KR20080106289A - 인자 ⅷ의 ｃ1 도메인에 대향하는 저해 항체의 저해 활성을중화시키는 항-개별특이형의 항체들 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인자 VIII의 C1 도메인에 결합하는 인자 VIII-저해 항체에 대향하는 항-개별특이형 모노클로날 항체에 관한 것이고, 또한 이 항-개별특이형 모노클로날 항체를 생산하는 세포주에 관한 것이고, 이 항-개별특이형 모노클로날 항체의 약물로서의 용도에 관한 것이며, 특히 A형 혈우병의 처치에서 사용되기 위한 약물의 제조에 관한 것이다.
항-개별특이형, 모노클로날, 항체, 혈우병, C1 도메인, 인자 VIII
Description
본 발명은 인자 VIII의 C1 도메인에 결합되는 인자 VIII 저해 항체에 대향하는 모노클로날 항-개별특이형 항체, 이러한 모노클로날 항-개별특이형 항체를 생산하는 세포주, 이러한 모노클로날 항-개별특이형 항체의 약물로서의 용도에 관한 것으로서, 특히 A형 혈우병(haemophilia A)의 치료를 위한 약물의 제조를 위한 그의 용도에 관한 것이다.
A형 혈우병은 X 염색체(chromosome X)의 이형(anomaly)과 관련된 유전병(hereditary disease)이며, 이것은 감염된 사람에게서 응고가 일어나지 않는 형태로 나타난다. 이 질병은 응고에 관여하는 단백질, 인자 VIII(FVIII) 단백질의 유전자 상에서의 돌연변이의 결과이며, 이는 혈액 중에서의 인자 VIII의 전체적 부재 또는 그의 부분적 부족을 결정한다.
A형 혈우병은 혈액 응고에 영향을 주는 가장 흔한 부전(insufficiencies) 중 가장 흔한 것이며; 프랑스에서는 5000명 당 1명 꼴의 남성이 감염되었으며, 이 는 혈우병으로 고통받는 환자들의 80%를 나타낸다. 다른 형태의 혈우병인 B형 혈우병은 혈우병으로 고통받는 환자의 20%가 감염되며, 이는 인자 IX로 알려진 하나의 다른 응고인자의 결손에 의해 야기된다.
혈우병(A형 또는 B형)의 현재 치료는 결핍되거나 또는 부재하는 응고인자의 정맥 내 투여로 이루어진다. 프랑스에서는, 혈우병의 치료를 위한 인자 VIII은 유전공학 방법에 의해 제조된 재조합 약물들의 형태로 라보라토이레 프란카이스 듀 프락티온네멘드 에트 데스 바이오테크놀로지스(Laboratoire Francais du Fractionnement et des Biotechnologies (LFB)) 또는 인터네셔널 파마슈티칼 라보레토리즈(International Pharmaceutical Laboratories)에 의해 제공되는 혈액 유래의 약물들의 형태로 이용가능하다. 효과적으로는, DNA 암호화 인자 VIII은 포유동물 세포들에서 단리되고 그리고 발현되었으며(Wood et al., Nature (1984) 312 : 330-337), 그의 아미노산 서열은 cDNA로부터 추론되었다.
분비된 인자 VIII(FVIII)은 300Kda(2332 아미노산)의 분자량을 갖는 당단백질(glycoprotein)이며, 고유의 응집 경로의 활성화에서 핵심 역할을 수행한다. 비활성의 FVIII은 6개의 영역들 즉 N-말단으로부터 C-말단까지 A1(1 내지 372 잔기들), A2(373 내지 740 잔기들), B(741 내지 1648 잔기들), A3(1690 내지 2019 잔기들), C1(2020 내지 2172 잔기들) 및 C2(2173 내지 2332 잔기들)로 이루어진다. 분비된 후에는, FVIII은 폰빌레브란트 인자(Von Willebrand factor)에 작용하며, 이는 혈장 프로테아제(plasma proteases)에 대하여 상기 FVIII을 보호한다. FVIII은 트롬빈에 의한 분열에 의하여 vWF로부터 해리된다. 이러한 분열은 상기 B 영역의 제거 및 이종이합체(heterodimer)의 형성의 결과를 가져온다. FVIII은 이러한 형태로 혈장 내에서 순환한다. 이 이종이합체는 중연쇄(A1, A2) 및 경연쇄(A3, C1, C2)로 구성된다.
FVIII이 혈우병 환자에 주입되는 경우, 이는 환자의 혈액순환 중에서 폰빌레브란트 인자에 결합한다. 활성화된 인자 FVIII은 활성화된 인자 IX의 보인자(co-factor)로서 작용하여 인자 X의 활성화된 인자 X로의 전환을 촉진한다. 활성화된 인자 X는 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환시킨다. 계속해서, 상기 트롬빈은 피브리노겐을 피브린으로 전환시키고, 응고가 일어난다.
인자 VIII 투여에서 마주치는 주요 문제는 "저해 항체(inhibiting antibodies)"라 언급되는 환자의 인자 VIII에 대향하는 항체들의 발현이다. 이들 항체들은 인자 VIII의 응고촉진 활성(procoagulant activity)을 중화시키고, 이는 주입되자마자 비활성화된다. 따라서, 주입된 응고인자는 출혈이 정지되기 전에 파괴되고, 이는 심각한 여병(complication)을 유도하고 상기 처치가 비효과적이 되도록 하는 원인이 된다. 더욱이, 일부 유전적으로 비-혈우병의 환자들은 내인성의 인자 VIII에 대한 저해제들을 개발시킬 수 있으며, 이는 후천성 혈우병(acquired haemophilia)으로 불리워진다.
상기 항-인자 VIII 면역 반응이 거의 IgG4 및 IgG1 아형(sub-class), 보다 드물게는 IgG2에 속하는 IgG 타입 폴리클로날이라는 것이 연구에서 밝혀졌다. 상기 IgG3 아형은 전혀 발현되지 않았다. 그 경연쇄는 종종 카파형(Kappa type)이다. IgG4의 과발현(overrepresentation)은 장기간 구축된 저해제를 갖는 혈우병환 자들에 대해서보다 뚜렷하다. 비록 몇몇 경우들에서 상기 A3 도메인에 직접적으로 대향하는 항체들이 검출되기는 하였으나, 상기 FVIII 분자의 상기 C2 및 A2 도메인들은 상기 면역반응의 가장 선호되는 목표들이다. 혈우병 환자들의 혈장이 FVIII로 고정된 면역흡착 컬럼(immunoadsorption column)을 통과시키는 경우, 전체 항-FVIII 항체들을 정제하는 것이 가능하다. 그 회수된 양은 종종 전체 IgG들 10㎎ 당 100㎍ 이상이다(Gilles JG et al. (1993) Blood ; 82 : 2452-2461). 인자 VIII의 저해제들의 형성을 연구하기 위한 동물 모델이 개발되었다. 인간 재조합 인자 VIII로 면역화시킨 생쥐들은 폴리클로날 형의 신속한 면역반응을 나타낸다(Jarvis et al., Thromb Haemost. 1996 Feb ; 75(2):318-25). 항-인자 VIII 항체들이 인자 VIII의 기능을 방해하는 메카니즘들은 다양하며, 인자 VIII의 단백질가수분해의 분열(proteolytic cleavage)의 방해 및 인자 VIII와 다른 참여자(partners)들 예를 들면 폰빌레브란트 인자(vWF), 인지질(PL), 인자 IX, 활성화된 인자 X(FXa) 또는 활성화된 단백질 C(APC ; Activated Protein C)들과의 상호작용의 방해를 포함한다.
이러한 면역반응의 영향력의 완화를 허용하는 몇 가지 치료가 이용가능한데, 예를 들면 인자 VIII의 생성을 자극하는 합성 호르몬인 데스모프레신(desmopressin), 프로트롬빈 복합체의 농축 또는 활성화된 프로트롬빈 복합체의 농축과 같은 응집촉진제제들(coagulation promoting agents), 재조합 인자 VIIa, 혈장사혈(plasmapheresis) 및 인자 VIII의 다량 또는 중간 정도의 양 주입과 관련된 치료들이다. 그럼에도 불구하고, 이들 방법들은 매우 고가이고 그리고 효율이 낮다.
이러한 면역 폴리클로날 반응(immune polyclonal response)의 생체 내 분석의 복잡성으로 인하여, 인자 VIII의 특정의 도메인들에 대향하는 모노클로날 항체들이 일부 연구팀들에 의해 단리되었다. 따라서, IgG4kappa 형의 인간모노클로날항체, LE2E9가 단리되었다. 이 항체는 인자 VIII의 상기 C1 도메인에 대향하며, 인자 VIII의 보인자 활성 및 그의 폰빌레브란트 인자에의 결합을 저해한다(Jacquemin et al., (2000) Blood 95:156-163). 동일한 방법으로, 저해제들을 갖는 A형 혈우병으로 고통받는 환자의 B기억세포(memory B cell)의 라이브러리로부터 생산된, BO2C11(IgG4kappa)로 언급되는, 인자 VIII의 C2 도메인에 대향하는 인간모노클로날 항체가 단리되었다(Jacquemin et al., Blood 1998 Jul 15;92 (2):496-506). BO2C11는 인자 VIII의 상기 C2 도메인을 인식하고 그리고 그의 폰빌레브란트 인자 및 인지질들에의 결합을 방해한다. 이는 본래의 그리고 활성화된 인자 VIII의 응고촉진 활성을 완전히 저해한다. 모노클로날 항체의 다른 예들로는 인자 VIII의 상기 A2 도메인에 대향하는 BOIIB2 항체를 들 수 있다. 상기 BOIIB2 항체는 인자 VIII 활성을 99% 저해한다. 상기 A2 도메인에의 결합에 의하여, FIXa의 결합을 방해하고 그리고 저해하며, 이는 FVIII의 이 영역 내에서의 낮은 친화도의 결합부위(binding site)를 포함하며, 따라서 FIXa의 효소 활성을 저해한다. 작용의 제2의 고려가능한 방법은 이들 복합체들의 상기 A2 도메인의 분해를 촉진시켜 그들에 비-기능성을 부여하는 것에 의한 그의 FVIII의 상기 이종이합체 형태(A2:A1 및 A3:C1:C2)와 FVIII의 이종삼합 형태(A2 및 Al 및 A3:C1:C2) 사이의 평형의 방해 이다(Ananyeva NM et al., (2004) Blood Coagul Fibrinolysis. Mar. 15(2):109-24. Review).
이들 새로운 도구들의 도움에 의하여, 더욱 최근의 상기 인자 VIII 저해제 항체들에 대한 전략적인 투쟁으로 상기 저해제 항체들을 중화시키는 항-개별특이형 항체들(다른 항체들의 가변부위(variable region)에 작용하는 능력을 갖는 항체들)의 투여가 고려되었다(Saint-Remy JM et al., (1999) Vox Sang ; 77 (suppl 1) : 21-24). 국제공개특허공보 제2004/014955호에서 기술된, 14C12로 알려진 생쥐 항-개별특이형 항체는 생체 내에서 용량의존적인 방법으로 항-인자 VIII 목표 항체(모노클로날 항체 BO2C11)의 저해 특성들을 중화시키며, 이는 인자 VIII의 상기 C2 도메인에 대향하는 것이다. 인자 VIII의 상기 A2 도메인에 대향하는 폴리클로날, 생쥐 항-개별특이형 항체들인 상기 항-인자 VIII 면역반응은 이미 개발되었다(이는 프랑스 특허출원 제FR 05 08320호에 기술되어 있다). 상기 A2 도메인은 43kD의 도메인이며, 그의 기능은 잘 알려져 있지는 않으나, 전이상태(transition state)에서의 복합체 FXase/FX의 전환을 저해하는 것에 의하여 인자 VIII의 상기 A2 도메인에 대향하는 저해 항체들이 인자 VIIIa의 기능을 저해한다는 것은 입증되었다(Lollar et al., J Clin Invest. 1994 Jun; 93(6):2497-504, Fay et al., J Biol Chem. 1996 ; 271(11) : 6027-6032).
그러나, 인자 VIII에 대향하는 상기 면역반응이 폴리클로날이며, 따라서, 저해 항체들이 상기 A2 및 C2 도메인들과 다른 도메인들에 대향한다는 것을 의미한다. 결국, 비록 항-인자 VIII 항체들의 에피토프 특정성(epitopic specificities) 의 연구가 대부분의 저해제들이 상기 중연쇄의 상기 A2 도메인 및/또는 상기 경연쇄의 상기 C2 도메인 상에 위치되는 상기 인자 VIII 분자의 제한된 영역들을 인식하는 것으로 나타나기는 하였으나, 다른 에피토프들이 때로 인식된다. 결국, 환자들로부터 수득되는 일부 혈장이 인자 VIII의 상기 경연쇄의 상기 C1 도메인에 결합할 수 있는 항체들을 포함한다(Moreau et al., 2000 ; 95(11) :3435-441 ; Jacquemin et al,. 2000 ; 95(1) :156-162).
따라서, 혈우병 환자들의 상기 항-인자 VIII 폴리클로날 반응들을 보다 완전하게 중화시키기 위하여 인자 VIII의 다른 도메인들에 대향하는 다른 인자 VIII 저해 항체들의 중화를 가능하게 하는 다른 도구들에 대한 요구가 있어 왔다.
따라서, 본 발명자(들)은 인자 VIII의 상기 C1 도메인에 대향하는 저해 항체들의 중화를 가능하게 하여 A형 혈우병을 치료하기 위한 신규한 도구를 개발하고자 시도하였다.
따라서, 본 발명의 제1의 목적은 인자 VIII 인간 저해 항체에 대향하는 모노클로날 항-개별특이형 항체에 관한 것이며, 이 저해 항체는 인자 VIII의 상기 C1 도메인에 대향하는 것이고, 이 항-개별특이형 항체는 상기 항체의 상기 경연쇄들 각각의 적어도 하나의 상보성결정영역(CDR ; Complementarity Determining Region)을 가지며, 여기에서 펩티드 서열은 서열 확인 번호(SEQ ID NO) 12, 서열 확인 번호 13, 서열 확인 번호 14 및 상기 항체의 중연쇄들 각각의 적어도 하나의 상보성결정영역에 대하여 적어도 70%의 동일성을 가지며, 여기에서 상기 펩티드 서열은 서열 확인 번호 9, 서열 확인 번호 10, 서열 확인 번호 11들로부터 선택된 서열에 적어도 70%의 동일성을 갖는다.
상기 관련된 상보성결정영역들은 CDR1 및/또는 CDR2 및/또는 CDR3 영역들이다.
상기 서열 확인 번호 9, 서열 확인 번호 10, 서열 확인 번호 11, 서열 확인 번호 12, 서열 확인 번호 13, 서열 확인 번호 14 서열들은 카밧(Kabat) 법에 따라 정의되었다(Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", NIH Publication, 91-3242 (1991)).
특히 바람직한 구체예에 있어서, 상기 언급된 서열들 각각에 대한 동일성(identity)는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 99%, 더욱 바람직하게는 100%이다. 동일성의 백분율은 비교되어야 할 2개의 서열들을 정렬시키고, 그리고 동일한 아미노산들을 갖는 위치들의 수를 계수하고, 이 수를 상기 서열의 아미노산들의 총 수로 나누는 것에 의하여 계산된다. 어떠한 경우에도, 이들 서열 차이들은 그의 목표에 대한 모노클로날 항체의 친화도 또는 그의 기능성에 전혀 영향을 미치지 않는다.
인자 VIII의 "저해 항체들" 또는 "저해제들"은 인자 VIII의 응고촉진 활성의 전부 또는 일부를 저해하는 항체들, 즉 그들에, 바람직하게는 그의 에피토프가 인자 VIII 상에 위치되는 항-인자 VIII 항체를 의미한다. 유리하게도, 본 발명의 항체는 인자 VIII의 상기 C1 도메인에 대향하는 저해 항체들의 응집저해 활성의 적어도 20%, 더 유리하게는 적어도 30%, 더 유리하게는 적어도 40%, 더 유리하게는 적어도 50%, 더 유리하게는 적어도 60%, 그리고 더욱 유리한 방법으로는 적어도 70%, 80%, 90%, 99% 또는 100% 중화시킬 수 있는 능력을 가지며, 이는 본 발명의 항-개별특이형 모노클로날 항체들의 목표들이다. 저해 항체들의 응집저해 활성을 중화시키는 이러한 능력은 "인자 VIII 크로모겐 테스트(Factor VIII chromogen test ; Jacquemin et al. (1998) Blood 92. 494-506) 등과 같은 분석법에서 저해 항체 및 항-개별특이형 항체의 존재 중에서의 인자 VIII의 활성을 측정하는 것에 의하여 결정될 수 있다.
"항-개별특이형 항체"라는 표현은 목표 저해 항체들의 가변부위에 대향하는 항체들을 의미한다. 본 발명의 특별한 관점에 있어서, 본 발명의 상기 항-개별특이형 항체는 저해 항체들에 대향하는 것이며, 상기 항체의 중연쇄의 가변부위가 생식세포주(germ line) DP-10에 관련된 것이다. 이러한 저해 항체들은 인자 VIII 또는 인자 VIII로부터 유도된 단편들, 특히 상기 C1 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 단편들로의 면역화에 의하여 인간(예를 들면, 저해 항체들을 포함하는 환자들의 정액으로부터) 또는 비-제한적인 목록으로부터 취해지는 쥐, 말, 염소, 비-인간 영장류들 등과 같은 다른 동물종으로부터 얻어질 수 있다.
유리하게도, 본 발명의 상기 항-개별특이형 항체의 상기 목표 저해 항체는 그의 본래의 배치 내의 상기 C1 도메인을 인식한다. 유리하게도, 본 발명의 상기 항-개별특이형 항체의 상기 목표 저해 항체는 R2150H 돌연변이인 동일한 도메인은 인식하지 못한다.
본 발명의 상기 모노클로날 항-개별특이형 항체는 인간 또는 동물 유래의 것이 될 수 있다. 게다가, 이는 다양한 서로 다른 방법들을 사용하여 수득될 수 있다. 예를 들면, 항-개별특이형 항체들을 생산하는 세포들은 항-인자 VIII 저해 항체들을 갖는 환자들 또는 건강한 사람들의 말초혈액 림프구(peripheral blood lymphocytes)들로부터 수득될 수 있다. 이들 세포들은 당해 기술분야에서 공지된 기술들의 사용에 의하여 불사화(immortalized)되고 그리고 생산된 항-개별특이형 항체들의 인자 VIII에 대향하는 저해 항체들을 중화시키는 능력에 관하여 선택될 수 있다. 본 발명의 상기 모노클로날 항-개별특이형 항체를 생산하는 다른 방법은 인자 VIII의 상기 C1 도메인에 대향하는 인자 VIII 저해 항체들의 주입에 의하여 그리고 계속해서 비장 림프구(spleen lymphocytes)들의 미엘로마 세포주(myeloma cell line), 바람직하게는 생쥐의 미엘로마에의 융합에 의하여 그리고 후속하여 상기 인자 VIII 저해 항체들에 대향하는 상기 항-개별특이형 항체들을 생산하는 세포 배양물들의 동일성 확인 및 클로닝(cloning)에 의하여 동물, 유리하게는 생쥐들의 면역화를 통한 것이다.
본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 상기 항-개별특이형 항체의 경연쇄의 각 상보성결정영역은 각각 서열 확인 번호 12, 서열 확인 번호 13 및 서열 확인 번호 14로 개별적으로 확인된 서열들과 적어도 70%의 동일성을 갖는 펩티드 서열을 포함하며, 상기 항체의 경연쇄들 각각의 각 상보성결정영역은 각각 서열 확인 번호 9, 서열 확인 번호 10 및 서열 확인 번호 11로 개별적으로 확인된 서열들과 적어도 70%의 동일성을 갖는 펩티드 서열을 포함한다.
따라서, 본 발명의 상기 항체의 경연쇄들 각각의 상기 상보성결정영역1은 서열 확인 번호 12 서열에 대하여 적어도 70%의 동일성을 갖는 펩티드 서열을 포함하고, 본 발명의 상기 항체의 경연쇄들 각각의 상기 상보성결정영역2는 서열 확인 번호 13 서열에 대하여 적어도 70%의 동일성을 갖는 펩티드 서열을 포함하고, 본 발명의 상기 항체의 경연쇄들 각각의 상기 상보성결정영역3은 서열 확인 번호 14 서열에 대하여 적어도 70%의 동일성을 갖는 펩티드 서열을 포함하고, 그리고 본 발명의 상기 항체의 중연쇄들 각각의 상기 상보성결정영역1은 서열 확인 번호 9 서열에 대하여 적어도 70%의 동일성을 갖는 펩티드 서열을 포함하고, 본 발명의 상기 항체의 중연쇄들 각각의 상기 상보성결정영역2는 서열 확인 번호 10 서열에 대하여 적어도 70%의 동일성을 갖는 펩티드 서열을 포함하고, 본 발명의 상기 항체의 중연쇄들 각각의 상기 상보성결정영역3은 서열 확인 번호 11 서열에 대하여 적어도 70%의 동일성을 갖는 펩티드 서열을 포함한다. 특별히 유리한 방법에 있어서, 앞서 언급된 서열들 각각에 대한 동일성은 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 99% 및 특히 바람직하게는 100%이다.
유리하게도, 본 발명의 상기 모노클로날 항-개별특이형 항체의 상기 경연쇄들 각각의 상기 가변부위는 핵산 서열 서열 확인 번호 16에 대하여 적어도 70%의 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화되고, 그리고 상기 모노클로날 항-개별특이형 항체의 상기 중연쇄들 각각의 상기 가변부위는 핵산 서열 서열 확인 번호 15에 대하여 적어도 70%의 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 상기 목적들을 위하여, 서열 확인 번호 15 및 서열 확인 번호 16 서열들에 신호(signal) 펩티드가 첨가되어 각각 예를 들면 서열 확인 번호 1 및 서열 확인 번호 2들을 수득할 수 있으며, 여기에서 본 발명의 상기 항체의 활성 또는 특이성 둘 다 이러한 신호 펩티드에 의해 영향을 받지 않는다.
특히 유리한 방법에 있어서, 상기 서열 동일성은 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 95 내지 99%이다. 동일성의 백분율은 비교되어야 할 2개의 서열들을 정렬시키고 그리고 동일한 뉴클레오티드를 포함하는 위치들의 수를 계수하고, 이 수를 상기 서열의 뉴클레오티드들의 총 수로 나누는 것에 의하여 계산된다. 유전 암호 축퇴(genetic code degeneration)는 동일한 아미노산은 서로 다른 뉴클레오티드들의 여러 3중항(triplets)들로 암호화될 수 있다는 사실을 유도한다. 어떠한 경우에도, 그의 목표에 대한 상기 모노클로날 항체의 친화성 또는 상기 목표 저해 항체들의 저해 활성을 중화시키는 그의 능력 둘 다 이들 서열 차이들에 의해 영향을 받지 않는다.
본 발명의 바람직한 관점에 있어서, 상기 모노클로날 항-개별특이형 항체의 상기 경연쇄들 각각의 상기 가변부위는 상기 핵산 서열 서열 확인 번호 16에 의해 암호화되고, 그리고 상기 모노클로날 항-개별특이형 항체의 상기 중연쇄들 각각의 상기 가변부위는 상기 핵산 서열 서열 확인 번호 15에 의해 암호화된다.
유리한 방법에 있어서, 본 발명의 상기 항체의 상기 경연쇄들의 상기 가변부위들 각각의 상기 펩티드 서열은 서열 서열 확인 번호 18에 대하여 적어도 70%의 동일성, 바람직하게는 적어도 80% 또는 90% 그리고 보다 바람직하게는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열이다.
본 발명의 상기 목적들을 위하여, 서열 확인 번호 17 및 서열 확인 번호 18 서열에 신호 펩티드가 첨가되어 각각 예를 들면 서열 확인 번호 3 및 서열 확인 번호 4들을 수득할 수 있으며, 여기에서 본 발명의 상기 항체의 활성 또는 특이성 둘 다 이러한 신호 펩티드에 의해 영향을 받지 않는다.
유리하게도, 본 발명의 상기 항체의 상기 중연쇄의 상기 가변부위들 각각의 펩티드 서열은 서열 서열 확인 번호 3에 대하여 적어도 70%의 동일성, 바람직하게는 적어도 80% 또는 90% 그리고 보다 바람직하게는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열이다.
유리한 방법에 있어서, 본 발명의 상기 항체의 상기 경연쇄들 각각의 상기 펩티드 서열은 서열 서열 확인 번호 4에 대하여 적어도 70%의 동일성, 바람직하게는 적어도 80% 또는 90% 그리고 보다 바람직하게는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열이고, 그리고 본 발명의 상기 항체의 상기 중연쇄들 각각의 상기 펩티드 서열은 서열 서열 확인 번호 3에 대하여 적어도 70%의 동일성, 바람직하게는 적어도 80% 또는 90% 그리고 보다 바람직하게는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열이다.
바람직하게는, 본 발명의 상기 항체의 상기 경연쇄들 각각의 상기 펩티드 서열은 서열 서열 확인 번호 4이다.
바람직하게는, 본 발명의 상기 항체의 상기 경연쇄들 각각의 상기 펩티드 서열은 서열 서열 확인 번호 3이다.
상기 서열 서열 번호 16으로부터 유도된 상기 펩티드 서열은 서열 서열 확인 번호 18이고, 그리고 상기 서열 서열 확인 번호 15로부터 유도된 상기 펩티드 서열은 서열 서열 확인 번호 17이다. 바람직하게는, 본 발명의 상기 모노클로날 항-개별특이형 항체의 상기 경연쇄들 각각의 상기 가변부위는 펩티드 서열 서열 확인 번호 18을 가지고, 그리고 본 발명의 상기 모노클로날 항-개별특이형 항체의 상기 중연쇄들 각각의 상기 가변부위는 펩티드 서열 서열 확인 번호 17을 갖는다.
바람직한 방법에 있어서, 본 발명의 상기 항-개별특이형 항체의 목표 저해 항체는 2004년 8월 콜렌 리서치 파운데이션(Collen Research Foundation)에 의해 승인 번호 LMBP 6165CB로 벨기에 B-9052 쯔위나르드 테크놀로지에파크 297 유니버시티 오브 겐트 라보라토리움 부르 몰레큘레어 바이올로지에(Laboratorium voor Moleculaire Biologie, University of Ghent, Technologiepark 297, B-9052 Zwijnaarede, Belgium)의 벨지안 코오디네이티드 컬렉션 오브 마이크로오르가니즘스/플라스미드 컬렉션(BCCM/LMBP ; Belgian Co-ordinated Collections of Microorganisms/Plasmid Collection)에 기탁된 항체 RHD5이다. 그의 뉴클레오티드 및 펩티드 서열들과 마찬가지로 이 항체는 국제공개특허공보 제WO 2005/016455호에 기술되어 있다. 상기 항체 RHD5는 초기에 A형 혈우병 즉 높은 수준의 저해제들을 갖는 후천성의 심각한 A형 혈우병으로 고통받는 환자의 림프구들로부터 생산된 인자 VIII의 C1 도메인에 대향하는 인간 모노클로날 IgG1 항체이다. 이 항체는 아형 IgG1에 속하며, 생식세포주 DP-10으로부터 유래된다. 인자 VIII에 대한 상기 항체에 의해 인식되는 에피토프는 그의 원래의 배치 내의 상기 C1 도메인으로, R2150H 돌연변이에 대한 동일한 도메인은 아니다. 상기 항체 RHD5는 인자 VIII의 활성의 98% 이상까지 저해할 수 있다.
본 발명의 상기 항체는 또한 본 발명의 특징들을 갖는 임의의 변형된 항체들을 의미하며, 여기에서 하나 또는 그 이상의 아미노산들이 치환되거나 또는 결손된 것이다. 이러한 치환 또는 결손은 상기 분자 내에서 임의의 위치 상에 위치될 수 있다. 여러 아미노산들이 치환되거나 또는 결손된 경우에서, 치환 또는 결손의 임의의 조합이 고려될 수 있다. 본 발명의 상기 항체의 상기 가변부위들 내의 이러한 서열 변형들은 본 발명의 상기 항-개별특이형 항체와의 접촉 및 상기 목표 저해제 항체와의 접촉 등과 같은 잔기들의 증가를 위하여 수행될 수 있다.
본 발명의 하나의 구체예에 있어서, 상기 항-개별특이형 항체는 생쥐 항체이다.
유리하게도, 이 생쥐 모노클로날 항-개별특이형 항체는 IgG1kappa이다.
바람직하게는, 본 발명의 상기 모노클로날 항체는 키메라 항체(chimeric antibody)이다. "키메라 항체"라는 표현에 대하여는, 이것은 상기 경연쇄들 및 중연쇄들의 불변부위(constant region)들 보다는 상기 경연쇄들 및 상기 중연쇄들의 상기 가변부위들이 서로 다른 종들에 속하는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서 본 발명의 상기 항체는 또한 경연쇄들 및 중연쇄들의 상기 불변부위가 비-쥐과의 종(non-murine species)들에 속하는 것들을 포함한다. 이와 관련하여서는, 모든 비-쥐과의 포유동물족 및 종들이 사용될 수 있으며, 특히, 예를 들면, 조류와 마찬가지로 인간, 원숭이, 쥐과(muridae ; 생쥐를 제외), 멧돼지과(suidae), 소과(bovidae), 말과(equidae), 고양잇과(felidae), 개과(canidae)들이 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 키메라 항체들은 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게 공지된 재조합 DNA에 대한 표준 기술들을 사용하여, 특히 예를 들면 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81. pp. 6851-55 (1984)에 의해 기술된 바와 같은 "키메라" 항체 구축 기술들의 사용을 통하여 구축될 수 있으며, 여기에서는 비-인간 포유동물에서 유래하는 항체의 중연쇄의 불변부위 및/또는 경연쇄의 불변부위를 인간 면역글로불린의 대응하는 영역들로 대체하는 재조합 DNA 기술의 사용이 이루어졌다.
본 발명의 특별한 관점에 있어서, 본 발명의 상기 항체는 인간 잡종항체(hybrid antibody), 즉 키메라 항체이며, 그의 불변부(constant part)는 인간유래의 것이다. 본 발명의 이 구체예는 인간에서의 상기 항체의 면역원성(immunogenicity)에서의 감소를 가능하게 하며, 그에 의하여 인간에서의 치료적인 투여에 대한 그의 효율을 증가시킨다.
유리하게도, 본 발명의 상기 항체는 인간화된 항체이다. 이러한 항체는 당해 기술분야에서 교시된 바의 제조방법(Jones et al., Nature (1986) 321:522 ; Riechmann et al., Nature (1988) 332:323) 등과 같이 비-인간 종들의 모노클로날 항체의 하나 또는 그 이상의 CDR 영역(상보성결정영역(들))의 인간 구조지역(framework regions)들(구조(frameworks)로 알려진 가변부위들이 고도로 보존된 부위들)과의 결합에 의해 수득될 수 있다. FVIII의 상기 C1 도메인을 인식하는 저해 항체들의 가변 도메인(variable domain)에 대향하는 이러한 인간화된 항체는 인간 구조부위들 및 상기 서열 확인 번호 9, 서열 확인 번호 10, 서열 확인 번호 11, 서열 확인 번호 12, 서열 확인 번호 13, 서열 확인 번호 14 서열들의 상보성결정영역들 중 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 본 발명의 특정의 인간화된 항체는 FVIII의 상기 C1 도메인을 인식하는 저해 항체들의 상기 가변 도메인에 대향하는 인간화된 항체이며, 그의 상기 상보성결정영역들은 서열 확인 번호 9, 서열 확인 번호 10, 서열 확인 번호 11, 서열 확인 번호 12, 서열 확인 번호 13, 서열 확인 번호 14 서열들이다.
바람직한 방법에 있어서, 본 발명의 상기 모노클로날 항-개별특이형 항체는 등록번호 CNCM I-3559로 2006년 1월 24일에 콜렉티옹 나쇼날레 드 쿨뜨레 데 미크로오가니즈메스(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes ; CNCM, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)에 기탁된 하이브리도마 18B6에 의해 생산된 항체 18B6이다. 상기 모노클로날 항-개별특이형 항체 18B6의 경연쇄들 각각의 상기 가변부위는 핵산 서열 서열 확인 번호 16으로 암호화되어 있고, 상기 모노클로날 항-개별특이형 항체 18B6의 경연쇄들 각각의 상기 불변부위는 핵산 서열 서열 확인 번호 15로 암호화되어 있다. 상기 하이브리도마 18B6을 수득하는 방법은 본 명세서의 "실시예들" 부분에 기술되어 있다.
본 발명의 상기 모노클로날 항-개별특이형 항체는 또한 상기 항체 18B6의 단편들을 포함하는 임의의 항체 및 특히 바람직하게는 상기 항체 18B6의 상기 중연쇄의 상기 경연쇄의 가변부위 및/또는 상기 중연쇄의 가변부위를 포함하는 임의의 항체, 또는 상기 항체 18B6의 상기 경연쇄의 상기 가변부위 및/또는 중연쇄의 상기 가변부위의 임의의 단편을 의미한다. "단편(fragments)"이라는 표현에 대하여는, F(ab')2 단편 또는 Fab' 단편 또는 Fab 단편 또는 상보성결정영역 또는 이들 단편들 또는 영역들 중 임의의 것의 임의의 변형된 버전(version)을 의미한다.
본 발명의 특정의 구체예에 있어서, 본 발명의 상기 모노클로날 항-개별특이형 항체는 F(ab')2 단편 또는 Fab' 단편 또는 Fab 단편 또는 상보성결정영역 또는 이들 단편들 또는 영역들 중 임의의 것의 임의의 변형된 버전(version)이다. 면역글로불린의 파파인(papain)에 의한 효소적 분해물(enzymatic digestion)은 소위 "항원결합단편(Fab ; Fragment Antigen Binding)" 및 Fc(결정화가능 부위 ; Crystallizable fractions)의 2개의 동일한 단편들을 생성한다. 상기 Fc 단편은 면역글로불린들의 효과기 기능(effector functions)에 대한 지지부(support)이다.
펩신 분해(pepsin digestion)를 사용하여, Fab 단편들이 2개의 디설파이드 결합들에 의해 결합된 채로 잔류하는 F(ab')2 단편이 생성되고, 그리고 상기 Fc 단편은 여러 펩티드들로 갈라진다. 상기 F(ab')2 단편은 F(ab')2를 형성하기 위하여 쇄간 디설파이드 결합(intercatenary disulfide bonds)들에 의해 연결된 2개의 Fab' 단편(하나의 단편은 Fab 및 힌지부위(hinge region)로 이루어짐)들에 의해 형성된다.
상기 항체의 결합부위(binding site)를 포함하는 이러한 단편들은 보체(complement)를 활성화시키는 능력 또는 감마 Fc 수용체(Fcgamma receptors)들에 결합하는 능력 등과 같은 그들이 유도된 전체 항체의 특성들 중의 일부를 손실할 수 있다. 그러나, 이들 단편들은 상기 저해제 항체를 중화시키는 상기 전체 항체의 능력을 손실하지는 않는다. 따라서, 본 발명은 또한 F(ab')2, Fab', Fab 단편들, 또는 상보성결정영역 또는 상기 항체 18B6의 이들 단편들 또는 영역들 중 임의의 것의 임의의 변형된 버전을 의미한다. 특히, 이들 단편들은 RHD5 항체들을 중화시키는 상기 전체 항체의 능력을 보존한다.
본 발명의 또 다른 목적은 앞서 기술한 바와 같이 항체를 생산하는 안정한 세포주(cell line)를 제공하는 것이다. 본 발명의 상기 안정한 세포주는 인간 또는 동물 유래의 것이 될 수 있다. 본 발명의 상기 안정한 세포주는 인간 불사화 세포(immortalized cells)들로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 이 세포주는 동물 유래 예를 들면 생쥐의 불사화된 세포로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 이러한 구체예에서 수득된 세포주의 바람직한 실시예는 I-3559라는 이름 하에 CNCM에 기탁된 18B6 세포주이다. 또 다른 구체예에 있어서, 본 발명의 상기 안정한 세포주는 게놈(genome)의 원하는 지점에서 본 발명의 상기 항체의 발현을 허용하는 집적된 유전적 구축(genetic construction)을 갖는 세포주이다. 이러한 세포의 수득으로 이루어지는 단계는 안정한 트랜스펙션(transfection)이다. 이 단계는 시험관 내 배양에서 유지될 수 있는 한 임의의 형태의 세포들에도 적용될 수 있다. 안정한 트랜스펙션은 집적된 유전적 구축을 필요로 하며, 이는 이형동원 재조합(homologous recombination) 또는 무작위로 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 세포에 대하여 항생작용적 저항을 부여하는 대상 유전자를 포함하는 유전적 구축 내에서의 포지티브 셀렉션 카셋트(positive selection cassette)의 존재는 상기 세포 게놈 내로의 형질전환유전자(transgene)의 삽입(insertion)을 입증한다. 부-복제(sub-cloning)의 결과로서, 본 발명의 상기 항체로부터 장기간 프로듀서 세포주(long term producer cell line), 예를 들면 18B6가 수득되며, 이는 시험관 내 배양에서 유지될 수 있다.
본 발명의 항체를 발현하는 상기 안정한 세포주는 인간 세포주, 설치류 세포주(rodent cell line) 예를 들면 생쥐 세포주, SP2/0, YB2/0, IR983F, 나말와(Namalwa) 등과 같은 인간 미엘로마, 또는 PERC6, CHO 세포주들, 즉, CHO-K-1, CHO-Lec10, CHO-Lec1, CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO dhfr- (CHO DX B11, CHO DG44) 등과 같은 인간 유래의 임의의 다른 세포, 또는 Wil-2, 유르카트(Jurkat), 베로(Vero), Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, K6H6, NS0, SP2/0-Ag 14 및 P3X63Ag8.653 들로부터 선택되는 다른 세포주들로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 것이 될 수 있다.
본 발명의 또 다른 특정한 대상체는 CNCM I-3559라는 이름 하에 CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)에 기탁된 하이브리도마 18B6이다. 상기 하이브리도마 18B6에 의해 생산된 모노클로날 항-개별특이형 항체의 경연쇄들 각각의 상기 가변부위는 핵산 서열 서열 확인 번호 16에 의해 암호화되고, 그리고 상기 하이브리도마 18B6에 의해 생산된 모노클로날 항-개별특이형 항체의 중연쇄들 각각의 상기 가변부위는 핵산 서열 서열 확인 번호 15에 의해 암호화된다. 상기 하이브리도마 18B6에 의해 생산된 상기 항체는 항체 18B6이고, 상기 하이브리도마 18B6를 수득하는 방법은 본 명세서의 "실시예" 부분에 기술되어 있다.
본 발명의 또 다른 대상체는 앞서 기술한 바와 같은 본 발명의 상기 항체의 상기 중연쇄의 상기 가변부위를 암호화하는 상기 서열 서열 확인 번호 15의 DNA 단편이다. 이 DNA 단편은 폴리펩티드, 바람직하게는 항체의 발현이 가능한 벡터 내로 삽입되어 숙주세포(host cell) 내로 도입되고 그 안에서 유지될 수 있으며, 상기 항체의 상기 중연쇄의 상기 가변부위는 핵산 서열 서열 번호 15에 의해 암호화되고, 그의 유도된 펩티드 서열은 서열 서열 번호 17이다. 이 벡터가 이러한 발현에 필수적인 상기 서열(프로모터(promoter), 폴리아데닐화 서열(polyadenylation sequence), 선택 유전자(selection gene))들을 포함하기 때문에, 이 벡터는 상기 숙주세포 내에서 이 외래 핵산 단편의 발현이 가능하다. 이러한 벡터들은 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게는 널리 공지된 것이며, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 플라스미드 또는 박테리오파지가 될 수 있으나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 게다가, 임의의 포유동물 세포가 상기 숙주세포로서 사용될 수 있으며, 본 발명의 상기 폴리펩티드 또는 상기 항체를 발현하는 상기 세포로서는 예를 들면, SP2/0, YB2/0, IR983F, 나말와(Namalwa) 등과 같은 인간 미엘로마, 또는 PERC6, CHO 세포주들, 즉, CHO-K-1, CHO-Lec10, CHO-Lec1, CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO dhfr- (CHO DX B11, CHO DG44) 등과 같은 인간 유래의 임의의 다른 세포, 또는 Wil-2, 유르카트(Jurkat), 베로(Vero), Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, K6H6, NS0, SP2/0-Ag 14 및 P3X63Ag8.653 들로부터 선택되는 다른 세포주들이 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 앞서 기술한 바와 같은 본 발명의 항체의 상기 경연쇄의 상기 가변부위를 암호화하는 상기 서열 서열 확인 번호 16의 DNA 단편이다. 이 DNA 단편은 폴리펩티드, 바람직하게는 항체의 발현이 가능한 벡터 내로 삽입되어 숙주세포 내로 도입되고 그 안에서 유지될 수 있으며, 상기 항체의 상기 경연쇄의 상기 가변부위는 핵산 서열 서열 번호 16에 의해 암호화되고, 그의 유도된 펩티드 서열은 서열 서열 확인 번호 18이다. 이 벡터가 이러한 발현에 필수적인 상기 서열(프로모터, 폴리아데닐화 서열, 선택 유전자)들을 포함하기 때문에, 이 벡터는 상기 숙주세포 내에서 이 외래 핵산 단편의 발현이 가능하다. 이러한 벡터들은 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게는 널리 공지된 것이며, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 플라스미드 또는 박테리오파지가 될 수 있으나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 게다가, 임의의 포유동물 세포가 상기 숙주세포로서 사용될 수 있으며, 본 발명의 상기 폴리펩티드 또는 상기 항체를 발현하는 상기 세포로서는 예를 들면, SP2/0, YB2/0, IR983F, 나말와(Namalwa) 등과 같은 인간 미엘로마, 또는 PERC6, CHO 세포주들, 즉, CHO-K-1, CHO-Lec10, CHO-Lec1, CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO dhfr- (CHO DX B11, CHO DG44) 등과 같은 인간 유래의 임의의 다른 세포, 또는 Wil-2, 유르카트(Jurkat), 베로(Vero), Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, K6H6, NS0, SP2/0-Ag 14 및 P3X63Ag8.653 들로부터 선택되는 다른 세포주들이 있다.
본 발명의 또 다른 대상은 본 발명의 항체 및 적어도 하나의 첨가제(excipients) 및/또는 적어도 하나의 약제학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 바람직하게는, 본 발명의 상기 약제학적 조성물에 포함되는 상기 모노클로날 항-개별특이형 항체는 앞서 기술한 바와 같은 항체 18B6, 18B6으로부터 유도되는 단편 또는 부위, 또는 심지어 18B6의 상기 가변부위들 또는 상기 상보성결정영역들을 포함하는 키메라 항체 또는 인간화된 항체이다. 본 발명의 상기 약제학적 조성물은 치료되어야 할 환자에 의해 견디어질 수 있는 임의의 첨가제들 내로 조성될 수 있다. 이러한 첨가제들의 예들에는 물, 식염수, 링거액(Ringer's solution), 덱스트로스 용액(dextrose solutions) 및 임의의 다른 적절한 수용성 생리학적 용액들이 포함된다. 상기 첨가제는 또한 등장성(isotonicity) 및 상기 조성물의 안정성을 증가시키는 물질 등과 같은 소량의 첨가제(additives)들을 포함할 수 있다. 이러한 첨가제들에는 인산염 완충제(phosphate buffer), 중탄산염 완충제(bicarbonate buffer) 및 트리스 완충제(Tris buffer) 들이 포함될 수 있다. 이러한 첨가제들은 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게는 잘 알려진 것들이다. 표준 조성들은 주사를 위한 액체들의 형태이거나 또는 투여에 앞서 적절한 액체 내로 재현탁될 수 있는 고체 조성이 될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물들의 제조를 위한 유용한 담체들은 유리하게 동물 또는 환자에서의 치료 조성물의 반감기(half-life)를 증가시키거나 또는 상기 활성 성분의 제어된 방출을 가능하게 하는 기능을 갖는다. 이러한 담체들은 유기 및 합성 중합체들 그리고 약물을 정상적인 속도에서 공급하거나 또는 이들을 단지 특정한 환경들에서 공급할 수 있는 화학적 화합물들이 될 수 있으며, 또한 리포좀(liposomes)이 될 수 있으나, 이들에 제한되는 것은 아니다.
유리하게도, 더욱이 본 발명의 상기 약제학적 조성물은 인자 VIII의 상기 C1 도메인과는 다른 도메인에 결합하는 상기 저해 항체에 대향하는 적어도 하나의 항-개별특이형 항체를 포함한다. 이러한 다른 항체는 인자 VIII의 A1 또는 A3 또는 B, A2 또는 C2 도메인들에 결합하는 저해 항체에 대향하는 항-개별특이형 항체가 될 수 있다. 결국, 발전된 저해 항체들을 갖는 A형 혈우병으로부터 고통을 받는 환자는 여러 형태들의 저해 항체들을 매우 빈발하게 나타낸다. 게다가, 저해 항체들의 상기 다른 형태들의 양 및 속성은 고정되지 않으며, 상기 환자의 일생 동안 변화될 수 있다. 따라서 동일한 환자의 상기 다른 저해 항체들은 인자 VIII의 다른 도메인들에 대향하며, 이는 특히 하나가 아닌 여러 형태들의 상기 다른 저해 항체들에 대향하는 항-개별특이형 항체를 갖는 환자를 처치하는 데 특히 유리하다.
바람직하게는, 상기 약제학적 조성물은 인자 VIII의 상기 C2 도메인에 결합하는 저해 항체 및/또는 인자 VIII의 상기 A2 도메인에 결합하는 저해 항체 및 본 발명의 상기 모노클로날 항체에 대향하는 모노클로날 항-개별특이형 항체를 포함한다. 결국, 상기 A2 도메인 및 C2 도메인들은 상기 항-인자 VIII 면역 반응의 주요 목표들이다. 따라서, 인자 VIII의 상기 C1 도메인에 결합하는 저해 항체들에 대향하는 항-개별특이형 항체들 및 상기 C2 도메인에 결합하는 저해 항체들에 대향하는 항-개별특이형 항체들의 혼합물을 포함하는 약제학적 조성물은 환자 내에 존재하는 전체 저해 항체들의 적어도 70%, 그리고 바람직하게는 적어도 80% 또는 90%의 중화를 가능하게 한다. 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 상기 약제학적 조성물은 상기 항체 14C12(LMBP 5878CB라는 번호로 벨지안 코디네이티드 컬렉션스 오브 마이크로오가니즘스(Belgian Coordinated Collections of Microorganisms)에 기탁된 것) 및/또는 상기 항체 30D1(I-3450이라는 번호로 CNCM에 기탁된 것)을 포함한다. 본 발명의 다른 바람직한 구체예에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 I-3510이라는 번호로 상기 CNCM에 기탁된 키메라 항체 14C12 및/또는 상기 항체 30D1으로부터 유도되는 키메라 항체 또는 인간화된 항체(이는 항체 30D1의 상기 가변부위를 포함하는 항체임)를 포함한다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 상기 항체의 약물로서의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 상기 항체의 약물의 제조에의 용도를 제공하는 것이다. 유리하게도, 이러한 약물들은 인자 VIII의 상기 C1 도메인에 대향하는 저해 항체들을 포함하는 혈우병으로부터 고통을 받는 환자에서의 출혈을 경감 및/또는 방지 및/또는 치료하는 데 사용된다.
본 발명의 또 다른 목적은 A형 혈우병의 치료를 목적으로 하는 약물의 제조를 위한 본 발명의 상기 항체의 용도를 제공한다.
유리하게도, 따라서 상기 치료된 A형 혈우병은 저해제들을 갖는 혈우병이다. 이러한 형태의 본 발명의 상기 항체로 치료된 혈우병은 선천성 또는 후천성이 될 수 있다. 인자 VIII의 상기 활성이 더 이상 저해 항체들에 의해 저해되지 않기 때문에, 상기 저해 항체들의 중화에 의하여, 본 발명의 상기 항체는 인자 VIII의 환자에 주사하는 것에 의하여 효과적인 치료를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 인자 VIII의 상기 C1 도메인에 대향하는 저해 항체의 저해 활성의 시험관 내 또는 생체 내에서의 중화를 위한 본 발명의 상기 항체의 용도를 제공한다. 이 과정은 환자의 혈액으로부터 인자 VIII의 상기 C1 도메인에 대향하는 상기 저해 항체들을 감소 및 그 후에 상기 환자의 상기 치료된 혈액을 재-주사하기 위하여 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 항체, 바람직하게는 상기 항체 18B6를 포함하는 약물에 관련된 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 예를 들면 인자 VIII 저해 항체들을 정제하기 위하여 상기 저해 항체들의 흡착을 위한 상기 항체의 용도에 관한 것이다.
마지막으로, 본 발명의 또 다른 목적은 인자 VIII 저해 항체들의 검출 및/또는 정제를 위한 본 발명의 상기 항체의 용도에 관한 것이다. 이러한 검출 및 정제의 방법들을 수행하는 일반적인 과정들은 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게는 잘 알려진 것이다. 예를 들면, 그들의 표면에 분지된 본 발명의 항체를 갖는 비드(beads)들을 포함하는 면역-정제 컬럼(immuno-purification column)이 언급될 수 있다. 상기 항체들에 의해 인지되는 상기 분자들만이 상기 비드들에 달라붙을 수 있다. 다른 것들은 상기 컬럼을 통하여 통과할 것이다. 상기 분자를 회수하기 위해서는, 용매의 이온세기(ionic strength)의 증가로 충분하다.
본 발명의 다른 관점들 및 잇점들이 이하의 실시예들에서 명백하게 될 것이며, 이는 설명을 위한 것으로 고려되어야 하며 본 발명의 관점을 제한하는 것은 아니다.
도 1은 4마리의 생쥐들에 대한 RHD5에 대한 항-개별특이형 항체들의 결합에서의 증가(평균값)를 나타내는 그래프이다.
도 2는 불용화된(insolubilized) 항체 RHD5에 대한 상기 항-개별특이형 항체 18B6의 결합에 관련된 그래프이다.
도 3은 불용화된 재조합 FVIII(recFVIII)에 대한 상기 항체 RHD5의 결합의 저해를 나타내는 그래프이다.
도 4는 18B6에 의한 RHD5의 중화를 나타내는 그래프이다.
실시예 1 : 인자 VIII의 상기 C1 도메인에 대향하는 인간 모노클로날 항체("항-C1 항체")의 생산
문헌 Jacquemin et al. (1998), Blood 92, 496-506 및 국제공개특허 제WO 2005/016455호서 기술된 절차에 따라 인자 VIII에 대해 발달된 면역반응을 갖는 후천성 A형 혈우병으로부터 고통받는 환자의 B 림프구들(B lymphocytes)의 불사화에 의해 이하에서 기술된 인간 림프아세포 세포주(human lymphoblastoid cell line) RHD5를 수득하였다.
상기 모노클로날 항-C1 RHD5 항체를 생산하는 상기 세포주는 콜렌 리서치 파운데이션(Collen Research Foundation)에 의해 2004년 8월에 승인 번호 LMBP 6165CB로 벨기에 B-9052 쯔위나르드 테크놀로지에파크 297 유니버시티 오브 겐트 라보라토리움 부르 몰레큘레어 바이올로지에의 벨지안 코오디네이티드 컬렉션 오브 마이크로오르가니즘스/플라스미드 컬렉션(BCCM/LMBP)에 기탁되었다.
상기 RHD5 항체의 상기 중연쇄의 상기 가변부위의 뉴클레오티드 서열은 서열 서열 확인 번호 5이고, 그리고 상기 RHD5 항체의 상기 경연쇄의 상기 가변부위의 뉴클레오티드 서열은 서열 서열 확인 번호 6이다. 상기 서열 서열 번호 5에 대응하는 펩티드 서열은 서열 서열 확인 번호 7이고, 그리고 상기 서열 서열 확인 번호 6에 대응하는 펩티드 서열은 서열 서열 확인 번호 8이다.
선택적으로, 상기 요구되는 특성들을 나타내는 항체들은 동물들의 면역화에 의해 생산될 수 있다. 이 경우에 있어서, 인간 인자 VIII가 보조제(adjuvant)와 함께 생쥐 내로 주사되었다. 모노클로날 항-인간 항체들이 비장 림프구(spleen lymphocytes)들과 생쥐 미엘로마 세포주의 융합에 의해 수득되었다. 상기 항-인자 VIII 항체를 생산하는 세포 상층액(cell supernatants)을 동정하고 그리고 한계 희석(limiting dilution)에 의해 클로닝하였다. 이러한 방법들의 일반적인 설명은 "Current Protocols in Immunology, Chapter 2, John Wiley & Sons, Inc, 1994"에서 찾아볼 수 있다. 원하는 특성들을 나타내는 저해제들의 그 이상의 선택들이 이하에서 기술된다.
실시예 2 : 항-개별특이형 항체 18B6의 생산
I. 생쥐 면역화
4마리의 6주령 Balb/c 암컷 생쥐를 그의 앞발에 완전 프로드 보조제(ACF ; complete Freund's adjuvant) 내에 (1차 면역화) 그리고 계속해서 불완전 프로드 보조제(AIF ; incomplete Freund's adjuvant) 내에 현탁된 FVIII RHD5 항체의 상기 인간 항-C1 도메인 10㎍으로 3회 피하주사(SC ; sub-cutaneously injected) 하였다.
면역화(출혈 일자 0(D0))에 앞서 제1방혈(first bloodletting)(방혈 0)를 수행하였고, 계속해서 상기 주사들 및 방혈들을 다음과 같이 진행하였다 :
D1 : 1번 주사(완전 프로드 보조제의 존재 중에서의 RHD5 항체 10㎍)
D15 : 1번 방혈
D16 : 2번 주사(불완전 프로드 보조제의 존재 중에서의 RHD5 항체 10㎍)
D28 : 2번 방혈
D29 : 3번 주사(불완전 프로드 보조제의 존재 중에서의 RHD5 항체 10㎍)
D44 : 3번 방혈
II. 생쥐의 면역 반응의 평가
서로 다른 방혈들에서의 상기 항-RHD5 항체들의 존재를 평가하기 위하여, 직접결합(direct binding)으로의 엘리사 분석(ELISA assay)을 수행하였다. 이를 위하여, 상기 RHD5 항체 또는 대조군 IgG1 3㎍/㎖을 50㎕/웰(well)에서 글리신 완충제(glycine buffer)에서 4℃에서 하룻밤 동안 불용화시켰다(글리신 완충제 = 0.1M 글리신, 0.17M NaCl, pH 9.2). PBS/트윈으로 3회 세척을 수행하였다(PBS = 140.0mM NaCl, 2.6mM KCl, 1.4mM KH2PO4, 8.1nM Na2HPO4ㆍ2H2O, pH 7.4). 이 시스템을 포화상태에서 실온에서 100㎕/웰의 매직완충제(Magic Buffer)와 함께 30분간 방치하였다(매직완충제 = 50mM 트리스, 0.17M NaCl, 1% BSA, pH 7.2). 그 후, 상기 방혈들을 매직완충제에 1/10, 1/100, 1/1000 및 1/10000으로 희석시키고 그리고 실온에서 2시간 동안 배양시켰다(50㎕/웰). 계속해서, PBS/트윈으로 3회 세척을 수행하였다. 후속하여, 상기 시스템을 고추냉이 과산화효소(HRP ; horseradish peroxidase)(바이오-라드사(Bio-Rad)로 표지된 염소 폴리클로날 생쥐 항-IgG 항체들의 1㎍/㎖ 용액과 함께 실온에서 2시간 동안 배양시켰다(50㎕/웰)(매직완충제로 희석). 계속해서, 상기 시스템을 PBS/트윈으로 3회 세척하고, 그리고 크로모 겐(chromogen ; 오르토-페닐 디아민(ortho-phenyl diamine))으로 시사(revelation)를 수행하였으며, 그 수득된 착색의 강도를 파장 490/650㎚에 대응하는 필터를 갖는 판독기(reader)로 판독하였다(판독기는 미합중국 캘리포니아주 서니베일 소재 이맥스 몰레큘러 데비티즈(Emax Molecular Devithese) 사 제품임).
대조군인 IgG1에 대하여 수득된 광학 밀도(optical densities)들을 하기 표 1에 나타내었다.
| 희석 1000X | 1번 생쥐 | 2번 생쥐 | 3번 생쥐 | 4번 생쥐 |
| 0번 방혈 | 0.031 | 0.019 | 0.018 | 0.018 |
| 1번 방혈 | 0.019 | 0.020 | 0.025 | 0.028 |
| 2번 방혈 | 0.026 | 0.023 | 0.169 | 0.045 |
| 3번 방혈 | 0.027 | 0.063 | 0.150 | 0.024 |
RHD5에 대하여 얻어진 광학 밀도들을 하기 표 2에 나타내었다.
| 희석 1000X | 1번 생쥐 | 2번 생쥐 | 3번 생쥐 | 4번 생쥐 |
| 0번 방혈 | 0.031 | 0.019 | 0.018 | 0.018 |
| 1번 방혈 | 0.019 | 0.020 | 0.025 | 0.028 |
| 2번 방혈 | 0.026 | 0.023 | 0.169 | 0.045 |
| 3번 방혈 | 0.027 | 0.063 | 0.150 | 0.024 |
상기 결과들을 도 1에 나타내었다.
결론 : 각 생쥐는 상기 RHD5 Fab 단편의 주사에 정확하게 응답하고 그리고 유사하게 반응하였다. 다른 임의의 방법에 있어서, 4번 생쥐를 선택하여 융합을 수행하였다.
III. 융합 및 스크리닝
4번 생쥐의 비장 림프구들과 미엘로마 WP2/0의 세포들의 융합을 수행하였다. 상기 융합은 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 통상적인 방법으로 수행하였다(J.G. Gilles et al., Blood (2004) 103 : 2617-23 ; P. Cornelis, "Les anticorps monoclonaux", Revue IRE, vol. 7, No. 4, 1983).
한계 희석들의 원리에 따라 하이포크산틴(hypoxanthine) 및 티미딘(thymidine)을 포함하는 DMEM 매질(둘베코 변형 이글 매질(Dulbecco's Modified Eagle Medium)) 내에서 상기 세포들을 확장시켰으며, 시험된 클론들은 앞서의 II절에서 기술한 바와 같은 직접결합 엘리사 분석에서 양성으로 검출되었다.
상기 결합의 특이성은 무연관 특이성(irrelevant specificity)을 갖는 불용화 인간 IgG1 항체에 의해 확인되었으며, 상기 실험실 내에서 생산되었다.
하이브리도마 안정성을 결정하기 위하여, 클론들의 발현 동안에 200㎕ 내지 5㎖의 서로 다른 매질의 용적들 내에서 상기 에피토프 스크리닝 시험(시험 1 내지 3)들을 반복하였다.
시험 1 = 200㎕의 웰 내에서의 측정
시험 2 = 1㎖의 웰 내에서의 측정
시험 3 = 5㎖의 웰 내에서의 측정
서로 다른 에피토프 스크리닝들 동안에 수득된 결과들을 하기 표 3에 나타내었다.
| 스크리닝 1 | 스크리닝 2 | 스크리닝 3 | 스크리닝 3 /IgG1 | 저해 : 엘리사 | 중화 : 기능 시험 | |
| 1A1 | + | - | - | - | ||
| 1F3 | + | + | + | - | + (92.5%) | + (100%) |
| 2A1 | + | - | - | - | ||
| 2C9 | + | + | + | + | ||
| 3G9 | + | + | + | + | ||
| 4B7 | + | + | - | - | ||
| 4B10 | + | + | + | + | ||
| 4D5 | + | + | + | + | ||
| 5B11 | + | + | + | - | + (93.6%) | + (100%) |
| 5E1 | + | - | +/- | + | ||
| 5G3 | + | + | + | + | ||
| 5H7 | + | - | - | + | ||
| 5H8 | + | + | +/- | + | ||
| 6A9 | + | + | + | + | ||
| 6E1 | + | + | +/-- | + | ||
| 6H7 | + | + | + | + | ||
| 6H8 | + | + | + | + | ||
| 9D2 | + | - | - | + | ||
| 10D2 | + | + | + | - | + (93.6%) | + (100%) |
| 10G8 | + | + | + | - | - | |
| 11C5 | + | + | + | - | - | |
| 11D7 | + | - | - | - | ||
| 11G3 | + | + | + | + | ||
| 12D7 | + | + | + | - | - | |
| 12G3 | + | - | - | - | ||
| 12H12 | + | + | + | - | - | |
| 13A1 | + | + | + | - | + (90.9%) | + (95.6%) |
| 13C3 | + | + | + | - | + (93.6%) | + (100%) |
| 13D7 | + | + | + | - | ||
| 13H5 | + | + | +/- | + | ||
| 14H1 | + | + | - | - | ||
| 14D11 | + | + | +/-- | + | ||
| 14F11 | + | + | + | - | + (83.6%) | + (100%) |
| 14H2 | + | + | + | + | ||
| 14H5 | + | + | + | + | ||
| 15B4 | + | + | - | - | ||
| 15F6 | + | - | - | + | ||
| 16B4 | + | + | + | - | + (94%) | + (90.9%) |
| 16F6 | + | + | + | - | - | |
| 17A5 | + | + | + | + | ||
| 17C4 | + | + | + | - | + (92.4%) | + (100%) |
| 18A5 | + | + | + | - | - | |
| 18A9 | + | + | + | - | - | |
| 18B6 | + | + | + | - | + (93.1%) | + (100%) |
| 18C4 | + | + | + | + | ||
| 19C4 | + | + | + | + | ||
| 19G3 | + | + | - | +/- | ||
| 20A7 | + | + | + | + | ||
| 20C4 | + | - | - | - | ||
| 20G3 | + | - | - | - | ||
| 21D8 | + | + | + | - | + (93.8%) | - |
| 22H7 | + | - | + | + | ||
| 23A7 | + | + | + | - | - | |
| 23E3 | + | + | - | - | ||
| 23G2 | + | - | +/- | - | - | |
| 24D5 | + | + | + | - | +/- (56.3%) | +/- (76.9%) |
| 24D12 | + | + | + | + | ||
| 24E3 | + | - | - | - | ||
| 28C10 | + | - | - | - |
IV. 배양물 상층액들에 대한 저해 분석
표 3에서 나타난 바와 같이, 상기 배양물 상층액들에 대한 저해의 시험을 수행하였다. 이 분석은 상기 클론들로부터 상기 RHD5 Ab의 파라토프 수준(paratope level)에 위치하는 에피토프 결정자(epitope determinant)를 정확하게 인식하는 상기 항-개별특이형 항체들 선택하기 위하여 수행되었다. 상기 항-개별특이형 항체들을 상기 불용화된 FVIII에의 상기 RHD5의 결합의 저해에 대한 엘리사 분석으로 시험하였다.
글리신 완충제 50㎕/웰 내의 2㎍/㎖의 재조합 인자 VIII(recFVIII)(벡스터(Baxter)사)를 불용화시키고, 계속해서 실온에서 2시간 동안 방치하였다. 0.6㎍/㎖의 최종 농도의 상기 RHD5 항체(또는 무연관 IgG1)를 매직완충제내에의 1/1, 1/2 및 1/4로의 희석에서의 배양물 상층액들로 2시간 이상 사전-배양(pre-incubated)시켰다. 상기 웰들을 PBS/트윈 완충제로 3회 세척하고, 계속해서 100㎕/웰의 매직완충제로 포화시켰다(실온에서 30분). 그 후, 상기 배양물 상층액을 50㎕의 RHD5(또는 무연관 IgG1)과 함께 배양시키고(실온에서 매직완충제로 2시간 동안), 계속해서 3회의 세척을 수행하였다. 50㎕/웰의 생쥐 폴리클로날 인간 항-IgG HRP-표지(사우던 바이오테크놀로지(Southern Biotechnology)사)된 항체들의 용액의 매직완충제의 1㎍/㎖의 첨가에 의하여 불용화된 recFVIII에 부착된 상기 RHD5 항체들을 검출하였다. PBS/트윈으로의 3회의 연속적인 세척을 수행하고, 계속해서 크로모겐(오르토-페닐 디아민)으로 시사를 수행하였으며, 그 수득된 착색의 강도를 파장 490/650㎚에 대응하는 필터를 갖는 판독기로 판독하였다(판독기는 미합중국 캘리포니아주 서니베일 소재 이맥스 몰레큘러 데비티즈사 제품임).
결론 :
표 3에 나타난 바와 같이, 11개의 클론들이 불용화된 recFVIII에 결합하는 상기 RHD5 항체를 특이적으로 저해할 수 있다(주의 : 부의 값(negative value)은 상기 파라토프의 외부부위(external region)에 결합하는 가능성을 나타내거나 또는 상기 배양물 상층액 내에서의 상기 Ab의 불충분한 농도를 반영한다. 그러나, 양의 수들과 관련하여 상기 부의 웰(negative well)들은 후속의 시험들로부터 제거되었다.).
V. 배양물 상층액들에 대한 기능 시험 : RHD5 항체 저해 활성(항-인자 VIII)의 중화의 측정
상기 RHD5 항체를 1㎍/㎖의 농도에서 상기 저해 시험 동안에 선택된 서로 다른 클론들의 상층액(3배, 6배, 12배 및 24배 희석된)들과 함께 매직완충제 내에서 37℃에서 배양시켰다. 30분 후, 0.5U/㎖ 최종 농도에서의 상기 FVIII 코제네이트(Kogenate ; 바이엘(Bayer)사)를 첨가하였으며, 계속해서 37℃에서 30분간 보충 배양(complementary incubation)을 수행하였다. 상기 시료들을 매직완충제 내에서 30배로 희석시켰으며, 계속해서 크로모겐성 DADE(인자 VIII 크로모겐의, 독일 마르브르쿠 소재의 다데 베링 게엠베하(Dade Behring Gmbh, Marburg, Germany)의 시약을 제조자의 지시들에 따라 첨가하였다.
표 3에 나타난 바와 같이, 10개의 클론들이 상기 RHD5 Ab의 저해 활성을 중화시킬 수 있었다. 상기 결과들과 중화 곡선들의 함수로서 항체 18B6가 선택되어 이하의 실험들에서 사용되었다.
VI. 상기 선택된 18B6 항-RHD5 클론의 대량 생산
상기 항-개별특이형 항체 18B6를 DMEM 배양 매질 내에서 생산하였다. 이 생산 이후에 단백질 G 친화성 컬럼(Protein G affinity column) 상에서 정제하였다(이 컬럼은 정제를 가능하게 하고, 계속해서 상기 항체들의 농축 및 그에 따른 상기 수득된 항-개별특이형 항체 특이성을 확인하는 것을 가능하게 한다).
정제 : 18B6 : 8.48㎎/㎖에서의 8㎖의 생산
VII. 특이성 평가
상기 II. 및 IV.에서 기술된 바와 같은 동일한 절차(protocol)에 따라 엘리사로 여러 제제들을 평가하였다.
1. 엘리사 분석 : 상기 항-개별특이형 항체의 불용화된 항체 RHD5에의 직접결합
상기 항-개별특이형 항체 18B6의 상기 불용화된 항체 RHD5에의 직접결합을 도 2에 나타내었다. 항체 18B6의 RHD5에의 결합을 나타내는 곡선은 용량-의존적(dose-dependent)이다.
2. 엘리사 분석 : 불용화된 재조합 FVIII에의 항체 RHD5 결합의 저해
불용화된 재조합 FVIII에의 RHD5 항체 결합의 저해는 상기 IV.에서 기술된 절차에 따라 측정되었다. 사용된 RHD5의 농도는 2㎍/㎖과 동등하다.
| 18B6 농도 (㎍/㎖) | 결합의 저해 (%) |
| 50 | 96.1 |
| 25 | 97.2 |
| 12.5 | 96.9 |
| 6.25 | 96.7 |
| 3.12 | 94.1 |
| 1.56 | 90.3 |
| 0.78 | 50.3 |
| 0.39 | 9.2 |
| 0.195 | 0 |
| 0.098 | 0 |
그 결과들을 도 3에 나타내었다. FVIII에의 RHD5의 결합의 50% 저해는 2.5의 RHD5/18B6의 몰비에서 수득되는 반면에, 등량의 몰비가 이 결합의 92%를 저해하였다.
3. 기능 시험 : RHD5 항체 저해 활성(항-FVIII)의 중화의 측정
0.4㎍/㎖의 최종 RHD5 농도 및 4 내지 0.002㎍/㎖ 최종 농도의 정제된 항-개별특이형 항체에 대한 절차는 상기 V.에서 기술된 것과 동일하다.
그 결과들을 이하의 표 5에 나타내었다.
| 항-개별특이형 항체의 농도 (㎍/㎖) | 중화 (%) |
| 4 | 89.5 |
| 1.33 | 81.2 |
| 0.44 | 54.3 |
| 0.148 | 27.4 |
| 0.049 | 11 |
| 0.0165 | 8.8 |
| 0.0055 | 6.7 |
| 0.00183 | 8.9 |
| 0.0006 | 6.7 |
| 0.0002 | 0 |
그 결과들을 도 4에 나타내었다. 등량의 RHD5/18B6 몰비에서 RHD5 저해 활성의 50% 중화가 수득되었다.
4. "표면 플라스몬 공명 비아코어(Biacore)" 방법으로의 항-개별특이형 18B6 항체의 결합 키네틱(binding kinetics)의 측정
파마시아 바이오센서 비아코어Pharmacia Biosensor BIAcore)(스웨덴 웁살라 소재 파마시아 바이오센서 아베( (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden))를 사용하는 상기 "표면 플라스몬 공명 비아코어(Biacore)" 방법의 사용에 의하여 저해제 RHD5 항체에 대한 상기 항-개별특이형 항체 18B6의 결합 키네틱을 측정하였다. 상기 RHD5 항체들을 CM5 전극(CM5 probe)의 활성화된 표면 상에서 고정시켰다. 상기 항-개별특이형 항체 18B6들을 상기 전극의 상기 표면 상에 고정된 서로 다른 RHD5 농도들에서 융합시켰다. 그 결합 및 해리 상수들을 결정하였다 :
Ka (M-1S-1) = 4,26 x 103
Kd (S-1) = 1.45 x 10-5
KD : M. 3,4 x 10-9
5. 상기 항-개별특이형 항체 18B6 아형의 특성화
상기 항체 18B6의 상기 아종을 결정하기 위하여, 로체(Roche)사에 의해 제공되는 이소스트립 시스템(IsoStrip system)을 사용하였다(색체띠(colorimetric strip)). 상기 항체 18B6는 IgG1 카파(IgG1 Kappa)로 확인되었다.
VIII. 상기 항체 18B6의 서열
서열분석을 실행하기 위하여, 퀵 프렙 마이크로 메신저-알엔에이 퓨리피케이션 킷트(Quick Prep Micro mRNA Purification Kit)(스웨덴 웁살라 소재 아메르샴 파마맛마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden))을 사용하여 상기 항-개별특이형 항체 18B6를 생산하는 하이브리도마의 mRNA를 단리하였다. 첫번째-가닥 cDNA 합성 킷트(아메르샴 파마시아 바이오테크)의 사용에 의하여 cDNA를 합성하였다. 생쥐 내에서 잠재적으로 발견되는 유전자들의 서로 다른 족(families)들에 대응하는 특정의 프라이머들을 사용하여 PCR(중합효소연쇄반응)에 의해 상기 중연쇄(VH) 및 상기 경연쇄(VL)를 암호화하는 상기 cDNA를 증폭시켰다. 키아 퀵 젤 추출 킷트(QIA quick Gel Extraction Kit)(독일 힐덴 소재 키아젠(Qiagen, Hilden, Germany)) 수단에 의하여 아가로스겔 1.5%로부터 상기 중합효소연쇄반응 생성물들을 단리하였으며, pGEM-T 이지 벡터 시스템(pGEM-T Easy Vector system)(미합중국 위스콘신주 메디슨 소재 프로메가사(Promega, Madison, WI))로 클로닝 하였다. 하이 퓨어 플라스미드 단리 킷트(High Pure Plasmid Isolation Kit)(독일 만하임 소재 로체 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany))의 수단에 의하여 양성 콜로니들의 플라스미드 DNA를 단리하였으며, 시퀘나제(Sequnase(미합중국 클리블랜드주 유에스 바이오케미칼사(US Biochmical, Cleveland, OH))로 양 방향들에서 서열분석하였다.
IX. 상기 18B6 항체의 특정의 특성들
항체 18B6는 그의 항원 인자 VIII에 결합하는 RHD5 항체를 완전히 저해한다. 상기 RHD5는 18B6의 그것에 상보성인 개별특이형 항체를 수반한다.
항체의 상기 항원에의 결합은 수소결합들, 소수성 또는 극성 인력 및 반데르발스 결합(VanderWals bridges)들에 의해 서로간에 결합하는 많은 수의 아미노산들에 대응하는 6 내지 12옹스트롬의 상호 인식의 공유영역(interface)를 포함한다.
기능의 수준에서, 항체가 항체의 항원에의 결합을 완전히 저해하는 경우, 이는 상기 저해 항체가 상기 항원의 "내부상(internal image)" 즉, 상기 항원의 3-D 구조를 흉내내는 3차 구조를 수반하는 것을 의미한다.
비록 상기 18B6 항체의 1차 구조(아미노산 서열)가 인자 VIII의 상기 C1 도메인에 낮은 동일성을 나타내기는 하나, FVIII의 상기 C1 도메인의 2차 구조, 상기 RHD5 항체의 항원성 목표 및 상기 18B6의 모델의 3차 구조에 대한 상기 18B6 항체의 2차 구조의 배열은 상기 C1 도메인의 3차 구조와의 중첩에 의하여 18B6의 상기 경연쇄(VL)의 상기 가변부위가 상기 C1 도메인의 내부상을 나타내는 것을 나타낸다.
이러한 관찰은 상기 18B6 항체에 특정의, 신규한 그리고 예측할 수 없는 특성을 부여한다. 달리 말하면, RHD5 등과 같은 항체에 대한 면역화에 의하여 18B6와 유사한 항체들을 생산하는 어떠한 임의의 시도도 18B6와 동일한 항체들을 생산하지 못한다.
본 발명은 A형 혈우병(haemophilia A)에 대한 약물의 제조 등 제약산업에서 이용될 수 있다.
Claims (29)
- 저해 항체가 인자 VIII의 C1 도메인에 대향하는 것이고,여기에서 상기 항체의 경연쇄들 각각의 적어도 하나의 상보성결정영역(CDR)이 서열 확인 번호 12, 서열 확인 번호 13, 서열 확인 번호 14 서열들로부터 선택되는 서열에 적어도 70%의 동일성을 갖는 펩티드 서열을 포함하고, 그리고 상기 항체의 중연쇄들 각각의 적어도 하나의 상보성결정영역(CDR)이 서열 확인 번호 9, 서열 확인 번호 10, 서열 확인 번호 11 서열들로부터 선택되는 서열에 적어도 70%의 동일성을 갖는 펩티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 인자 VIII 인간 저해 항체에 대향하는 모노클로날 항-개별특이형 항체.
- 제 1 항에 있어서,상기 항체의 상기 경연쇄들 각각의 각 상보성결정영역이 개별적으로 상기 서열 확인 번호 12, 서열 확인 번호 13, 서열 확인 번호 14 서열들에 적어도 70%의 동일성을 갖는 펩티드 서열을 포함하고, 그리고 상기 항체의 상기 중연쇄들 각각의 각 상보성결정영역이 개별적으로 상기 서열 확인 번호 9, 서열 확인 번호 10, 서열 확인 번호 11 서열들에 적어도 70%의 동일성을 갖는 펩티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 인자 VIII 인간 저해 항체에 대향하는 모노클로날 항-개별특이형 항체.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,상기 항체의 상기 경연쇄들 각각의 가변부위가 핵산 서열 서열 번호 16에 대해 적어도 70%의 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화되고, 그리고 상기 항체의 상기 중연쇄들 각각의 가변부위가 핵산 서열 서열 확인 번호 15에 대해 적어도 70%의 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 인자 VIII 인간 저해 항체에 대향하는 모노클로날 항-개별특이형 항체.
- 상기 전 청구항들 중 어느 한 항에 있어서,상기 항체의 상기 경연쇄들 각각의 가변부위가 핵산 서열 서열인 번호 16에 의해 암호화되고, 그리고 상기 항체의 상기 중연쇄들 각각의 가변부위가 핵산 서열 서열 확인 번호 15에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 인자 VIII 인간 저해 항체에 대향하는 모노클로날 항-개별특이형 항체.
- 상기 전 청구항들 중 어느 한 항에 있어서,그의 상기 경연쇄들 각각의 상기 가변부위의 펩티드 서열은 서열 서열 확인 번호 18과 적어도 70%의 동일성을 나타내는 서열이고, 그리고 그의 상기 중연쇄들 각각의 상기 가변부위의 펩티드 서열은 서열 서열 확인 번호 17과 적어도 70%의 동일성을 나타내는 서열임을 특징으로 하는 인자 VIII 인간 저해 항체에 대향하는 모노클로날 항-개별특이형 항체.
- 상기 전 청구항들 중 어느 한 항에 있어서,상기 서열 서열 확인 번호 16으로부터 유도된 펩티드 서열은 서열 확인 번호 18 서열이고, 그리고 상기 서열 서열 확인 번호 15으로부터 유도된 펩티드 서열은 서열 확인 번호 17 서열임을 특징으로 하는 인자 VIII 인간 저해 항체에 대향하는 모노클로날 항-개별특이형 항체.
- 상기 전 청구항들 어느 한 항에 있어서, 저해 항체가 항체 RHD5(LMBP 6165CB라는 번호로 BCCM/LMBP에 기탁됨) 임을 특징으로 하는 인자 VIII 인간 저해 항체에 대향하는 모노클로날 항-개별특이형 항체.
- 상기 전 청구항들 중 어느 한 항에 있어서,상기 항-개별특이형 항체가 생쥐 항체인 것을 특징으로 하는 인자 VIII 인간 저해 항체에 대향하는 모노클로날 항-개별특이형 항체.
- 제 8 항에 있어서,상기 항-개별특이형 항체가 IgG1 카파인 것을 특징으로 하는 인자 VIII 인간 저해 항체에 대향하는 모노클로날 항-개별특이형 항체.
- 상기 전 청구항들 어느 한 항에 있어서,상기 항체가 키메라 항체인 것을 특징으로 하는 인자 VIII 인간 저해 항체에 대향하는 모노클로날 항-개별특이형 항체.
- 제 10 항에 있어서,상기 항체가 인간 잡종항체인 것을 특징으로 하는 인자 VIII 인간 저해 항체에 대향하는 모노클로날 항-개별특이형 항체.
- 상기 제1항 내지 제9항들 중 어느 한 항에 있어서,상기 항체가 인간화된 항체인 것을 특징으로 하는 인자 VIII 인간 저해 항체에 대향하는 모노클로날 항-개별특이형 항체.
- 상기 전 청구항들 어느 한 항에 있어서,상기 항체가 F(ab')2 단편, Fab' 단편, Fab 단편, 상보성결정영역 및 이들 단편들 또는 영역들 중 임의의 것의 임의의 변형된 버전으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 인자 VIII 인간 저해 항체에 대향하는 모노클로날 항-개별특이형 항체.
- 청구항 제 1 항 내지 제 9 항들 중의 어느 한 항에 있어서,상기 항체가 등록번호 CNCM I-3559로 콜렉티옹 나쇼날레 드 쿨뜨레 데 미크로오가니즈메스(CNCM)에 기탁된 하이브리도마 18B6에 의해 생산될 수 있는 것임을 특징으로 하는 인자 VIII 인간 저해 항체에 대향하는 모노클로날 항-개별특이형 항 체.
- 상기 청구항 제 1 항 내지 제 13 항들 중의 어느 하나에 따른 항체를 생산하는 것을 특징으로 하는 안정한 세포주.
- 제 15 항에 있어서,상기 세포주가 SP2/0, YB2/0, IR983F, 인간 미엘로마 나말와, PERC6, CHO 세포주들, 즉, CHO-K-1, CHO-Lec10, CHO-Lec1, CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, 유르카트, 베로, Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, K6H6, NS0, SP2/0-Ag 14 및 P3X63Ag8.653 들로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 안정한 세포주.
- 등록번호 CNCM I-3559로 콜렉티옹 나쇼날레 드 쿨뜨레 데 미크로오가니즈메스(CNCM)에 기탁된 것을 특징으로 하는 하이브리도마 18B6.
- 저해 항체가 등록번호 CNCM I-3559로 콜렉티옹 나쇼날레 드 쿨뜨레 데 미크로오가니즈메스(CNCM)에 기탁된 하이브리도마 18B6에 의해 생산되는 인자 VIII의 C1 도메인에 대향하는 것임을 특징으로 하는 인자 VIII 인간 저해 항체에 대향하는 모노클로날 항-개별특이형 항체.
- 상기 청구항 제 1 항 내지 제 14 항들 중의 어느 한 항에 따른 항체의 중연쇄의 가변부위를 암호화하는 상기 서열 서열 확인 번호 15를 나타내는 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
- 상기 청구항 제 1 항 내지 제 14 항들 중의 어느 한 항에 따른 항체의 경연쇄의 가변부위를 암호화하는 상기 서열 서열 확인 번호 14를 나타내는 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
- 상기 청구항 제 1 항 내지 제 14 항들 중의 어느 한 항에 따른 항체 및 적어도 하나의 첨가제 및/또는 적어도 하나의 약제학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 제 21 항에 있어서,인자 VIII의 C1 도메인과는 다른 도메인에 대향하는 항-FVIII 항체에 대향하는 적어도 하나의 항-개별특이형 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서,인자 VIII의 C2 도메인에 대향하는 항-FVIII 항체에 대향하는 항-개별특이형 항체 및/또는 인자 VIII의 A2 도메인에 대향하는 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 약물의 제조를 위한 것을 특징으로 하는 제 1 항 내지 제 14 항들 중의 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
- A형 혈우병의 치료를 목적으로 하는 약물의 제조를 위한 것을 특징으로 하는 제 1항 내지 제 14 항들 중의 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
- 제 25 항에 있어서,상기 A형 혈우병이 저해제들을 갖는 혈우병임을 특징으로 하는 제 1항 내지 제 14 항들 중의 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
- 시험관 내에서 인자 VIII의 C1 도메인에 대향하는 저해 항체의 저해 활성을 중화시키기 위한 것을 특징으로 하는 제 1항 내지 제 14 항들 중의 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
- 시험관 내에서 인자 VIII 저해 항체들의 검출 및/또는 정제를 위한 것을 특징으로 하는 제 1항 내지 제 14 항들 중의 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
- 제 1 항 내지 제 14 항들 중의 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 것을 특 징으로 하는 약물.
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