, 상기 수용체 단백질은 STRA6-관련 단백질이다. STRA6는 레티놀 결합 단백질에 대한 막 수용체로서 식별되었으며 STRA6가 비타민 A의 세포내 흡수를 조절할 수 있다는 증거가 제시된 바 있다. STRA6에 관한 추가 정보는 미국 특허 제 7,173,115호, 카와구치 등의 논문[Kawaguchi R. et al., 2007, Science 315: 820-25], 및 블래너의 논문[Blaner W. 2007, Cell Metabolism 5: 164-66]에서 찾아 볼 수 있으며, 상기 모든 문헌들은 이들의 전체내용이 참고문헌으로 본원에 통합된다. STRA6 관련 단백질에 관한 추가 정보는 미국 특허 출원 US 2007/0128188호, US 2003/0021788호, 및 US 2002/0156252호에서 찾아 볼 수 있으며, 상기 모든 문헌들은 이들의 전체내용이 참고문헌으로 본원에 통합된다.

본원에서 LDL 수용체 유전자 패밀리에 속하는, 망막 및 RPE 세포내의 트랜스사이토틱 수용체의 활성을 상쇄(antagonizing), 작동(agonizing), 및/또는 조절(modulating)함으로써 시력 결함을 예방, 치료 또는 완치시키기 위한 방법이 제공된다. 몇몇 경우에, RPE의 하부막 상의 LDL 수용체 유전자 패밀리에 속하는 수용체는 LDL 수용체 유전자 패밀리 결합 작용제로 상쇄되고, 그에 따라 RBP-레티놀, RBP-레티놀-TTR, 또는 레티놀의 결합 및 RPE내로의 RBP-레티놀, RBP-레티놀-TTR, 또는 레티놀의 흡수가 억제된다. 다른 경우에, RPE의 상부막 상의 LDL 수용체 유전자 패밀리에 속하는 수용체가 LDL 수용체 유전자 패밀리 결합 작용제로 상쇄되고, 그에 따라 레티놀, 레티날, IRBP-레티놀, IRBP-레티날, 또는 IRBP의 결합 및 RPE 세포내 또는 외부로의 레티놀, 레티날, IRBP-레티놀, IRBP-레티날, 또는 IRBP의 트랜스시토시스가 억제된다.

약물 및 독소의 독성 효과

다양한 안구 질환 또는 병태는 약물 및 독소를 이용한 처치의 결과이다. 예를 들어, 아미노글리코시드와 같은, 항생제는 박테리아 감염을 치료 또는 예방하기 위해 안과학에서 자주 사용된다. 이러한 항생제들은 이독성(ototoxic), 신독성(nephrotoxic)을 비롯하여 망막독성인 것으로 알려져 있다[D'Amico et al. Retinal Toxicity of Intravitreal Gentamicin Invest. Ophthalm. Vis. Sci. 25:564-572, 1984; Campochiaro et al. Arch. Ophthalmol. 113(3):262-263, 1995; Grizzard, Arch Ophthalmol. 112(1):48-53, 1994)]. 예를 들어, 아베카신, 젠타마이신, 카나마이신, 네오마이신, 파라마이신, 리보스타마이신, 리비도마이신, 아미카신, 디베카신, 부타카신, 토브라마이신, 스트렙토마이신, 디히드로스트롭토마이신, 시소미신, 베르다미신, 네틸미신, 및 부티카신과 같은, 아미노글리코시드는 안구 조직에 축적되고/거나 눈에서 독성 효과를 발휘하는 것으로 알려져 있다. 한 구체예에서, 작용제는 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 항생제가 결합하는 것을 막는다. 또 다른 구체예에서, 본원에서 제공된 작용제는 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 결합 및 상기 구성원에 의한 항생제의 트랜스시토시스를 막는다.

눈의 다른 질환이 안구 독성을 나타내는 약물과 관련되어 있다. 특정 약제학적 약물은 눈 안의 망막 및/또는 RPE 세포에 축적된다. 특정 경우에, 치료 약물 은 예를 들어, 눈의 망막 및/또는 RPE 세포와 같은 안구 조직에서 대사된다. 시토크롬 P450 및 미엘로퍼옥시다제가 충만한, 망막은 산화제에 대하여 외래물질(xenobiotics)을 활성화시키는 역할을 할 수 있고, 그 결과 안구 손상이 초래된다. 이러한 활성화된 작용제는 직접적으로 레티날 부가생성물(retinal adducts)을 형성시키거나 감소된 안구내 글루타치온 농도를 감소시킬 수 있다[Toler, Exp. Biol. Med. 229:607-615, 2004]. 한 구체예에서, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 대한 치료 약물의 결합 억제는 상기 치료 약물의 사용과 관련된 안구 독성을 감소시킨다. 또 다른 구체예에서, 망막 및 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 의한 치료 약물의 결합 및 상기 약물의 트랜스시토시스는 본원에 소개된 작용제에 의해 억제된다.

망막증은 광범위하게 2가지 범주, 단순 또는 비증식성 망막증 및 증식성 망막증으로 분류된다. 단순 망막증은 혈관 벽의 팽윤(bulging), 안구내 출혈, 면화삼출물(cotton wool exudates)로 불리는 죽은 망막 세포의 작은 덩어리, 및 폐쇄된 혈관에 의해 식별되는 결함을 포함한다. 이 형태의 망막증은 유순한 것으로 생각된다. 증식성, 또는 중증 망막증 형태는 새롭게 자라난 혈관, 안구 내부에 형성된 상처 조직, 심하게 손상된 고립형(closed-off) 혈관, 및 혈관을 보호하는 혈관 메쉬로부터 떨어져 나온 망막(망막 박리)에 의해 식별되는 결함을 포함한다.

다양한 치료 약물-유도성 막막 효과가 의학 치료의 경과 중에 관찰되어 왔다[LeBlanc et al. Regulatory Toxicology and Pharmacology 28, 124-132, 1998]. 다양한 치료학적 부류에 속하는 약물들은 안구에서 약간의 독성 효과를 나타내었 다. 약간의 약물-유도성 망막 효과를 나타내는 약물을 하기 약물들을 포함한다:

- 예를 들어, 클로로퀸, 퀴닌과 같은 항말리아제;

- 예를 들어, 아미노글리코시드, 스파르소마이신, 클리오퀴놀과 같은, 항생 약물;

- 예를 들어, 에탐부톨과 같은 항결핵 약물;

- 예를 들어, 미코나졸과 같은 항진균 약물;

- 예를 들어, 페노티아진과 같은 CNS 약물(예를 들어, 클로르프로마진, 아미트리프탈린, 리세르지드와 같은, 페노티아진);

- 예를 들어, 니페디핀, 아미오다론과 같은 심혈관 약물;

- 예를 들어, 5-플루오로우라실, 타목시펜, 카무스틴, 클로람부실, 시스-플래티늄, 마이토테인, 니트로겐 머스타드, 니트로소 우레아, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 독소루비신과 같은 항신생물 약물;

- 예를 들어, 에트레티네이트, 칸타크산틴, 이소트레티노인과 같은 피부 약물;

- 예를 들어, 코르티코스테로이드, 이부프로펜, 인도메타신, 페닐부타존과 같은 항염증 약물;

- 예를 들어, 틸로론(항바이러스) 알파 인터페론과 같은 면역조절 약물;

- 경구 피임제

- 예를 들어, 클로미펜과 같은 호르몬;

- 예를 들어, 데페록사민, 니아신, 와파린과 같은 기타 약물;

- 예를 들어, 디피베프린, 페닐에프린, 에피네프린과 같은 교감신경흥분 약물.

모세관 벽과 함께 RPE는 혈관-망막 장벽을 구성한다. 안구내 망막 및/또는 RPE 세포로의 치료 약물의 진입은 수용체 매개 트랜스시토시스에 의해 이루어진다. 몇몇 구체예에서, 치료 약물은 안구에서 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 결합하며 수용체 매개 트랜스시토시스를 겪게 된다. 본원에서 치료 약물에 기인하는 망막 독성 부작용의 치료 및/또는 예방 방법 및 이를 위한 조성물이 제공된다. 한 구체예에서, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 대한, 안구내 독성을 나타내는, 치료 약물의 결합은 예를 들어, 메갈린 결합 작용제와 같은 LDL 수용체 유전자 패밀리 결합 작용제에 의해 억제된다. 또 다른 구체예에서, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원은 LDL 수용체 유전자 패밀리 결합 작용제와 길항작용하여, 그에 따라 치료 약물의 결합 및 망막 및/또는 RPE 세포내로의 상기 약물의 흡수가 억제된다. 한 구체예에서, 상기 치료 약물은 항생제 약물이다. 또 다른 구체예에서, 상기 치료 약물은 아미노글리코시드이다. 몇몇 구체예에서, 상기 망막-독성 치료 약물은 리포프로테인 또는 예를 들어, 알부민 또는 락토페린과 같은, 운반 단백질에 결합된다. 망막 및/또는 RPE 세포내 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 대한 운반 단백질 또는 리포프로테인의 결합은 망막 및/또는 RPE 세포내로의 망막-독성 치료 약물의 진입을 위한 또 다른 수단을 제공한다. 한 구체예에서, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원은 LDL 수용체 유전자 패밀리 결합 작용제와 길항작용하여, 그에 따라 운반 단백질 또는 리포단백질의 결합 및 망막 및/또는 RPE 세포내로의 상기 단백질의 흡수가 억제된다.

LDL 수용체 유전자 패밀리

개개의 단백질은 하나 이상의 독특한 단량체 도메인을 보유한다. 이러한 단백질들은 종종 모자이크 단백질로 불린다. 예를 들어, 저밀도 리포프로테인(LDL)-수용체 유전자 패밀리의 구성원들은 4개의 주요 구조 도메인을 내포한다: 시스테인 풍부 A-도메인 반복부, 표피 성장 인자 전구체 유사 반복부, 막관통 도메인 및 세포질 도메인. LDL-수용체 유전자 패밀리는 저밀도 리포프로테인(LDL) 수용체, 초저밀도 리포프로테인 수용체(VLDL-R), 아포리포단백질 E 수용체 2, LDL 수용체-관련 단백질(LRP) 및 메갈린을 포함한다. 패밀리 구성원들을 하기 특징들을 지닌다: 1) 세포 표면 발현; 2) A-도메인 반복부로 이루어진 세포외 리간드 결합; 3) 리간드 결합을 위한 칼슘에 대한 요구; 4) 수용체-연관 단백질 및 아포리포단백질(apo) E의 인지; 5) YWTD 반복부를 포함하는 표피 성장 인자(EGF) 전구체 상동성 도메인; 6) 단일막관통부위; 및 7) 다양한 리간드의 수용체-매개 엔도시토시스[다음 문헌 참조: Hussain et al., The Mammalian Low-Density Lipoprotein Receptor Family, (1999) Annu. Rev. Nutr. 19: 141-72]. 그 외에도, 상기 구성원들은 몇몇 구조적으로 비유사한 리간드에 결합한다.

저밀도 리포프로테인(LDL) 수용체 유전자 패밀리의 단백질[Neels, J. G. et al., Fibrinolysis Proteolysis 12, 219-240, 1998]은 유사한 구조의 관련된 모자이크 막관통 수용체의 그룹이며 이들의 엑토도메인(ectodomains)내에 다양한 범위 의 단백질 리간드에 결합한다. LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원들 중 임의의 구성원에 결합된 리간드는 고전적인 엔토사이토시스에 의해 내부화된다[Chen et al., J. Biol. Chem. 265, 3116-3123, 1990]. 인간에서, 공지된 LDL 수용체 유전자 패밀리 단백질 그룹은, 예를 들어, LDL 수용체[Russell, D. et al., Cell 37, 577-585, 1984], LDL 수용체-관련 단백질(LRP)[Herz, J. et al., EMBO J. 7, 4119-4127, 1988; Kristensen, T. et al., FEBS Lett. 276, 151-155, 1990], 초저밀도 리포프로테인 수용체(VLDLR)[Webb, J. C. et al. Hum. Mol. Genet. 3, 531-537, 1994], apoE 수용체2(apoER2)[Kim et al. J. Biol. Chem. 271, 8373-8380, 1996], 메갈린/gp330/LRP2[Hjalm, G. et al. Eur. J. Biochem. 239, 132-137, 1996], LRP6 [Brown et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 248, 879-888, 1998] 및 LRP7 [Hey, P. J. et al., Gene (Amst.) 216, 103-111, 1998; Dong, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 251, 784 790, 1998]을 포함한다. 도 1을 참조하라.

LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원들은 엔도시토시스 경로를 통해 세포내로의 다양한 단백질 적재물(cargoes)의 흡수를 매개하는 싱글-패스형 막 단백질 I(single-pass type I membrane protein)의 패밀리에 속한다[Krieger, M. and Herz, J. Structures and functions of multiligand lipoprotein receptors: macrophage scavenger receptors and LDL receptor-related protein (LRP). Annu. Rev. Biochem. 63, 601-637, 1994]. 각각의 수용체는 많은 상이한 적재 단백질에 결합하며, 연속적으로 세포 표면에서부터 세포표면으로 순환된다. 몇몇 리간드들 은 상이한 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 결합할 수 있다. 몇몇 리간드들은 오직 LDL 수용체 유전자 패밀리의 한 구성원에만 결합할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 일부 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원들은 동일한 리간드에 결합할 수 있다. 다른 구체예들에서, LDL 수용체 유전자 패밀리 중의 한 구성원만이 특정 리간드에 결합할 수 있다. 다른 구체예들에서, 상이한 조직 유형에서 발현된 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원은 동일한 리간드에 결합한다. 다른 구체예들에서, 상이한 조직 유형에서 발현된 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원은 동일한 리간드에 결합하지 아니한다. 몇몇 구체예에서, 세포의 상이한 부분에서 발현된 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원은 동일한 리간드에 결합한다. 다른 구체예에서, 세포의 상이한 부분에서 발현된 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원은 동일한 리간드에 결합한다. 몇몇 구체예에서, RPE 세포의 하부막에 존재하는 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원은 RPE 세포의 상부막에 존재하는 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 결합하는 동일한 리간드에 결합한다. 몇몇 구체예에서, RPE 세포의 하부막에 존재하는 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원은 RPE 세포의 상부막에 존재하는 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 결합하는 동일한 리간드에 결합하지 아니한다.

LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원은 특징적으로 하기 5가지 공통 구조 모티프를 지닌다:

- a) 리간드-결합(컴플리먼트)형 시스테인-풍부 반복부;

- b) 표피 성장 인자(EGF) 수용체-유사 시스테인 풍부 반복부;

- c) 티로신-트립토판-트레오닌-아스파르트산(YWTD) 도메인;

- d) 단일 막관통부분; 및

- e) 1-3 NPxY 모티프를 포함하는 세포질 미부(cytoplasmic tail).

아미노-말단 영역은 2개 내지 11개의 개별 반복부의 클러스터로 리간드-결합-형 반복부를 포함하는데, 이들 각각은 3개의 내부 이황화 결합으로 특징져지는 대략 40개의 아미노산으로 이루어진 긴가닥(stretch)이다. 이러한 수용체에 대한 상기 리간드의 대부분은 이러한 리간드-결합 도메인과 상호작용한다. 다수의 리간드-결합 도메인의 존재는 수용체에 대한 다양한 양상의 리간드 결합을 유도한다. 일부 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 있어서, 다양한 리간드에 대한 다수의, 독립적인 결합 부위가 존재한다. 일부 리간드의 경우, 수용체에 대한 단지 1개의 고-친화력 결합 부위만 존재한다. 몇몇 경우에 있어서, 상이한 결합 부위를 지니는 2개 이상의 상이한 리간드가 동시적으로 수용체에 결합할 수 있을지도 모른다. 몇몇 경우에 있어서, 수용체 단백질은 하기한 것의 결과로 고 친화력을 지니는 다수의 구조적으로 독특한 리간드에 결합할 수 있다: 수용체 단백질 내 다수의 리간드-결합-형 반복부의 존재, 각각의 반복부에 있어서 독특한 윤곽의 표면과 전하 분배, 및 리간드와 수용체 둘 모두 사이의 다수의 상호작용. 일부 리간드는 순차적 방식으로 상이한 조합(combinations)의 이러한 반복부를 인지할 수 있을 것이며, 한편 다른 것들은 별개의 클러스터로부터 반복부를 인지하는 것으로 보인다. RAP가 수용체 단백질 메갈린 상의 2개의 결합 부위를 점유하고 있으며[Beeg, EJ. Br. J. Clin. Pharmacol. 39, 597-603, 1995[, 한편 대략 60 내지 100개 분자의 저분자량 유기 화합물인 젠타마이신은 메갈린 단백질에 대하여 결합하는 것으로 보고된바 있 다[Schmitz, C. J. Biol. Chem. 227, 618-622, 2002].

리간드-결합 (보체(complement)) 형 시스테인-풍부 반복부는 양이온성 리간드에 결합할 수 있는 다수의 음으로 하전된 잔기들을 함유한다(참조예: US 2003/0202974호, 이 특허문헌은 참고문헌으로 통합됨). 몇몇 구체예에서, 양이온성 리간드들의 결합은 수용체 단백질과의 이온성 상호작용에 의해 이루어진다.

리간드 결합 도메인에 후속하여, 시스테인-비풍부(cystein-poor) 스페이서 영역에 의해 분리된, 시스테인-풍부 표피 성장 인자(EGF) 전구체-형 반복부가 연결되어 있다. 스페이서 영역은 엔도좀 구획(endosomal compartments)에서 리간드의 pH-의존성 리간드 방출에 관여하는 YWTD 모티프를 함유한다. EGF 전구체-형 반복부가 측면에 접해있는(flanked) YWTD 모티프는 EGF 전구체 상동 도메인으로 지칭된다. LRP와 gp330에서, EGF 전구체 상동 도메인에 후속하여 또 다른 리간드-결합 도메인 또는 스페이서 영역이 연결되어 있다.

이들의 세포외 도메인과는 반대로, 상기 상이한 수용체들의 세포질 미부는 컨센서스 서열 NPxY에 의해 특징져지는 짧은 아미노산 모티프를 예외로 하면서 매우 적은 서열 유사성을 지니는데, NPxY는 테트라-아미노산 모티프 아스파라진-프롤린-X-티로신(여기서 X는 임의의 아미노산을 나타냄)을 지칭하며, 상기 모티프는 엔도시토시스에 앞서 코팅된 피트(pits)로 LDL 수용체의 크러스터링을 매개하는 것으로 알려져 있다[Willnow T.E. et al. Nature Cell Biology, vol 1, E157-E162, 1999].

몇몇 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원, 예컨대 LDL 수용체 및 VLDL 수용체 는, 세포외 공간에 O-연결형 당 도메인과 이에 인접한 단일막-관통 부분을 함유한다.

LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원은, 예를 들어, 하기와 같이 서열분석되었다:

LRP(LDL 수용체 관련 단백질; 알파-2-매크로글로불린 수용체)

cDNA: X13916 NM_002332

유전자: AH003324

LRP2(메갈린; gp330; gp600)

cDNA: U33837

유전자: NT_002176

아포리포단백질 E 수용체 2(ApoE 수용체 2; LRP8)

cDNA: D50678

유전자: SEG_D86389S

초저밀도 리포프로테인 수용체(VLDL 수용체)

cDNA: D16493

유전자: SEG_HUMVLDLR

LRP1B

cDNA: NM_018557

MGEF-7

cDNA: AB011540.

LDL 수용체

세포는 LDL 수용체를 이용하여 저밀도 지질단백질(LDL)의 엔도시토시스로 혈액으로부터 콜레스테롤을 흡수한다. 리간드에 결합한 후, LDL 수용체는 혈장 막에서 코팅된 피트로 클러스터를 형성한다. 그런 다음 엔도시스틱 비히클의 형성 및 내부화, 리소좀내에서 엔도시토시스된 지질단백질의 가수분해 및 세포질내로 지질의 방출이 후속하여 일어난다[Brown et al. A receptor-mediated pathway for chol에스테르ol homeostasis. Science. 232, 34-47 (1986)]. LDL 수용체는 지질단백질을 함유하는 아포리포단백질 B 및/또는 아포리포단백질 E(apoE)의 세포내 내부화를 매개함으로써 콜레스테롤 항상성유지에 중요한 역할을 한다. LDL 수용체는 NPxY(Asn-Pro-x-Tyr, 여기서 x는 임의의 아미노산을 나타냄) 서열을 함유하는 50개 잔기 길이의 세포질 도메인을 지니며, 상기 서열은 이 수용체가 클라스린(clathrin)-코팅된 피트를 목표로 삼게 한다. 세포외 부분은 O-연결형 당 도메인과 2개의 시스테인-풍부 반복부 클러스터를 함유한다. 첫번째 시스테인-풍부 클러스터는, O-연결형 당 도메인 옆에 위치하고 있는데, 반복부의 5개 복제물(copies)에 의해 분리된 피 성장 인자 유사 반복부와 상동성을 지니며, 상기 각각의 반복부는 공통적으로 테트라펩티드, 티로신-트립토판-트레오닌-아스파르트산(YWTD)를 함유한다. 표피 성장 인자 상동성은 상기 LDL 수용체가 엔도좀 내부에서 리간드를 방출시키는 산-의존성 형태 변화를 겪도록 하는데 필요한 것으로 보이며, 비점유된 수용체들이 세포 표면으로 다시 재순환되도록 한다. 두번째 시스테인 풍부 클러스터는 7개의 보체 유사 반복부를 함유하고 있는데, 이 반복부는 리간 드, 아포리포단백질 B와 E의 결합에 관여한다.

LDL-수용체 관련 단백질(LRP)

LDL 수용체 관련 단백질(LRP)은 다른 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원들보다 더 거대하나 상기 구성원들과 구조적으로 유사하다[Herz et al. J. Clin. Invest. 108:779-784, 2001; Willnow et al. Nature Cell Biology, vol. 1, E157-E162, 1999; Kreiger et al. Structures and functions of multiligand lipoprotein receptors:macrophage scavenger receptors and LDL receptor-related protein (LRP). Annu. Rev. Biochem. 63:601-637 (1994)]. LRP는 절단되어 아미노-말단 515kDa 단편(LRP 515)과 카르복시-말단 85kDa 단편(LRP85)을 생성시키는 600kDa의 전구체(LRP 600)로 합성된다. LRP 515는 공지된 모든 리간드 결합 부위를 수용하고 있으며, 막 앵커와 세포질 도메인을 함유하는, LRP 85와 비공유결합적으로 연결되어 있다.

본원에 사용된, "LRP"는 단백질인데, 이 단백질의 cDNA를 엔코딩하는 서열은 cDNA:X13916 NM_002332; 유전자: AH003324와 75% 이상의 뉴클레오티드 동일성을 갖는다.

본원에 사용된, "LRP-관련 단백질"은 LDL 수용체 유전자 패밀리에 속하며 LRP에 대하여 50%를 초과하는 상동성을 지니거나; 항-LRP 항체(특이적인 항체들)에 고 특이성을 가지며 반응하는 단백질이다.

LDL 수용체는 리포프로테인 물질대사에서 유일하게 반응하는 것으로 나타난 반면, LRP과 이 패밀리의 다른 구성원들은 다른 독특한 기능을 지니는 것으로 보인 다. LRP의 많은 기능들 중에서, 킬로미크론은 LRP의 엔도시토시스 활동에 의해 간에서 흡수되는 것으로 알려져 있다. 그 외의 LRP 결합 리간드는 하기를 포함한다:

- 프로테이나아제 및 억제자 복합체: 예를 들어, α2M-프로테이나아제 복합체, 임신 영역 단백질(Pregnancy Zone Protein, PZP)-프로테이나아제 복합체, t-PA, u-PA, t-PA:PAI-1, u-PA:PAI-1, uPA:프로테이나아제 넥신 1, 조직 인자 경로 억제자, 엘라스타아제-α1-안티트립신, α1-안티트립신, C1 억제자;

- 지질단백질: 예를 들어, 아포 E, 아포 E-풍부 β-VLDL, 리포프로테인 리파아제, 리포프로테인 리파아제-풍부 VLDL, 리포프로테인 리파아제-풍부 β-VLDL, 간성(hepatic) 리파아제;

- 혈액 응고제: 예를 들어, 인자 IXa, 인자 VIIIa, 인자 VIIa/TFPI, 항트롬빈 III, THPI, 헤파린 공동인자 II;

- 샤페론 단백질: 예를 들어, HSP-96, RAP;

- 기질 단백질: 예를 들어, 트롬보스폰딘-1, 트롬보스폰딘-2;

- 기타 분자: 예를 들어, 슈도모나스 엑소톡신 A, 락토페린, RAP, α2-거대글로불린, 킬로미크론 잔류물(remnants), 보체 C3, 스핑고지질 활성화 단백질 (SAP), 리노바이러스, HIV-Tat 단백질, MMP-13, MMP-9, 호르몬 갑상선자극호르몬(thyrotropin), 공동 인자 코발라민 및 리소좀 단백질 사포신; RBP 및 iRBP.

메갈린

gp330 또는 LRP2로도 알려져 있는, 메갈린은 당화된 형태로 600-kDa의 세포표면 단백질인데, 신장 근위 세뇨관, 내이의 와우각, 눈의 섬모체 상피를 포함하는 인체의 수많은 상피 표면에서 발현된다(Christensen et al. Essential Role of Megalin in Renal Proximal Tubule for Vitamin Homeostasis. J. Am. Soc. Nephrol. 10: 2224-2236, 1999). 여기서 제시된 바와 같이, 하나 이상의 메갈린 단백질 또는 하나 이상의 메갈린-관련 단백질은 또한 눈의 망막과 RPE 세포내에서 발현된다.

래트와 인간 메갈린으로부터 추론된 cDNA 서열은 대략 600 kDa의 단백질을 엔코딩하는데, 상기 단백질은 LDL 수용체 유전자 패밀리의 엔도시토시스 수용체의 모든 특징을 나타낸다. 메갈린은 단일 막관통 도메인을 지니는 1형 세포 표면 트랜스시토시스 수용체이다. 메갈린은 저밀도 리포프로테인(LDL) 수용체 유전자 패밀리에 속한다. 메갈린은 단일 막관통 도메인, 짧은 세포질 미부, 및 세포외 공간으로 신장되어 있는 거대 아미노-말단 부분을 지니는 1형 세포 표면 엔도시토시스 수용체이다. 아미노-말단 영역은 리간드-결합 (보체) 형 시스테인-풍부 반복부를 함유하는데, 각각의 반복부는 3개의 내부 이황화 결합에 의해 특징져지는 대략 40개의 아미노산의 스트레치이다. 이러한 반복부는 리간드에 대한 결합 부위를 구성하며, 이것은 몇몇 리간드들이 리간드-결합 반복부의 제 2 클러스터내의 동일하거나 밀접하게 연결된 부위들에 결합한다는 것을 입증한다[Orlando RA. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2368-2373, 1997]. 더욱이, 메갈린은 시스테인-비풍부 스페이서 영역에 의해 분리된, 시스테인-풍부 표피 성장 인자(EGF) 전구체-형 반복부를 수용하고 있다. 스페이서 영역은 엔도좀 구획에서 pH-의존성 리간드 방출에 관여하는 YWTD 모티프를 함유한다. 메갈린의 세포질 미부는 수용체를 코팅된 피트 로 유도하는, 3개의 NPxY 모티프 복제물을 운반한다. 메갈린은 예를 들어, LDL 수용체 및 VLDL 수용체와 같은, 유전자 패밀리의 일부 수용체들에서 발견되는, O-연결형 당 도메인을 함유하지 아니한다.

메갈린과 LRP의 세포외 부분은 LDL 수용체 도메인의 다수 복제물과 유사하다. 메갈린과 다른 패밀리 구성원들 간의 전반적인 아미노산 서열 동일성은 30 내지 50% 사이에서 달라진다.

메갈린 수용체에 관한 서열은 하기와 같이 제시된다:

- cDNA:U33837

- 유전자:NT_002176

인간 메갈린 유전자는 염색체 2q24-q31에 위치한다[Korenberg JR. et al. Genomics 22:88-93, 1994].

주요 역할이 콜레스테롤-적재 지질단백질의 세포내 흡수를 매개하는 것인, LDL 수용체와는 달리, 메갈린, LRP 및 다른 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원들은 고 친화력으로 구조적으로 독특한 다양한 리간드들에 결합하고/하거나 인지한다. 메갈린은 수용체를 발현하는 조직내로의 단백질, 지용성 비타민 및 스테로이드 호르몬의 흡수에 주로 관여하는 무차별성(promiscuous) 스캐빈저 수용체로서 기능하는 것으로 알려져 있다. 메갈린 결합 리간드는 긴 목록의 다양한 단백질과 화학 물질을 포함한다.

메갈린 결합 리간드는 하기 것들을 포함한다:

- 예를 들어, 트랜스코발라민-비타민 B12, 비타민-D-결합 단백질, 레티놀-결 합 단백질, 광수용체간 레티노이드 결합 단백질을 포함하는, 비타민-결합 단백질;

- 예를 들어, 아포리포단백질 B, 아포리포단백질 E, 아포리포단백질 J/클러스테린, 아포리포단백질 H/β2-당단백질-I를 포함하는, 지질단백질;

- 예를 들어, 면역글로불린 경쇄, PAP-1, β2-마이크로글로불린을 포함하는, 면역- 및 스트레스-관련 단백질;

- 예를 들어, 성 호르몬 결합 단백질-에스트로겐, 안드로겐 결합 단백질-안드로겐을 포함하는, 스테로이드 호르몬 결합 단백질;

- 예를 들어, 부갑상선 호르몬, 인슐린, 표피 성장 인자, 프로락틴, 씨로글로불린을 포함하는, 호르몬 및 전구체;

- 예를 들어, PAI-1, PAI-1-유로키나아제, PAI-1-tPA, 프로-유로키나아제, 리포프로테인 리파아제, 플라스미노겐, β-아밀라아제, β1-마이크로글로불린, 리소자임, 아프로티닌을 포함하는, 효소 및 효소 억제자;

- 예를 들어, 알부민, 락토페린, 헤모글로빈, 후각자극물질-결합 단백질, 트랜스씨레틴을 포함하는, 기타 운반 단백질;

- 예를 들어, PTH, 인슐린, β2-마이크로글로불린, 표피 성장 인자, 프로락틴, 리소자임, 시토크롬 c를 포함하는, 저분자량 펩티드 및 호르몬;

- 예를 들어, 아미노글리코시드, 젠타마이신, 폴리믹신 B, 아프로티닌, 트리코산틴을 포함하는, 약물 및 독소;

- 예를 들어, 항메갈린 항체, 래빗 항-래트 메갈린 항체, 래빗 사전-면역(pre-immune) IgG을 포함하는, 항체;

- 예를 들어, RAP, Ca²⁺, 시토크롬 c, 레티놀, 망막l, EDTA, 씨로글로불린, 플라스미노겐, 알부민, 락토페린을 포함하는, 기타 리간드.

메갈린은 수용체의 세포외 도메인을 통해 이의 리간드와 상호작용한다. 결합은 복합체 단백질-단백질 상호작용을 통해서(리간드가 단백질인 경우), 또는 보체형 반복부내 음으로 하전된 아미노산의 정렬과 함께 양으로 하전된 물질의 단순 이온성 상호작용을 통해서(상기 리간드가 화학적 화합물인 경우) 일어난다. 지용성 비타민과 스테로이드 호르몬과 메갈린의 결합은 간접적이며 혈장내로 이러한 물질을 운반하는 특이적 운반 단백질(예를 들어, 레티놀 결합 단백질 또는 광수용체간 레티노이드 결합 단백질)과 수용체의 상호작용을 통해 매개된다.

본원에 사용된,"메갈린"은 포유동물의 망막 또는 망막 색소 상피 세포에서 발현되는 단백질을 의미하며, 이의 cDNA를 엔코딩하는 서열은 문헌[Korenberg, J. R. et al. (Genomics. 1994 Jul 1;22(1):88-93, 1994)]에 소개된 유전자 접근 번호 U04441을 갖는 인간 메갈린 cDNA 서열, 문헌[Hjalm, G., et al. (Eur J Biochem. 239(1):132-7, 1996)]에 개시된 유전자 접근 번호 U33837을 갖는 인간 메갈린 cDNA 서열, 또는 문헌[Saito et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:9725-9729, 1994)]에 소개된 유전자 접근 번호 L34049을 갖는 래트 메갈린 cDNA 서열과 75% 이상의 뉴클레오티드 동일성을 갖는다.

본원에 사용된, "메갈린-관련 단백질"은 LDL 수용체 유전자 패밀리에 속하며 메갈린에 50%를 초과하는 상동성을 갖거나; 항-메갈린 항체(특이적인 항체)에 고 특이성을 지니면서 반응하는 단백질을 의미한다.

"메갈린 결합 리간드"는 (1) 메갈린과 결합하는 물질, (2) 메갈린에 의해 매개된 기작에 의해 엔도시토시스으로 세포내로 이입되는 물질 또는 (3) 상기 정의 (1) 또는 (2)에 기술된 물질에 스스로 결합하는 물질을 의미한다.

용어 "내생성 메갈린 결합 리간드"는 포유동물 내부에서 기원하거나 생산된 메갈린 결합 리간드를 의미한다.

"뉴클레오티드 동일성"은 또 다른 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 인간 메갈린의 뉴클레오티드 서열에 대하여 계산된 뉴클레오티드 서열의 서열 정렬도(alignment)를 의미한다. 구체적으로, 해당 용어는 표준화된 알고리즘을 이용하여 정렬된 2개 이상의 뉴클레오티드 서열들 사이의 잔기 매치의 백분율을 의미한다. 이러한 알고리즘은 서열간의 정렬을 최적화하기 위해 표준화되고 재생가능한 방식으로 비교되는 서열내에 갭(gaps)을 삽입시킬 수 있는데, 그에 따라 더 의미있는 비교가 달성된다. 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성 비율은 바람직하게는 MEGALIGN^TM 서열 정렬 프로그램 버전 5에 통합된 것과 같은 CLUSTAL W 알고리즘의 디폴트 파라미터들을 이용하여 결정된다. 이 프로그램은 분자 생물학 분석 프로그램(DNASTAR, Madison Wis.)의 LASERGENE^TM 스위트의 일부분이다. CLUSTAL W는 문헌[Thompson 1994]에 소개되어 있다.

"뉴클레오티드 서열"및 "폴리뉴클레오티드"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태 중 어느 하나인 DNA 또는 RNA를 의미한다. 해당 용어는 "상보적인 뉴클레오티 드 서열"은 구아니딘 뉴클레오티드(G)와 시티딘 뉴클레오티드(C)의 짝지음 및 아데노신 뉴클레오티드(A)와 티미딘 뉴클레오티드(T)의 짝지음(단, RNA에서 T가 우리딘 뉴클레오티드(U)로 대체되어 U가 A와 결합하는 것을 예외로 함)에 따라 또 다른 뉴클레오티드 서열에 어닐링(결합)되는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.

LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원은 상이한 유형의 조직에서 발현된다. LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원은 망막과 RPE 세포에서 발현될 뿐만 아니라, 신장 내에서 발현된다. 메갈린은 눈의 망막과 RPE 세포에서 발현될 뿐만 아니라, 신장 내에서 발현된다.

큐빌린(Cubilin)

큐빌린은 몇몇 유형의 조직 내에서 메갈린과 공통위치에 존재하는(colocalizing) 460 kDa 막-결합 단백질로서, 큐빌린-결합 리간드의 메갈린-매개 내부화 이전에 세포 표면에 리간드를 격리시킴으로써 엔도시토시스 과정을 촉진할 수 있다. 리간드는 큐빌린에 결합할 수 있을 뿐만 아니라 메갈린에 직접적으로 결합할 수 있다. 그러나 큐빌린은 그 자신이 엔도시토시스를 매개할 수 없는 것으로 보이지만 메갈린은 물리적으로 큐빌린과 결합할 수 있고 이의 내부화를 매개할 수 있다.

큐빌린의 서열은 아래와 같이 제시된다:

- cDNA:XM_011904

- 유전자:NT_008682(호모 사피엔스 염색체 10번 워킹 드래프트 서열 부분)

수용체-연관 단백질(RAP)

LRP, 메갈린 및 다른 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 정상적인 가공과정은 39 kDa 단백질인, RAP의 존재를 필요로 한다[Bu, G. et al., J. Biol. Chem. 271, 22218-22224, 1996; Strickland, D. K. e t al., J. Biol. Chem. 266, 13364-13369, 1991]. RAP는 3개의 상동성 도메인으로 구성되어 있는 것으로 생각되는데[Bu, G., et al., EMBO J. 14, 2269-2280, 1995; Ellgaard, L. et al., Eur. J. Biochem. 244, 544-551, 1997; Rall, S. C. et al., J. Biol. Chem. 273, 24152-24157, 1998; Medved, L. V. et al., J. Biol. Chem. 274, 717-727, 1999.], 상기 도메인들 중 도메인 1은 3-헬릭스 다발로 이루어진 것으로 밝혀졌다[Nielsen, P. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 7521-7525, 1997]. RAP는 모든 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원과 상호작용하며 모든 수용체/리간드 상호작용을 위한 유니버셜 길항제이다. RAP 도메인 1과 3(RAPd3) 둘 모두 수용체에 결합하나[Warshawsky, I. et al. J. Biol. Chem. 268, 22046-22054, 1993], 오직 도메인 3만이 세포내에서 RAP의 샤페론-유사 기능을 충분히 모방한다[Obermoeller, L. M. et al., J. Biol. Chem. 272, 10761-10768, 1997; Savonen, R. et al., J. Biol. Chem. 274, 25877-25882, 1999.]. RAP 도메인 2는 cAMP-의존성 단백질 키나아제에 대한 기질이나[Petersen, C.M. et al., EMBO J. 15, 4165-4173, 1996], RAP 도메인 1 및 3과 비교할 때 LRP와 메갈린에 대하여 매우 낮은 친화력을 갖는다[Tauris, J. et al., FEBS Lett. 429, 27-30, 1998.]. 인간 RAP의 자율 영역은 도메인 1(아미노산 위치 18-112), 도메인 2(아미노산 위치 113-218) 및 도메인 3(아미노산 위치 219-323)을 포함한다.

RAP는 XM_003315(유전자: AH006949)로 제시되는 서열을 가지는 것으로 알려져 있다. RAP는 LRP에 고 친화력으로 결합하고(KD = 4 nM) 이 수용체의 리간드 결합 특성을 상쇄시키며, LRP가 리간드의 세포내 내부화를 매개하는 것을 막는다[Williams et al. A novel mechanism for controlling the activity of α2-macroglobulin receptor/low density lipoprotein receptor-related protein. Multiple regulatory sites for 39-kDa receptr-related protein. J. Biol. Chem. 267, 9035-9040, 1992]. LRP는 다수의 리간드 결합 부위를 함유하고 있으며, 각각의 부위는 독립적으로 RAP에 의해 조절된다. RAP는 또한 gp330에(KD = 8 nM)[Kounnas et al. The 39kDa receptor-related protein interacts with two members of the low density lipoprotein receptor family, α2-macroglobulin receptor and glycoprotein gp330. J. Biol. Chem. 267, 21162-21166, 1992] 그리고 VLDL 수용체에(KD = 0.7 nM)[Battey et al. The 39kDa receptor-related protein regulates ligand binding by the very low density lipoprotein receptor. J. Biol. Chem. 269, 23268-23273, 1994] 고 친화력으로 결합하나, LDL 수용체에 더 낮은 친화력으로 결합하며(KD = 500nM), 또한 이러한 수용체들의 리간드 결합 특성을 거스른다. 외인성으로(Exogeneously) 첨가된 RAP 또는 과발현된 RAP 둘 모두는 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성을 억제한다[Willnow et al. Inhibition of chylomicron remnant uptake by gene transfer of a receptor anatagonist. Science, 264, 1471-1474, 1994). 또한 외인성 RAP가 RPE 세포에서 RBP-레티놀의 흡수를 억제하는 것을 보여주는, 도 10을 참조하라.

RAP의 최소 도메인, 예컨대, 펩티드를 동정하는 것이 가능한데, 이 도메인은 수용체 결합 및 억제의 최소 기능성 도메인을 운반하며 이에 따라 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 길항제로서 역할하기도 한다. 한 구체예에서, RAP 유래성 물질은 104개 이하의 아미노산, 바람직하게는 20 내지 60개의 아미노산을 갖는 최소 기능성 도메인을 포함하는 펩티드이다. 특히, 이들은 최소 기능성 단백질 도메인이다. 이러한 펩티드들은 104개 이하의 아미노산, 바람직하게는 20 내지 60개의 아미노산을 포함한다. 바람직한 도메인은 RAP의 아미노산 위치 219 내지 323이다. 또 다른 바람직한 도메인은 RAP의 아미노산 위치 18 내지 112이다.

유전자 녹-아웃 연구는 RAP가 결여된 세포가 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 감소된 발현을 나타냄을 밝혀냈는데, 이것은 아마도 RAP가 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 대한 새로이 합성된 리간드의 미숙한(premature) 결합과 소포체(ER) 내부에서 수용체의 침전을 막기 때문인 것으로 추정된다. 유도된 RAP 유전자 결함을 지니는 마우스 모델에서(녹아웃 마우스), 치료제의 흡수는 RAP 유전자 결함을 보유하지 아니하는 마우스 모델과 비례하여 최대 50%까지 감소된다[Willnow et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 92:4537-4541, 1995]. 한 구체예에서, 망막과 RPE에서 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원이 본원에서 고려한 리간드 및/또는 작용제의 세포내 흡수에 관여하는지 여부를 평가하기 위한 방법은, 하기 단계들을 포함한다:

- RAP 유전자 결함 마우스(녹아웃 마우스)에 리간드 또는 작용제를 투여하는 단계

- 야생형 마우스(RAP 유전자 결함을 보유하지 아니함)에 리간드 또는 작용제를 투여하는 단계

- 상기 동물 모델 및 대조군 동물의 망막 및/또는 RPE 세포내의 상기 리간드 또는 작용제의 양을 평가하는 단계.

이 모델에서, LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 의해 수행된 망막 및/또는 RPE 세포내로의 상기 리간드 또는 작용제의 흡수에 관여하는 과정들의 기여도가 정량될 수 있다. RAP 풍부 마우스와 비교하여 RAP 유전자 결함 마우스에서 세포내에 축적된 상기 리간드 또는 작용제의 양은 세포내 축적 메커니즘이 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 의해 또는 몇몇 다른 메커니즘에 의해 매개 되는지 여부를 제시한다.

위에 언급된 실험은 또한 유도된 메갈린 유전자 결함을 지니는 마우스 모델(녹아웃 마우스; Nykjaer et al. Cell, 96, 507-515)을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 동물 모델에서, 망막 및 RPE 세포내로의 리간드 또는 작용제 흡수에 관한 메갈린 또는 다른 수용체-매개성 또는 수용체-의존성 과정의 기여도가 시험될 수 있다. 충분한 메갈린을 지니는 대조군과 비교하였을 때 세포내에 축적된 리간드 또는 작용제의 양이 세포내 축적 메커니즘이 메갈린 결합 또는 일부 다른 메커니즘을 통한 것인지 여부를 나타낸다.

몇몇 구체예에서, 상기 리간드는 레티놀, RBP-레티놀 복합체, 또는 RBP-레티놀-TTR 복합체이다. 몇몇 구체예에서, 상기 리간드는 IRBP, IRBP-레티놀, 또는 IRBP-레티날이다. 몇몇 구체예에서, 상기 리간드는 약물 또는 독소다. 또 다른 구체예에서, 상기 리간드는 항생제이다. 또 다른 구체예에서, 상기 리간드는 아미노글리코시드다.

몇몇 구체예에서, 본원에서 고려된 작용제는 망막 및 RPE 세포와 연관된 질환 및 병태의 진단, 예방, 또는 치료시 RAP 또는 RAP 폴리펩티드에 컨쥬게이션되며, 예를 들어, 참고문헌으로 포함된, US 20060029609호를 참조하라.

화학 및 생화학 용어

달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어와 과학 용어는 청구된 발명 주제가 속한 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미가 있다. 달리 언급하지 않는 한, 본원에 사용된 청구 용어 및 화학 용어는 참고를 목적으로 본원에 참고문헌으로 포함된, 2005년 6월 10일에 출원된, 미국 특허출원 제 11/150,641호에 정의된 것과 동일하다. 본원의 전체 교시내용에 걸쳐서 인용된 모든 특허, 특허 출원, 공개된 출원 및 공개자료, Genbank 서열, 웹사이트 및 기타 공개된 매체들은, 달리 특별히 언급하지 않는 한, 이들의 전체내용이 참고문헌으로 포함된다. 본원에서 용어와 관련하여 복수의 정의가 존재하는 경우, 그 부분에서의 정의가 우선시 된다. 참고문헌이 URL 또는 기타의 것, 예컨대, 식별자 또는 주소인 경우, 그러한 식별자는 변할 수 있고 인터넷상의 특정 정보는 변동될 수 있으나, 동등한 정보가 인터넷 검색에 의해 발견될 수 있다는 것이 이해된다. 게다가 참고문헌은 그러한 정보의 유용성 및 대중적 전파의 증거가 된다.

상기 일반적 설명과 하기 상세한 설명은 모두 예시와 설명을 위한 것이며 청구된 발명 주제를 제한하려는 것은 아님이 이해되어야 한다. 본 명세서에서, 단수 의 사용은 달리 특별히 언급하지 않는 한 복수를 포함한다. 본 명세서에서, "또는"의 사용은 달리 언급하지 않는 한, "및/또는"을 의미한다. 더 나아가, 용어 "포함하는"을 비롯한 다른 형태의 용어, 예컨대, "포함하다"와 "포함된"은 한계를 두지 아니한다.

본원에서 표제어 부분은 단지 조직화 목적을 위하여 사용된 것이며 기술된 주제를 제한하려는 의도로 사용된 것은 아니다. 특허, 특허 출원서, 논문, 책, 매뉴얼, 및 전문서적을 포함하나, 이로만 국한되지 아니하는, 본원에서 인용된, 모든 문서, 또는 문서의 일부는 임의의 목적을 위해 이들의 전체내용이 참고문헌으로 의도적으로 본원에 통합된다.

용어 "보호기"는 이 보호기가 제거될 때까지 일부 또는 모든 반응성 부분을 블로킹하거나 그러한 기들이 화학 반응에 참여하는 것을 막는 화학적 부분을 의미한다. 각각의 보호기는 상이한 수단에 의해 제거될 수 있어야 바람직하다. 전체적으로 상이한 반응 조건하에서 절단되는 보호기는 차별적인 제거의 필요조건을 충족시킨다. 보호기는 산, 염기, 및 수소화분해에 의해 제거될 수 있다. 트리틸, 디메톡시트리틸, 아세탈 및 t-부틸디메틸실일과 같은 기는 산 분해성이며, Cbz 기(수소화 분해로 제거될 수 있음)와 Fmoc 기(염기 분해성임)로 보호된 아미노기 존재시 카르복시와 히드록시 반응성 부분을 보호하기 위해 사용될 수 있다. 카르복시산과 히드록시 반응성 부분은 t-부틸 카바메이트와 같은 산 분해성 기 또는 산과 염기 둘 모두에 안정하나 가수분해적으로 제거될 수 있는 카바메이트로 블로킹된 아민 존재시, 이로만 국한되는 것은 아니나, 메틸, 에틸, 및 아세틸과 같은 염기 분해성 기로 블로킹될 수 있다.

카르복시산과 히드록시 반응성 부분은 또한 가수분해적으로 제거될 수 있는 보호기, 예컨대, 벤질기로 블로킹될 수 있으며, 한편 산과 수소 결합할 수 있는 아민기는 염기 분해성 기, 예컨대, Fmoc로 블로킹될 수 있다. 카르복시산 반응성 부분은 본원에 예시된 것과 같은 단순 에스테르 유도체로 전환되어 보호되거나 산화적으로 제거가능한 보호기, 예컨대, 2,4-디메톡시벤질로 블로킹될 수 있으며, 한편 공존(co-existing) 아미노기는 플루오라이드 분해성 실일 카바메이트로 블로킹될 수 있다.

알릴(Allyl) 보호기는 산- 과 염기-보호기 존재시 유용한데, 상기 알릴 보호기는 안정하며 후속적으로 금속 또는 파이-산(pi-acid) 촉매로 제거될 수 있기 때문이다. 예를 들어, 알릴-블로킹된 카르복시산은 산 분해성 t-부틸 카바메이트 또는 염기 분해성 아세테이트 아민 보호기의 존재시 Pd0 촉매 반응에 의해 탈보호될 수 있다. 여전히 또 다른 형태의 보호기는 화합물 또는 중간생성물이 부착될 수 있는 레진이다. 잔기가 레진에 부착되어 있는 한, 작용기는 블로킹되며 반응할 수 없다. 레진으로부터 일단 방출되면, 작용기는 반응에 참여할 수 있게 된다.

전형적인 블로킹/보호기는 하기 기들 중에서 선택될 수 있다:

다른 보호기는 문헌[Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthsis, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, NY, 1999]에 기술되어 있으며, 상기 문헌의 전체 내용은 본원에 참고문헌으로 통합된다.

용어 "선택적으로 치환된"은 지칭된 기가 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알리시클릭(heteroalicyclic), 히드록시, 알콕시, 아릴옥시, 머캅토, 알킬티오, 아릴티오, 시아노, 할로, 카르보닐, 티오카르보닐, 이소시아네이토, 티오시아네이토, 이소티오시아네이토, 니트로, 퍼할로알킬, 퍼플루오로알킬, 실일, and 아미노(모노 치환 및 디 치환 아미노 기를 포함), 및 이들의 보호된 유도체들 중에 서 개별적으로 그리고 독립적으로 선택된 하나 이상의 추가 기(들)로 개별적으로 치환될 수 있다는 것을 의미한다. 상기 치환기의 보호 유도체를 형성할 수 있는 보호기는 당업계의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며 상기 문헌[Greene and Wuts]과 같은 참고문헌에서 찾아 볼 수 있다.

본원에 제시된 화합물은 하나 이상의 키랄 센터를 보유할 수 있는데 각각의 센터는 R 또는 S 배열로 존재할 수 있다. 본원에 제시된 화합물은 모든 부분입체이성질체, 거울상이성질체, 및 에피머 형태를 비롯한 이의 적절한 혼합물을 포함한다. 요망되는 경우, 입체이성질체는 예를 들어, 입체이성질체가 키랄 크로마토그래피 컬럼에 의한 입체이성질체의 분리와 같은, 당업계에 공지된 방법에 의해 획득될 수 있다.

본원에 기술된 방법 및 제형은 예를 들어, 메갈린-조절제와 같이, LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성을 조절하는 작용제의 N-옥사이드, 결정형(다형(폴리morphs)으로도 알려져 있음), 또는 약제학적으로 허용되는 염을 비롯한 도일한 유형의 활성을 갖는 이러한 화합물의 활성 대사산물의 사용을 포함한다. 몇몇 상황에서, 화합물은 호변이성질체로 존재할 수 있다. 모든 호변이성질체가 본원에 제시된 화합물의 영역 내에 포함된다. 또한, 본원에 기술된 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 변화시키는 작용제는 비용매화된 형태뿐만 아니라 약제학적으로 허용되는 용매, 예컨대, 물, 에탄올, 등과 용매화된 형태로 존재할 수 있다. 본원에 제시된 화합물의 용매화된 형태도 역시 본원에 개시된 것으로 고려된다.

본원에 제시된 다양한 아미노산 서열에서 등장하는, 본원에 사용된, 아미노산은 이들의 널리 알려진, 3-문자 또는 1-문자 축약어에 따라 확인된다. 다양한 DNA 단편으로 등장하는, 뉴클레오티드는 당업계에서 관용적으로 사용되는 표준 단일-문자 표기로 지정된다(하기 표 1을 참조하라).

본원에 사용된, 아미노산 잔기는 폴리펩티드의 펩티드 결합에서 폴리펩티드의 화학적 분해(가수분해)시 형성된 아미노산을 의미한다. 특정 구체예에서, 본원 에 기술된 아미노산 잔기는 "L" 이성질체 형태로 존재한다. "D" 이성질체 형태의 잔기는, 요망되는 기능적 특성이 해당 폴리펩티드에 의해 유지되는 한, 임의의 "L"아미노산 잔기로 대체될 수 있다. NH₂는 폴리펩티드의 아미노 말단에 존재하는 유리 아미노기를 의미한다. 문헌[J. Biol. Chem., 243:3552 59 (1969)]에 기술되어 있고 법규정[37 C.F.R. §§ 1.821-1.822]에서 수용한 표준 폴리펩티드 명명법을 준수할 때, 아미노산 잔기에 대한 축약어가 하기 표에 제시된다:

화학식으로 본원에 제시된 모든 아미노산 잔기 서열은 아미노 말단에서 카르복시 말단의 관용적인 방향으로 좌에서 우 배열을 지닌다는 것을 주목하여야 한다. 또한, 어구 "아미노산 잔기"는 본원에서 참고문헌으로 인용되며 법규정[37 C.F.R. §§1.821-1.822]에 설명된 아미노산과 같은, 대응, 변형 및 일반 아미노산의 표에 나열된 아미노산을 포함하는 것으로 폭넓게 정의된다. 더욱이, 아미노산 잔기 서열의 시작 또는 끝에서 대시(dash)는 하나 이상의 아미노산 잔기의 추가 서열 또는 NH₂와 같은 아미노 말단 또는 COOH와 같은 카르복시 말단 기에 대한 펩티드 결합을 지시한다.

펩티드 또는 단백질에서, 아미노산의 적합한 보존적 치환은 당업계의 통상의 기술자에게 알려져 있으며 그 결과 얻어지는 분자의 생물학적 활성을 변화시키지 아니하면서 일반적으로 행해질 수 있다. 당업계의 통상의 기술자는, 일반적으로, 폴리펩티드의 비필수적 지역내의 단일 아미노산 치환이 실질적으로 생물학적 활성을 변화시키지 아니한다는 것을 인지하고 있다(예를 들어, 문헌[Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., p.224)] 참조).

그러한 치환은 하기 표 2에 제시된 것에 따라 이루어질 수 있다:

다른 치환이 또한 허용될 수 있으며 실험적으로 또는 공지된 보존적 치환과 부합되게 결정될 수 있다.

본원에 사용된, 용어 "선택적 결합 화합물"은 하나 이상의 표적 수용체의 임의의 부분에 선택적으로 결합하는 작용제를 의미한다.

본원에 사용된, 용어 "선택적으로 결합하다"는 비-표적 수용체에 결합하는 것보다 더 월등한 친화력으로 표적 수용체에 결합하는 선택적 결합 작용제의 능력을 의미한다. 특정 구체예에서, 특이적 결합은 비-표적에 대한 친화력보다 10, 50, 100, 250, 500, 1000배 또는 그 이상의 친화력으로 표적에 결합하는 것을 의미한다.

본원에 사용된, 용어 "표적 수용체"는 선택적 결합 화합물에 의해 결합될 수 있는 수용체 또는 수용체의 일부분을 의미한다. 특정 구체예에서, 표적 수용체는 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원이다. 몇몇 구체예에서, 표적 수용체는 레티노이드 결합 단백질 수용체이다. 몇몇 구체예에서, 레티노이드 결합 단백질 수용체는 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원이다.

본원에 사용된, "작용제"는 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원과 상호작용할 수 있고, 그에 따라 상기 수용체 단백질의 활성을 조절할 수 있는 임의의 물질을 의미한다.

본원에 사용된, 용어 "조절자"는 분자의 활성을 조절하는 화합물을 의미한다. 예를 들어, 조절자는, 이 조절자 부재시 활성의 정도와 비교하였을 때, 예를 들어, LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원과 같은, 분자의 특정 활성의 정도에서 증가 또는 감소를 초래할 수 있다. 특정 구체예에서, 조절자는 분자의 하나 이상의 활성의 정도를 감소시키는 억제자이다. 특정 구체예에서, 억제자는 완전하게 분자의 하나 이상의 활성을 차단한다. 특정 구체예에서, 조절자는 분자의 적어도 하나의 활성의 정도를 증가시키는 활성자이다. 특정 구체예에서, 이 조절자의 존재는 상기 조절자의 부재시에 생기지 않는 활성을 초래한다.

대상 폴리펩티드, 예컨대 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 생물학적 활성을 조절하는 작용제는 적당한 대조군과 비교하였을 때, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 50% 이상, 약 100% 이상, 또는 약 2배 이상, 약 5배 이상, 약 10배 이상 또는 그 이상 상기 활성을 증가 또는 감소시킨다.

용어 "리간드"는 예를 들어, LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원과 같이, 또 다른 분자 상의 특정 부위에 결합하는 임의의 분자를 의미한다.

용어 "내생성 리간드" 또는 "내생성 결합 리간드"는 포유동물에서 기원하거나 포유동물 내부에서 생산되는 리간드를 의미한다.

용어 "조절하다(modulate)"는 적당한 대조군과 비교할 때, 측정된 활성에 있어서, 증가 또는 감소, 촉진, 억제, 또는 저해(blockage)를 포괄한다.

세포내에서 "핵산의 발현 수준을 조절하는" 작용제는 이 작용제가 결여된 대조군과 비교할 때, 세포가 후보 작용제와 접촉한 뒤, mRNA 및/또는 폴리펩티드의 수준(즉, 양)을 약 1.25배 이상, 약 1.5배 이상, 약 2배 이상, 약 5배 이상, 약 10배 이상 또는 그 이상으로 증가 또는 감소시키는 물질이다.

망막과 RPE 세포내에서 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 결합하는 작용제는 천연적으로 생성된 리간드(예를 들어, 레티노이드 결합 단백질과 같은 리간드) 보다 수용체 단백질에 대해 일반적으로 더 월등한 친화력을 지닐 것이다. 작용제는 레티노이드 결합 단백질보다 망막과 RPE 세포내에서 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 대하여 2배 이상 월등한 친화력을 가질 것이다. 또 다른 구체예에서, 작용제는 레티노이드 결합 단백질보다 망막과 RPE 세포내에서 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 대하여 5배 이상 월등한 친화력을 가질 것이다. 또 다른 구체예에서, 작용제는 레티노이드 결합 단백질보다 망막과 RPE 세포내에서 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 대하여 10배 이상 월등한 친화력을 가질 것이다. 수용체에 대한 친화력은 당업계에 공지된 표준 방법에 의해 측정된다.

본원에 사용된, "레티노이드 결합 단백질"은 레티노이드에 결합할 수 있는 임의의 운반 단백질을 의미한다. 특정 레티노이드 결합 단백질을 구체적으로 지정하지 아니하는 한, 레티노이드 결합 단백질은, 예를 들어, 레티놀-결합 단백질(RBP), 간질성(interstitial) 레티노이드 결합 단백질(IRBP), 레틴알데히드-결합 단백질(RALBP), 세포성 레티놀-결합 단백질(CRBP), 및 세포성 레틴알데히드-결합 단백질(CRALBP)을 포함한다.

본원에 사용된, "광수용체간 레티노이드 결합 단백질" 및 "간질성 레티놀 결합 단백질"은 호환적으로 사용되며 동일한 단백질을 가리킨다.

본원에 사용된, 용어 "수용체 매개 활성"은 수용체에 대한 리간드의 결합으로 부터 직접 또는 간접적으로 야기되는 임의의 생물학적 활성을 의미한다.

본원에 사용된, 용어 "작동제(agonist)"는 화합물인데, 이의 존재가 수용체에 대한 천연적으로 생성되는 리간드의 존재로부터 야기되는 생물학적 활성과 동일 한 수용체의 생물학적 활성을 초래하는 화합물을 의미한다.

본원에 사용된, 용어 "부분 작동제"는 화합물인데, 이의 존재가 수용체에 대한 천연적으로 생성되는 리간드의 존재로부터 야기되는 생물학적 활성과 동일한 것과 동일한 유형이지만, 더 낮은 규모의 수용체의 생물학적 활성을 초래하는 화합물을 의미한다.

본원에 사용된, 용어 "길항제"는 화합물인데, 이의 존재가 수용체의 생물학적 활성의 규모에서 감소를 초래하는 화합물을 의미한다. 특정 구체예에서, 상기 길항제의 존재는 수용체의 생물학적 활성의 완전한 억제로 귀결된다.

본원에 사용된, IC₅₀은 안드로겐 수용체 활성의 조절과 같은, 반응을 측정하는 검정시, 최대 반응의 50% 억제가 달성되는 특정 시험 화합물의 양, 농도 또는 투여량을 의미한다.

본원에 사용된, EC₅₀은 특정 시험 화합물에 의해 유발, 조장 또는 강화되는 특정 반응의 최대 발생의 50%에서의 용량-의존적 반응을 야기시키는 특정 시험 화합물의 투여량, 농도 또는 양을 의미한다.

용어 "폴리펩티드," "펩티드," 및 "단백질"은 임의 길이의 폴리머 형태의 아미노산을 의미하는데, 이는 천연적으로 생성된 아미노산, 코딩 및 비코딩된 아미노산, 화학적으로 또는 생물학적으로 변형, 유도체화, 또는 디자인된 아미노산, 아미노산 유사체, 펩티토모방체(peptidomimetics), 및 뎁시펩티드, 및 변형된, 고리, 비시클릭, 뎁시시를릭 또는 뎁시비시클릭 펩티드 골격을 지니는 폴리펩티드를 포함 할 수 있다. 용어는 또한 컨쥬게이션된 단백질, 융합 단백질을 포함하는데, 여기에는 GST 융합 단백질, 이종성 아미노산 서열을 지니는 융합 단백질, 이종성 및 상동성 선도 서열을 지니는 융합 단백질, N-말단 메티오닌 잔기를 지니거나 지니지 않는 융합 단백질, 페길화된 단백질, 및 면역학적으로 태깅된 단백질이 포함되나, 이로만 국한되지 아니한다. 이 용어에는 또한 천연적으로 생성된 단백질의 변이체(variations)가 포함되는데, 여기서 이러한 변이체는 천연적으로 생성되는 단백질을 비롯한 상이한 종으로부터의 대응되는 상동체와 상동성이거나 실질적으로 유사하다. 폴리펩티드 서열의 변이체는 대상 폴리펩티드와 비교하여 삽입, 부가, 결실 또는 치환을 포함한다. 용어는 또한 펩티드 앱타머를 포함한다.

본원에 사용된, 용어 "조직-선택적"은 작용제가 또 다른 조직 내에서 생물학적 활성을 조절하는 것보다 한 조직에서 더 월등하게 또는 더 열등하게 당해 생물학적 활성을 조절시키는 능력을 의미한다. 상이한 조직 내에서 생물학적 활성은 동일하거나 상이할 수 있다. 상이한 조직 내에서 생물학적 활성은 동일한 유형의 표적 수용체에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 조직-선택적 화합물은 한 조직 내에서 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원과 연관된 생물학적 활성을 조절할 수 있으며, 또 다른 유형의 조직 내에서 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원과 연관된 생물학적 활성을 조절하지 못하거나, 더 열등한 정도로 조절할 수 있다.

"활성 단편"은 천연적으로 생성되는 분자의 구조적, 조절적, 또는 생화학적 기능을 가지거나 대사 과정 또는 생리학적 과정과 관련 또는 연관된 임의의 기능을 지니는 단편이다. 예를 들어, 단편은 또 다른 분자와의 분자 상호작용에 참여하거나, 질환 상태를 경감시키는 치료적 가치를 지니거나, 질환의 발생을 예방하거나 감소시키는 예방적 가치를 지니거나, 분자에 대한 면역 반응을 유도하는 경우 활성을 나타낸다. 활성 폴리펩티드 단편은 본원에 제시된 폴리펩티드의 활성과 반드시 동일하지는 아니하지만, 유사한 활성을 나타내는 단편을 포함한다. 활성은 요망되는 활성의 개선, 또는 비요망되는 활성의 감소를 포함할 수 있다.

핵산 분자의 "발현"은 정보가 유전자 생성물로 전환되는 것을 의미한다. 유전자 생성물은 유전자의 직접적인 전사 생성물(예를 들어, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 구조 RNA, 또는 임의의 다른 유형의 RNA) 또는 mRNA의 번역에 의해 생성된 단백질일 수 있다. 유전자 생성물은 예를 들어, 캡핑, 폴리아데닐화, 메틸화, 및 에디팅(editing)과 같은 과정에 의해, 변형된 RNA와, 예를 들어, 메틸화, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴화(ubiquitination), ADP-리보실화, 미리스틸화(myristilation), 및 당화(glycosylation)에 의해 변형된 단백질을 포함한다.

본원 발명의 목적을 위한, "유전자"는 유전자 생성물을 엔코딩하는 DNA 영역뿐만 아니라, 조절 서열이 코딩되고/되거나 전사된 서열에 인접되어 있든지 그렇지 않든지 간에, 유전자 생성물의 생산을 조절하는 모든 DNA 영역을 포함한다. 따라서, 유전자는 프로모터 서열, 터미네이터, 번역 조절 서열, 예컨대, 리보좀 결합 부위와 내부 리보좀 진입 부위, 인핸서, 사일렌서, 인설레이터(insulators), 경계 인자, 복제 기점, 기질 부착 부위 및 로커스 조절 영역을 포함하나, 반드시 이로만 국한되는 것은 아니다.

용어 "항체"는 특정 항원을 인지하고 이에 결합할 수 있는 면역 시스템에 의해 생산되는 단백질을 의미한다. 항체, 및 항체를 제조하는 방법은, 당업계에 일반적으로 공지되어 있다.

본원에 사용된, 용어 "항체"는 폴리클론 항체와 단일클론 항체 제조물을 비롯한, 하이브리드 항체, 변형된 항체, 키메라 항체와 인간화 항체를 포함하는 제조물을 포함하며, 이뿐만 아니라, 하이브리드(키메라) 항체 분자; F(ab')₂ 및 F(ab) 단편; Fv 분자(비공유결합 헤테로다이머(hetedimers)); 단일-쇄 Fv 분자(sFv); 이량체 및 삼량체 항체 단편 작제물; 미세항체(minibodies); 인간화 항체 분자; 및 특이적-결합을 유지하는, 그러한 분자로부터 획득된 임의의 기능적 단편을 포함한다.

"항원"은 면역 반응을 야기시키는 물질이다.

"에피토프"는 항체가 결합하는 항원 분자의 부위이다.

"작동제 항체"는 이 작동제와 상호작용하는 분자의 기능을 모방, 증강, 작극, 또는 활성화시키는 항체이다.

"길항제 항체"는 이 항체와 상호작용하는 분자의 활성과 경합, 억제, 또는 손상시키는 항체이다. 예를 들어, 길항제 항체는 활성 반응을 유도하지 아니하면서 수용체에 결합할 수 있다.

"항원-결합 단편(Fab 단편)"은 이황화결합으로 연결된 헤테로다이머인데, 각각의 쇄는 하나의 면역글로불린 불변 영역(C) 도메인과 하나의 가변 영역(V) 도메 인을 함유한다; V 도메인들의 병렬(juxtaposition)은 항원-결합 부위를 형성한다. 온전한 면역글로불린 분자의 2개의 Fab 단편은 이의 2 팔(arms)에 해당하는데, 상기 팔은 전형적으로 중쇄의 V와 C1 도메인과 쌍을 이루는 경쇄 영역을 포함한다.

"단편 결정화가능 단편(Fc 단편)"은 이펙터 분자 및 세포와 상호작용하는 항체 분자의 일부이다. 이것은 면역글로불린 중쇄의 카르복시-말단부를 포함한다. 중쇄 이소형들간의 기능적 차이는 주로 Fc 단편에 존재한다.

항체의 "불변 영역"은 이의 이펙터 영역이며, 항체의 기능적 부류를 결정한다. 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역은 카르복시 말단에 또는 그 근처에 위치하고 있다.

항체의"가변 영역"은 항원에 결합하는 영역이다; 이것은 항체 특이성을 제공한다. 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역은 아미노 말단에 또는 그 근처에 위치하고 있다. "VH" 단편은 중쇄의 가변 영역을 포함한다. "VL" 단편은 경쇄의 가변 영역을 포함한다.

"면역글로불린"은 항체 분자이다.

"중쇄"는 결합하여 면역글로불린 분자를 형성하는 2 종류(class)의 폴리펩티드 쇄 중 더 큰 쇄이다. 중쇄의 종류는 면역글로불린의 종류, 예를 들어, IgG, IgA, IgE, IgD, 또는 IgM을 결정한다.

"경쇄"는 결합하여 면역글로불린 분자를 형성하는 2종류의 폴리펩티드 쇄 중 더 작은 쇄이다. 경쇄는 일반적으로 이들의 불변 영역의 구조적 차이에 근거하여, 2 부류, 카파(kappa)와 람다(lambda)로 분류된다.

"상보성-결정 영역(cdr)"은 항원 특이성을 제공하는 항체의 3차원 구조이다.

"골격부(Framework) 단편"은 상대적으로 불변 서열을 함유하며 초가변 영역 사이에 존재하는 가변 도메인의 영역이다. 골격부 영역은 초가변 영역에 대하여 단백질 스캐폴드를 제공한다.

"인간화" 항체는 주로 인간 면역글로불린 서열을 함유한 항체이다. 이 용어는 일반적으로 인간 서열의 일부를 포함하도록 변형된 비-인간 면역글로불린을 지칭하기 위해 사용되며, 전체적으로 인간 면역글로불린 서열을 포함하는 인간 항체를 포함할 수 있다.

"단일쇄 항체"는 펩티드에 의해 경쇄의 V 도메인에 연결된 중쇄의 V 도메인만을 포함하는 Fab 단편이다.

"폴리클론 항체"는 다양한 항원 또는 에피토프에 대하여 면역화된 동물의 혈정내의 항체와 같이, 상이한 특이성을 지닌 항체의 혼합물이다.

"단일클론 항체"는 상동성 항체 집단을 갖는 항체 조성물이다. 용어는 항체의 종 또는 공급원과 관련하여 한정되지 아니하며, 또한 이것이 제조되는 방식에 의해서도 제한되지 아니한다. 용어는 전체 면역글로불린과 면역글로불린 단편을 괄한다.

폴리클론 및 단일클론 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 폴리클론 항체는 적당한 동물, 예컨대 마우스, 래트, 래빗, 양 또는 염소를 관심있는 항원, 예컨대 항원을 엔코딩하는 유전자로 형질변형된 줄기 세포로 면역화시킴으로써 생산된다. 면역원성을 증강시키기 위해, 항원은 면역화에 앞서 캐리어에 연결 될 수 있다. 적당한 캐리어는 전형적으로 크고, 서서히 대사되는 거대분자, 예컨대 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리머 아미노산, 아미노산 공중합체, 지질 집합체(lipid aggregates)(예컨대, 오일 점액(droplets) 또는 리포좀), 및 불활성 바이러스 입차이다. 이러한 캐리어는 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 더욱이, 항원은 이의 면역원성을 증강시키기 위해, 박테리아 톡소이드, 예컨대 디프테리아, 파상풍, 콜레라 등으로부터의 톡소이드에 컨쥬게이션될 수 있다.

항체 결합의 문맥에서, 용어 "특이적으로 결합하다"는 특정 폴리펩티드, 또는 더 정확하게는, 특정 폴리펩티드의 에피토프에 대한 항체의 높은 결합력(avidity) 및/또는 고 친화력 결합을 의미한다. 폴리펩티드의 그러한 에피토프에 대한 항체의 결합은 임의의 다른 에피토프, 특히 관심있는 폴리펩티드와 결합된 분자로 존재하거나 상기 폴리펩티드와 같은 샘플로 존재할 수 있는 다른 에피토프에 대한 동일 항체의 결합보다 더 강할 수 있다. 예를 들어, 항체가 다른 에피토프보다 한 에피토프에 더 강하게 결합할 때, 결합 조건을 조정하는 것은 동일 폴리펩티드 상의 임의의 다른 에피토프와, 해당 에피토프를 포함하지 않는 임의의 다른 폴리펩티드에 대한 항체 결합을 초래하지 아니하며, 특정 에피토프에 대한 거의 독점적인 항체 결합을 초래할 수 있다. 대상 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체는 약하지만, 검출가능한 수준으로 다른 폴리펩티드에 결합할 수도 있다(예를 들어, 관심있는 폴리펩티드에 대하여 나타난 결합의 10% 미만의 수준). 그러한 약한 결합 또는 백그라운드 결합은 예를 들어, 적절한 대조군을 이용하여, 대상 폴리펩 티드에 대한 항체의 특이적 결합과 쉽게 구분될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 항체는 10^-7 M 이상(예를 들어, 10^-8 M, l0^-9 M, 10^-10 M, 10^-11 M 등)의 결합 친화력으로 특정 폴리펩티드에 결합한다.

"질환"은 개체의 생리적, 비정상적, 및/또는 유해한 상태이다. 용어는 병태, 증후군, 장애를 포함한다.

본원에 사용된, "치료", "치료하는" 등은 인간을 포함하는 포유동물내 생리학적 상태 또는 장애의 여하한 치료를 포함하는, 요망되는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 획득하는 것을 의미한다. 이 효과는 완전하거나 부분적으로 장애 또는 이의 증상을 예방한다는 점에서 예방적이고/이거나 장애 및/또는 이 장애에서 기인할 수 있는 나쁜 영향의 부분적 또는 완전한 치유의 관점에서 치료적일 수 있다. 즉, "치료"는 장애를 지닌 것으로 아직 되지 아니하였으나 장애에 사전노출된 피검체에서 장애가 발생 또는 재발하는 것을 예방하는 것, (2) 장애를 억제하는 것, 예컨대 이의 발달을 지연시키는 것, (3) 장애 또는 이와 연관된 하나 이상의 증상을 멈추거나 종결시켜, 숙주가 더 이상 장애 또는 이의 증상으로 고통받지 않게 하는 것, 예컨대 장애 또는 이의 증상의 퇴행을 초래하는 것(예를 들어, 손실, 누락 또는 결함 기능을 회복 또는 복구시키거나, 비효율적인 과정을 촉진시킴으로써), 또는 (4) 장애 또는 이와 연관된 증상을 완화, 경감, 또는 개선하는 것(여기서 개선은 광범위한 의미에서 파라미터의 규모에서의 적어도 감소를 지칭하기 위해 사용됨)을 포함한다.

본원에 사용된, "단편"은 의도된 폴리펩티드, 예를 들어, 단지 온전한 전장-길이 단백질 서열 및 구조의 일부분으로 이루어진, 단백질 도메인이다. 단편은 천연 폴리펩티드의 C-말단 결실, N-말단 결실, 및/또는 내부 결실을 포함할 수 있다. 단백질 단편은 일반적으로 전장-길이 분자의 약 5-10개 이상의 연속된 아미노산 잔기들, 바람직하게는 전장-길이 분자의 약 15-25개 이상의 연속된 아미노산 잔기들, 가장 바람직하게는 전장-길이 분자의 약 20-50개 또는 그 이상의 연속된 아미노산 잔기들, 또는 5개 아미노산과 전장-길이 서열 사이의 임의의 정수의 연속된 아미노산 잔기들을 포함한다.

상기에 언급된, "생물학적으로 활성 있는" 실체(entity), 또는 "생물학적 활성"을 갖는 실체는 천연적으로 생성되는 분자의 구조적, 조절적, 또는 생화학적 기능, 또는 대사적 또는 생리적 과정과 관련 또는 연관된 임의의 기능을 갖는 실체이다. 생물학적으로 활성 있는 폴리펩티드 단편은 전장-길이 폴리펩티드의 활성과 유사하나, 반드시 동일하지 아니한 활성을 나타내는 단편이다. 생물학적 활성은 증가된 요망되는 활성, 또는 감소된 비요망되는 활성을 포함할 수 있다. 예를 들어, 실체는 이것이 또 다른 분자와의 상호작용에 참여하는 경우, 또는 이것이 질환 상태를 경감시키는 치료적 가치를 가지는 경우, 또는 이것이 분자에 대한 면역 반응을 유발하는데 있어서 예방적 가치를 가지는 경우, 또는 분자의 존재를 결정하는데 있어서 진단적 가치를 가지는 경우 생물학적 활성을 나타낸다. 생물학적으로 활성 있는 폴리펩티드 또는 이의 단편은 생물학적 반응에 참여할 수 있는 것(예를 들어, 전사 개시를 위한 다른 전사 인자와 화합하는 전사 인자로서) 또는 항체의 생성과 같은 면역 반응을 자극시키기 위한 에피토프 또는 면역원으로서 역할할 수 있는 것, 또는 세포내로 또는 외부로 분자를 운반할 수 있는 것, 또는 촉매 활성(예를 들어, 중합화 또는 뉴클레아제 활성)을 나타낼 수 있는 것, 또는 수용체, 단백질, 또는 핵산, 활성화된 효소 또는 기질에 결합함으로써 신호 전달에 참여할 수 있는 것을 포함한다.

"동정된", "정제된", 또는 "실질적으로 동정된" 폴리펩티드, 또는 "실질적으로 순수한 형태"의 폴리펩티드, "실질적으로 정제된 형태"의 폴리펩티드, "실질적으로 순수한" 폴리펩티드 또는 "동정체"로서 폴리펩티드는 대상 폴리펩티드의 서열 또는 단편을 포함하지 않는 천연 또는 다른 폴리펩티드 서열과 결합된 물질이 실질적으로 없는 폴리펩티드이다. 실질적으로 없다는 것은 조성물의 약 90% 미만, 약 80% 미만, 약 70% 미만, 약 60%, 또는 약 50% 미만이 동정된 폴리펩티드 이외의 물질로 이루어진다는 것을 의미한다. 총 거대분자의 약 99% 이상이 동정된 폴리펩티드인 경우, 상기 폴리펩티드는 약 99% 이상 순수하며, 조성물은 약 1% 미만의 오물질을 함유한다. 이와 같은 동정된 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드, 변형, 태깅 및 융합 폴리펩티드, 및 화학적으로 합성된 폴리펩티드일 수 있는데, 기원 또는 조작의 덕택으로, 이러한 폴리펩티드는 천연 상태에서 결합된 물질의 전부 또는 일부와 결합되지 않거나, 천연 상태에서 연결된 분자 이외의 분자에 연결되거나, 천연 상태에서 생겨나지 아니한다.

본원에서 제공된 검출 방법은 정성적 또는 정량적 방법일 수 있다. 따라서, 본원에 사용된, 용어 "검출하는", "식별하는", "결정하는" 등은 정성적 및 정량적 측정을 모두 지칭하며, "측정하는"을 포함한다. 예를 들어, 검출 방법은 생물학적 샘플 내의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 존재 및/또는 수준을 검출하기 위한 방법, 및 샘플 내 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 생물학적 활성의 존재 및/또는 수준을 검출하기 위한 방법을 포함한다.

본원에 사용된, "생물학적 샘플"은 생물학적 기원의 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 뇌척수액, 눈물, 침, 림프액, 투석액, 세정액, 정액, 및 기타 액체 샘플 또는 조직과 같은 생물학적 유체이다. 이것은 배양물 내 세포, 세포 상청액, 및 세포 파쇄물을 포함하는, 세포 또는 이들로부터 유래된 세포 및 이의 자손을 포함한다. 이것은 기관 또는 조직 배양물 유래 유체, 조직 생검 샘플, 종양 생검 샘플, 대변 샘플, 및 생리학적 조직으로부터 추출된 유체를 포함한다. 고체 조직, 조직 절편, 및 세포 파쇄물로부터 분리된 세포가 포함된다. 상기 정의는 이들의 획득 후, 임의의 방식으로, 예컨대, 시약 처리, 가용화(solubilization), 또는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 같은 특성 성분의 농축에 의하여 조작된 샘플을 포함한다. 이 용어에는 생물학적 샘플의 유도체 및 분획이 포함된다. 생물학적 샘플은 진단 검정 또는 검정 모니터링에 사용될 수 있다.

본원에 사용된, 용어 "핵산"은 단일 가닥 및/또는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드, 예컨대 데옥시리보핵산(DNA), 및 리보핵산(RNA)을 비롯한 RNA 또는 DNA의 유사체 또는 유도체를 의미한다. 핵산 분자는 3',5' 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 뉴클레오티드들의 선형 중합체이다. DNA에서, 데옥시리보핵산, 당 그룹은 데옥시리보오즈이고, 뉴클레오티드의 염기는 아데닌, 구아닌, 티민, 및 시토신이다. RNA, 리보핵산은 당으로 리보오즈를 가지며 우라실이 티민을 대체한다. 용어 "핵산"에는 또한 핵산의 유도체, 예컨대, 펩티드 핵산(PNA), 포스포로티오에이트 DNA, 및 기타, 예컨대 유사체 및 유도체 또는 이의 조합물이 포함된다.

본원에 사용된, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 2개 이상 연결된 뉴클레오티드또는 뉴클레오티드 유도체를 포함하는 올리고머 또는 폴리머를 의미하는데, 이 폴리뉴클레오티는 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 및 예를 들어, 뉴클레오티드 유사체 또는 포스포디에스테르 결합 이외의 "골격(backbone)"결합(예를 들어, 포스포트리에스테르 결합, 포스포르아미데이트 결합, 메틸포스포네이트 디에스테르 결합, 포스포로티오에이트 결합, 티오에스테르 결합, 또는 펩티드 결합(펩티드 핵산))을 내포하는, DNA 또는 RNA 유도체를 포함한다. 용어 "올리고뉴클레오티드"는 또한, 당업계의 통상의 기술자가 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, PCR 프라이머가 일반적으로 약 50개 내지 100개 미만의 뉴클레오티드 길이임을 인지할지라도, "폴리뉴클레오티드"와 본질적으로 동의어로 본원에서 사용된다.

폴리뉴클레오티드는 또한 절단에 대해 비교적 저항성이 있는 하나 이상의 결합을 함유하는데, 예를 들어, 키메라 올리고뉴클레오티드 프라이머는 펩티드 핵산 결합에 의해 연결된 뉴클레오티드와 3'에 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 포스포디에스테르 결합 등에 의해 연결되며, 폴리머라아제에 의해 신장될 수 있다. 펩티드 핵산 서열은 널리 알려진 방법을 이용하여 제조될 수 있다(예를 들어, 문헌[Weiler et al. (1997) Nucleic acids Res. 25:2792-2799)]를 참조하라).

폴리뉴클레오티드는 더 거대한 핵산 분자의 일부(예를 들어, 다형성 영역을 함유하는 유전자의 일부), 또는 염색체의 유전자외(extragenic) 영역의 일부(예를 들어, 짧은 단위 반복(short tandem repeat, STR) 로커스, 초변이성 단위 반복(variable number of tandem repeat, VNTR) 로커스, 미위성체(microsatellite) 로커스 또는 미니위성체(minisatellite) 로커스와 같은, 뉴클레오티드 반복부의 영역의 일부)일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 단일 가닥 또는 이중 가닥(예를 들어, DNA-RNA 하이브리드)이거나, 3중 가닥 또는 4중 가닥일 수 있다. 폴리뉴클레오티드가 이중 가닥 DNA인 경우, 이것은 A, B, L 또는 Z 배열로 존재할 수 있고, 한 폴리뉴클레오티드는 이러한 배열의 조합을 포함할 수 있다.

본원에 사용된, DNA 또는 핵산 상동체는 미리 선별된 보존된 뉴클레오티드 서열, 예컨대, 치료적 폴리펩티드를 엔코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 의미한다. 용어 "실질적으로 상동성"은 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 상동성을 가지거나, 더 적은 비율의 상동성 또는 동일성 및 보존된 생물학적 활성 또는 기능을 지닌다는 것을 의미한다.

용어 "상동성" 및 "동일성"은 종종 호환적으로 사용된다. 이와 관련하여, 상동성 또는 동일성 백분율이, 예를 들어, GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. GAP 프로그램은 스미스와 워터만[Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]에 의해 교정된대로, 니들만과 분쉬[Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 방법을 이용한다. 간단히 요약하면, GAP 프로그램은 2개의 서열 중 더 짧은 서열내 심볼의 총 개수로 나누어진, 유사한 정렬된 심볼(예를 들어, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 개수로서 유사도를 정의한다. GAP 프로그램에서 디폴트 파라미터는 하기를 포함할 수 있다: (1) 진수 비교 행렬(동일성에 대한 값 1 및 비동일성에 대한 값 0을 포함) 및 그립스코브와 버제스[Gribskov and Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745 (1986)]의 계량 비교 행렬(weighted comparison matrix)(슈바르츠와 데이호프[Schwartz and Dayhoff, eds., ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, pp. 353 358 (1979)]에 기술됨); (2) 각 갭에 대한 패널티 3.0과 각 갭내의 각 심볼에 대한 추가 패널티 0.10; 및 (3) 말단 갭에 대한 노패널티.

임의의 2 핵산 분자가 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 "동일한" 뉴클레오티드를 갖고 있는지 여부는 일예로, 피어슨과 리프만의 논문[Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)]에서와 같은 디폴트 파라미터를 사용하는, "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 대안적으로, 생물학 정보를 위한 국가 센터[National Center for Biotechnology Information] 데이터베이스의 BLAST 기능이 동일성 결정을 위해 사용될 수 있다.

일반적으로, 서열은 가장 높은 차수(order) 매치가 획득되게 정렬된다. "동일성" 그 자체로는 당업계에 공지된 의미를 가지며 공개된 교시를 이용하여 계산될 수 있다. (예를 들어, 하기 문헌들을 참조하라: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; 및 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991). 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 사이의 동일성을 측정하기 위한 다수의 방법들이 존재하므로, 용어 "동일성"은 통상의 기술자에게 널리 알려져 있다(Carillo, H. & Lipton, D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988)). 2개의 서열 사이에 동일성 또는 유사도를 결정하기 위해 흔히 사용되는 방법들은, 문헌[Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994], 및 문헌[Carillo, H. & Lipton, D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988)]에 소개된 방법을 포함하나, 이로만 국한되는 것은 아니다. 동일성과 유사도를 결정하기 위한 방법은 컴퓨터 프로그램에서 체계적으로 분류된다. 2개의 서열 사이에 동일성과 유사도를 결정하기 위한 컴퓨터 프로그램 방법은, GCG 프로그램 패키지[Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(I):387 (1984)], BLASTP, BLASTN, FASTA[Atschul, S.F., et al., J. Molec. Biol. 215:403 (1990)]을 포함하나, 이로만 국한되는 것은 아니다.

그러므로 본원에 사용된, 용어 "동일성"은 시험 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 레퍼런스 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 사이의 비교를 나타낸다. 예를 들어, 시험 폴리펩티드는 레퍼런스 폴리펩티드와 90% 이상 동일한 임의의 폴 리펩티드로 정의될 수 있다.

본원에 사용된, 용어 "~에 90% 이상 동일한"은 레퍼런스 폴리펩티드와 대비하여 90 내지 99.99 퍼센트의 동일성을 의미한다. 90% 이상의 수준에서 동일성은 예증 목적을 위해 추정되는, 100개 아미노산 길이의 시험 및 레퍼런스 폴리펩티드가 비교된다는 사실을 의미한다. 시험 폴리펩티드에서 단지 10%(예를 들어, 100개 중 10개) 아미노산이 레퍼런스 폴리펩티드의 아미노산과 다르다. 유사한 비교가 시험 및 레퍼런스 폴리뉴클레오티드 사이에서 이루어질 수 있다. 그러한 차이는 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐서 무작위적으로 분포된 점 돌연변이로 나타나거나 이들은 허용되는 최대까지 다양한 길이의 하나 이상의 위치들로 무리지어질 수 있다(예를 들어, 10/100 아미노산 차이(대략 90% 동일성). 차이는 핵산 또는 아미노산 치환, 또는 결실로 정의된다.

용어 "실질적으로 동일한 또는 실질적으로 상동성인 또는 유사한"은 당업계의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이 문맥에 따라 다르며 일반적으로 60% 이상 또는 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 85% 이상, 또는 더 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 의미한다.

본원에 사용된, "실질적으로 순수한"은, 그러한 순도를 평가하기 위해 당업계의 통상의 기술자에 의해 사용되는, 표준 분석 방법, 예컨대, 박층 크로마토그래피(TLC), 겔 전기영동, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 질량분석기(MS)에 의해 측정함으로써, 쉽게 검출할 수 있는 불순물이 결여된 것으로 생각될 정도로 충분히 상동성이 있다는 것을 뜻하거나, 추가 정제가 물질의 효소적 활성과 생물학적 활성과 같은 물리적 특성 및 화학적 특성을 검출가능하게 변형시키지 아니할 정도로 충분히 순수하다는 것을 의미한다. 실질적으로 화학적으로 순수한 화합물을 생산하기 위한 화합물의 정제 방법은 당업계의 통상의 기술자에게 알려져 있다. 그러나 실질적으로 호학적으로 순수한 화합물은 입체이성질체의 혼합물일 수 있다. 이와 같은 경우에, 추가 정제가 화합물의 특정 활성을 증가시킬 수 있다.

LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성을 조절하는 특정 작용제의 합성

LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원, 예를 들어, 레티노이드 결합 단백질 수용체의 활성을 조절하는 작용제의 합성은 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 표준 합성 기술을 이용하거나, 본원에 기술된 방법과 조합하여 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 방법을 이용하여 합성될 수 있다. 예를 들어, 하기 문헌들을 참조하라: 미국 특허 공개 공보 2004/0102650호; Um, S. J., et al., Chem. Pharm. Bull., 52:501-506 (2004). 또한, LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성을 조절하는 몇몇 작용제들은 시중의 다양한 공급업체로부터 구매될 수 있다. 더 상세한 지침으로 하기 합성 방법이 또한 활용될 수 있다.

몇몇 구체예에서, LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원은 유사한 리간드에 결합한다. 몇몇 구체예에서, 상이한 조직 또는 세포에서 발현된 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원은 동일한 리간드 또는 작용제에 결합할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 망막 및/또는 RPE 세포 이외의 조직 또는 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원과 상호작용하는 작용제는 또한 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원과 상호작용할 수 있다. LDL 수용체 유전자 패밀리의 구성원과 상호작용 할 수 있는 작용제는 당업계에 공지되어 있고 본원에서 고려된다. 예를 들어, US 2003/0202974호, WO 06/037335호, WO 03/080103호, US 2004/0198705호, WO 04/084876호, US 2006/0029609호, US 2005/0026823호, US 2005/0100986호, US 2005/0089932호, US 2005/0042227호, US 2004/0204357호, US 2004/0198705호, US 2004/0049010호, US 2003/0202974호, US 2003/0181660호, US 2003/0082640호, US 2003/0157561호 및 US 2003/0077672호(상기 특허문헌들 모두는 참고문헌으로 포함된다).

눈 안의 망막 및/또는 망막 색소 상피 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성을 조절하는 작용제들은 바람직하게는 본원에 개관된 방법들에 의해 확인된다. 작용제는 예를 들어, 항체, 폴리펩티드, 핵산, 폴리핵산, 폴리머, 내생성 결합 리간드, 저분자량 유기 화합물, Ca²⁺ 스캐빈저, 환원제, 및 이들의 임의의 단편과 유도체일 수 있다.

한 구체예에서, 작용제는 레티놀 결합 단백질(RBP)에 대한 레티놀의 결합 또는 복합체화(complexing), 또는 광수용체간 레티노이드 결합 단백질(IRBP)에 대한 레티놀결합 또는 복합체화를 경쟁적으로 억제한다. 그러한 화합물은, 예를 들어, 레티놀 화합물 또는 레티노이드 결합 단백질 또는 광수용체간 레티노이드 결합 단백질 중 어느 하나와의 추가 결합을 입체적으로 억제하는 방식으로 상기 레티놀 화합물 또는 레티놀 결합 단백질 또는 광수용체간 레티노이드 결합 단백질 중의 어느 하나와 특이적으로 상호작용하는 화합물일 수 있다. (예를 들어, 참고문헌으로 통 합된, US 특허 공개공보 2006/0094063호를 참조하라).

또 다른 구체예에서, 작용제는 망막 및/또는 망막 색소 상피 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 대한 레티노이드 결합 단백질 또는 광수용체간 레티노이드 결합 단백질의 결합을 경쟁적으로 억제한다. 그러한 작용제는, 예를 들어, 망막 및/또는 망막 색소 상피 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원과 레티노이드 결합 단백질 또는 광수용체간 레티노이드 결합 단백질 중 어느 하나와의 결합 또는 추가적인 결합을 입체적으로 억제하는 방식으로 망막 및/또는 망막 색소 상피 세포내 레티노이드 결합 단백질 또는 광수용체간 레티노이드 결합 단백질과 특이적으로 상호작용하거나 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원과 특이적으로 상호작용하는 화합물일 수 있다.

아직 또 다른 구체예에서, 작용제는 망막 및/또는 망막 색소 상피 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 공수용체에 대한 레티노이드 결합 단백질의 결합을 경쟁적으로 억제한다.

또 다른 구체예에서, 작용제는 수용체 단백질 상의 충분한 양의 결합 부위를 블로킹하고/거나 레티노이드 결합 단백질을 블로킹함으로써, LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 대한 레티노이드 결합 단백질의 결합을 억제하고, 그리하여 정상적인 치료 효과를 유지하나 망막 및/또는 RPE 세포내에서 수용체 단백질에 대한 결합은 억제시킨다. 몇몇 구체예에서, 작용제는 망막 및/또는 RPE 세포내 수용체 단백질 상의 충분한 양의 결합 부위에 결합할 수 있고, 그에 따라 망막 및/또는 RPE 세포내 수용체 단백질에 대한 레티노이드 결합 단백질의 결합을 억제시킨다. 몇몇 구체예에서, 작용제는 망막 및/또는 RPE 세포내 수용체 단백질에 결합할 수 있고, 그리하여 수용체 단백질에 대한 레티노이드 결합 단백질의 결합을 억제시킨다. 몇몇 구체예에서, 작용제는 레티노이드 결합 단백질에 결합할 수 있고, 그에 따라 상기 단백질이 망막 및 RPE 세포내 수용체 단백질에 결합하는 것을 막는다.

또 다른 구체예에서, 작용제는 망막 및/또는 망막 색소 상피 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 대한 치료 약물의 결합을 경쟁적으로 억제시킨다. 또 다른 구체예에서, 작용제는 망막 및/또는 망막 색소 상피 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 대한 항생 약물의 결합을 경쟁적으로 억제시킨다. 또 다른 구체예에서, 작용제는 망막 및/또는 망막 색소 상피 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 대한 아미노글리코시드 약물의 결합을 경쟁적으로 억제시킨다.

여전히 추가 구체예에서, 작용제는 망막 및/또는 망막 색소 상피 세포내에서 레티노이드의 흡수를 증가시킨다. 추가 구체예에서, 작용제는 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 대한 RBP 또는 IRBP의 결합을 증가시킨다.

또 다른 구체예에서, 작용제는 망막 및/또는 RPE 세포내에서 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 대한 레티놀, RBP, RBP-레티놀 복합체, IRBP, IRBP-레티놀, TTR 또는 RBP-레티놀-TTR의 결합을 차단한다. 또 다른 구체예에서, 작용제는 망막 및/또는 RPE 세포내에서 레티노이드 흡수를 차단한다.

또 다른 구체예에서, 작용제는 망막 및/또는 RPE 세포내에서 치료 약물 흡수를 차단한다. 또 다른 구체예에서, 작용제는 망막 및/또는 RPE 세포내에서 항생 약물의 흡수를 차단한다. 또 다른 구체예에서, 작용제는 망막 및/또는 RPE 세포내 에서 아미노글리코시드 약물의 흡수를 차단한다. 또 다른 구체예에서, 작용제는 망막 및/또는 RPE 세포내에서 젠타마이신의 흡수를 차단한다.

여전히 또 다른 구체예에서, 작용제는 망막 및/또는 망막 색소 상피 세포내에서 LDL 수용체 유전자 패밀리의 발현을 변화시키는 효능을 갖는다. 예를 들어, 작용제는 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 정상적으로 발현하는 세포내에서 그러한 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 발현을 감소시키거나, 달리 상기 작용제는 세포내에서 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 발현을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, MPR는 혈청 내에서 레티놀과 RBP 수준을 감소시키는 것으로 알려져 있다. MPR로 장기간에 걸친 마우스의 치료는 RBP의 트랜스시토시스를 담당하는 RPE내 식별된 LDL 수용체 유전자 패밀리 단백질의 발현을 감소시키는 결과를 가져오며, 그에 따라 RPE내의 LDL 수용체 유전자 패밀리 단백질과 혈청 RBP-레티놀 사이의 관계를 확립시킨다.

LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 발현을 변화시키기 위한 다른 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 핵산 서열이 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 발현을 변화시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, US 2004/0198705호의 단락 [0176] 내지 [0186], 및 WO 2005/070965호를 참조하라.

더욱이, 작용제는 세포내에서 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 공수용체의 발현을 변화시키는 효능을 지닐 수 있다. 예를 들어, 작용제는 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 정상적으로 발현하는 세포내에서 그러한 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 공수용체의 발현을 감소시키거나, 달리 상기 작용제는 세포내에서 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 공수용체의 발현을 증가시킬 수 있다.

본원에서 고려된 작용제는 천연적으로 생성되는 화합물 및 합성 화합물의 라이브러리로부터 선택될 수 있는데, 상기 화합물은 결합의 변화에 대하여 무작위적으로 시험된다.

폴리펩티드와 단백질

한 구체예에서, 작용제는 폴리펩티드이다. 예를 들어, 그러한 폴리펩티드는 RBP 결합 단백질 수용체 도메인과 이의 단편, RBP 결합 단백질 공수용체 도메인과 이의 단편, LDL 수용체 유전자의 구성원에 결합하는 내생성 리간드, 변형된 레티노이드 결합 단백질 또는 이의 단편, 레티노이드 결합 단백질의 단편, LDL 수용체 유전자 패밀리 길항제, 예컨대 수용체 연관 단백질(RAP), 및 이들 중 어느 하나의 기능적 상동체로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

한 구체예에서, 작용제는 레티노이드 결합 단백질에 결합할 수 있는 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 도메인이다. 바람직하게는, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 도메인은 레티노이드 결합 단백질, 예컨대 RBP 또는 IRBP에 결합할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 도메인은 메갈린 도메인이다. 한 구체예에서, 상기 도메인은 LRP 도메인이다.

LRP의 보체형 반복부는 RAP로 지정된 단백질에 결합할 수 있다는 것이 알려져 있다. 더 구체적으로, LRP의 클러스터 11의 8개 보체형 반복부는 음으로 하전된 아미노산이 결여되어 있다는 점에서 나머지와 상이한, 반복부 8을 예외로 하면서 RAP와 결합할 수 있다[Andersen et al., 2000, J. Biol. Chem. 275:21017- 21024].

따라서, LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 도메인이 1개 이상의 보체형 반복부, 더 바람직하게는, 2개 이상의 보체형 반복부를 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 보체형 반복부 2개, 보체형 반복부 3개, 보체형 반복부 4개, 보체형 반복부 5개, 보체형 반복부 6개, 보체형 반복부 7개, 보체형 반복부 8개, 보체형 반복부 9개, 보체형 반복부 10개, 보체형 반복부 11개 이상을 포함하는 LDL 수용체 유전자 패밀리의 도메인과 같은, LDL 수용체 유전자 패밀리의 다른 도메인이 고려된다. 바람직한 구체예에서, LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 도메인은 2개의 보체형 반복부를 포함한다. LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 특정 도메인에 대해서는, 예를 들어, US 2004/0198705호의 단락 [0143] 내지 [0164]를 참조하라.

또 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 레티노이드 결합 단백질의 단편이다. 바람직하게는, 그러한 단편은 망막과 RPE 세포내에서 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원과 결합할 수 있다. 더욱이, 레티노이드 결합 단백질의 이러한 단편은 예를 들어, 레티놀과 같은, 레티노이드와 결합하거나 회합할 수 없다. 그러한 경우에 있어서, 레티노이드 결합 단백질의 단편은 망막 및/또는 RPE 세포내에서 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 결합할 수 있고, 그에 따라 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리의 구성원과 레티놀-RBP 복합체 또는 레티놀-RBP-TTR 복합체의 결합은 억제된다.

한 구체예에서, 작용제는 레티노이드 결합 단백질과 결합할 수 있는 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원과 결합할 수 있는 RAP의 단편이다.

또 다른 구체예에서, 작용제는 임의의 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 대한 내생성 리간드이다. LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원은 공통 내생성 리간드를 공유하는 것으로 알려져 있다(상기 참조). LRP와 메갈린과 같은, LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 대한 내생성 리간드의 예는 위에 제시되어 있다.

한 구체예에서, 폴리펩티드는 경쇄다[Klassen et al. Light Chains are Ligand for Megalin. J. Appl. Physiol. 98:257-263, 2005].

한 구체예에서, 폴리펩티드는 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 대한 길항제이다. 폴리펩티드는 망막 및/또는 RPE 세포내에서 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성을 조절시키는 이들의 활성에 관해 스크리닝 될 수 있다. 한 구체예에서, 폴리펩티드는 RPE 세포내로 레티노이드 흡수를 억제시키는 이들의 활성에 대해 스크리닝된다. 또 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 RPE 세포내로의 IRBP-레티놀 및/또는 RBP-레티놀 흡수를 억제시키는 이들의 활성에 대해 스크리닝된다. 또 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 망막 및/또는 RPE 세포내로의 치료 약물 흡수를 억제시키는 이들의 활성에 대해 스크리닝된다. 또 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 망막 및/또는 RPE 세포내로의 예를 들어, 아미노글리시드 약물과 같은, 항생 약물의 흡수를 억제시키는 이들의 활성에 대해 스크리닝된다.

핵산

한 구체예에서, 작용제는 핵산 서열이다. 바람직하게는, 그러한 핵산 서열은 잠재적으로 망막 및/또는 RPE 세포내에서 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 발현을 변화시킨다. 한 구체예에서, LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원은 레티노이 드 결합 단백질 수용체이다.

한 구체예에서, 핵산 서열은 망막 및 RPE 세포내에 존재하는 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 안티센스 RNA 또는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 엔코딩하는 DNA를 포함하거나 상기 핵산 서열은 망막 및 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 안티센스 RNA이다. 이의 상동체가 또한 본원의 교시 영역 내에 포함된다. 몇몇 구체예에서, LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원은 레티노이드 결합 단백질이다.

더욱이, 핵산 서열은 항유전자(antigene) 핵산 서열을 포함할 수 있는데, 상기 서열은 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 엔코딩하는 유전자와 혼성화될 수 있고 그에 따라 상기 유전자의 전사를 억제시킨다. 상기 항유전자 핵산 서열은 상기 유전자의 임의의 일부, 예를 들어, 상기 유전자의 프로모터 및/또는 인트론 및/또는 엑손에 혼성화될 수 있다. 항유전자 핵산은 여하한 종류의 핵산, 예를 들어 DNA, RNA, LNA 또는 PNA 또는 siRNA일 수 있다.

본원에 사용된, 용어 "안티센스 RNA"는 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 비암호화 DNA 가닥으로부터 전사되는 RNA 서열 또는 스트린전시한(stringent) 조건하에서 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원 mRNA에 혼성화할 수 있는 RNA 서열 또는 이의 단편을 포함하려는 의도이다.

핵산 서열이 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 안티센스 RNA를 엔코딩하는 DNA 서열 또는 이의 상동체인 경우, 그러한 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 본원에 소개된 특정 구체예의 세포내에서 상기 DNA 서열의 전사를 유도하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된다.

또 다른 구체예에서, 핵산 서열은 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 엔코딩하는 서열 또는 이의 상동체 또는 이의 단편을 포함한다. 그러한 핵산 서열은 바람직하게는 본원에 소개된 특정 구체예의 세포내에서 상기 DNA 서열의 전사를 유도하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된다.

DNA 서열의 전사를 유도하는 다양한 뉴클레오티드 서열이 당업계의 통상의 기술자에게 알려져 있고 그러한 서열은 각 경우의 특정 필요에 따라 선택되어야 한다. 예를 들어, 그러한 서열은 원핵생물, 진핵생물 또는 바이러스 기원의 프로모터 서열 및 인핸서 서열이거나 합성된 서열일 수 있다.

핵산 서열은 벡터 내에 포함될 수 있고 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 벡터 및 임의의 적당한 벡터가 사용될 수 있다. 벡터는 핵산 분자를 숙주 세포로 운반할 수 있다. 그러한 벡터는 천연적으로 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 핵산 서열 근처에서 발견되지 않는 핵산 서열을 함유한다.

벡터는 한 개체에서 다른 개체로 DNA 서열을 운반하기 위해 사용될 수 있는 플라스미드이다. 벡터는 DNA, RNA, LNA 및 PNA를 포함하는 임의의 핵산일 수 있는 복제가능한 작제물이다. 일단 적당한 숙주 내로 형질변환되면, 벡터는 숙주 게놈과는 독립적으로 복제 및 기능하거나, 일부 경우에 있어서, 상기 게놈 내로 통합될 수 있다.

전형적으로, 벡터는 바이러스 유래 벡터, 레트로바이러스 유래 벡터, 파아지, 플라스미드, 코스미드, 통합가능한 DNA 단편(즉, 재조합에 의해 숙주 게놈내로 통합가능한 단편), 박테리아 또는 진핵생물 세포이다.

저분자량 유기 화합물

몇몇 구체예에서, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성을 조절하는 작용제는 저 분자량 유기 화합물이다. 몇몇 구체예에서, 저분자량 유기 화합물은 양전하를 지닌다. 몇몇 구체예에서, 저분자량 유기 화합물은 1 이상의 양전하를 지닌다. 몇몇 구체예에서, 저분자량 유기 화합물은 2의 양전하를 지닌다. 몇몇 구체예에서, 저분자량 유기 화합물은 3의 양전하를 지닌다. 몇몇 구체예에서, 저분자량 유기 화합물은 4의 양전하를 지닌다. 몇몇 구체예에서, 저분자량 유기 화합물은 5의 양전하를 지닌다. 몇몇 구체예에서, 저분자량 유기 화합물은 1, 2, 3, 4, 또는 4 이상의 양전하를 지닌다. 양전하를 띤 저 분자량 유기 화합물을 선별함으로써, 수용체 단백질 상의 충분한 수의 결합 부위를 차단하는 것이 가능하다. LDL 수용체 유전자 패밀리 구성 원내 결합 부위가 양이온성 종과 상호작용할 수 있는 음이온성 아미노산 잔기를 함유한다는 것이 알려져 있다(상기 참조).

몇몇 구체예에서, 본원에서 제공된 저분자량 화합물은 아미노기를 갖는다. 몇몇 구체예에서, 저분자량 화합물은 2개의 아미노기를 갖는다. 몇몇 구체예에서, 저분자량 화합물은 1개 이상의 아미노기를 갖는다. 몇몇 구체예에서, 저분자량 화합물은 양성자를 받아들일 수 있는 작용체(functionality)(기)를 갖는다. 몇몇 구체예에서, 저분자량 화합물은 양성자를 받아들일 수 있는 1개 이상의 작용체(기)를 갖는다. 몇몇 구체예에서, 저분자량 화합물은 1개 이상의 양성자를 받아들일 수 있는 1개 이상의 작용체(기)를 갖는다. 양성자를 받아들일 수 있는 적당한 작용체는 아미노기이다.

몇몇 구체예에서, 저분자량 유기 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 약제학적으로 허용되는 N-옥사이드, 약제학적으로 활성있는 대사산물, 약제학적으로 허용되는 전구약물, 및 이의 약제학적으로 허용되는 용매화물은 하기 화학식 (I)의 구조를 갖는다:

상기 화학식에서, L은 결합, 아릴, 0 내지 3개의 N 원자를 함유하는 헤테로아릴, C₃-C₈ 카르보시클로알킬, 0 내지 3개의 N 원자를 함유하는 C₃-C₈ 헤테로시클로알킬인데, 여기서 상기 아릴, 헤테로아릴, 카르보시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬은 O(옥소), OH, 페닐, 할라이드, C₁-C₄ 알킬, C₂-C₄ 알케닐, C₂-C₄ 알키닐, 헤테로아릴, 아릴-(C₁-C₄ 알킬), 헤테로아릴-(C₁-C₄ 알킬), 헤테로시클로알킬-(C₁-C₄ 알킬), 시클로알킬알킬, O-(C₁-C₄ 알킬), O(COR¹⁰), -CO₂H, -CO₂R¹⁰, -C(O)R10, -CON(R¹⁰)₂, -NHC(O)R¹⁰, -C(OH)(R¹⁰)₂, 테트라졸일, -C(O)NHSO₂R¹⁰, -CHOHCF₃, -COCF₃, -SO₂NHC(O)R¹⁰, 또는 -N(R¹⁰)₂로 치환되거나 치환되지 아니하며, 여기서 각각의 R10은 독립적으로 H, 또는 저급 알킬, 저급 플루오로알킬, 저급 알케닐, 저급 알키닐, C₃-C₆ 시클로알킬, 페닐, 또는 벤질 중에서 선택된 치환되거나 비치환된 기이고; R1 및 R2는 각각 독립적으로 결합 및 C_l-C₁₀ 알킬 중에서 선택되며, 여기서 C₁-C₁₀ 알킬은 O, OH, 페닐, 아민(NH₂), 이민(NH), 할로겐, 알킬, 알케닐 또는 알키닐, 치환된 저급 알킬, 치환된 저급 알케닐 또는 알키닐, 아릴, 헤테로시클일, 헤테로아릴, 아릴-(C₁-C₄)-알킬, 헤테로아릴-(C₁-C₄)-알킬, 헤테로시클일-(C₁-C₄)-알킬, 시클로알킬알킬, 시클로알킬, 알콕시, 카르복시, 트리플루오로메틸, 시아노, 아미노, 또는 니트로 중에서 선택된 치환기로 1회 이상 치환되거나 비치환되며, 여기서 상기 C_l-C₁₀ 알킬내의 탄소들 중 임의의 탄소는 산소, 질소, 황, 또는 규소로 대체되거나 비대체되며;

R³, R⁴, R⁵, 및 R⁶는 수소, OH, 트리플루오로메틸, C(NH)NH₂, 시아노, 아미노, 니트로, 알킬, 헤테로알킬, 알케닐, 알키닐, 페닐, 벤질, 아릴, 헤테로시클로알킬, 헤테로아릴, 아릴-(C₁-C₄)-알킬, 헤테로아릴-(C₁-C₄)-알킬, 헤테로시클일-(C₁-C₄)-알킬, 시클로알킬알킬, 시클로알킬 중에서 선택된 치환되거나 비치환된 기 중에서 개별적으로 선택되며, 여기서 치환되거나 비치환된 기는 H, O(옥소), OH, 페닐, 이민(NH), 할로겐, C₁-C₄알킬, C₂-C₄알케닐 또는 C₂-C₄알키닐, 아릴, 헤테로시클일, 헤테로아릴, 아릴-(C₁-C₄)-알킬, 헤테로아릴-(C₁-C₄)-알킬, 헤테로시클일-(C₁-C₄)-알킬, 시클로알킬알킬, 시클로알킬, 알콕시, 카르복시, 트리플루오로메에틸, 시아노, 아미노, 및/또는 니트로 중에서 선택된 치환기를 가지거나;

R³, R⁴, R⁵, 및 R⁶ 중 하나 이상은 L에 대한 결합이거나;

R³, R⁴, R⁵, 및 R⁶ 중 하나 이상은 또 다른 R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ 및/또는 L에 연결되어, 고리를 형성하며;

여기서 N' 및 N''은 부착된 추가 기를 가지거나 가지지 아니하여 4차 암모늄 염을 형성한다.

몇몇 구체예에서, N' 및 N''은 4개 이상의 원자에 의해 이격된다.

몇몇 구체예에서, L은 시클로펜틸, 푸란, 티에닐, 피롤, 이미다졸, 옥사졸, 피롤리딘, 테트라히드로푸란, 및 테트라히드로티오펜 중에서 선택된다. 몇몇 구체예에서, L은 푸란 또는 피롤이다. 몇몇 구체예에서, L은 테트라히드로푸란이다. 몇몇 구체예에서, L은 피리딘, 피리미딘, 테트라히드로피란, 피페리딘, 피페라진, 시클로헥실, 및 페닐 중에서 선택된다. 몇몇 구체예에서, L은 시클로헥실 또는 페닐이다. 몇몇 구체예에서, L은 결합이다.

몇몇 구체예에서, 저분자량 유기 화합물은 하기 화학식 (II)의 구조를 갖는다:

상기 화학식에서,

각각의 R⁹은 독립적으로 H, OH, O-(C₁-C₄ 알킬), O(COR¹⁰), 할라이드, C₁-C₄ 알킬, (C₁-C₄ 알킬)-아미노, -N(R¹⁰)₂ 및 아릴 중에서 선택되며;

다른 변수들(variables)은 본원에 기재된 것과 같다.

몇몇 구체예에서, 저분자량 유기 화합물은 하기 화학식 (III)의 구조를 갖는다:

상기 화학식에서,

각각의 R⁹은 독립적으로 H, OH, O-(C₁-C₄ 알킬), O(COR¹⁰), 할라이드, C₁-C₄ 알킬, (C₁-C₄ 알킬)-아미노, -N(R¹⁰)₂ 및 아릴 중에서 선택되며;

다른 변수들은 본원에 기재된 것과 같다.

몇몇 구체예에서, 저분자량 유기 화합물은 하기 화학식 (IV)의 구조를 갖는다:

상기 화학식에서,

각각의 n은 독립적으로 0, 1, 2, 또는 3이고;

다른 변수들은 본원에서 상기에 기재된 바와 같다.

몇몇 구체예에서, 저분자량 유기 화합물은 하기 화학식 (V)의 구조를 갖는다:

상기 화학식에서,

R¹²는 H 또는

이고;

각각의 n은 독립적으로 0, 1, 2, 또는 3이며;

다른 변수들은 본원에서 기재된 바와 같다.

몇몇 구체예에서, 각각의 n은 1이다.

몇몇 구체예에서, 저분자량 유기 화합물 및 이의 약제학적으로 허용되는 염은 1,2,-디아미노에탄; 1,3-디아미노프로판; 1,4-디아미노부탄; 1,5-디아미노펜탄; 1,6-디아미노헥산; 1,7-디아미노헵탄; 1,8-디아미노옥탄; 3-메틸아미노-1-(4-메틸피페라지노)-프로판-2-올; 4-피페라지노아닐린; 1-(3-클로로페닐)피페라진 디히드로클로라이드; 피페라진-2-온 HCl; 2-[4-(2-아미노에틸)-피페라진-1-일]-에틸아민; 피페라진; 2,4-디아미노-6-페닐-1,3,5-트리아진; 3,5-디아미노-1,2,4-트리아졸; 멜론아미드; 아르기닌 HCl; 피페리딘; 2,5-피페라진디온; 무수 피페라진; 피페라진-2-온 HCl; 및 1-(2-피리미딜)피페라진 디히드로클로라이드 중에서 선택된다.

몇몇 구체예에서, 저분자량 유기 화합물은 2-[4-(2-아미노에틸)피페라진-1-일]-에틸아민; 3-메틸아미노-1-(4-메틸피페라지노)-프로판-2-올; 및 피페라진 중에서 선택된다.

몇몇 구체예에서, 저분자량 유기 화합물은 피페라진이다.

몇몇 구체예에서, 저분자량 유기 화합물은 1,2-디아미노에탄; 1,3-디아미노프로판; 1,4-디아미노부탄; 1,5-디아미노펜탄; 1,6-디아미노헥산; 1,7-디아미노헵탄; 및 1,8-디아미노옥탄 중에서 선택된다.

몇몇 구체예에서, 저분자량 유기 화합물은 1,2-디아미노에탄; 1,4-디아미노부탄; 1,5-디아미노펜탄; 1,6-디아미노헥산; 및 1,7-디아미노헵탄 중에서 선택된다.

몇몇 구체예에서, 저분자량 유기 화합물은 1,6-디아미노헥산이다.

한 구체예에서, 작용제는 하기 화합물들 중에서 선택된다:

또 다른 구체예에서, 상기 작용제는 하기 화합물들 중에서 선택된다:

한 구체예에서, 작용제는 하기 화합물들 중에서 선택된다:

한 구체예에서, 작용제는 하기 화합물들 중에서 선택된다:

한 구체예에서, 작용제는 하기 화합물이다:

*424

한 구체예에서, 작용제는 하기 화합물들 중에서 선택된다:

한 구체예에서, 상기 작용제는 하기 화합물들 중에서 선택된다:

한 구체예에서, 상기 작용제는 하기 화합물들 중에서 선택된다:

한 구체예에서, 상기 작용제는 하기 화합물들 중에서 선택된다:

또 다른 구체예에서, 작용제는 트랜스 1,4-디아미노시클로헥산; 1,3-비스(아 미노메틸)-시클로헥산; 1,4-비스(아미노메틸)-시클로헥산; p-자일렌 디아민; m-자일렌 디아민; 1-(4-(피리드-4-일)-피페라진; 2,5-디메틸-1,4-자일렌-디아민 디히드로클로라이드; α,α'-(디메틸아미노)-p-자일렌 디히드로브로마이드; 및

중에서 선택된다.

한 구체예에서, 상기 화합물은 트랜스 1,4-디아미노시클로헥산; 1,3-비스(아미노메틸)-시클로헥산; 1,4-비스(아미노메틸)-시클로헥산; p-자일렌 디아민; m-자일렌 디아민; 2,5-디메틸-1,4-자일렌-디아민 디히드로클로라이드; α,α'-(디메틸아미노)-p-자일렌 디히드로브로마이드 중에서 선택된다.

또 다른 구체예에서, 상기 화합물 트랜스 1,4-디아미노시클로헥산; p-자일렌 디아민; m-자일렌 디아민; 2,5-디메틸-1,4-자일렌-디아민 디히드로클로라이드; 1-(피리드-4-일)-피페라진, α,α'-(디메틸아미노)-p-자일렌 디히드로브로마이드 중에서 선택된다.

또 다른 구체예에서, 상기 화합물은 p-자일렌 디아민; 1-(피리드-4-일)-피페라진, α,α'-(디메틸아미노)-p-자일렌 디히드로브로마이드 중에서 선택된다.

또 다른 구체예에서, 상기 화합물은 트랜스 p-자일렌 디아민 및 α,α'-(디메틸아미노)-p-자일렌 디히드로브로마이드 중에서 선택된다.

한 구체예에서, 저분자량 유기 화합물은 RPE 세포내로 레티노이드의 흡수를 억제시킨다. 또 다른 구체예에서, 저분자량 유기 화합물은 RPE 세포내로 RBP-레티놀 및/또는 IRBP-레티놀의 흡수를 억제한다. 또 다른 구체예에서, 저분자량 유기 화합물은 RPE 세포 내로 망막-독성 치료 약물의 흡수를 억제한다.

아미노글리코시드의 유도체

또 다른 구체예에서, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성을 조절하는 작용제는 아미노글리코시드의 유도체이다. 아미노글리코시드는 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 결합하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, WO 2004/084876호를 참조하라. 아미노글리코시드의 유도체는 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 길항제로서 효능을 지니는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, WO 2004/084876호를 참조하라. 한 구체예에서, 작용제는 젠타마이신, 폴리믹신 B, 아프로티닌, 트리코산틴, 아미카신, 카나마이신, 네오마이신, 네틸미신, 파로모마이신, 스트렙토마이신, 토브라마이신 또는 아프라마이신의 유도체이다. 한 구체예에서, 작용제는 젠타마이신, 폴리믹신 B, 아프로티닌, 또는 트리코산틴의 유도체이다. 또 다른 구체예에서, 작용제는 젠타마이신의 유도체이다. 또 다른 구체예에서, 작용제는 가로즈아민(garoseamine), 푸르포스아민(purposamine), 및 2-데옥시스트렙트아민 중에서 선택된 젠타마이신의 유도체이다.

Ca ²⁺ 스캐빈저

LDL 수용체 패밀리의 구성원은, 수용체 안정도에 기여하며 수용체를 이의 본래 형태로 유지시키는데 기여하는 것으로 생각되는, Ca²⁺에 결합하는 것으로 알려져 있는데, 이것은 수용체에 대한 특정 리간의 결합에 중요하다[Andersen et al. J. Biol. Chem. Vol 275, no. 28, 21017-21024, 2000]. 예를 들어, RBP, IRBP 및 RAP 와 같은, 특정 단백질 리간드는 이의 본래 형태로 수용체 단백질에 결합한다. 몇몇 구체예에서, 작용제는 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성을 조절하기 위해 사용되는 Ca²⁺ 스캐빈저이다. 몇몇 구체예에서, Ca²⁺ 스캐빈저는 수용체 단백질의 안정도를 감소시킨다. 몇몇 구체예에서, Ca²⁺ 스캐빈저는 EDTA이다. 몇몇 구체예에서, Ca²⁺ 스캐빈저는 제 2 작용제와 함께 첨가된다.

이황화 환원제

LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원 내에 존재하는 리간드-결합 (보체) 타입 시스테인-풍부 반복부는 수용체 단백질의 3차원 구조에 기여하는 다수의 이황화 브릿지를 함유한다[Andersen et al. J. Biol. Chem. Vol 275, no. 28, 21017-21024, 2000]. 예를 들어, RBP와 IRBP와 같은, 특정 단백질 리간드는 수용체 단백질이 이의 천연 형태로 존재할 때, LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 인지하고 이에 결합한다. 이황화 브릿지의 환원은 수용체 단백질의 천연 형태를 붕괴시키고, 단백질 리간드의 결합을 상당히 억제시킨다(예를 들어, US 2003/0202974호를 참조하라). 한 구체예에서, 작용제는 환원제이다. 또 다른 구체예에서, 작용제는 수용체 단백질내 이황화기를 환원시킨다.

폴리머

몇몇 구체예에서, 작용제는 폴리머이다. 몇몇 구체예에서, 폴리머는 1 이상의 양전하를 갖는다. 몇몇 구체예에서, 폴리머는 1을 초과하는 양전하를 갖는다. 한 구체예에서, 폴리머는 폴리리신이다. 또 다른 구체예에서, 폴리머는 폴리리신 의 유도체이다. 본원에서 고려된 다른 폴리머는 WO 2004/084876호 및 WO 2006/037335호에 개시된 폴리머를 포함한다. 본원에 개시된 모든 펩티드 또는 단백질의 폴리머가 또한 고려된다.

항체

몇몇 구체예에서, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성을 조절하기 위해 본원에서 사용되는 작용제는 항체이다. 본원에서 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 특이적으로 인지하는, 항체, 및 항체를 제조하는 방법이 소개된다. 항체는 예를 들어, 피츠제랄드 인더스트리 인터내서널(Fitzgerald Industries International, Inc., Concord, MA), 옥스포드 바이오메디컬 리서치(Fitzgerald Industries International, Inc., Concord, MA), 산타크루즈 테그놀로지즈(Santa Cruz Technologies, Santa Cruz, CA)와 같은 판매업자를 통해 획득된다. 대안적으로, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 특이적인 항체는 당업계에 공지된 방법에 의해 획득된다.

적절한 항체를 생산하기 위한 면역원은 망막 및/또는 RPE 세포내에서 발현되는 LDL 수용체 유전자 패밀리의 완전한 구성원, 또는 이의 단편과 유도체, 또는 망막 및/또는 RPE 세포의 표면에서 발현되는 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 포함할 수 있다. 면역원은 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원 중 어느 하나의 전부 또는 일부를 포함하는데, 여기서 이러한 아미노산은 천연 표적 단백질에서 발견되는, 번역 후 변형, 예컨대 당화를 함유한다. 단백질 세포외 도메인을 포함하는 면역원은 당업계에 공지된 다양한 방식, 예를 들어, 통상적인 재조합 방법을 이용한 클로닝된 유전자의 발현, 또는 종양 세포 배양물 상청액으로부터의 분리 등에 의해 생산된다. 면역원은 또한 숙주 동물 내로 도입된 면역원성 펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 생체내에서 발현될 수 있다.

본원에서 고려된 항체 분자는 면역글로불린 분자를 포함하는데, 상기 분자는 전형적으로 중쇄 및 경쇄로 구성되며, 각각은 다른 면역글로불린 분자와 유사성을 나타내는 불변 영역 및 특정 항원에 대한 특이성을 동반하는 가변 영역을 포함한다. 대부분의 면역글로불린은 중쇄 불변 영역내 항원 결정기에 기초하여, 다수의 부류, 예를 들어, IgG, IgM, IgA, IgE, 및 IgD로 분류될 수 있다; 각 부류는 면역 반응에서 상이한 역할을 한다.

항체는 적당한 대조군과 비교할 때 측정된 활성의 자극, 억제, 또는 봉쇄(blockage)를 증가시키거나 감소시킴으로써, 생물학적 활성을 조절하는데 사용될 수 있다.

항체 조절자는 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 특이적으로 결합하며 수용체 단백질, 예컨대, 신호 전달을 개시시키는 수용체-리간드 결합을 활성화시키는 항체; LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 특이적으로 결합하며 폴리펩티드에 대한 또 다른 분자의 결합을 억제시켜, 신호 전달 경로의 활성화를 막는 항체; LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 결합하여 전사를 조절하는 항체; 및 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 결합하여 번역을 조절하는 항체를 포함한다. LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원, 또는 이의 폴리뉴클레오티드의 생물학적 활성을 조절하는 항체는, 적당한 대조군과 비교할 때, 결합 활성을 약 10% 이 상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 50% 이상, 약 100% 이상, 또는 약 2배 이상, 약 5배 이상, 또는 약 10배 이상 증가 또는 감소시킨다. 한 구체예에서, 항체는 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성을 특이적으로 방해한다. 보다 구체적으로, 항체는 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 세포외 도메인에 특이적으로 결합한다.

한 구체예에서, 작용제는 인트라바디(intrabody)이다. 인트라바디는 세포내부에서 표적 분자와 특이적으로 결합하고 이를 불활성화시키도록 고안된 세포내에서 발현되는 단일-쇄 항체 분자이다. 인트라바디는 세포 검정 및 전 개체에서 사용되어 왔다[Chen et al., Hum. Gene Ther. 5:595 (1994); Hassanzadeh et al., FEBS Lett. 437:75 (1998)]. 유도성 발현 벡터는 망막 및/또는 RPE 세포내에서 발현되는 LDL 수용체 유전자 패밀리에 속하는 단백질 수용체와 특이적으로 반응하는 인트라바디로 작제될 수 있다. 이러한 벡터는 숙주 세포와 모델 개체 내로 도입될 수 있다.

한 구체예에서, 작용제는 "인공" 항체, 예를 들어, 시험관내에서 생산되고 선별된 항체와 항체 단편이다. 몇몇 구체예에서, 이러한 항체는 상기한 것과 같은, 박테리오파아지 또는 다른 바이러스 입자의 표면에 현출된다. 다른 구체예들에서, 인공 항체는 M13 유전자 III 단백질을 포함하나, 이로만 국한되지 않는, 바이러스 또는 박테리오파지 구조 단백질과의 융합 단백질로 제시된다. 그러한 인공 항체를 생산하기 위한 방법은 당업계에 널리 알려져 있다(미국 특허 제 5,516,637호; 5,223,409호; 5,658,727호; 5,667,988호; 5,498,538호; 5,403,484호; 5,571,698호; 및 5,625,033호). 인공 항체, 예를 들어, 선별된 항원에 대한 파지 결합에 기초하여, 선별된 인공 항체는, 예를 들어, US 5,116,964호 또는 WO 99/61630호에 기술된 것처럼, 치료제로 사용하기 위하여 면역글로불린의 Fc 단편에 융합될 수 있다. 항체는 직접 또는 간접적으로 세포의 생물학적 활성을 조절하는데 사용될 수 있다. 대상 항체는, 일차적인 상호작용을 갖는, 표적 세포의 활성을 조절하거나, 부수적 효과를 발휘함으로써, 즉, 일차 표적이 다른 세포와 상호작용하거나 의사소통할 때, 다른 세포의 활성을 조절할 수 있다. 본원에 제공된 항체는 포유동물, 특히 인간에서 치료용 및/또는 진단용으로 투여될 수 있다.

한 구체예에서, 작용제는 항체이다. 또 다른 구체예에서, 항체는 인간 또는 인간화 항체이다. 또 다른 구체예에서, 항체는 폴리클론 항체, 단일클론 항체, 단일쇄 항체, 작동제 항체, 길항제 항체, 중화 항체, 또는 이의 활성 단편이다. 한 구체예에서, 항체의 활성 단편은 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 단편이다. 한 구체예에서, 활성 단편은 항원-결합 단편, Fc 단편, cdr 단편, VH 단편, VL 단편 또는 골격부 단편이다. 한 구체예에서, 항체는 면역글로불린의 가변 영역, 면역글로불린의 불변 영역, 면역글로불린의 중쇄, 면역글로불린의 경쇄 및 면역글로불린의 항원-결합 영역 중에서 선택된 하나 이상의 도메인을 포함한다. 한 구체예에서, 항체는 면역글로불린의 경쇄를 하나 이상 포함한다.

펩티드 앱타머

망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성을 조절하기 위한 또 다른 적합한 작용제는 펩티드 앱타머이다. 펩티드 앱타머는 단백질 기 능의 우성 억제자로서 역할하는 펩티드 또는 작은 폴리펩티드이다. 펩티드 앱타머는 특이적으로 표적 단백질에 결합하여, 이들의 기능적 활성을 차단한다[Kolonin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14266 (1998)]. 펩티드 앱타머의 고도로 선택적 특성으로 인해, 이들은 특정 단백질을 표적으로 삼기 위해, 또한 해당 단백질의 특정 기능(예를 들어, 신호전달 기능)을 표적으로 삼기 위해 사용될 수 있다. 더 나아가, 펩티드 앱타머는 일시적, 공간적 또는 유도성 방식으로 발현을 조절하는 프로모터의 사용에 의해 조절되는 방식으로 발현될 수 있다. 펩티드 앱타머는 우성적으로 작동하고, 그에 따라, 이들은 기능상실(loss-of-function) 돌연변이체가 활용되지 못하는 단백질을 분석하는데 사용될 수 있다.

표적 단백질에 대하여 고 친화력 및 특이성을 동반하면서 결합하는 펩티드 앱타머는 당업계에 공지된 다양한 기술에 의해 동정될 수 있다. 펩티드 앱타머는 효모 투-하이브리드(two-hybrid) 스크린에 의해 무작위 펩티드 라이브러리로부터 동정될 수 있다[Xu et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:12473 (1997)]. 이들은 또한 파지 라이브러리[Hoogenboom et al., Immunotechnology 4:1 (1998)] 또는 화학적으로 생성된 펩티드/라이브러리로부터 동정될 수 있다.

LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 대한 내생성 결합 리간드

상기한 것과 같은, 용어 "내생성 결합 리간드"는 메갈린과 메갈린-유사 단백질을 포함하는, LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 결합하는 주요(primary) 내생성 물질을 비롯한, 상기 주요 결합 물질이 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 결합할 때, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 주요 결합 리간드에 결합 하는 부수적(secondary) 내생성 물질을 포함한다는 의미이다. 당업계의 통상의 기술자는 본원의 기재에 기초하여 검출 및 측정된 특정 내생성 결합 리간드가, 망막 및/또는 RPE 세포내로 흡수되는 경우, 예를 들어, 상기 리간드를 용이하게 검출될 수 있게 하는 활성을 포함하는, 다수의 인자들에 좌우될 것임을 이해할 것이다. 다양한 메갈린 결합 리간드가 존재하는 것으로 공지되어 있는데, 예를 들어, 상기에 나열된 것들을 포함한다(또한 문헌[Chistensen, I. L. and Willnow, T. E. J. Am. Soc. Nephrol. 10, 2224-2236, 1999]을 참조하라). 본원에 제시된 것과 같은 바람직한 내생성 메갈린 결합 리간드는 레티노이드 결합 단백질과 광수용체간 레티노이드 결합 단백질을 포함한다. 추가의 내생성 메갈린 결합 리간드는 하기 문헌들에 소개된 방법들 중 하나 이상의 방법에 의해 확인될 수 있다: Christensen et al. (1992), Chistensen, I. L. and Willnow, T. E. (1999) J. Am. Soc. Nephrol. 10, 2224-2236; Cui, S. et al. (1996) Am. J. Physiol. 271, F900-F907; Gburek, J. et al. (2002) J. Am. Soc. Nephrol. 13, 423-430; Hilpert et al. (1999), J. Biol. Chem. 274, 5620-5625; Kanalas, J. J. and Makker, S. P. (1991) J. Biol. Chem. 266, 10825-10829; Kounnas, M. Z. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267, 21162-21166; Kounnas, M. Z. et al. (1993) J. Biol. Chem. 268, 14176-14181; Kounnas, M. Z. et al (1995) J. Biol. Chem. 270, 13070-13075; Moestrup, S. K. et al. (1993) J. Biol. Chem. 268, 16564-16570; Moestrup, S. K. et al. (1995) J. Clin. Invest. 96, 1404-1413; Moestrup, S. K. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 8612-8617; Moestrup, S. K. et al. (1998) J. Clin. Invest. 102, 902-909; Nykjaer, A. et al. (1999) Cell, 96, 507-515; Orlando, R. A. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6698-6702; Orlando, R. A. et al. (1998) J. Am. Soc. Nephrol. 9, 1759-1766; Stefansson, S. et al. (1995-A) J. Cell Sci. 108, 2361-2368; Stefansson, S. et al. (1995-B) J. Biol. Chem. 270, 19417-19421; Wilnow, T. E. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267, 26172-26180; Wilnow, T. E. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 8460-8464; 및 Zheng, G. et al. (1998) Endocrinology 139, 1462-1465.

본원의 기재에 기초하여 당업계의 통상의 기술자는 내생성 메갈린 결합 리간드의 검출 및 정량 방법이 다수의 가용한 분석 도구들 중 임의의 것을 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 그러한 방법은 HPLC, NMR의 사용을 포함하거나, 당업계에 공지된 표준 면역검정 방법을 사용할 것이다. 그러한 면역검정은 RIA, ELISA, "샌드위치" 면역검정, 면역방사계수(immunoradiometric) 검정, 겔 확산 침전 반응, 면역확산 검정, 인 시츄(in situ) 면역검정(예를 들어, 콜로이드성 금, 효소 레이블 또는 방사능동위원소 레이블을 이용), 웨스턴 블롯, 2-차원 겔 분석, 침전 반응, 면역형광 검정, 단백질 A 검정, 및 면역전기영동 검정과 같은 기술을 이용한 경쟁적 및 비경쟁정 검정 시스템을 포함하나, 이로만 국한되는 것은 아니다.

리간드 결합 영역의 확인

LDL 수용체 유전자 패밀리 내부의 보체-타입 리간드-결합 반복부는 리간드의 인지에 관여한다[Herz et al., LRP:a multifunctional scanvenger and signaling receptor. The Journal of Clinical Investigation, vol 108, no. 6, pp779-784, 2001). 본원에서 확인된 LDL 수용체 유전자 패밀리의 인지 특성은 당업계의 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다. 간략히, 그리고 단지 예시의 일환으로, 다수의 리간드 결합에 관여하는 영역은 다음 방법을 이용하여 얻어질 수 있다. 확인된 수용체의 "미니수용체"가 리간드 결합 반복부의 다양한 클러스터를 수용체의 막 스패닝(spanning) 및 세포질 도메인에 융합시키고 세포내에서 발현 후 리간드의 세포내 내부화를 조절할 수 있는 이들의 활성을 측정함으로써 제조될 수 있다[Willnow et al., Molecular dissection of ligand binding sites on the low density lipoprotein receptor related protein. J. Biol. Chem. 269:15827-15832, 1994). 또 다른 접근법은 시험관내에서 다양한 리간드에 결합할 수 있는 활성에 대하여 수용체 내에서 각각의 클러스터를 대표하는 가용성 재조합 수용체 단편을 시험하는 단계를 포함할 수 있다[Springer, TA. An extracellular beta-propellar module predicted in lipoprotein and scavenger receptors, tyrosine kinases, epidermal growth factor precursor, and extra cellular matrix components. J. Mol. Biol. 283:837-862, 1998].

고 친화력을 지니는 다수의 구조적으로 독특한 리간드의 결합은 수용체내 다수의 리간드-결합-형 반복부의 존재로부터, 각각의 반복부에 대한 특유한 윤곽 표면과 전하 분배로부터, 리간드와 수용체 둘 간의 다수의 상호작용으로부터 생겨난다. 몇몇 리간드는 순차적인 방식으로 상이한 반복부를 인지할 수 있으며, 한편 다른 것들은 별개의 클러러스로부터 반복부를 인지하는 것으로 보인다[Herz et al., LRP:a multifunctional scanvenger and signaling receptors. The Journal of Clinical Investigation, vol 108, no. 6, pp779-784, 2001).

검정

작용제가 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 결합하고/하거나 상기 구성원의 활성을 조절하는지 여부를 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 당해 기술분야에 소개된 검정법은 하기 문헌들에 개략적으로 설명되어 있는 방법들을 포함한다: US 2003/0202974호, WO 06/037335호, WO 03/080103호, US 2004/0198705호, WO 04/084876호, US 2006/0029609호, US 2005/0026823호, US 2005/0100986호, US 2005/0089932호, US 2005/0042227호, US 2004/0204357호, US 2004/0198705호, US 2004/0049010호, US 2003/0202974호, US 2003/0181660호, US 2003/0082640호, US 2003/0157561호, US 2003/0077672호, Chistensen, et al. (1999) J. Am. Soc. Nephrol. 10, 2224-2236; Cui, S. et al. (1996) Am. J. Physiol. 271, F900-F907; Gburek, J. et al. (2002) J. Am. Soc. Nephrol. 13, 423-430; Hilpert et al. (1999), J. Biol. Chem. 274, 5620-5625; Kanalas, J. J. and Makker, S. P. (1991) J. Biol. Chem. 266, 10825-10829; Kounnas, M. Z. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267, 21162-21166; Kounnas, M. Z. et al. (1993) J. Biol. Chem. 268, 14176-14181; Kounnas, M. Z. et al (1995) J. Biol. Chem. 270, 13070-13075; Moestrup, S. K. et al. (1993) J. Biol. Chem. 268, 16564-16570; Moestrup, S. K. et al. (1995) J. Clin. Invest. 96, 1404-1413; Moestrup, S. K. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 8612-8617; Moestrup, S. K. et al. (1998) J. Clin. Invest. 102, 902-909; Nykjaer, A. et al. (1999) Cell 96, 507-515; Orlando, R. A. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6698-6702; Orlando, R. A. et al. (1998) J. Am. Soc. Nephrol. 9, 1759-1766; Stefansson, S. et al. (1995-A) J. Cell Sci. 108, 2361-2368; Stefansson, S. et al. (1995-B) J. Biol. Chem. 270, 19417-19421; Wilnow, T. E. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267, 26172-26180; Wilnow, T. E. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 8460-8464; and Zheng, G. et al. (1998) Endocrinology 139, 1462-1465.

망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리의 구성원과 상호작용하는 (즉, 상기 구성원과 결합하고/하거나 이의 활성을 조절하는) 작용제의 식별은 임의의 공지된 방법을 이용하여 검출될 수 있다. 적당한 방법은 다음 방법을 포함한다: 효모 투-하이브리드 시스템[Zhu et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 94:13,063 (1997); Fields et al., Nature 340:245 (1989); U.S. Pat. No. 5,283,173; Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9578 (1991)]; 포유동물 세포 투-하이브리드 방법; 형광 공명 에너지 전이(FRET) 검정; 생물발광 공명 에너지 전이(BRET) 검정; 형광 켄칭 검정; 형광 이방성(anisotropy) 검정[Jameson et al., Methods Enzymol. 246:283 (1995)]; 면역학 검정; 및 고정화된 단백질에 대한 검출가능하게 표지된 단백질의 결합을 포함하는 검정.

생물학적 샘플 내의 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 존재 및 상기 구성원의 생물학적 활성을 검출하는 방법은 공지되어 있다. 사용된 검정법은 LDL 수용 체 유전자 패밀리의 특정 구성원의 생물학적 활성에 적절할 것이다. 따라서, 예를 들어, 생물학적 활성이 제 2 거대분자에 대한 결합인 경우, 검정법은, 널리 알려진 검정법을 이용하여, 적절하게, 단백질-단백질 결합, 단백질-DNA 결합, 단백질-탄수화물 결합 또는 단백질-지질 결합을 검출한다. 생물학적 활성이 신호 전달(예를 들어, 세포 외부에서 세포 내부로의 신호의 전송) 또는 운송인 경우, 세포내 칼슘 이온 농도의 측정, 막 전도도 변화의 측정, 또는 세포내 칼륨 이온 농도의 측정과 같은, 적절한 검정법이 사용된다.

본원에서 특이적 항체를 이용하여 생물학적 샘플 내 LDL 수용체 유전자 패밀리에 속하는 정상 또는 비정상 레티노이드 결합 단백질 수용체의 존재 또는 상기 수용체의 수준을 검출하기 위한 방법이 제공된다. 이 방법은 일반적으로 샘플과 특이적 항체를 접촉시키는 단계 및 항체와 샘플의 분자 간의 결합을 검출하는 단계를 포함한다. 적당한 대조군과 비교할 때, 특이적 항체 결합은 관심있는 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원이 샘플 내에 존재한다는 지표가 된다.

특이적 항체-항원 상호작용을 검출하기 위한 다양한 방법들이 당업계에 공지되어 있는데, 예를 들어, 표준 면역조직학 방법, 면역침전법, 효소 면역검정, 및 방사성 면역검정이 있다. 간략하게, 항체는 세포 샘플에 첨가되고, 에피토프에 대한 결합이 가능하게 되는 충분한 시간, 대개 약 10분 이상 동안 인큐베이션된다. 항체는 방사성동위원소, 효소, 형광물질, 화학발광물질, 또는 직접 검출을 위한 다는 라벨로 라벨링될 수 있다. 달리, 특이적 결합 쌍이 사용될 수 있는데, 이에는, 예를 들어, 상기한 것과 같은, 검출가능하게 라벨링된 제 2 단계 항체 또는 시약이 포함된다. 그러한 시약 및 이들의 사용 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.

LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 생물학적 활성을 조절하는 작용제를 확인하는 방법은 공지되어 있다. 이 방법은 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원과 같은, 대상 폴리펩티드를 함유한 샘플과 시험 작용제를 접촉시키는 단계, 및 상기 시험 작용제 존재하에 LDL 수용체 유전자 패밀리의 대상 구성원의 생물학적 활성을 분석하는 단계를 포함한다. 적당한 대조군(예를 들어, 시험 작용제 부재하에 LDL 수용체 유전자 패밀리의 대상 구성원을 포함하는 샘플)에서의 활성과 비교하여 검정된 생물학적 활성에서의 증가 또는 감소가 해당 물질이 대상 폴리펩티드의 생물학적 활성을 조절한다는 지표가 된다. 성분들의 혼합물이 필수적인 상호작용을 제공하는 임의의 순서로 첨가된다.

작용제, 특히 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 핵산 발현 수준을 조절하는 생물학적으로 활성있는 작용제를 식별하기 위한 방법이 공지되어 있다. 이 방법은 하기 단계를 포함한다: 시험되는 후보 작용제와 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 엔코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 혼합(combining)하는 단계, 및 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 발현에 대한 상기 작용제의 효과를 결정하는 단계.

망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 생물학적 활성을 감소시키는 작용제는 이 분자의 생물학적 활성과 연관된 병태 또는 장애를 치료하는데 있어서 용도가 발견될 수 있다. 예를 들어, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 발현의 조절은 안구 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 발현 수준의 감소가 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 정상적으로 발현시키는 망막과 RPE 세포내로 흡수된 레티놀, 레티놀-RBP, 및/또는 레티놀-RBP-TTR의 양을 감소시킬 수 있다. 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 발현 수준의 증가가 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 정상적으로 발현시키는 망막과 RPE 세포내로 흡수되는 치료 약물(즉, 요망되지 않는 안구-독성 부작용을 일으키는 약물)의 양을 감소시킬 수 있다. 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 발현 수준의 감소가 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 정상적으로 발현시키는 망막과 RPE 세포내로 흡수되는, 예를 들어, 아미노글리코시드와 같은, 항생제의 양을 감소시킬 수 있다.

달리, 몇몇 구체예들은 생물학적 활성을 증가시키는 작용제를 검출할 것이다.

한 구체예에서, RPE 세포는 본원에서 제시된 RBP-레티놀 및/또는 IRBP-레티놀 및 작용제로 처리된다. 소정 시간 경과 후, 세포는 분리되고 레티놀 함량(RBP와 IRBP 함량을 포함함)에 대해 분석된다. 대조군과 비교할 때(본원에서 제시된 작용제 없이 RBP-레티놀 및/또는 IRBP-레티놀로 처리된 RPE 세포) RPE 세포 내부에서 발견되는 레티놀의 양은 수용체 매개 활성(즉, RBP-레티놀 또는 IRBP-레티놀 수용체-매개 트랜스시토시스의 억제)에 관한 상기 작용제의 효과에 대한 지표를 제공할 것이다.

또 다른 구체예에서, RPE 세포는 예를 들어, 본원에서 제시된 항생 약물과 작용제와 같은, 치료 약물로 처치된다. 치료 약물은 예를 들어, 망막 및/또는 RPE 세포와 같은, 안구 조직 내에 독성 효과에 기여할 것이다. 소정 시간 경과 후, 세포는 분리되고 치료 약물 함량에 대해 분석된다. 대조군과 비교할 때(본원에서 제시된 작용제 없이, 치료 약물로 처리된 망막 및/또는 RPE 세포) 망막 및/또는 RPE 세포 내부에서 발견되는 치료 약물의 양은 수용체 매개 활성(즉, 치료 약물 수용체-매개 트랜스시토시스의 억제)에 관한 상기 작용제의 효과에 대한 지표를 제공할 것이다.

망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 생물학적 활성을 증가시키는 작용제는 상기 생물학적 활성에 있어서 결함과 연관된 안구 질환 치료시에 용도가 발견될 수 있다. 예를 들어, LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 생물학적 활성의 증가는 망막 및/또는 RPE 세포내 트랜스시토시스의 증가를 가져오며, 그에 따라 상기 세포내 레티노이드 농도를 증가시키거나 상기 세포내 레티노이드 및/또는 독성 화학물질의 축적을 막는다.

다양한 상이한 후보 작용제가 상기 방법에 의해 스크리닝될 수 있다. 후보 작용제는 상기한 것과 같은, 수많은 부류의 화학물질을 포함한다.

후보 작용제는 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리를 포함하는 광범위하게 다양한 공급원으로부터 획득된다. 수많은 수단이, 무작위화된(randomized) 올리고뉴클레오티드와 올리고펩티드의 발현을 포함하는, 폭넓게 다양한 유기 화합물과 생분자의 무작위 합성 및 유도 합성에 이용될 수 있다. 예를 들어, 무작위 펩티드 라이브러리는 효모 투-하이브리드 스크린[Xu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12473 (1997)], 파지 라이브러리[Hoogenboom et al., Immunotechnology 4:1 (1998)], 또는 화학적으로 생성된 라이브러리에 의해 획득된다.

달리, 박테리아, 진균, 식물 및 동물 추출물의 형태의 천연 화합물 라이브러리가 이용가능하거나 용이하게 생성되는데, 이에는 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 또는 엔코딩 폴리뉴클레오티드로 동물을 면역화시, 생산된 항체가 포함된다. 추가로, 천연 또는 합성적으로 생산된 라이브러리와 화합물이 관용적인 화학적, 물리적 및 생화학적 수단을 통해 용이하게 변형되고, 조합 라이브러리를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 더 나아가, 공지의 약물 작용제가 구조적 유사체를 생산하기 위해, 직접적이거나 무작위적인 화학적 변형, 예컨대, 아실화, 알킬화, 에스테르화, 및 아미드화 등을 겪게 될 수 있다.

한 구체예에서, 작용제가 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성을 조절하는지 여부를 평가하기 위한 방법은 동물 모델을 이용하여 수행된다.

약제학적 조성물

또 다른 양상은, 예를 들어, 메갈린 조절제와 같이, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성을 조절하는 작용제 및 및 약제학적으로 허용되는 희석제, 부형제, 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.

또 다른 양상은 메갈린 조절제 및 약제학적으로 허용되는 희석제, 부형제, 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.

용어 "약제학적 조성물"은 예를 들어, 메갈린 조절제와 같이, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성을 조절하는 작용제와 다른 화 학적 성분들, 예컨대, 담체, 안정화제, 희석제, 분산제, 현탁제, 농유제(thickening agents), 및/또는 부형제의 혼합물을 의미한다. 약제학적 조성물은 개체에 대한 화합물의 투여를 용이하게 한다. 화합물을 투여하는 다수의 기술이 당업계에 존재하며, 하기 투여를 포함하나, 이로만 국한되는 것은 아니다: 정맥내, 경구, 에어로졸, 비경구, 안구, 폐 및 국소 투여.

용어 "담체"는 세포 또는 조직 내로 화합물의 인입을 용이하게 하는 비교적 무독성 화학적 화합물 또는 작용제를 의미한다.

용어 "희석제"는 전달에 앞서 관심있는 화합물을 희석하기 위해 사용되는 화학적 화합물을 의미한다. 희석제는 또한 이들이 더 안정한 환경을 제공할 수 있기 때문에 화합물을 안정화시키는데 사용될 수 있다. (pH 조절 또는 유지를 제공할 수도 있는) 완충된 용액에 용해된 염은 당업계에서 희석제로 활용되는데, 이에는 인산 완충 염수 용액이 포함되나, 이로만 국한되는 것은 아니다.

용어 "생리학적으로 허용되는"은 화합물의 생물학적 활성 또는 특성을 무력화시키지 아니하며, 무독성인, 담체 또는 희석제와 같은, 물질을 의미한다.

용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 이것이 투여되는 개체에 유의한 자극을 유발시키지 아니하며 화합물의 생물학적 활성과 특성이 무효화되지 아니하는 화합물의 제형을 의미한다. 약제학적으로 허용되는 염은, 예를 들어, 메갈린 조절제와 같이, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 조절하는 작용제와, 염화수소산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 살리실산 등과 같은 산과 반응시킴으로써 획득될 수 있다. 약제학 적으로 허용되는 염은, 예를 들어, 메갈린 조절제와 같이, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 조절하는 작용제와 염, 예컨대 암모늄염, 알칼리 금속 염(예컨대, 나트륨 또는 칼륨염), 알칼리 토금속 염(예컨대, 칼슘 또는 마그네슘염), 유기 염기(예컨대, 디시클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(히드록시메틸)메틸아민)의 염, 및 아미노산(예컨대, 아르기닌, 리신 등)의 염을 형성할 수 있는 염기와 반응시킴으로써, 또는 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 획득될 수 있다.

본원에 개시된 화합물의 "대사산물"은 화합물이 대사될 때 형성되는 화합물의 유도체이다. 용어 "활성 대사산물"은 화합물이 대사될 때 형성되는 화합물의 생물학적으로 활성있는 유도체이다. 용어 "대사된"은 특정 물질이 개체에 의해 변화되는 과정의 총계(가수분해 반응 및 효소에 의해 촉매되는 반응을 포함하나, 이로만 국한되지 아니함)이다. 따라서, 효소는 화합물에 특이적인 구조적 변형을 일으킬 수 있다. 예를 들어, 시토크롬 P450는 다양한 산화 반응과 환원 반응을 촉매하며, 한편 우리딘 디포스페이트 글루쿠로닐트랜스퍼라아제는 활성화된 글루쿠론산 분자의 방향족 알코올, 지방족 알코올, 카르복시산, 아민 및 유리 설프히드릴 기로의 전이를 촉매한다. 대사에 관한 추가 정보는 문헌[The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Edition, McGraw-Hill (1996)]으로부터 얻을 수 있다.

본원에 소개된 화합물의 대사산물은 숙주에게 화합물을 투여하고 상기 숙주로부터의 조직 샘플을 분석하거나, 시험관내에서 간세포와 함께 화합물을 인큐베이션하고 그 결과 얻어진 화합물을 분석함으로써 식별될 수 있다. 상기 두 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.

"전구약물"은 생체내에서 모 약물로 전환되는 작용제를 의미한다. 전구약물은 종종 유용한데, 일부 상황에 있어서, 이들이 모 약물보다 더 용이하게 투여될 수 있기 때문이다. 예를 들어, 이들은 경구 투여에 의해 생체이용가능할 수 있으나, 모 약물은 그렇지 못하다. 전구약물은 또한 모 약물을 능가하는 약제학적 조성물로 개선된 용해도를 지닐 수 있다. 비제한적인, 전구약물의 일예는 수 용해도가 이동도에 불리한 세포막을 가로지르는 운송을 용이하게 하기 위해 에스테르("전구약물")로 투여되나, 이후 수 용해도가 이로운 세포 내부로 일단 진입되면, 카르복시산으로 대사적으로 가수분해되는, 예를 들어, 메갈린 조절제와 같이, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 조절하는 작용제일 수 있다. 전구약물의 추가 일예는 산기(acid group)에 결합된 짧은 펩티드(폴리아미노산)일 수 있는데, 여기서 펩티드는 대사되어 활성 부분을 드러내게 된다.

본원에 기재된 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성을 조절하는 작용제는 그 자체로 인간 환자에게 투여되거나, 약제학적 조성물(여기서, 이들은, 병용 요법에서와 같이, 다른 활성 성분, 또는 적당한 담체(들) 또는 부형제(들)과 혼합됨)로 투여될 수 있다. 본원의 화합물의 제형화 기술 및 투여를 위한 기술은 문헌["Remington: The Science and Practice of Pharmacy," 20th ed. (2000)]에서 찾아 볼 수 있다.

투여 경로

적합한 투여 경로는, 예를 들어, 경구, 직장, 경점막(transmucosal), 경피, 폐, 안구 또는 장내 투여; 근내, 피하, 정맥내, 연수내(intramedullary) 주사를 비롯한, 척수내(intrathecal), 직접 뇌실내(intraventricular), 복강내(intraperitoneal), 비강내, 또는 안구내 주사를 포함하는, 비경구 전달을 포함할 수 있다.

달리, 예를 들어, 종종 데포(depot) 또는 지연 방출 제형으로, 장기내로 직접적인 화합물의 주입을 통하여, 전신 투여 방식보다는 국소 투여 방식으로 화합물을 투여할 수 있다. 더욱이, 예를 들어, 장기 특이적 항체로 코팅된 리포좀으로, 표적으로 삼은 약물 전단 시스템 내로 약물을 투여할 수 있다. 리포좀은 해당 장기에 타깃화될 것이고 상기 장기에 의해 선택적으로 흡수될 것이다. 또한, 약물은 급속 방출 제형의 형태로, 연장 방출 제형의 형태로, 또는 즉각 방출 제형의 형태로 제공될 수 있다.

조성물/제형

망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 조절하는 작용제, 예를 들어, 메갈린 조절제를 포함하는 약제학적 조성물은 그 자체가 공지된 방식에 의해, 예를 들어, 통상의 혼합, 용해, 과립화, 당의정(dragee) 제조, 가루화(levigating), 유화, 캡슐화(encapsulating), 엔트랩핑(entrapping), 또는 압축 공정을 이용하여 제조될 수 있다.

약제학적 조성물은 약제학적으로 사용될 수 있는 제조물로 활성 화합물의 가공을 용이하게 하는 부형제와 보조제(auxiliaries)를 포함하는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체를 이용하여 퉁상의 방식으로 제형화될 수 있다. 적절한 제 형은 선택된 투여 경로에 의해 좌우된다. 예를 들어, 상기 문헌[Remington’s Pharmaceutical Sciences] 내의, 널리 공지된 기술, 담체, 및 부형제 중 임의의 것이 적당하게 그리고 당업계에 이해된 대로 사용될 수 있다.

예를 들어, 메갈린 조절제와 같이, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 조절하는 작용제는 눈으로의 모든 형태의 국소 전달을 포함하는, 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 또한, 예를 들어, 메갈린 조절제와 같이, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 조절하는 작용제는 전신적으로, 예컨대, 경구적으로 또는 정맥내로 투여될 수 있다. 예를 들어, 메갈린 조절제와 같이, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 조절하는 작용제는 눈에 국소적으로 투여될 수 있으며 다양한 국소 투여가능 안구 조성물, 예컨대, 용액, 현탁액, 겔 또는 연고로 제형화될 수 있다. 따라서, "안구 투여"는, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 안내 주입, 망막하 주입, 유리체내(intravitreal) 주입, 안와(periocular) 투여, 결막하(subconjuctival) 주입, 구후(retrobulbar) 주입, 앞방내(intracameral) 주입(전방(anterior chamber) 또는 유리체방내로의 주입 포함), 테논하(sub-Tenon) 주입 또는 이식, 안구 용액, 안구 현탁액, 안구 연고, 안내 이식 및 안내 삽입물(inserts), 안구내(intraocular) 용액, 이온토포레시스의 사용, 외과적 자극 용액내 통합(incorporation) 및 팩(단지 예시의 일환으로, 운개(fornix)에 삽입된 포화 면 가제(saturated cotton pledget))을 포함한다.

눈에 대한 조성물의 투여는 일반적으로 투여된 작용제의 적어도 일부가 통과 하는 각막에 작용제의 직접적인 접촉을 초래한다. 종종, 조성물은 눈에서 약 2 내지 약 24 시간, 더 전형적으로는 약 4 내지 약 24 시간, 가장 전형적으로는 약 6 내지 약 24시간의 유효 체류 시간을 갖는다.

예를 들어, 메갈린 조절제와 같이, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 조절하는 작용제를 포함하는 조성물은 예시적으로 액체의 형태를 취할 수 있는데, 여기서 상기 작용제는 용액으로, 현탁액으로 또는 상기 둘 모두로 존재한다. 전형적으로 조성물이 용액 또는 현탁액으로 투여될 때, 작용제의 첫번째 분획(portion)은 액체 기질 내 현탁액 중의, 용액으로 존재하고 작용제의 두번째 분획은 미립자(particulate) 형태로 존재한다. 몇몇 구체예에서, 액체 조성물은 겔 제형을 포함할 수 있다. 다른 구체예들에서, 액체 조성물은 수성이다. 달리, 조성물은 연고 형태를 취할 수 있다.

유용한 조성물은 점안액(eye drops)의 형태로 존재할 수 있는, 수성 용액, 현탁액 또는 용액/현탁액일 수 있다. 바람직한 투여량(dosage)은 공지된 다수의 점액을 통해 눈으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 25㎕의 점액 부피의 경우, 1 내지 6 방울의 투여가 25 내지 150㎕의 조성물을 전달할 것이다. 수성 조성물은 전형적으로 약 0.01 w/v(질량/부피)% 내지 약 50 w/v%, 더 전형적으로는 약 0.1 w/v% 내지 약 20 w/v%, 여전히 더 전형적으로는 약 0.2% 내지 약 10 w/v%, 및 가장 전형적으로는 약 0.5 w/v% 내지 약 5 w/v%의, 예를 들어, 메갈린 조절제와 같은, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성을 조절하는 작용제를 함유한다.

전형적으로, 수성 조성물은 안과학적으로 허용되는 pH와 삼투압을 지닌다. 제형, 조성물 또는 성분과 관련하여 "안과학적으로 허용되는"은 전형적으로는 치료되는 눈 또는 이의 기능에, 또는 치료되는 피검체의 전반적인 건강에 지속적인 해로운 효과를 미치지 아니한다는 것을 의미한다. 일시적 효과, 예컨대, 사소한 자극 또는 "찌르른 듯이 아픈" 감각은 작용제의 국소 안과 투여에 일반적이며 "안과학적으로 허용되는" 문제의 제형, 조성물 또는 성분에 수반된다.

유용한 수성 현탁액은 또한 현탁제로서 하나 이상의 폴리머를 함유할 수 있다. 유용한 폴리머는 수 용해성 폴리머, 예컨대 셀룰로오스성(cellulosic) 폴리머, 예를 들어, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스, 및 수 불용성 폴리머, 예컨대 가교된 카르복시-함유 폴리머를 포함한다. 유용한 조성물은 또한, 예를 들어, 카르복시메틸셀룰로오스, 카보머(carbomer)(아크릴산 폴리머), 폴리(메틸메타크릴레이트), 폴리아크릴아미드, 폴리카보필, 아크릴산/부틸 아크릴레이트 공중합체, 알긴산 나트륨 및 덱스트란으로부터 선택된, 안과학적으로 허용되는 점착(mucoadhesive) 폴리머를 포함한다.

유용한 조성물은 또한 예를 들어, 예를 들어, 메갈린 조절제와 같은, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 조절하는 작용제의 용해도에 도움이 되는 안과학적으로 허용되는 가용화제를 포함한다. 용어 "가용화제"는 일반적으로 작용제의 미셀(micellar) 용액 또는 참용액(true solution)의 형성을 초래하는 작용제를 포함한다. 특정한 안과학적으로 허용되는 비이온성 계면활성제, 예를 들어, 폴리소르베이트 80이 가용화제로 사용될 수 있고, 안과학적으로 허 용되는 글리콜로서, 폴리글리콜, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 400, 및 글리콜 에테르가 사용될 수 있다.

유용한 조성물은 또한 아세트산, 시트르산, 락트산, 인산 및 염화수소산과 같은 산; 수산화나트륨, 인산나트륨, 붕산나트륨, 시트르산나트륨, 아세트산나트륨 및 트리스-히드록시메틸아미노메탄과 같은 염기; 및 시트레이트/덱스트로즈, 중탄산나트륨 및 염화암모늄과 같은 완충액을 포함하는, 하나 이상의 안과학적으로 허용되는 pH 조절제 또는 완충제를 포함할 수 있다. 그러한 산, 염기 및 완충제는 안과학적으로 허용되는 범위로 조성물의 pH를 유지하기 위해 필요한 양으로 포함된다.

유용한 조성물은 안과학적으로 허용되는 범위로 조성물의 삼투압을 생성시키는데 필요한 양으로 하나 이상의 안과학적으로 허용되는 염을 포함할 수도 있다. 그러한 염은 나트륨, 칼륨 또는 암모늄 양이온 및 클로라이드, 시트레이트, 아스코르베이트, 보레이트, 포스페이트, 비카보네이트, 설페이트, 티오설페이트 또는 비설피트 음이온을 지니는 염들을 포함한다; 적당한 염은 염화나트륨, 염화칼륨, 나트륨 티오설페이트, 나트륨 비설피트 및 암모늄 설페이트를 포함한다.

다른 유용한 조성물은 미생물 활성을 억제시키는 하나 이상의 안과학적으로 허용되는 방부제를 포함할 수도 있다. 적당한 방부제는 머펜(merfen)과 티오머살(thiomersal)과 같은 수은-함유 물질; 안정화된 이산화염소; 및 벤잘코늄 클로라이드, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드와 세틸피리디움 클로라이드와 같은 4차 암모늄 화합물을 포함한다.

여전히 다른 유용한 조성물은 물리적 안정도를 증강시키거나 다른 목적을 위해 하나 이상의 안과적으로 허용되는 계면활성제를 포함할 수 있다. 적당한 비이온성 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 지방산 글리세리드 및 식물성 오일, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌(60) 수소화된 피마자유; 및 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 및 알킬페닐 에테르, 예를 들어, 옥트옥시놀 10, 옥트옥시놀 40을 포함한다.

여전히 다른 유용한 조성물은 요망되는 경우, 화학적 안정도를 증강시키기 위한 하나 이상의 항산화제를 포함할 수 있다. 적당한 항산화제는, 단지 예시의 일환이기는 하나, 아스코브산과 소디움 메타비설피트를 포함한다.

수성 현탁 조성물은 단일 용량 재밀폐 불가능 용기 내에 포장될 수 있다. 대안으로, 다중 용량 재밀폐가능 용기가 사용될 수 있는데, 이 경우, 조성물 내에 방부제를 포함시키는 것이 전형적이다.

안구 조성물은 또한 눈과 눈꺼풀 사이 또는 결막낭(conjunctival sac) 내로 삽입될 수 있는 고체 물품의 형태를 취할 수 있는데, 상기 물품은 작용제를 방출한다. 방출은 눈물액(lacrimal fluid) 또는 직접 각막 그 자체로 되며, 이 눈물액은 각막의 표면을 적시고(bathe), 이 방출물과 상기 고체 물품이 일반적으로 친밀하게 접촉하게 된다. 그러한 방식으로 눈에 이식되기에 적합한 고체 물품은 일반적으로 주로 폴리머로 구성되며 생체 분해성 또는 생체비분해성일 수 있다.

정맥내 주입의 경우, 예를 들어, 메갈린 조절제와 같이, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 조절하는 작용제는 수성 용액, 바람직하게는 생리학적으로 융화가능한(compatible) 완충액, 예컨대, 한크(Hank) 용액, 링거 액, 또는 생리학적 염수 완충액으로 제형화될 수 있다. 경점막 투여의 경우, 장벽을 투과하기에 적절한 침투제가 제형으로 사용된다. 그러한 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 다른 비경구 주입의 경우, 적절한 제형은 수성 또는 비수성 용액일 수 있으며, 바람직하게는 생리학적으로 융화가능한 완충제 또는 부형제를 지니는 수성 또는 비수성 용액일 수 있다. 그러한 부형제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있다.

경구 투여의 경우, 예를 들어, 메갈린 조절제와 같이, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 조절하는 작용제는 활성 화합물과 당업계에 널리 알려진 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 화합시킴으로써 용이하게 제형화될 수 있다. 그러한 담체는, 치료되는 환자에 의한 경구 소화를 위해, 본원에 기술된 작용제가 정제, 분말, 환제, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 엘릭시르(elixirs), 슬러리, 현탁액 등으로 제형화될 수 있게 한다. 경구용 약제 제조물은 하나 이상의 고체 부형제를 본원에 기재된 하나 이상의 작용제와 혼합하고, 선택적으로 그 결과 얻어진 혼합물을 마쇄하고, 요망되는 경우, 정제 또는 당의정 핵을 획득하기 위해, 적당한 보조제를 첨가한 후, 상기 과립 혼합물을 가공함으로써 획득될 수 있다. 적당한 부형제는, 특히, 락토오스, 수크로스, 만니톨, 또는 소르비톨을 포함하는, 당과 같은 충전제(fillers); 예를 들어, 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 껌 트라가캔쓰(tragacanth), 메틸셀룰로오스, 미세결정성(microcrystalline) 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스와 같은, 셀룰로오스 제조물; 또는 폴리비닐피롤리돈(PVP 또는 포비돈) 또는 칼슘 포스페이트와 같은, 기타물질을 포함한다. 요망되는 경우, 가교된 크로스카멜로스(croscarmellose) 나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 아가, 또는 알긴산 또는 이의 염(예컨대, 알긴산나트륨)과 같은 붕해제가 첨가될 수 있다.

당의정 핵은 적당한 코팅과 함께 제공된다. 이러한 목적을 위해, 농축된 당 용액이 사용되는데, 선택적으로 껌 아라빅, 탈크, 폴리비닐피롤리돈, 카보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 및/또는 이산화티타늄, 라커액(lacquer solutions), 및 적당한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있다. 염료 또는 색소가 식별을 위하여 또는 활성 화합물 용량의 상이한 조합을 특색화하기 위해 정제 또는 당의정 코팅에 첨가될 수 있다.

경구적으로 사용될 수 있는 약제 제조물은 젤라틴으로 제조된 푸쉬 핏(push fit) 캡슐을 비롯한, 젤라틴과 글리세롤 또는 소르비톨과 같은, 가소제로 제조된 연질의 밀봉 캡슐을 포함한다. 푸쉬 핏 캡슐은 락토오스와 같은 충진제, 전분과 같은 결합제, 및/또는 탈크 또는 스테아르산마그네슘과 같은, 윤활제, 및 선태적으로 안정화제와 혼합하여 활성 성분을 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서, 활성 화합물은 적당한 액체, 예컨대, 지방 오일, 액체 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜에 용해되거나 현탁될 수 있다. 또한, 안정화제가 첨가될 수 있다. 모든 경구 투여용 제형은 그렇나 투여에 적합한 투여량으로 존재하여야 한다.

구강(buccal) 또는 설하 투여의 경우, 조성물은 관용적인 방식으로 제형화된 정제, 로젠지(lozenges), 또는 겔의 형태를 취할 수 있다.

예를 들어, 메갈린 조절제와 같이, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유 전자 패밀리 구성원을 조절하는 작용제의 투여를 위한 또 다른 제형은 경피 전달 장치("패치")를 이용한다. 그러한 경피 패치는 조절된 분량으로 본 발명의 화합물의 연속 또는 불연속 주입을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 약제학적 작용제의 전달을 위한 경피 패치의 제작 및 이의사용은 당업계에 널리 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 5,023,252호를 참조하라. 그러한 패치는 약제학적 작용제의 지속적이거나, 박동성(pulsatile)이거나, 요구되는 전달을 위해 구성될 수 있다. 여전히 더 나아가, 작용제의 경피 전달은 이온도입 패치 등을 이용하여 이루어질 수 있다. 경피 패치는 화합물의 조절된 전달을 제공할 수 있다. 흡수율은 속도 조절 막을 사용하거나 폴리머 매트릭스 또는 겔 내부에 화합물을 가둠으로써 늦추어 질 수 있다. 역으로, 흡수 증강제가 흡수를 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 경피 투여에 적당한 제형은 개별 패치로 제공될 수 있고 친유성 에멀젼 또는 완충된, 수성 용액, 용해되고/거나 분산된 폴리머 또는 접착제일 수 있다. 경피 패치는 눈 구석구석을 포함한, 환자의 신체의 상이한 부분 구석구석에 놓여질 수 있다.

예를 들어, 메갈린 조절제와 같이, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 조절하는 작용제의 안구내 투여에 사용될 수 있는 추가의 이온도입 장치는 옵티스 프랑스 에스.에이.(Optis France S.A.) 사에 의해 제조되고 특허등록된, 아이게이트 애플리케이터(Eyegate applicator)와 아이오메드(Iomed, Inc.)에 의해 개발된 오큐포르(Ocuphor™) 안구내 이온도입 시스템이 있다.

흡입에 의한 투여의 경우, 예를 들어, 메갈린 조절제와 같이, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 조절하는 작용제는, 적당한 추진 제, 예를 들어, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적당한 기체의 사용을 동반한, 가압된 팩 또는 네블라이저로부터 제공되는 에어로졸 스프레이 형태로 간편하게 전달된다. 가압된 에어로졸의 경우, 투여량 단위는 계량된(metered) 분량으로 전달하기 위하여 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기(insufflator)에서 사용하기 위한, 예를 들어, 젤라틴의 캡슐 및 카트리지가 화합물과 적당한 분말 기재, 예컨대 락토오스 또는 전분의 혼합 분말을 함유하여 제형화될 수 있다.

화합물은, 주사, 예를 들어, 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의해 비경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 첨가된 방부제와 함께, 단위 투여량 형, 예를 들어, 앱플 또는 다수 용량 용기로 제공될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 내의 현탁액, 용액 또는 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있으며, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다.

비경구 투여용 약제 제형은 수 용해성 형태로 활성 화합물의 수성 용액을 포함한다. 추가로, 활성 화합물의 현탁액은 적절한 유성 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적당한 친유성 용매 또는 비히클은 지방산, 예컨대, 참기름, 또는 합성 지방산 에스테르, 예컨대, 에틸 올레이트 또는 트리글리세리드, 또는 리포좀을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점성을 증가시키는 물질, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨, 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 선택적으로, 현탁액은 또한 화합물의 용해도를 증가시켜 고도로 농축된 용액의 제조를 가능케 하는 적당한 안정화제 또는 작용제를 함유할 수 있다.

대안적으로, 활성 성분은 사용하기 전에, 적당한 비히클, 예를 들어, 발열인자가 없는 멸균수를 이용하여 구성되는 분말 형태로 존재할 수 있다.

화합물은 또한 예를 들어, 코코아 버터 또는 기타 글리세리드와 같은 통상의 좌약 기재를 포함하는, 직장 조성물, 예컨대, 직장 겔, 직장 기포, 직장 에어로졸, 좌약 또는 체류 관장제(retention enemas)로 제형화될 수 있다. 화합물은 또한 질 또는 요도 좌제(부지(bougies)), 약제담은 탐폰(medicated tampons), 및 질 정제를 포함하는, 질 또는 요도 조성물로 제형화될 수 있다.

앞서 기술한 제형 이외에, 화합물은 데포 제조물로서 제형화될 수도 있다. 그러한 장기 지속형 제형은 이식으로(예를 들어, 피하로 또는 근내로) 또는 근내 주사로 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 화합물은 적당한 폴리머 또는 소수성 물질(예를 들어, 하용가능한 오일 중의 에멀젼으로) 또는 이온 교환 수지와 함께, 또는 드물게 용해되는 유도체, 예를 들어, 드물게 용해되는 염으로 제형화될 수 있다.

주사가능한 데포 형태는 생체분해가능한 폴리머로 예를 들어, 메갈린 조절제와 같은, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 조절하는 작용제의 마이크로캡슐화된 매트릭스(또한 마이크로캡슐 매트릭스로도 공지되어 있음)를 형성시킴으로써 제조될 수 있다. 약물 대 폴리머의 비율과 사용된 특정 폴리머의 특성에 따라서, 약물 방출 속도가 조절될 수 있다. 데포 주사가능 제형은 또한, 리포좀 또는 마이크로에멀션 내에 약물을 가둠으로서 제조될 수 있다. 단지 예시의 일환으로, 후부 공막주변(juxtascleral) 데포가 예를 들어, 메갈린 조절제 와 같이, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 조절하는 작용제의 투여 모드로 사용될 수 있다. 공막은 얇은 무혈관 층인데, 척추동물 눈의 대부분을 에워싸고 있는 고도로 정렬된 콜라겐 네트워크로 이루어져 있다. 공막이 무혈관이기 때문에, 이것은 주입된 물질이 눈으로부터 빠르게 제거되거나 소거될 수 없는 천연 저장소 데포로 활용될 수 있다. 눈의 공막 층으로 화합물의 투여에 사용되는 제형은 공막 층으로의 주입에 적당한 작은 직경을 갖는 캐뉼러를 통해 주입됨으로써 공막으로의 적용에 적합한 임의의 형태일 수 있다. 주사가능한 적용 형태의 예는 용액, 현탁액 또는 콜로이드 현탁액이다.

대안적으로, 소수성 약제 화합물을 위한 다른 전달 시스템이 이용될 수 있다. 리포좀과 에멀젼은 소수성 약물을 위한 전달 비히클 또는 담체의 널리 알려진 일예이다. 특정 유기 용매, 예컨대 N-메틸피롤리돈이, 상당한 독성이 문제될 수 있지만, 이용될 수 있다. 또한, 화합물은 치료제를 함유한 고체 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스와 같은, 지연 방출 시스템을 이용하여 전달될 수 있다. 다양한 지연 방출 물질이 확립되어 있고 당업계의 통상의 기술자에게 널리 알려져 있다. 지연 방출 캡슐은, 이들의 화학적 특성에 따라, 화합물을 수주 내지 최대 100일 이상 동안 방출할 수 있다. 치료제의 화학적 특성 및 생물학적 안정도에 의존하여, 단백질 안정화를 위한 추가 전략이 이용될 수 있다.

본원에 기재된 모든 제형은 항산화제, 금속 킬레이트제, 티올 함유 화합물 및 기타 일반적인 안정화제로부터의 혜택을 지닐 것이다. 그러한 안정화제의 일예는, 하기를 포함하나, 이로만 국한되지 아니한다: (a) 약 0.5% 내지 약 2% w/v 글 리세롤, (b) 약 0.1% 내지 약 1% w/v 메티오닌, (c) 약 0.1% 내지 약 2% w/v 모노티오글리세롤, (d) 약 1 mM 내지 약 10 mM EDTA, (e) 약 0.01% 내지 약 2% w/v 아스코브산, (f) 0.003% 내지 약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80, (g) 0.001% 내지 약 0.05% w/v. 폴리소르베이트 20, (h) 아르기닌, (i) 헤파린, (j) 덱스트란 설페이트, (k) 시클로덱스트린, (l) 펜토산 폴리설페이트 및 기타 헤파리노이드, (m) 2가 양이온, 예컨대, 마그네슘 및 아연; 또는 (n) 이의 조합물.

수많은 작용제는 약제학적으로 융화가능한 짝이온과 함께 염으로 제공될 수 있다. 약제학적으로 융화가능한 염은, 염화수소산, 황산, 아세트산, 락트산, 타르타르산, 말산, 석신산 등을 포함하나, 이로만 국한되지 않는, 많은 산으로 형성될 수 있다. 염은 대응되는 유리 산 또는 염기 형태보다 수성 또는 다른 양성자 용매 중에서 더 잘 용해되는 경향이 있다.

형광 화합물 검출을 위한 진단 방법

예를 들어, 황반 변성 및/또는 황반 이영양증과 같은, 망막 질환의 조기 진단은 즉각적인 치료 개입을 개시하는데 중요하다. 안구 조직 내 형광 화합물의 존재를 검출하고/거나 측정하는 방법은 미국 특허 공개 2006/0099714호에 제공되어 있으며, 상기문헌은 참고문헌으로 포함된다. 본원에서 안구 조직 내, 예를 들어, 산화된 인지질 및 산화된 지방산과 같은 독성 형광 화합물의 검출 기술 및 방법이 제공된다.

인지질과 지방산은 망막 및/또는 RPE 세포내에서 풍부하게 발견되며 RPE 및 망막 세포의 적절한 기능에 필수적이다. 망막 및/또는 RPE 세포내 독성 화합물의 존재 및 이의 축적은 예를 들어, 황반 변성 및/또는 황반 이영양증과 같은 안구 질환에 대한 기초를 제공한다. 안구 조직 내 그러한 독성 화합물의 조기 검출은 즉각적인 치료 개입을 개시하기 위해 중요하다. RPE 및/또는 망막 세포내 산화된 인지질과 지방산의 존재는 안구 질환과 서로 관련되어 있다. 인지질과 지방산은 망막 및/또는 RPE 세포내에서 광 유발 산화 및/또는 화학적 유발 산화를 겪을 수 있다. 산화된 인지질과 산화된 지방산은 형광 분광광도계에 의해 검출될 수 있는 형광 화합물이다. 안구 조직 내 형광 화합물의 검출을 위한 방법은, 참고문헌으로 포함된, 미국 특허 공개공보 2006/0099714호에 제시되어 있다.

산화된 인지질과 산화된 지방산은 예를 들어, N-레티닐이덴-포스파티딜에탄올아민, 디히드로-N-레티닐이덴-N-레티닐-포스파티딜에탄올아민, N-레티닐이덴-N-레티닐-포스파티딜에탄올아민, 디히드로-N-레티닐이덴-N-레티닐-에탄올아민, 및 N-레티닐이덴-포스파티딜에탄올아민과 같은 다른 망막 독성 화합물과는 상이한 형광 방출 스펙트럼을 지닌다.

한 구체예에서, 본원에서 인구 조직 내에서 산화된, 산화된 인지질(산화된 포스파티딜 세린을 포함) 및 산화된 지방산(도코사헥산산을 포함)의 존재 및/또는 양을 측정하는 것을 포함하는, 예를 들어, 황반 변성 및/또는 황반 이영양증과 같은, 망막 질환의 조기 진단 방법이 제공된다.

한 구체예에서, 샘플 내 산화된 인지질 및/또는 지방산의 존재를 측정하기 위한 방법이 제공된다. 몇몇 구체예에서, 샘플 내 산화된 인지질 및/또는 지방산의 존재는 300 내지 400㎚ 사이의 파장을 갖는 광을 샘플에 조사하고, 400 내지 500㎚ 사이에서 샘플로부터 나온 방출 형광을 측정함으로써 결정된다.

인지질과 지방산은 RPE 세포에 의해 서서히 흡입된다. 그러나 산화된 인지질과 산화된 지방산은 비산화된 인지질과 지방산의 흡수 속도보다 대략 10배 더 빠른 속도로 흡수된다. 산화된 인지질과 산화된 지방산은 수용체 매개성 트랜스시토시스에 의해 RPE 세포에 의해 흡수된다. 한 구체예에서, 산화된 인지질과 산화된 지방산은 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 의해 RPE 세포에 의해 흡수된다.

치료 방법, 투여량 및 병용 요법

용어 "포유동물"은 인간을 비롯한 모든 포유동물을 의미한다. 포유동물에는, 단지 예시의 일환이긴 하지만, 인간, 인간을 제외한 영장류, 소, 개, 고양이, 염소, 양, 돼지, 래트, 마우스 및 토끼가 포함된다.

본원에 사용된 용어 "유효량"이란 치료되는 질환, 병태 또는 장애의 하나 이상의 증상을 어느 정도 경감시킬 수 있게 투여되는 화합물의 양을 의미한다.

본원에 기술된 화합물(들)을 함유하는 조성물은 예방적 및/또는 치료적 치료를 위해 투여될 수 있다. 용어 "치료하는"은 예방적 및/또는 치료적 치료를 언급할 목적으로 사용된다. 치료적 적용에서, 조성물은 질환, 병태 또는 장애를 이미 앓고 있는 환자에게 질환, 장애 또는 병태의 증상을 치유하거나 적어도 부분적으로 저지하는데 충분한 양으로 투여된다. 이러한 사용에 유효한 양은 질환, 장애 또는 병태의 중증도 및 과정, 이전의 치료법, 환자의 건강 상태 및 약물에 대한 반응 및 치료하는 의사의 판단에 따라 달라질 것이다. 이와 같은 치료적 유효량이 정규 실험(예를 들어, 용량 단계적 증량 임상 실험)에 의해 결정된다는 것은 당업자들이 잘 알고 있는 것이다.

예방적 적용에서, 본원에 기술된, 예를 들어, 메갈린 조절제와 같은, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 조절하는 작용제를 함유하는 조성물은 특정 질환, 장애 또는 병태에 걸리기 쉽거나 그러한 위험이 있는 환자에게 투여된다. 이러한 양은 "예방적으로 유효한 양 또는 용량"으로 정의된다. 이의 사용에서, 정확한 양은 또한 환자의 건강 상태, 체중 등에 따라 달라진다. 이와 같은 예방적으로 유효한 양이 정규 실험(예를 들어, 용량 단계적 증량 임상 실험)에 의해 결정된다는 것은 당업자들이 잘 알고 있는 것이다.

용어 "증강시키다" 또는 "증강시키는"은 요망되는 효과의 효능 또는 지속기간을 증가시키거나 연장시키는 것을 의미한다. 따라서, 치료제의 효과에 대한 증강과 관련하여, 용어 "증강시키는"이란 시스템에 대한 다른 치료제의 효과의 효능 또는 기간을 증가시키거나 연장시킬 수 있는 능력을 의미한다. 본원에 사용된 "증대시키는 유효량"이란 소정의 시스템에서 다른 치료제의 효과를 증대시키기에 충분한 양을 말한다. 환자에게 사용시, 이러한 사용에 유효한 양은 질환, 장애 또는 병태의 중증도 및 과정, 이전의 치료법, 환자의 건강 상태 및 약물에 대한 반응 및 치료 의사의 판단에 따라 달라질 것이다.

환자의 병태가 호전되지 않는 경우, 의사의 재량으로 화합물은 환자의 질환 또는 병태의 증상을 경감시키거나, 다르게는 제어 또는 제한하기 위하여 장기간, 즉 환자의 전 생존기간을 비롯한 연장된 기간 동안 투여될 수 있다.

환자의 병태가 호전되는 경우, 의사의 재량으로 화합물의 투여는 연속적으로 제공될 수 있거나; 일정 기간 동안 일시적으로 중단될 수도 있다(즉, "휴약기").

환자 상태가 호전되면, 필요에 따라 유지 용량(maintenance dose)이 투여된다. 이어서, 투여량 또는 투여 빈도, 또는 둘 모두가 호전된 질환, 장애 또는 병태가 유지되는 수준에 대한 증상의 함수로서 감소될 수 있다. 그러나 환자들은 임의의 증상 재발에 기초하여 장기간 간헐적인 치료를 필요로 할 수 있다.

이와 같은 양에 상응하게 되는 주어진 작용제의 양은 특정 화합물, 질환 상태 및 그의 중증도, 치료할 대상 또는 숙주의 독자성(예를 들어, 체중) 등의 인자에 따라 달라질 것이나, 그럼에도 불구하고, 예를 들어, 투여되는 특정 작용제, 투여 경로, 치료될 병태 및 치료될 대상 또는 숙주를 비롯하여 해당 증례(case)에 동반된 특정 상황에 따라 당업계에 공지된 방법에 의해 관례적으로 결정될 수도 있다. 그러나 일반적으로 성인 치료를 위해 사용되는 용량은 전형적으로 1일 0.02-5000㎎, 바람직하게는 1일 1-1500㎎일 것이다. 바람직한 용량은 편의상 단위 용량으로 또는 동시 (또는 단기간에 걸쳐) 또는 적절한 간격, 예를 들어, 1일 2회, 3회, 4회 또는 그 이상 회수의 분할용량(sub-dose)으로 투여되는 분할된 용량으로 주어질 수도 있다.

특정의 경우에, 본원에 기술된, 예를 들어, 메갈린 조절제와 같은, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 조절하는 작용제(또는 약제학적으로 허용가능한 염, 에스테르, 아미드, 프로드러그 또는 용매화물) 중 적어도 하나를 다른 치료제와 병용하여 투여하는 것이 적절할 수 있다. 단지 예시의 일환이긴 하지만, 본원에 개시된 화합물 중 하나를 투여받았을 때 환자가 경험하게 되 는 부작용 중 하나가 염증이라면, 항염증제를 초기 치료제와 병용하여 투여하는 것이 적절할 수 있다. 또한, 단지 예시의 일환이기는 하지만, 본원에 기술된, 예를 들어, 메갈린 조절제와 같은, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 조절하는 작용제 중 하나의 치료 효과는 애쥬번트를 투여하여 증대시킬 수 있다(즉, 애쥬번트 그 자체로는 최소의 치료 이익만을 얻게 되나 또 다른 치료제와 병용한 경우 환자에 대한 총 치료 이익이 향상된다). 또한, 단지 예시의 일환이기는 하지만, 본원에 기술된, 예를 들어, 메갈린 조절제와 같은, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 조절하는 작용제 중 하나를 역시 치료 효과를 가진 다른 치료제(또한 다른 치료 섭생도 포함)와 함께 투여함으로써 환자가 경험하게 되는 이익을 증가시킬 수 있다. 단지 예시의 일환이기는 하지만, 본원에 기술된, 예를 들어, 메갈린 조절제와 같은, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 조절하는 작용제 중 하나를 투여하는 단계를 포함하는 황반 변성의 치료법에서, 환자에게 다른 황반 변성 치료제 또는 요법을 제공함으로써 치료 이익을 증가시킬 수 있다. 임의의 경우에, 치료할 질환, 장애 또는 병태와 상관없이, 환자가 경험하는 총 이익은 두 치료제의 단순 합일 수 있거나, 환자는 상승적인 이익을 경험할 수 있을 것이다.

가능한 병용 요법의 특이적인, 비제한적 일예는, 본원에 기술된, 예를 들어, 메갈린 조절제와 같은, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 조절하는 작용제 중 적어도 하나와 산화질소(NO) 유도제, 스타틴, 음으로 하전된 인지질, 항산화제, 미네랄, 항염증제, 항혈관형성제, 매트릭스 금속단백질분해 효소 억제제, 카로티노이드, 13-시스-레티노산, 또는 하기 화학식 (A)의 구조를 갖는 화합물과 함께 사용하는 것을 포함한다:

상기 화학식 (A)에서,

X₁은 NR², O, S, CHR²으로 구성된 군에서 선택되고;

R¹은 (CHR²)x-L1-R³인데, 여기서

x는 0, 1, 2, 또는 3이며; L¹은 단일 결합 또는 -C(O)-이고;

R²는 H, (C₁-C₄)알킬, F, (C₁-C₄)플루오로알킬, (C₁-C₄)알콕시, -C(O)OH, -C(O)-NH₂, -(C₁-C₄)알킬아민, -C(O)-(C₁-C₄)알킬, -C(O)-(C₁-C₄)플루오로알킬, -C(O)-(C₁-C₄)알킬아민, 및 -C(O)-(C₁-C₄)알콕시로 구성된 군에서 선택된 부분이며;

R³는 H 또는 (C₂-C₇)알케닐, (C₂-C₇)알키닐, 아릴, (C₃-C₇)시클로알킬, (C₅-C₇)시클로알케닐, 및 헤테로고리로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기들로 치환되거나 비치환된 부분이다.

일부의 경우에, 적합한 병용 제제는 여러 범주 내에 속할 수 있다(단지 예시의 일환이긴 하지만, 루테인은 항산화제이며 카로티노이드이다). 또한, 예를 들 어, 메갈린 조절제와 같은, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 조절하는 작용제는 환자에게 이익을 제공할 수 있는 추가 작용제와 함께 투여될 수 있는데, 단지 예시의 일환이기는 하지만, 사이클로스포린 A가 상기 추가 작용제에 포함된다.

또한, 예를 들어, 메갈린 조절제와 같은, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 조절하는 작용제는 환자에게 추가적인 또는 상승적인 이익을 제공할 수 있는 방법과 함께 병용될 수 있는데, 단지 예시의 일환이긴 하지만, 이에는 체외 유동술(extracorporeal rheopheresis)(또한 막 분별 여과(membrane differential filtration)로 알려져 있음)의 사용, 이식용 소형 망원경(implantable miniature telescope)의 사용, 드루젠의 레이저 광응고술 및 미세자극(microstimulation) 요법이 포함된다.

항산화제의 사용은 황반 변성 및 황반 이영양증에 걸린 환자에 유익한 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 문헌[Arch. Ophthalmol, 119: 1417-36(2001); Sparrow, et al., J. Biol. Chem., 278: 18207-13(2003)]을 참조하라. 예를 들어, 메갈린 조절제와 같은, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 조절하는 작용제와 병용하여 사용될 수 있는 적합한 항산화제의 예로는 비타민 C, 비타민 E, 베타-카로틴 및 다른 카로티노이드, 코엔자임 Q, 4-히드록시-2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-N-옥실(템폴(Tempol)로도 알려져 있음), 루테인, 부틸화된 히드록시톨루엔, 레스베라트롤, 트롤록스(trolox) 유사체(PNU-83836-E) 및 빌베리(bilberry) 추출물이 포함된다.

특정 미네랄의 사용이 또한 황반 변성 및 이영양에 걸린 환자에 유익한 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 문헌[Arch. Ophthalmol, 119: 1417-36(2001)]을 참조하라. 예를 들어, 메갈린 조절제와 같은, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 조절하는 적어도 하나의 작용제와 병용하여 사용될 수 있는 적합한 미네랄의 예로는 구리-함유 미네랄, 예컨대, 산화제2구리(단지 예시의 일환임); 아연-함유 미네랄, 예컨대, 산화아연(단지 예시의 일환임); 및 셀레늄-함유 화합물이 포함된다.

특정 음으로 하전된 인지질의 사용이 또한 황반 변성 및 황반 이영양증에 걸린 환자에 유익한 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 문헌[Shaban & Richter, Biol. Chem., 383:537-45(2002); Shaban, et al., Exp. Eye Res., 75:99-108(2002)]을 참조하라. 예를 들어, 메갈린 조절제와 같은, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 조절하는 적어도 하나의 작용제와 병용하여 사용될 수 있는 적합한 음으로 하전된 인지질의 예로는 카디오리핀 및 포스파티딜글리세롤이 포함된다. 또한, 양으로 하전된 및/또는 중성 인지질이, 메갈린 조절제와 병용하여 사용될 때, 황반 변성 및 황반 이영양증에 걸린 환자에 유익할 수 있다.

특정 카로티노이드의 사용이 광수용체 세포에 필요한 광보호 유지와 상호관련되어 있다. 카로티노이드는 식물, 조류(algae), 박테리아 및 특정 동물, 예컨대, 조류(birds) 및 조개에 존재하는 테르페노이드 계열(group)의 자연발생 황색 내지 적색 색소이다. 카로티노이드는 거대 분류 분자로서 600개 이상의 자연발생 카로티노이드가 알려져 있다. 카로티노이드는 탄화수소(카로틴) 및 이들의 산소 화, 알코올 유도체(크산토필)를 포함한다. 이들은 액티니오에리쓰롤, 아스타크산틴, 칸타크산틴, 캡산틴, 캡소루빈, β-8'-아포-카로테날(아포-카로테날), β-12'-아포-카로테날, α-카로틴, β-카로틴, "카로틴"(α- 및 β-카로틴의 혼합물), γ-카로틴, β-크립토크산틴, 루테인, 리코펜, 비올에리스린, 제아크산틴 및 이들의 하이드록실- 또는 카르복실-함유 구성원의 에스테르를 포함한다. 다수의 카로티노이드는 천연에서 시스- 및 트랜스-이성질체 형태로 존재하는 반면, 합성 화합물은 흔히 라세믹 혼합물이다.

인간에서, 망막은 주로 두 개의 카로티노이드, 즉 제아크산틴 및 루테인을 선택적으로 축적한다. 이들 두 가지 카로티노이드는 강력한 항산화제이면서 청색광을 흡수하기 때문에 망막을 보호하는데 도움이 되는 것으로 여겨진다. 메추라기를 대상으로 한 연구에서 카로티노이드가 결핍된 식이로 기른 그룹은 제아크산틴의 농도가 낮은 망막을 가졌으며, 매우 많은 수의 세포자멸 광수용체 세포에 의해 입증된 바와 같이, 빛에 의해 극심한 손상을 입은 반면, 제아크산틴 농도가 높은 그룹은 최소의 손상을 나타낸 것으로 조사되었다. 예를 들어, 메갈린 조절제와 같은, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 조절하는 적어도 하나의 작용제와 병용하기에 적합한 카로티노이드의 예로는 상기 언급된 임의의 카로티노이드를 비롯한, 루테인 및 제아크산틴이 포함된다.

적합한 산화질소 유도제는 내부 NO를 자극하거나, 생체내에서 내인성 내피세포-의존성 이완 인자(EDRF, endothelium-derived relaxation factor)의 수준을 상승시키거나, 산화질소 합성효소에 대한 기질인 화합물을 포함한다. 이러한 화합물 에는, 예를 들어, L-아르기닌, L-호모아르기닌 및 N-히드록시-L-아르기닌[이들의 니트로소화 및 니트로실화 유사체를 포함함(예를 들어, 니트로소화 L-아르기닌, 니트로실화 L-아르기닌, 니트로소화 N-히드록시-L-아르기닌, 니트로실화 N-히드록시-L-아르기닌, 니트로소화 L-호모아르기닌 및 니트로실화 L-호모아르기닌)], L-아르기닌의 전구체 및/또는 이들의 생리학적으로 허용가능한 염, 예를 들어 시트룰린, 오르니틴, 글루타민, 리신, 적어도 하나의 이들 아미노산을 포함하는 폴리펩티드, 아르기나제 효소 억제제(예를 들어, N-히드록시-L-아르기닌 및 2(S)-아미노-6-보로노헥산산) 및 산화질소 합성효소 기질, 시토킨, 아데노신, 브래디키닌, 칼레티큘린, 비사코딜 및 페놀프탈레인을 포함한다. EDRF는 내피세포에 의해 분비되는 혈관이완 인자이며, 산화질소 또는 그와 밀접한 관련 유도체로서 확인되었다[Palmer et al., Nature, 327:524-526(1987); Ignarro et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 84:9265-9269(1987)].

스타틴은 지질 저하제 및/또는 적합한 산화질소 유도제로 역할한다. 또한, 스타틴 사용과 황반 변성의 발병 또는 발생 지연의 관계가 입증되었다[G. McGwin, et al., British Journal of Ophthalmology, 87:1121-25(2003)]. 따라서, 스타틴은 메갈린 조절제와 병용하여 투여되는 경우 안과적 병태(예컨대 황반 변성, 황반 이영양 및 망막 이영양)로 고통받는 환자에게 이익을 제공할 수 있다. 적합한 스타틴으로는 단지 예시의 일환이긴 하지만, 로수바스타틴, 피티바스타틴, 심바스타틴, 프라바스타틴, 세리바스타틴, 메바스타틴, 벨로스타틴, 플루바스타틴, 콤팩틴, 로바스타틴, 달바스타틴, 플루인도스타틴, 아토르바스타틴, 아토르바스타틴 칼슘 (아토르바스타틴의 헤미칼슘 염), 및 디하이드로콤팩틴이 포함된다.

적합한 항염증성 작용제는 단지 예로서, 아스피린 및 다른 살리실산염, 크로몰린(cromolyn), 네도크로밀(nedocromil), 데오필린(theophylline), 질류턴(zileuton), 자피르루카스트(zafirlukast), 몬텔루카스트(montelukast), 프란루카스트(pranlukast), 인도메타신(indomethacin), 및 리폭시제나제 억제제; 비스테로이드성 항염증성 제제(non-steroidal antiinflammatory drugs: NSAID)(예를 들어 이부프로펜(ibuprofen) 및 나프록신(naproxin)); 프레드니손(prednisone), 덱사메타손(dexamethasone), 시클로옥시제나제(cyclooxygenase) 억제제(다지 말해, COX-1 및/또는 COX-2 억제제 예를 들어 Naproxen™, 또는 Celebrex™); 스타틴(단지 예로서, 로수바스타틴(rosuvastatin), 피티바스타틴(pitivastatin), 심바스타틴(simvastatin), 프라바스타틴(pravastatin), 세리바스타틴(cerivastatin), 메바스타틴(mevastatin), 벨로스타틴(velostatin), 플루바스타틴(fluvastatin), 콤팩틴(compactin), 로바스타틴(lovastatin), 달바스타틴(dalvastatin), 플루인도스타틴(fluindostatin), 아토르바스타틴(atorvastatin), 아토르바스타틴 칼슘(이는 아토르바스타틴의 헤미칼슘 염이다), 및 디하이드로콤팩틴); 및 분해된 스테로이드를 포함하며, 이 함영증성 작용제와 함께 예를 들어 메갈린-조절제와 같은 망막 및/또는 RPE 세포 내 LDL 수용체 유전자 패밀리의 구성원을 조절하는 작용제가 사용될 수 있다.

적합한 매트릭스 금속단백질분해효소(MMP) 억제제가 또한 황반 또는 망막 변성과 관련한 안과적 병태 또는 증상을 치료하기 위해, 예를 들어, 메갈린 조절제와 같이, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 조절하는 작용제와 병용하여 투여될 수 있다. MMP는 대부분의 세포외 매트릭스 성분을 가수분해하는 것으로 알려져 있다. 이들 단백질분해효소는 정상 조직 재형성, 배아형성, 상처 치유 및 혈관신생과 같은 많은 생물학적 과정에 중요한 역할을 한다. 그러나 황반 변성을 비롯한 많은 질환 상태에서 MMP의 과발현이 관찰되었다. MMP는 대부분 다중도메인 아연 엔도펩티다제로 확인되었다. 다수의 금속단백질분해효소 억제제가 공지되었다(예를 들어, MMP 억제제에 대한 검토 문헌[Whittaker M. et al., Chemical Reviews 99(9):2735-2776(1999)]을 참조하라). MMP 억제제의 대표적인 예로 금속단백질분해효소의 조직 억제제(TIMP)(예를 들어, TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 또는 TIMP-4), α2-마크로글로불린, 테트라사이클린류(예를 들어, 테트라사이클린, 미노사이클린 및 독시사이클린), 하이드록사메이트(예를 들어, BATIMASTAT, MARIMISTAT 및 TROCADE), 킬레이트제(예를 들어, EDTA, 시스테인, 아세틸시스테인, D-페니실아민 및 금 염), 합성 MMP 단편, 숙시닐 머캅토퓨린, 포스폰아미데이트 및 하이드록사민산이 포함된다. 메갈린 작용제와 병용하여 사용될 수 있는 MMP 억제제로는 단지 예로서 상기 언급된 임의의 억제제가 포함된다.

항혈관형성 또는 항-VEGF 약물의 사용이 또한 황반 변성 및 이영양증으로 고통받는 환자에게 이익을 제공할 수 있다. 예를 들어, 메갈린 조절제와 같이, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 조절하는 적어도 하나의 작용제와 병용하여 사용될 수 있는 적합한 항혈관신생 또는 항-VEGF 약물의 예로는 루파브(Rhufab) V2(Lucentis^TM), 트립토파닐-tRNA 합성효소(TrpRS), EyeOOl(항-VEGF 페길화압타머), 스쿠알라민, Retaane^TM 15㎎(데포 현탁액 용 아네코타브 아세테이트; 알콘 인코포레이션(Alcon, Inc.)), 콤브레타스타틴 A4 프로드러그(CA4P), 마쿠겐(Macugen^TM), 미페프렉스(Mifeprex^TM)(미페프렉스톤-ru486), 서브테논 트리암시놀론 아세토나이드, 유리체내 결정성 트리암시놀론 아세토나이드, 프리노마스타트(AG3340 - 합성 매트릭스 금속단백질분해효소 억제제, Pfizer), 플루오시놀론 아세토나이드(플루오시놀론 안내 이식 포함, Bausch & Lomb/Control Delivery System)), VEGFR 억제제(Sugen) 및 VEGFTrap(Regeneron/Aventis)가 포함된다.

시각 장애를 개선하기 위해 사용되고 있는 다른 약제학적 요법이, 예를 들어, 메갈린 조절제와 같이, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 조절하는 적어도 하나의 작용제와 병용되어 사용될 수 있다. 이러한 치료에는 비열(non-thermal) 레이저의 사용과 함께 Visudyne^TM, PKC 412, 엔도비온(NeuroSearch A/S), 아교 유래 향신경 인자 및 섬모체 향신경 인자를 포함하나 이에 한정되지 않는 향신경인자, 디아타젬, 도르졸라미드, 광영양체, 9-시스-레티날, 포스포린 요오다이드 또는 에코티오페이트 또는 탄산탈수효소 억제제를 비롯한 눈 약물처치(에코 요법 포함), AE-941(AEterna Laboratories, Inc.), Sirna-027(Sirna Therapeutics, Inc.), 페갑타니브(NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences), 뉴트로핀(단지 예시의 일환이기는 하지만, NT-4/5(Genentech)를 포함 함), Cand5(Acuity Pharmaceuticals), 라니비주마브(Genentech), INS-37217(Inspire Pharmaceuticals), 인테그린 길항제(Jerini AG and Abbott Laboratories 제품 포함), EG-3306(Ark Therapeutics Ltd.), BDM-E(BioDiem Ltd.), 탈리도미드(예를 들어, EntreMed, Inc.에 의한 기존 사용품), 카디오트로핀-1(Genentech), 2-메톡시에스트라디올(Allergan/Oculex), DL-8234(Toray Industries), NTC-200(Neurotech), 테트라티오몰리브데이트(University of Michigan), LYN-002(Lynkeus Biotech), 미세조류 화합물(Aquasearch/Albany, Mera Pharmaceuticals), D-9120(Celltech Group plc), ATX-S1O(Hamamatsu Photonics),,TGF-베타 2(Genzyme/Celtrix), 티로신 키나제 억제제(Allergan, SUGEN, Pfizer), NX-278-L(NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences), Opt-24(OPTIS France SA), 망막 세포 신경절 신경보호제(Cogent Neurosciences), N-니트로피라졸 유도체(Texas A&M University System), KP-102(Krenitsky Pharmaceuticals)및 사이클로스포린 A 등의 약제들이 포함되나, 이에만 국한되는 것은 아니다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개공보 제20040092435호를 참조하라.

임의의 경우, 다중 치료제(이중 하나는 본원에 개시된, 예를 들어, 메갈린 조절제와 같이, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 조절하는 작용제들 중 어느 하나임)가 임의 순서로 또는 동시에 투여될 수 있다. 동시 투여되는 경우, 다중 치료제는 단일 형태 또는 다중 형태(단지 예시의 일환이기는 하지만, 단일 환제 또는 두 개의분리 환제로서)로 제공될 수 있다. 치료제 중 하나가 다중 용량으로 제공될 수 있거나, 둘 모두가 다중 용량으로 제공될 수 있다. 동시에 투여되는 경우가 아니라면, 다중 투여 간격은 0주 이상 4주 이하에서 달라질 수 있다. 또한, 병용 방법, 조성물 및 제형은 두 약제를 사용하는 경우에만 제한되지 않으며; 다중 치료법을 병용하여 사용하는 경우에도 계획된다. 단지 예시의 일환으로서, 메갈린 조절제는 적어도 하나의 항산화제 및 적어도 하나의 음으로 하전된 인지질과 함께 제공될 수 있거나; 예를 들어, 메갈린 조절제와 같이, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 조절하는 작용제는 적어도 하나의 항산화제 및 적어도 하나의 산화질소 생성 유도제와 함께 제공될 수 있거나; 예를 들어, 메갈린 조절제와 같이, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 조절하는 작용제는 적어도 하나의 산화질소 생성 유도제 및 적어도 하나의 음으로 하전된 인지질와 함께 제공될 수 있거나, 그 밖의 경우도 가능하다.

또한, 예를 들어, 메갈린 조절제와 같이, 망막 및/또는 RPE 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원을 조절하는 작용제는 환자에 추가적이거나 상승적인 이점을 제공할 수 있는 방법과 병용하여 사용될 수 있다. 시각 장애를 개선하는 것으로 공지되었거나 제안되었거나 그렇게 판단되는 방법으로는 '제한 망막 전좌법', 광역학 치료법(단지 예시의 일환으로서, 수용체-표적 PDT(Bristol-Myers Squibb, Co.); PDT와 함께 주사하기 위한 포르피머 나트륨; 버테포르핀(QLT Inc.); PDT와 함께 주사하기 위한 로스타포르핀(Miravent MedicalTechnologies); PDT와 함께 주사하기 위한 탈라포르핀 나트륨(Nippon Petroleum); 모텍사핀 루테튬(Pharmacyclics, Inc.)를 포함), 안티센스 올리고뉴클레오티드(단지 예시의 일환 으로서, Novagali Pharma SA에 의한 테스트 제품 및 Isis Pharmaceuticals의 ISIS-13650 포함), 레이저 광응고술, 드루젠 레이저법, 황반 원공 수술법, 황반 전좌 수술법, 이식용 소형 망원경, 파이-운동 혈관조영상(또한 마이크로레이저 요법 및 공급자 혈관 처리로도 공지됨), 양성자 빔 치료법, 미세자극 요법, 망막 박리술 및 유리체 수술법, 공막 압편법, 황반하 수술법, 경동공 온열치료법, 광계 I 요법, RNA 간섭법(RNAi) 이용, 체외 유동술(또한 막 분별 여과 및 유동요법(Rheotherapy)로도 공지되어 있음), 마이크로칩 이식법, 줄기 세포 요법, 유전자 대체 요법, 리보자임 유전자 요법(저산소증 반응 요소에 관한 유전자 요법(Oxford Biomedica; Lentipak, Genetix); PDEF 유전자 요법(GenVec)을 포함함), 광수용체/망막 세포 이식법(이식용 망막 상피 세포(Diacrin, Inc.); 망막 세포 이식(Cell Genesys,Inc.)을 포함함) 및 침술이 포함되나, 이들에만 국한되는 것은 아니다.

개체에 이익을 주기 위해 사용될 수 있는 추가의 병용법으로는 개체가 특정의 안과적 병태와 관련이 있는 것으로 알려진 돌연변이 유전자의 보균자인지를 결정하는 유전자 테스트를 이용하는 것을 포함한다. 단지 예시의 일환으로서, 인간 ABCA4 유전자 결함은 스타르가르트 질환, 추체-간체 이영양증, 연령 관련 황반 변성 및 색소성 망막염을 비롯한 다섯 개의 상이한 망막 표현형과 관련이 있는 것으로 생각된다. 또한, 스타르가르트 질환의 상염색체 우성 형태는 ELOV4 유전자의 돌연변이에 의해 야기된다. 예를 들면, 문헌[Karan, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(2005)]을 참조하라. 이러한 돌연변이들 중 임의의 것을 지니는 환자는 본원에 개시된 방법으로 치료적 및/또는 예방적 이익을 얻을 것으로 기대된다.

예시적인 실시예

RPE 배양 - 인간 RPE 세포를 검시용 조직에서 수집하고, 첨가제와 함께 칼슘비함유 이글(Eagle) 최소 필수 배지(EMEM; Sigma Chemical, St. Louis, MO)에서 거주 세포들이 증식되고, 세포군(confluence)을 형성하고, 배지 내로 배출될 때까지 성장시켰다. 이러한 비부착 세포들을 수집하고 마우스 라미닌(Collaborative Research, Bedford, MA)로 코팅된 폴리카르보네이트 필터(Milipore, Bedford, MA, USA)에서 성장시켰다. 밀리셀(Millicell) 챔버를, 상부 및 하부 배지 구획이 분리되게 하는, 멀티웰 플레이트내에 유지시켰다.

시약 - MEM 배지 w/ 얼(Earle) 염 및 글루타민을 셀그로(Cellgro(Herndon, VA))로부터 얻었다. 래빗, 항-래트 메갈린을 미첼 마리노 박사(Dr. Michele Marino, University of Pisa, Italy)로부터 기증받았다. 래빗, 항-인간 gp330을 피츠제랄드 인더스트리즈 인터내셔널(Fitzgerald Industries International, Inc., Concord, MA)로부터 획득하였다. 래빗 전-면역 IgG를 산타 크루즈 테크놀로지즈(Santa Cruz Technologies, Santa Cruz, CA)로부터 얻었고 수용체-연관 단백질(RAP)을 옥스포드 바이오메디칼 리서치(Oxford Biomedical Research, Oxford, MI)로부터 얻었다. 인간 레티놀 결합 단백질(RBP)을 E.coli에서 발현시켰다. 이 단백질을 이온 교환 크로마토그래피와 크기 배제 크로마토그래피로 정제하고 뒤이어 변성 및 레티놀(Sigma, St Louis, Mo.) 존재하에서 리폴딩시켰다. 소 간질성 레티노이드 결합 단백질(IRBP)을 동결된 소 망막으로부터 준비하였다. 간략히 요 약하면, 동결된 망막을 등장성 완충액에 넣고 4℃에서 밤새 유순하게 진탕시켰다. 가용성 단백질을 원심분리로 균질 현탁액(homogenate)으로부터 제거하고 IRBP를 순차적 ConA 세파로즈 및 이온 교환 크로마토그래피로 상청액으로부터 정제하였다. SDS-PAGE를 사용하여 RBP와 IRBP를 확인하였다.

면역조직화학 - 공초점 현미경의 경우, 필터 상의 RPE 배양물을 4% 파라포름알데히드에 고정시키고, 연속적으로 에탄올로 탈수시키고 에폰(Epon)에 엠베딩시켰따. 일부 경우에, 세포를 고정시킨 후 -20℃에서 5분 동안 메탈올을 투과(permeabilization)시켰다. 절편(Sections)을 레이카(Leica) 레이저 스캐닝 공초점 현미경(TCS-SP2, Leica, Exton, PA)을 이용하여 분석하였다. 일련의 1㎛ x-y(정면(en face)) 섹션을 수집하였다. 염색된 RPE 세포 배양물 각각의 개별 x-y 이미지는 전체 안구 부분의 3차원 투영을 나타낸다(쌓아 올려진 모든 이미지들의 총합). 현미경 패널을 AdobePhotoshop 5.5을 이용하여 비교하였다(Bar = 40㎛). 사용된 항체는 위에 기술되어 있다. 2차 항체는 염소 항-마우스 및 래빗 알렉사(Alexa) 488 및 알렉사 594(Molecular Probes, Eugene, OR)를 포함하였다.

인간 RPE 세포내 레티놀 결합 단백질 및 간질성 레티노이드 결합 단백질의 메갈린 매개 흡수 - 메갈린-특이적 항체(0.2㎍/㎖), 또는 RAP(0.5㎍/㎖)를 RPE 세포 배양물의 하부 또는 상부 구획 중 어느 하나에 첨가하고, 이 샘플을 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. RBP-레티놀(30μM) 또는 IRBP-레티놀(10μM)을 적절한 구획에 첨가하고 인큐베이션을 37℃에서 1시간 동안 재개하였다. 인큐베이션 후, 배지를 상기 두 구획으로부터 제거하고 버렸다. RPE 세포를 필터 지지체로부 터 제거하고 하기한 바와 같이 처리하였다.

조직 제조 및 추출 - 5 mM EDTA(pH 7.2)를 함유한 PBS 250 마이크로리터를 상부 구획에 첨가하고 이를 세포가 필터 십입체로부터 떨어져 나오도록 진탕시키는데 사용하였다. 세포 현탁액을 1.5㎖ 원심분리 튜브에 옮기고 세포를 14,000 x g로, 5분간 원심분리하였다. 상청액을 버리고 세포 펠렛을 추가 100㎕의 PBS로 세척하였다. 2차 원심분리 후, RPE 세포 펠렛을 50㎕의 ddH2O에 현탁시켰다. 그런 다음 세포막을 100㎕의 MeOH와 10㎕의 1M NH2OH로 처리하였다. 샘플을 실온에서 5분간 인큐베이션하였다. 레티노이드를 300㎕의 디클로로메탄(CH2Cl2)로 추출하였다. 혼합과 원심분리(14,000 x g, 1분) 후, 상층(유기상)을 제거하고 버렸다. 수성상(하층)을 CH2Cl2 300㎕ 분취액(aliquots)으로 2회 재추출하였다. 유기상을 포집하고 용매를 질소 기체 증기하에서 건조시켰다. 샘플 잔류물을 HPLC에 의한 분석을 위해 210㎕의 헥산에 재현탁시켰다.

HPLC - 레티노이드 추출물을 광다이오드 어레이 검출기가 구비된 아길런트(Agilent) 1100 시리즈 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 분석하였는데, 실리카 컬럼(Agilent Zorbax Rx-Sil 4.6 mm × 250 mm, Agilent, Palo Alto, CA)과 2 mL/분의 유속에서 n-헥산 중의 디옥산의 구배를 이용하였다.

전체 조직으로부터 메갈린 풍부 막의 제조 - 수크로스 밀도 원심분리를 이용하여 신장, 망막, 및 RPE-아이컵(eyecup)(RPE와 더불어 맥락막 및 공막) 샘플로 부터 막성 구성 성분을 분리하였다. 절제 후, 조직 샘플을 0.25 M 수크로스(pH 7.5)를 함유한 완충액에서 균질화시켰다. 균질 현탁액을 27,000 x g로 20분 동안 원심분리하였다. 상청액 분획을 버리고 그 결과 얻어진 펠렛(P1)을 0.5% CHAPS를 함유한 완충액에서 균질화시켰다. 원심분리를 반복하여 불용성 펠렛(이것을 버림)과 CHAPS-용해성 단백질 분획(CS)을 생성시켰다. CS 분획을 모든 면역블롯 실험을 위한 단백질 공급원으로 사용하였다. 이 분획을 또한 전기영동 이동도에 관한 탄수화물 제거 효과를 평가하기 위해 탈-당화(de-glysosylation) 연구(단백질 ㎍당 1유닛의 엔도글리코시다아제로 처리)에 사용하였다. 몇몇 실험에서, P1를 메갈린-면역반응성 단백질을 최대로 면역침전시키기 위해 1% 트리톤에 재현탁시켰다.

펩티드 서열분석 - 메갈린-면역반응성 단백질을 SDS-PAGE 겔에서 잘라내고, 실리콘이첨가된 에펜도르프 튜브에 넣었다. 이 겔 샘플을 200㎕의 탈색(destaining) 용액(Sigma)으로 탈색시켰다. 탈색 후, 겔 조작을 건조시키고 5유닛의 PNGase F(Sigma)를 첨가하고 뒤이어 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 겔 조각이 전부 잠기게 물을 첨가하고 37℃에서의 인큐베이션을 12-16시간 동안 재개하였다. 인큐베이션 용액을 버리고 겔 조각을 물로 세척하고 실온에서 초음파분해시켰다. 겔 조각을 진공하에서 건조시켰다. 트립신(0.4㎍, Sigma)을 첨가하고 샘플을 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 50㎕의 트립신 반응 완충액(Sigma)을 상기 겔 샘플에 첨가하고 37℃에서의 인큐베이션을 12-16시간 동안 재개하였다. 인큐베이션 후, 반응 용액을 버리고 50㎕의 펩티드 추출 용액(Sigma)을 첨가하여 펩티드를 용리시켰다. 37℃에서 30분간의 인큐베이션 및 간헐적인 격력한 진탕 후, 펩티드-함유 용액을 제거하고 버려진 반응 용액과 합쳤다. 샘플 부피를 진공하 증발로 ~10㎕까지 감소시켰다. 이러한 방식으로 제조된 샘플 을 아래 기술한 것과 같이 전자분사 이온화 질량 분석기(ESI-LC/MS)에 커플링된 모세관 액체 크로마토그래피에 관한 질량 분석기로 분석하였다.

ESI-LC/MS - 아질런트 1100 시리즈 모세관 액체 크로마토그래피를 크로마토그래피용으로 사용하였다. 펩티드를 조르박스(Zorbax) 300SB-C18 컬럼(0.5 x 250 mm)을 이용한 역상 크로마토그래피로 분리시켰다. 0.2% 아세트산과 0.005% 헵타플루오로부티르산을 함유한, 아세토니트릴 구배를 5㎕/분의 속도로 컬럼에 펌핑하였다. 컬럼 온도를 50℃로 유지하였다. 컬럼 용출액(eluate)을 인-라인 전자분사 이온화 질량 분석기(LCQ Deca XP plus, Thermo, San Jose, CA)에 옮겼다. ESI 소스를 하기 파라미터를 이용하여 프로그래밍하였다: 분사 전압 = 4.04 kV, 모세관 전압 = 42.34 V, 모세관 온도 = 275.20℃, 튜브 렌즈 = 20V. 헬륨 단편화 에너지를 25-30% 사이로 변화시켜 펩티드 단편 분해를 최적화시켰다.

면역블롯 분석 - 면역블롯 분석을 위해 사용한 단백질 샘플을 SDS 로딩 완충액에 재현탁시켰다. 이러한 샘플은 3-8% 트리스-아세테이트 겔(Invitrogen, Carlsbad, CA) 상에서 전기영동시키고, 이후 PVDF 막으로 옮겼다. 상기 막을 트리스로 완충액 염수(TBST)에 용해된 0.1% 트윈(Tween) 20 중의 5% 밀크로 블로킹시키고 난 다음, 4℃에서 12-16시간 동안 적절한 1차 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 웨스턴 블롯에 사용한 항체는 래빗 항-래트 메갈린 폴리클론 항체(5㎍/㎖), 및 래빗, 항-인간 RAP 폴리클론 항-혈청(1:500으로 희석)을 포함하였다. TBST로 4회 세척 후, 상기 막을 양고추냉이 과산화효소와 접합된 염소 항-래빗 IgG(1:100,000으로 희석)와 함께 인큐베이션하였다. 상기 막을 4회 세척하고, 케미글로우 웨스트 기질(ChemiGlow West Substrate)(Alpha Innotech, San Leandro, CA)로 현상시키고 난 다음, 발광 영상장치(Alpha Innotech에서 출시된 FluorChem)를 이용하여 시각화시켰다.

ABCA4 녹아웃 마우스 . ABCA4는 간상세포 및 추상세포 광수용체의 외절 원반에서 ATP-결합 카세트(ABC) 수송체인 림단백질(RmP)을 엔코딩한다. RmP에 대한 수송 기질은 알려져 있지 않다. abca4 유전자에 녹아웃 돌연변이를 가지도록 생산된 마우스(문헌[Weng et al., Cell, 98:13-23(1999)]을 참조바람)는 RmP 기능을 연구하는데 유용할 뿐만 아니라 후보 물질의 효능을 생체내에서 스크리닝하는데 유용하다. 이러한 동물은 다음과 같은 복잡한 안구 표현형(ocular phenotype)을 가진다: (i) 느린 광수용체 변성, (ii) 광 노출에 따른 간상세포 감도의 회복 지연, (iii) 광표백 후 광수용체 외절에서의 atRAL의 증가 및 atROL의 감소, (iv) 외절에서의 구조적으로 증가된 포스파티딜에탄올아민(PE) 및 (v) RPE 세포에서의 리포푸신 축적. 문헌[Weng et al., Cell, 98:13-23(1999)]을 참조하라.

광수용체의 변성 속도는 두 가지 기술에 의해 처리 및 미처리 야생형 마우스와 abca4-/- 마우스에서 모니터될 수 있다. 하나는 다른 시간에 ERG 분석에 의해 마우스를 연구하는 것으로 임상 진단 과정에 채용된다. 문헌[Weng et al., Cell, 98:13-23(1999)]을 참조하라. 마취된 마우스의 각막 표면에 전극을 설치하고, 광 섬광에 대한 전기적 반응을 망막으로부터 기록한다. 광수용체의 광-유도 과다분극으로부터 야기된 α-파 진폭은 광수용체 변성의 민감성 지표(sensitive indicator)이다. 문헌[Kedzierski et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 38:498- 509(1997)]을 참조하라. ERG는 살아있는 동물에서 수행된다. 따라서, 동일한 마우스를 경시적 연구 동안 반복적으로 분석할 수 있다. 광수용체 변성을 정량하는 명확한 기술은 망막 절편의 조직학적 분석이다. 각 시점에서, 망막에 잔존하는 광수용체의 개수는 외핵층내 광수용체 핵의 열(row)을 계수함으로써 결정될 것이다.

조직 추출 . 안구 샘플을 pH 7.2의 1 ㎖ PBS 중의 얼음 상에서 해동시키고, 이중의 유리-유리 균질화기를 이용하여 손으로 균질화시켰다. 1 ㎖ 클로로포름/메탄올(2:1, v/v)을 첨가한 뒤 시료를 추가로 균질화시켰다. 상기 샘플을 보로실리케이트 튜브로 옮기고, 지질을 4㎖의 클로로포름으로 추출하였다. 유기 추출물을 pH 7.2의 3㎖ PBS로 세척한 뒤, 샘플을 3,000×g로 10분간 원심분리하였다. 클로로포름 상을 따라 내고, 수성상을 추가의 4㎖ 클로로포름으로 재추출하였다. 원심분리 후, 클로로포름 상을 취합하고, 샘플을 질소 기체하에서 건조시켰다. 샘플 잔류물을 100㎕ 헥산에 재현탁시키고, 아래 기술된 바와 같이 HPLC로 분석하였다.

HPLC 분석 . 형광 및 다이오드 어레이 검출기가 구비된 아길런트(Agilent) 1100 시리즈 액체 크로마토그래피를 이용하여 아길런트 조르박스(Agilent Zorbax) Rx-Sil 컬럼(5μm, 4.6×250 ㎜) 상에서 크로마토그래피 분리를 수행하였다. 이동상(헥산/2-프로판올/에탄올/pH 7.0의 25mM KH2PO4/아세트산; 485/376/100/50/0.275, v/v)을 1㎖/분의 속도로 이동시켰다. 샘플 피크를 인증 표준(authentic standard)의 체류 시간 및 흡수 스펙트럼과 비교하여 확인하였다. 데이터를 형광 검출기로부터 획득한 형광 피크(L.U.)로 기록하였다.

다음의 실시예는 메갈린 조절제의 효능과 안정성에 대한 예시적인 시험 방법 을 제공한다. 이들 실시예는 단지 예시적인 목적을 위해 제공된 것이며 본원에 제공된 청구범위를 제한하기 위해 제공된 것은 아니다.

실시예 1: A2E 축적에 대한 메갈린 조절제의 효과

실험군 마우스에게는 메갈린 조절제를 투여하고 대조군 마우스에게는 DMSO만을 투여한 뒤 A2E 축적에 대해 분석하였다. 실험군에게는 1일당 10 내지 25 ㎕의 DMSO 중의 2.5 내지 20 ㎎/㎏의 메갈린 조절제를 투여하였다. 50㎎/㎏의 최고 용량에서도 효과가 관찰되지 않는 경우에는 더 많은 용량으로 시험하였다. 대조군에게는 DMSO만을 10 내지 25㎕ 주사하였다. 1개월을 초과하지 않는 다양한 실험 기간 동안 복강내(i.p.) 주사에 의해 시험 물질 또는 대조 물질을 마우스에게 투여하였다.

abca4^-/^- 마우스 RPE에서 A2E의 축적을 평가하기 위하여, 1일당 2.5 내지 20 ㎎/㎏의 메갈린 조절제를 복강내 주사에 의해 2개월령 abca4-/- 마우스에 제공하였다. 1개월 후 실험군 마우스 및 대조군 마우스를 죽이고 RPE내 A2E 수준을 HPLC로 측정하였다. 또한, N-레티닐리덴-포스파티딜에탄올아민, 디히드로-N-레티닐리덴-N-레티닐-포스파티딜에탄올아민, N-레티닐리덴-N-레티닐-포스파티딜에탄올아민, 디히드로-N-레티닐리덴-N-레티닐에탄올아민 및/또는 N-레티닐리덴-포스파티딜에탄올아민의 자가형광 또는 흡수 스펙트럼을 UV/가시광선 분광법을 이용하여 모니터링할 수 있다.

실시예 2: 리포푸신 축적에 대한 메갈린 조절제의 효과

실험군 마우스에게는 메갈린 조절제를 투여하고 대조군 마우스에게는 DMSO만을 투여한 뒤 리포푸신 축적에 대해 분석하였다. 실험군에게는 1일당 10 내지 25 ㎕의 DMSO 중의 2.5 내지 20 ㎎/㎏의 메갈린 조절제를 투여하였다. 50 ㎎/㎏의 최고 용량에서도 효과가 관찰되지 않는 경우에는 더 많은 용량으로 시험하였다. 대조군에게는 DMSO만을 10 내지 25㎕ 주사하였다. 1개월을 초과하지 않는 다양한 실험 기간 동안 복강내 주사에 의해 실험 물질 또는 대조 물질을 마우스에게 투여하였다. 대안적으로, 1개월을 초과하지 않는 다양한 실험 기간 동안 0.25㎕/시(hr)의 속도로 실험 물질 또는 대조 물질을 전달하는 펌프를 마우스에 이식할 수도 있다.

메갈린 조절제 처리 및 미처리 abca4-/- 마우스에서 리포푸신 형성에 대한 메갈린 조절제의 효과를 분석하기 위해, 안구를 전자 현미경 또는 형광 현미경으로 검사할 수 있다.

실시예 3: 간상세포 사멸 또는 간상세포 기능 손상에 대한 메갈린 조절제의 효과

실험군 마우스에게는 메갈린 조절제를 투여하고 대조군 마우스에게는 DMSO만을 투여한 뒤 간상세포 사멸 또는 간상세포 기능 손상에 대한 메갈린 조절제의 효과를 분석하였다. 실험군에게는 1 일당 10 내지 25 ㎕의 DMSO 중의 2.5 내지 20 ㎎/㎏의 메갈린 조절제를 투여하였다. 50㎎/㎏의 최고 용량에서도 효과가 관찰되지 않는 경우에는 더 많은 용량으로 시험하였다. 대조군에게는 DMSO만을 10 내지 25㎕ 주사하였다. 1 개월을 초과하지 않는 다양한 실험 기간 동안 복강내 주사에 의해 실험 물질 또는 대조 물질을 마우스에게 투여하였다. 대안적으로, 1개월을 초과하지 않는 다양한 실험 기간 동안 0.25㎕/시(hr)의 속도로 실험 물질 또는 대조 물질을 전달하는 펌프를 마우스에 이식할 수도 있다.

대략 8주간 1일당 2.5 내지 20㎎/㎏의 메갈린 조절제로 처리된 마우스에 대해 ERG 기록을 모니터링하고 망막 조직학 검사를 수행함으로써 간상세포 사멸 또는 간상세포 기능 손상에 대한 메갈린 조절제의 효과를 분석할 수 있다.

실시예 4: 광 손상 보호에 관한 시험

아래의 연구는 문헌[Sieving, P.A., et al, Proc. Natl. Acad. Sci, 98:1835-40(2001)]으로부터 이루어진 것이다. 만성 광-노출 연구를 위하여, 스프래그-돌리(Sprague-Dawley) 수컷 7 주령 알비노 래트를 5 룩스 형광 백색광의 12:12 시간 명/암 사이클에 순응시켰다. 복강내 주사에 의해 0.18㎖ DMSO 중의 20-50㎎/㎏ 메갈린 조절제를 8주 동안 1일 3회 만성 래트에 투여하였다. 대조군에게는 0.18㎖ DMSO를 복강내 주사하였다. 마지막 주사 후 이틀째에 래트를 절명시켰다. 50㎎/㎏의 최고 투여량에서도 효과가 관찰되지 않는 경우에는 더 많은 투여량으로 시험하였다.

급성 광-노출 연구를 위하여, 래트를 밤새 암-순응시킨 뒤, 암적색광하에서 0.18㎖ DMSO 중의 20-50㎎/㎏ 메갈린 조절제를 단일 복강내 주사하고 ERG 측정에 앞서 표백광에 노출시키기 전 1시간 동안 어두운 상태로 유지하였다. 래트를 2,000룩스(lux)의 백색 형광 빛에 48시간 동안 노출시켰다. 7 일후 ERG를 기록하고, 즉시 조직학 연구를 실시하였다.

래트를 안락사시키고 안구를 제거하였다. 양 반구(hemisphere)에 걸쳐 200㎛마다 외핵층 두께 및 간상체 외절(ROS) 길이의 원주 세포 수를 측정하고, 수치를 평균내어 전체 망막에 대한 세포 변화의 척도(measure)를 얻었다. 치료 4주 및 8주째에 만성 래트로부터 ERG를 기록하였다. 급성 설치류에서는, 표백광으로부터의 간상세포 회복은 추상세포에 대한 기여를 유발하지 않는 자극을 이용함으로써 암-순응 ERG에 의해 추적되었다. 추상세포 회복을 광순응 EGG로 추적하였다. ERG에 앞서, 동물을 암적색광하에서 준비하고 안락사시켰다. 동공을 확장시키고, 골드-와이어 각막 루프(gold-wire corneal loop)를 이용하여 양 안구로부터 ERG를 동시에 기록하였다.

실시예 5: 메갈린 조절제 및 펜레티나이드을 포함하는 병용 요법

추가의 두 처리군(arms)을 제외하고, 실시예 1-4에 개시된 방법으로 마우스 및/또는 래트를 시험하였다. 추가 처리군 중 하나에서, 마우스 및/또는 래트 군은 페레티나이드 용량을 1일당 5㎎/㎏에서 50㎎/㎏로 증가시키면서 처리하였다. 두 번째 추가 처리군에서, 마우스 및/또는 래트 군은 1일당 20 ㎎/㎏의 메갈린 조절제와 1일당 5㎎/㎏에서 50㎎/㎏로 증가시킨 용량의 페레티나이드를 병용하여 처리하였다. 병용 요법에 대한 이점을 실시예 1-4에 기술한 바와 같이 분석하였다.

실시예 6: RPE 세포내 레티놀 및 RBP 수준에 대한 메갈린 조절제의 효과

RPE 세포내 레티놀(또는 레티닐 에스테르) 및 RBP 수준을 HPLC 분석에 의해 측정한 것을 제외하고, 마우스 및/또는 래트를 실시예 1-4에 기술된 방법으로 시험하였다. 본 실험은 시험 대상 작용제에서 기인하는 조절 활성의 정도를 결정한다. 실험군과 대조군 간의 RPE 세포내 레티놀 및 RBP 수준의 직접적 비교는 RPE 세포 내에서 발현되는 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원에 대한 레티놀, 레티놀-RBP 또는 레티놀-RBP-TTR의 결합 및 흡수 억제에 관여하는 작용제의 직접적인 상관관계를 제공한다.

본원에 개시되거나 청구된 모든 방법은 본원의 개시된 내용에 비추어 과도한 실험 없이 실시할 수 있다. 본원의 개념, 사상 및 영역을 벗어나지 않으면서, 본 원에 기재된 방법, 단계들 또는 단계들 간의 순서에 다양한 변형이 가능하다는 것은 당업계의 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적으로나 생리학적으로 연관된 특정 약물이 본원에 기재된 약물을 대체하여 동일하거나 유사한 결과를 제공할 수 있다는 것은 자명한 사실이다. 이와 같이 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 상기와 같은 유사한 치환 및 변형은 상부된 청구범위에 의해 정의된 본 발명의 개념, 사상 및 영역에 속한다.

SEQUENCE LISTING <110> MATA, NATHAN L. HAN, YUN <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING OPHTHALMIC CONDITIONS VIA MODULATION OF MEGALIN ACTIVITY <130> 30851-709.201 <140> 11/767,426 <141> 2007-06-22 <150> 60/805,586 <151> 2006-06-22 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Phe Trp Thr Asp 1 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Tyr Trp Thr Asp 1 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 3 Asp Leu Leu Val Gly Asp Leu His Gly Arg 1 5 10 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 4 Leu Tyr Leu Val Glu Thr Lys 1 5 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 5 Ile Asp Val Val Asn Leu Glu Gly Asn Gln Arg 1 5 10 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 6 Val Thr Leu Ile Thr Glu Asn Leu Gly His Pro Arg 1 5 10 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 7 Asn Phe Leu Leu Phe Ser Ser Lys 1 5 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 8 Leu Gly His Val Asp Gln Met Thr His Pro Phe Gly Leu Thr Val Phe 1 5 10 15 Lys <210> 9 <211> 14 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 9 Val Thr Gly Ser Glu Asn Pro Leu Leu Val Val Ala Ser Arg 1 5 10 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 10 Val Phe Trp Ser Asp Leu Leu Gln Gly Lys 1 5 10 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 11 Gly Leu Ala Leu Asp Pro Arg 1 5 <210> 12 <211> 14 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 12 Asp Asn Ile Ile Phe Gly Ile Ser Leu Asp Pro Glu Val Lys 1 5 10 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 13 Ser Ile Glu Val Leu Thr Leu Lys 1 5 <210> 14 <211> 12 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 14 Thr Val Leu Val Ser Glu Gly Ile Val Thr Pro Arg 1 5 10 <210> 15 <211> 13 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 15 Leu Pro Thr Gln Pro Ser Gly Ile Ser Thr Val Val Lys 1 5 10 <210> 16 <211> 14 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 16 Gln Asn Ser Asn Ile Glu Pro Tyr Leu Ile Phe Ser Asn Arg 1 5 10 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 17 Leu Tyr Trp Ile Asp Ala Glu Lys 1 5 <210> 18 <211> 19 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 18 Lys Trp Leu Ile Thr Thr Gln Leu Asp Gln Pro Ala Ala Ile Ala Val 1 5 10 15 Asn Pro Lys <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 19 Phe Trp Thr Asp Gln Gly Lys Gln Pro Lys 1 5 10

Claims (25)

1. 포유동물의 눈 내 망막 및/또는 망막 색소 상피 세포내 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성을 조절하는 작용제의 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물의 눈에서 안질환을 치료하기 위한 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원이 메갈린(megalin) 또는 메갈린-관련 단백질인 치료 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원이 레티노이드 결합 단백질 수용체인 치료 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성이 하기 물질들로 구성된 군으로부터 선택된 제2 작용제에 대한 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 결합인 치료 방법: 비타민-결합 단백질, 지질단백질, 면역- 및 스트레스-관련 단백질, 스테로이드 호르몬 결합 단백질, 호르몬 및 전구체, 펩티드, 효소 및 효소 억제자, 알부민, 락토페린, 헤모글로빈, 후각자극물질-결합 단백질(odorant-binding protein), 트랜스씨레틴(transthyretin); 다염기성 약물 및 독소, RAP, 칼슘(Ca²⁺), 및 시토크롬 c.
5. 제1항에 있어서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성이 하기 물질들로 구성된 군에서 선택된 제2 작용제에 대한 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 결합인 치료 방법: 레티놀, 레티놀-RBP 복합체, 레티놀-RBP-TTR 복합체, 광수용체간 레티노이드 결합 단백질(IRBP), 레티놀-IRBP 복합체, 트랜스코발라민-비타민 B12, 트랜스코발라민-비타민 B12 결합 단백질, 비타민-D-결합 단백질, 아포리포단백질 B, 아포리포단백질 E, 아포리포단백질 J/클러스테린, 아포리포단백질 H; 면역글로불린 경쇄, PAP-1, β2-마이크로글로불린; 성 호르몬 결합 단백질-에스트로겐, 안드로겐 결합 단백질-안드로겐; 부갑상선 호르몬, 인슐린, 표피 성장 인자, 프로락틴, 씨로글로불린(thyroglobulin); 플라스미노겐 활성인자 억제자-1 (PAI-1), 유로키나아제-PAI-1, tPA-PAI-1, 프로-유로키나아제, 리포프로테인 리파아제, 플라스미노겐, β-아밀라아제, β1-마이크로글로불린, 리소자임; 알부민, 락토페린, 헤모글로빈, 후각자극물질-결합 단백질, 트랜스씨레틴; 아미노글리코시드, 폴리믹신(polymyxin) B, 아프로티닌, 트리코산틴(trichosanthin), 젠타마이신(gentamicin); RAP, Ca²⁺, 및 시토크롬 c.
6. 제1항에 있어서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성이 레티놀, 레티놀-RBP 복합체, 또는 레티놀-RBP-TTR 복합체에 대한 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 결합인 치료 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성이 레티노이드 결합 단백질에 대한 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 결합인 치료 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성이 하기 물질들로 구성된 군에서 선택된 제2 작용제의 트랜스시토시스(transcytosis)인 방법: 비타민-결합 단백질, 지질단백질, 면역- 및 스트레스-관련 단백질, 스테로이드 호르몬 결합 단백질, 호르몬 및 전구체, 펩티드, 효소 및 효소 억제자, 알부민, 락토페린, 헤모글로빈, 후각자극물질-결합 단백질, 트랜스씨레틴; 다염기성 약물 및 독소, RAP, 칼슘(Ca²⁺), 및 시토크롬 c.
9. 제1항에 있어서, 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 활성이 하기 물질들로 구성된 군에서 선택된 제2 작용제의 트랜스시토시스인 치료 방법: 레티놀, 레티놀-RBP 복합체, 레티놀-RBP-TTR 복합체, 광수용체간 레티노이드 결합 단백질(IRBP), 레티놀-IRBP 복합체, 트랜스코발라민-비타민 B12, 트랜스코발라민-비타민 B12 결합 단백질, 비타민-D-결합 단백질, 아포리포단백질 B, 아포리포단백질 E, 아포리포단백질 J/클러스테린, 아포리포단백질 H; 면역글로불린 경쇄, PAP-1, β2-마이크로글로불린; 성 호르몬 결합 단백질-에스트로겐, 안드로겐 결합 단백질-안드 로겐; 부갑상선 호르몬, 인슐린, 표피 성장 인자, 프로락틴, 씨로글로불린; 플라스미노겐 활성인자 억제자-1(PAI-1), 유로키나아제-PAI-1, tPA-PAI-1, 프로-유로키나아제, 리포프로테인 리파아제, 플라스미노겐, β-아밀라아제, β1-마이크로글로불린, 리소자임; 알부민, 락토페린, 헤모글로빈, 후각자극물질-결합 단백질, 트랜스씨레틴; 아미노글리코시드, 폴리믹신 B, 아프로티닌, 트리코산틴, 젠타마이신; RAP, Ca²⁺, 및 시토크롬 c.
10. 제1항에 있어서, 상기 작용제가 레티놀-결합 단백질에 결합하는 치료 방법.
11. 제1항에 있어서, 상기 작용제가 트랜스씨레틴에 결합하는 치료 방법.
12. 제1항에 있어서, 상기 작용제가 광수용체간 레티노이드 결합 단백질(Interphotoreceptor retinoid binding protein: IRBP)에 결합하는 치료 방법.
13. 제1항에 있어서, 상기 작용제가 상기 망막 및/또는 망막 색소 상피 세포에서 상기 LDL 수용체 유전자 패밀리 구성원의 발현을 조절하는 치료 방법.
14. 제1항에 있어서, 상기 작용제가 항체, 폴리펩티드, 핵산, 폴리핵산, 폴리머, 수용체 연관 단백질(Receptor associated protein: RAP) 또는 이의 단편, 저 분자 량 유기 화합물, 비타민-결합 단백질, 지질단백질, 면역- 및 스트레스-관련 단백질, 스테로이드 호르몬 결합 단백질, 호르몬 및 전구체, 펩티드, 효소 및 효소 억제자, 알부민, 락토페린, 헤모글로빈, 후각자극물질-결합 단백질, 트랜스씨레틴; 다염기성 약물 및 독소, RAP, 칼슘(Ca²⁺), 칼슘 스캐빈저, 환원제 및 시토크롬 c로 구성된 군에서 선택된 치료 방법.
15. 제1항에 있어서, 상기 작용제가 항체, 폴리펩티드, 핵산, 폴리핵산, 폴리머, 수용체 연관 단백질(RAP) 또는 이의 단편, 저 분자량 유기 화합물, 레티놀, 레티놀-RBP 복합체, 레티놀-RBP-TTR 복합체, 광수용체간 레티노이드 결합 단백질(IRBP), 레티놀-IRBP 복합체, 트랜스코발라민-비타민 B12, 트랜스코발라민-비타민 B12 결합 단백질, 비타민-D-결합 단백질, 아포리포단백질 B, 아포리포단백질 E, 아포리포단백질 J/클러스테린, 아포리포단백질 H; 면역글로불린 경쇄, PAP-1, β2-마이크로글로불린; 성 호르몬 결합 단백질-에스트로겐, 안드로겐 결합 단백질-안드로겐; 부갑상선 호르몬, 인슐린, 표피 성장 인자, 프로락틴, 씨로글로불린; 플라스미노겐 활성인자 억제자-1(plasminogen activator inhibitor-1: PAI-1), 유로키나아제-PAI-1, tPA-PAI-1, 프로-유로키나아제, 리포프로테인 리파아제, 플라스미노겐, β-아밀라아제, β1-마이크로글로불린, 리소자임; 알부민, 락토페린, 헤모글로빈, 후각자극물질-결합 단백질, 트랜스씨레틴; 아미노글리코시드, 폴리믹신 B, 아프로티닌, 트리코산틴, 젠타마이신; RAP, RAP 단편, Ca²⁺, 칼슘 스캐빈저, 환원제 및 시토크롬 c로 구성된 군에서 선택된 치료 방법.
16. 제1항에 있어서, 상기 작용제의 유효량을 반복하여 투여하는 단계를 추가로 포함하는 치료 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 투여 사이에서 1회 이상이 1주 이상인 치료 방법.
18. 제16항에 있어서, 상기 투여 사이에서 1회 이상이 1일 이상인 치료 방법.
19. 제1항에 있어서, 산화질소 생성 유도제, 항염증제, 생리학적으로 허용되는 항산화제, 생리학적으로 허용되는 미네랄, 음으로 하전된 포스포리피드, 카로티노이드, 스타틴(statin), 항혈관신생 약물, 매트릭스 메탈로프로테나아제 억제자, 13-시스-레티노산, 또는 화학식 (A)의 구조를 갖는 화합물로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 추가 작용제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 치료 방법:

    

    상기 화학식 (A)에서,

    X₁은 NR², O, S, CHR²으로 구성된 군에서 선택되고;

    R¹은 (CHR²)x-L¹-R³인데, 여기서

    x는 0, 1, 2, 또는 3이며; L¹은 단일 결합 또는 -C(O)-이고;

    R²는 H, (C₁-C₄)알킬, F, (C₁-C₄)플루오로알킬, (C₁-C₄)알콕시, -C(O)OH, -C(O)-NH₂, -(C₁-C₄)알킬아민, -C(O)-(C₁-C₄)알킬, -C(O)-(C₁-C₄)플루오로알킬, -C(O)-(C₁-C₄)알킬아민, 및 -C(O)-(C₁-C₄)알콕시로 구성된 군에서 선택된 부분이며;

    R³는 H 또는 (C₂-C₇)알케닐, (C₂-C₇)알키닐, 아릴, (C₃-C₇)시클로알킬, (C₅-C₇)시클로알케닐, 및 헤테로고리로 구성된 군에서 선택된, 1 내지 3개의 독립적으로 선택된 치환기들로 치환되거나 비치환된 부분이다.
20. 제19항에 있어서, 상기 화학식 (A)의 구조를 갖는 화합물은

    

    ; 또는 이의 활성 대사산물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 전구약물 또는 용매화물인 치료 방법.
21. 제19항에 있어서, 상기 화합물이 4-히드록시페닐레틴아미드; 4-메톡시페닐레틴아미드; 또는 이의 대사산물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 전구약물 또는 용매화물인 치료 방법.
22. 제1항에 있어서, 상기 포유동물에게 체외 유동술(extracorporeal rheopheresis), 제한된 망막 전위술(limited retinal translocation), 광역동요법(photodynamic therapy), 드루젠 레이저조사(drusen lasering), 황반 원공 수술(macular hole surgery), 황반 전위 수술, 파이-모션(Phi-Motion), 양성자 빔 치료, 망막 박리 및 유리체 수술, 공막 돌륭(Scleral Buckle), 황반하 수술(Submacular Surgery), 동공경유온열요법(Transpupillary Thermotherapy), 광계 I 요법, 미세전류 자극(MicroCurrent Stimulation), RNA 간섭, 안구 약물, 예컨대 포스포린 아이오디드 또는 에코치오페이트 또는 탄산탈수효소 억제자의 투여, 마이크로칩 이식, 줄기 세포 요법, 유전자 대체 요법, 리보자임 유전자 요법, 광수용체/망막 세포 이식, 레이저 광응고(laser photocoagulation), 및 침술로 구성된 군에서 선택된 요법을 시술하는 단계를 추가로 포함하는 치료 방법.
23. 제1항에 있어서, 망막 변성을 위한 추가의 치료제를 더 포함하는 치료 방법.
24. 제1항에 있어서, 상기 포유동물은 인간인 치료 방법.
25. 제24항에 있어서, 상기 인간이 스타가르트 질병, 열성 망막색소변성증(recessive retinitis pigmentosa), 열성 추체-간체 이영양증(recessive cone- rod dystrophy), 건성 연령관련 황반변성(dry-form age-related macular degeneration), 삼출성 연령관련 황반변성, 추체-간체 이영양증, 망막색소변성증, 리포푸신-계열(lipofuscin-based) 망막 변성, 광수용체 변성, 및 지도형 위축(geographic atrophy)으로 구성된 군에서 선택된 안과 질환 또는 형질(trait)을 지니는 치료 방법.

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