KR20090009268A - 검출 방법 및 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 금속염에 연결된 항원의 검출 및/또는 정량을 위한 방법에 관한 것이다. 항원은 다양한 항원의 혼합물, 예를들어 다가 백신 조성물에 존재할 수 있다. 본 발명은 본 발명의 방법에 사용하기 위한 키트를 추가로 제공한다.
Description
배경
본 발명은 금속염에 연결된 항원의 검출 방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 알루미늄 염, 예를들어 알루미늄 히드록시드 또는 포스페이트 또는 알루미늄 히드록시포스페이트 술페이트에 연결된 항원의 양을 검출하기 위한 방법에 관한 것이다.
예를들어, WO2004/038417 및 애봇(Abbott)사의 오스자임(Auszyme™) 키트에서와 같이 금속염에 연결된 항원을 검출하는데 사용될 수 있는 종래 당 분야의 방법이 공지되어 있고, 상기 둘 모두는 예를들어 알루미늄 히드록시드를 함유하는 B형 간염 백신의 분석에 사용될 수 있다.
정제된 재조합 B형 간염 표면 항원(HBsAg) 입자를 함유하는 B형 간염 백신은 전세계적으로 널리 사용되며, 통상적인 소아용 조합 백신의 성분으로 증가적으로 사용되고 있다. 이러한 백신의 품질 관리는 역가의 결정을 필요로 하고, 대부분은 현재 HBsAg 함량을 측정하는 시험관내 역가 분석을 이용하여 시험된다. 제조업체들은 제품 특이적인 분석법을 개발하였으나, 이들은 모두 시판되는 ELlSA 키트(애봇 래버러토리스(Abbott laboratories)사의 오스자임(Auszyme™) EIA 키트)에 주로 기초하며, 공인 시험을 위해 다수의 국립 관리 연구소에 의해 사용된다.
오스자임™ 키트는 퍼옥시다아제로 표지된 마우스 모노클로날 IgM 항-HBsAg 및 마우스 모노클로날 IgG 항-HBsAg로 코팅된 비드를 이용하는 샌드위치 기술을 기초로 하며, 이는 알루미늄 애쥬번트로부터의 HBsAg의 사전 탈착 없이 백신에 사용될 수 있다.
쿠바의 B형 간염 백신의 제조업체가 B형 간염 측정을 위한 간접적인 방법을 개발하였다 - 참조[Cuervo and Huerta, Validation of an in vitro potency test for the Cuban hepatitis B vaccine, Dev Biol (Basel). 2002; 111 :305-12 and Cuervo et al Bioiogicals 32, 2004, 171 - 176].
금속 또는 금속염에 연결된 항원의 검출, 특히 보다 큰 항원 조합물의 상황에서의 상기 항원이 검출을 위한 방법이 여전히 필요하다. 본 발명의 방법은 이러한 요구를 다룬다.
발명의 진술
첫번째 양태에서, 본 발명은 금속염에 연결된 항원의 검출 및/또는 정량을 위한 방법에 관한 것으로, 이러한 방법은, (1) 상기 항원과 이러한 항원에 특이적인 항체를 접촉시키는 단계; (2) 존재하는 임의의 항체가 고체 지지체 상의 항원과 함께 항체-항원 복합체를 형성하도록 하는 조건하에서, 상기 단계 (1)의 비결합된 임의의 항체와 고체 지지체에 연결된 항원을 접촉시키는 단계; 및 (3) 고체 지지체 상에 형성된 항체-항원 복합체를 검출하는 단계를 포함한다.
한 관련 양태에서, 본 발명은 알루미늄염에 연결된 B형 간염 항원의 검출 및/또는 정량을 위한 방법에 관한 것으로, 이러한 방법은, (1) 상기 항원과 이러한 항원에 특이적인 항체를 접촉시키는 단계; (2) 존재하는 임의의 항체가 고체 지지체 상의 항원과 함께 항체-항원 복합체를 형성하도록, 상기 단계 (1)의 비결합된 임의의 항체와 고체 지지체에 연결된 항원을 접촉시키는 단계; 및 (3) 고체 지지체 상에 형성된 항체-항원 복합체를 검출하는 단계를 포함한다.
또 다른 관련 양태에서, 본 발명은 금속염에 연결된 제 1 항원의 검출 및/또는 정량을 위한 방법에 관한 것으로, 상기 항원은 하나 이상의 다른(제 2) 항원과 조합되어 있으며, 상기 방법은, (1) 제 1 항원과 이러한 제 1 항원에 특이적인 항체를 접촉시키는 단계; (2) 존재하는 임의의 항체가 고체 지지체 상의 항원과 함께 항체-항원 복합체를 형성하도록, 상기 단계 (1)의 비결합된 임의의 항체와 고체 지지체에 연결된 항원을 접촉시키는 단계; 및 (3) 고체 지지체 상에 형성된 항체-항원 복합체를 검출하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 금속염에 연결된 항원의 검출 및/또는 정량을 위한 키트에 관한 것으로, 이러한 키트는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 설명서 및 하기로부터 선택된 하나 이상의 다른 성분을 포함한다:
(1) 검출되는 항원에 특이적인 항체(검출 항체);
(2) 고체 지지체에 연결되거나 연결되지 않은 항원;
(3) 고체 지지체 상에 형성된 임의의 항체-항원 복합체의 검출을 위한 검출 시약;
(4) 양성 대조군; 및
(5) 음성 대조군.
상세한 설명
본 발명은 항원이 금속염에 연결된 샘플에서 상기 항원의 함량을 간접적으로 측정하는 억제 분석에 관한 것이다. 이러한 방법은 ELISA 유형 분석에서 항체(예를들어, 폴리클로날 항체)를 이용한다. 요약하면, 관심 항원과 특이적으로 상호작용하는 항체가 항원-금속염 복합체를 함유하는 샘플과 접촉된다. 적절한 시간(항체가 샘플 내의 항원과 반응하는 시간) 후, 임의의 결합되지 않은 항체가 고체 지지체, 예를들어 ELISA 플레이트에 결합된 항원과 반응되도록 한다. 플레이트 상의 항원에 결합된 항체의 검출은 최초 항체-항원 샘플 반응으로부터 발생한 결합되지 않은 항체의 양을 나타낸다. 따라서, ELISA 방법에 의해 보다 많은 항체가 검출될수록, 본래의 항체-항원 반응 후에 보다 많은 결합되지 않은 항체가 존재하고, 본래의 샘플에 보다 적은 양의 항원이 존재하는 것이다.
이러한 방법은 ELISA 플레이트 내의 금속 성분의 존재로 인한 임의의 간섭을 감소시킨다.
따라서, 첫번째 양태에서, 본 발명은 금속염에 연결된 항원의 검출 및/또는 정량을 위한 방법에 관한 것으로, 이러한 방법은, (1) 상기 항원과 이러한 항원에 특이적인 항체를 접촉시키는 단계; (2) 존재하는 임의의 항체가 고체 지지체 상의 항원과 함께 항체-항원 복합체를 형성하도록, 상기 단계 (1)의 비결합된 임의의 항체와 고체 지지체에 연결된 항원을 접촉시키는 단계; 및 (3) 고체 지지체 상에 형성된 항체-항원 복합체를 검출하는 단계를 포함한다.
항원은 임의의 적절한 항원일 수 있다. 한 양태에서, 항원은 B형 간염 표면 항원이다. 본원에서는 B형 간염 항원을 이용하여 실험을 수행하였으나, 본 발명은 금속염에 연결된 다른 항원(애쥬번팅될 수 있음)에 적용가능하다. 따라서, 문맥에서 명백하게 달리 지시되지 않은 경우, 본원의 B형 간염 표면 항원(HBsAg)에 대한 임의의 언급은 특히 HBsAg를 포함하는 금속염에 연결될 수 있는 임의의 적절한 항원을 언급하는 것으로 해석된다.
본 발명의 금속염은 알루미늄, 아연, 철 또는 칼슘염, 예를들어 알루미늄 히드록시드, 알루미늄 포스페이트, 칼슘 포스페이트, 아연 히드록시드 또는 칼슘 히드록시드를 포함한다.
본원에서 용어 '항체'는, 예를들어 2개의 중쇄 및 경쇄를 지니는 무손상 항체에 관한 것이거나, 항체의 특정 항원 결합능 특성을 보유하고 당 분야에 널리 공지된 무손상 항체의 서브-단편, 예를들어 Fv 영역에 관한 것일 수 있다.
항원은 이러한 항원이 금속염으로 흡착되도록 하는 조건하에서 항원과 금속을 혼합시킴으로써 금속염에 연결될 수 있다. 이러한 조건은 당 분야에 널리 공지되어 있다 (참고문헌:[Vaccine. 2004 Mar 29;22(11-12): 1475-9, "Mechanism of adsorption of hepatitis B surface antigen by aluminium hydroxide adjuvant"]).
한 양태에서, 고체 지지체 상에 형성된 항체-항원 복합체는 항체, 한 양태에서 표지된 항체를 이용하여 검출된다. 한 양태에서, 항체는 항원-항체 복합체의 항체 부분, 예를들어 항체의 Fc 영역에 특이적이다.
본 발명은 백신에서 발견된 항원, 예를들어 알루미늄 히드록시드, 알루미늄 포스페이트 또는 알루미늄 히드록시포스페이트 술페이트에 흡착된 B형 간염 표면 항원의 존재 및 정량의 평가에 적합하다.
따라서, 본원에서 사용되는 용어 '알루미늄 포스페이트' 및 '알루미늄 히드록시드'의 의미는 백신을 애쥬번팅하기에 적합한 알루미늄 히드록시드 및 알루미늄 포스페이트의 모든 형태를 포함한다.
예를들어, 알루미늄 포스페이트는, 임의로 그러나 배타적이지는 않게, 가용성 알루미늄 염과 인산염을 혼합시킴으로써 제조될 수 있는 불용성 알루미늄 포스페이트의 침전물(무정형, 반-결정성 또는 결정성)일 수 있다. "알루미늄 히드록시드"는, 임의로 그러나 배타적이지는 않게, 알루미늄염의 용액을 중화시킴으로써 제조될 수 있는 불용성 알루미늄 히드록시드의 침전물(무정형, 반-결정성 또는 결정성)일 수 있다. 특히 적절한 것은, 시판되는 알루미늄 히드록시드 및 알루미늄 포스페이트 젤의 다양한 형태, 예를들어 수퍼포스(Superfos)(Vedbaek, 2950 Denmark)사에서 공급되는 알히드로젤(Alhydrogel)(알루미늄 히드록시드, 수중 3% 현탁액) 및 애쥬-포스(Adju-fos)(알루미늄 포스페이트, 염수중 2% 현탁액)이다.
따라서, 한 관련 양태에서, 본 발명은 알루미늄염에 연결된 B형 간염 항원의 검출 및/또는 정량을 위한 방법에 관한 것으로, 이러한 방법은, (1) 상기 항원과 이러한 항원에 특이적인 항체를 접촉시키는 단계; (2) 존재하는 임의의 항체가 고체 지지체 상의 항원과 함께 항체-항원 복합체를 형성하도록, 상기 단계 (1)의 비결합된 임의의 항체와 고체 지지체에 연결된 항원을 접촉시키는 단계; 및 (3) 고체 지지체 상에 형성된 항체-항원 복합체를 검출하는 단계를 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은 항원의 보다 큰 혼합물, 예를들어 다가 백신 조성물 내의 항원의 검출에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 B형 간염 항원과 디프테리아, 파상풍, 백일해, 비활성화된 폴리오(IPV); 헤모필루스 인플루엔자 b(Hib); 및 A형 간염(HA)으로 구성된 목록으로부터 선택된 하나 이상의 항원이 조합된, B형 간염 항원의 검출에 관한 것이다.
한 양태에서, 본 발명은, 예를들어 (1) A형 간염 항원; (2) 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 백일해 톡소이드, 섬유상 혈구응집소, 퍼탁틴, 폴리오바이러스 유형 1 (예를들어, 마호니(Mahoney)), 폴리오바이러스 유형 2 (예를들어, MEF-1), 폴리오바이러스 유형 3 (예를들어, 소켓(Saukett)); (3) 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 백일해 톡소이드, 섬유상 혈구응집소, 퍼탁틴; (4) 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 전세포(Whole cell) B. 백일해 항원; 또는 (5) 파상풍 톡소이드에 컨쥬게이션된 H. 인플루엔자 유형 b 폴리리보실 리비톨 포스페이트와 조합된 B형 간염 표면 항원의 검출에 관한 것이다.
한 양태에서, B형 간염 항원은 다수의 항원을 함유하는 조합 백신의 상황에서 알루미늄 포스페이트에 흡착된다. 참조로서 본원에 포함되는 WO93/24148호를 참조하라.
따라서, 한 양태에서, 본 발명은 금속염에 연결된 제 1 항체의 검출 및/또는 정량을 위한 방법에 관한 것으로, 상기 항원은 하나 이상의 다른(제 2) 항원과 조합되어 있으며, 상기 방법은, (1) 제 1 항원과 이러한 제 1 항원에 특이적인 항체를 접촉시키는 단계; (2) 존재하는 임의의 항체가 고체 지지체 상의 항원과 함께 복합체를 형성하도록, 상기 단계 (1)의 비결합된 임의의 항체와 고체 지지체에 연결된 항원을 접촉시키는 단계; 및 (3) 고체 지지체 상에 형성된 항체-항원 복합체를 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 한 추가 양태에서, 검출 및/또는 정량을 위한 방법은 단계 1로부터 결합되지 않은 항체가 단계 2 전에 결합된 항체로부터 분리되는 것이 수행되는, 상기 방법의 단계 1과 2 사이에 추가적인 방법의 단계를 포함한다. 분리는 당 분야에 널리 공지된 기술, 예를들어 본원의 실시예에 기술된 바와 같은 원심분리를 이용하여 수행될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 금속염에 연결된 항원의 검출 및/또는 정량을 위한 키트에 관한 것이다.
한 양태에서, 키트는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 설명서 및 하기로부터 선택된 하나 이상의 다른 성분을 포함한다:
(1) 검출되는 항원에 특이적인 항체(검출 항체);
(2) 고체 지지체에 연결되거나 연결되지 않은 항원;
(3) 고체 지지체 상에 형성된 임의의 항체-항원 복합체의 검출을 위한 검출 시약;
(4) 양성 대조군; 및
(5) 음성 대조군.
한 양태에서, 키트는 검출 항체로의 결합에 특이적인 항원 및 항체, 바람직하게는 표지된 항체로 미리 코팅된 플레이트를 포함한다. 한 양태에서, 플레이트는 B형 간염 표면 항원으로 코팅된다.
한 양태에서, 사용되는 항체는 B형 간염 검출의 경우 항-HBs 항체 (Nabi-HB™ - Nabi Biopharmaceuticals, Boca Raton, FL. USA)와 같은 인간 폴리클로날 항체이다.
본 발명의 방법의 개관이 도 1에 제공되고, 이러한 방법은 금속염에 연결된 항원의 분석에 일반적으로 적용될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 예시되며, 이는 본 발명을 제한하지는 않는다.
실시예 1
본 발명자들은 B형 간염 백신의 B형 간염 표면 항원(HBsAg) 함량을 결정하기 위한 제조업체 및 국립 관리 연구소에 의해 사용되는 오스자임(Auszyme™) 키트의 판매 중단으로 인해 대안적 억제 ELISA 방법을 개발하였다.
국제조화회의(The International Conference of Harmonization, ICH)에 따라 유효성 연구를 수행하였고, 4개의 관선의약관리시험소(Official Medicine Control Laboratories, OMCLs)에서 실행가능성 연구로 재현성을 평가하였다.
용량 반응 곡선은 60 내지 360ng/ml의 HBsAg의 범위에서 직선성(R2 > 0.99)을 입증하였다. 반복성(CV < 7%), 매개 정밀성(CV < 10%) 및 정확성(91-113% 회수율)은 오스자임™ 방법과 유사하였다. 상기 분석에서 사용된 시판되는 항체는 HBsAg의 보호 에피토프에 결합하는 것으로 나타났고, HBsAg에 대한 상기 방법의 특 이성이 입증되었다. 오스자임™ 방법과 양호하게 일치하였으나, 상기 ELISA는 보다 높은 결과를 발생시켰다(엔제릭스™-B(Engerix™-B) (n= 64)에 대해 25.3 vs. 24.4 μg/ml, 트윈릭스(Twinrix™) (n= 69)에 대해 28.9 vs. 27.0 μg/ml, 인펀릭스 펜타(Infanrix™ penta) (n= 62)에 대해 25.5 vs. 21.6 μg/ml). 상기 방법은 4개의 OMCL에 성공적으로 이전되었다.
본 발명자들은 상기 ELISA가 이의 소정의 목적에 적합하고, 국립 관리 연구소 및 기관에 의해 전세계적으로 사용되는 공통적인 방법으로 고려될 수 있음을 입증하였다.
1. 서문
정제된 재조합 B형 간염 표현 항원(HBsAg) 입자를 함유하는 B형 간염 백신은 전세계적으로 널리 사용되며, 통상적인 소아용 조합 백신의 성분으로 증가적으로 사용되고 있다. 이러한 백신의 품질 관리는 역가의 결정을 필요로 하고, 대부분은 현재 HBsAg 함량을 측정하는 시험관내 역가 분석을 이용하여 시험된다. 제조업체들은 제품 특이적인 분석법을 개발하였으나, 이들은 모두 유럽 약전[1]에 의해 권고되는 시판되는 ELlSA 키트(애봇 래버러토리스(Abbott laboratories)사의 오스자임(Auszyme™) EIA 키트)에 주로 기초하며, 공인 시험을 위해 다수의 국립 관리 연구소에 의해 사용된다. 그러나, 오스자임™ 키트는 애봇 래버러토리스사에 의해 판매 중단되었으며, 이에 따라 본 발명자들은 대안적인 ELISA 방법을 개발함으로써 상기 키트의 대체를 개시하였다.
오스자임™ 키트는 마우스 모노클로날 IgM 항-HBsAg로 코팅된 비드를 이용하 는 샌드위치 기술을 기초로 하며, 이는 알루미늄 애쥬번트로부터의 HBsAg의 사전 탈착 없이 백신에 사용될 수 있다. 이는 또한 신규한 ELISA 방법에서 샘플의 전처리를 회피하도록 설계되었다. 최초의 방법은 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 이용하는 샌드위치 ELISA를 개발하는 것이었다. 그러나, 마이크로플레이트로의 백신 애쥬번트의 고착으로 인한 비-특이적 결합의 문제점과 조우되었다. 또한, 애쥬번트 함량이 변하는, 다양한 B형 간염 항원 함유 조합 백신에 대해 HBsAg 값에서의 유의한 차이가 수득되었다. 이러한 문제를 억제하는 유일한 수단은 인간 폴리클로날 항체를 이용하여 HBsAg 함량을 간접적으로 측정함으로써 ELISA 플레이트 내의 애쥬번트의 존재로 인한 임의의 간섭을 감소시키는 억제 분석을 이용하는 것이다.
본 발명자들은 다양한 HBsAg 함유 백신을 공개하여 오스자임™ 키트의 판매 중단으로 인해 발생할 수 있는 백신 공급의 임의의 중지를 회피하는, 국립 관리 연구소에 의해 사용될 수 있는 표준 공인 방법의 대체를 제공할 것으로 생각되는 상기 신규한 ELISA에 대한 유효성 연구를 수행하였다.
2. 참여기관
대부분의 유효성 실험은 하나의 백신 제조업체에 의해 수행된 반면, 재현성을 평가하기 위한 협력 연구에는 4개의 관선의약관리시험소(OMCL)가 참여하였다. 이러한 OMCL은 다음과 같다: 벨기에의 공공위생과학연구원(Scientific Institute of Public Health, ISP), 프랑스의 건강제품위생안전기관(Sanitary Safety of Health Products Agency, AFSSAP), 독일의 파울 에를리히 연구소(Paul Ehrlich Institute, PEI) 및 영국의 국립생물제제표준화연구소(National Institute for Biological Standard and Control, NIBSC). 참여기관의 목록은 섹션 8의 레포트의 말기에 제공된다.
3. 재료 및 방법
3.1. 백신 샘플
본 실험에 사용된 모든 백신(표 1 참조)은 글락소스미스클라인(GSK) 바이올로지칼스(GlaxoSmithKline (GSK) Biologicals)사(Rixensart, Belgium)에서 제조되었다. 역가를 인공적으로 감소시키기 위해, 몇몇 백신 샘플을, 60℃에서 7일 또는 15일 동안 인큐베이션 또는 100 ppm의 과산화수소와 함께 37℃에서 밤새 인큐베이션에 의해 스트레스를 주었다. 처리 후, 샘플을 시험시까지 4℃에서 저장하였다.
3.2. 참조 백신
오스자임™ 방법 및 신규한 억제 ELISA 둘 모두에 사용된 참조 표준은 유럽 약전 B형 간염 백신(rDNA) BRP2b 참조이다. 이러한 참조는 로우리(Lowry) 단백질 분석으로 측정시 20 μg/ml의 HBsAg를 함유한다.
3.3. 인간 폴리클로날 항체
인간 폴리클로날 항-HBs 항체 (Nabi-HB™ - Nabi Biopharmaceuticals, Boca Raton, FL. USA)의 통상적인 제조물을 신규한 억제 ELISA 방법에 사용하였다. 이러한 제조물이 HBsAg의 보호 에피토프에 결합하는 항체를 함유하는지 확인하기 위해, RF1HBs 모노클로날 항체를 이용한 경쟁 분석으로 시험하였다. RF1HBs 항체는 감수성 침팬지에서 HBV의 감염능을 차단하는 것으로 나타났다[2,3].
고정량(6.25ng/ml)의 비오티닐화된 RF1 모노클로날 항체(mAb)를 함유하는 완 충제에서 시험 샘플의 2배 희석을 수행하고, HBsAg 코팅된 플레이트에서 37℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션시켰다. 세척 단계 후, 포화 완충제에서 희석된 스트렙타비딘-HRP 암덱스(Amdex) (Amersham, Uppsala, Sweden) 복합체를 웰에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 이후, 플레이트를 세척하고, 22℃에서 10분 동안 테트라메틸벤지딘 기질의 용액과 함께 인큐베이션시켰다. H2SO4를 이용하여 반응을 중지시켰다. RF1-유사 항체 항체의 양에 대해 역비례하는 광학 밀도(OD)(경쟁 분석)를 분광광도법(450 nm)에 의해 측정하였다.
3.4. 신규한 억제 ELISA를 이용한 HBsAg 함량의 결정
본 방법의 개관이 도 1에 제공된다. 0.1% BSA 및 0.1% Tween 20을 함유하는 PBS로 표준 및 백신 샘플을 희석시켰다. 세포 배양을 위한 그레이너 바이오-원(Greiner Bio-One) 플레이트(Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany)에서 100 μl의 각각의 희석액을 100 μl의 고정량의 인간 폴리클로날 항-HBs 항체 (± 170 mIU 항-HBs/ml) (Nabi-HB™ - Nabi Biopharmaceuticals, Boca Raton, FL. USA)와 함께, 교반하에서 25℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 이후, 플레이트를 2000 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 상층액을 1 μg/ml의 HBsAg (GSK)로 4℃에서 밤새 코팅된 후, PBS-1% BSA로 코팅된 ELISA 플레이트(Maxisorp immuno-plate from NUNC, Roskilde, Denmark)로 옮겼다. 이후, 플레이트를 교반하에서 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다.
세척 후, 퍼옥시다아제(Sigma-Aldrich, St-Louis, MO. USA)로 표지된 100 μ l의 염소 항-인간 IgG 항체의 1/10000 희석액을 각각의 웰에 첨가하였다. 이후, 플레이트를 교반하에서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, 세척하였다. 결합 항체의 양을 기질로서 테트라메틸벤지딘/과산화수소 용액을 첨가함으로써 비색 측정하였다. 실온에서 어두운 곳에서의 20분의 인큐베이션 후, H2SO4를 첨가하여 반응을 중지시키고, 450 nm에서 OD 판독하였다. 측정된 OD는 공지되지 않은 샘플의 HBsAg의 양에 역비례한다.
3.5. 오스자임™ EIA 키트를 이용한 HBsAg 함량의 결정
본 방법은 애봇(Abbott)사의 오스자임™ ELISA 키트 (Abbott Laboratories, Chicago, IL. USA)를 이용하며, 이는 B형 간염 백신(rDNA)의 분석을 위한 유럽 약전 방법 B였다 [1].
간단히, 백신을 0.2% BSA를 함유하는 PBS 중에 희석시켰다. 희석액을 모노클로날 항-HBs 항체로 코팅된 플라스틱 비드와 함께 인큐베이션시켰다. 40℃에서 3시간의 인큐베이션 후, 비드를 세척하고, 퍼옥시다아제로 표지된 모노클로날 항-HBs 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 실온에서 30분의 인큐베이션 후, 비드를 세척하였다. 결합된 HBsAg의 양을 기질로서 오르토-페닐렌-디아민/과산화수소를 첨가함으로써 비색 측정하였다. H2SO4를 첨가하여 반응을 중지시킨 후, 490 nm에서 OD를 판독하였다. 측정된 OD는 공지되지 않은 샘플 내의 HBsAg의 양에 비례한다.
3.6. 시험관내 역가의 계산
둘 모두의 분석을 위해, 시험 샘플의 HBsAg 함량을 평행선 분석의 통계적 방 법을 이용하여 계산하였다 [4]. 일련의 희석액에 기초하여, 샘플 희석액의 직선성 및 표준 곡선에 비한 반응의 평행성에 대한 p 값을 각각의 역가 결과에 대해 결정하였다. 직선성 및 평행성 둘 모두에 대한 p 값이 0.05보다 높은 경우 결과가 유효한 것으로 간주하였다. p 값이 0.05 미만인 경우, 결과가 유효하지 않은 것으로 간주하였고, 반복 결정을 수행하였다.
3.7. 용량-반응 범위
통상적인 실시에서, 360, 300, 240, 180, 120 및 60 ng HBsAg/ml의 참조 표준을 함유하는 용량-범위 곡선을 각각의 결정에 대해 확립시켰다. 시험 샘플을 이에 따라 희석하였다.
역가 값을 계산하기 위해 사용된 평행선 분석은 곡선 용량/반응의 직선부만 이용한다. 참조 표준 및 샘플에 대한 용량 반응 곡선이 통상적인 시험에서 사용된 가장 많은 용량과 가장 적은 용량 사이에서 선형임을 나타내기 위해, 참조 제조물, 및 엔제릭스™-B(Engerix™-B), 트윈릭스(Twinrix™) 및 인펀릭스(Infanrix™) 펜타 백신 (표 1 참조) 각각의 하나의 로트(lot)를 점진적으로 희석시킴으로써 실험을 수행하였다. 두배 연속 방식으로, 참조에 대해 19.5 ng/ml의 HBsAg 농도에 해당하는 1:1024로 희석을 수행하였다. 각각의 샘플을 이중으로 시험하였다.
3.8. 정량 한계(LOQ)
샘플의 계산에 사용된 OD 값이 참조 표준에 대해 수득된 가장 높은 OD 값과 가장 낮은 OD 값 사이에 존재하여야 하므로, 유효한 정량을 가능케 하는 가장 낮은 항원 농도는 정량 범위에 대해 결정된 가장 낮은 값이다.
3.9. 검출 한계(LOD)
6개의 독립적 실험에서 6회로 블랭크(blank) 샘플(PBS, Tween 0.1%, BSA 0.1%)을 분석하고, 평균 OD 값 및 표준 편차를 계산함으로써 분석 백그라운드 반응의 크기 측정을 수행하였다. 분석 블랭크의 평균 OD - 3개의 표준 편차를 계산하였다. 이후, 이러한 OD 값을 참조를 이용하여 확립된 표준 곡선의 방정식에 도입시켰고, 이는 방정식 y = ax + b (y = 광학 밀도, x = log 농도, a = 교정 곡선의 기울기, b = 절편)를 이용한 회귀 분석에 의해 당량 역가의 결정을 가능케 한다. 희석액에 대한 교정 후, 분석 백그라운드 반응을 수득하기 위해 LOD 값을 계산하였다.
3.10. 직선성 및 평행성
LOD를 결정하기 위한 참조 표준을 이용하여 확립된 6개의 표준 곡선의 선형 상관계수를 직선성을 결정하는데 사용하였다. 또한, 상기 언급된 바와 같이, 평행선 분석 동안 각각의 샘플에 대해 직선성 및 평행성에 대한 p 값을 계산하였다.
3.11. 정밀성
반복성(분석내 정밀성)을 평가하기 위해, 엔제릭스™-B, 트윈릭스™ 및 인펀릭스™ 펜타 백신의 각각의 3개의 로트를 동일한 실험으로 6회 시험하였다.
매개 정밀성(분석내 정밀성)을 평가하기 위해, 엔제릭스™-B, 트윈릭스™ 및 인펀릭스™ 펜타 백신의 각각의 3개의 로트를 4개월에 걸쳐 3명의 기술자에 의해 6회의 독립적인 실험으로 시험하였다. 시약의 로트간 변이성(inter-lot variability)을 고려하여 Nabi-HB™의 두개의 상이한 로트를 이용하여 유효성을 수 행하였다. 둘 모두의 로트는 동일한 역가의 항-HBsAg를 지녔고, 따라서 동일한 희석으로 사용하였다.
재현성(실험실간 정밀성)을 평가하기 위해, 엔제릭스™-B, 트윈릭스™ 및 인펀릭스™ 펜타의 각각의 하나의 로트를 본 발명자의 실험실 및 4개의 유럽 OMCL에서 병행 시험하였다: 각각의 실험실에는 HBsAg 및 참조 시약이 코팅된 Nabi-HB™이 공급되었으며, 3개의 독립적인 기간으로 각각의 백신 로트를 시험하였다.
모든 정밀성 결과를 변동 계수 (표준 편차/평균 x 100)로 나타내었다.
3.12. 정확성
공지된 양의 표준을 엔제릭스™-B, 트윈릭스™ 및 인펀릭스™ 펜타 백신에 첨가함으로써 수행된 회수율 실험으로 정확성을 평가하였다. 로우리 방법에 의해 20 μg HBsAg/ml의 값으로 지정된 참조를 각각 5 μg, 10 μg 및 15 μg의 HBsAg (250 μl, 500 μl 및 750 μl에 상응함)를 지니는 시험 샘플을 스파이킹(spiking)하기 위해 사용하였다. 동시에, 대조군으로서 250 μl, 500 μl 및 750 μl 의 희석액을 첨가한 후에 시험 샘플을 시험하였다. 회수 백분율을 하기와 같이 계산하였다:
[실험치스파이킹됨 / (실험치스파이킹 되지 않음 + 스파이크의 이론치] x 100.
3.13. 특이성
위약 및 HBsAg를 함유하지 않는 백신을 시험함으로써 특이성을 평가하였다. 엔제릭스™-B 및 인펀릭스™ 펜타의 위약을 시험함으로써 알루미늄 애쥬번트(즉, Al(OH)3 및 AlPO4)로의 Nabi-HB™ 시약의 비특이적 결합을 검사하였다. 둘 모두의 위약을 순수한 위약(neat), 1:2, 1:4, 및 1:8로 시험하였다.
Nabi-HB™ 시약과 다른 백신 항원 사이의 교차-반응성의 결핍을 확인하기 위해, HBsAg를 함유하지 않는 다양한 백신(표 1 참조)을 순수한 백신, 1/10, 1/20 및 1/83 (백신을 시험하기 위해 사용된 가장 낮은 희석)로 시험하였다. 둘 모두의 위약을 또한 본 실험에서 추가하였다. 동시에, 엔제릭스™-B 백신의 2개의 로트를 1/83의 희석으로 시험하였다.
3.14. 오스자임™ 방법을 이용한 브릿징(bridging)
엔제릭스™-B, 트윈릭스™ 및 인펀릭스™ 펜타 백신의 로트에 대해 신규한 ELISA 및 오스자임™ 방법 둘 모두에 의해 HBsAg 함량을 결정하였다. 대응표본 t-검정(paired t-test)에 의해 결과를 비교하였다.
일반 시판 범위의 가장 낮은 극단 및 가장 높은 극단의 역가 값을 측정하는 두 방법의 능력을 또한 평가하였다. 이는 스트레스 처리(섹션 2.1 참조)에 의해 유도된 감소된 역가를 지니는 백신 로트 및 티오머살의 제거로 인한 보다 높은 역가 (10 내지 20 μg/ml의 HBsAg를 함유하는 후보 티오머살 비함유 백신의 진전 로트(development lot)) 또는 증가된 항원 함량 (표 1의 펜드릭스(Fendrix™) 참조)을 지니는 로트의 시험을 포함하였다.
4. 결과
4.1. 방법의 확실성
분석 발달 동안, 분석 확실성에 중요한 하기 파라미터를 확인하였다. 첫째로, 밤새의 인큐베이션 동안 애쥬번트로의 항체의 비특이적 결합을 회피하기 위해서는 희석 완충제 중의 BSA의 존재가 중요하다. 둘째로, 이러한 밤새의 인큐베이션 동안, 흡착된 Ag와 항체 사이의 정확한 상호작용을 가능케 하기 위해 마이크로플레이트의 교반이 또한 중요하다. 마지막으로, ELISA 플레이트 내의 애쥬번트의 존재를 회피하기 위해 밤새의 인큐베이션 후의 원심분리 단계가 중요하다. 이러한 원심분리는 실온에서의 30분 이상의 침전(이 또한 유효함, 데이터는 나타내지 않음)으로 대체될 수 있다.
4.2. 인간 폴리클로날 항체(Nabi-HB™)의 특성규명
도 2는 양성 대조군(엔제릭스™-B 백신으로 예방 접종된 환자의 혈청의 풀(pool)) 및 음성 대조군(비-관련 백신으로 주사된 환자의 혈청의 풀)에 비한, Nabi-HB™ 인간 폴리클로날 항체 용액에 대한 보호 RF1 모노클로날 항체에 대한 경쟁 분석의 결과를 도시한다. 이러한 분석에서, 시험 샘플 내에 존재하는 항-HBs 항체는 HBsAg로의 결합에 대해 고정량의 비오티닐화된 항-RF1 mAbs와 경쟁한다. 따라서, OD는 항-RF1 mAbs와 동일한 에피토프로의 항체 결합의 양에 역비례한다. 결과는 Nabi-HB™ 제조물 내의 RF1-유사 보호 항체의 수준이 엔제릭스™-B 백신 접종자로부터의 혈청의 풀에서 발견되는 수준과 유사함을 입증한다.
4.3. 용량-반응 범위
도 3에 나타낸 용량-반응 곡선은 lin/log 변환된 형태(Y-축에 OD 및 로그 스케일의 X-축에 역 희석)로 작도시 특징적인 S자형 형태를 나타낸다. 그래프는 통 상적인 실시에서 사용된 HBsAg 농도에 해당하는 희석에 대해 선형이다 (즉, 표준 제조물에 대해서는 360 및 60 ng/ml, 및 시험 제조물에 대해서는 240 및 60 ng/ml).
4.4. 정량 한계
샘플의 계산에 사용된 OD 값은 참조 표준에 대해 수득된 가장 낮은 OD 값과 가장 높은 OD 값(60 및 360 ng/ml에 해당함)사이에 존재하여야 하므로, 유효한 정량을 가능케 하는 가장 낮은 항원 농도는 60 ng/ml이다.
4.5. 검출 한계
표 2는 6개의 독립적인 실험으로부터 추정된 LOD 값이 35 ng/ml임을 나타낸다.
4.6. 직선성 및 평행성
표 2에 나타난 바와 같이, 6개의 표준 곡선에 대한 선형 회귀의 상관 계수의 값은 모두 0.99를 초과하였고, 이에 의해 60 내지 360 ng/ml의 분석 범위에 대한 직선성을 입증하였다. 또한, 직선성 및 평행성 둘 모두에 대한 p의 값이 0.05를 초과하는 경우에만 역가 값이 유효한 것으로 간주하였다. 이러한 유효성 기준을 이용한 준수는 보통 95%를 초과하고(데이터는 공개하지 않음), 본 연구에서는 수득된 모든 역가 값이 유효하였다.
4.7. 반복성 및 매개 정밀성
6회 시험된 엔제릭스™-B, 트윈릭스™ 및 인펀릭스™ 펜타의 각각의 3개의 로트에 대한 반복성 (분석내 정밀성)을 표 3에 제시하였다. 반복성에 대한 CV 값 은 모두 7% 미만이었다.
표 4는 6회의 독립적인 실험으로 시험된 엔제릭스™-B, 트윈릭스™ 및 인펀릭스™ 펜타의 각각의 3개의 로트에 대한 매개 정밀성(분석내 정밀성)을 나타낸다. 매개 정밀성에 대한 CV 값은 모두 10% 미만이었다.
4.8. 재현성
본 발명자의 실험실 및 4개의 OMCL 사이에서의 재현성에 대한 협력 연구의 결과를 표 5에 제시하였다. 몇몇, 특히 한 실험실에서의 결과는 유효성 기준 (주로 직선성 및 평행성)을 이용하지 않은 미준수로 인해 유효하지 않았다. 그러나, 모든 유효한 결과로부터 계산된 CV는 엔제릭스™-B 및 트윈릭스™에 대해서는 10% 미만이었고, 인펀릭스™ 펜타에 대해서는 15% 미만이었으며, 이는 4개의 OMCL로의 본 발명의 방법의 이전성을 입증한다.
4.9. 정확성
정확성 측정의 결과를 표 6에 제시하였다. 수득된 회수 값 백분율은 91% 내지 113%의 범위였다.
4.10. 특이성
예비 실험은 1:2, 1:4 및 1:8의 희석의 엔제릭스™-B 및 인펀릭스™ 펜타의 알루미늄 위약에 대해 관찰된 OD 값이 분석 블랭크에 대해 통상적으로 관찰되는 것보다 낮음(표준 곡선은 [HBsAg]에 대해 역 관계임)을 나타내었다. 그러나, 백신을 시험하는데 사용된 가장 낮은 희석(1:83)에서, 비특이적 결합이 관찰되지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 이는 1:10으로부터의 위약 희석액의 OD 값이 블랭크와 유사한 것으로 나타난 또 다른 실험(표 7)에서 수득된 위약 결과에 의해 확인되었다. 따라서, Nabi-HB 시약은 높은 농도에서 알루미늄에 비특이적으로 결합하지만, 백신 샘플을 시험하는데 통상적으로 사용되는 희석에서 비특이적 결합은 관찰되지 않았다.
표 7은 또한 HBsAg를 함유하지 않는 백신에 대한 데이터를 나타낸다. 예상되는 바와 같이, 모든 희석되지 않은 백신 샘플(알루미늄염에 흡착되지 않은 유일한 백신인 히베릭스(Hiberix™) 제외)은 블랭크의 평균 OD 값을 초과하는 평균 OD 값을 지녔다. 그러나, 1:10 이상으로 희석되는 경우, 비-HBsAg 백신 성분에 대한 비특이적 결합 및/또는 교차-반응성의 증거가 존재하지 않았다.
4.11. 오스자임™ 방법을 이용한 브릿징
엔제릭스™-B (64개의 로트), 트윈릭스™ (69개의 로트) 및 인펀릭스™ 펜타 (62개의 로트)의 다양한 시판 로트에 대한 상기 두 방법을 이용하여 결정된 역가 결과를 표 8에 나타내었다. 종합적으로, 상기 3개 모두의 백신에 대한 상기 두 방법 사이에 양호한 일치가 존재하였으나, 신규한 ELISA 방법이 대체로 보다 높은 결과를 발생시켰다(대응표본 t-검정에 의해 결정시 상기 3개의 백신에 대해 유의하게 상이함, p<0.01). 도 4는 스트레스 처리에 의해 유도된 감소된 역가를 지니는 로트, 및 티오머살의 제거 및 보다 높은 항원 함량으로 인한 보다 높은 역가를 지니는 로트(펜드릭스™)를 포함하여 시험된 상이한 유형의 백신에 대해 상기 두 방법 사이의 상관관계를 나타낸다. 상관 계수는 0.76이었고, 정상 보다 약한 역가, 정상 범위 역가 및 높은 역가 로트 사이에 명백한 차이가 존재하였다.
5. 논의
B형 간염 백신의 HBsAg 함량을 결정하기 위해 제조업체 및 국립 관리 연구소에 의해 사용된 오스자임™ 키트의 판매 중단으로 인해, 본 발명자들은 대안적인 억제 ELISA 방법을 개발하였다. ELISA는 애쥬번트로부터의 항원의 사전 탈착 없이 백신을 시험하는 것을 가능케 하고, 기존에 사용된 것과 동일한 BRP 참조를 이용하여 다양한 조합의 백신에 적용되는 것을 가능케 하도록 고안되었다.
본 연구의 목적은 본원에 제안된 ELISA가 이의 목적에 적합한지 입증하기 위한 것이다. 첫째로, 상기 분석에 의한 HBsAg의 정량이 백신 역가의 관련 수단임을 나타내는 것이 중요하다. 본 발명자들은 이를 상기 분석에 사용된 인간 폴리클로날 항-HBs 항체(Nabi-HB™)의 시판 제조물이 HBsAg의 보호 에피토프에 결합하는 항체를 함유하고, 보호 항체의 수준이 B형 간염 백신 접종자로부터의 혈청에서 발견된 것과 유사하다는 것을 입증함으로써 확립하였다.
이후, 본 발명자들은 국제조화회의(ICH)에 따른 분석으로 유효성 연구를 수행하였다[5]. ELISA의 성능 특성이 시험된 모든 B형 간염 함유 백신에 대해 만족스러운 것으로 밝혀졌다. ELISA의 반복성, 매개 정밀성 및 정확성은 오스자임™ 키트에 기초한 기존의 방법의 것과 유사하였다[1]. 본원에 제안된 ELISA의 감수성은 낮았으나(오스자임™ 방법에 대한 60 ng/ml의 LOQ 대 2.5 ng/ml), 대부분의 백신이 10-20μg/ml의 HBsAg를 함유함에 따라, 이는 분석의 소기의 사용에 영향을 미치지 않는다. 사실, 보다 낮은 감수성은 필요한 희석 단계의 수를 감소시킴으로써 잠재적 오류 및 변이성을 최소화시키는 이점을 부여할 수 있다.
본 발명자들은 본원에 제안된 ELISA가 기타 백신 항원의 존재하에서 HBsAg를 특이적으로 측정할 수 있음을 밝혀내었고, 이는 HBsAg가 조합 백신의 성분으로서 증가적으로 사용됨에 따라 중요하다. 본 발명자들은 또한 알루미늄에 대한 Nabi-HB™ 시약의 비특이적 결합이 존재하지만, 이는 상기 분석에 사용된 희석 범위에서 간섭하지 않음을 입증하였다.
엔제릭스™-B, 트윈릭스™ 및 인펀릭스™ 펜타의 각각의 60개 초과의 로트를 이용하여 수행된 오스자임™ 방법을 이용한 브릿징 연구는 상기 두 방법 사이에서 양호한 일치를 나타내지만, 본원에 제안된 ELISA 방법이 대체로 보다 높은 결과를 발생시키는 것을 나타내었다. 몇몇 백신에 대해, 이러한 차이는 방출 내역(release specification)의 교정이 고려되어야 한다. 두 방법 사이의 상관관계는 또한 정상 보다 약한 역가 로트 및 높은 역가 로트의 확인을 가능케 하였다 (티오머살을 함유하지 않은 로트를 포함함, B형 간염 백신 제형으로부터 티오머살의 제거는 역가를 증가시키는 것을 관찰하였음(데이터는 공개하지 않음)).
4개의 관선의약관리시험소(Official Medicine Control Laboratories, OMCLs)에서의 병행 시험은 상기 방법이 다른 연구소에 용이하게 이전될 수 있음을 나타내었다. 항원 및 참조 시약으로 코팅된 Nabi-HB™과 함께 시험 프로토클이 금방 공급된 참여 연구소에서 트레이닝이 없었다. 그 결과로, 약간 유효하지 않은 결과가 관찰되었으나, 추가의 연습 및 파라미터의 미세한 조율이 이를 감소시킬 것이다. 기타 제조업체로부터의 백신에 대해 참여 연구소의 일부에 의해 수행된 예비 시험도 유망하였다. 결과(데이터는 공개하지 않음)는 시험이 동종 참조의 이용 및 정 량 범위의 변경에 의해 다른 제조업체로부터의 백신에 사용하기 위해 잠재적으로 적합될 수 있음을 나타내었다.
용이하게 이용가능한 시약을 이용하는 본원에 제안된 ELISA의 성공적인 재현 및 이의 다른 제조업체로부터의 백신에 적용되는 잠재성은 국립 관리 연구소 및 기관에 의해 전세계적으로 사용될 수 있는 공통적인 방법을 위한 기초를 제공할 수 있음을 나타낸다.
6. 결론
본원에 제안된 ELISA는 다양한 B형 간염 백신의 HBsAg 함량을 측정하는데 적합하며, 판매 중단된 오스자임™ 키트를 이용하는 방법에 대한 확실한 대안을 제공한다.
7. 참고문헌
표 1 : 본 연구에 사용된 백신 조성의 개요
| 백신 | HBsAg 함량* | 기타 항원 | 애쥬번트 |
| 엔제릭스(EngerixTM) | 20 ㎍/ml | - | 알루미늄 히드록시드 |
| 트윈릭스 (TwinrixTM) | 20 ㎍/ml | 비활성화된 A형 간염 바이러스 | 알루미늄 히드록시드 + 알루미늄 포스페이트 |
| 펜드릭스 (FendrixTM) | 40 ㎍/ml | - | AS04TM 애쥬번트 + 알루미늄 포스페이트 |
| 인펀릭스 (InfanrixTM) 펜타 (페디아릭스 (Pediarix®)로도 공지됨) | 20 ㎍/ml(백신이 0.5 ml로 존재함에 따라 실제 용량은 10 ㎍) | 디프테리아 톡소이드 파상풍 톡소이드 백일해 톡소이드 섬유상 혈구응집소 퍼탁틴 폴리오바이러스 유형 1 (마호니) 폴리오바이러스 유형 2 (MEF-1) 폴리오바이러스 유형 3 (소켓) | 알루미늄 히드록시드 + 알루미늄 포스페이트 |
| 인펀릭스TM IPV | - | 인펀릭스TM 펜타와 동일함 | 알루미늄 히드록시드 + 알루미늄 포스페이트 |
| 인펀릭스TM | - | 디프테리아 톡소이드 파상풍 톡소이드 백일해 톡소이드 섬유상 혈구응집소 퍼탁틴 | 알루미늄 히드록시드 + 알루미늄 포스페이트 |
| 하브릭스 (HavrixTM) | - | 비활성화된 A형 간염 바이러스 | 알루미늄 히드록시드 |
| 트리트란릭스 (TritranrixTM) | - | 디프테리아 톡소이드 파상풍 톡소이드 전세포 B. 백일해 항원 | 알루미늄 포스페이트 |
| 히베릭스 (HiberixTM) | - | 파상풍 톡소이드에 컨쥬게이션된 H. 인플루엔자 유형 b 폴리리보실 리비톨 포스페이트 | - |
* 로우리 단백질 분석에 의해 결정됨.
표 2 : 검출 한계 (LOD)
1블랭크 샘플은 희석 완충제(PBS, Tween 0.1%, BSA 0.1%)이다.
2분석 백그라운드 반응의 크기 및 편차는 블랭크 샘플을 6회 분석하여 수행된다.
3교정 곡선의 기울기.
4R2는 선형 회귀의 적합도(goodness-of-fit)의 측정값이다.
5LOD는 블랭크 신호의 평균 OD에서 3개의 표준 편차를 공제하는 것을 고려하여 계산되었다. 이후, 이러한 OD 값은 참조 표준을 이용하여 확립된 표준 곡선의 방정식에 도입되고, 이는 방정식 y = ax + b (y = OD-(3*st.dev.), x = 농도, a = 교정 곡선의 기울기, b = 절편)를 이용한 회귀 분석에 의해 당량 역가의 결정을 가능케 하였다. 희석액에 대한 교정 후, 분석 백그라운드 반응을 수득하기 위해 LOD 값을 계산하였다.
표 3 : 반복성 (분석내 정밀성)
1다양한 백신의 조성에 대해서는 표 1을 참조하라.
2각각의 로트는 동일한 날에 6회 시험하였다.
3변동 계수 = (표준 편차/평균)* 100.
표 4 : 매개 정밀성(분석내 정밀성)
1다양한 백신의 조성에 대해서는 표 1을 참조하라.
2각각의 로트는 독립적인 실험으로 6회 시험하였다.
3변동 계수 = (표준 편차/평균)* 100.
표 5 : 4개의 관선의약관리시험소(Official Medicine Control Laboratories, OMCLs)에서의 재현성.
1다양한 백신의 조성에 대해서는 표 1을 참조하라.
2유효성 기준을 이용하지 않은 미준수로 인한 유효하지 않은 결과.
표 6 : 정확성
1참조는 로우리 방법에 의해 측정시 20 μg HBsAg/ml의 값(표지된 값)으로 제공되었다.
2회수(%) = [실험치스파이킹됨 / (실험치스파이킹 되지 않음 + 스파이크의 이론치] x 100.
3다양한 백신의 조성에 대해서는 표 1을 참조하라.
표 7 : 특이성
1인펀릭스 펜타TM에 해당하는 위약.
2엔제릭스TM-B에 해당하는 위약.
3다양한 백신의 조성에 대해서는 표 1을 참조하라.
표 8 : 오스자임™ 방법을 이용한 브릿징
CV (변동 계수) = (표준 편차/평균)*100.
Claims (6)
- (1) 금속염에 연결된 항원과 이러한 항원에 특이적인 항체를 접촉시키는 단계;(2) 존재하는 임의의 항체가 고체 지지체 상의 항원과 함께 항체-항원 복합체를 형성하도록 하는 조건하에서, 상기 단계 (1)의 비결합된 임의의 항체와 고체 지지체에 연결된 항원을 접촉시키는 단계; 및(3) 고체 지지체 상에 형성된 항체-항원 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 금속염에 연결된 항원의 검출 및/또는 정량 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 항원이 알루미늄염에 연결된 B형 간염 표면 항원인 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 금속염에 연결된 항원이 하나 이상의 다른 제 2의 항원과 조합된, 검출 및/또는 정량 방법.
- 제 3항에 있어서, 상기 항원이 하기의 항원 그룹 중 하나와 조합된 B형 간염 표면 항원인 방법:(1) A형 간염 항원;(2) 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 백일해 톡소이드, 섬유상 혈구 응집소, 퍼탁틴, 폴리오바이러스 유형 1 (예를들어, 마호니(Mahoney)), 폴리오바이러스 유형 2 (예를들어, MEF-1), 폴리오바이러스 유형 3 (예를들어, 소켓(Saukett));(3) 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 백일해 톡소이드, 섬유상 혈구응집소, 퍼탁틴;(4) 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 전세포(Whole cell) B. 백일해 항원; 및(5) 파상풍 톡소이드에 컨쥬게이션된 H. 인플루엔자 유형 b 폴리리보실 리비톨 포스페이트.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 1의 말기에 존재하는 임의의 비결합된 항체가 상기 단계 2 전에 결합된 항체-항원으로부터 정제되는 방법.
- 본 발명의 방법을 수행하기 위한 설명서 및 하기로부터 선택된 하나 이상의 다른 성분을 포함하는, 금속염에 연결된 항원의 검출 및/또는 정량을 위한 키트:(1) 검출되는 항원에 특이적인 항체(검출 항체);(2) 고체 지지체에 연결되거나 연결되지 않은 항원;(3) 고체 지지체 상에 형성된 임의의 항체-항원 복합체의 검출을 위한 검출 시약;(4) 양성 대조군; 및(5) 음성 대조군.
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