KR20080106842A - 금속-폴리사카라이드 콘쥬게이트: 조성물 및 합성 - Google Patents
금속-폴리사카라이드 콘쥬게이트: 조성물 및 합성 Download PDFInfo
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Abstract
한 양태에 있어서 본 발명은 폴리사카라이드 콘쥬게이트를 포함한다. 이러한 콘쥬게이트는 폴리사카라이드, 및 폴리사카라이드에 공유결합된 O-기를 가지는 하나 이상의 단량체성 아미노산을 갖는다. 콘쥬게이트는 또한 아미노산의 O-기에 의해서 콘쥬게이트된 하나 이상의 금속을 갖는다. 또다른 양태에 따르면, 본 발명은 O-기를 가지는 단량체성 아미노산을 폴리사카라이드에 공유결합시키고 O-기에 금속을 콘쥬게이트시켜서 폴리사카라이드 콘쥬게이트를 형성함으로써 폴리사카라이드 콘쥬게이트를 합성하는 방법을 제공한다. 본 발명의 제 3 양태는 효과량의 폴리사카라이드 콘쥬게이트를 세포에 투여함으로써 암세포를 사멸시키는 방법에 관한 것이다. 이러한 콘쥬게이트는 폴리사카라이드, 및 폴리사카라이드에 공유결합된 O-기를 가지는 하나 이상의 단량체성 아미노산을 갖는다. 상기 콘쥬게이트는 또한 아미노산의 O-기에 의해서 콘쥬게이트된 하나 이상의 금속을 갖는다.
Description
본 발명의 양태들은 단량체성 아미노산을 통한 금속 및 폴리사카라이드의 콘쥬게이트에 관한 것이다. 이들 폴리사카라이드 콘쥬게이트는 암세포 사멸의 유도 및 암 치료에 사용될 수 있다.
혈관신생과정(angiogenesis process)은 종양혈관구조밀도 및 투과성과 관련된다. 세포주기 조절 및 세포 신호화제(cell signaling agent) 뿐만 아니라 상기 과정들에 대한 증진된 이해는 각종 종양들의 치료에 있어서의 새로운 시대를 열었다. 혈관신생의 분야에서 이루어진 현저한 진보에도 불구하고, 약물제제를 통한 혈관신생 성분을 가지는 암, 종양 및 기타 질병의 치료에 있어서 일부 중요한 한계점들이 여전히 남아 있다. 현시점에서 가장 중요한 한계점 중의 하나는 생체내에서의 세포증식억제약물 대신에 세포독성약물의 전달에 관한 것이다.
종양 활성에 대한 백금 콘쥬게이트의 효능은 밝혀져 있다. 예를 들어 널리 사용되는 항암 약물인 시스플라틴(cisplatin)은 단독으로 또는 다른 제제와의 조합으로 유방암 및 난소암을 치료하는데 사용되어 왔다. '시스-다이아민다이클로로백금(II)(CDDP)'으로도 알려진 시스플라틴은 NH3 분자들에 콘쥬게이트된 Pt를 가지는 간단한 분자이다. 시스플라틴은 S-상에서의 세포정지(cell arrest)를 유발하며 증식세포의 유사분열정지(mitotic arrest)를 유도한다. 또한, 시스플라틴은 화학요법 도중에 혈관내피성장인자(VEGF)의 발현을 감소시키고, 그에 따라 혈관신생을 제한한다. 시스플라틴은 대부분의 고형 종양의 치료에 효과적이다. 그러나, 시스플라틴을 사용한 임상 적용은 상당한 콩팥독성, 골수억제, 약물내성, 위장독성, 신경독성 및 기타 부작용(예: 구토, 과립혈구감소증(granulocytopenia) 및 체중손실)으로 인하여 제한된다. 또한, 시스플라틴은 그의 치료학적 효능을 손상시키는 불량한 수용성을 가지는 벌키한 비히클로 제형화된다. 각종 백금 콘쥬게이트의 화학적 변형태는 그의 친수성을 증가시키도록 제조되어 그의 부작용을 감소시키고 그의 치료학적 효능을 향상시켜 왔지만, 이들 콘쥬게이트에는 여전히 심각한 결점이 존재한다.
본 발명의 목적은 암세포 사멸의 유도 및 암 치료에 유용한 폴리사카라이드 콘쥬게이트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리사카라이드 콘쥬게이트의 합성방법을 제공하는 것이다.
한 양태에 있어서 본 발명은 폴리사카라이드 콘쥬게이트를 포함한다. 이러한 콘쥬게이트는 폴리사카라이드, 및 폴리사카라이드에 공유결합된 O-기를 가지는 하나 이상의 단량체성 아미노산을 갖는다. 콘쥬게이트는 또한 아미노산의 O-기에 의해서 콘쥬게이트된 하나 이상의 금속을 갖는다.
또 다른 양태에 따르면 본 발명은 O-기를 가지는 단량체성 아미노산을 폴리사카라이드에 공유결합시키고 O-기에 금속을 콘쥬게이트시켜서 폴리사카라이드를 형성함으로써 폴리사카라이드 콘쥬게이트를 합성하는 방법을 제공한다.
제 3 양태에 따르면, 본 발명은 효과량의 폴리사카라이드 콘쥬게이트를 세포에 투여함으로써 암세포를 사멸시키는 방법에 관한 것이다. 이러한 콘쥬게이트는 폴리사카라이드, 및 상기 폴리사카라이드에 공유결합된 O-기를 가지는 하나 이상의 단량체성 아미노산을 갖는다. 콘쥬게이트는 또한 아미노산의 O-기에 의해서 콘쥬게이트된 하나 이상의 금속을 갖는다.
첨부된 도면은 본원 명세서의 일부를 구성하며 본 발명의 특정한 양상을 추가적으로 설명하기 위해서 포함된 것이다. 본 발명은 본원에서 제시된 양태들에 관한 기술과 함께 첨부된 도면들 중 하나 이상을 참조로 하여 보다 원활하게 이해될 수 있다. 본 특허 또는 특허출원의 파일은 칼러로 작성된 하나 이상의 도면을 가진다. 칼러 도면(들)을 가지는 본 특허 또는 특허출원공보의 사본은 신청 및 필요비용의 지불시에 특허청에 의해서 제공될 것이다.
도 1은 본 발명의 양태에 따르는 3가지 유형의 금속-폴리사카라이드 콘쥬게이트를 도시한 것이다. "AA"는 아미노산을 지칭한다. "M"은 금속을 지칭한다. 도 1a에는 하나만의 또는 몇 개의 아미노산 군 및 콘쥬게이트된 금속이 존재한다. 도 1b에는 중간 개수의 아미노산 군 및 콘쥬게이트된 금속이 존재한다. 도 1c에는 최대 또는 거의 최대로 가능한 아미노산기 및 콘쥬게이트된 금속이 존재한다.
도 2는 본 발명의 한 양태에 따르는 백금 유사체 (II) 및 (IV)-폴리사카라이드 콘쥬게이트의 하나의 합성방법(방법 A)을 도시한 것이다.
도 3은 본 발명의 한 양태에 따르는 폴리사카라이드-백금 유사체 (II) 및 (IV) 콘쥬게이트의 하나의 합성방법(방법 B)을 도시한 것이다.
도 4는 48시간(A) 및 72시간(B)에서의 백금-내성 난소암 세포(2008-c13)의 억제에 대한 본 발명의 한 양태에 따르는 백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트의 효과를 도시한 것이다.
도 5는 48시간(A) 및 72시간(B)에서의 백금-민감성 난소암 세포(2008)의 억제에 대한 본 발명의 한 양태에 따르는 백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트의 효과를 도시한 것이다.
도 6은 48시간에서의 백금-내성 난소암 세포주(2008-c13)에서 시스플라틴(CDDP)(a) 및 본 발명의 한 양태에 따르는 백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트(PC)(b)의 세포사멸 효과를 보여주는 유세포 분석결과이다.
도 7은 48시간(A) 및 72시간(B)동안 다양한 농도에서의 시스플라틴(CDDP) 또는 본 발명에 따르는 백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트(PC)로 처리된 백금-내성 난소암 세포주 2008-c13에서 유세포 분석기로 측정한 사멸 세포의 비율(%)을 나타낸 것이다.
도 8은 48시간동안 다양한 농도에서의 시스플라틴(CDDP) 또는 본 발명에 따르는 백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트(PC)로 처리된 백금-내성 난소암 세포주 2008-c13에서 TUNEL 분석기로 측정한 사멸 세포의 비율(%)을 나타낸 것이다.
도 9는 24시간(a) 및 94시간(b)에서의 유방 종양 성장에 대한 본 발명의 양태에 따르는 백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트의 생체내(in vivo) 효과를 도시한 것이다(단일 투여량, Pt 10 mg/kg). 오로지 콘드로이틴만이 투여된 동물로부터 종양 지정 DY를 취하였다. 백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트가 투여된 동물로부터 종양 지정된 DP-A-P를 취하였다. 도 9a에서, 왼편의 종양은 5.2591 ㎤ [2.08 cm x 2.58 cm x 1.96 cm)/2]의 부피로 측정되었다. 오른편의 종양은 5.2661 ㎤ [2.20 cm x 2.37 cm x 2.02 cm)/2]의 부피로 측정되었다. 도 9b에서, 왼편 종양은 14.3622 ㎤ [(2.99 cm x 3.29 cm x 2.92 cm)/2]의 부피로 측정되었다. 오른편 종양은 0.8782 ㎤ [1.11 cm x 1.84 cm x 0.86 cm)/2]의 부피로 측정되었다.
도 10은 본 발명의 양태에 따르는 백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트 또는 콘드로이틴을 단독으로 투여한 후 24시간 및 94시간째의 괴사를 보여주는 종양의 H 및 E 염색 사진이다. 도 10a는 콘드로이틴이 투여된지 24시간째의 유방종양(13762)을 나타낸다. 도 10b는 백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트가 투여된지 24 시간째의 유방종양(13762)을 나타낸다. 도 10c는 콘드로이틴이 투여된지 94시간째의 유방종양(13762)을 나타낸다. 도 10d는 백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트가 투여된지 94시간째의 유방종양(13762)을 나타낸다.
도 11은 백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트(PC) 또는 시스플라틴(CDDP)으로 처리한 2008-c13 세포로부터 PARP 단백질의 웨스턴 블랏팅 분석결과를 나타낸 것이다.
도 12는 48시간 후 백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트(PC) 또는 시스플라틴(CDDP)으로 처리한 2008-c13의 세포주기를 유세포 분석한 결과이다.
도 13은 적은 투여량의 백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트(PC) 또는 시스플라틴(CDDP)으로 처리한 2008-c13 세포에서의 p21 전사체의 노던 블랏팅 분석결과(도 13a) 및 발현된 p21의 웨스턴 블랏팅 분석결과(도 13b)를 나타낸 것이다.
도 14a는 시스플라스틴(CDDP) 또는 콘쥬게이트(PC 또는 DDAP)에 대해 48시간동안 노출 후 서브(sub)-G1 분획의 투여량에 따른 증가를 유세포 분석한 결과이다. 동일 투여량에서, PC는 백금 내성 2008-c13 세포에서 CDDP보다 sub-G1을 실질적으로 보다더 많이 유도하였다. 도 14b는 CDDP 또는 PC(DDAP)에 대해 48시간동안 노출 후 2008-c13 세포에서 sub-G1 분획의 비율(%)을 나타낸 것이다.
도 15는 약물 노출 48시간 후 시스-다이아민다이클로로백금(II)(CDDP) 및 다이아민 다이카복실산 백금(PC 또는 DDAP)에 의해 유도된 세포사멸의 TUNEL 분석결과를 나타낸다. 도 15a에서, 세포사멸성 형태학적 변화는 갈색 입자로 지시된다. 도 15b는 세포사멸성 형태학적 변화를 갖는 세포의 비율(%)이다. 막대는 3회의 독 립적인 실험의 평균치이고, 바(bar)는 표준오차를 나타낸다.
도 16은 시스-다이아민다이클로로백금(II)(CDDP) 또는 다이아민 다이카복실산 백금(PC 또는 DDAP)으로 처리한 2008-c13 세포에서 절단된 카스파제(caspase)-3 및 특정 폴리(ADP-리보즈) 폴리머라제(PARP) 단편의 웨스턴 블랏팅 분석결과를 나타낸다. GAPDPH는 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제이다.
도 17a는 시스-다이아민다이클로로백금(II)(CDDP) 또는 다이아민 다이카복실산 백금(PC 또는 DDAP)으로 48시간동안 처리한 후의 2008-c13 세포주에서 세포 주기 분포를 나타내는 것이다. G1, G2, M 및 S는 세포상을 나타낸다. 도 17b는 시스-다이아민다이클로로백금(II)(CDDP) 또는 다이아민 다이카복실산 백금(PC 또는 DDAP)에 48시간동안 노출시킨 후 2008-c13 세포에서 p21 및 사이클린 A 발현의 웨스턴 블랏팅 분석결과를 나타낸다.
본 발명의 금속-폴리사카라이드 콘쥬게이트는 암세포 사멸의 유도 및 암 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
특정한 양태에서 본 발명은 금속-폴리사카라이드 콘쥬게이트, 이의 합성방법 및 암세포 사멸 및 암의 치료를 포함하는 이의 사용을 포함한다. 보다 상세하게, 콘쥬게이트는 부착된 하나 이상의 단량체성 아미노산을 갖는 폴리사카라이드를 포함할 수 있다. 그에 따라 이러한 아미노산은 금속을 콘쥬게이트할 수 있다. 선택된 양태에서, N-기보다 오히려 O-기를 통해 금속을 콘쥬게이트시킬 수 있다. 몇몇 양태에서, 금속은 전이금속일 수 있다. 많은 양태에서, 다수의 금속 군의 콘쥬게이트를 허용하는, 부착된 다수의 단량체성 아미노산이 존재할 수 있다. 콘쥬게이트는 임의의 크기를 가질 수 있으나, 특정 양태에서 콘쥬게이트는 신장을 통한 배출이 제한되도록 각 분자가 10,000 달톤 이상, 예를 들어 10,000 내지 50,000 달톤으로 설계될 수 있다. 특정한 양태에서, 폴리사카라이드 콘쥬게이트는 약 20,000 달톤 내지 약 50,000 달톤의 분자량을 가질 수 있으며, 보다 구체적으로는, 약 26,000 내지 약 30,000 달톤일 수 있다.
선택된 폴리사카라이드는 임의의 폴리사카라이드일 수 있지만, 혈관 흡수와 관련된 폴리사카라이드가 특히 유용할 수 있다. 보다 상세하게, 점착성 분자, 예컨대 콜라겐, 콘드로이틴, 히아우라니에이트(hyauraniate), 키토산 및 키틴은 폴리사카라이드로서 사용에 매우 적합할 수 있다. 하나의 특정한 양태에서, 콘드로이틴 A일 수 있다. 본 발명은 특정한 작용 양식에 의해 한정되지는 않지만, 상기 폴리사카라이드는 혈관을 통해 용이하게 흡수되고 암세포로 전이될 수 있다. 이는 특히 혈관 신생이 이행되는 영역, 예컨대 대부분 종양에서 특히 전형적일 수 있다. 20,000 내지 50,000 달톤의 분자량을 갖는 말기 산물이 혈관계 치료를 달성하는 것을 보조할 것이다.
아미노산은 임의의 안정한 방식으로 폴리사카라이드에 부착될 수 있지만, 많 은 양태에서 폴리사카라이드에 공유결합될 것이다. 아미노산은 단량체 형태일 수 있어 개별적인 단량체가 폴리사카라이드에 별도로 부착된다. 아미노산은 금속의 콘쥬게이트화(conjugation)에 유용한 O-기를 가질 수 있으며, 특히 유용한 2개의 O-기를 가질 수 있다. 금속은 단일 단량체성 아미노산에 의해 콘쥬게이트되거나 또는 2개 이상의 단량체성 아미노산을 통해 콘쥬게이트될 수 있다. 단독으로 또는 조합으로 사용될 수 있는 아미노산 단량체의 예로는 글루탐산, 아스파트산, 알라닌과 조합된 글루탐산, 아스파라긴과 조합된 글루탐산, 글루타민과 조합된 글루탐산, 글리신과 조합된 글루탐산 및 글리신과 조합된 아스파트산을 들 수 있다. 2개의 카르복실산간의 결합 거리 및 보다 우수한 종양 흡수 특이성으로 인해 아스파트산이 바람직하다. 아미노산은 L-형태 또는 D-형태, 또는 L- 및 D-형태의 라세미 혼합물일 수 있다. L-형태 아미노산은 적정한 종양 흡수에 바람직하다. 단일 아스파트산 단량체는 그 자체상에 금속을 콘쥬게이트시킬 수 있기 때문에 아스파트산이 선택될 수 있다. 또한, 아스파트산은 포유동물 세포에 의해 생산될 수 없지만, 종양세포를 빠르게 성장시킴으로써 흡수되도록 하기때문에 필수 영양소이다.
아미노산은 폴리사카라이드 콘쥬게이트의 약 10 내지 약 50중량%를 포함할 수 있다.
폴리사카라이드상의 아미노산 부착 지점의 포화정도는 변화될 수 있다. 예를 들어, 도 1a에서 보듯이, 단지 하나의 아미노산이 부착될 수 있다. 매우 낮은 포화정도, 예컨대 5% 이하, 10% 이하 또는 20% 이하가 달성될 수도 있다. 도 1b는 중간 정도의 포화, 예컨대 대략 30%, 대략 40%, 대략 50% 또는 대략 70%의 포화정 도를 갖는 콘쥬게이트를 예시한다. 도 1c는 매우 높은 포화정도, 예컨대 80% 이상, 90% 이상 또는 실질적으로 완전한 포화정도를 갖는 콘쥬게이트를 예시한다. 도 1에서 각 아미노산은 콘쥬게이트된 금속을 갖지만, 많은 실질적인 예에서, 금속에 의해 가능한 아미노산의 포화정도, 예컨대 5% 미만, 10% 미만 또는 20% 미만, 대략 30%, 대략 40%, 대략 50% 또는 대략 70%, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 실질적으로 완전한 포화정도일 것이다.
금속은 아미노산 단량체의 O-기에 의해 콘쥬게이트될 수 있는 금속을 함유하는 임의의 금속원자 또는 이온 또는 화합물일 수 있다. 특정 양태에서, 금속은 전이금속, 예컨대 백금, 철, 가돌리늄, 레늄, 망간, 코발트, 인듐, 갈륨 또는 로듐일 수 있다. 금속은 치료금속(therapeutic metal)일 수 있다. 이는 거대분자, 예컨대 약물의 일부분일 수 있다. 금속은 아미노산 단량체의 O-기를 통해 폴리사카라이드-아미노산 골격에 콘쥬게이트될 수 있다.
하나의 양태에서, 금속은 폴리사카라이드 콘쥬게이트의 15 내지 약 30중량%일 수 있다.
하나의 실시양태에서, 콘쥬게이트는 아스파트산 단량체에 공유결합된 콘드로이틴 A를 포함하며, 이는 백금 함유 화합물중에 백금을 콘쥬게이트할 수 있다. 하나의 변형된 양태에서, 백금은 백금(II)일 수 있으며, 또다른 하나의 변형태에서 백금은 백금(IV)일 수 있다.
콘쥬게이트는 수용성일 수 있다. 예를 들어, 이는 약 20 mg(금속 당량)/물 ml의 용해도를 가질 수 있다. 콘쥬게이트는 다양한 형태, 예컨대 수용액 또는 분 말로 제공될 수 있다. 콘쥬게이트 및 이의 제형은 멸균처리될 수 있다. 예를 들어, 멸균된 분말로서 제공될 수 있다.
콘쥬게이트는 폴리사카라이드에 하나 이상의 아미노산 단량체를 별도로 공유결합시킴으로써 본 발명의 하나의 양태에 따라 합성될 수 있다. 따라서, 금속은 아미노산 단량체에 의한 콘쥬게이트화를 제공할 수 있다. 본 발명의 또다른 양태에 따라, 금속은 아미노산 단량체에 콘쥬게이트될 수 있으며, 이에 따라 하나 이상의 아미노산 단량체가 폴리사카라이드에 공유결합될 수 있다.
본 발명의 콘쥬게이트는 암 또는 종양세포를 사멸시키는데 사용될 수 있으며, 이에 따라 암 또는 종양을 치료할 수 있다. 콘쥬게이트는 암, 구체적으로 고형암을 표적할 수 있다. 이는 예를 들어, 화합물의 방사표지된 변이체, 예컨대 감마 영상화를 허용하는, 99 mTc에 콘쥬게이트된 폴리사카라이드-아미노산 골격을 통해 증명될 수 있다. 금속 성분을 갖는 세포독성 치료제는 폴리사카라이드-아미노산 골격에 콘쥬게이트되어 이들의 세포독성효과를 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 세포독성 치료제는 급성 전신독성을 감소시키는 폴리사카라이드로부터 점차적으로 방출될 수 있다. 또한, 불량한 수용성 또는 종양 표적능을 갖는 약물의 치료지수(독성/효능)는 이들 약물을 폴리사카라이드-중합체 골격에 콘쥬게이트시킴으로써 증가될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 백금 함유 콘쥬게이트는 시스플라틴보다 적은 투여량에서 암세포 성장을 억제시킬 수 있다. 또한, 백금 함유 콘쥬게이트는 시스플라틴 -내성 암세포, 특히 난소암 세포의 세포 성장을 억제할 수 있다.
임의의 유형의 암세포 또는 종양세포는 본 발명의 선택된 콘쥬게이트에 의해 사멸되거나 또는 그의 성장이 억제될 수 있다. 그러나, 고형 종양은 이들 콘쥬게이트에 대해 가장 우수한 반응을 할 수 있다. 본 발명의 특정 콘쥬게이트에 대해 민감할 수 있는 암의 예로는 난소암, 시스플라틴-내성 난소암, 췌장암, 유방암, 육종, 자궁암 및 임파종을 들 수 있다.
암에 더하여, 본 발명의 특정 콘쥬게이트는 하기 질병의 발달 및 진행과 관련된 세포를 표지하거나 억제할 수 있다; HIV, 자가면역 질환(예를 들어, 뇌척수염, 백반증, 공피증, 갑상선염 및 천공 교원증), 유전 질환(예를 들어, 색소성 건피증 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제 결핍증), 대사 질환(예를 들어, 당뇨병), 심혈관 질환, 신경/정신 질환 및 기타 의약적 증상(예를 들어, 저혈당증 및 간경변증).
실시예
하기 실시예들은 본 발명의 특정 양태를 설명하기 위해 포함된다. 당분야의 숙련가는 본 발명자들에 의해 발견된 작용기술을 나타내는 하기 실시예에 기재된 기술들이 본 발명의 실시내에 있다는 것을 인식해야 한다. 그러나, 당분야의 숙련가는 본원의 기재에 비추어, 본원에 개시된 특정 양태에서 많은 변화가 이루어질 수 있으며 이로부터 본 발명의 범위 및 범주로부터 벗어나지 않고 여전히 유사하거나 비슷한 결과를 수득할 수 있다는 것을 인지해야 한다.
실시예 1: 백금 유사체(II) 및(IV)-폴리사카라이드 콘쥬게이트의 합성
방법 A
시스-1,2-다이아미노사이클로헥세인 설파토백금(II)(시스-1,2-DACH-Pt·SO4)를 2단계 과정으로 합성하였다. 1단계에서, 120 ml의 탈이온수중 K2PtCl4(5.00g, 12 mmol)의 여과용액을 KI(12 ml의 물중 20.00g, 120 mmol)과 혼합하고, 5분동안 교반시킴으로써 시스-1,2-DACH-PtI2 복합체를 합성하였다. 수득된 용액에 1당량의 시스-1,2-DACH(1.37g, 1.487 ml, 12 mmol)를 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30분동안 교반하였다. 수득된 황색 고체를 여과하여 분리한 다음 소량의 탈이온수로 세척하였다. 최종 산물을 진공하에서 건조시키고 시스-1,2-DACH-PtI2(6.48g, 96%)를 수득하였다. 2단계에서, Ag2SO4(3.45g, 11 mmol)의 수용액에 고체로서 시스-1,2-DACH(1단계로부터 추가의 정제없이 수득함, 6.48g, 11.5 mmol)를 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. AgI를 여과하여 제거하고 여과물을 진공하에서 동결건조하여 황색의 시스-1,2-DACH-Pt(II)SO4(4.83g, 99%)를 수득하였다. 원소분석결과 Pt는 44.6%(w/w)인 것으로 나타났다.
물(5 ml)중 콘드로이틴(1g, MW. 30,000-35,000) 교반 용액에 설포-NHS(241.6 mg, 1.12 mmol) 및 3-에틸카보다이이미드-1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드-HCl(EDC)(218.8 mg, 1.15 mmol)(피어스 케미칼 컴파니(Pierce Chemical Company), 미국 일리노이주 록퍼드 소재)를 가하였다. 이어서, L-아스파트산 나트륨 염(356.8 mg, 1.65 mmol)을 가하였다. 혼합물을 실온에서 24시간동안 교반하였다. 혼합물을 10,000에서 분획을 갖는 스펙트라(Spectra)/POR 분자 다공질 막(스펙트럼 메디칼 인더스트리즈 인코포레이티드(Spectrum Medical Industries Inc., 미국 텍사스주 휴스톤 소재)을 사용하여 48시간동안 투석하였다. 투석 후, 산물을 여과하고 동결건조기(랩콘코(Labconco), 미국 미조리주 칸사스시 소재)를 사용하여 동결건조하였다. 산물 아스파테이트-콘드로이틴(폴리사카라이드)은 염의 형태로서 1.29 g으로 칭량되었다. 글루탐산 및 알라닌을 갖는 콘드로이틴, 글루탐산 및 아스파라긴을 갖는 콘드로이틴, 글루탐산 및 글루타민을 갖는 콘드로이틴, 글루탐산 및 글리신을 갖는 콘드로이틴, 및 글루탐산 및 알라닌, 아스파라긴, 글루타민 및 글리신으로 콘쥬게이트된 하나의 아스파트산을 갖는 콘드로이틴을 제조하기 위해 유사한 기술을 사용하였다.
시스-1,2-DACH-Pt(II)SO4(500 mg, 1.18 mmol)를 10 ml의 탈이온수에 용해시키고 아스파테이트-콘드로이틴 용액(15 ml의 탈이온수중 1.00g)을 가하였다. 용액을 실온에서 24시간동안 교반하였다. 투석(MW: 10,000) 및 동결건조 후, 1.1462g의 시스-1,2-DACH-Pt(II)-폴리사카라이드를 수득하였다.
백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트, 시스-1,2-DACH-다이클로로-Pt(IV)-아스파테이트-콘드로이틴(PC)을 하기와 같이 합성하였다: 상기 수득된 용액을 30% 과산화수소 수용액 2.5 ml에 적가하였다. 24시간 후 HCl(75 ml, 0.02N)을 가하고 실온 에서 24시간동안 교칸시킨 다음, 밤새 탈이온수로 투석(MW: 10,000)하고 진공하에서 동결건조시켰다. 수득된 최종 산물은 1.15g이었다. 원소분석 결과, Pt는 21.87%(w/w)로 나타났다. 합성 반응식은 도 2에 나타내었다.
방법 B
시스-1,2-DACH-Pt(II)SO4 또는 시스-1,2-DACH-다이클로로-Pt(IV)(500 mg, 1.18 mmol)을 10 ml의 탈이온수에 용해시키고 2 ml의 탈이온수중 아스파트산(67 mg, 0.5 mmol)의 용액을 가하였다. 용액을 실온에서 24시간동안 교반시켰다. 투석 및 동결건조 후, 시스-1,2-DACH-Pt-아스파트산을 물(5 ml)중 콘드로이틴(1g, MW 30,000-35,000), 설포-NHS(241.6 mg, 1.12 mmol) 및 3-에틸카보다이이미드-1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드-HCl(EDC)(218.8 mg, 1.15 mmol)(피어스 케미칼 컴파니, 미국 일리노이주 록퍼드 소재)와 반응시켰다. 합성 반응식은 도 3에 나타내었다.
실시예 2: 생체외(in vitro) 세포 배양액 분석
시스플라틴 및 방법 A를 사용하여 상기 개시된 바와 같이 제조된 백금(II)-폴리사카라이드 콘쥬게이트(PC)의 포유동물 종양세포에 대한 세포독성을 평가하기 위하여 2개의 인간 종양세포주인 2008 세포주 및 이의 백금-내성 아세포주(subline) 2008-c13을 선별하였다. 모든 세포를 10% 소 태아 혈청 및 글루타민 (2 mM)이 보충된 RPMI 1640 배지중 5% CO2를 함유하는 습윤 분위기하의 37 ℃에서 배양하였다. 2008 또는 2008-c13 세포를 96웰 플레이트에 씨딩(seeding)하고(4,000세포/웰) RPMI 1640 배지에서 24시간동안 배양하였다. 이어서, 세포를 2.5 ㎍/ml, 5 ㎍/ml, 10 ㎍/ml, 20 ㎍/ml, 25 ㎍/ml 및 50 ㎍/ml 농도의 PC 또는 CDDP로 48시간 및 72시간동안 처리하였다. 대조군은 DMSO 또는 PBS로 처리하였다. 세포를 처리한 후, 20 ㎕의 테트라졸리움 기질을 사용하여 37 ℃에서 1 내지 2시간동안 배양함으로써 세포의 성장 및 생존성을 측정하였다. 96웰 시너지 HT-마이크로플레이트 판독기(바이오텍(Biotek)사, 미국 벌몬트주 위누스키 소재)를 사용하여 450nm에서 흡수도를 측정하였다. 세포 성장 억제율은 하기 수학식 1과 같이 비율로서 나타내었다:
실험을 독립적으로 3회 반복하였다. 메틸렌 테트라졸리움(MTT) 염색분석으로 생존 세포의 양을 측정하였다. 로우리(Lowry) 분석으로 세포성 단백질의 함량을 측정하였다. 이어서, 세포 성장의 50%를 억제하는 약물 농도(IC-50)을 측정하였다. 데이타는 대조군과 비교되는 차이(처리 후 세포의 OD/처리하지 않은 세포의 OD)를 비율로서 나타내었다. 세포 억제 곡선은 도 4 및 도 5에 도시하였다.
백금-내성 난소암 세포주에서는 백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트(PC)의 IC-50에 있어서의 노출에 대한 세포의 민감도가 시스플라틴(CDDP)의 IC50에 있어서의 노출에 대한 세포의 민감도보다 5.7배 크게 나타난 반면(도 4), 백금-민감성 난소암 세포주(2008)에서는 그렇지 않았다(도 5). 구체적으로, 2.5 ㎍/ml 및 5 ㎍/ml의 농도의 백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트 (PC)는 48시간째에 시스플라틴(CDDP)과 비교하여 각각 5.9배 및 4.6배로 종양을 사멸시켰으며(도 4a), 72시간째에서는 시스플라틴(CDDP)과 비교하여 각각 9.3배 및 1.5배로 종양을 사멸시켰다(도 4b). 이러한 데이타는 적은 투여량의 백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트(PC)가 백금-내성 난소암 세포의 성장을 유의적으로 억제한다는 것을 보여준다.
백금-내성 난소암 세포에 대한 백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트(PC)의 효과를 측정하기 위하여, 2008-c13 세포(0.5 x 10-6)를 백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트(PC)로 처리하였다. 세포를 트립신처리하고, 2500 rpm에서 5분동안 원심분리하였다. 1 x PBS로 2회 세척한 후, 세포를 70% 에탄올로 밤새 고정하고, 1 x PBS로 2회 세척한 다음, 1 ml의 요오드화 프로피디움(PI) 용액(1 x 10-6)에 재현탁시켰다. 이어서, RNanse(20 ㎍/ml) 용액을 1 ml의 요오드화 프로피디움(PI, PBS중 50 ㎍/ml) 용액에 가하였다. 시료를 37℃에서 15분동안 배양하고 PI 형광성을 EPIS XL 분석기를 사용하여 분석하였다. 시스플라틴(CDDP)과 비교할 때 낮은 농도(2.5 ㎍/ml 및 5 ㎍/ml)의 백금(IV)-폴리사카라이드 콘쥬게이트에서도 백금-내성 난소암 세포상에서 세포 사멸 효과가 유의적으로 향상되었다(도 6 및 도 7).
이러한 결과는 TUNEL 분석에 의해 확인하였으며, 이 분석에서는 처리후 48시간째에 모든 약물에 노출시킨 후 투여량에 따른 사멸 세포의 명확한 증가가 관찰되 었다. 그러나, 각 투여량에서 비교할 때 백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트(PC) 처리된 군은 보다더 많은 사멸 세포(P<0.05)를 갖는다(도 8).
실시예 3: 유방암을 앓는 랫트 모델을 사용한 항암제 평가
암컷 피셔(Fischer) 344 랫트(125-175g)에 유방암 세포(13762NF, 106 세포/랫트, 뒷다리에 피하주사함)를 접종하였다. 15 내지 20일 후 종양의 부피가 1 cm가 된 후, 유방암을 앓는 랫트에 백금-콘드로이틴(백금-폴리사카라이드)콘쥬게이트(PC) 또는 단독의 콘드로이틴을 10 mg Pt/kg(백금(IV)-폴리사카라이드) 또는 45 mg/kg(콘드로이틴)의 투여량으로 투여하였다. 종양 부피 및 체중을 6일동안 매일 기록하였다. 종양 부피를 하기 수학식 2와 같이 측정하였다:
15%의 체중의 감소는 화학적으로 유도된 독성 효과인 것으로 생각된다. 측정 결과, 백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트(PC)는 유방 종양 성장에 대해 생체내(in vivo) 효과가 있는 것으로 나타났다(도 9). 백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트로 처리한 후, 종양 조직을 절개하여 포르말린에 침지시켰다. 종양 조직을 파라핀으로 고정하고 조직학적 검사를 위해 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트(PC) 투여 후 94시간째에 괴사의 증가가 관찰되었으나, 폴리 사카라이드만을 단독으로 투여한 경우에는 괴사의 증가가 관찰되지 않았다(도 4).
실시예 4: 종양세포의 사멸 또는 억제 방법
2008-c13 유방암 세포를 콘쥬게이트로 처리하고 웨스턴 블랏팅 분석을 통해 세포성 단백질상 효과를 측정함으로써 종양세포상에서 실시예 1의 백금-폴리사카라이드콘쥬게이트의 효과를 분석하였다(도 11). 절단된 PARP는 시스플라틴(CDDP)과 비교할 때 백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트(PC)로 처리된 세포에서 유의적으로 증가하였으며, 이는 백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트가 카스파제-3 의존적 경로에서 세포 사멸을 향상시킴으로써 2008-c13 세포 성장을 억제한다는 것을 시사한다.
이러한 효과는 약물을 노출한지 48시간 및 72시간 후 2008-c13 세포주에서 유세포 분석기를 사용하여 검사하였다. 유세포 분석 결과, PC 및 CDDP 처리 후 sub-G1 분획에서 투여량에 따른 세포수의 증가가 있었으며, 이는 이배수성 세포를 나타내며 세포 사멸의 유도를 시사한다. 그러나, CDDP와 비교할 때 PC의 사용은 동일 투여량에서 sub-G1 분획에서 보다더 공인된 증가를 나타내었다(도 14).
세포 사멸의 전형적인 DNA 단편화는 3회의 독립적인 실험으로 TUNEL 분석을 통해 추가로 측정하였다. 2개의 약물에 대한 노출 후 투여량에 따른 사멸 세포 수의 명백한 증가가 관찰되었다. 그러나, 각 투여량에서 비교할 때, PC 처리된 세포는 매우 높은 정도의 세포 사멸(P<0.05)을 나타내었다(도 15).
세포 사멸이 카스파제-3 의존적 경로 및 PARP의 절단에 의해 유도되는지를 측정하기 위해, 카스파제-3 활성화 이후 형성되는 절단된 카스파제-3 및 PARP의 양 을 웨스턴 블랏팅 분석으로 측정하였다, PARP는 카스파제-3-의존적 세포 사멸동안 85 kDa 단편으로 특이적으로 절단되는 것으로 보이는 113 kDa의 핵산 단백질이다. 세포가 48시간동안 CDDP 또는 PC에 노출된 후, 절단된 PARP는 각 투여량에서 존재하였다. CDDP 처리 군에서, 절단된 PARP 발현은 2.5 ㎍/ml에서 20 ㎍/ml로 증가하였으며, 절단된 카스파제-3은 PARP와 유사한 양상으로 발현되었다. PC 처리 군에서, 절단된 카스파제-3의 발현은 5 ㎍/ml의 PC에서 보인 낮은 발현을 제외하고는 CDDP 처리 군의 것에 필적하는 수준이었다. 많은 투여량(20 ㎍/ml)의 PC에 의해 유도되는 절단된 PARP 발현은 적은 투여량의 PC에서 유도되는 것보다 낮게 나타났지만, 이러한 차이는 이의 상부 절단된 카스파제-3 발현에서는 검출되지 않았다(도 16).
2008-c13 유방암 세포상 추가의 생체외(in vitro) 실험에서의 유세포 분석 결과, 백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트(PC)에 노출된지 48시간 후에 S-상에서 세포가 유의적으로 정지하는 것을 볼 수 있다(도 12). 가장 높은 수준의 S-상에서의 차단은 가장 낮은 투여량인 2.5 ㎍/ml 및 5 ㎍/ml(90.3% 및 90.1%)에서 일어났다. 시스플라틴(CDDP)과 비교할 때, S-상에서 정지하는 세포에서의 백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트(PC)의 효과는 유의적으로 상이했다.
구체적으로, DNA 함량은 2008-c13 세포를 PC 또는 CDDP로 처리한지 48시간 후 유세포 분석기를 사용하여 분석하였다. CDDP에 대한 노출은 S-상에서 세포 정지를 유도하였고, 5 ㎍/ml에서 sub-G1 분획을 증가시킨 반면, 가장 적은 투여량인 2.5 ㎍/ml에서는 그렇지 않았다. S-상 및 sub-G1 분획상에 정지하는 세포의 수는 CDDP 투여량이 증가함에 따라 계속적으로 증가하여 20 ㎍/ml에서는 S-상에서 최대의 세포(84.8%)가 정지하였다. 세포가 48시간동안 PC에 노출된 후, 가장 높은 수준의 S-상에서의 차단은 가장 적은 투여량(2.5 ㎍/ml[90.3%] 및 5 ㎍/ml[90.1%])에서 일어났다. 가장 많은 투여량(10 ㎍/ml 및 20 ㎍/ml)에서, S-상에서의 정지수준은 sub-G1 분획이 증가함에 따라 계속적으로 증가하였다. 이는 세포가 S-상에서 정지하기 전에 많은 투여량의 PC의 강한 스트레스하에서 세포 사멸을 신속하게 바로 일으킨다는 사실을 증명할 수 있다(도 17).
2008-c13에서 CDDP 및 PC에 의해 유발된 S-상에서의 정지를 일으키는 메카니즘을 밝히기 위해, 약물 노출 48시간 후에 S-상에서의 세포 주기 조절에 있어 주요한 p21 및 사이클린 A의 2008-c13 세포에서의 발현을 측정하였다. CDDP 처리 후, p21 및 사이클린 A의 발현중 어느 쪽도 S-상에서의 정지 증가와 관련되지 않았다. 그러나, PC 처리 후, p21 및 사이클린 A 발현은 S-상에서의 정지 증가와 직접 관련된다: p21은 적은 투여량의 PC 처리 후 최대의 S-상에서의 정지로 상향 조절되었지만, 많은 투여량의 처리 후에는 그렇지 않았고; 사이클린 A는 많은 투여량의 PC 처리 후 상향 조절되었으며 적은 양의 PC 처리 후에는 낮은 수준으로 유지되었다(도 17b).
백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트(PC)로 처리된 2008-c13 유방암 세포는 시스플라틴(CDDP)으로 처리된 세포와 비교할 때 전사 수준(도 13a) 및 단백질 발현 수준(도 13b)에서 모두 증가된 p21 발현을 나타내었다.
본 발명을 상기 예시적인 실험 양태로서 구체적으로 설명하였지만, 본 발명 은 발명의 범위 및 목적 범주로부터 벗어남이 없이 상기 실시예의 변형 및 변화가 이루어질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
도 1은 본 발명의 양태에 따르는 3가지 유형의 금속-폴리사카라이드 콘쥬게이트를 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 한 양태에 따르는 백금 유사체 (II) 및 (IV)-폴리사카라이드 콘쥬게이트의 하나의 합성방법(방법 A)을 도시한 것이다.
도 3은 본 발명의 한 양태에 따르는 폴리사카라이드-백금 유사체 (II) 및 (IV) 콘쥬게이트의 하나의 합성방법(방법 B)을 도시한 것이다.
도 4는 48시간(A) 및 72시간(B)에서의 백금-내성 난소암 세포(2008-c13)의 억제에 대한 본 발명의 한 양태에 따르는 백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트의 효과를 도시한 것이다.
도 5는 48시간(A) 및 72시간(B)에서의 백금-민감성 난소암 세포(2008)의 억제에 대한 본 발명의 한 양태에 따르는 백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트의 효과를 도시한 것이다.
도 6은 48시간에서의 백금-내성 난소암 세포주(2008-c13)에서 시스플라틴(CDDP)(a) 및 본 발명의 한 양태에 따르는 백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트(PC)(b)의 세포사멸 효과를 보여주는 유세포 분석결과이다.
도 7은 48시간(A) 및 72시간(B)동안 다양한 농도에서의 시스플라틴(CDDP) 또는 본 발명에 따르는 백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트(PC)로 처리된 백금-내성 난소암 세포주 2008-c13에서 유세포 분석기로 측정한 사멸 세포의 비율(%)을 나타낸 것이다.
도 8은 48시간동안 다양한 농도에서의 시스플라틴(CDDP) 또는 본 발명에 따르는 백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트(PC)로 처리된 백금-내성 난소암 세포주 2008-c13에서 TUNEL 분석기로 측정한 사멸 세포의 비율(%)을 나타낸 것이다.
도 9는 24시간(a) 및 94시간(b)에서의 유방 종양 성장에 대한 본 발명의 양태에 따르는 백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트의 생체내(in vivo) 효과를 도시한 것이다(단일 투여량, Pt 10 mg/kg).
도 10은 본 발명의 양태에 따르는 백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트 또는 콘드로이틴을 단독으로 투여한 후 24시간 및 94시간째의 괴사를 보여주는 종양의 H 및 E 염색 사진이다. 도 10a는 콘드로이틴이 투여된지 24시간째의 유방종양(13762)을 나타낸다. 도 10b는 백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트가 투여된지 24시간째의 유방종양(13762)을 나타낸다. 도 10c는 콘드로이틴이 투여된지 94시간째의 유방종양(13762)을 나타낸다. 도 10d는 백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트가 투여된지 94시간째의 유방종양(13762)을 나타낸다.
도 11은 백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트(PC) 또는 시스플라틴(CDDP)으로 처리한 2008-c13 세포로부터 PARP 단백질의 웨스턴 블랏팅 분석결과를 나타낸 것이다.
도 12는 48시간 후 백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트(PC) 또는 시스플라틴(CDDP)으로 처리한 2008-c13의 세포주기를 유세포 분석한 결과이다.
도 13은 적은 투여량의 백금-폴리사카라이드 콘쥬게이트(PC) 또는 시스플라틴(CDDP)으로 처리한 2008-c13 세포에서의 p21 전사체의 노던 블랏팅 분석결과(도 13a) 및 발현된 p21의 웨스턴 블랏팅 분석결과(도 13b)를 나타낸 것이다.
도 14a는 시스플라스틴(CDDP) 또는 콘쥬게이트(PC 또는 DDAP)에 대해 48시간동안 노출 후 서브(sub)-G1 분획의 투여량에 따른 증가를 유세포 분석한 결과이다.
도 14b는 CDDP 또는 PC(DDAP)에 대해 48시간동안 노출 후 2008-c13 세포에서 sub-G1 분획의 비율(%)을 나타낸 것이다.
도 15는 약물 노출 48시간 후 시스-다이아민다이클로로백금(II)(CDDP) 및 다이아민 다이카복실산 백금(PC 또는 DDAP)에 의해 유도된 세포사멸의 TUNEL 분석결과를 나타낸다.
도 16은 시스-다이아민다이클로로백금(II)(CDDP) 또는 다이아민 다이카복실산 백금(PC 또는 DDAP)으로 처리한 2008-c13 세포에서 절단된 카스파제(caspase)-3 및 특정 폴리(ADP-리보즈) 폴리머라제(PARP) 단편의 웨스턴 블랏팅 분석결과를 나타낸다.
도 17a는 시스-다이아민다이클로로백금(II)(CDDP) 또는 다이아민 다이카복실산 백금(PC 또는 DDAP)으로 48시간동안 처리한 후의 2008-c13 세포주에서 세포 주기 분포를 나타내는 것이다.
도 17b는 시스-다이아민다이클로로백금(II)(CDDP) 또는 다이아민 다이카복실산 백금(PC 또는 DDAP)에 48시간동안 노출시킨 후 2008-c13 세포에서 p21 및 사이클린 A 발현의 웨스턴 블랏팅 분석결과를 나타낸다.
Claims (17)
- 폴리사카라이드; 폴리사카라이드에 공유결합된 O-기를 가지는 하나 이상의 단량체성 아미노산; 및 아미노산의 O-기에 의해서 콘쥬게이트된 하나 이상의 금속을 포함하는, 폴리사카라이드 콘쥬게이트.
- 제 1 항에 있어서,약 20,000 달톤 내지 약 50,000 달톤의 분자량을 가지는 폴리사카라이드 콘쥬게이트.
- 제 1 항에 있어서,폴리사카라이드가 콜라겐, 콘드로이틴, 히아우라니에이트(hyauraniate), 키토산 및 키틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리사카라이드 콘쥬게이트.
- 제 1 항에 있어서,폴리사카라이드가 콘드로이틴을 포함하는 폴리사카라이드 콘쥬게이트.
- 제 1 항에 있어서,단량체성 아미노산이 아스파트산, 글루탐산, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 글리신 및 그들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리사카라이드 콘쥬게이트.
- 제 1 항에 있어서,단량체성 아미노산이 아스파트산을 포함하는 폴리사카라이드 콘쥬게이트.
- 제 1 항에 있어서,약 10중량% 내지 약 50중량%의 단량체성 아미노산을 포함하는 폴리사카라이드 콘쥬게이트.
- 제 1 항에 있어서,금속 포함 약물을 추가적으로 포함하는 폴리사카라이드 콘쥬게이트.
- 제 1 항에 있어서,금속이 치료금속(therapeutic metal)인 폴리사카라이드 콘쥬게이트.
- 제 1 항에 있어서,금속이 백금, 철, 가돌리늄, 레늄, 망간, 코발트, 인듐, 갈륨, 로듐 및 그들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리사카라이드 콘쥬게이트.
- 제 1 항에 있어서,금속이 백금(II)을 포함하는 폴리사카라이드 콘쥬게이트.
- 제 1 항에 있어서,금속이 백금(IV)를 포함하는 폴리사카라이드 콘쥬게이트
- 제 1 항에 있어서,약 10중량% 내지 약 50중량%의 금속을 포함하는 폴리사카라이드 콘쥬게이트.
- 제 8 항에 있어서,약 10중량% 내지 약 50중량%의 금속 포함 약물을 포함하는 폴리사카라이드 콘쥬게이트.
- 제 1 항에 있어서,약 15중량% 내지 약 30 중량%의 백금(II) 또는 백금(IV) 금속 및 대략 70중량%의 아스파트산 단량체성 아미노산을 포함하고 약 26,000 내지 약 30,000 달톤의 분자량을 가지는 폴리사카라이드 콘쥬게이트.
- O-기를 가지는 단량체성 아미노산을 폴리사카라이드에 공유결합시키는 단계: 및O-기에 금속을 콘쥬게이트하여 폴리사카라이드 콘쥬게이트를 형성하는 단계를 포함하는,폴리사카라이드 콘쥬게이트의 합성방법.
- 제 16 항에 있어서,폴리사카라이드를 건조시켜서 분말을 형성하는 단계를 추가적으로 포함하는 폴리사카라이드 콘쥬게이트의 합성방법.
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