BRPI0707031A2 - anticorpos anti-idiotìpicos que neutralizam a atividade inibitória de um anticorpo inibidor dirigida contra o domìnio c1 do fator viii - Google Patents

Abstract

ANTICORPOS ANTI-IDIOTìPICOS QUE NEUTRALIZAM A ATIVIDADE INIBITóRIA DE UM ANTICORPO INIBIDOR DIRIGIDA CONTRA O DOMìNIO Cl DO FATOR VIII. A presente invenção refere-se a um anticorpo monoclonal anti-idiotípico dirigido contra um anticorpo inibidor do fator VIII que se liga ao domínio Cl do Fator VIII e também a uma linhagem de células que produz esse anticorpo monoclonal anti-idiotípico, para o uso desse anticorpo monoclonal anti-idiotípico como medicamento, e mais particularmente para seu uso na fabricação de um medicamento para uso no tratamento da hemofilia A.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPOS ANTI-IDIOTÍPICOS QUE NEUTRALIZAM A ATIVIDADE INIBITÓRIA DE UMANTICORPO INIBIDOR DIRIGIDA CONTRA O DOMÍNIO C1 DO FATOR VIII"

A presente invenção refere-se a um anticorpo monoclonal anti-idiotípicodirigido contra um anticorpo inibidor do Fator Vlll que se liga ao domínio C1 doFator VIII, assim como a uma linhagem de células que produz esse anticorpomonoclonal anti-idiotípico, ao uso desse anticorpo monoclonal anti-idiotípico comomedicamento e mais particularmente ao uso do mesmo na fabricação de ummedicamento para o tratamento da hemofilia A.

Descrição do estado da técnica

A hemofilia A é uma doença hereditária ligada a uma anomalia docromossomo X, a qual se manifesta na pessoa afetada por uma incapacidade decoagulação [do sangue]. Essa doença resulta de mutações do gene de umaproteína envolvida na coagulação, a proteína Fator Vlll (FVIII), o que determinauma total ausência de FatorVIII no sangue ou um déficit parcial do mesmo

A hemofilia A é a mais comum das insuficiências que afetam a coagulaçãodo sangue: na França, 1 em 5.000 homens é afetado, o que representa 80% dospacientes que sofrem de hemofilia. O outro tipo de hemofilia, a hemofilia B, afeta20% dos pacientes que sofrem de hemofilia; esta é causada por uma deficiênciade um outro fator de coagulação, conhecido como Fator IX.

O tratamento atual da hemofilia (do tipo A ou B) consiste na administraçãointravenosa do fator de coagulação deficiente ou ausente. Na França, o FatorVIIIpara tratamento de hemofílicos está disponível na forma de medicamentosderivados do sangue fornecidos pelo Laboratoire Français du Fractionnement etdes Biotechnologies (LFB) ou por laboratórios farmacêuticos internacionais, assimcomo na forma de medicamentos recombinantes preparados por meio demétodos de engenharia genética. Efetivamente, o DNA que codifica o Fator Vlllfoi isolado e expresso em células de mamíferos (Wood et al., Nature (1984) 312:330-337), e sua seqüência de aminoácido foi deduzida de cDNA.

O Fator Vlll (FVIII) secretado é uma glicoproteína com um peso molecularde 300 Kda (2.332 aminoácidos), e desempenha um papel chave na ativação deuma via de coagulação intrínseca. O FVIII inativo consiste em seis regiões: A1(resíduos 1-372), A2 (resíduos 373-740), B (resíduos 741-1.648), A3 (resíduos1.690-2.019), C1 (resíduos 2.020-2.172) e C2 (resíduos 2.173-2.332), daextremidade terminal N à extremidade terminal C. Após ser secretado, FVIIIinterage com o Fator von Willebrand (vWF), o qual protege o FVIII contraproteases do plasma. FVIII se dissocia do vWF ao ser clivado por trombina. Essaclivagem resulta na eliminação do domínio B e na formação de um heterodímero.O FVIII circula no plasma sob essa forma. Esse heterodímero consiste em umacadeia pesada (Α1, A2) e em uma cadeia leve (A3, C1, C2).

Quando o FVIII é infundido em um paciente hemofílico, ele se liga ao Fatorvon Willebrand na circulação de sangue do paciente. O Fator Vlll ativado agecomo um co-fator do Fator IX ativado, acelerando a conversão do Fator X emFator X ativado. O Fator X ativado converte protrombina em trombina. Então atrombina converte fibrinogênio em fibrina, e ocorre a coagulação.

O maior problema encontrado com a administração do Fator Vlll é osurgimento de anticorpos dirigidos contra o Fator Vlll no paciente, chamados de"anticorpos inibidores". Esses anticorpos neutralizam a atividade pró-coagulantedo Fator VIII, o qual é desativado imediatamente após a infusão. Dessa forma, ofator de coagulação é destruído antes que o sangramento possa ser interrompido,o que conduz a uma complicação séria, fazendo, assim, com que o tratamentoseja ineficaz. Além disso, alguns pacientes geneticamente não hemofílicospodem desenvolver inibidores contra o Fator Vlll endógeno; isto é chamado dehemofilia adquirida.

Estudos têm mostrado que a resposta imune do anti-Fator Vlll é do tipo deIgG policlonal que pertence principalmente às subclasses lgG4 e IgGI, e maisraramente à lgG2. A subclasse lgG3 não é representada nunca. A cadeia leve ésempre do tipo Kappa. A super-representação de lgG4 é mais pronunciadaquando os hemofílicos têm um inibidor estabelecido em longo prazo. Os domíniosC2 e A2 da molécula de FVIII são os alvos preferidos da resposta imune apesarde que, em alguns casos, são detectados anticorpos dirigidos contra o domínioA3. Quando o plasma de pacientes hemofílicos é passado através de uma colunade imunoadsorção com FVIII imobilizado, é possível purificar anticorpos anti-FVIIItotais. As quantidades recuperadas são sempre maiores do que 100 Dg por 10mg de IgGs totais (Gilles JG et al. (1993) Blood; 82 : 2452-2461). Um modelo emanimal foi desenvolvido para estudar a formação de inibidores de Fator VIII; ratosimunizados com Fator Vlll recombinante humano mostram uma resposta imunerápida do tipo policlonal (Jarvis et al., Thromb Haemost. 1996 Feb; 75 (2): 318-25). Os mecanismos pelos quais os anticorpos anti-Fator Vlll interferem com afunção do Fator Vlll são numerosos, e incluem a interferência com a clivagemproteolítica do Fator Vlll e com a interação do Fator Vlll com diferentesreagentes, tais como o Fator von Willebrand (vWF), fosfolipídeos (PL), Fator IX,Fator X ativado (FXa) ou APC (Proteína C Ativada).

Vários tratamentos que permitem a atenuação das conseqüências dessaresposta imune estão disponíveis, tais como, por exemplo, tratamentos queenvolvem desmopressina, que é um hormônio sintético que estimula a produçãodo Fator VIII, agentes promotores de coagulação, tais como concentrados decomplexos de protrombina ou concentrados de complexos de protrombinaativada, Fator Vlla recombinante, plasmaférese e infusões de quantidadesgrandes ou intermediárias de Fator VIII. Entretanto, esses métodos são muitocaros e de baixa eficácia.

Devido à complexidade da análise in vivo dessa resposta imune policlonal,anticorpos monoclonais dirigidos contra certos domínios do Fator Vlll têm sidoisolados por algumas equipes de pesquisa. Dessa forma, foi isolado um anticorpomonoclonal humano do tipo lgG4 kappa, LE2E9. O anticorpo é dirigido contra odomínio C1 do Fator Vlll e inibe a atividade do co-fator do Fator Vlll e sua ligaçãoao Fator von Willebrand (Jacquemin et al., (2000) Blood 95 : 156-163). Da mesmaforma, foi isolado um anticorpo monoclonal humano dirigido contra o domínio C2do Fator VIII, chamado de B02C11 (lgG4 kappa), produzido a partir de umabiblioteca de memória células B de um paciente que sofria de hemofilia A cominibidores (Jacquemin et al., Blood 1998 Jul 15; 92 (2) : 496-506). B02C11reconhece o domínio C2 do Fator VIII, e inibe sua ligação ao Fator von Willebrande a fosfolipídeos. Ele inibe completamente a atividade pró-coagulação de FatorVlll nativo e ativado. Um outro exemplo de anticorpo monoclonal é o anticorpoBOIIB2 dirigido contra o domínio A2 do Fator VIII. O anticorpo BOIIB2 inibe 99%da atividade do Fator VIII. Ligando-se ao domínio A2, ele pode interferir com einibir a ligação de FIXa1 a qual apresenta baixa afinidade com o local de ligaçãodentro desta região do FVIII, e desta forma inibe a atividade da enzima de FIXa.A segunda forma concebível de ação é sua interferência com o equilíbrio entre aforma heterodimérica (A2:A1 e A3:C1:C2) do FVIII e a forma heterotrimérica (A2e A1 e A3:C1 :C2) do FVIII pela aceleração da dissociação do domínio A2 dessescomplexos, tornando-os não funcionais. (Ananyeva NM et al., (2004) BloodCoagul Fibrinolysis. Mar. 15 (2): 109-24. Review).

Com a ajuda dessas novas ferramentas, uma nova, mais recente, lutaestratégica contra os anticorpos inibidores do Fator Vlll tem analisado aadministração de anticorpos anti-idiotípicos (anticorpos que têm a capacidade deinteragir com a região variável de outros anticorpos) para neutralizar os anticorposinibidores (Saint-Rémy JM et al., (1999) Vox Sang; 77 (suppl 1) : 21-24). Umanticorpo anti-idiotípico de camundongo, conhecido como 14C12, revelado nodocumento WO 2004/014955, neutraliza in vivo, de uma forma dependente dedose, as propriedades inibitórias do anticorpo alvo anti-Fator Vlll (anticorpomonoclonal B02C11), o qual é dirigido contra o domínio C2 do Fator VIII. Sendopoliclonal a resposta imune anti-Fator VIII, também têm sido desenvolvidosanticorpos anti-idiotípicos de camundongo dirigidos contra o domínio A2 do FatorVlll (e descritos no pedido de patente FR 05 08320). O domínio A2 é de 43 kD,com função não bem conhecida, mas tem-se demonstrado que anticorposinibidores dirigidos contra o domínio A2 do Fator Vlll inibem a função do FatorVllla inibindo a conversão do complexo FXase/FX no estado de transição (Lollaret al., J Clin Invest. 1994 Jun; 93 (6) : 2497-504, Fay et al., J Biol Chem. 1996;271 (11) : 6027-6032).

Entretanto, a resposta imune dirigida contra o Fator Vlll é policlonal e,portanto, implica em que os anticorpos inibidores sejam dirigidos contra domíniosdiferentes de A2 e C2. Na verdade, mesmo que o estudo sobre especificidadesepitópicas dos anticorpos anti-Fator Vlll tenha mostrado que a maioria dosinibidores reconhece regiões limitadas da molécula de Fator VIII, situadas nacadeia A2 da cadeia pesada e/ou no domínio C2 da cadeia leve, outros epítopossão às vezes reconhecidos. Na verdade, alguns plasmas de pacientes contêmanticorpos capazes de se ligarem ao domínio C1 da cadeia leve do Fator Vlll(Moreau et al„ 2000; 95(11): 3435-441; Jacquemin etal., 2000; 95 (1): 156-162).

Dessa forma, existe sempre a necessidade de novas ferramentas quepermitam a neutralização de outros anticorpos inibidores do Fator Vlll dirigidoscontra outros domínios do Fator VIII, para neutralizar mais completamente asrespostas policlonais anti-Fator Vlll de pacientes hemofílicos.

Dessa forma, o Solicitante tentou desenvolver uma nova ferramenta paratratar hemofilia A que promova a neutralização de anticorpos inibidores dirigidoscontra o domínio C1 do Fator VIII.

Descrição resumida dos desenhos

A presente invenção será, a seguir, mais detalhadamente descrita combase em um exemplo de execução representado nos desenhos. As figurasmostram:

Figura 1: um gráfico ilustrando o aumento (valor médio) para os 4camundongos na ligação de anticorpos anti-idiotípicos ao RHD5;

Figura 2: um gráfico ilustrando a ligação direta do anticorpo anti-idiotípico18B6 ao anticorpo insolubilizado RHD5;

Figura 3: um gráfico ilustrando a inibição da ligação do anticorpo RHD5 aoFVIII recombinante insolubilizado (recFVIII); e

Figura 4: um gráfico ilustrando a neutralização de RHD5 por 18B6.

Descrição detalhada da invenção

Dessa forma, um primeiro objeto da invenção refere-se a um anticorpomonoclonal anti-idiotípico dirigido contra um anticorpo humano inibidor do FatorVIII, o anticorpo inibidor sendo dirigido contra o domínio C1 do Fator VIII, esteanticorpo anti-idiotípico tendo no mínimo uma região CDR (Região Determinantede Complementaridade) de cada uma das cadeias leves do referido anticorpo, naqual a seqüência de peptídeos tem no mínimo 70% de identidade com umaseqüência selecionada das seqüências SEQ No ID: 12, SEQ No ID: 13, SEQ NoID: 14 e no mínimo uma região CDR de cada uma das cadeias pesadas doreferido anticorpo, na qual a seqüência de peptídeos tem no mínimo 70% deidentidade com uma seqüência selecionada das seqüências SEQ No ID: 9, SEQNo ID: 10, SEQ No ID: 11.

As regiões CDR em questão são as regiões CDR1 e/ou CDR2 e/ou CDR3.

As seqüências SEQ No ID: 9, SEQ No ID: 10, SEQ No ID: 11 SEQ No ID:12, SEQ No ID: 13 e SEQ No ID: 14 são definidas de acordo com Kabat [Kabat etal., "Sequences of Proteins of Immunological lnterest", NIH Publication, 91-3242(1991)].

Em uma configuração particularmente vantajosa, a identidade com cadauma das seqüências acima referidas é de no mínimo 80%, preferivelmente de nomínimo 90%, 95%, 99% e mais preferivelmente de 100%. A percentagem deidentidade é calculada alinhando-se as duas seqüências a comparar e contando-se o número de posições que têm um aminoácido idêntico, este número sendodividido pelo número total de aminoácidos da seqüência. De qualquer forma,essas diferenças de seqüências não afetam absolutamente a afinidade doanticorpo monoclonal por seu alvo ou sua funcionalidade.

"Anticorpos inibidores" ou "inibidores" do Fator Vlll referem-se a anticorposque inibem total ou parcialmente a atividade pró-coagulante do Fator VIII, a saber,através da ligação ao mesmo, e particularmente um anticorpo anti-Fator Vlll cujoepítopo esteja situado no Fator VIII. Vantajosamente, o anticorpo da invençãotem a capacidade de neutralizar no mínimo 20%, vantajosamente no mínimo30%, vantajosamente no mínimo 40%, vantajosamente no mínimo 50%,vantajosamente no mínimo 60%, e, de uma forma ainda mais vantajosa, nomínimo 70%, 80%, 90%, 99% ou 100% da atividade inibitória de coagulação dosanticorpos inibidores dirigidos contra o domínio C1 do Fator VIII, os quais são osalvos dos anticorpos monoclonais anti-idiotípicos da invenção. Essa capacidadede neutralizar a atividade inibitória de coagulação dos anticorpos inibidores podeser determinada através da medição da atividade do Fator Vlll na presença deum anticorpo inibidor e de um anticorpo anti-idiotípico em um ensaio como o"teste de cromogênio do Fator VIII" (Jacquemin et al., (1998) Blood 92. 494-506).

A expressão "anticorpo anti-idiotípico" refere-se a um anticorpo dirigidocontra a região variável dos anticorpos inibidores alvo. Em um aspecto particularda invenção, o anticorpo anti-idiotípico da invenção é dirigido contra anticorposinibidores, cujo domínio variável da cadeia pesada do referido anticorpo estárelacionado com a linhagem linha germinal DP-10. Esses anticorpos inibidorespodem ser obtidos de humanos (por exemplo, do soro de pacientes contendoanticorpos inibidores) ou de outras espécies de animais como camundongo,cavalo, cabra, primatas não humanos, extraídos de uma relação não limitante, porimunização com o Fator Vlll ou com fragmentos derivados do Fator VIII, e maisparticularmente com um fragmento compreendendo total ou parcialmente odomínio C1.

Vantajosamente, o anticorpo inibidor alvo do anticorpo anti-idiotípico dainvenção reconhece o domínio C1 em sua configuração nativa. Vantajosamente,o anticorpo inibidor alvo do anticorpo anti-idiotípico da invenção não reconhece omesmo domínio quando é uma mutação R2150H.

O anticorpo monoclonal anti-idiotípico da invenção pode ser de origemhumana ou animal. Além disso, ele pode ser obtido usando uma variedade dediferentes métodos. Por exemplo, células produzindo anticorpos anti-idiotípicospodem ser obtidas de linfócitos do sangue periférico de pacientes contendoanticorpos inibidores anti-Fator Vlll ou de pessoas sadias. Essas células podemser imortalizadas pelo uso de técnicas bem conhecidas dos profissionais da áreae selecionadas em relação à capacidade dos anticorpos anti-idiotípicosproduzidos de neutralizar os anticorpos inibidores dirigidos contra o Fator VIII. Umoutro método de produção do anticorpo monoclonal anti-idiotípico da invenção éatravés da imunização de animais, vantajosamente camundongos, por injeção deanticorpos inibidores de Fator Vlll dirigidos contra o domínio C1 do Fator VIII, eentão por fusão de linfócitos do baço com uma linhagem de célula de mieloma,vantajosamente mieloma de camundongo, seguida pela identificação e clonagemde culturas de células que produzem anticorpos anti-idiotípicos dirigidos contra osanticorpos inibidores do Fator VIII.

Em uma configuração preferida da invenção, cada uma das regiões CDRdas cadeias leves do anticorpo anti-idiotípico da invenção contém uma seqüênciade peptídeos com no mínimo 70% de identidade com as seqüências identificadasrespectivamente como SEQ No ID:12, SEQ No ID: 13 e SEQ No ID: 14, e cadauma das regiões CDR de cada uma das cadeias pesadas do referido anticorpocontém uma seqüência de peptídeos com no mínimo 70% de identidade com asseqüências identificadas respectivamente como SEQ No ID: 9, SEQ No ID: 10 eSEQ No ID: 11.

Dessa forma, a região CDR1 de cada uma das cadeias leves do anticorpoda invenção contém uma seqüência de peptídeos com no mínimo 70% deidentidade com a seqüência SEQ No ID: 12, a região CDR2 de cada uma dascadeias leves do anticorpo da invenção contém uma seqüência de peptídeos comno mínimo 70% de identidade com a seqüência SEQ No ID: 13, a região CDR3de cada uma das cadeias leves do anticorpo da invenção contém uma seqüênciade peptídeos com no mínimo 70% de identidade com a seqüência SEQ No ID: 14e a região CDR1 de cada uma das cadeias pesadas do anticorpo da invençãocontém uma seqüência de peptídeos com no mínimo 70% de identidade com aseqüência SEQ No ID: 9, a região CDR2 de cada uma das cadeias pesadas doanticorpo da invenção contém uma seqüência de peptídeos com no mínimo 70%de identidade com a seqüência SEQ No ID: 10 e a região CDR3 de cada uma dascadeias pesadas do anticorpo da invenção contém uma seqüência de peptídeoscom no mínimo 70% de identidade com a seqüência SEQ No ID: 11. De umaforma particularmente vantajosa, a identidade com cada uma das seqüênciasacima mencionadas é no mínimo de 80%, preferivelmente no mínimo de 90%,95%, 99% e mais preferivelmente de 100%.

Vantajosamente, a região variável de cada uma das cadeias leves doanticorpo monoclonal anti-idiotípico da invenção é codificada por uma seqüênciade ácidos nucléicos com no mínimo 70% de identidade com a seqüência deácidos nucléicos SEQ No ID: 16, e a região variável de cada uma das cadeiaspesadas do anticorpo monoclonal anti-idiotípico da invenção é codificada por umaseqüência de ácidos nucléicos com no mínimo 70% de identidade com aseqüência de ácidos nucléicos SEQ No ID: 15.

Para os fins da invenção, um peptídeo de sinal pode ser adicionado àsseqüências SEQ No ID: 15 e SEQ No ID: 16 para produzir respectivamente, porexemplo, as seqüências SEQ No ID: 1 e SEQ No ID: 2, nas quais nem a atividadenem a especificidade do anticorpo da invenção são afetadas por um peptídeo desinal como esse.

De uma forma particularmente vantajosa, a identidade da seqüência é nomínimo de 80%, e preferivelmente no mínimo de 95 a 99%. A percentagem deidentidade é calculada alinhando-se as 2 seqüências a comparar e contando-se onúmero de posições que têm um nucleotídeo idêntico, este número sendodividido pelo número total de nucleotídeos da seqüência. A degeneração docódigo genético resulta no fato de que o mesmo aminoácido pode ser codificadopor vários tripletos de diferentes nucleotídeos. De qualquer forma, nem aafinidade do anticorpo monoclonal por seu alvo, nem sua capacidade paraneutralizar a atividade inibitória dos anticorpos inibidores alvo, é absolutamenteafetada por essas diferenças de seqüência.

Em um aspecto preferido da invenção, a região variável de cada uma dascadeias leves do anticorpo monoclonal anti-idiotípico é codificada pela seqüênciade ácidos nucléicos SEQ No ID: 16, e a região variável de cada uma das cadeiaspesadas de anticorpo monoclonal anti-idiotípico é codificada pela seqüência deácidos nucléicos SEQ No ID: 15.

De uma forma vantajosa, a seqüência de peptídeos de cada uma dasregiões variáveis das cadeias leves do anticorpo da invenção é uma seqüênciacom no mínimo 70% de identidade, e vantajosamente no mínimo 80% ou 90%, eainda mais vantajosamente no mínimo 99% de identidade com a seqüência SEQNo ID: 18.

Para os fins da invenção, um peptídeo de sinal pode ser adicionado àsseqüências SEQ No ID: 17 e SEQ No ID: 18 para produzir respectivamente, porexemplo, as seqüências SEQ No ID: 3 e SEQ No ID: 4; nem a atividade nem aespecificidade do anticorpo da invenção são afetadas por um peptídeo de sinalcomo esse.

Vantajosamente, a seqüência de peptídeos de cada uma das regiõesvariáveis das cadeias pesadas do anticorpo da invenção é uma seqüência comno mínimo 70% de identidade, e vantajosamente no mínimo 80% ou 90%, e aindamais vantajosamente no mínimo 99% de identidade com a seqüência SEQ No ID:3.

De uma forma particularmente vantajosa, a seqüência de peptídeos decada uma das cadeias leves do anticorpo da invenção é uma seqüência com nomínimo 70% de identidade, e vantajosamente no mínimo 80% ou 90%, e aindamais vantajosamente no mínimo 99% de identidade com a seqüência SEQ No ID:

4, e a seqüência de peptídeos de cada uma das cadeias pesadas do anticorpo dainvenção é uma seqüência com no mínimo 70% de identidade, e vantajosamenteno mínimo 80% ou 90%, e ainda mais vantajosamente no mínimo 99% deidentidade com a seqüência SEQ No ID: 3.

Preferivelmente, a seqüência de peptídeos de cada uma das cadeias levesdo anticorpo da invenção é a seqüência SEQ No ID: 4.

Preferivelmente, a seqüência de peptídeos de cada uma das cadeias levesdo anticorpo da invenção é a seqüência SEQ No ID: 3.

A seqüência de peptídeos deduzida da seqüência SEQ No ID: 16 é aseqüência SEQ No ID: 18, e a seqüência de peptídeos deduzida da seqüênciaSEQ No ID: 15 é a seqüência SEQ No ID: 17. Preferivelmente, a região variávelde cada uma das cadeias leves do anticorpo monoclonal anti-idiotípico dainvenção tem a seqüência de peptídeos SEQ No ID: 18, e a região variável decada uma das cadeias pesadas do anticorpo monoclonal anti-idiotípico dainvenção tem a seqüência de peptídeos SEQ No ID: 17.

De uma forma preferida, o anticorpo inibidor alvo do anticorpo anti-idiotípico da invenção é o anticorpo RHD5 depositado nas Coleções CoordenadasBelgas da Coleção de Microorganismos / Plasmídeos (BCCM/LMBP), Laboratóriode Biologia Molecular, Universidade de Ghent, Technologiepark 297, B-9052Zwijnaarede, Bélgica, em agosto de 2004, pela Fundação de Pesquisa Collen,sob o número de acesso LMBP 6165CB. Esse anticorpo, assim como suasseqüências de nucleotídeos e de peptídeos são descritos no pedido de patenteWO 2005/016455. O anticorpo RHD5 é um anticorpo IgGI monoclonal humanodirigido contra o domínio C1 do Fator Vlll produzido inicialmente a partir delinfócitos de um paciente sofrendo de hemofilia A, a saber, hemofilia A severaadquirida, com um alto nível de inibidores. Esse anticorpo pertence à subclasseIgGI, e é originado da linha germinal DP-10. O epítopo reconhecido pelo referidoanticorpo no Fator Vlll é o domínio C1 em sua configuração nativa, mas não omesmo domínio com uma mutação R2150H. O anticorpo RHD5 pode inibir até98% da atividade do Fator VIII.

O anticorpo da invenção refere-se também a qualquer anticorpomodificado que tenha as características da invenção, nas quais um ou maisaminoácidos tenha sido substituído ou excluído. Tal substituição ou exclusãopode estar situada em qualquer posição da molécula. No caso de váriosaminoácidos terem sido substituídos ou excluídos, qualquer combinação desubstituição ou exclusão pode ser considerada. Essas modificações de seqüênciadas regiões variáveis do anticorpo da invenção podem ser efetuadas paraaumentar o número de resíduos com probabilidade de entrar em contato com oanticorpo anti-idiotípico da invenção e com o anticorpo inibidor alvo.

Em uma configuração da invenção, o anticorpo anti-idiotípico é umanticorpo de camundongo.

Vantajosamente, esse anticorpo monoclonal anti-idiotípico de camundongoé um IgGIkappa.

Preferivelmente, o anticorpo monoclonal da invenção é um anticorpoquimérico. Pela expressão "anticorpo quimérico" entende-se que ela se refere aum anticorpo no qual as regiões variáveis das cadeias leves e das cadeiaspesadas pertencem a espécies diferentes daquelas das regiões constantes dascadeias leves e das cadeias pesadas. Dessa forma, o anticorpo da invençãotambém contém as regiões constantes das cadeias leves e pesadas pertencendoa espécies não murinas. A esse respeito, todas as famílias e espécies demamíferos não murinos podem ser usadas e, particularmente, por exemplo, ohomem, o macaco, murídeos (exceto o camundongo), suídeos, bovídeos,eqüídeos, felídeos, canídeos, assim como aves.

Os anticorpos quiméricos da invenção podem ser construídos com o usode técnicas padrão para DNA recombinante, bem conhecidas dos profissionais daárea, e mais particularmente através do uso das técnicas de construção deanticorpo "quimérico" descritas, por exemplo, por Morrison et al., Proc. Natl. Acad.Sei. U.S.A., 81. pp. 6851-55 (1984), nas quais se recorre à tecnologia de DNArecombinante para substituir a região constante de uma cadeia pesada e/ou aregião constante de uma cadeia leve de um anticorpo originado de um mamíferonão humano com as regiões correspondentes de uma imunoglobulina humana.

Em um aspecto particular da invenção, o anticorpo da invenção é umanticorpo humano híbrido, o que eqüivale a um anticorpo quimérico, cuja parteconstante é humana. Essa configuração da invenção promove uma redução naimunogenicidade do anticorpo em humanos, e dessa forma melhora sua eficáciaquanto à administração terapêutica a humanos.

Vantajosamente, o anticorpo da invenção é um anticorpo humanizado. Umanticorpo como esse pode ser obtido pela associação de uma ou mais regiõesCDR (Região Determinante de Complementaridade) de um anticorpo monoclonalde uma espécie não humana com regiões humanas de estrutura (regiõesaltamente conservadas de regiões variáveis, conhecidas como estruturas), sendoesse processo de fabricação ensinado no estado da arte (Jones et al., Nature(1986) 321 : 522; Riechmann et al., Nature (1988) 332 : 323). Esse anticorpohumanizado dirigido contra o domínio variável de anticorpos inibidores quereconhecem o domínio C1 do FVIII pode conter regiões humanas de estrutura euma ou mais regiões CDR das seqüências SEQ N- ID: 9, SEQ N2 ID: 10, SEQ N2ID: 11, SEQ N- ID: 12, SEQ N2 ID: 13, SEQ N2 ID: 14. Um anticorpo humanizadoparticular da invenção é um anticorpo humanizado dirigido contra o domíniovariável dos anticorpos inibidores que reconhecem o domínio C1 do FVIII1 cujasregiões CDR são regiões de seqüência SEQ N2 ID: 9, SEQ N2 ID: 10, SEQ N2 ID:11, SEQ N2ID: 12, SEQ N2ID: 13, SEQ N2ID: 14.

De uma forma vantajosa, o anticorpo monoclonal anti-idiotípico dainvenção é o anticorpo 18B6, produzido pelo hibridoma 18B6 depositado sob onúmero de registro CNCM I-3559, em 24 de janeiro de 2006 na Coleção Nacionalde Culturas de Microorganismos (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, 75724 ParisCedex 15). A região variável de cada uma das cadeias leves do anticorpomonoclonal anti-idiotípico 18B6 é codificada pela seqüência de ácidos nucléicosSEQ N2 ID: 16, e a região variável de cada uma das cadeias pesadas doanticorpo monoclonal anti-idiotípico 18B6 é codificada pela seqüência de ácidosnucléicos SEQ N2 ID: 15. O método de obtenção do hibridoma 18B6 é descrito naseção "Exemplos" do presente documento.

O anticorpo monoclonal anti-idiotípico da invenção refere-se também aqualquer anticorpo que compreenda fragmentos do anticorpo 18B6, e maisparticularmente a qualquer anticorpo que compreenda a região variável da cadeialeve e/ou a região variável da cadeia pesada do anticorpo 18B6, ou qualquerfragmento da região variável da cadeia leve e/ou da região variável da cadeiapesada do anticorpo 18B6. Pela expressão "Fragmentos", entende-se umfragmento F(ab')2 ou um fragmento Fab'ou um fragmento Fab ou uma regiãoCDR ou qualquer versão modificada de qualquer desses fragmentos ou região.

Em uma configuração particular da invenção, o anticorpo monoclonal anti-idiotípico da invenção é um fragmento F(ab')2 ou um fragmento Fab' ou umfragmento Fab ou uma região CDR ou qualquer versão modificada de qualquerdesses fragmentos ou região. A digestão enzimática de imunoglobulinas compapaína gera 2 fragmentos idênticos chamados "fragmento Fab" (Ligação aAntígeno de Fragmento), e um fragmento Fc (fração cristalizável). O fragmento Fcé o suporte para as funções de efetor das imunoglobulinas.

Usando digestão com pepsina, é gerado um fragmento F(ab')2 no qualambos os fragmentos Fab mantêm-se ligados por duas ligações de dissulfeto, e ofragmento Fc é desmembrado em vários peptídeos. O fragmento F(ab')2 éformado por dois fragmentos Fab' (um fragmento Fab' consistindo em um Fab euma região de dobradiça), ligados por ligações intercatenárias de dissulfeto paraformar um F(ab')2.

Esses fragmentos, que contêm o local de ligação do anticorpo, podem terperdido algumas das propriedades de um anticorpo integral do qual eles derivam,como a capacidade de ativar o complemento ou de ligar os receptores Fcgama.Entretanto, esses fragmentos não perderam a capacidade do anticorpo integralde neutralizar o anticorpo inibidor. Dessa forma, a invenção refere-se também aosfragmentos F(ab')2, Fab' e Fab1 ou à região CDR ou a qualquer versãomodificada de qualquer desses fragmentos ou região do anticorpo 18B6.Particularmente, esses fragmentos preservaram a capacidade do anticorpointegral de neutralizar anticorpos RHD5.

Um objeto adicional da invenção é uma linhagem estável de células queproduzem um anticorpo acima descrito. A linhagem estável de células dainvenção pode ser de origem humana ou animal. A linhagem estável de célulasda invenção pode se originar de células humanas imortalizadas. Em umaconfiguração adicional da invenção, essa linhagem de células pode se originar decélulas imortalizadas de origem animal, por exemplo, de camundongos. Umexemplo preferido de uma linhagem de células obtida nesta configuração dainvenção é a linhagem 18B6, depositada na CNCM sob o número I-3559. Emuma outra configuração, a linhagem estável de células da invenção é umalinhagem que integrou uma construção genética que permite a expressão doanticorpo da invenção no ponto desejado do genoma. A etapa que consiste emobter essa célula é uma transfecção estável. Essa etapa pode ser aplicada aqualquer tipo de células desde que elas possam ser mantidas em cultura in vitro.A transfecção estável requer integração da construção genética, que pode serrealizada por recombinação homóloga ou randomicamente. A presença de umcassete de seleção positiva na construção genética que compreende o gene deinteresse, o qual confere resistência antibiótica à célula, por exemplo, atesta ainserção do transgene no genoma da célula. Como resultado de uma etapa desubclonagem, uma linhagem de células produtoras em longo prazo é obtida apartir do anticorpo da invenção, por exemplo, 18B6, que pode ser mantida emcultura in vitro.

A linhagem estável de células que expressam um anticorpo da invençãopode ser selecionada do grupo constituído de uma linhagem humana de células,uma linhagem de células de roedor, por exemplo, uma linhagem de células decamundongo, SP2/0, YB2/0, IR983F, um mieloma humano como Namalwa ouqualquer outra célula de origem humana como PERC6, linhagens de célulasCHO, a saber, CHO-K-1, CHO-LecI 0, CHO-LecI, CHO-LecI 3, CHO Pro-5, CHO-dhfr- (CHO DX B11, CHO DG44), ou outras linhagens de células selecionadas deWil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, K6H6, NSO, SP2/0-AG 14 eP3X63Ag8.653.Um outro assunto especial da invenção é o hibridoma 18B6 depositadosob o número de registro CNCM I-3559 na Coleção Nacional de Culturas deMicroorganismos (CNCM). A região variável de cada uma das cadeias leves doanticorpo monoclonal anti-idiotípico produzido pelo hibridoma 18B6 é codificadapela seqüência de ácidos nucléicos SEQ N2 ID: 16, e a região variável de cadauma das cadeias pesadas do anticorpo monoclonal anti-idiotípico produzido pelohibridoma 18B6 é codificada pela seqüência de ácidos nucléicos SEQ N2 ID: 15.O anticorpo produzido pelo hibridoma 18B6 é o anticorpo 18B6, e um métodopara obter o hibridoma 18B6 é descrito na seção "Exemplos" do presentedocumento.

Um outro assunto da invenção é um fragmento de DNA da seqüência SEQN2 ID: 15 que codifica a região variável da cadeia pesada da invenção, acimadescrito. Esse fragmento de DNA pode ser inserido em um vetor que permite aexpressão de um polipeptídeo, preferivelmente de um anticorpo; a região variávelda cadeia pesada do referido anticorpo é codificada pela seqüência de ácidosnucléicos SEQ N2 ID: 15; cuja seqüência de peptídeos derivada é a SEQ N2 ID:17, para ser introduzida e mantida em uma célula hospedeira. Esse vetor permitea expressão desse fragmento de ácido nucléico estranho na célula hospedeiraporque ele contém as seqüências (a promotora, de poliadenilação, gene deseleção) essenciais para esta expressão. Esses vetores são bem conhecidos dosprofissionais da área e podem ser um adenovírus, um retrovírus, um plasmídeoou um bacteriófago, não se limitando a esta relação.Além disso, qualquer célulade mamífero pode ser utilizada como célula hospedeira, que é a célula queexpressa o polipeptídeo ou o anticorpo da invenção, por exemplo, SP2/0, YB2/0,IR983F, um mieloma humano como Namalwa ou qualquer outra célula de origemhumana como PERC6, linhagens CHO de células, a saber, CHO-K-1, CHO-Lecl 0, CHO-LecI, CHO-LecI 3, CHO Pro-5, CHO-dhfr- (CHO DX B11, CHODG44), ou outras linhagens selecionadas de Wil-2, Jurkat1 Vero, Molt-4, COS-7,293-HEK, BHK, K6H6, NSO, SP2/0-AG 14 e P3X63Ag8.653.

Outro objeto da invenção é um fragmento de DNA da seqüência SEQ N2ID: 16 que codifica a região variável da cadeia leve de um anticorpo da invençãoacima descrito. Esse fragmento de DNA pode ser inserido em um vetor quepermite a expressão de um polipeptídeo, preferivelmente de um anticorpo; aregião variável da cadeia leve do referido anticorpo é codificada pela seqüênciade ácidos nucléicos SEQ N2 ID: 16; a seqüência de peptídeos deduzida damesma é a SEQ Ns ID: 18, para ser introduzida e mantida em uma célulahospedeira. Esse vetor permite a expressão desse fragmento de ácido nucléicoestranho na célula hospedeira porque ele contém as seqüências (a promotora, depoliadenilação, gene de seleção) essenciais para essa expressão. Esses vetoressão bem conhecidos dos profissionais da área e podem ser um adenovírus, umretrovírus, um plasmídeo ou um bacteriófago, não se limitando a estarelação.Além disso, qualquer célula de mamífero pode ser utilizada como célulahospedeira, que é a célula que expressa o polipeptídeo ou o anticorpo dainvenção, por exemplo, SP2/0, YB2/0, IR983F, um mieloma humano comoNamalwa ou qualquer outra célula de origem humana como PERC6, linhagensCHO de células, especialmente CHO-K-1, CHO-LecI0, CHO-LecI, CHO-LecI 3,CHO Pro-5, CHO-dhfr- (CHO DX B11, CHO DG44), ou outras linhagensselecionadas de Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, K6H6, NSO,SP2/0-AG 14 e P3X63Ag8.653.

Um outro objeto da invenção é uma composição farmacêutica quecompreende um anticorpo da invenção e no mínimo um excipiente e/ou nomínimo um veículo farmaceuticamente aceitável. Preferivelmente, o anticorpomonoclonal anti-idiotípico contido na composição farmacêutica da invenção é oanticorpo 18B6, um fragmento ou uma região derivada do 18B6, ou mesmo umanticorpo quimérico ou humanizado que compreende as regiões variáveis ou asCDRs do 18B6, e os descritos acima no presente documento. A composiçãofarmacêutica da invenção pode ser formulada com um excipiente que possa sertolerado por um paciente a ser tratado. Exemplos desses excipientes incluemágua, soluções salinas, solução de Ringer, soluções de dextrose e qualquer outrasolução fisiológica aquosa adequada. O excipiente também pode conterquantidades de aditivos, como substâncias que aumentam a isotonicidade e aestabilidade da composição. Esses excipientes incluem tampão de fosfato,tampão de bicarbonato e tampão Tris. Esses excipientes são bem conhecidosdos profissionais da área. As formulações padrão podem estar na forma delíquidos para injeção ou de formulações sólidas que podem ser re-suspendidasem um líquido adequado antes da administração. Os veículos úteis napreparação da composição farmacêutica da invenção têm vantajosamente afunção de aumentar a meia-vida da composição terapêutica no animal oupaciente, ou de promover a liberação controlada do princípio ativo. Essesveículos podem ser polímeros orgânicos e sintéticos e outros compostos químicoscapazes de disseminar os medicamentos em um ritmo normal ou disseminá-lossomente em certos ambientes, e também podem ser lipossomos, sem selimitarem a esta relação.

Vantajosamente, a composição farmacêutica da invenção, além disso,compreende no mínimo um anticorpo anti-idiotípico dirigido contra o anticorpoinibidor ligado a um domínio diferente do domínio C1 ou Fator VIII. Esse outroanticorpo pode ser um anticorpo anti-idiotípico dirigido contra um anticorpoinibidor ligado aos domínios A1, ou A3, ou Β, A2 ou C2 do Fator VIII. Narealidade, um paciente que sofre de hemofilia A, havendo desenvolvidoanticorpos inibidores, exibe mais freqüentemente vários tipos de anticorposinibidores. Além disso, as quantidades e a natureza dos diferentes tipos deanticorpos inibidores não são fixas mas podem se alterar durante a vida dopaciente. Os diferentes anticorpos inibidores de um mesmo paciente são, destaforma, dirigidos contra os diferentes domínios do Fator VIII, e é particularmentevantajoso tratar o paciente não com um mas com vários tipos de anticorpo anti-idiotípico, dirigidos contra os diferentes anticorpos inibidores.

Preferivelmente, a composição farmacêutica compreende um anticorpomonoclonal anti-idiotípico dirigido contra um anticorpo inibidor ligado ao domínioC2 do Fator Vlll e/ou um anticorpo inibidor ligado ao domínio A2 do Fator VIII, e oanticorpo monoclonal da invenção. Na verdade, os domínios A2 e C2 são osprincipais alvos da reação imune anti-Fator VIII. Dessa forma, uma composiçãofarmacêutica que compreende uma mistura de anticorpos anti-idiotípicos dirigidoscontra anticorpos inibidores ligados ao domínio C1 do Fator VIII, e anticorpos anti-idiotípicos dirigidos contra anticorpos inibidores ligados ao domínio C2, permite aneutralização de no mínimo 70%, e vantajosamente no mínimo 80% ou 90% detodos os anticorpos inibidores presentes em um paciente. Em uma configuraçãopreferida da invenção, a composição farmacêutica da invenção compreende oanticorpo 14C12 (depositado sob o número LMBP 5878CB nas ColeçõesCoordenadas Belgas de Microorganismos) e/ou o anticorpo 30D1 (depositado naCNCM sob o número I-3450). Em uma outra configuração preferida da invenção,a composição farmacêutica compreende o anticorpo quimérico 14C12,depositado na CNCM sob o número 1-3510 e/ou um anticorpo quimérico ouhumanizado derivado do anticorpo 30D1, que é um anticorpo que compreende asregiões variáveis do anticorpo 30D1.

Um outro objeto da invenção é o uso do anticorpo da invenção comomedicamento.

Outro objeto da invenção é o uso do anticorpo da invenção para fabricaçãode um medicamento. Vantajosamente, esse medicamento é usado para reduzire/ou prevenir e/ou tratar sangramento em um paciente que sofre de hemofilia,compreendendo anticorpos inibidores dirigidos contra o domínio C1 do Fator VIII.

Outro objeto da invenção é o uso do anticorpo da invenção para fabricaçãode um medicamento destinado ao tratamento de hemofilia do tipo A.

Vantajosamente, a hemofilia do tipo A assim tratada é uma hemofilia cominibidores. Esse tipo de hemofilia tratada com o anticorpo da invenção pode serinato ou adquirido. Neutralizando os anticorpos inibidores, o anticorpo dainvenção torna eficaz o tratamento de um paciente por injeção do Fator VIII, umavez que a atividade do Fator Vlll deixa de ser inibida pelos anticorpos inibidores.

Um outro objeto da invenção é o uso do anticorpo da invenção paraneutralização da atividade inibitória in vitro ou in vivo de um anticorpo inibidordirigido contra o domínio C1 do Fator VIII. Esse processo pode ser executadopara depletar os anticorpos inibidores dirigidos contra o domínio C1 do Fator Vllldo sangue de um paciente, e em seguida re-injetar o sangue tratado no referidopaciente.

Um outro objeto da invenção está relacionado com um medicamento quecompreende um anticorpo da invenção, preferivelmente o anticorpo 18B6.

Um outro objeto da invenção é o uso do anticorpo para adsorção dosanticorpos inibidores, à guisa de exemplo, para purificar os anticorpos inibidoresdo Fator VIII.Finalmente, um outro objeto da invenção é o uso do anticorpo da invençãopara detecção e/ou purificação dos anticorpos inibidores do Fator VIII. Osprocessos gerais que realizam esses métodos de detecção e purificação são bemconhecidos dos profissionais da área. À guisa de exemplo, pode-se mencionar ouso de uma coluna de imunopurificação contendo contas com o anticorpo dainvenção enxertado sobre a superfície destas. Somente as moléculasreconhecidas pelo anticorpo aderirão às contas. As outras passarão através dacoluna. Para recuperar a molécula, basta um aumento da força iônica dosolvente.

Outros aspectos e vantagens da invenção serão descritos nos exemplosque se seguem, que devem ser considerados como ilustração e não comolimitação do escopo da invenção.

Exemplo 1: Produção de um anticorpo monoclonal humano dirigido contrao domínio C1 do FatorVIII ("anticorpo anti-C1")

A linhagem de células linfoblastóides humanas RHD5 abaixo descrita foiobtida por imortalização de linfócitos B de um paciente sofrendo de hemofilia Aadquirida que desenvolveu uma resposta imune ao Fator VIII, de acordo com oprocedimento descrito no documento Jacquemin et ai, (1998), Blood 92, 496-506e no pedido de patente WO 2005/016455.

A linhagem de células que produzem o anticorpo monoclonal anti-C1RHD5 foi depositada nas Coleções Coordenadas Belgas da Coleção deMicroorganismos / Plasmídeos (BCCM/LMBP), Laboratório de Biologia Molecular,Universidade de Ghent, Technologiepark 297, B-9052 Zwijnaarede, Bélgica, emagosto de 2004, pela Fundação de Pesquisa Collen, sob o número de acessoLMBP 6165CB.

A seqüência de nucleotídeos da região variável da cadeia pesada doanticorpo RHD5 é a seqüência SEQ Ns ID: 5 e a seqüência de nucleotídeos daregião variável da cadeia leve do anticorpo RHD5 é a seqüência SEQ Ns ID: 6. Aseqüência de peptídeos correspondente à seqüência SEQ N° ID: 5 é a seqüênciaSEQ Ns ID: 7, e a seqüência de peptídeos correspondente à seqüência SEQ NsID: 6 é a seqüência SEQ N2 ID: 8.Opcionalmente, anticorpos que exibem as propriedades requeridas podemser produzidos pela imunização de animais. Neste caso, o Fator Vlll é injetadoem camundongos com um adjuvante. Anticorpos monoclonais anti-humanos sãoobtidos por fusão dos linfócitos do baço com uma linhagem de células de5 mieloma de camundongo. Sobrenadantes da célula que produzem anticorposanti-Fator Vlll são identificados e clonados por diluição limitante. Uma descriçãogeral desses métodos pode ser encontrada em "Current Protocols in Immunology1Chapter 2, John Wiley & Sons Inc, 1994". Outras seleções de inibidores queexibem as propriedades desejadas são descritas abaixo.

Exemplo 2: Produção do anticorpo anti-idiotípico 18B6I. Imunização de camundongos

Quatro fêmeas de camundongo de 6 semanas de idade Balb/c receberaminjeção subcutânea (SC) três vezes na sola da pata de 10 μg de anticorpo RHD5humano anti-domínio C1 do FVIII suspenso em um adjuvante de Freund completo(ACF) (primeira imunização) e então em um adjuvante de Freund incompleto(AIF).

A primeira sangria (sangria 0) foi efetuada antes da imunização (Dia 0 dosangramento (DO)), e então as injeções e a sangria procederam da seguinteforma:

D1: Injeção N2 1 (10 μg de anticorpo RHD5 na presença de adjuvante deFreund completo)

D15: Sangria Ne 1

D16: Injeção N2 2 (10 μg de anticorpo RHD5 na presença de adjuvante deFreund incompleto)

D28: Sangria N2 2

D29: Injeção N2 3 (10 μg de anticorpo RHD5 na presença de adjuvante deFreund incompleto)

D44: Sangria N2 3

II. Avaliação da resposta imune dos camundongosPara avaliar a presença dos anticorpos anti-RHD5 nas diferentes sangrias,é efetuado um ensaio ELISA com ligação direta. Para esse fim, o anticorpo RHD5ou uma IgGI de controle a 3 μg/ml é insolubilizado, 50 μg/cubeta, tampão deglicina, ao longo da noite a 4 0C (tampão de glicina = glicina 0,1 M, Na Cl 0,17 M,pH 9,2). Três lavagens são efetuadas com PBS/Tween (PBS = NaCI 140,0 mM,KCI 2,6 mM, KH2PO4 1,4 mM, Na2HPO4^H2O 8,1 nM, pH 7,4). O sistema édeixado em saturação por 30 minutos à temperatura ambiente (RT) com 100μΙ/cubeta de tampão Magic (tampão Magic = Tris 50 mM, NaCI 0,17 M, 1% BSA,pH 7,2). Em seguida, as sangrias são diluídas a 1/10, 1/100, 1/1.000 e 1/10.000em tampão Magic e incubadas por 2 horas à temperatura ambiente (50μΙ/cubeta). Então 3 lavagens são efetuadas em PBS/Tween. Em seguida osistema é incubado com uma solução de 1 μg/ml de anticorpos anti-lgG decamundongo policlonais de cabra marcada com HRP (peroxidase de raiz-forte)(Bio-Rad) por 2 horas à temperatura ambiente (50 μΙ/cubeta) (diluição em tampãoMagic). Então o sistema é lavado 3 vezes com PBS/Tween, e é efetuadarevelação com um cromogênio (orto-fenil-diamina) e a intensidade da coloraçãoobtida é lida com o uso de um leitor com filtros correspondendo a comprimentosde onda de 490/650 nm (leitor Emax Molecular Devithese, Sunnyvale, CA).

Resultado das densidades óticas obtidas com a IgGI de controle:

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Tabela 1

Resultado das densidades óticas obtidas com RHD5:

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Tabela 2Os resultados obtidos são apresentados na Figura 1.

Conclusão: Cada camundongo respondeu corretamente e reagiu de formasemelhante à injeção do fragmento Fab de RHD5. De uma forma arbitrária, ocamundongo Ns 4 foi selecionado para se efetuar a fusão.

III. Fusão e triagem

Foi efetuada a fusão dos linfócitos de baço do camundongo N2 4 com ascélulas de um mieloma SP2/0. A fusão foi efetuada de uma forma convencionalpara os profissionais da área (J.G. Gilles et ai, Blood (2004) 103 : 2617-23; P.Cornelis1 "Les anticorps monoclonaux", Revue IRE, vol. 7, N2 4,1983).

As células foram sucessivamente expandidas em um meio DMEM (MeioEagle Modificado de Dulbecco) contendo hipoxantina e timidina de acordo com oprincípio de diluições limite e os clones testados como positivos detectados emensaio ELISA de ligação direta, como foi descrito acima no item II.

A especificidade da ligação foi confirmada pela insolubilização de umanticorpo de IgGI humana com especificidade irrelevante, e produzido nolaboratório.

Para determinar a estabilidade do hibridoma, os testes de triagem doepítopo (testes 1 a 3) foram repetidos durante a expansão dos clones, emdiferentes volumes, de 200 μΙ a 5 ml.

Teste 1 = medição em cubeta de 200 μΙ

Teste 2 = medição em cubeta de 1 ml

Teste 3 = medição em garrafa de 5 ml

Os resultados obtidos durante diferentes triagens de epítopos sãoresumidos na seguinte tabela:

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Tabela 3

IV. Ensaio de inibição com sobrenadantes da cultura

Como mostra a Tabela 3, foi realizado um teste de exibição com ossobrenadantes da cultura. Esse ensaio foi realizado para selecionar, a partir dosclones, os anticorpos anti-idiotípicos que reconhecem exatamente umdeterminante de epítopo situado no nível do parátopo do Ab RHD5. Os anticorposanti-idiotípicos foram testados em um ensaio ELISA para inibição da ligação doRHD5 ao FVIII insolubilizado.

O Fator Vlll recombinante (recFVIII) (Baxter) a 2 μς/ιτιΙ em um tampão deglicina, 50 μΙ/cubeta, foi insolubilizado e então deixado por 2 horas à temperaturaambiente. O anticorpo RHD5 (ou uma IgGI irrelevante) à concentração final de0,6 μg/ml foi pré-incubado durante 2 horas com os sobrenadantes da cultura emuma diluição de 1/1, 1/2 e 1/4 em tampão Magic. As cubetas foram lavadas 3vezes com um tampão PBS/Tween, e então saturadas com 100 μΙ/cubeta detampão Magic (30 minutos à temperatura ambiente). Em seguida, o sobrenadanteda cultura foi incubado com 50 μΙ de RHD5 (ou IgGI irrelevante) (2 horas àtemperatura ambiente, tampão Magic), e então 3 lavagens foram realizadas. Osanticorpos RHD5 ligados ao recFVIII insolubilizado foram detectados através daadição de 50 μΙ/cubeta de uma solução de anticorpos humanos marcados comHRP anti-lgG policlonais de camundongo (Southern Biotechnology) a 1 μg/ml emtampão Magic. Três lavagens sucessivas foram realizadas com PBS/Tween, eentão foram efetuadas a revelação com um cromogênio (OPD - orto-fenil-diamina) e uma leitura da intensidade de coloração obtida com um leitor comfiltros correspondendo aos comprimentos de onda 490/650 nm (leitor EmaxMolecular Devithese, Sunnyvale1 CA).

Conclusões:

Como mostra a Tabela 3, 11 clones são capazes de inibir especificamenteo anticorpo RHD5 ligado ao recFVIII insolubilizado. (Nota: um valor negativoexpressa a possibilidade de ligação a uma região externa do parátopo, ou refleteuma concentração insuficiente de Ab no sobrenadante da cultura. Entretanto,com respeito ao número de positivos, as cubetas negativas foram eliminadas dostestes subseqüentes).

V. Teste funcional com sobrenadantes da cultura:medicão da neutralizaçãoda atividade inibitória do anticorpo RHD5 (anti-Fator VIII)

O anticorpo RHD5 é incubado a uma concentração de 1 mg/ml comsobrenadantes de diferentes clones selecionados durante o teste de inibição(diluído 3 vezes, 6 vezes, 12 vezes e 24 vezes) em tampão Magic a 37 o C. Após30 minutos, o Kogenate de FVIII (Bayer) a 0,5 U/ml final foi adicionado, e entãofoi efetuada uma incubação complementar de 30 minutos a 37 o C. As amostrasforam diluídas 30 X em tampão Magic e então os reagentes do teste de DADEcromogênico (cromogênico de Fator VIII, Dade Behring Gmbh, Marburg,Alemanha) foram adicionados seguindo as instruções do fabricante.

Como mostra a Tabela 3, 10 clones são capazes de neutralizar a atividadeinibitória do Ab RHD5. O anticorpo 18B6 foi selecionado para ser usado nasseguintes experiências, como uma função dos resultados e das curvas deneutralização.

VI. Produção extensiva do clone de 18B6 anti-RHD5 selecionado

O anticorpo anti-idiotípico 18B6 foi produzido em um meio de culturaDMEM. Essa produção foi seguida de purificação em uma coluna de afinidade deproteína G (a qual permite a purificação e então a concentração dos anticorpos, edessa forma traz confirmação adicional da especificidade do anticorpo anti-idiotípico obtido).

Purificação: 18B6: produção de 8 ml a 8,48 mg/ml.

VII. Avaliação da especificidade

As várias preparações foram avaliadas com um ELISA seguindo o mesmoprotocolo descrito nos itens Il e IV.

1. Ensaio ELISA: ligação direta do anticorpo anti-idiotípico 18B6 aoanticorpo RHD5 insolubilizadoA ligação direta do anticorpo anti-idiotípico 18B6 ao anticorpo RHD5

insolubilizado é ilustrada na Figura 2. A curva mostra que a ligação do anticorpo18B6 ao RHD5 é dependente de dose.

2. Ensaio ELISA: inibição da ligação do anticorpo RHD5 ao recombinanteinsolubilizado FVIII.

A inibição da ligação do anticorpo RHD5 ao recombinante insolubilizado

FVIII foi medida de acordo com o protocolo descrito no item IV. A concentraçãodo RHD5 utilizado é de 2 mg/ml.

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Tabela 4Os resultados são mostrados na Figura 3. Uma inibição de 50% da ligaçãode RHD5 ao FVIII é obtida com uma razão molar RHD5/18B6 de 2,5, enquantouma razão equimolar inibe 92% dessa ligação.

3. Teste funcional: medição da neutralização da atividade inibitória doanticorpo RHD5 (anti-FVIII)

O protocolo é o mesmo que o descrito no item V, com uma concentraçãofinal de RHD5 de 0,4 pg/ml e uma curva de anticorpo anti-idiotípico purificadocom concentração final de 4 a 0,002 pg/ml.

Os resultados são dados a seguir na Tabela 5:

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Tabela 5

Os resultados são ilustrados na Figura 4. Uma neutralização de 50% daatividade inibitória de RHD5 é obtida a uma razão RHD5/18B6 equimolar.

4. Medição da cinética da ligação do anticorpo anti-idiotípico 18B6 com ométodo "ressonância de superfície do plásmon Biacore"

A cinética da ligação do anticorpo anti-idiotípico 18B6 ao anticorpo inibidorRHD5 foi avaliada com o uso do método "ressonância de superfície do plásmonBiacore" usando o Pharmacia Biosensor BIAcore (Pharmacia Biosensor AB1Uppsala, Suécia). Os anticorpos RHD5 foram imobilizados na superfície ativadade uma sonda CM5. Os anticorpos anti-idiotípicos 18B6 foram infundidos emdiferentes concentrações de RHD5 imobilizado na superfície da sonda. Asconstantes de associação e de dissociação foram determinadas:

Ka (M-1S-1) = 4,26x103Kd(S-I) = 1,45x10-5KD: M. 3,4 χ 10"9

5. Caracterização da subclasse do anticorpo anti-idiotípico 18B6.

Para determinar a subclasse do anticorpo 18B6, foi usado o sistemaIsoStrip da Roche (fita colorimétrica). O anticorpo 18B6 foi identificado como umaIgGI kappa.

VIII. Seqüência do anticorpo 18B6

Para efetuar o seqüenciamento, foi isolado o mRNA do hibridoma queproduz o anticorpo anti-idiotípico 18B6, usando um Quick Prep Micro mRNAPurification Kit (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia). O cDNA foisintetizado com o uso do First-strand cDNA Synthesis Kit (Amersham PharmaciaBiotech). O cDNA que codifica a cadeia pesada (VH) e a cadeia leve (VL) foiamplificado por PCR (Reação em Cadeia de Polimerase) usando preparadoresespecíficos correspondentes a diferentes famílias de genes potencialmenteencontrados no camundongo. Os produtos de PCR foram isolados de um gel deagarose de 1,5% por meio do Quick Gel Extraction Kit QIA (Qiagen, Hilden,Alemanha) e clonados com o sistema pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison,Wl). O DNA plasmídico das colônias positivas foi isolado por meio do High PurePlasmid Isolation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha) e seqüenciadoem ambas as direções com Seqenase (US Biochemical, Cleveland, OH).

IX. Propriedades particulares do anticorpo 18B6

O anticorpo 18B6 inibe completamente a ligação do anticorpo RHD5 a seuantígeno, Fator VIII. O anticorpo RHD5 apresenta um idiótipo complementar aodo 18B6.

A ligação de um anticorpo ao antígeno envolve uma interface de mútuoreconhecimento de 6 a 12 angstrõm2 correspondendo a um grande número deaminoácidos que se associam entre si com ligações de hidrogênio, atraçãohidrofóbica ou polar e pontes de Van der Wals.

Em um nível funcional, quando um anticorpo inibe completamente aligação de um anticorpo ao antígeno, isto implica em que o anticorpo inibidorapresenta uma "imagem interna" do antígeno, isto é, uma estrutura tridimensionalque mimetiza a estrutura 3-D do antígeno.

Apesar de a estrutura primária (seqüência de aminoácidos) do anticorpo18B6 mostrar baixa identidade com o domínio C1 do Fator VIII, o alinhamentodas estruturas secundárias do anticorpo 18B6 com aquelas do domínio C1 doFVIII, o alvo antigênico do anticorpo RHD5, e a modelagem tridimensional do18B6 indicam, por superposição com a estrutura 3-D do domínio C1, que a partevariável da cadeia leve (VL) do 18B6 representa uma imagem interna do domínioC1.

Esta observação confere ao anticorpo 18B6 uma propriedade particular,inédita e imprevisível. Em outras palavras, qualquer tentativa de gerar anticorpossemelhantes ao 18B6 através de imunização com um anticorpo como o RHD5não produzirá de facto anticorpos idênticos ao 18B6.Listagem siquencia biolo.txtLISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS BIOLÓGICAS

Requerente: Laboratoire Français du Fractionnement et desBiotechnologies

Titulo da invenção:"anticorpos anti-idiotípicos que neutralizam aATIVIDADE INIBITÓRIA DE UM ANTICORPO INIBIDORDIRIGIDA CONTRA O DOMÍNIO Cl DO FATOR VIII"

Número de seqüências: 18

Sistema operacional: Patentin version 3.3

N°. identificação: 1

Tamanho: 424

Tipo: DNA

Nome: Mus musculus

<400> 1 atgggatgga gctggatctt tctcttcctg ttttcagtaa ctgcaggtgt ccactcccag 60

gtccagcttc agcagtctgg ggctgaactg gcaaaacctg gggcctcagt gaagatgtcc 120

tgcaaggctt ctggctacac ctttactacc tactggatgc actggataaa acagaggcct 180

ggacaggatc tggaatggat tggatacatt aatcctacct ctggttatac tgagtacaat 240

cagaacttca aggacaaggc cacattgact gcagacaaat cctccagcac agcctacatg 300

caactgaaca gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt tctgtgcaag atcgggggcc 360

tactataggt acgacgatgc tatggactcc tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 420

tcag 424N0. identificação: 2

Tamanho: 391

Tipo: DNA

Nome: Mus musculus <400> 2

atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctattca gtgcctcagt cataatgtcc 60

agaggacaaa ttgttctctc ccagtctcca gcaatcctgt ctgcatctcc aggggagaag 120

gtcacaatga cttgcagggc cagctcaagt gtaagttaca tgaactggta tcagcagaag 180

ccaggatcct cccccaaacc ctggatttat gccacatcca acctggcttc tggagtccct 240

gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttattctc tcacaatcag cagagtggag 300

gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggagta gtaacccacc catgctcacg 360

ttcggtgctg ggaccaagct ggagctgaaa C 391

N°. identificação: 3

Tamanho: 141

Ti po: PRT

Nome: Mus musculus <400> 3 Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Phe Ser val Thr Ala Gly 1 5 10 15

Página 1Listagem siquencia biolo.txt

Val His Ser Gln vai Gln Leu Gln Gln ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys 20 25 30

Pro Gly Ala Ser vai Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45

Thr Thr Tyr Trp Met His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Asp Leu 50 55 60

Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Thr Ser Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn65 70 75 80

Gln Asn Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala vai 100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Gly Ala Tyr Tyr Arg Tyr Asp Asp Ala Met 115 120 125

Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 140

N0. identificação: 4Tamanho: 130Ti po: PRTNome: Mus musculus

<400> 4

Met Asp Phe Gln vai Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Phe Ser Ala Ser1 5 10 15

vai lie Met ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln ser Pro Ala Ile 20 25 30

Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys vai Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45

Ser Ser vai Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser 50 55 60

Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly vai Pro65 70 75 80

Ala Arq Phe Ser Gly Ser Gly ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile 85 90 95

Ser Arq vai Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 100 105 11O

Página 2Listagem siquencia biolo.txt

Ser Ser Asn Pro Pro Met Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu 115 120 125

Leu Lys 130

N0. Identificação: 5Tamanho: 421Tipo: DNANome: Homo sapiens

<400> 5

atggactgga cctggaggtt cctctttgtg gtggcagcag ctgcaggtgt ccagtcccag 60

gtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcccg ggtcgtcggt gatggtctcc 120

tgcaaggctt ctggaggcac cttcagcagc tttggtatca gctgggtgcg acaggcccct 180

ggacaagggc ttgagtgggt gggagggatc atccctatct ttggtacagc aaacaccgca 240

cggaacttcc agaatagagt caccattacc gcggacgaat tcacgagcac agcctacata 300

cgactgagga gcctgagatc tgaagatacg gccgtgtatt actgtgtcgg cggtcgagat 360

gcctacagct ttgatggttt tgatgtctgg ggccaaggga caatggtcac cgtctcttca 420 g 421

N0. Identificação: 6Tamanho: 385Ti po: DNANome: Homo sapiens

<400>6atggcatgga tccctctctt cctcggcgtc cttgtttact gcacaggatc cgtggcctcc 60tctgggctga ctcagccaca ctcagtgtcc gtgtccccag gacagacagc caacatcacc 120tgctctagag ataagttggg tcataaattt gcttcctggt atcaacagaa gccaggccag 180tcccctgctc ttctcatcta tcaagacagc aagcggccct cagggatccc tgagcgattc 240tctggctcca actctgggaa cacagccact ctgaccatca gcgggaccca ggctatggat 300gaggctgact attactgtca ggcgtgggac aacaccactg ccgtattcgg cggagggacc 360aagttgacag tcctaagtca gccca 385

N°. Identificação: 7Tamanho: 140Ti po: PRTNome: Homo sapiens

<400> 7

Met Aso Trp Thr Trp Arq Phe Leu Phe Val Val Ala Ala Ala Ala Gly1 5 10 15

Vai Gln Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30

Página 3Listagem siquencia biolo.txt

Pro Gly Ser ser vai Met vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe35 40 45

Ser Ser Phe Gly Ile ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu50 55 60

Glu Trp Val Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Thr Ala65 70 75 80

Arq Asn Phe Gln Asn Arg vai Thr Ile Thr Ala Asp Glu Phe Thr ser 85 90 95

Thr Ala Tyr Ile Arq Leu Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val100 105 110

Tyr Tyr Cys vai Gly Gly Arg Asp Ala Tyr ser Phe Asp Gly Phe Asp115 120 125

vai Trp Gly Gln Gly Thr Met vai Thr vai Ser Ser130 135 140

N°. identificação: 8

Tamanho: 128

Ti po: PRT

Nome: Homo sapiens

<400> 8

Met Ala Trp Ile Pro Leu Phe Leu Gly vai Leu vai Tyr Cys Thr Gly15 10 15

Ser vai Ala Ser ser Gly Leu Thr Gln Pro His ser Val Ser vai Ser20 25 30

Pro Gly Gln Thr Ala Asn Ile Thr Cys Ser Arg Asp Lys Leu Gly His35 40 45

Lys Phe Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Ala Leu50 55 60

Leu Ile Tyr Gln Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe65 70 75 80

Ser Gly Ser Asn ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr85 90 95

Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Asn Thr100 105 110

Thr Ala vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr vai Leu ser Gln Pro115 120 125

Página 4Listagem siquencia biolo.txt

N°. identificação: 9

Tamanho: 10

Ti po: PRT

Nome: Mus musculus

<400> 9

Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp Met His1 5 10

N°. identificação: 10

Tamanho: 17

Tipo: PRT

Nome: Mus musculus

<400> 10

Tyr Ile Asn Pro Thr Ser Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Asn Phe1 5 10 15

Asp

N°. identificação: 11

Tamanho: 13

Ti po: PRT

Nome: Mus musculus

<400> 11

Ser Gly Ala Tyr Tyr Arg Tyr Asp Asp Ala Met Asp Ser15 10

N°. identificação: 12

Tamanho: 10

Ti po: PRT

Nome: Mus musculus

<400> 12

Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn1 5 10

N°. identificação: 13

Tamanho: 7

Ti po: PRT

Nome: Mus musculus

<400> 13

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser1 5

N°. identificação: 14

Tamanho: 11

Ti po: PRT

Nome: Mus musculus

<400> 14

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Met Leu Thr

Página 5Listagem siquencia biolo.txt

N0. identificação: 15Tamanho: 367Ti po: DNANome: Mus musculus

<400> 15caggtccagc ttcagcagtc tggggctgaa ctggcaaaac ctggggcctc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctggcta cacctttact acctactgga tgcactggat aaaacagagg 120

cctggacagg atctggaatg gattggatac attaatccta cctctggtta tactgagtac 180

aatcagaact tcaaggacaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240

atgcaactga acagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagatcgggg 300

gcctactata ggtacgacga tgctatggac tcctggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 360

tcctcag 367

N0. identificação: 16Tamanho: 325Ti po: DNANome: mus musculus

<400> 16caaattgttc tctcccagtc tccagcaatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60

atgacttgca gggccagctc aagtgtaagt tacatgaact ggtatcagca gaagccagga 120

tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttat tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaacc cacccatgct cacgttcggt 300

gctgggacca agctggagct gaaac 325

N°. identificação: 17Tamanho: 122Ti po: PRTNome: Mus musculus

<400> 17

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala1 5 10 15

Ser vai Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30

Trp Met His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Asp Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Thr ser Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Página 6Listagem siquencia biolo.txt

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala vai Tyr Phe Cys 85 90 95

Ala Arq Ser Gly Ala Tyr Tyr Arg Tyr Asp Asp Ala Met Asp Ser Trp 100 105 110

Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120

N0. identificação: 18

Tamanho: 108

Ti po: PRT

None: Mus musculus

<400> 18

Gln Ile vai Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly vai Pro Ala Arg Phe ser Gly Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg vai Glu Ala Glu65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Met 85 90 95

Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105

Página 7

Claims (29)

1. Um anticorpo monoclonal anti-idiotípico dirigido contra um anticorpoinibidor humano Fator VIII, o referido anticorpo inibidor sendo dirigido contra odomínio C1 do Fator VIII, no qual no mínimo uma região CDR (RegiãoDeterminante de Complementaridade) de cada uma das cadeias leves do referidoanticorpo contém uma seqüência de peptídeos que apresenta no mínimo 70% deidentidade com uma seqüência selecionada entre o grupo: SEQ Ns ID: 12, SEQN2 ID: 13, SEQ N- ID: 14 e no qual no mínimo uma região CDR de cada uma dascadeias pesadas do referido anticorpo contém uma seqüência de peptídeos queapresentam pelo menos 70% de identidade com uma seqüência selecionadadentre as seqüências SEQ N2 ID: 9, SEQ N2 ID: 10, SEQ N2 ID: 11.

2. O anticorpo de acordo com a reivindicação 1, na qual cada região CDRde cada uma das cadeias leves do referido anticorpo contém uma seqüência depeptídeos que apresenta no mínimo 70% de identidade com as seqüências SEQN2 ID: 12, SEQ N2 ID: 13 e SEQ N2 ID: 14, respectivamente, e na qual cadaregião CDR de cada uma das cadeias pesadas do referido anticorpo contém umaseqüência de peptídeos que apresenta no mínimo 70% de identidade com asseqüências SEQ N2 ID: 9, SEQ N2 ID: 10 e SEQ N2 ID: 11, respectivamente.

3. O anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, naqual a região variável de cada uma das cadeias leves do referido anticorpo écodificada por uma seqüência de ácidos nucléicos que apresenta pelo menos70% de identidade com a seqüência de ácidos nucléicos SEQ N2 ID: 16, e naqual a região variável de cada uma das cadeias pesadas do referido anticorpoestá codificada por uma seqüência de ácidos nucléicos que apresenta pelomenos 70% de identidade com a seqüência de ácidos nucléicos SEQ N2 ID: 15.

4. O anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, naqual a região variável de cada uma das cadeias leves do referido anticorpo écodificada pela seqüência de ácidos nucléicos SEQ N2 ID: 16, e na qual a regiãovariável de cada uma das cadeias pesadas do referido anticorpo é codificada pelaseqüência de ácidos nucléicos SEQ N2 ID: 15.

5. O anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações acimacitadas, na qual a seqüência de peptídeos da região variável de cada uma dascadeias leves do mesmo é uma seqüência que exibe pelo menos 70% deidentidade com a SEQ N- ID: 18, e a seqüência de peptídeos da região variávelde cada uma das cadeias pesadas do mesmo é uma seqüência que exibe nomínimo 70% de identidade com a SEQ N2 ID: 17.

6. O anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações acimacitadas, na qual a seqüência de peptídeos deduzida da seqüência SEQ N2 ID: 16é a seqüência SEQ N2 ID: 18, e na qual a seqüência de peptídeos deduzida daseqüência SEQ N2 ID: 15 é a seqüência SEQ N2 ID: 17.

7. O anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores,na qual o anticorpo inibidor é o anticorpo RHD5 (depositado na ColeçãoBCCM/LMBP sob o número LMBP 6165CB).

8. O anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, naqual o referido anticorpo anti-idiotípico é um anticorpo de um camundongo.

9. O anticorpo de acordo com a reivindicação 8, na qual o referidoanticorpo anti-idiotípico é uma IgGI kappa.

10. O anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesanteriores, na qual o referido anticorpo é um anticorpo quimérico.

11. O anticorpo de acordo com a reivindicação 10, na qual o referidoanticorpo é um anticorpo híbrido humano.

12. O anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, naqual o referido anticorpo é um anticorpo humanizado.

13. O anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesanteriores, na qual ele é selecionado dentre o grupo constituído de: um fragmentoF(ab')2, um fragmento Fab', um fragmento Fab, uma região CDR e qualquerversão modificada de qualquer um desses fragmentos ou regiões.

14. O anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, naqual ele é capaz de ser produzido pelo hibridoma 18B6 depositado sob o númerode registro CNCM 1-3559 na Coleção Nacional de Culturas de Microorganismos(CNCM).

15. Uma linhagem estável de células que produzem um anticorpo deacordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13.

16. A linhagem estável de células, de acordo com a reivindicação 15, éselecionada dentre um grupo constituído de: SP2/0, YB2/0, IR983F, o mielomahumano Namalwa, PERC6, as linhagens de células CHO1 a saber, CHO-K-1,CHO-LecI O, CHO Lecl, CHO-Led 3, CHO Pro-5, CHO-dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero,Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 e P3X63Ag8.653.

17. O hibridoma 18B6 depositado sob o número de registro CNCM I-3559na Coleção Nacional de Culturas de Microorganismos (CNCM).

18. Um anticorpo monoclonal anti-idiotípico dirigido contra um anticorpohumano inibidor do Fator VIII, o referido anticorpo inibidor sendo dirigido contra odomínio C1 do Fator Vlll produzido pelo hibridoma 18B6 depositado sob onúmero de registro CNCM I-3559 na Coleção Nacional de Culturas deMicroorganismos (CNCM).

19. Um fragmento de DNA que exibe a seqüência SEQ Ne ID: 15 e codificaa região variável da cadeia pesada de um anticorpo de acordo com qualquer dasreivindicações 1 a 14.

20. Um fragmento de DNA que exibe a seqüência SEQ Ns ID: 16 e codificaa região variável da cadeia leve de um anticorpo de acordo com qualquer dasreivindicações 1 a 14.

21. Uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo deacordo com qualquer das reivindicações 1 a 14 e no mínimo um excipiente e/ouno mínimo um veículo farmaceuticamente aceitável.

22. A composição de acordo com a reivindicação 21, caracterizada porcompreender no mínimo um anticorpo anti-idiotípico dirigido contra um anticorpoanti-FVIII dirigido contra um domínio diferente do domínio C1 do Fator VIII.

23. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 ou-22, a qual compreende um anticorpo anti-idiotípico dirigido contra um anticorpoanti-FVIII dirigido contra o domínio C2 do Fator Vlll e/ou um anticorpo dirigidocontra o domínio A2 do Fator VIII.

24. O uso de um anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a-14, para a fabricação de um medicamento.

25. O uso de um anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a-14, para a fabricação de um medicamento destinado ao tratamento de hemofiliado tipo A.

26. O uso de um anticorpo de acordo com a reivindicação 25, na qual ahemofilia é uma hemofilia com inibidores.

27. O uso de um anticorpo de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 14 para a neutralização in vitro da atividade inibitória de umanticorpo inibidor dirigido contra o domínio C1 do Fator VIII.

28. O uso de um anticorpo de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 14, para detecção e/ou purificação in vitro dos anticorposinibidores do Fator VIII.

29. Um medicamento compreendendo um anticorpo de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 14.