KR20090022308A

KR20090022308A - 무세포 단백질 합성을 이용한 트랜스아미나제의 활성스크리닝 방법 및 키트

Info

Publication number: KR20090022308A
Application number: KR1020070087566A
Authority: KR
Inventors: 김동명; 권용찬
Original assignee: 주식회사 핸슨바이오텍
Priority date: 2007-08-30
Filing date: 2007-08-30
Publication date: 2009-03-04
Also published as: KR100966655B1

Abstract

본 발명은 다종의 트랜스아미나제 유전자를 무세포 단백질 합성(cell-free protein synthesis)을 이용하여 동시 발현시킨 후, 아미노기 전이반응을 수행하고 발색반응을 통해 효소활성을 측정함으로써, 다종의 트랜스아미나제를 동시에 신속하게 스크리닝하는 방법 및 키트에 관한 것으로서, 기존의 단백질 발현 시스템에서 구현할 수 없었던 다종의 효소를 연쇄적으로 빠른 시간 내에 발현시켜 단백질 발현에 소요되는 시간, 비용 및 노동력을 최소화할 수 있을 뿐만 아니라, 복잡한 정제과정과 HPLC 등의 고가의 장비를 사용하지 않고도 육안으로 쉽게 효소활성을 확인할 수 있으므로, 트랜스아미나제 뿐만 아니라 산업적으로 유용한 여러 가지 효소의 활성 및 기질특이성을 신속하게 스크리닝할 수 있다.

트랜스아미나제, 무세포 단백질 합성, 중복 신장 PCR, 발색반응, 아민 공여체, 아민 수용체, 2,4-디니트로페닐히드라진

Description

무세포 단백질 합성을 이용한 트랜스아미나제의 활성 스크리닝 방법 및 키트{Methods and kits for screening activities of transaminases by using cell-free protein synthesis}

본 발명은 무세포 단백질 합성(cell-free protein synthesis)을 이용한 트랜스아미나제(transaminases)의 활성 스크리닝에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 다종의 트랜스아미나제 유전자를 무세포 단백질 합성을 이용하여 동시 발현시킨 후, 아미노기 전이반응(transamination)을 수행하고 발색반응을 통해 효소활성을 측정함으로써, 다종의 트랜스아미나제를 동시에 신속하게 스크리닝하는 방법 및 키트에 관한 것이다.

트랜스아미나제는 아미노기 전이효소로서, 생물체 내에서 생체대사를 위해 존재하고 있다. 또한 상기 효소는 각각의 효소에 따라 서로 다른 기질특이성을 가지고 있기 때문에, 다양한 아미노기 전이반응에 응용할 수 있는 장점을 가지므로 산업적으로 매우 유용한 효소이다. 트랜스아미나제는 생물체 내에 다량 존재하고 있으므로, 신규의 생물, 혹은 기존에 잘 알려져 있는 생물들이 보유하고 있는 트랜스아미나제의 기질특이성을 빠른 시간 내에 스크리닝해낼 수 있는 기술들이 연구되 고 있다. 지금까지는 대장균 숙주세포를 이용한 생체 내 과잉발현(overexpression)을 통해 목적하는 트랜스아미나제를 획득하고 이를 분리정제한 후, 얻어진 트랜스아미나제의 활성을 고성능액체크로마토그래피(High performance liquid chromatography, HPLC)를 이용하여 분석하는 방법을 사용하여 왔다. 그러나 트랜스아미나제를 얻어내기 위해 실시되는 대장균 숙주세포를 이용한 생체 내 단백질 발현에는 수일이 소요되며, 한 번에 다양한 종류의 목적단백질을 생산해낼 수 없기 때문에 현재 요구되고 있는 다종동시발현에는 적합하지 않다. 또한 복잡한 분리정제 과정을 거쳐야만 하므로 시간·비용·노동 소모적이기도 하다. 특히, 트랜스아미나제의 활성을 측정하기 위해 실시되는 HPLC에서는 아미노기 전이반응의 산물을 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-β-D-글루코피라노실-이소티오시아네이트(tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl isothiocyanate, GITC) 등으로 유도체화한 후 수십 분에 걸쳐 분석을 수행하여야 하므로 분석효율이 떨어질 수밖에 없다. 따라서 다종의 트랜스아미나제를 동시에 신속하게 합성하고, 그 효소활성을 신속 간편하게 분석할 수 있는 새로운 기술의 개발이 절실히 요청되어 왔다.

상기 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 지속적인 연구를 수행해온 결과, 무세포 단백질 합성기술을 이용하여 다종의 트랜스아미나제를 동시에 신속하게 합성하고, 합성된 트랜스아미나제의 활성과 기질특이성을 발색반응을 통해 신속하고 간편하게 스크리닝할 수 있는 방법을 개발해내고, 본 발명을 완성하기에 이르 렀다.

따라서 본 발명의 목적은 다종의 트랜스아미나제를 동시에 신속하게 발현하고 그의 활성 및 기질특이성을 스크리닝하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 다종의 트랜스아미나제를 동시에 신속하게 발현하고 그의 활성 및 기질특이성을 스크리닝하는 키트를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 제1면은

⑴ 복수의 트랜스아미나제 유전자를 각각 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 통해 증폭하여 무세포 단백질 합성을 위한 주형을 제조하고;

⑵ 상기 주형을 각각 무세포 단백질 합성용 반응액에 가하여 동시에 트랜스아미나제로 발현시키고;

⑶ 발현된 트랜스아미나제에 아민 공여체(amine donor) 및 아민 수용체(amine acceptor)를 가하여 아미노기 전이반응을 수행한 후, 발색반응을 통해 효소활성을 측정하는:

단계를 포함하는, 복수의 트랜스아미나제 활성을 동시에 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

단계 ⑴에서는, 각각의 트랜스아미나제 유전자를 중복 신장 PCR(overlap extension PCR)을 통해 5'-비번역부위(5'-Untranslated Region, 5'-UTR), 오픈리딩프레임(Open Reading Frame, ORF) 및 3'-비번역부위(3'-Untranslated Region, 3'- UTR)를 포함하도록 증폭하는 것이 바람직하다. 또한, 단계 ⑵에서는 트랜스아미나제의 동시 발현을 멀티-웰 플레이트(multi-well plate) 상에서 수행하는 것이 바람직하다. 단계 ⑶에서, 아민 공여체의 종류에 특별한 제한이 있는 것은 아니나, 예를 들어 벤질아민, 1-페닐에틸아민, 3-페닐-1-프로필아민, 4-페닐부틸아민, 프로필아민, 부틸아민, 아밀아민, 이소프로필아민, sec-부틸아민, β-알라닌, 3-아미노-n-부티르산, 페닐알라닌 및 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 사용할 수 있다. 또한, 아민 수용체의 종류에도 특별한 제한이 있는 것은 아니나, 예를 들어 피루베이트(pyruvate)나 키토산(chitosan), 특히 피루베이트를 사용하는 것이 바람직하다. 발색시약으로서는 당업계에 알려진 통상적인 것들 중 어느 것도 사용할 수 있으나, 예를 들어 2,4-디니트로페닐히드라진(2,4-dinitrophenylhydrazine)을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 제2면은

⑴ 복수의 트랜스아미나제 유전자로부터 각각 PCR을 통한 증폭에 의해 제조된 무세포 단백질 합성을 위한 주형; 및

⑵ 상기 주형으로부터 트랜스아미나제를 발현시키기 위한 무세포 단백질 합성용 반응액:

을 포함하는, 복수의 트랜스아미나제 활성을 동시에 스크리닝하기 위한 키트에 관한 것이다.

상기 주형은 각각의 트랜스아미나제 유전자를 중복 신장 PCR을 통해 5'-UTR, ORF 및 3'-UTR을 포함하도록 증폭하여 제조된 것이 바람직하다. 또한, 무세포 단 백질 합성용 반응액은 멀티-웰 플레이트의 각 웰 내에 존재하는 것이 바람직하다. 본 발명의 스크리닝 키트는 아미노기 전이반응을 위한 아민 수용체 및/또는 아민 공여체를 추가로 포함할 수 있다. 아민 공여체로는 벤질아민, 1-페닐에틸아민, 3-페닐-1-프로필아민, 4-페닐부틸아민, 프로필아민, 부틸아민, 아밀아민, 이소프로필아민, sec-부틸아민, β-알라닌, 3-아미노-n-부티르산, 페닐알라닌 및 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 사용할 수 있으나, 이들로 특별히 제한되는 것은 아니다. 아민 수용체로는 케톤 화합물, 예를 들어, 피루베이트나 키토산을 사용할 수 있으나, 이것으로 특별히 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 키트는 발색시약을 추가로 포함할 수 있다. 발색시약으로는 2,4-디니트로페닐히드라진을 사용할 수 있으나, 이것으로 특별히 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따르면, 기존의 단백질 발현 시스템에서 구현할 수 없었던 다종의 효소를 연쇄적으로 빠른 시간 내에 발현시켜 단백질 발현에 소요되는 시간, 비용 및 노동력을 최소화할 수 있을 뿐만 아니라, 복잡한 정제과정과 HPLC 등의 고가의 장비를 사용하지 않고도 육안으로 쉽게 효소활성을 확인할 수 있다. 따라서 무세포 단백질 발현과 더불어 발색반응을 통한 활성측정을 통해 트랜스아미나제 뿐만 아니라 산업적으로 유용한 여러 가지 효소의 활성 및 기질특이성을 신속하게 스크리닝할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서는, 다양한 미생물 유래의 트랜스아미나제를 무세포 단백질 합성 시스템에서 고속으로 발현하기 위하여 PCR을 통해 선형의 주형을 제조한다. 상세하게는, 트랜스아미나제의 유전정보를 포함하고 있는 다양한 미생물 유래의 오픈리딩프레임(ORF)을 PCR을 통해 프로모터와 터미네이터(예: T7 프로모터·터미네이터)를 포함하는 단백질의 형태로 번역가능한 선형 주형으로 증폭한다. 즉, 선형 주형은 무세포 단백질 합성 시스템에서 최적의 발현을 위해 프로모터와 터미네이터가 도입되도록 제조되며, 특별한 정제과정 없이 바로 단백질 발현에 적용할 수 있다. 상기 선형 주형을 단백질 발현의 주형으로 사용하여 무세포 단백질 합성 시스템을 통해 다종의 트랜스아미나제를 신속하게 합성할 수 있다. 상기 방법을 통해 트랜스아미나제 뿐만 아니라 어떠한 유전자 서열도 무세포 단백질 합성 시스템에서 효과적으로 발현되도록 주형을 제조할 수 있다. 이는 필요한 유전자 서열을 단백질의 형태로 신속하게 발현할 수 있도록 해줄 뿐만 아니라 주형의 제조에 있어서 유연성을 가지므로 선형 주형에 다양한 응용을 가할 수도 있다. 도 1에 본 발명에 따른 무세포 단백질 합성의 주형을 제작하는 방법을 모식적으로 나타내었다.

PCR을 통해 확보한 다종의 선형 주형을 무세포 단백질 합성 시스템에서 활성형으로 발현시킨다. 통상적으로, 무세포 단백질 합성을 위한 반응액은 목적 단백질의 합성을 위해 필요한 세포 소기관 및 인자를 포함하는 세포 파쇄액(cell lysate), 아미노산 혼합물, 단백질 합성 에너지원, 유전자 정보원 및 완충용액을 포함한다. 세포 파쇄액을 제조하기 위한 세포로는 대장균, 고초균, 밀배아, 쌀배아, 보리 배아, CHO 세포, 하이브리도마 세포 또는 망상적혈구 세포를 사용할 수 있고, 세포 파쇄액은 문헌 [Pratt, J.M. (1984) Coupled transcription-translation in prokaryotic cell-free systems. In: Hames, B.D., Higgins, S.J. (Eds.), Transcription and translation: a practical approach, IPL Press, New York, pp. 179-209]에 기재된 방법에 따라 제조된 S30 추출액(S30 extract), 한국등록특허 제0733712호(2007. 6. 29 공고)에 기재된 방법에 따라 제조된 S12 추출액 등일 수 있다. 아미노산 혼합물은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 시스테인, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파테이트, 글루타메이트, 아스파라긴 또는 글루타민으로부터 선택되는 L-아미노산의 혼합물이며, 단백질 합성 에너지원은 ATP, CTP, GTP, TTP 또는 UTP로부터 선택되는 하나 이상이고, 유전자 정보원은 목적 단백질을 코딩하는 DNA 또는 mRNA일 수 있다. 예를 들어, 무세포 단백질 발현은 멀티-웰 플레이트, 특히 96-웰 플레이트 상, 27~35 ℃, 특히 30 ℃ 항온배양기 내에서 1~5 시간, 특히 3 시간 동안 이루어질 수 있다. 도 2에 96-웰 플레이트 상에서 무세포 단백질 합성을 구현하는 방법을 모식적으로 나타내었다. 발현된 효소는 60% 이상의 용해도를 보이며, 초저준위 액체 섬광계수기(Liquid Scintillation Counter)를 이용하여 발현량에 대한 용해도를 측정한다.

효과적으로 발현된 트랜스아미나제의 효소활성은 아민 공여체와 아민 수용체를 첨가한 일련의 아미노기 전이반응을 수행한 후, 발색시약, 예를 들어 2,4-디니트로페닐히드라진과 아미노기 전이반응 이후에 잔존하는 아민 수용체, 예를 들어 피루베이트와의 친핵성 탈수 첨가반응으로 생성되는 2,4-디나이트로페닐히드라존의 발색을 이용하여 측정할 수 있다. 도 3에 아미노기 전이반응의 기작을, 도 4에 2,4-디니트로페닐히드라진과 케톤 화합물의 반응기작을 나타내었다. 또한, 도 5에 피루베이트의 농도에 따른 2,4-디니트로페닐히드라진의 발색을 나타내었다. 상기한 방법을 통해 특정 효소의 활성을 분석하기 위해 소요되었던 시간, 비용 및 노동력을 획기적으로 감소시킬 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 어떤 식으로든지 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1: 발현에 필요한 선형 주형의 제작

먼저 트랜스아미나제를 코딩하는 유전자의 시작 코돈(start codon) 다음의 서열부터 약 18개의 뉴클레오티드가 중복하고 5'-UTR과 중복하도록 순방향 프라이머(forward primers)를 제작하였다. 역방향 프라이머(reverse primers)는 정지 코돈(stop codon) 앞쪽 서열로부터 약 18개의 뉴클레오티드가 중복하고 3'-UTR과 중복하도록 역상보적으로 제작하였다. 상기 규칙에 따라, 각각의 유전자에 대해 상이한 프라이머를 제작하였다. 본 발명에 사용된 순방향 및 역방향 프라이머의 염기서열은 다음과 같다.

순방향 프라이머: 5'-TCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGG-3'(서열번호 1)

역방향 프라이머: 5'-CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'(서열번호 2)

사용된 15종의 트랜스아미나제 유전자를 표 1에 나타내었다.

ID	벡터	MW	기원
Ad	pHAWK	46.97	알칼리제네스 데니트리피칸스 (Alcaligenes denitrificans)
Cc	pHAWK	47.76	카울로박터 크레센투스 (Caulobacter crecentus)
Ml	pHAWK	48.18	메조리조비움 로티 (Mesorhizobium loti)
Ms	pHAWK	47.49	메조리조비움 sp (Mesorhizobium sp)
Tr	pHAWK	49.02	아그로박테리움 튜메파시엔스(Atu3300) (Agrobacterium tumefaciens(Atu3300))
Vf	pHAWK	50.26	비브리오 플루비알리스 JS17 (Vibrio fluvialis JS17)
Xc	pHAWK	48.45	잔토모나스 캄페스트리스 (Xanthomonas campestris)
0107	pET24ma	50.10	메조리조비움 로티
1207	pET24ma	50.20	메조리조비움 로티
1632	pET24ma	48.10	메조리조비움 로티
5990	pET23b	49.00	메조리조비움 로티
6101	pET24ma	51.10	메조리조비움 로티
6963	pET23b	51.20	메조리조비움 로티
7037	pET24ma	48.90	메조리조비움 로티
7127	pET23b	49.60	메조리조비움 로티

벡터 pHAWK는 로슈(Roche)사의 pIVEX 2.3d 벡터의 C-말단 6×히스티딘 태그를 제거하여 제조하였고, 벡터 pET24ma는 노바젠(Novagen)사의 pET24 벡터의 N-말단 6×히스티딘 태그를 제거하여 제조하였으며, 벡터 pET23b는 노바젠사의 제품을 사용하였다.

제작된 프라이머로 트랜스아미나제 유전자에 대해 1단계 PCR을 수행한 후, 1.5% 아가로스 젤 전기영동을 통해 정제하였다. 다음으로, 미리 제작해둔 5'-UTR및 3'-UTR과 1단계 PCR을 통해 얻은 산물을 이용하여 2단계 중복 신장 PCR을 수행하였다. 이렇게 획득한 산물은 T7 프로모터 이하 리보솜 결합위치(RBS), 시작 코돈, 트랜스아미나제 코딩 유전자, 정지 코돈 및 T7 터미네이터를 포함하는 일련의 발현 주형이 된다. 이를 별도의 정제 없이 바로 무세포 단백질 합성 시스템의 발현 주형으로 사용하였다.

실시예 2: 무세포 단백질 합성

일반적으로 무세포 단백질 합성은 마이크로튜브에서 이루어지나, 본 실시예에서는 무세포 단백질 합성을 96-웰 플레이트에서 수행하였다. 무세포 단백질 합성에 필요한 반응혼합물에 실시예 1에서 제조한 주형을 첨가하고, 배양기에서 배양하여 무세포 단백질 합성을 수행하였다. 무세포 단백질 합성을 위한 기본적인 반응액의 조성은 아래와 같았으며 총 15 ㎕의 반응을 수행하였다: 57 mM Hepes-KOH(pH 8.2), 1.2 mM ATP, 각각 0.85 mM의 CTP, GTP, UTP, 2 mM DTT, 0.17 ㎎/㎖ 대장균 tRNA(균주 MRE600로부터), 0.64 mM cAMP, 90 mM 포타슘 글루타메이트, 80 mM 암모늄 아세테이트, 12 mM 마그네슘 아세테이트, 34 ㎍/㎖ l-5-포밀-5,6,7,8-테트라하이드로폴산(폴린산), 각각 1.0 mM의 20종 아미노산, 2% 폴리에틸렌글리콜 8000, 67 mM 크레아틴 포스페이트(CP), 3.2 ㎍/㎖ 크레아틴 키나제(CK), 0.01 mM L-[U-¹⁴C]류신(11.9 GBq/mmol, 아머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences)), 6.7 ㎍/㎖ DNA, S30 추출액(상기 문헌 [Pratt, J.M. (1984)]에 기재된 방법에 따라 제조) 4 ㎕. 초저준위 액체 섬광계수기를 통해, 효소의 발현량이 500 ㎍~1 ㎎/㎖임을 확인하였다.

실시예 3: 아미노기 전이반응

발현된 효소의 활성을 측정하기 위하여, 아미노기 전이반응을 수행하였다. 아미노기 전이반응에는 표 2에 나타낸 12종의 아민 공여체가 사용되었으며, 아민 수용체로 피루베이트를 사용하였다.

96-웰 플레이트 상에서 발현된 효소에 최종농도 5~20 mM의 아민 공여체와 아민 수용체를 첨가한 후, 공동인자(cofactor)로 최종농도 0.2~0.3 μM의 피리독살-5-포스페이트(pyridoxal-5-phosphate, PLP)를 첨가하였다. 완충작용을 위하여 최종농도 50 mM의 pH 7.2의 포타슘 포스페이트 완충액을 첨가한 후 37 ℃의 진탕배양기(250 rpm)에서 1~8 시간 동안 아미노기 전이반응을 수행하였다.

실시예 4: 트랜스아미나제의 활성 측정

진탕배양기에서 아미노기 전이반응을 수행한 후, 전체 부피의 1/2이 되도록 2,4-디니트로페닐히드라진을 첨가하였다. 1~10 분 가량 상온에서 진탕이나 피펫팅을 수행한 후, 첨가한 2,4-디니트로페닐히드라진의 2배 부피의 2 N 소디움하이드록사이드를 첨가하였다. 이후 색의 변화를 측정하였다. 도 6에 비브리오 플루비알리스 유래 트랜스아미나제(Vf)에 의한 아미노기 전이반응의 시간에 따른 정반응 및 역반응 양상을 관찰한 결과를 나타내었다.

도 7에 표 1에 나타낸 15종의 트랜스아미나제와 표 2에 나타낸 12종의 아민 공여체를 사용한 아미노기 전이반응의 활성 측정결과를 나타내었다. 도 7에 나타난 바와 같이, 아그로박테리움 튜메파시엔스(Atu3300) 유래의 트랜스아미나제(Tr)와 비브리오 플루비알리스 유래 트랜스아미나제(Vf)는 벤질아민(S01)과 1-페닐에틸아민(S02)에 대해, 메조리조비움 로티 유래 트랜스아미나제(Ml)와 메조리조비움 로티 유래 트랜스아미나제(1632)는 β-알라닌(S10)과 3-아미노-n-부티르산(S11)에 대해 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 또한 메조리조비움 로티 유래 트랜스아미나제(1207)는 벤질아민(S01), 1-페닐에틸아민(S02), 3-페닐-1-프로필아민(S03), 4-페닐부틸아민(S04), 부틸아민(S06), 아밀아민(S07)에 대해 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.

도 1은 PCR을 통해 무세포 단백질 합성을 위한 주형을 제작하는 과정을 보여주는 모식도이고;

도 2는 96-웰 플레이트 상에서 무세포 단백질 합성을 구현하는 과정을 보여주는 모식도이며;

도 3은 아미노기 전이반응의 기작을 보여주는 도면이고;

도 4는 2,4-디니트로페닐히드라진과 케톤 화합물의 반응기작을 보여주는 도면이며;

도 5는 피루베이트의 농도(0~50 mM)에 따른 2,4-디니트로페닐히드라진의 발색반응을 보여주는 도면이고;

도 6은 비브리오 플루비알리스 유래 트랜스아미나제의 아미노기 전이반응의 시간(1~15 시간)에 따른 정반응 및 역반응의 양상을 2,4-디니트로페닐히드라진을 이용하여 검출한 결과를 보여주는 도면이며;

도 7은 15종의 트랜스아미나제와 12종의 아민 공여체를 이용하여 아미노기 전이반응을 수행한 후 활성을 측정한 결과를 보여주는 도면이다.

<110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> Methods and kits for screening activities of transaminases by using cell-free protein synthesis <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 1 tcgatcccgc gaaattaata cgactcacta tagg 34 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 2 caaaaaaccc ctcaagaccc gttta 25

Claims

⑴ 복수의 트랜스아미나제 유전자를 각각 중합효소연쇄반응(PCR)을 통해 증폭하여 무세포 단백질 합성을 위한 주형을 제조하고;

⑵ 상기 주형을 각각 무세포 단백질 합성용 반응액에 가하여 동시에 트랜스아미나제로 발현시키고;

⑶ 발현된 트랜스아미나제에 아민 공여체 및 아민 수용체를 가하여 아미노기 전이반응을 수행한 후, 발색반응을 통해 효소활성을 측정하는:

단계를 포함하는, 복수의 트랜스아미나제 활성을 동시에 스크리닝하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 ⑴에서 각각의 트랜스아미나제 유전자를 중복 신장 PCR(overlap extension PCR)을 통해 5'-비번역부위(5'-UTR), 오픈리딩프레임(ORF) 및 3'-비번역부위(3'-UTR)를 포함하도록 증폭하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 ⑵에서 트랜스아미나제의 동시 발현을 멀티-웰 플레이트 상에서 수행하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 ⑶에서 아민 공여체가 벤질아민, 1-페닐에틸아민, 3-페닐-1-프로필아민, 4-페닐부틸아민, 프로필아민, 부틸아민, 아밀아민, 이소프로필아민, sec-부틸아민, β-알라닌, 3-아미노-n-부티르산, 페닐알라닌 및 이들의 혼합 물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 단계 ⑶에서 아민 수용체가 피루베이트 또는 키토산인 방법.
제1항에 있어서, 단계 ⑶에서 발색시약이 2,4-디니트로페닐히드라진인 방법.
⑴ 복수의 트랜스아미나제 유전자로부터 각각 중합효소연쇄반응(PCR)을 통한 증폭에 의해 제조된 무세포 단백질 합성을 위한 주형; 및

⑵ 상기 주형으로부터 트랜스아미나제를 발현시키기 위한 무세포 단백질 합성용 반응액:

을 포함하는, 복수의 트랜스아미나제 활성을 동시에 스크리닝하기 위한 키트.
제7항에 있어서, 상기 주형이 각각의 트랜스아미나제 유전자를 중복 신장 PCR(overlap extension PCR)을 통해 5'-비번역부위(5'-UTR), 오픈리딩프레임(ORF) 및 3'-비번역부위(3'-UTR)를 포함하도록 증폭하여 제조된 것인 키트.
제7항에 있어서, 무세포 단백질 합성용 반응액이 멀티-웰 플레이트의 각 웰 내에 존재하는 키트.
제7항에 있어서, 아미노기 전이반응을 위한 아민 수용체, 아민 공여체, 또는 아민 수용체 및 아민 공여체를 추가로 포함하는 키트.
제10항에 있어서, 아민 공여체가 벤질아민, 1-페닐에틸아민, 3-페닐-1-프로필아민, 4-페닐부틸아민, 프로필아민, 부틸아민, 아밀아민, 이소프로필아민, sec-부틸아민, β-알라닌, 3-아미노-n-부티르산, 페닐알라닌 및 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 키트.
제10항에 있어서, 아민 수용체가 피루베이트 또는 키토산인 키트.
제7항에 있어서, 발색시약을 추가로 포함하는 키트.
제13항에 있어서, 발색시약이 2,4-디니트로페닐히드라진인 키트.