RU2794885C1 - Натрий-кобальт-полигалактуронат, обладающий противоопухолевой активностью - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к области медицины, а именно к применению натрий-кобальт-полигалактуроната (ПГNaCo) в качестве средства, обладающего цитотоксической активностью в отношении карциномы легкого А549 и аденокарциномы молочной железы MCF-7. Настоящее изобретение обеспечивает реализацию назначения.

Description

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, в частности, к металлокомплексу пектинового биополимера, обладающего противоопухолевой активностью в отношении карциномы легкого A549, аденокарциномы молочной железы MCF-7, и может найти применение в медицине и фармакологии.

На сегодняшний день онкологические заболевания занимают второе место по смертности после сердечно-сосудистых заболеваний. Существует более 200 типов злокачественных опухолей человека и между опухолями даже одного органа имеются различия в гистологическом строении, в особенностях роста, во взаимодействии с организмом и т.д. Основной недостаток имеющихся в аптечной сети противоопухолевых лекарственных препаратов – это высокая токсичность, низкая биодоступность и отсутствие селективности к нормальным клеткам живых организмов.

Поэтому снижение токсичности известных противоопухолевых лекарственных средств при сохранении их эффективности остается актуальной задачей. Из литературы известно, что для повышения эффективности лечения опухолевых заболеваний необходимо создание новых, более избирательно действующих на опухолевые клетки препаратов, оптимизация методик применения противоопухолевых агентов, совершенствование химиотерапии как звена или этапа комплексного и комбинированного лечения больных со злокачественными опухолями, применение фармакологических средств с целью уменьшения побочного действия противоопухолевых препаратов и т.д. [Панкратов Андрей Александрович. Автореферат диссертации «Противоопухолевая эффективность и токсичность бинарных каталитических систем на основе металлокомплексов кобальта: Экспериментальное исследование» на соискание степени к.б.н. по специальности 14.00.14. – 31 с.].

Использование биополимеров, в том числе пектиновых полисахаридов – перспективный подход для решения поставленной задачи. Пектины привлекают все большее внимание исследователей в качестве потенциальных препаратов и биологически активных добавок в составе терапии злокачественных опухолей, особенно в торможении метастазирования и реабилитации после химиотерапии. Пектиновые полисахариды – растительные биополимеры полиуронидной природы, обладающие функциональными свойствами (комплексообразующей и гелеобразующей способностью), что обуславливает их перспективность в качестве радиопротекторов для выведения из организма радионуклидов, а также в пищевой промышленности (Е440). Пектины входят в состав клеточных стенок растений [Оводов Ю.С. / Современные представления о пектиновых веществах // Биоорганическая химия, 2009. Т. 35. № 3. С. 293-310 (обзор); Graham B. Seymour, J. Paul Knox / Pectins and their Manipulation // U.S.A. Canada CRC Press. 2002. 250 р.; Pectin: Chemical Properties, Uses and Health Benefits (Food Science and Technology) / Ed. Ph.L. Bush. New York: Nova science publishers, 2014. 268 р.], ими богаты употребляемые в пищу овощи и фрукты. Основными производимыми в мире промышленными видами коммерческого пектина являются яблочный и цитрусовый пектины.

Пектиновые полисахариды и продукты их модификации обладают широким спектром биологической активности: иммуномодулирующей, противовоспалительной, антибактериальной, антиоксидантной и противоопухолевой активностью [S.T. Minzanova, V.F. Mironov, D.M. Arkhipova, A.V. Khabibullina, L.G. Mironova, Y.M. Zakirova, V.A. Milyukov. Biological Activity and Pharmacological Application of Pectic Polysaccharides: A Review // Polymers. 2018, 10(12), 1407. DOI: 10.3390/polym10121407].

Известно, что извлеченные из растительного сырья нативные пектины, и в большей степени модифицированные различными способами пектины, уменьшают пролиферацию, миграцию и адгезию раковых клеток и индуцируют апоптоз на различных опухолевых линиях [Maxwell, E.G.; Colquhoun, I.J.; Chau, H.K.; Hotchkiss, A.T.; Waldron, K.W.; Morris, V.J.; Belshaw, N.J. Rhamnogalacturonan I containing homogalacturonan inhibits colon cancer cell proliferation by decreasing ICAM1 expression // Carbohydr. Polym. 2015. 132, 546–553]. Maxwell E.G. с соавторами оценивали эффективность пектинов из разных источников (картофель, сахарная свекла, лиственница и цитрусовые) для лечения рака толстой кишки. Рак ободочной и прямой кишки является третьим наиболее распространенным раком в мире, связанным с питанием. Исследования показали, что увеличение потребления фруктов и овощей способствует снижению риска развития данного заболевания. Авторами установлено, что варьированием дозы рамногалактуронана-I экстрактов картофельного пектина можно снизить пролиферацию раковых клеток толстой кишки.

В патентном документе [US5895784 (A), – 1999-04-20] раскрывается способ лечения рака у млекопитающих для ингибирования метастазирования первичных опухолей путем перорального введения терапевтического количества модифицированного пектина, а именно пектина с модифицированным рН, имеющего молекулярную массу ~ 1–15 кДа (преимущественно 10 кДа), или заявляемой композиции, которая содержит смесь сухого цитрусового пектина с модифицированным рН и фармацевтически приемлемый перевариваемый носитель. На модели Dunning (R3327) аденокарциномы предстательной железы, разработанной Dunning из спонтанно возникающей аденокарциномы, которая при инъекциях 1 × 10⁶ клеток MLL в бедро крысы приводит к заболеванию. В течение примерно 25 дней распространения обширной инфекции, проиллюстрирована исследованная in vivo зависимость среднего количества метастаз (%) в легких от концентрации модифицированного цитрусового пектина (0.01%, 0.1%, 1.0%). Установлено, что концентрация модифицированного цитрусового пектина 1.0% обеспечивает максимальное снижение метастаз. Технический результат – снижение метастаз – обеспечивается пектином с модифицированным рН, который связывается с белками, связывающими углеводы на поверхности опухолевых клеток, например, деметоксилированной полигалактуроновой кислотой.

В [WO2009096789 (A1), 2009-08-06] предложена композиция, включающая галактоолигосахарид, фруктоолигосахарид и гидролизат пектина в соотношении (5-9):1:(2-10) соответственно, предназначенная для стимулирования активности естественных клеток-киллеров (NK-клеток, крупных гранулярных лимфоцитов) людей, у которых активность этих клеток снижена на 10-40% по сравнению со здоровыми людьми, в том числе у онкологических больных, для предотвращения прогрессирования заболевания. Авторами показано, что применение указанной композиции повышает активность NK-клеток, определяемой с помощью коммерчески доступного набора тестов NKTEST®, выпускаемого ORPEGEN Pharma, на 30-50%, по сравнению с активностью NK-клеток до поступления в организм заявляемой композиции. Преимущественно кислотные олигосахариды (получаемые из высокометоксилированного пектина) имеют степень метилирования 70%, меньше 50%, и еще меньше – 20%. Гидролизат пектина вводили в количестве от 10 мг до 100 г в день, либо от 100 мг до 50 г в день, либо от 500 мг до 20 г в день. Кроме того, предлагается применение композиции с дополнительным включением N-ацетилцистеина, также дополнительно композиция может включать белки, жиры, легко усвояемые углеводы, витамины и минералы – как минимум, 10% молочного белка и 10–50% жира от общей калорийности композиции.

Изобретение [CN113025674 (A), 2021-06-25] раскрывает способ получения продукта энзимолиза лимонного пектина (modified citrus pectin, МCP) с противоопухолевой активностью. Способ включает следующие стадии: трехкратный гидролиз пектиназой МСР в буфере (при pH буфера NaAc/HAc 4.2) при температуре 50 °С, проведение энзимолиза МСР пектиназой при комнатной температуре в течение ночи, нагревание на кипящей водяной бане в течение 10 мин, центрифугирование при 4000 об/мин в течение 15 мин после охлаждения для удаления инактивированной пектиназы, диализ в диализном мешке с отделением фракции с молекулярной массой 1000 Да с получением смешанного продукта после энзимолиза МСР, а затем последовательное проведение разделения колоночной хроматографией и очистки продукта энзимолиза с использованием ДЭАЭ-целлюлозы и сефадекса для получения пяти очищенных продуктов ферментативного гидролиза пектина, имеющих различный моносахаридный состав. Изобретение раскрывает возможность применения продукта энзимолиза лимонного пектина против клеток рака молочной железы человека MCF-7 и против клеток немелкоклеточного рака легкого А549. Противоопухолевую активность каждого компонента ферментативного гидролиза МСР, оценивают по ингибированию пролиферации клеток рака молочной железы человека MCF-7 с высокой экспрессией галектина-3 и немелкоклеточного рака легкого А549. При условии введения дозы 63-2000 мкг/мл, после обработки клеток MCF-7 пятью компонентами пролиферативная активность клеток MCF-7 снижается соответственно до 53.4%, 55.4%, 61.0%, 36.7% и 45.9%; пролиферативная активность клеток А549 снижается соответственно до 89.3%, 64.8%, 53.4%, 57.4% и 82.8%.

Известен обзор авторов [Zhang, W., Xu, P., & Zhang, H. Pectin in cancer therapy: A review // Trends in Food Science & Technology, 2015. 44. 258–271. DOI: 10.1016/j.tifs.2015.04.001], в котором обобщены данные о потенциале коммерческих пектинов и пектинов из нетрадиционных растительных источников при терапии рака. Обоснована необходимость дополнительной проработки фундаментальных вопросов для продвижения пектина в терапии рака: подробное описание роли галектина-3 (Gal-3), модификация пектина как таковая, а также их фармакокинетика и фармакодинамика.

Известна работа [Lionel Leclere, Maude Fransolet, Francois Cote, Pierre Cambier, Thierry Arnould, Pierre Van Cutsem, Carine Michiels. Heat-Modified Citrus Pectin Induces Apoptosis-Like Cell Death and Autophagy in HepG2 and A549 Cancer Cells // PLOS ONE. 2015, 1-24. DOI: 10.1371/journal.pone.0115831], в которой авторы оценивали цитотоксичность термически фрагментированного цитрусового пектина и нативного цитрусового пектина по отношению к клеточным линиям гепатоцеллюларной карциномы (HepG2) и карциномы легкого (A549) через 24 часа и 48 часов инкубации. Клетки HepG2 и клетки A549 инкубировали в сравнении с контрольной средой, 50 мкМ этопозидом, 3 мг/мл термически фрагментированного цитрусового пектина или 3 мг/мл нативного цитрусового пектина. Фракция термически фрагментированного цитрусового пектина проявила противоопухолевую активность в отношении раковых клеток HepG2: она дает коэффициент клеточной смертности 95% при концентрации 5 мг/мл и имеет IC₅₀ 3 мг/мл. Противоопухолевая активность нативного цитрусового пектина очень незначительна.

Известна работа авторов [Delphi L., Sepehri H. Apple pectin: A natural source for cancer suppression in 4T1 breast cancer cells in vitro and express p53 in mouse bearing 4T1 cancer tumors, in vivo. Biomed. Pharmacother. 2016. 84. 637–644. DOI: 10.1016/j.biopha.2016.09.080], в которой описана способность яблочного пектина вызывать гибель раковых клеток и подавлять рост опухолей in vivo на модели рака груди мышей. Результаты исследований in vitro показали, что 0.1%-ная концентрация пектиновой кислоты может вызывать апоптоз, ингибировать рост опухолевых клеток (p <0,001) и уменьшать адгезию клеток. Кроме того, исследования in vivo на животной модели рака груди 4T1 показали, что пектиновая кислота может ингибировать рост опухолей за счет сверхэкспрессии p53 и увеличения количества апоптотических клеток.

Известна работа [Lin, L.; Wang, P.; Du, Z.; Wang, W.; Cong, Q.; Zheng, C.; Jin, C.; Ding, K.; Shao, C. Structural elucidation of a pectin from flowers of Lonicera japonica and its antipancreatic cancer activity // Int. J. Biol. Macromol. 2016. 88. 130–137. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2016.03.025], авторы которой показали, что пектиновый полисахарид из цветов Lonicera japonica перспективен для создания на его основе мощного лекарственного средства для лечения рака поджелудочной железы. Пектиновый полисахарид может ингибировать рост клеток рака поджелудочной железы PANC-1 в концентрации 1 мг/мл с коэффициентом ингибирования 52.1%.

Результаты авторов [Hadjira Hamai-Amara, Khalida Abdoun-Ouallouche, Assia Nacer-Khodja, Karima Abdelhafid, Abdelouafi Benmouloud & Assia Djefal-Kerrar. Optimization of the extraction of orange peel pectin and evaluation of its antiproliferative activity towards HEp2 cancer cells // Euro-Mediterranean Journal for Environmental Integration. 2020. 5, article number: 43] демонстрируют проапоптотический эффект химически модифицированного и облученного пектина, выделенного из апельсиновых корок на линию клеток рака гортани (HEp2). Самая сильная проапоптотическая активность по отношению к клеткам HEp2 наблюдалась через 72 часа контакта с химически модифицированным и облученным пектином из апельсиновых корок. С использованием этого модифицированного пектина была достигнута смертность раковых клеток 95% (IC₉₅ 5 мг /мл), при этом IC₅₀ 3.18 мг/мл.

Известен обзор M. Khotimchenko, в котором обсуждаются различные формы системы доставки лекарственных средств на основе пектина (гидрогели, таблетки, пленки, микросферы, наночастицы и т.д.) и представлена обширная литература по пектиновым биополимерам как средствам доставки лекарств в толстую кишку. Показано, что пектины могут подавлять рост опухоли за счет ингибирования роста клеток, уменьшения адгезии клеток [M. Khotimchenko. Pectin polymers for colon-targeted antitumor drug delivery // International Journal of Biological Macromolecules. 2020. 158. 1110–1124. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2020.05.002].

Авторами [Kamonrak Cheewatanakornkool, Sathit Niratisai, Somkamol Manchun, Crispin R. Dass, Pornsak Sriamornsak. Characterization and in vitro release studies of oral microbeads containing thiolated pectin – doxorubicin conjugates for colorectal cancer treatment // Asian journal of pharmaceutical sciences. 2017. 12 509–520; Cheewatanakornkool K, Niratisai S, Manchun S, Dass CR, Sriamornsak P. Thiolated pectin-doxorubicin conjugates: Synthesis, characterization and anticancer activity studies // Carbohydr. Polym. 2017. V. 174. P. 493-506. DOI: 10.1016/j.carbpol.2017.06.115] получены конъюгаты тиолированный пектин-доксорубицин (DOX), определены характеристики, физико-химические свойства и морфология тиолированных пектинов и конъюгатов тиолированный пектин – DOX. Противораковая активность in vitro конъюгатов тиолированного пектина и DOX была значительно выше, чем у свободного DOX, в клетках карциномы толстой кишки и остеосаркомы костей человека, но незначительно отличалась от активности нативного DOX в клетках рака простаты человека. Это обуславливает перспективность конъюгатов тиолированный пектин-DOX для доставки DOX, направленного на лечение колоректального рака.

Авторами [Indu Hira, Reena Kumari, Adesh Kumar Saini, Henok Gullilat, Vipin Saini, Anil Kumar Sharma, Reena V. Saini. Apoptotic Cell Death Induction Through Pectin, Guar Gum and Zinc Oxide Nanocomposite in A549 Lung Adenocarcinomas // Biointerface Research in Applied Chemistry. 2022. 12. 2. 1856–1869. DOI: 10.33263/BRIAC122.18561869] выявлен in vivo противораковый потенциал нанокомпозита Pec-gg-ZnO в отношении клеток карциномы легкого A549, карциномы шейки матки (HeLa) и аденокарциномы предстательной железы (PC-3). Значения IC₅₀ составляли 83.67 ± 0.10 мкг/мл, 87.25 ± 0.03 мкг/мл и 85.95 ± 0.03 мкг/мл для клеток A549, HeLa и PC-3 соответственно. Способность убивать раковые клетки шейки матки (HeLa) у нанокомпозита была значительно выше, чем у пектина (IC₅₀ 781.70 ± 0.09 мкг/мл) и гуаровой камеди (IC₅₀ 374.20 ± 0.08 мкг/мл).

В работе [Противоопухолевая активность пектинов различной молекулярной массы / Е.А. Леонтьева, В.В. Вихарева, А.А. Калитник, М.Ю. Хотимченко // Тихоокеанский медицинский журнал, 2020. № 4 (82). 68–72. DOI: 10.34215/1609-1175-2020-4-68-72] приведен анализ зависимости противоопухолевых свойств различных пектинов от структурных особенностей и молекулярной массы. Для исследования противоопухолевого действия полисахаридов были использованы клеточные линии мышиной аденокарциномы молочной железы C127, карциномы шейки матки HeLa, карциномы толстой кишки человека SW620, аденокарциномы молочной железы человека HTB-30 и нормальные клетки сетчатки глаза RPE. Оценку противоопухолевого и цитотоксического действия пектинов проводили с помощью теста на метаболическую активность методом МТТ-анализа и с помощью прижизненной окраски флуоресцентными ДНК-связывающими красителями Hoechst и пропидия йодидом живых и мертвых клеток. Показано, что образцы цитрусовых пектинов во всем выбранном диапазоне концентраций обладали значительным противоопухолевым эффектом по отношению к клеточной линии аденокарциномы C127, снижая метаболическую активность и пролиферацию клеток, а также проявляя выраженный цитотоксический эффект.

Противоопухолевые препараты, содержащие в своем составе ионы металлов, играют важную роль в химиотерапии опухолей.

В литературе известна высокая цитотоксическая активность координационных соединений биогенных металлов [D.A. Guk, O.O. Krasnovskaya, E.K. Beloglazkina. Russ. Chem. Rev., 2021. 90 (12). 1566 – 1623 (обзор). https://doi.org/10.1070/RCR5016?locatt=label:RUSSIAN] и каталитических систем (комплексы переходных металлов (Со, Fe, Мn и др.), а также их перспективность в качестве потенциальных противоопухолевых агентов. В приведенном обзоре показано, как варьирование структуры лиганда может заметно изменить не только цитотоксичность координационного соединения, но и механизм связывания с ДНК, а в некоторых случаях сделать основным другой механизм цитотоксического действия.

В работе [Панкратов Андрей Александрович. Автореферат диссертации «Противоопухолевая эффективность и токсичность бинарных каталитических систем на основе металлокомплексов кобальта: Экспериментальное исследование» на соискание степени к.б.н. по специальности 14.00.14. – 31 с.] автором изучены противоопухолевые и токсические свойства бинарных каталитических систем на основе комплексов кобальта и аскорбиновой кислоты на экспериментальных животных in vivo.

Заявителем в предшествующем уровне техники не выявлены пектиновые металлокомплексы, проявляющие цитотоксическую активность в отношении опухолевой клеточной линии А549 (карцинома легкого человека), MCF-7 (аденокарциномы молочной железы). Известны первичные данные по угнетению жизнеспособности клеток карциномы шейки матки М-HeLa при воздействии натрий-кобальт-полигалактуроната (ПГNaCo), величина IC₅₀ составила 2.00%±0.20, полученные авторским коллективом заявителя [Минзанова С.Т., Волошина А.Д., Архипова Д.М., Краюшкина А.В., Миронова Л.Г., Сапунова А.С., Куфелкина А.А., Кулик Н.В., Миронов В.Ф., Милюков В.А. Синтез и противоопухолевая активность комплексов кобальта с полигалактуронатом натрия // Материалы ХШ Международной конференции «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования», Сочи, 4-8 июня 2018 г. – Москва: РУДН, 2018. – С. 634-637].

Проведенный анализ литературных данных демонстрирует, что реакция опухолевых клеток на действие пектинов зависит как от типа используемого соединения (пектины из различных растительных источников, пектины с различными свойствами, такими, как молекулярная масса, вязкость, степень этерификации), так и от чувствительности самих клеток к пектинам. Кроме того, некоторые пектиновые препараты плохо растворимы в воде, из-за чего для достижения терапевтического эффекта возникает необходимость увеличения дозы препарата, что в свою очередь вызывает сильные побочные эффекты. Известно, что с увеличением растворимости лекарственных препаратов для перорального приема повышается их эффективность, поэтому создание биодоступных (водорастворимых или жирорастворимых) лекарственных средств на основе пектиновых биополимеров остается актуальной задачей.

Серьёзной медицинской и социальной проблемой являются рак лёгкого и рак молочной железы. В развитых странах рак легкого является наиболее часто встречающейся злокачественной опухолью и наиболее распространённой причиной смерти от онкологической патологии. Согласно данным международного агентства по изучению рака, ежегодно в мире регистрируется около одного миллиона новых случаев рака лёгкого, и 60% онкологических больных погибает в результате данного заболевания. В России рак лёгкого занимает первое место среди онкологических заболеваний, его доля в данной патологии составляет двенадцать процентов, а в пятнадцати процентов случаев у умерших онкобольных был выставлен диагноз рак лёгкого. По данным ВОЗ 2000 года мужчины болеют раком лёгкого значительно чаще: рак лёгкого стал причиной смерти 32.0% мужчин, и 7.2% женщин, у которых были обнаружены какие-либо злокачественные новообразования [В.А. Нидюлин Б.В. Эрдниева. Об эпидемиологии рака лёгких // Медицинский вестник Башкортостана: обзорная статья // Башкирский государственный медицинский университет, 2009. 4 (1). 66-71. ISSN 1999-6209].

C раком молочной железы в России сталкивается каждая десятая женщина. Самым распространённым типом онкологической патологии грудных желез является аденокарцинома, она бывает двух видов: как новообразование, развивающееся в дольках молочной железы (10%); или как опухоль, которая возникает в грудных протоках (90%). Диагностика аденокарциномы молочной железы обязательно включает в себя стандартные клинические анализы крови и мочи, также оценивается гормональный фон. Кроме того, сдаётся кровь на онкологические маркеры (наибольшее значение имеет показатель специфического антигена СА15-3). По показаниям проводится генетическое тестирование для определённых генов [Хирургические болезни: учебник / под редакцией А.Ф. Черноусова. М.: ГЭОТАР-МЕДИА, 2010. 664 с. – ISBN 978-5-9704-1278-7].

Рак шейки матки – злокачественное новообразование, возникающее в области шейки матки. Гистологически различают две его основные разновидности: карцинома и плоскоклеточный рак. Заболеваемость раком шейки матки значительно превышает заболеваемость другими опухолями женской половой системы. В начале XXI века отмечается увеличение больных раком шейки матки на поздних стадиях: доля рака IV стадии, по разным данным, составляет 37,1 % – 47,3 % [Палийчук О.В., Полищук Л.З. Роль инфекционных факторов в этиологии и патогенезе интраэпителиальной неоплазии и рака шейки матки // Репродуктивное здоровье женщины. 2007. 32 (3). 10–16; Современные подходы к хирургическому лечению шейки матки. Доклад Морхова К.Ю. на онкологическом съезде «Белые ночи». 2015; https://www.youtube.com/watch?v=sX0Jkgu2-o0].

Техническая проблема, на решение которой направлено изобретение, состоит в расширении арсенала водорастворимых средств на основе пектинового биополимера, обладающих при этом цитотоксической активностью в отношении опухолевой клеточной линии карциномы легкого человека А549, аденокарциномы молочной железы MCF-7, практически не оказывающих токсического влияния на нормальные клетки человека.

Техническим результатом, обеспечиваемым изобретением, является реализация изобретением указанного назначения.

Техническая проблема решается, и технический результат достигается предложенным изобретением, относящимся к средству, обладающему селективным противоопухолевым действием при карциноме легкого А549 и аденокарциноме молочной железы MCF-7, при этом не оказывающим влияния на нормальные клетки человека средствами – водорастворимому натрий-кобальт-полигалактуронату (ПГNaCo).

Согласно классификации опасности веществ по степени воздействия на организм [ГОСТ 12.1.007.76 и Измеров Н.Ф., Саноцкий И.В., Сидоров К.К., Параметры токсикометрии промышленных ядов при однократном введении (справочник), М.: Медицина, 1977. С. 196-197] заявленное противоопухолевое средство не проявляет токсических эффектов на экспериментальных животных. При пероральном введении мышам в дозах 5000-15000 мг/кг не вызывает гибели животных. Это позволяет отнести заявляемое средство к классу малотоксичных (малоопасных) соединений.

Натрий-кобальт-полигалактуронат (ПГNaCo) со степенью солеобразования 100% известен из уровня техники, включая сведения о структуре, характеристиках и способе получения [RU 2219187 C1, 20.12.2003; S.T. Minzanova, V.F. Mironov, A.B. Vyshtakalyuk, O.V. Tsepaeva, L.G. Mironova, A.Z. Mindubaev, I.R. Nizameev, K.V. Kholin, V.A. Milyukov. Complexation of pectin with macro- and microelements. Antianemic activity of Na, Fe and Na, Ca, Fe complexes // Carbohydrate Polymers, 2015. 134. 524-533 (DOI: 10.1016/j.carbpol.2015.07.034); В.Ф. Миронов, А.Н. Карасева, О.В. Цепаева, А.Б. Выштакалюк, С.Т. Минзанова, В.И. Морозов, В.В. Карлин, Э.Р. Юнусов, А.З. Миндубаев. Некоторые новые аспекты комплексообразования пектиновых полисахаридов с катионами d-металлов. // Химия и компьютерное моделирование. Бутлеровские сообщения. 2003. 4 (1-3). С. 45-50].

Содержание металлов в заявляемом средстве – 4.68 (Na), 3.28 (Co) –определено методом атомно-эмиссионной спектроскопии на АЭС ИСП iCAP 6300 DUO. Удельное оптическое вращение металлокомплекса пектина измерялось на поляриметре Perkin-Elmer 341 (концентрация c дана в г/100 мл, длина волны 589 нм, температура 20°С) – [α]_D ²⁰ = +201.7 (С 0.5; H₂O). Элементный состав образцов определен на приборе Euro EA – CHNSO Elemental Analyser с использованием стандарта стрептоцид (C₆H₈O₂N₂S) – С = 31.91, Н = 4.70-4.51, N = 0.40.

Способ получения натрий-кобальт-полигалактуроната (ПГNaCo) описан в [RU 2281957 C1, 20.08.2006].

Как уже упоминалось, противоопухолевые свойства в отношении карциномы шейки матки М-HeLa натрий-кобальт-полигалактуроната (ПГNaCo) ранее нами описаны [Минзанова С.Т., Волошина А.Д., Архипова Д.М., Краюшкина А.В., Миронова Л.Г., Сапунова А.С., Куфелкина А.А., Кулик Н.В., Миронов В.Ф., Милюков В.А. Синтез и противоопухолевая активность комплексов кобальта с полигалактуронатом натрия // Материалы ХШ Международной конференции «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования», Сочи, 4-8 июня 2018 г. – Москва: РУДН, 2018. С. 634-637], однако способность ПГNaCo ингибировать рост онкоклеток карциномы легкого А549 и аденокарциномы молочной железы MCF-7, не известны заявителю из уровня техники.

Оценка цитотоксического действия заявляемого средства на клетки опухолевых линий осуществлялась in vitro на культурах клеток карциномы легкого человека А549, аденокарциномы молочной железы MCF-7 (плевральная жидкость) из коллекций Института цитологии РАН (Санкт-Петербург); в качестве нормальных клеточных линий были использованы клетки печени (Chang liver из коллекции НИИ вирусологии РАМН (Москва).

Цитотоксическое действие заявляемого средства определяют путем подсчета жизнеспособных клеток опухолевых культур А549, MCF-7, а также культуры нормальных клеток печени (Chang liver) с помощью многофункциональной системы Cytell Cell Imaging (GE Helthcare Life Science, Швеция), используя приложение Cell Viability BioApp, которое позволяет точно подсчитать количество клеток, оценить их жизнеспособность на основании интенсивности флуоресценции [A.D. Voloshina, A.S. Sapunova, N.V. Kulik, M.G. Belenok, I.Yu. Strobykina, A.P. Lyubina, S.K. Gumerova, V.E. Kataev, Antimicrobial and cytotoxic effects of ammonium derivatives of diterpenoids steviol and isosteviol, Bioorg. Med. Chem. 32 (2021) 115974. https://doi.org/10.1016/j.bmc.2020.115974].

Для культивирования клеток используют стандартную питательную среду «Игла» производства Московского института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова фирмы «ПанЭко» с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% заменимых аминокислот.

Рассев клеток проводят на 96-луночную панель фирмы «Eppendorf» в концентрации 100 тыс. кл/мл в каждую лунку в объёме 150 мкл среды и культивируют в СО₂-инкубаторе при 37°С. Через 24 ч после посадки клеток в лунки отбирают культуральную среду, а в лунки вносят по 150 мкл растворов изучаемого препарата в заданных разведениях. Разведения соединений готовят непосредственно в ростовой питательной среде.

Цитотоксическое действие заявляемого средства определяют в следующих концентрациях, масс. %: 0.047%, 0.093%, 0.1875%, 0.375%, 0.75%.

Расчет ингибирующей концентрации, при которой погибает 50% клеток, – IC₅₀ – производят с помощью онлайн-калькулятора: MLA – «Калькулятор Quest Graph ™ IC50». AAT Bioquest, Inc, 4 июня 2021 г., https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator [V. Kaur, M. Kumar, A. Kumar, K. Kaur, V. Singh Dhillon, S. Kaur, Pharmacotherapeutic potential of phytochemicals: Implications in cancer chemoprevention and future perspectives // Biomed. Pharmacother. 2018. 97. 564–586. DOI: 10.1016/j.biopha.2017.10.124].

Ингибирующая концентрация IC₅₀ натрий-кобальт-полигалактуроната (ПГNaCo) в отношении карциномы легкого А549 составила 0.023±0.002, в отношении аденокарциномы молочной железы MCF-7 – 2.2±0.2, в отношении культуры нормальных клеток печени (Chang liver) – 0.9±0.07.

Индекс селективности (SI) рассчитывают, как отношение значения IC₅₀ для нормальных клеток к значению IC₅₀ для раковых клеток; высокоселективными считаются соединения с SI≥10 [Peña-Morán O, Villarreal M, Álvarez-Berber L, Meneses-Acosta A, Rodríguez-López V. Cytotoxicity, post-treatment recovery, and selectivity analysis of naturally occurring podophyllotoxins from bursera fagaroides var. fagaroides on breast cancer cell lines // Molecules. 2016; 21 (8). 1013. DOI: 10.3390/molecules21081013], другие источники селективными называют соединения с SI≥3 [M. Ayoup, Y. Wahby, H. Abdel-Hamid, E. Ramadan, M. Teleb, M. Abu-Serie, A. Noby, Design, synthesis and biological evaluatесть ешion of novel a-acyloxy carboxamides via Passerini reaction as caspase 3/7 activators, Eur. J. Med. Chem. 168 (2019) 340-356. DOI: 10.1016/j.ejmech.2019.02.051].

Натрий-кобальт-полигалактуронат (ПГNaCo) продемонстрировал высокую селективность в отношении карциномы легкого А549 – индекс селективности (SI) 39.

Данные по цитотоксической активности и селективности заявляемого противоопухолевого средства сравнивают с данными противоопухолевых препаратов растительного происхождения, в качестве препаратов сравнения используют исходный цитрусовый пектин, метанольный экстракт Thymus vulgaris L. (тимьян обыкновенный) [Балакина А.А., Кузьмина Е.А., Древова А.Н., Мубарак М.М., Карсункина Н.П., Калашникова Е.А., Чередниченко М.Ю. Оценка цитотоксического действия экстрактов из лекарственных растений на клеточную линию М-HeLa. Электронный научно-производственный журнал «АгроЭкоИнфо»] и лекарственный препарат Арглабин, представляющий собой лиофилизат биологически активного сесквитерпенового лактона, выделенного из полыни гладкой Artemisia glabella (Карагандинский фармацевтический комплекс, ТОО) [Н.А. Неверова, А.Н. Жабаева, А.А. Левчук, В.А. Бабкин, А.Р. Бейсенбаев, Л.И. Ларина, А.Н. Сапожников, С.М. Адекенов. Исследование физико-химических свойств механообработанного арглабина и его механокомпозитов на основе арабиногалактана. Химия растительного сырья. 2019. 4. 105–112. DOI: 10.14258/jcprm.2019046259].

Водорастворимый ПГNaCo продемонстрировал высокую цитотоксичность в отношении опухолевых клеток карциномы легкого человека А549 – IC₅₀ 0.023% (IC₅₀ метанольного экстракта Thymus vulgaris L. (тимьян обыкновенный) составляет 0.34%) при высоком индексе селективности, равном 39 (IC₅₀ 0.9% в отношении Chang liver). При этом в отношении аденокарциномы молочной железы MCF-7 цитотокисчность ПГNaCo ниже цитотоксичности метанольного экстракта Thymus vulgaris L. (тимьян обыкновенный) – IC₅₀ 2.2% против IC₅₀ 0.14% соответственно.

Пектин цитрусовый не обладает селективностью, показатели его цитотоксичности (IC₅₀) в отношении всех видов раковых клеток и нормальных клеток печени (Chang liver) превышают 1.5%.

Лекарственный препарат Арглабин является эффективным противоопухолевым средством широкого действия, активным в отношении опухолевых клеток карциномы легкого человека А549 (IC₅₀ 0.0008), аденокарциномы молочной железы MCF-7 (IC₅₀ 0.0008). Основным недостатком препарата сравнения Арглабин является полное отсутствие селективности, показатель его цитотоксичности (IC₅₀) в отношении нормальных клеток печени (Chang liver) составляет 0.0006. Показатель индекса селективности лекарственного препарата Арглабин в отношении клеток опухолевых линий очень низкий: в отношении А549 и MCF-7 равен 0.8.

Таким образом, заявлено средство, расширяющее арсенал противоопухолевых водорастворимых средств на основе пектинового биополимера, обладающего биодоступностью, малотоксичностью (ЛД₅₀ выше 15000 мг/кг), высокоселективной цитотоксической активностью в отношении опухолевой клеточной линии карциномы легкого человека А549, активностью в отношении аденокарциномы молочной железы MCF-7 и практически не оказывающего токсического влияния на нормальные клетки человека, что обусловливает возможность его использования в качестве противоопухолевого препарата.

Claims (1)

1. Применение натрий-кобальт-полигалактуроната (ПГNaCo) в качестве средства, обладающего цитотоксической активностью в отношении карциномы легкого А549 и аденокарциномы молочной железы MCF-7.