KR20080096807A - 암 치료용 6탄당 화합물 - Google Patents

Abstract

교모세포종 및 췌장암의 치료 방법은 교모세포종 및 췌장암의 치료를 필요로 하는 환자에게 6탄당 화합물의 치료학적 유효량을 투여하는 것으로 제공된다. 본 발명은 뇌암 및 췌장암의 치료를 필요로 하는 환자에게 만노스 화합물의 치료학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 뇌암 및 췌장암의 치료 방법을 포함한다. 또한, 본 발명은 종양 증식의 치료를 필요로 하는 환자에게 2-FM의 치료학적 유효량의 투여를 포함하는 종양 증식의 치료 방법을 포함한다.

Description

암 치료용 6탄당 화합물{HEXOSE COMPOUNDS TO TREAT CANCER}

관련 출원

본 출원은 2006년 2월 24일에 출원된 미국 가출원 제60/776,793호; 2006년 4월 27일에 출원된 미국 가출원 제60/795,621호; 및 2006년 4월 28일에 출원된 미국 가출원 제60/796,173호에 대하여 우선권을 주장한다. 이들 출원들은 그 전체가 본 명세서에 참고로서 병합되어 있다.

발명의 분야

본 발명은 암 치료에 유용한 6탄당 화합물 및 암 매개 질병의 치료를 필요로 하는 환자에게 그러한 화합물을 투여하여 암 매개 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다.

암 치료는 종양 내성이 발현되는 위험과 종종 연관되어 있다. 프로그래밍된 세포 사멸 형태인 아포토시스에는 세포 형태 (morphology) 및 사멸에 이르는 일련의 생화학적 반응이 포함된다. 아포토시스 과정은 세포 단편을 안전하게 처리하는 방법으로 수행된다. 그러나, 암 치료 요법을 통해 세포내 신호 전달 경로를 밝힘으로써, 세포 사멸 유도에 있어 중요한 구조 및 프로세스에 영향을 미칠 수 있다. 사실상, 결함이 있는 아포토시스 프로세스는 수많은 질병과 연관되어 있다. 과다한 아포토시스는 허혈 손상과 같은 세포 손실 (cell-lose) 질병을 일으킨다. 반면, 충분하지 않은 정도의 아포토시스는 암과 같은 비조절성 세포 증식을 초래한다.

악성 신경아교종이 진행되면서 생기는 변화는 PI-3K/ AKT 경로의 활성 (전형적으로는 PTEN 손실에 의하거나 또는 EGFR과 같은 성장 인자 활성에 의함)과 관련될 수 있다. 이러한 생존 경로는 수많은 적응성 변화를 활성화시키는데, 이에는 기타의 것들 중에서 바람직하게는 혈관 형성 자극, 아포토시스 억제 및 해당 작용 (glycolysis)의 활성을 증진시키는 대사 방식의 변화가 포함된다. 유사하게, 췌장암 치료의 새로운 표적으로, 혈관 형성에 포함되는 신호 전달 경로 및 분자, 특히, ras 종양 유전자 신호 경로 및 기질 금속 단백 분해 효소 (MMP: matrix metalloprotease)의 억제제라는 표적이 있다.

악성 신경아교종 및 췌장암과 같은 많은 암은 본질적으로 통상적인 치료 요법에 대하여는 내성이 있고, 상당한 치료적 도전 가능성을 보인다. 악성 신경아교종은 100,000건 당 6.4건의 연간 발병률로 나타나는 것으로 (Central Brain Tumor Registry of the United States, 2002-2003), 주요한 뇌종양 및 가장 치명적인 인간 암의 가장 일반적인 아형이다. 가장 공격적인 증상을 보이는 다형성 교모세포종 (GBM)에 있어, 환자의 정중 (median) 생존 기간은, 치료하고자 하는 최대한의 노력에도 불구하고, 9 내지 12개월의 범위 내이다. 사실상, GBM을 앓고 있는 환자의 대략 1/3에 있어서는, 방사선 및 화학 치료 요법으로의 치료에도 불구하고, 그들의 종양이 계속 자랄 것이다. 유사하게, 진단시의 종양의 정도에 따라 다르겠지만, 췌장암의 예후는 일반적으로 나쁜 것으로 여겨지고, 진단 후 5년까지 살아있는 환자가 별로 없으며, 완전히 완화되는 경우는 거의 없다.

또한, 치료에 대한 종양 내성이 생기는 것뿐 아니라, 악성 종양을 치료하는 데 있어서의 또다른 문제는 질병의 영향을 받지 않은 정상 조직에 치료 독성이 미치는 것이다. 종종 화학 치료 요법은 이들 세포가 정상이건 악성이건 상관없이 빠르게 분할되는 세포를 죽이는 것을 목표로 한다. 그러나, 만약 종양의 성장 조절 경로가 무력하게 될 수 있다면, 일반적인 세포 사멸 및 암 치료 관련 부작용은 종양 억제를 위하여 필수적이지 않을 수 있다. 예컨대, 하나의 접근법은 치료 요법 감작 (therapy sensitization)을 이용하는 것, 즉 표준 치료 약물의 투여량을 줄이고 종양 세포 내의 중요한 프로세스를 특히 표적으로 하는 약물을 함께 사용하여 기타 약물의 효과를 증진시키는 것이다.

또한, 조합 치료 요법으로는 화학 치료 요법에 있어서 세포를 감소시키고 면역을 조절하는 요소와, 면역 치료 요법에 있어서 종양 세포의 세포 독성 특이성을 조합한 백신 기재 접근법이 있다. 그러나, 병합 치료 요법은 단일 제제만을 필요로 하는 치료 요법보다 환자와 의사 모두에게 일반적으로 더 어렵다. 또한, 특정 종양은 방사선 치료 요법에 대한 본연의 내성을 가지고, 차별되는 성장 패턴으로 인하여 수많은 화학 치료 요법 방식이 나타나게 되며, 상이한 타입의 성장 패턴은 개별 종양 내의 저산소 부위의 다양한 정도를 나타낼 수 있다. 예컨대, 신경아교종은 빠르게 성장하는 조영 증강 종괴성 병변과 대비시 MRI 스캔에서의 조영 증강이 거의 보이지 않고, 주로 침윤 방식으로 성장할 수 있다. 유사하게, 초기 췌장암은 발견되지 않은 채로 진행될 수 있다. 또한, 상대적 저산소 부위는 빠르게 성장하는 종양의 중앙 (종종 이와 관련된 괴사 부위를 가짐) 뿐 아니라 종양의 침윤 성분 내의 상대적 저산소 부위 둘다에서 발견될 수 있다. 따라서, 이들 상대적 저산소 부위의 일부는 느린 속도의 주기를 이루는 세포를 가질 수 있고, 따라서 화학 치료 요법 제제에 내성일 수 있다.

근래, 제안된 암 치료 요법에서는 해당 억제제를 사용하고자 한다. 이러한 타입의 억제제는 세포가 호기성 대사에서 혐기성 대사로 전환할 때 얻어지는 선택성으로부터 이득을 얻도록 되어 있다. 종양 증식으로 인하여, 암 세포에서는 혈액 (산소 공급)이 제거된다. 저산소 하에서, 종양 세포는 글루코스 전달체 및 해당 효소 둘다의 발현을 상향 조절하고, 이는 호기성 환경에서 정상 세포와 비교시 글루코스 유사체의 흡수량이 증가되는 것을 뒷받침한다. 혈액 내 세포에서의 해당 작용을 차단하여도 세포가 사멸되지 않을 것인데, 이는 세포가 에너지 (ATP와 같은 에너지 저장 분자에 의하여)를 생산하는 그 미토콘드리아 내의 지방 및 단백질을 태우는 데 산소를 이용하여 생존하기 때문이다. 이에 비하여, 저산소 환경의 세포 내에서 해당 작용이 차단될 때에는, 세포가 산소 없이 지방 및 단백질의 산화에 의하여 에너지 (미토콘드리아에 의하여)를 생산할 수 없기 때문에, 세포는 사멸된다. 따라서, 해당 억제제는 특정 암을 치료한다는 보장을 보여온 반면, 저산소 환경에서는 어떠한 암세포도 존재하지 않는다. 사실상, 오토 바르부르크 (Otto Warburg)의 고전적 보고서에서, 많은 종양이, 심지어 적정량의 산소의 존재 하에서 세포의 에너지 생산을 위한 해당 작용을 바람직하게 이용하는 것을 선호한다는 것을 설명해 왔다 (산화성 해당 작용 또는 "바르부르크 효과"라 칭함). 이러한 종양 적응성 반응은 악성 신경아교종에 대하여도 사실인 것으로 보인다.

그러므로, 화학 치료 요법에 대한 내성을 보이고, 종양 내부에 다양한 정도의 저산소 부위를 가지고 차별되는 성장 패턴을 보이며 및/또는 혈관 형성에 관한 자극이나 아포토시스를 억제하는 생존 경로를 가지는, 암을 치료할 필요가 있다.

도 1A는 24 시간의 기간에 걸친 2-DG, 2-FDG, 2-FDM 및 옥사메이트로 SKBR3 세포에서의 종양 성장 억제를 측정한 결과를 나타낸다. 각 수치는 평균 ± 제3 시료의 SD이다.

도 1B는 24 시간의 기간에 걸친 2-DG, 2-FDG, 2-FDM 또는 옥사메이트로 SKBR3 세포에서의 세포 독성을 측정한 결과를 나타낸다. 각 수치는 평균 ± 제3 시료의 SD이다.

도 2A는 배지 내의 2 mM의 2-DG 또는 2-FDG 중 어느 하나 및 락테이트 농축물의 부재 또는 존재 하에서 24 시간 동안의 SKBR3 세포 성장 결과를 나타낸다.

도 2B는 도 2A에서 사용된 농도와 동일한 농도의 2-DG 또는 2-FDG 중 어느 하나의 존재 하에서 6 시간 동안의 SKBR3 세포 성장 및 뒤이어 전체 세포 용해질 내에서의 ATP 정량 결과를 나타낸다.

도 3A는 SKBR3 세포를 여러 당의 존재하에서 2-DG로 처리한 후 세포 내에서의 성장 억제 측정 결과를 나타낸다. 각각의 수치는 평균 ± 제3 시료의 SD이다.

도 3B는 SKBR3 세포를 여러 당 존재하에서의 2-DG로 처리한 후 세포 내에서의 세포 독성 측정 결과를 나타낸다. 각각의 수치는 평균 ± 제3 시료의 SD이다.

도 3C는 2 mM 만노스의 존재 또는 부재 하에서 2-DG로 처리한 후, '저산소'의 3개의 상이한 모델에 있어서의 성장 억제 측정한 결과를 나타낸다.

도 3D는 2 mM 만노스의 존재 또는 부재 하에서 2-DG로 처리한 후, '저산소'의 3개의 상이한 모델에 있어서의 세포 독성 측정한 결과를 나타낸다.

도 4A는 SKBR3 세포를 각각의 레인에 나타낸 바와 같은 다양한 약물로 48 시간 동안 처리하고, 전체 세포 추출물을 얻으며, HRP-결합 ConA으로 블롯팅 (blotting)시킨 결과를 보인다. 동일한 양의 단백질을 각각의 레인에 로드하고, β-액틴으로 확인하였다. 글리코단백질 (화살표로 구별됨)은 8mM의 2-DG 및 2-FDM (2-FDG는 아님)이 그 ConA 결합을 감소시키는 것과, 이러한 감소가 만노스에 의하여 역행될 수 있다는 것을 보인다.

도 4B는 도 4A의 세포를 erbB2, 고발현된 글리코단백질에 대하여 블롯팅시킨 결과를 보인다. 이 단백질의 분자량에 있어서의 변화는 2-DG 및 2-FDM의 비슷한 투여량으로부터 기인한다.

도 5A는 SKBR3 세포를 8 mM의 2-DG, 2-FDG 또는 2-FDM 중 어느 하나로 24 시간 동안 처리하고, 전체 세포 용해질을 2개의 분자적 샤프론 (molecular 차프론), Grp78 및 Grp94에 대하여 블롯팅시킨 결과를 보인다. 1 micro g/ ml의 튜니카마이신 (TUN)을 양성 제어 (positive control)로 사용하였다. 단백질 로딩은 β-액틴으로 확인하였다.

도 5B는 "저산소" A, B 및 C 모델의 세포를 동일한 투여량의 당 유사체로 처리할 때 측정된 단백질의 웨스턴 블롯을 보인다.

도 6은 SKBR3 세포를 8 mM의 2-DG, 2-FDG 또는 2-FDM 중 어느 하나로 24 시간 동안 처리하고 전체 세포 용해질을 CHOP/GADD154에 대하여 탐색한 결과를 보인다. 2-DG 및 2-FDM 양자에 의하여 유도된 CHOP/GADD154의 유도는 외래성 만노스의 첨가에 의하여 역행되는 반면, 글루코스는 이 단백질의 양에 어떠한 영향도 미치는 않음을 보였다. 튜니카마이신을 양성 제어로서 사용하였다. 단백질 로딩은 β-액틴으로 확인하였다.

도 7은 해당 작용을 보이고, N-결합 당화 경로는 2-DG, 2-FDM 및 2-FDG가 저산소 종양 세포에 있어서의 해당 작용 및 계속해서 일어나는 세포 사멸을 방지하는 포스포글루코스 이성화 효소를 억제할 수 있음을 보인다. 그러나, 호기성 조건 하에서의 특정 종양 세포 타입에서, 2-DG 및 2FDM은 그 구조가 만노스 뿐 아니라 글루코스를 닮아서 전개된 단백질 반응 및 독성의 유도로 이끄는 올리고당의 지질 결합 회합를 방해할 수 있다. (삼각형 = 글루코스, 육각형 = 만노스 및 사각형 = N-아세틸-글루코사민)

도 8A는 선택된 신경아교종 세포주 및 본 발명의 특정 6탄당 화합물의 감작을 나타내는 MTT 분석을 보인다.

도 8B는 선택된 신경아교종 세포주 및 본 발명의 특정 6탄당 화합물의 감작을 나타내는 MTT 분석을 보인다.

도 8C는 선택된 신경아교종 세포주 및 본 발명의 특정 6탄당 화합물의 감작을 나타내는 MTT 분석을 보인다.

도 9A는 여러 6탄당 화합물로 처리에 따른 신경아교종 세포 성장을 보인다.

도 9B는 2-DG로 처리에 따른 D54 세포 성장의 억제를 보인다.

도 9C는 2-FG로 처리에 따른 D54 세포 성장의 억제를 보인다.

도 10A 및 도 10B는 2-DG로 처리한 세포에 있어서의 저산소의 효과에 있어서의 상이점을 보인다.

도 11은 저산소 및 정상 산소 조건 하에서 인간 교모세포종 세포주의 락테이트 생산을 보인다.

도 12는 저산소 및 정상 산소 조건 하에서 신경아교종 세포주 성장 결과를 보인다.

도 13은 신경아교종 세포에서의 2-FG의 흡수를 설명한다.

도 14는 마우스의 신경아교종을 2-DG로 처리한 결과를 보인다.

도 15는 Colo357-FG 췌장암 세포에 대한 2-FM 활성을 보인다.

도 16은 U251 신경아교종 세포에 대한 2-할로-D-만노스 활성을 보인다.

도 17은 2-FM으로 성장시킨 U87 세포의 억제를 보인다.

도 18은 2-플루오로-만노스로 처리한 후 U87 신경아교종 세포 내에서의 자가 포식 현상의 유도 백분율을 나타내는 챠트를 보인다.

발명의 요약

그러므로, 암을 예방, 억제 및 조절하는 6탄당 화합물 및 그의 약학 조성물과, 암, 특히, 교모세포종 및 췌장암을 치료하기 위하여 화합물을 사용하는 것을 발견하였다. 본 발명은 암 및 암 매개 질환 및 질병을 치료하는데 유용한 6탄당 화합물의 용도를 개시한다. 교모세포종 및 췌장암의 치료 방법은 교모세포종 및 췌장암의 치료를 필요로 하는 환자에게 6탄당 화합물의 치료학적 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 종양 증식의 치료를 필요로 하는 환자에게 2-FM의 치료학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 종양 증식의 치료 방법이 특히 관심의 대상이다. 본 발명은 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 만노스 화합물을 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법을 포함한다.

상세한 설명

악성 신경아교종를 치료하는 방법은 상당히 제한되어 있다. 이것은 이용될 수 있는 많은 화학 치료 요법에 대한 세포 본연의 내성에 부분적으로 기인한다. 또한, 이것은 악성 신경아교종이 보이는 상이한 성장 패턴에 부분적으로 기인할 수도 있다. 즉, 신경아교종은 빠르게 성장하는 조영 증강 종괴성 병변 대비시 MRI 스캔에서 보이는 조영 증강이 거의 없이 주로 침윤 방식으로 증식할 수 있다. 많은 연구는 이들 상이한 타입의 성장 패턴도 개별 종양 내의 저산소 부위의 다양한 정도를 나타낸다는 것을 지적하여 왔다. 상대적 저산소 부위는 빠르게 증식하는 종양의 중앙 (이와 관련된 괴사 부위를 종종 가짐) 뿐 아니라 종양의 침윤 성분 내의 일부 상대적 저산소 부위 둘다에서 보여질 수 있다. 따라서, 이들 상대적 저산소 부위 중 일부는 느린 속도로 주기를 이루는 세포를 가질 수 있고, 따라서 많은 화학 치료 요법 제제에 더욱 내성일 수 있다. 또한, 많은 종양이 심지어 적정량의 산소의 존재 하에 해당 작용을 진행하는 것을 선호한다는 것 (산화성 해당 작용 또는 "바르부르크 효과"라 칭함)을 설명한 바르부르크 보고는 악성 신경아교종에 대하여도 사실인 것으로 보인다. 이러한 특징으로 인하여, 신경아교종을 비롯하여 췌장암과 같은 기타의 고 해당성 지속 종양은 해당 작용 억제제에 민감할 수 있고, 종양 증식에 상당한 영향을 미칠 수 있다고 우리는 가정하였다.

그러므로, 일반적으로는 뇌에, 특별하게는 신경아교종에 독특한 추가의 특징은 글루코스 전달체 발현의 증가인데, 이는 당이 CNS로 충분히 흡수되도록 한다. 이러한 특징으로 인하여 신경아교종은 해당 작용 억제제에 특히 민감한, 독특한 질병 상태를 나타내는 것으로 우리는 가정하였다. 이러한 가정을 시험하기 위하여, 우리는 저산소 및 정상 산소 (normoxic) 둘다의 조건하에서 생체 외의 수많은 신경아교종 세포주 패널에 대해 공지된 해당 작용 억제제를 사용하였다. 제제의 효과는 동소 신경아교종 이종 이식을 한 동물에 대하여 수많은 상이한 투여 계획으로 시험되었다.

심지어 산소의 존재하에 에너지 생산의 주요한 원으로서 해당 작용을 바람직하게 이용하여 ("바르부르크 효과") 고질의 (high-grade) 신경아교종에 의하여 대사를 변화시키는 것은, HIF-Ia 및 PI-3 키나아제 경로의 활성에 의하여 부분적으로 추진된다. 해당 작용의 효과적인 억제제, 2-데옥시글루코스는 에놀라아제 반응에 의한 2-데옥시글루코스-6-포스페이트의 변환을 차단하고, 하전된 포스페이트 기로 인한, 세포에 있어서 이들 종의 축적을 가져온다.

공지된 대사 방식의 변화는 세포에 필요한 에너지를 공급하기 위하여 해당 작용을 바람직하게 이용하는 신경아교종을 포함하는, 고질의 신생물 (neoplasm) 내에서 일어난다. 이들 변화는 해당 작용 뿐 아니라 글루코스 전달체의 상향 조절에 필요한 중대 효소의 생산을 유도하는 HIF-Ia 및 PI-3 키나아제 활성을 포함한 생존 경로에 의하여 추진된다. 이러한 해당 표현형은 주된 특성으로서, 이는 정상 산소 조건 하에서도 일반적이다. 이러한 표현형은 "바르부르크 효과"로서 인지되고 이전에 설명되었었다. 이러한 표현형의 변화로 인하여, 이들 종양은 정상 세포보다 해당 작용 억제제에 더 민감성을 보인다. 당 기재 글리콜리틱 억제제 및 기타 만노스 화합물 군은 치료 제제로서 사용될 수 있다. 원형의 당 기재 억제제 2-데옥시글루코스는 이러한 연구에 있어서 내성이 있으면서도 강력한 항신경아교종 효과를 가지는 것으로 보여져 왔다. 6탄당 화합물 단독이나 또는 세포 독성 화학 치료 요법과 조합으로 사용되는 것은 암, 특히, 신경아교종 및 췌장암 치료에 효과적이다. 또한, 이러한 해당 표현형이 종양 환경 내에서 저산소 조건에 의하여 초기에 추진되기 때문에, 이러한 타입의 치료 요법은 항혈관형성 치료 요법과 함께 고려되어야 한다. 사실상, "이탈성" 항혈관형성 치료 요법을 가능하게 하는 종양은 일반적으로 해당 작용 및/또는 6탄당 화합물의 억제제에 바람직하게는 더 민감성일 수 있다.

우리는 당 기재 6탄당 화합물이 고질의 신경아교종 종양 및 췌장암의 치료에 효과적이라는 것을 보아 왔다. 또한, 기타 억제제-타입의 화합물은 CNS로의 바람직한 흡수가 이루어지도록 하고, 2-DG가 현재 누리는 바람직한 경구 생체 이용률을 유지하도록 한다. 세포 독성 제제 및 항혈관형성 제제 둘다와 조합하여 사용되는 6탄당 화합물에 관하여 진행 중인 연구는 미래의 임상적인 병행 시도에 대한 우수한 리드 (lead)를 제공할 것이다.

6탄당 화합물은 탄소 원자 6개를 포함하는 임의의 단당 (monosaccharide)을 의미하고 포함한다. 6탄당의 한 분류 (class)에는 알도6탄당 과 (family)가 있는데, 이에는 예컨대 글루코스, 갈락토스, 및 만노스가 포함된다. 또한, 알도6탄당에는 2-데옥시글루코스, 푸코스, 시마로스, 및 람노스와 같은 다양한 데옥시당이 포함된다. 6탄당의 추가의 분류에는 프락토스 및 소르보스로 대표되는 케토6탄당 과가 있다. 본 발명의 6탄당는 일반적으로 자연 발생의 D-배열이지만, 6탄당는 또한 L-에난티오머일 수 있다. 본 발명의 6탄당에는 알파 아노머, 베타 아노머, 및 그 혼합물이 포함된다. 본 발명의 임의의 6탄당는 임의로 치환될 수 있다. 그러한 치환으로는 하이드록실기와, 플루오르, 염소, 또는 브롬과 같은 할로겐과의 대체가 있다. 본 발명에서, 치환은 6탄당의 C-2 탄소에서 전형적으로 이루어지고, 6탄당의 6원 고리 의자형 입체 형태 내의 6탄당의 축 방향 또는 수평 방향 위치 중 어느 하나에서 이루어질 수 있다. 축 방향의 C-2에서의 치환은 당을 만노스 유도체로서 또는 만노 배열의 당으로서 나타낸다. 수평 방향의 C-2에서의 치환은 당을 글루코스 유도체로서 또는 글루코 배열의 당으로서 나타낸다.

본 발명의 실시에 있어 유용한 6탄당 화합물로는, 본원에 참고로서 병합되어 있는, 미국 특허 제6,670,330호 및 미국 특허 출원 제20030181393호, 제20050043250호 및 제20060025351호에 개시된 화합물이 있다. 본 발명의 특정 구체 실시 상태에 있어서, 바람직한 화합물은 2-데옥시-글루코스 (2-DG), 2-데옥시-만노스 (2-DM), 2-플루오로-글루코스 (2-FG) 및 2-플루오로-만노스 (2-FM) 및 이와 유사한 것과 같은, 종양 증식의 당 기재 억제제이다.

"중추 신경계의 종양"은 뇌, 척수 또는 기타 중추 신경계 조직 내에서의, 양성 또는 악성 중 어느 하나인, 조직의 임의의 비정상 성장을 의미한다. 이것에는 특히, 털모양세포 별아교세포종, 저질 (low-grade) 별아교세포종, 역형성 별아교세포종 및 다형성 교모세포종 (GBM 또는 교모세포종)과 같은 신경아교종이 포함된다. "중추 신경계의 종양"에는 또한 뇌 줄기 신경아교종, 뇌실막세포종, 신경절신경종, 소아 털모양세포 신경아교종, 혼합 신경아교종, 희소돌기신경아교종 및 시각 신경 신경아교종과 같은, 기타 타입의 양성 또는 악성 신경아교종이 포함된다. "중추 신경계의 종양"에는 또한 척삭종, 두개인두종, 속질모세포종, 수막종, 송과선 종양, 뇌하수체샘종, 원시 신경외배엽 종양, 신경집종, 혈관 종양 및 심경섬유종증과 같은 비신경아교종이 포함된다. 마지막으로, 중추 신경계의 종양에는 또한 악성 세포가 몸의 기타 부분으로부터 중추 신경계로 퍼트리는 전이 종양이 포함된다.

본 발명에 따른, "치료하는", "치료" 또는 "완화"는 치료적 처리 및 예방적 조치 양자를 칭하는 것으로서, 여기서 목표는 중추 신경계 종양의 성장을 예방하거나 늦추는 것, 종양의 크기를 감소시키는 것 또는 그 전체를 제거하는 것이다. 치료를 필요로 하는 환자에는 중추 신경계의 확인된 종양을 가진 환자, 중추 신경계의 종양을 가지는 것으로 의심되는 환자 및 중추 신경계의 종양이 전개할 위험에 있는 것으로 확인된 환자가 포함된다. 만약 환자가 본 발명에 따른 6탄당 화합물의 치료학적 양을 받은 후, 다음의 증상 중 1개 이상이 관찰되는 때, 환자의 중추 신경계의 종양이 성공적으로 "치료된" 것이다: 종양 크기의 감소 또는 종양의 부재; 종양 성장의 억제 또는 정지; 종양 전이의 억제 또는 정지; 및/또는 이환율 및 사망율의 감소 또는 생활의 질적 향상과 같은 종양과 관련된 1개 이상의 증상이 어느 정도 구제되는 것.

6탄당 화합물이 존재하는 뇌종양 세포의 성장을 예방하고 및/또는 이를 사멸시키는 정도에 따라, 그들은 세포 증식 억제성 및/또는 세포 독성으로 간주될 수 있다.

"병용 투여하는" 또는 "병용 투여"의 용어는 치료제를 동시에 또는 순차적으로 투여하는 것을 포괄하는 것으로 의도된다. 예컨대, 병용 투여에는 단일 조성물 내의 해당 억제제 및 화학 치료 요법 제제 둘다를 투여하는 것이 포함될 수 있다. 다수의 조성물을 동시에 투여하는 것도 포함될 수 있다. 대안적으로, 병용 투여에는 동일한 기간 동안의 상이한 때에 그러한 다수개의 조성물을 투여하는 것도 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 6탄당 화합물에는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 신경아교종 또는 기타 뇌종양에서 산화성 해당 작용을 억제할 수 있는 화합물인 해당 억제제가 포함되고, 6탄당 화합물, 예컨대 2-데옥시글루코스, 2-플루오로-글루코스, 2-플루오로-만노스 및 이와 유사한 것이 포함될 수 있다.

본원의 앞쪽에서 정의한 항증식성 치료는 단일의 치료 요법으로서 적용될 수 있거나, 1종 이상의 본 발명의 화합물, 1종 이상의 기타 물질 및/또는 치료를 더 포함할 수 있다. 그러한 치료는 치료용 개별 성분을 동시에, 순차로 또는 분리하여 투여하는 것으로 달성될 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물은 공지의 항암성의 세포 독성 제제 및 방사선 치료 요법과 같은 치료와 조합시 유용할 수 있다. 만약 고정된 투여량으로 제형화되면, 그러한 조합 생성물에는 본원에서 설명하는 투여량 범위의 본 발명의 화합물 및 승인된 투여량 범위의 기타 약학적 활성 제제가 함유된다. 해당 억제제는 기타 항암성 또는 세포 독성 제제를 함유하는 화학 치료 요법의 일부로서 순차적으로 및/또는 수술 또는 방사선 치료 요법과 같은 비화학 치료 요법 치료와의 결합으로 이용될 수 있다.

화학 치료 요법 제제에는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 3개의 주요한 치료 제제 카테고리가 포함된다: (i) 항혈관형성 제제, 예컨대 리노미드, 인테그린 -알파-베타 3 기능의 억제제, 혈광 생성 억제 인자, 라즈옥산); (ii) 세포 증식 억제성 제제, 예컨대 항에스트로겐 (예컨대, 타목시펜, 토레미펜, 라록시펜, 드롤록시펜, 아이오독시펜), 프로제스테론 (예컨대 메제스트롤 아세테이트), 아로마타제 억제제 (예컨대 아나스트로졸, 레트로졸, 보라졸, 에제메스탄), 항호르몬, 항프로제스테론, 항안드로젠 (예컨대 플루타미드, 니루타미드, 비칼루타미드, 시프로테론 아세테이트), LHRH 작용제 및 길항제 (예컨대, 고세레라인 아세테이트, 류프로리드), 테스토스페론 5-알파-디하이드로리덕타제의 억제제 (예컨대, 피나스테리드), 파르네실트란스퍼라제 억제제, 항침투성 제제 (예컨대, 마리마스타트와 같은 금속 백질 분해 효소 억제제 및 우로키나아제 플라시노겐 활성체 수용체 기능의 억제제) 및 성장 인자 기능의 억제제, (그러한 성장 인자에는 예컨대, EGF, FGF, 성장 인자 유래 혈소판 및 간세포 성장 인자가 포함되고, 그러한 억제제에는 성장 인자 항체, 성장 인자 수용체 항체 예컨대 아베스틴. (bevacizumab) 및 에르비투스. (cetuximab); 티로신 키나아제 억제제 및 세린/트레오닌 키나아제 억제제가 포함된다); 및 (iii) 의학 종양학에서 사용되는 항증식성/항종양성 약물 및 그 조합, 예컨대 항대사물질 (예컨대 메토트레제이트와 같은 항폴산염, 5-플루오로우라실과 같은 플루오로피리미딘, 퓨린 및 아데노신 유사체, 시토신 아라비노시드); 사이 항종양 항생제 (예컨대 독소루비신, 다우노마이신, 에피루비신 및 이다루비신과 같은 안트라시클린, 미토마이신-C, 닥티노마이신, 미트라마이신); 백금 유도체 (예컨대 시스플라틴, 카르보플라틴); 알킬화 제제 (예컨대 질소 머스타드, 멜파란, 클로라부실, 부술판, 시클로포스파미드, 이포스파미드 니트로소우레아, 티오테파; 항유사분열 제제 (예컨대 비크리스틴과 같은 빈카 알카로이드 및 타졸 (파클리타졸)과 같은 타조이드, 타조테르 (도세탁셀) 및 에포티론 유사체, 디스코데르모리드 유사체, 및 일레테로빈 유사체와 같은 더 새로운 미세관 제제); 국소 이성화효소 억제제 (예컨대 에토포시드 및 테니포시드와 같은 에피포도필로톡신, 암사크린, 토포테칸); 세포 주기 억제제; 생물학적 반응 개질제 및 벨케이드 (보르테조밉)와 같은 프로테아좀 억제제.

당해 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자, 즉 당업자는 본 발명에 개시된 치료 방법이 6탄당 화합물을 투여하는 다중 경로에 의하여 및 6탄당 화합물의 다양한 양/농도로 달성될 수 있음을 잘 인지할 것이다. 바람직한 투여 경로는 이용되는 6탄당 화합물에 따라 다를 수 있고, 그러한 경로에는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 경구, 구강, 근육 내 (Lm.), 정맥 내 (i.v.), 비경구 내 (i.p.), 국소, 또는 FDA에 의하여 허가된 기타의 임의의 투여 경로가 있다. 투여되거나 치료효과를 보이는 농도는 치료되는 환자 및 투여되는 6탄당 화합물에 따라 다를 것이다. 특정 구체 실시 상태에서, 6탄당 화합물의 농도는 체중 킬로그램 당 1 mg 내지 50 mg의 범위 내이다.

일련의 2-플루오로, 2-브로모, 및 2-클로로- 치환 글루코스 유사체를 초기에 제조하고, 이들은 해당 작용 경로에서 글루코스에 가능한 경쟁 기질로서 분석되며, 그러한 유사체는 2-데옥시-글루코스 (2-DG)와 유사한 방식으로 해당 억제제로서 작용해야 한다. 우리는 2-플루오로-D-만노스가 효과적인 항종양 제제라는 것을 발견하였는데, 이는 그 성질이 플루오르 원자 및 수소의 크기가 유사하다는 것을 고려할 때 2- 플루오로-D-만노스 (본원에서는 "2-FM"으로도 칭함)가 2-데옥시-D-글루코스 (2-데옥시- D-만노스와 같음)와 유사하다는 사실로부터 유래된 것일 수 있거나 또는 그것이 유도 효과 및 수소 결합 형성 가능성의 측면에서 수소보다 만노스의 하이드록실기를 더 닮아 D- 만노스에 유사할 수 있기 때문이다. 후자의 상황에서, 2-플루오로-D-만노스는 D-만노스 관련 생물학적 기능, 대사 및 생물학적 프로세스에 영향을 미칠 수 있다. 또한, D-글루코스 및 D-만노스 둘다에 영향을 미칠 수 있는 효과의 조합은 세포 프로세스와 관련된다.

사실상, 도 15 내지 도 18에 제공된 자료는 2-플루오로-D-만노스가 2-DG 보다 더 강력하고, 췌장 Colo357- FG 세포 내에서의 2-플루오로-D-글루코스의 활성보다 더 우수하거나 유사한 활성을 가진다는 것을 보인다. 또한, 2-플루오로-D-만노스 (2-FM)를 기타의 2-데옥시-D-만노스 유사체, 즉 2-클로로-D-만노스 (2-CM) 및 2-브로모-D-만노스 (2-BM)와 대비하였다. 놀랍게도, 2-플루오로-만노스가 이러한 시리즈에서 다른 것들보다 더 강력하다는 예견되지 않은 사실이 확인되었다. 특히, 자료는 2-플루오로-D- 만노스 (2-FM)가 U251 교모세포종 뇌종양 세포의 성장을 억제하는 데 있어 브로모 (2-BM) 및 클로로 (2-CM) 유사체 양자보다 명백히 우수하다는 것을 보인다. 또한, 2-FM은 U87 교모세포종 세포에 대하여 저산소 보다 정상 산소 하에서 놀랍도록 우수한 활성을 보였다 (도 17). 또한, 예견이 불가능했던 2-FM의 1 이상의 작용 모드는 2-FM이 종양 뇌 세포 내에서 자가 포식 현상을 강력하게 유도하는 능력을 보이는 것이고, 따라서 종양 세포주에 대한 그 작용 메카니즘에 대한 1 이상의 설명을 제공한다.

바로 아래에서 보이는 바와 같이, 2-데옥시 글루코스 (2-DG)는 당의 C-2 위치에 수소 2개를 가진다. 당의 6원 고리 의자형 입체 형태에서, 이들 2개의 수소는 축 방향 및 수평 방향 위치에 위치한다.

본질적으로, 2-플루오로만노스 (2-FM)는 2-데옥시글루코스 (2 데옥시만노스와 같은 것임) 내의 축 방향 수소를 플루오르로 대체한다. 플루오르는 일반적으로 수소와 등전자성으로 간주된다. 따라서, 어떠한 관점에서, 2-FM의 화학은 2-DG와 유사하다. 사실상, 2-FM은 등전자성 논쟁에 기초한 해당 억제 활성을 보여야 한다. 그러나, 플루오르는 수소보다 실질적으로 더 전기음성적이고, 그 결과로 수소 결합 모티프에 관여할 수 있다. 이러한 관점에서, 2-FM은 만노스에 더 근접하게 행동하여야 하고, 따라서, 2-FM은 고 만노스 올리고당의 합성에 있어 N-결합 글리코지질/단백질 경로를 붕괴시켜야 한다.

요약하면, 2-FM은 종양 세포에 대한 놀라울 정도로 우수한 증식 효과를 보이고, 2-데옥시-D-글루코스 (본원에서 "2-DG"로도 칭함) 및 2-데옥시-2-플루오로-D-글루코스 (본원에서 "2-FG"로도 칭함) 보다 더 강력해 보인다. 아래에서 논의하는 바와 같이, 화합물 2-FM은 231-GFP 유방암, U251 다형성 교모세포종 뇌종양 (도 16) 및 Colo357-FG 췌장 인간 암 세포주 (도 15)에서 특히 시험되었다. U251 및 Colo357-FG 세포에서, 2-FM을 2-DG, 2-FG, 2-데옥시- 2클로로-D-만노스 (본원에서는 때때로 "2-CM"으로 칭함), 2-데옥시-2-브로모-만노스 (본원에서는 "2-BM"으로도 칭함), 2-데옥시-클로로-D-글루코스 (본원에서는 "2-CG"로도 칭함) 및 2-데옥시-2-브롬-D- 글루코스 (본원에서는 "2-BG"로도 칭함)과 직접 대비하였다. 교모세포종 (도 16, 17 및 18) 및 췌장암 (도 15) 둘다에서, 2-FM은 이들 대비 제제 중 가장 강력한 제제였고, 관찰된 차이는 2-FM과 그 클로로 및 브로모 유도체간에 특히 컸다. 차이는 또한 2-DG과 대비시 유의적이었다. 그러므로, 자료는 2-FM이 종양 세포 증식을 억제하는 데 있어 2-DG 및 2-FG와는 구별되게 작용할 수 있다는 것을 보인다. 또한, 자료는 2-FM이 암, 특히 뇌종양 및 췌장 종양에 관한 항종양 치료에 매우 효과적일 수 있다는 것을 보인다.

특히, 도 15는 Colo357 세포주의 MTT 분석을 통한 세포 생존율 (viability)의 투여량 반응 곡선이 2-데옥시-글루코스 (2-DG), 2-플루오로-글루코스 (2-FG) 또는 2-플루오로-만노스 (2-FM)와의 처리 중 어느 하나에 반응한다는 것을 보인다. 여기서 볼 수 있는 바와 같이, 투여량 반응 곡선의 왼쪽으로의 변화는 2-FM이 2-DG 또는 2-FG 중 어느 하나보다 더 강력하다는 것을 보인다. 도 16은 만노스의 2-위치에 있는 할로겐의 성질이 활성에 영향을 미치는 중요한 요소라는 것을 설명한다. 신경아교종 세포주 U251 MG를 2-클로로- 만노스 (2-CM), 2-브로모-만노스 (2-BM), 또는 2-플루오로-만노스 (2-FM) 중 어느 하나로 처리하였다. 다시 세포 생존율을 MTT 분석으로 측정하였는데, 결과는 2-FM의 활성이 기타 할로겐 기재 유사체와 대비시 더 우수하다는 것을 분명히 보인다. 도 17은 저산소 (<1% 산소) 또는 정상 산소 (20% 산소)의 존재 하에서 2-플루오로-만노스 (2-FM)로 처리한 U87 세포주의 MTT 분석을 보인다. 여기서 볼 수 있는 바와 같이, 자료는 U87 세포주 내의 이 제제의 비정상적인 상황이 저산소 존재하에서 더 민감하지 않다는 것을 보인다. 이것은 잠재적으로 2-FM에 대한 대안적인 작용 메카니즘이 세포 사멸 효과의 원인일 수 있다는 것을 나타낸다.

도 18은 2-플루오로-만노스 (2-FM)의 독특하면서도 이전에는 확인되지 않은 메카니즘을 설명한다. U87 MG 신경아교종 세포주에서, 2-FM은 자가 포식 현상을 통한 세포 사멸을 유도한다. 도식적으로 나타낸 것은 아크리딘 오렌지 염색에 의한 Acidic Vesicular Organelles (AVO)의 흐름 세포 측정 분석의 결과로서 (공정 참조), 이는 자가 포식 프로세스에 특이하고도 특징적인 것이다. 결과는 2-FM의 노출 투여량을 증가시키는 것에 따라 자가 포식 현상을 진행하는 세포 백분율이 증가하는 것을 나타낸다. 자가 포식 현상의 이 정도의 유도는 인상적인데, 이는 단지 40시간의 노출 시간이 이러한 효과를 일으키는데 상당히 짧기 때문이다.

2-DG는 느리게 성장하는 저산소 종양 세포, 고형 종양에서 발견되는 내성이 가장 큰 세포 집단을 사멸시키는 해당 억제제의 첨가가 빠르게 분할하는 정상 산소 세포를 표적으로 하는 표준 화학 치료 요법의 치료 효능을 증강시키는 정도를 평가하기 위한 임상 실험에서 현재 투여되고 있다. 본 발명은 심지어 산소의 존재 하에, 특정 종양 세포주가 2-데옥시-2-플루오로-D-글루코스 (2-FG)가 아닌 2-DG 또는 2-FM이 투여될 때 사멸된다는 발견으로부터 부분적으로 출발되었다. 2-FG 및 2-DG 둘다 해당 작용을 억제하기 때문에, 해당 작용의 차단이 아닌 다른 메카니즘이 이 효과의 원인인 것으로 추정된다.

1970년대에 행하여진 연구는 2-DG 및 2-FM이 바이러스성 외피 글리코단백질의 N-결합 당화 (glycosylation)를 방해하고, 이는 만노스의 첨가에 의하여 역행될 수 있다는 보고로 이어졌다. 만노스와 글로코스 간의 차이는 2-탄소 위치에서의 수소의 기원에 있기 때문에, 그리고 2-DG는 만노스 및 글루코스 둘다에서의 마찬가지로, 2-위치 (수소 및 하이드록실기 대신)에 2개의 수소를 가지기 때문에, 2-DG는 만노스 또는 글루코스 유사체로서 보여질 수 있다. 따라서, 2-DG는 해당 작용 및 당화 둘다에 작용할 수 있다.

본 발명은 세포가 저산소 또는 정상 산소 환경에 있는지 여부와는 상관 없이, 6탄당 유도체를 단독으로 사용하거나 또는 기타 항종양 처리, 이에 한정되는 것은 아니지만, 예컨대 정상 산소 세포를 표적으로 하는 세포 독성 제제, 항혈관형성 제제, 방사선 치료 요법, 및 수술과 조합시켜 사용하여 종양 세포 증식을 억제하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 특정 종양 타입에 있어서, 정상 산소 (당화 방해에 의하여) 및 모든 저산소 (해당 작용 차단에 의하여) 암 세포 집단 둘다를 표적으로 할 수 있는 세포 독성 제제로서, 2-DG, 2-CM, 및 2-FM와 같은 유사체의 임상적인 사용에 대한 기초를 제공한다.

아래의 예는 본 발명의 효과를 확인시키고 2-DG, 2-CM, 및 2-FM (2-FG는 아님)가 정상 산소 하에서 성장하는 선택 종양 세포 타입에 독성이라는 것을 확인시키는 자료를 제공한다. 예로 설명되는 실험의 일부는 해당 작용의 억제에 반대되는 당화 방해가 정상 산소 효과의 원인이 되는 메카니즘인지 여부를 결정하도록 되어 있었다. 이론에 구애되지 않고, 얻어진 결과는 이들 화합물이 당화를 억제하고 그에 따라 특정 암세포가 저산소 환경 내에 있는지와는 무관하게 그 암세포 타입을 사멸시키는 것을 뒷받침한다.

결과는 2-FM, 2-DG 및 2-CM (2-FG는 아님)가 지질-결합 올리고당 사슬의 회합을 붕괴시키고, 전개된 단백질 반응 (UPR)을 유도하며, 이는 글리코단백질 합성 방해의 지표일 수 있다는 결론을 역시 뒷받침한다. 또한, UPR은 내성 세포가 아닌 민감성 세포에서의 UPR-특정 아포토시스 신호의 활성을 유도한다

정상 산소 조건 하에서 2DG, 2-FM, 및 2-CM에 민감성인 종양 세포 타입이 확인되었다. 세포를 종양으로부터 분리하고, 생체 외에서 실험하여 세포가 정상 산소 조건 하에서 2- DG, 2-CM, 또는 2-FM에 민감성인지 여부를 결정한다. 이하의 예는 세포가 민감성인지 여부를 결정하는 방법을 설명한다. 기타의 구체 실시 상태에서, 2-DG 민감성 및 내성 세포 쌍에 밀접하게 관련된 분자 서명 (molecular signiture)은 시험 세포주에 대비된다. 당화에 포함되는 포스포만노스 이성질화 효소 및 기타 효소와, 2-DG 축적에 포함되는 효소의 수치 및/또는 활성에 있어서의 차이가 설명된다.

산소 (정상 산소 조건) 존재 하에, 2-DG는 종양 세포주의 환자에게 독성이다. 이러한 결과는 놀라운 것이었는데, 이는 이전의 연구가 종양 및 정상 세포는 정상 산소 하에서 2-DG로 처리시 사멸되는 것이 아니라 성장이 억제된다고 설명하였기 때문이다. 성장 억제에 관한 이러한 이전의 관찰은 정상 산소 하에서 세포 내의 해당 작용을 차단하기에 충분히 높은 수치까지 2-DG가 축적되는 것에 기인하고, 그래서 세포 증식에 포함되는 다양한 동화 프로세스에서 사용되는 해당 경로의 중간체 수치에 있어서의 감소로 인하여 성장이 감소된다고 여겨졌다. 그러나, 만약 미토콘드리아의 기능이 정상이라면 그때에는 호기성 처리 세포가 2-DG에 의한 해당 작용의 차단을 견딜 수 있기 때문에 세포가 사멸되지 않는다. 그러므로, 세포가 정상 산소 하에서 2-DG에 민감성일 수 있는 이유에 대하여 가능한 한가지 설명은 세포가 결함이 있는 미토콘드리아를 가지는 것이다. 이러한 관점에서, 종양 세포가 결함이 있는 미토콘드리아 호흡에 기인한 산화성 인산화 대신 에너지 (ATP) 생산을 위한 현기성 해당 작용을 통하여 글루코스를 이용한다는 것은 알려져 있다. 그러나, 추가 실험은 해당 작용의 기타 억제제, 예컨대 옥사메이트 및 2-FG가 이들 세포에 비독성이고 그래서 미토콘드리아 호흡에 있어서의 결함은 2-DG에 대한 그 민감도를 용이하게 설명하지 못한다는 것을 보여 왔다. 그러므로, 해당 작용의 차단이 아닌 기타 메카니즘이 정상 산소 조건 하에서 이들 선택 세포주 내의 2-DG 독성의 원인인 것으로 가정되었다.

따라서, 기타 가설은 이러한 정상 산소 세포 독성의 메카니즘을 설명할 수 있다. 한가지 가능성 있는 메카니즘은 당화의 방해이다. 이러한 가능성 있는 메카니즘의 뒷받침은 특정 바이러스에 있어, N-결합 글리코단백질 합성이 2-DG를 포함하는 수많은 당 유사체에 의하여 억제된다는 것을 보고한 1970년대 후반의 일련의 논문에서 확인될 수 있다.

글루코스는 3개의 주요한 경로에 의하여 대사된다: 해당 작용, 펜토스 포스페이트 연결 통로 및 당화. 도 7은 해당 작용 및 당화 대사 경로의 도식 다이아그램이다. 글루코스가 세포질에 들어간 후, 헥소키나아제는 글루코스의 탄소 6을 인산화시키고, 그 결과 글루코스- 6-포스페이트 (G6P)가 합성된다. 만약 G6P가 포스포글루코스 이성질화 효소 (PGI)에 의하여 프락토스-6-포스페이트로 전환된다면, 그것은 해당 작용 경로에 대하여도 계속될 것이고, ATP 및 피루브산염을 생산할 수 있다. 대안적으로, G6P는 또한 만노스를 포함하는 다양한 당 부분의 합성에 사용될 수 있는데, 이는 지질-결합 올리고당의 회합, ER 내에서 수행되는 합성에서 요구된다. 2DG는 3개의 대사 경로 중 2개를 방해하는 것으로 보여졌고: 그것은 PGI를 억제함으로써 해당 작용을 차단할 수 있거나 또는 그것은 N-아세틸글루코사민 잔기로의 구아노신 디포스페이트 (GDP) 돌리콜 포스페이트 결합 만노스의 전달을 방해함으로써 N-결합 올리고당 전구체의 회합을 붕괴시킬 수 있고, 세포질로부터 ER의 루멘으로 만노스를 전달하는데 필요한 돌리콜-P를 고갈시킬 수 있다.

위에서 알린 바와 같이, 2-DG는 탄소 2의 2개의 위치에 수소를 가지기 때문에 만노스 유사체와 유사하다. 반면, 플루오로 유사체 내의 이 위치의 불소의 존재는 새로운 에나티오머 중심을 만들고 따라서 플로오로 유도체는 단지 글루코스 또는 만노스 중 어느 하나의 유사체인 것으로 고려될 뿐일 수 있고; 이들 유사체를 묘사함에 있어서 불소 부분은 만노스 유사체에 대하여는 탄수화물 고리의 평면의 위로 그려지고 글루코스 유사체에 대하여는 아래로 그려진다.

지질-결합 올리고당 사슬에 첨가되는 만노스에 있어서, 그것은 구아노신 디포스페이트 (GDP) 또는 돌리콜 포스페이트로 전달됨으로써 우선 활성화되어야 한다. 2-DG는 2-DG- GDP로의 전환을 진행하고, 이는 지질-결합 올리고당의 회합 동안 N-아세틸글루코사민 잔기에 만노스를 첨가하는 데 있어 만노스-GDP와 경쟁한다. 따라서, 2-DG 처리 결과로서 얻어지는 변위 (aberrant) 올리고당은 과학 문헌에서 보고되는 실험에서 바이러스성 글리코단백질의 합성을 감소시키는 결과를 가져 왔다. 이들 실험에 있어, 2-DG의 억제 효과는 글루코스가 첨가되는 때가 아닌 외래성 (exogenous) 만노스의 첨가로 역행되었고, 또한 2-DG가 만노스 유사체와 다소 유사하다는 것이 확인되었다. 이들 조사자들은 또한 다른 만노스 유사체, 2-플루오로-만노스 (2-FM)가 만노스에 의하여 역시 역행되는 2-DG와 유사한 효과를 가지는 것을 보여주었고, 이들 유사체의 만노스 배열이 당화 방해에 중요할 수 있다는 것을 나타내었다.

또한, 유전자 연구는 당화의 붕괴가 심한 생물학적 효과를 가질 수 있음을 보였다. 효소 포스포만노스 이성질화 효소 (PMI)는 탄수화물 결함 글리코단백질 신드롬 타입 Ib를 앓고 있는 환자에게는 없다. 이러한 효소의 부재는 혈청 글리코-단백질의 저당화를 초래하고, 이는 단백질-소실 창자병증으로 특징지워지는 혈전증 및 위창자 질환을 유도한다. 이들 환자의 식이에 외래성 만노스를 첨가할 때, 그 증상은 사라지고, 그 혈청 글리코단백질은 정상으로 돌아오며, 및 그들은 질병으로부터 회복되었다. 실험 자료가 정상 산소 수치의 존재 하에서 2-DG로 처리될 때 사멸되는 선택된 종양 세포를 외래성 만노스가 구조할 수 있다는 것을 보여주듯이, 상기 관찰은 본 발명에서 유용한 화합물에 대한 작용 메카니즘과 일치한다. 이들 특정 종양 세포가 하향 조절 PMI이거나 이 효소 내에 결함이 있을 수 있다. 반면, N-결합 당화에 필수적인 만노스 중간체를 생산하는 효소는 이들 세포 내에서 상향 조절될 수 있고, 그 결과로 만노스-GDP에 대한 더 높은 2- DG-GDP 비율을 초래하며, 그에 의해 정상 산소 조건 하에서 2-DG에 대한 비정상적인 민감도를 가져올 수 있다.

메카니즘과는 상관 없이, 본 발명은 심지어 정상 산소 조건 하에서 종양을 치료하는 단일 제제로서 2-DG 및 기타 글루코스 및 만노스 유사체를 투여함으로써 암을 치료하는 방법을 제공한다. 화합물은 인간 유방 (SKBR3), 비소세포 폐 (NSCLC), 신경아교종, 췌장 및 골육종 암 세포주를 포함하는 수많은 종양 세포주에 대하여 효과적인 것으로 설명되고, 이들 모두는 상대적으로 낮은 투여량의 2-DG로 치료시 세포 사멸을 진행한다.

도 3B는 정상 산소 조건 하에서 지정된 투여량의 2-DG, 2-FM 및 기타 제제로 72 시간 동안 처리한 SKBR3 세포의 반응을 보이는 차트이다. 세포 독성을 트립판 청색 배제 (trypan blue exclusion)로 측정하였다. 결과는 2-DG 및 만노스 유사체 2-FM가 독성인 반면, 2-FG, 글루코스 유사체는 아님을 보인다. 또한, 옥사메이트, 락트산 탈수소효소 수치에서 해당 작용을 차단하는 피부르산염 유사체는 정상 산소 조건 하에서 성장하는 이들 세포에 역시 비독성이다. 반면, 만노스 유사체, 2-FM은 또한 이들 세포 내에서 독성이고, 이 활성을 가지는 화합물에 있어 만노스 골격이 중요하다는 것을 다시 지적하는 것으로 입증되었다.

2-DG의 억제 효과는 글루코스가 첨가될 때가 아니라 외래성 만노스가 첨가될 때 역행되었고, 또한 2-DG가 만노스 유도체로서 작용한다는 것을 확인시켜 주었다. 기타 시험은 2- DG가 정상 산소 조건 하에서 성장하는 NSCLC에도 독성이고, 1 mM 만노스의 첨가가 이 독성을 역행시킨다는 것을 보였다.

또한, 이 자료는 2-DG 및 2-FM이 당화 방해로 인하여 정상 산소 조건 하에서 성장하는 선택 종양 세포에 독성이라는 것을 뒷받침한다. 이들 만노스 유사체가 해당 작용을 차단하는 것에 의해서가 아니라 이 메카니즘으로 작용한다는 것의 추가 증거는, 전개된 단백질 반응 단백질, GRP 78 및 94, 잘못 겹쳐지고 잘못 당화된 단백질의 지표가 2-FG에 의해서가 아니라 2-DG 및 2-FM에 의하여 투여량 의존 방식으로 상향 조절되고; 이 효과는 만노스 첨가에 의하여 용이하게 역행된다는 것이다.

따라서, 만노스 유사체 2-DG 및 2-FM (글루코스 유사체 2-FG는 아님)은 정상 산소 하에서 성장하는 선택 종양 세포 타입에 독성이고, 만노스의 첨가가 이 독성을 역행시킨다. 2- FG는 2-DG보다 해당 작용을 더 잘 억제하기 때문에, 해당 작용의 억제가 아닌 당화의 방해가 이 효과의 원인인 것으로 믿어지는 메카니즘이다. 위에서 언급한 바와 같이, 2-DG는 바이러스성 외피 단백질의 N-결합 당화를 방해하고, 외래성적으로 첨가된 만노스가 효과를 역행시키는 것으로 보고되어 왔다. 그러므로, 정상 산소 하에서 SKBR3, NSCLC 및 2개의 기타 인간 종양 세포주에 대한 2-DG의 독성 효과는 당화를 방해하는 것에 기인하는 것으로 보인다. 만약 이러한 메카니즘적 이론이 맞다면, 만노스의 첨가는 이들 세포주 내에서 2DG 독성을 역행시켜야 한다. 사실상, 1 mM의 만노스는 시험된 세포주 (NSCLC) 중 1개에서의 6 mM의 2DG의 독성 효과를 역행시킨다.

만노스의 혈액 수치가 50 내지 60 micro g/ml의 범위로 알려져 있기 때문에, 2-DG 독성을 역행시키는 데 필수적인 최소 만노스를 결정하기 위한 투여량 반응 실험이 수행될 수 있다. 예컨대, 이것은 성장 배지에 투석된 소 태아 혈청 (FBS)이 보충되는 실험에 의하여 달성될 수 있는데, 이는 FBS가 일반적으로 만노스 잔여량을 함유하기 때문이다. 또한, 기타 당이 아닌 만노스를 첨가하는 것이 2-DG 독성을 역행시키는 데에 필요하다는 것을 확인하기 위하여, 글리코단백질 합성에 관여하는 것으로 알려진 당, 즉 글루코스, 푸코스, 갈락토스, 및 유사체의 2-DG 독성을 역행시키는 능력을 시험할 수 있다. 만약 이들 당 중 어떠한 것이라도 유사하게 독성을 역행시킬 수 있다면, 그때에는 그 활성을 UPR 유도 및 그 예후, 올리고당 사슬 연장의 방해 및 콘코나발린 A의 결합에 있어 2-DG의 효과를 역행시키는 데에 아래에서 설명하는 실험에서의 만노스의 그것과 비교할 수 있다. 전체적으로, 이들 실험은 생리적 농도의 만노스의 존재 하에 항종양 활성을 내도록 생체 내에서 사용될 수 있는 2-DG 또는 2-FM의 생체 외 투여량을 평가하도록 한다. 그러나, 본 발명의 방법에서 사용되는 2-DG, 2-FM, 및 2-CM의 치료 효과적인 경구 투여량은, 전형적으로 환자 무게의 5 - 500 mg/kg, 예컨대 50 - 250 mg/kg의 범위 내일 것이다. 하나의 구체 실시 상태에서, 투여량은 환자 무게의 약 100 mg/kg이다.

또한, 본 발명은 의사가 종양 또는 기타 암이 현재의 치료 방법에 감수성 (susceptible)이 있는 세포를 포함하는지 여부를 결정하는데 사용할 수 있는 수많은 진단 방법을 제공한다. 하나의 구체 실시 상태에서, 종양으로부터의 세포가 2-DG, 2 -FM, 또는 2-CM에 의하여 사멸되는지 여부를 결정하기 위하여, 세포를 정상 산소 조건 하에서 시험한다. 또 하나의 구체 실시 상태에서, 이 시험을 수행하고; 그 후, 만노스를 첨가하여 그것이 세포 독성 효과를 역행시키는지 여부를 결정한다.

또 하나의 구체 실시 상태에서, 감수성에 대한 시험은 지표로서 N-결합 당화를 사용하여 수행한다. 위에서 알린 바와 같이, 2-DG 및 2-FM (2-FG는 아님)는 지질 결합 올리고당 사슬의 회합을 붕괴시키고, (2) 전개된 단백질 반응 (UPR)을 유도하는데, 이는 정상 글리코단백질 합성 방해의 지표이며, 및 (3) 2-DG 민감성 세포 (내성 세포는 아님) 내의 UPR-특정 아포토시스 신호를 활성화시킨다. 또한, 만노스는 이들 효과를 역행시킨다. 따라서, 이들 동일한 시험을 관심의 대상이 되는 종양 또는 암 세포에 수행하여 세포가 본 방법으로 처리에 감수성이 있는지 여부를 결정한다.

위에서 알린 바와 같이, 만노스의 지질-결합 올리고당 사슬로의 병합은 바이러스 오염 세포 내의 ER의 세포질 표면에서 발생하고, 이러한 병합은 2-DG 또는 2-FM의 GDP 유도체, 즉 GDP-2DG 및 GDP-2-FM에 의하여 억제될 수 있다. 일반적으로, 제5 만노스가 가하여진 후, 지질-결합 올리고당 사슬을 ER의 루멘에 면하도록 (face) 플립(flip)시킨다. 성장하는 사슬에의 만노스의 첨가를 계속하기 위하여, 돌리콜-포스페이트 (DoI-P)를 세포질로부터 ER 기질로 만노스를 운반하는 운반체로서 사용한다. 2-DG-GDP는 돌리콜에의 결합에 있어 만노스-GDP와 경쟁하고, 또한 그에 의하여 N-결합 당화를 방해한다. 또한, 돌리콜-결합 2-DG는 ER 내의 올리고당 사슬에 만노스를 전달시키는데에 있어 경쟁한다. 따라서, 실험은 2-DG 민감성 세포주 및 내성 세포주의 둘다에 있어 지질 결합 올리고당 전구체 및 만노스 유도체, 즉 만노스-6-포스페이트, 만노스- 1 -포스페이트, GDP-만노스 및 Dol-P-만노스를 형성시키는데 대한 2-DG 및 2-FM의 효과를 설명하도록 수행될 수 있다. 이것은 차례로 2-DG 및 2-FM에 의하여 억제되는 올리고당 회합 내의 단계를 설명한다. 이것은 차례로 2-DG, 2-FM, 및/또는 2-CM에의 노출에 따라 생산되는 (및 생산되지 않는) 올리고당에 기초한 민감성 또는 내성과 같은 기타 세포 타입을 특징지우도록 한다.

이전에 수립된 크로마토그래피 방법은 SKBR3 및 NSCLC 세포 내에서의 만노스 유도체 및 지질-결합 올리고당 전구체를 모아 이를 측정하는 데 사용할 수 있다. 간단히 말하면, 세포를 [2-H³] 만노스로 표지화시키고, 세포 용해질을 각각 클로로포름/메탄올 (3:2) 및 클로로포름/메탄올/물 (10: 10:3)로 추출하여 Dol-P-Man 및 지질 결합 올리고당을 각각 얻는다.

Dol-P-Man을 함유하는 일정 부분을 얇은 막 크로마토그래피에 이용되도록 하는 반면, 지질 결합 올리고당을 HPLC로 분리시킬 수 있다. 용출 분획을 액체 섬광 계수로 분석할 수 있다. 만노스 포스페이트 및 GDP-만노스를 하강 종이 크로마토그래피로 분리할 수 있고, 경산 (mild acid) 가수분해에 의한 각각의 분획으로부터 d얻어진 [2-H³] 만노스를 측정할 수 있다. 2-DG 또는 2-FM으로 처리한 세포로부터 유래된 수치를 미처리 대조군과 비교하여 N-결합 올리고당 전구체 및 만노스 유도체에 대한 이들 약물의 효과를 설명할 수 있다. 외래성 만노스가 2- DG 독성을 역행시키기 때문에, 만노스가 관찰되는 2-DG 당화 방해도 역행시키는지 여부를 시험할 수 있다.

2-DG 및 2-FM에 더하여, 2개의 기타 당화 억제제, 튜니카마이신 및 데옥시만노지리마이신 (DMJ), 이는 N-결합 당화의 특정 단계를 억제할 수 있고, 이는 양성 제어로서 이용될 수 있다. 튜니카마이신은 돌리톨 파이로포스페이트에 제1 N-아세틸글루코사민 잔기를 첨가하는 것을 방해하고, DMJ은 N-결합 올리고당 사슬의 말단에 3 만노스 잔기를 마름질 (trimming)하는 만노시다제 I의 특정 억제제이다. 따라서, 외래성 만노스는 이들 제제의 당화에 대한 독성 또는 효과 중 어느 하나를 역행시킬 수 있어서는 안된다. 또한, 글루코스 유사체 2-FG는 정상 산소 하에서 SKBR3 및 NSCLC 세포를 사멸시키지 않지만, 해당 작용을 차단하고 저산소 세포를 사멸시키는 점에서 2-DG보다 더 강력하기 때문에, 당화에 영향을 미치지 않은 채로 해당 작용을 방해할 수 있고 따라서 그런 시험의 도구로서 사용될 수도 있다.

소포체 (ER) 내에서의 N-결합 당화 프로세스를 방해하는 것은 글리코단백질의 부적절한 접힘의 원인이 되고, 이는 전개된 단백질 반응 (UPR)이라 불리는 ER 스트레스 반응을 이끌어낸다. DNA 손상에 대한 P53 반응의 회상시, ER은 (1) 잔류성 차프론 (GRP 78 및 GRP 94) 유도를 통한 접는 능력의 증강, (2) 단백질 합성의 차단에 의한 그 자신의 생합성 로드의 감소, 및 (3) 전개된 단백질의 붕괴의 증강에 의한 것과 거의 동일한 방식으로 스트레스에 응수한다. 만약 스트레스가 완화될 수 없다면, 아포토시스 경로는 개시되고 후속적으로 세포는 사멸한다. 따라서, 당화 방해의 측정은 UPR의 상향 조절이다.

SKBR3 세포를 2-DG로 처리할 때, ER 스트레스 반응 단백질, GRP 78 및 94 둘다는 투여량을 증가시키는 기능을 증진시키고; 만노스는 이러한 유도를 역행시킨다. 2-FG는 이들 단백질을 유도하지 않는다. 따라서, 본 발명의 또 하나의 구체 실시 상태에서, 이 반응은 종양 또는 암 세포가 본 방법에 따른 처리에 감수성이 있는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다. 정상 산소 조건 하에서 2-DG에 민감성이지 않은 세포주는 이들 단백질의 상향 조절의 부재가 2-DG에 대한 그 내성과 관련이 있는 음성 제어로서 유사하게 사용될 수 있다.

ER 스트레스가 해소될 수 없을 때, 아포토시스 신호는 개시된다. ER 스트레스는 CHOP/GADD153을 경유하는 미토콘드리아 의존성 아포토시스 경로, BCL-2를 하향 조절하는 핵 전사 요소, 및 인간 세포주에 있어서의 캐스페이스 4 및 5 및 마우스 세포주에 있어서의 카스파제 12에 의한, 미토콘드리아 비의존성 경로를 유도한다. 따라서, 실험은 특히 ER 스트레스에 대한 아포토시스 신호가 2-DG 민감성 세포 (내성 세포는 아님) 내에서 활성화되는지 여부를 결정하는데 수행될 수 있다. CHOP/GADD153의 상향 조절과 캐스페이스 4 및 5의 활성은 웨스턴 블롯에 의하여 측정될 수 있다. 이전 시험에서와 같이, 만약 이러한 상향 조절이 2-DG-민감성 라인에 특이한 것이면, 그때 시험 암세포 내에서 관찰되는 상향 조절은 세포가 유래된 암이 본 발명에 따른 처리에 감수성이 있다는 지표로서 이용된다.

SKBR3은 글리코단백질 ErbB2를 충분히 발현시키기 때문에, 2-DG가 이 단백질의 N-결합 당화에 영향을 미치고, 잘못 겹쳐지고 붕괴되도록 하는 것으로 기대된다. 2-DG로 처리된 SKBR3 세포로부터의 ErbB2의 웨스턴 블롯은 이 단백질의 전체 수치를 결정하기 위하여 처리되지 않은 세포의 것과 비교될 수 있다. 또한, 2-DG 처리 후의 ErbB2의 만노스 컨텐트 (content)는 이 단백질을 면역 침전시키고, 콘코나발린 A, 고 만노스 타입 N-결합 올리고당을 인지하는 렉틴으로 블롯팅시켜 분석될 수 있다. 만노스 유사체는 ErbB2 뿐 아니라 모든 N-결합 글리코단백질의 만노스 콘텐트를 억제하기 쉽기 때문에, 이들 세포로부터 얻어지는 전체 세포 용해질을 이 렉틴으로 탐지할 수 있다. 모든 단백질에 결합하는 퐁슈 염색은 DG 및 2FM가 특히 글리코단백질에 영향을 미치는 것을 확인하기 위한 음성 제어로서 사용될 수 있고, 또한, 이러한 또는 유사한 방법은 암 또는 종양 세포가 본 발명에 따른 처리에 감수성이 있는지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있다.

심지어 만약 N-결합 당화를 방해하는 지표인 ER 스트레스가 2-DG 및 2 -FM에 의하여 발생하는 것으로 사실상 확인되는 경우에, ER에 반대되는 것으로 세포질 내에서 일어나는 O-당화의 방해도 측정될 수 있다. 과학 문헌은 2-DG가 O- 당화 전사 요소, Sp1로부터의 N- 아세틸글루코사민 잔기의 마름질을 억제하고 그 결과 각각의 프로모터에의 결합을 억제할 수 있다고 보고한다. Sp1는 수많은 종양 유전자를 활성화시키는 중요한 전사 요소이고, 만약 2-DG에 의한 영향을 받을 수 있다면, 정상 산소 하에서 성장하는 SKBR3 세포가 2- DG에 민감성인 이유를 설명한다. 따라서, 2-DG 및 2-FM로의 처리 후 Sp1의 당화 패턴은 면역 침전에 의하여 조사되고, WGA, O-당화 단백질을 특히 결합하는 렉틴으로 탐지될 수 있다. 2-DG가 Sp1 및 O-결합 당화에 영향을 미치는 정도에 따라, 당화의 변경이 측정되고, 종양 또는 기타 암 세포주가 2-DG-매개 세포 사멸에 감수성이 있다는 지표로서 사용될 수 있다.

전개된 단백질 반응에 의하여 유발되는 세포 사멸은 잘못 겹쳐진 단백질에 대한 반응에 있어 모든 세포의 소포체 내에서 일어나는 것으로, 이는 추가 제제, 베르시펠로스타틴의 투여에 의하여 증강될 수 있다. 따라서, 하나의 구체 실시 상태에서, 2-DG, 2-FM, 및/또는 2-CM을 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하고, 베르시펠로스타틴을 상기 환자에게 병용 투여한다.

유사하게, 단백질이 잘못 겹쳐진 것에 대한 반응으로 일어나는 세포 사멸은 프로테오좀 억제제로 잘못 겹쳐진 글리코단백질의 단백질 분해를 차단함으로써 증강될 수 있다. 따라서, 또 하나의 구체 실시 상태에서, 본 발명은 프로테오좀 억제제를 2-DG, 2-FM, 및/또는 2-CM과 조합하여 투여함으로써 암을 처리하는 방법을 제공한다. 하나의 구체 실시 상태에서, 프로테오좀 억제제는 벨케이드이다.

특정 타입의 암은 기타의 방법보다는 본 방법으로 처리하는 것이 더 감수성 있을 수 있다. 그러한 타입을 확인하기 위하여, 본 발명의 방법에 따른 다양한 세포 타입을 시험할 수 있다. 예컨대, ATCC로부터 다양한 암 세포주를 얻고, 위에서 설명한 바와 같이 그들을 스크리닝하여 산소의 존재 하에 2DG 및 2FM과 같은 만노스 유사체에 우수한 민감성을 보이는 기타의 세포 타입을 확인할 수 있다. 5 mM 이하 농도의 2-DG 또는 2-FM에서 사멸되는 세포는 감수성이 있는 것으로 확인된다. 또한, 이들 감수성 있는 종양 세포주의, 2-FG 및 옥사메이트에 대한 민감도는 각각 최대 20 mM 및 30 mM의 투여량에서 시험될 수 있다. 만약 당화의 방해가 2-DG 및 2-FM의 독성 모드라면, 그때에는 이들 세포주가 미토콘드리아 산화성 인산화에 있어서 결함을 가지지 않는 한, 그들은 기타 해당 억제제, 2-FG 및 옥사메이트에 내성이어야 한다. 이들 세포의 미토콘드리아 기능성을 확인하기 위하여 호흡은 예컨대, 클라크 전극 기구를 사용하여 측정될 수 있다. 2-DG 및 2-FM의 독성이 이들 세포주에서의 당화 방해에 기인하는 것이라는 것을 확인하기 위하여, 만노스에 의한 세포 사멸 회복을 위에서 설명한 바와 같이 측정할 수 있다.

현재의 방법 및 다른의 것에 대하여 내성인 세포에 관한 분자적 기초는 글루코스 즉 포스포글루코스 이성화제 (PMI) (이는 글루코스-6-포스페이트를 만노스-6-포스페이트로 전환시킨다 (도 7 참조))로부터의 GDP-만노스의 합성에 포함되는 유전자의 발현에 있어서의 차이에 기인한 것일 수 없다. PMI에 있어서의 고갈은, 위에서 언급한 바와 같이, 당화 신드롬 Ib를 일으키는 것으로 보이는데, 이는 이러한 결함을 가진 것으로 확인된 환자에 있어서 혈전증 및 위창자 질환을 유도하는 혈청 글리코단백질의 저당화를 낳는다. 식이에 만노스를 첨가하는 것은 환자의 증상을 완화시킬 뿐 아니라 그 글리코단백질을 정상화시키는 것으로 보여진다. 따라서, 이 효소의 결함 또는 하향 조절은 2DG 및 2FM의 독성과 지금까지 시험된 민감성 세포주에 있어서의 외래성 만노스에 의한 역행을 설명할 수 있다.

PMI의 하향 조절 또는 고갈이 민감성 세포주에 있어 2-DG 독성을 유도하는 이유는, 이러한 효소의 부재하에, 세포가 N-결합 올리고당 전구체를 합성하는 외래성 만노스 (혈청으로 존재)에 의존하기 때문이다. 포유 동물의 혈청 중의, 또는 생체 외 연구에 사용되는 배지 내의 만노스 농도 (50-60 microg/ml)는 글루코스의 농도보다 상당히 낮다는 것이 알려져 있다. 따라서, 고갈되거나 하향 조절된 PMI를 가진 세포에서, 낮은 투여량의 2-DG 및 2-FM은 혈청 내에 존재하는 소량의 만노스와 우호적으로 경쟁할 수 있고, 그 결과로 이 당의 올리고당 사슬로의 첨가를 완전히 차단할 수 있다. 반면, 정상 PMI를 가진 세포는 글루코스로부터 GDP-만노스를 생산할 수 있고; 따라서, 올리고당 회합의 완전한 붕괴를 일으키기 위하여는 더 많은 투여량의 2-DG 또는 2-FM이 필요하다. 이는 시험되는 대부분의 세포가 정상 산소 조건 하에서 2DG에 내성인 이유를 설명할 수 있다. 이 효소 활성의 직접 측정은 결함이 있는 또는 낮은 PMI 수치가 정상 산소 하에서 성장하는 선택 세포 내에서의 2-DG 및 2-FM에의 민감도의 원인인지 여부를 결정하도록 본 발명에 따라 이용될 수 있고, 만약 그러하다면, 그때에는 본 방법에 따른 처리에 감수성이 있는 종양 및 암 세포를 확인하는데 이용될 수 있다. 이와는 달리, 이러한 비정상적인 민감도를 설명하는 다른 가능성은 이들 선택 세포 내의 PMI가 정상 산소 텐션 하에서 성장할 때 이들 제제에 의한 영향을 받지 않는 정상 및 종양 세포주의 대부분에서보다 2-DG 및 2-FM에 의하여 더 잘 억제된다는 것이다. 이를 직접적으로 시험하기 위하여, 세포 추출물을 SKBR 내성 및 민감성 세포쌍으로부터 분리시킬 수 있고, 글루코스-6-P를 만노스-6-P로 전환시키는 능력은 2-DG 및 2-FM의 존재 또는 부재 하에서 결정될 수 있다.

만약 감소된 PMI 활성이 SKBR3 민감성 세포에서의 2-DG 독성의 원인이 아니라면, 그때에는 이를 설명하는 대안적인 메카니즘은 올리고당 회합에 사용되는 만노스 유도체, 즉 포스포만노뮤테이스 (PMM) 및 GDP-Man 합성 효소의 생산에 포함되는 효소를 인코딩하는 유전자의 상향 조절이다 (도 7). 2-DG에 민감성인 세포가 증가된 당화를 진행하고, 따라서, 이들 효소 중 하나 또는 둘다를 상향 조절할 가능성이 존재한다. 그러므로, 그러한 세포는 더 많은 2-DG-GDP을 축적시키고, 당화를 더 많이 방해하며, 결과적으로 당화가 더 느린 속도 또는 능력으로 일어나는 내성 세포보다 더 많은 세포 사멸이 유도된다

당화의 상향 조절이 세포가 2-DG에 민감성으로 되는 메카니즘인 것으로 판명되는지 여부와는 상관 없이, 세포 내에 축적되거나 병합되는 2-DG의 전체량은 그 민감도 증가에 기여한다. 따라서, [³H] 표지된 2-DG를 사용한 흡수 및 축적 연구는 세포에 있어 글리코스 전달체의 수치가 더 높은 것이 본 방법에 따른 처리에 더 감수성이 있도록 하는지 여부를 결정하도록 수행될 수 있다.

후자에 관하여 2-DG의 투여량을 증가시키고, 생존을 위하여 선택을 하는 처리를 함으로써 민감성 세포로부터 2-DG 내성 돌연변이를 얻을 수 있다. 내성 돌연변이 및 그들의 부모의 민감성 대응부는 설명된 방법으로 이용될 수 있다. 그러한 연구는 또한 세포가 2-DG에 대하여 내성이 되는 메카니즘을 이해하는 수단을 제공하여야 하고, 그러므로 임상적으로 이 약물을 더 잘 이용하도록 적용할 수 있을 것이다. 앞으로의 논의는 분자 서명이 종양 세포 타입이 산소의 존재 하에 2-DG 및 2-FM에 민감성일 수 있다는 것을 예견하는 데에 이용될 수 있다는 것을 반영한다.

세포 사멸의 수행은 아포토시스 및 괴사 간의 범위를 넓히는 현저한 형성성을 보인다. DNA 절단 타입을 조사함으로써 세포 사멸 모드를 비교하는, 수립된 방법을 이용하여, 막 조성물, 보전, 및 톤에 있어서의 변화는 당화 방해에 의하고 해당 작용의 억제에 의하여 유도되는 세포 사멸 메카니즘을 결정할 수 있다. 해당 작용 및 산화성 인산화 둘다의 억제는 심각한 ATP 고갈을 초래하고, 이에 의하여 아포토시스로부터 괴사에 이르는 변화가 일어난다. ATP는 캐스페이스를 활성화시키는데 필요하기 때문에, 심하게 고갈될 때에는, 아포토시스가 차단되고, 결과적으로 에너지 없이 세포는 괴사를 통하여 사멸된다. 해당 억제제로 처리된 호기성 세포는 에너지 원으로서 아미노산 및 또는 지방 중 어느 하나에 의하여 촉진되는 산화성 인산화를 경유하여 ATP를 생산할 수 있다. 따라서, 2-DG가 정상 산소 하에서 세포 사멸로 이끄는 UPR 반응을 유도할 때, 세포는 아포토시스를 진행하는 것으로 믿어진다. 반대로, 저산소 세포 모델에서, 2-DG의 투여량이 해당 작용을 차단하기에 충분할 정도로 높을 때, 이들 세포가 ATP 고갈을 진행하고 괴사를 통해 사멸되어야 하는 것이 기대된다.

그러므로, 아포토시스 및 괴사를 측정하는 수립된 방법을 이용하고, 2-DG가 아포토시스, 괴사 및 또는 이들 양자의 조합에 의하여 세포를 사멸시키는지 여부를 결정할 수 있다. 몇몇의 아포토시스 변수는 흐름 세포 측정 분석을 이용하여 아포토시스로부터의 괴사를 구별하는데 시험될 수 있다. 2-DG 처리 후, 세포 표면에의 포스포아티딜 세린의 노출 및 세포막 보전 손실 각각을 검출하기 위하여 안넥신-V 및 프로피디움 요오드화물로 세포를 이중 염색할 수 있다. 안넥신-V 단독이나 또는 안넥신-V 및 프로피디움 요오드화물 둘다로 염색하면 아포토시스를 나타내는데, 프로피디움 요오드화물 단독으로의 염색은 괴사를 나타낸다. 또한, 아포토시스의 최종 산물 중 2개인, 핵 DNA 분획 및 단일 가닥 DNA의 형성도 측정될 수 있다. 이들 2개의 후자 변수는 아포토시스 세포 사멸에 독특한 것으로 보고되어 왔고, 괴사로부터 아포토시스를 구별하기 위하여 다양한 연구자에 의하여 사용하여 왔다. ATP 수치는 그것이 검출된 사멸 모드과 연관되는지 여부를 결정하는데 시험될 수도 있다.

또한, 만약 2-DG가 저산소 세포에서 아포토시스 및 괴사 양자를 유도한다면, 그때 저산소 조건 하에서 2-FG에 의하여 유도되는 세포 사멸 모드를 결정할 수 있다. 위에서 언급한 바와 같이, 2-FG는 당화를 방해하지 않고, 2-DG보다 더 강력한 해당 억제제이다. 따라서, 2-FG에 의하여 유도된 세포 사멸은 유일하게 괴사를 통하여 발생할 것이라는 것이 기대된다.

누드 마우스에서 잘 성장하는, 정상 산소 하 생체 외에서의 2DG 및/또는 2FM 및/또는 2-CM에 민감성인 것으로 증명된 세포주는, 2DG (및 2-FM 및 2-CM)가 생체 내에서 주어질 때 그들에 대항하는 단일 제제로서 효과적이라는 것을 설명하는 데 이용될 수 있다. 종양이 어떤 특정 크기에 이른 후, 2DG로의 처리는 복막 내 주입으로 적용될 것이다. 이들 동물에 있어 이전에 수립된 최소 치사 투여량에 따른 2DG의 투여량 및 치료 요법은 종양 퇴행 및 세포 독성을 설명하는데 이용될 수 있다.

실시예 1 : 물질 및 방법

내성 돌연변이의 분리. 2-DG 민감성 SKBR3 및 NSCLC 세포에의 2-DG 투여량을 증가시키고, 내성 콜로니를 분리, 2-DG의 적절한 투여량에서 복제하였다. 그런 후 복제된 2-DG 내성 세포를 분석하고, 이를 독특한 야생 타입 민감도의 원인일 수 있는 특정 유전자 발현에 관한 야생 타입 민감성 대응부와 대비한다.

약물 및 항체. Rho 123, 올리고마이신, 스타우로스포린, 및 2-DG, 2-FG, 2-FM, 튜니카마이신, 데옥시만노지리노마이신을 시그마 케미칼사로부터 구한다. 다음의 제1 Abs를 사용할 수 있다: 단클론으로 HIF-1a 및 LDH-a. (BD Biosciences); erbB2 (Calbiochem, USA); Grps 78 & 94, (StressGen, USA); 캐스페이스 4 및 5 (StressGen, USA); 및 액틴 (Sigma Chemical Co.); 다클론성 abs로 GLUT-1 (USA Biological) 및 GADD153/CHOP (Santa Cruz, USA). 제2 항체는 홍당무 과산화효소가 결합된 토끼 항마우스 및 염소 항토끼 (Promega,Co.)이다.

세포 독성 측정 및 빠른 DNA 내용 분석. 세포를 37 ℃, 5% CO₂ 중에서 24 시간 동안 배양하고, 약물 처리를 시작한 후 72 시간 동안 계속하였다. 이때, 부착된 세포를 트립신화시키고 그 각각의 배양 배지와 혼합한 후, 5분간 40O g에서 원심 분리시킨다. 세포를 함유하는 펠릿을 1.5 ml의 배지/트립판 청색 혼합물 중에 재현탁시켜 세포 독성 측정하거나, 또는 프로피디움 요오드화물/저장성 시트레이트 염색 용액 중에 재현탁시키고 코울터 XL 흐름 세포 측정기로 핵 DNA 내용 및 세포 주기을 결정한다. 최소 10,000 세포를 분석하여 DNA 분포 히스토그램을 작성한다.

락트산 측정. 처리 또는 비처리된 배양으로부터의 제단백 배지 0.025 ml을, 락트산 탈수소효소 (1000 unit/ml) 0.1 ml, 글리신 완충 용액 (글리신 0.6 mol/L 및 하이드라진, pH 9.2) 2 ml 및 NAD 1.66 mg/ml를 함유하는 반응 혼합물에 첨가하여 락트산을 측정한다. 시험 배양으로부터의 배지 0.5 ml를 8% w/v의 과염소산 1 ml로 처리하고, 30초간 보텍스시킨 후, 이 혼합물을 4 ℃에서 5분간 배양하며, 1500 g에서 10분간 원심분리하는 것으로 제단백을 수행된다. 상청액을 3회 더 원심 분리하고, 최종의 맑은 상청액 0.025 ml를 락트산 결정에 사용한다. NADH 형성을 340 nm의 벡크만 DU r 520 UV/vis 분광 광도계로 측정하는데, 이는 락테이트 표준 곡선에 의하여 결정되는 바와 같이 락트산 수치에 직접 대응된다.

2- DG 흡수. 세포를 페트리 접시에 넣고, 37 ℃ 및 5% CO₂에서 24"시간 동안 배양한다. 그런 후에 배지를 제거하고, 플레이트를 글루코스 및 혈청이 없는 배지로 세척한다. ³H 표지된 2-DG를 함유하는, 무혈청 배지 2 ml를 접시 (1 ΓCi/plate)에 가하고, 플레이트를 적절한 시간 동안 배양한다. 그런 후에 배지를 제거하고, 플레이트를 4 ℃에서 3회 세척하며, 비표지 2-DG 100 micro M 및 1N NaOH 0.5 ml를 함유하는 무혈청 배지를 가한다. 37 ℃에서 3 시간 (또는 밤새도록) 배양한 후, 세포를 스크랩핑하고, 초음파 처리 (10초)로 균질화시킨다. 용액을 ³H 정량하기 위해 튜브에 모은다 (단백질 측정을 위한 일부를 남김). 포름산 100 micro L, 시료 250 micro L 및 섬광 칵테일 7. ml를 ³H 카운팅 바이알에 혼합하고, 섬광 계수기를 읽는다. 전달율 (nmol/mg protein/time)을 전체 CPM/특정 방사성/전체 단백질로 계산한다.

ATP 정량 측정. ATP 수치를 정량하는데 ATP 라이트 키트 (Perkin Elmer)를 사용할 수 있다. 세포 용해 용액 약 50 micro L를 흰색 바닥 96- 웰 플레이트 내의 세포 현탁액 100 micro L에 가하였다. 플레이트를 쉐이커 (700 rpm) 위에서 실온에서 5분간 배양한다. 그런 후에 기질 용액 50 micro L를 웰에 가하고 실온에서 추가 5분 동안 흔든다 (700 rpm). 그런 후에 플레이트를 10분간 어두운 곳에 적응시키고, 발광을 측정한다.

Dol -P Man 및 지질 결합 올리고당 ( LLO )의 대사 표지화 및 추출. Lehle에 의하여 설명된 공정에 따라, 세포를 30분간 [2-³H] 만노스로 표지시키고, 얼음같이 찬 메탄올 2 ml 내로 스크랩핑시키며, 음파 처리로 용해시킨다. 클로로포름 4 ml를 가한 후, 물질을 음파 처리하고, 뒤이어 4 ℃에서 5000 rpm으로 10분간 원심 분리한다. 상청액을 모은 후, 펠릿을 클로로포름/메탄올 (3:2) (C/M)로 2회 추출한다. Dol-P-Man 및 작은 크기의 지질 결합 올리고당을 함유하는 혼합 상청액을 N₂ 하에 건조시키고, C/M 3 ml 중에 용해시키며, 세척하고, C/M/H₂O (65:25:4)을 함유하는 러닝 완충 용액 내의 실리카겔 60 알루미늄 쉬트를 사용하는 얇은 막 크로마토그래피로 분석한다. 큰 크기의 LLO를 함유하는 잔여 펠릿을 세척하고, C/M/H₂O (10:10:3)으로 추출한다. C/M 및 C/M/H₂O 추출물의 대응 일정 부분을 혼합하고, N₂ 하에서 건조시키며, 35 Γl 1-프로판올 중에서 재현탁시킨다. 경산 (mild acid) 가수 분해로 올리고당을 유리시키기 위하여, 500 ΓI 0.02 N HCl을 가하고, 뒤이어 100 ℃에서 30분간 배양한다.

가수 분해된 물질을 N₂ 하에서 건조시킨 후, 물 200 Γl 중에서 음파 처리하여 재현탁시키고, 원심 분리로 클리어시킨다. 유리된 올리고당을 함유하는 상청액을 HPLC 분석에 사용한다.

HPLC 에 의한 올리고당의 크기 분별. LC-NH₂ (2 cm x 4.6 mm) 프레칼럼을 포함하는 수펠코실 LC-NH₂ 칼럼 (25 cm x 4.6 mm; 5 Γm; Supelco)으로 LLO을 분리시킬 수 있다. 물 중 70% 내지 50% 아세노트릴의 선 기울기는 1 ml/min.의 유속에서 적용된다. 용출 분획을 액체 섬광 계수로 분석한다.

만노스 6- 포스페이트 , 만노스 1- 포스페이트 , GDP - 만노스의 제조. [2-³H] 만노스로 표지화한 후, 세포를 모아, 코르너 등에 의하여 설명된 바와 같이, 종이 크로마토그래피를 이용하여, 뉴클레오티드 결합되고 인산화된 만노스 유도체로부터 유리 만노스를 분리한다. 용출 분획을 액체 섬광 계수로 분석한다.

웨스턴 블롯 분석. 세포를 10⁴ 세포 cm^-2에 두고, 지정된 시간 동안 약물 처리 하에서 성장시킨다. 처리 기간이 끝난 때, 세포를 모으고, 단백질 분해 효소 억제제 칵테일로 보충된 RIPA 완충 용액 (150 mM NaCl, 1% Np-40, 0.5% DOC, 0.1 % SDS, 50 mM Tris-HCI, ph 8.0)으로 용해시킨다. 용액을 21G 니들에 10회 통과시킴으로써 DNA를 단편화시킨다. 단백질 농도를 수퍼 단백질 분석 키트 (Cytoskeleton, USA)로 측정한다. 시료를 2x 램나이 시료 완충 용액 (Bio-Rad, USA)과 혼합하고, SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 이동시킨다. 겔을 니트로셀룰로스 막 (Amersham, USA)으로 전달시키고, 특정 항체로 탐지한다. 탐지 후, 막을 세척하고, HRP 결합 제2 항체와 함께 배양한다. 필름에 노출시킴으로써 화학 발광을 검출한다.

지시된 곳의 막을 스트립핑 완충 용액 (Pierce, USA)으로 스트립핑시키고, 항액틴 제1 항체로 재탐지한다.

ErbB2 의 면역 침전. 세포를 24 시간 동안 처리한 후, 이를 RIPA (15 mM NaCl, 1% Np-40, 0.1% SDS)로 용해시키고, 음파 처리한다. 세포 용해질을 단클론성 ErbB2 항체 (Calbiochem, USA)에 결합된, CnBr 활성 세파로스 비드(Amersham, USA)와 함께 배양하고, 5분간 40O g에서 스핀시킨다.

면역 침전시킨 ErbB2를 SDS-PAGE 겔 위에 로딩시키고, 콘코나발린 A로 블롯팅시키는데, 이는 글리코단백질의 만노스 잔기에 특히 결합된다.

아포토시스 측정. 아포토시스 ELISA 측정은 설명된 바와 같이 이용되고, 포름아미드에 의한, 아포토시스 세포의 농축 염색질 내에서의 선택적인 DNA 변성 및 아포토시스 세포 내의 단일 가닥 DNA (ssDNA)의 ssDNA에 대한 높은 특이성을 가진 단클론성 항체와의 반응성에 기초한다. 이들 항체는 특히 아포토시스 세포를 검출하고, 괴사 세포와는 반응하지 않는다.

흐름 세포 측정에 의한 세포 사멸 메카니즘 조사. 아포토시스는 An-nexin-V-Fluos 염색 키트 (Roche, USA)에 의하여 괴사와는 구별된다. 지시된 처리 후, 10⁶ 세포를 FITC 결합된 에넥신-V 및 프로피디움 요오드화물을 함유하는 배양 완충 용액 중에 재현탁시켜 포스파티딜세린 및 플라즈마 막 보전을 각각 검출한다. 배양 후, 세포를 488 nm 들뜸과, 형광 검출을 위한 515 nm 밴드패스 필터 및 PI 검출을 위한 > 600 nm 필터를 사용하는 흐름 세포 측정기로 분석한다.

유전자 발현 프로파일링. 유전자-배열 키트를 수퍼 어레이사로부터 구입할 수 있다. 선택된 세포주로부터의 전체 RNA를 dCTP [α-³²P] (3000Ci/mmol)를 사용하여 역전사 반응으로 탐지한다. 그런 후, 탐지된 표지 cDNA를 미리 하이브리드화시킨 배열 막에 가하고, 밤새도록 하이브리드 형성 오븐 내에서 배양한다. 프리 프루브를 제거하기 위하여 여러 차례 세척한 후, 막을 X-선 필름에 노출시켜 이미지를 기록한다.

생체 내 종양 실험. Cancer Res . 2004 (Lampidis 등에 의함)에 보고된, 2-DG + Dox에 관하여 설명된 프로토콜은 2-DG를 2-FG로 대체하여 사용될 수 있다. 5 내지 6주되고, 무게가 30 g인 누드 마우스, 세포주 CDl에 인간 골육종 세포주 143b의 100 Γl를 10⁷ 세포/ml로 이식시킨다 (S. C.). 종양의 크기가 50 mm³인 때 (9-10일 후), 동물을 다음과 같은 4개의 군 (8마리의 쥐/군)으로 쌍으로 짝을 지운다 (pair-matched): 살린-처리 대조군; 2-FG 단독; Dox 단독; 및 Dox + 2-FG. 0일에, 2-FG 단독 및 Dox + 2-FG 군에는 0.2 ml의 2-FG i.p.가 75 mg/ml (500 mg/kg)으로 주어지고, 이는 실험의 지속 기간 동안 주당 3번 반복된다. 1일에, Dox 및 Dox + 2-DG 군에는 0.3 ml의 Dox i.v.가 0.6 mg/ml (6 mg/kg)으로 주어지고, 이는 전체 3번 처리 (18 mg/kg) 하는 동안 주당 1회 반복된다. 마우스의 무게를 측정하고, 주당 3회 캘리퍼로 종양 측정을 실시한다.

SKBR3 세포를 이식하고, 2-DG 또는 2-FM이 있고, 독소루비신 (Dox)이 없는 상기 모델 중에서 시험한다.

실시예 2

만노스 유도체에 대한 특정 종양 세포의 정상 산소 민감도.

저산소 하에서 성장하는 세포는 에너지 생산을 위하여 해당 작용을 경유하는 글루코스 대사에만 의존한다. 결과적으로, 이 경로가 2-데옥시-D-글루코스 (2-DG)로 막히면, 저산소 세포는 사멸된다. 반면, 정상 산소 하에서 해당 작용이 차단되면, 대부분의 세포는 생존하는데, 이는 지방 및 단백질이 미토콘드리아의 산화성 인산화를 가속화시키는 에너지 원으로 대체될 수 있기 때문이다. 본 발명은 정상 산소 텐션 하에서, 선택된 수의 종양 세포주가 2-DG (4 mM)의 투여량이 상대적으로 낮은 때에 사멸된다는 것을 발견한 데에 부분적으로 기초를 둔다. 2-DG가 바이러스 외피 글리코단백질 합성에 있어서의 N-결합 당화 프로세프를 방해하고, 이는 외래성 만노스를 첨가함으로써 역행될 수 있다는 것은 이전에 알려져 있다. 본원에서 설명하는 바와 같이, 정상 산소 하에서 2-DG 독성은 낮은 투여량의 만노스 (2 mM)에 의하여 완전히 역행될 수 없기 때문에, 당화는 이러한 결과에 책임이 있는 메카니즘인 것으로 여겨지지만, 해당 작용은 그러하지 아니하다. 또한, 2-플루오로-데옥시-D-글루코스 (2-FDG)는 해당 작용을 억제하고 저산소 세포를 죽이는 점에 있어 2-DG보다 더 강력한 것으로, 이는 정상 산소 조건 하에서 2-DG에 민감성인 어떠한 세포 타입에 대하여도 독성을 나타내지 않음을 보인다.

글리코단백질 합성에 대한 2-DG의 효과를 조사하기 위하여, 2- FDG가 아닌 2-DG가 결합을 감소시키는 (이는 외래성 만노스 부가에 의하여 역행된다) 것을 보여주는 연구에 콘카나발린 A (글리코단백질 위 만노스 부분에 결합함)을 사용하였다. 유사하게, 전개된 단백질 반응 (UPR) 단백질, grp 98 및 78 (n-결합 당화가 변경될 때 유도되는 것으로 알려짐)은 2-FDG가 아닌 2-DG에 의하여 상향 조절되는 것으로 확인되었는데, 이러한 효과는 다시 만노스에 의하여 역행될 수 있다. 또한, 2-DG는 UPR 특정 전사 요소 (GADD154/CHOP)를 상향 조절하여 세포 사멸을 유도하는데, 이는 아포토시스를 매개한다. 따라서, 특정 종양 세포 타입에서, 2-DG는 고형 종양의 호기성 (당화를 방해하여) 세포 뿐 아니라 저산소 (해당 작용의 억제를 통하여) 세포 둘다를 선택적으로 죽이기 위하여 단일 제제로서 임상적으로 사용될 수 있다.

혈관 형성에도 불구하고, 대사는 산소 공급을 능가하는 빠른 종양 성장을 종종 요구하는데, 이는 고형 종양의 대부분의 저산소 부위의 형성에 기여한다. 종양 성장시에 발생하는 산소 수치에 있어서의 감소는 저산소 부위에 있어서의 세포의 복제율을 느리게 하고, 결과적으로 빠르게 증식하는 세포를 일반적으로 표적으로 하는 화학 치료 요법 제제의 대부분에 대한 내성을 낳는다 (Brown, J.M, 등, Exploiting Tumor Hypoxia In Cancer Treatment, Nat Rev Cancer 2004; 4:437-47). 저산소 세포는 느린 성장과 반응성 산소종을 생산하는 데에 필수적인 산소의 부재로 인하여 방사선 처리에도 내성이 있다 (Semenza, G.L., Intratumoral Hypoxia , Radiation Resistance , And HIF -I, Cancer Cell 2004;5:405-406). 암 처리에 관한 이들 단점에 더하여, 저산소는 종양 세포가 에너지 생산 및 생존을 위한 해당 작용에 의존적이 되도록 한다. 저산소 하에서, 산화성 인산화, ATP 생산의 가장 효율적인 수단이 억제되어 해당 작용이 ATP를 생산하는 유일한 수단이 되도록 한다. 따라서, 저산소 종양 세포에 있어서의 해당 작용을 차단하는 것은 세포 사멸을 유도한다. 사실상, 생체 외에서의 자극된 저산소의 3개의 상이한 조건 하에서, 종양 세포는 해당 작용의 억제제에 의하여 사멸될 수 있음을 보여 왔다 (Maher, J. C, 등, Greater Cell Cycle Inhibition And Cytotoxicity Induced By 2- Deoxy -D- Glucose In Tumor Cells Treated Under Hypoxic vs Aerobic Conditions, Cancer Chemother Pharmacol 2004; 53: 116-122). 또한, 일반적으로 산화된 세포에 있어서의 해당 작용의 억제는 그 에너지 생산에 상당한 영향을 미치지 않는데, 이는 대체 탄소원, 즉 아미노산 및 지방이 미토콘드리아 산화성 인산화를 추진하는데 이용될 수 있기 때문이다. 그러므로, 해당 억제제를 호기성 조건에서 성장하는 정상 세포 또는 종양 세포에 많은 독성을 보이지 않고서 저산소 종양 세포를 선택적으로 표적으로 하는데 이용될 수 있다 (Boros, L. G., 등, Inhibition Of Oxidative And Nonoxidative Pentose Phosphate Pathways By Somatostatin : A Possible Mechanism Of Antitumor Action, Med Hypotheses 1998; 50:501; LaManna, J. C, Nutrient Consumption And Metabolic Perturbation, Neurosurg Clin N Am 1997;8: 145-163).

사실상, 생체 내 실험은 2-DG (느리게 성장하는 저산소 종양 세포를 표적으로 하는)가 상이한 인간 종양 이종 이식에 있어서의 표준 화학 치료 요법 제제 (빠르게 증식하는 호기성 세포에 대항하도록 하는)의 효능을 증진시킨다는 것을 보여준다 (Maschek, G., 등, 2- Deoxy -D- Glucose Increases The Efficacy Of Adriamycin And Paclitaxel In Human Osteosarcoma And Non - Small Cell Lung Cancers In Vivo, Cancer Res 2004;64:31-4). 이들 연구 결과 뿐 아니라 저산소의 생체 외 모델로부터의 자료는 현재 진행 중인 "진행 중인 고형 악성 종양을 앓고 있는 환자에 대하여 2-데옥시-D-글루코스 단독 및 도세탁셀과의 조합으로의 Phase I 투여량 증강 시험"이라는 제목의 Phase I 임상 시험의 형태로서 인간에 있어서의 화학 치료 요법 프로토콜을 개선시키기 위하여 이 전략을 시험하도록 이끈다 (Maher, J.C., 등, Greater Cell Cycle Inhibition And Cell Cytotoxicity Induced By 2- Deoxy -D- Glucose In Cancer Cells Treated Under Hypoxic vs Aerobic Conditions, Cancer Chemother Pharmacol 2004; 53: 116-122). 동물 연구로부터의 자료 뿐 아니라 Phase I 임상 시험으로부터의 예비 자료는 2-DG가 정상 세포에 대하여 상당한 내성이 있고 상대적으로 비독성이라는 것을 나타낸다.

이론적으로 산화성 인산화를 진행할 수 있는 미토콘드리아를 가진 종양 세포는 해당 억제제 2-DG에 의하여 사멸되어서는 안되지만, 선택된 많은 수의 암 세포주가 이 당 유사체의 낮은 투여량에서 산소의 존재 하에 사멸된다. 독성 메카니즘은 해당 작용의 차단에 의한 것이 아닌데, 이는 이들 세포주가 정상 미토콘드리아성 호흡을 진행하고, 기타 해당 억제제에 대하여 내성이 있기 때문이다. 비슷한 메카니즘이 바이러스성 글리코단백질 합성에서 보여지는데, 여기서 2-DG는 지질 결합 올리고당 회합를 방해함으로써 N-결합 당화를 차단한다 (Datema, R., 등, Interference With Glycosylation Of Glycoproteins, Biochem J 1979;184: 113-123; Datema, R., 등, Formation Of 2- Deoxyglucose - Containing Lipid - Linked Oligosaccharides, Eur J Biochem 1978;90: 505-516). 정상 산소 하에서 증식하는 선택된 종양 세포주에서의 2-DG의 독성은 비슷한 메카니즘으로 인한 것으로 보인다.

본 발명에 따르면, 2-DG는 정상 산소 하에서 2-DG에 민감성인 세포를 포함하는 고형 종양을 가진 특정 환자에 있어서 단일 제제로서 사용될 수 있다. 따라서, 이들 환자에 있어서 2-DG는 (1) 당화를 방해하여 호기성 종양 세포 집단을 표적으로 하고; 및 (2) 종양의 저산소 부위에 있어서의 해당 작용을 억제하는 이중 효과를 가져야 하며; 양자의 메카니즘은 세포 사멸로 이끈다.

물질 및 방법

세포 타입

이전에 설명된 바와 같이, 지속 기간 동안 골육종 세포주 143B (wt)를 브롬산 에티디움으로 처리하여 p⁰ 세포를 분리하였다 (King, M. P., 등, Human Cells Lacking Mtdna : Repopulation With Exogenous Mitochondria By Complementation, Science 1989; 246: 500-503). p⁰ 세포는 우리딘 및 피루브산염 영양 요구 균주이기 때문에, 이들을 10% 소 태아 혈청, 50 micro g/ml의 우리딘 및 100 mM의 피루브산나트륨으로 보충된 DMEM (GIBCO ,USA) 중에서 성장시킨다. SKBR3 세포주를 마이애미 대학교의 조셉 로젠블라트 박사의 실험실로부터 얻었다. 췌장암 세포주 1420 및 1469, 난소암 세포주 SKOV3, 자궁 경부 암 세포주 HELA, 및 골육종 세포주 143B를 ATCC로부터 구매하였다. 비-소세포 폐암 및 소세포 폐암 세포주는 마이애미 대학교의 미라몰 사바라쥐 박사에 의하여 환자로부터 얻어졌다. SKBR3 및 SKOV3 세포를 맥코이 5A 배지에서 성장시키고; 1420, 1469 및 143B을 DMEM (GIBCO, USA) 중에서 성장시키며; 및 HELA를 MEM (GIBCO, USA) 중에서 성장시켰다. 배지에 10% 소 태아 혈청을 보충하였다. 모든 세포를 5% CO₂ 및 37 ℃ 하에서 성장시켰다.

약물 및 화학 물질

2-DG, 올리고마이신 및 튜니카마이신을 시그마로부터 구매하였다. 2-FDG 및 2-FDM는 프리에베 박사 (MD Anderson Cancer Center, TX)로부터 얻었다.

저산소

저산소 조건 (모델 C)에서의 연구를 위하여, 아래의 직접 세포 독성 측정에서 설명하는 바와 같이, 세포를 살포하고, 37 ℃ 및 5% CO₂ 하에서 24 시간 동안 배양하였다. 24 시간 배양 후, 세포에 약물 처리를 하고, 세포를 모델 110 산소 조절기 (Reming Bioinstruments Co. Redfield, NY)에 부착된 Pro-Ox 생체 외 챔버 내에 두었는데, 여기서 모델 110 산소 조절기에는 바람직한 O₂ 수치 (0.1%)를 달성하도록 챔버에 95% 질소 및 5% CO₂의 혼합물이 주입되어 사용된다.

세포 독성 측정

세포를 5% CO₂에서 37 ℃의 온도로 24 시간 동안 배양하고, 약물 처리를 시작하여 72 시간 동안 지속하였다. 이때, 부착 세포를 트립신화시키고, 각각의 배양 배지와 혼합시킨 후 400 g에서 5분간 원심 분리시킨다. 펠릿을 1 ml의 핸크 용액 중에 재현탁시키고, Vi-CeIl (Beckman Coulter, USA) 세포 활성 분석기로 분석하였다.

락트산 측정

0.1 ml의 락트산 탈수소효소 (1000 unit/ml), 2 ml의 글리신 완충 용액 (글리신, 0.6 mol/L, 및 하이드라진, pH 9.2), 및 1.66 mg/ml NAD를 함유하는 반응 혼합물에, 처리 또는 비처리 배양으로부터의 제단백 배지 0.025 ml를 가하여 락트산을 측정한다. 시험 배양으로부터의 배지 0.5 ml를, 8% w/v 과염소산 1 ml로 처리하고, 30초 간 보텍스시킨 후, 이 혼합물을 4 ℃에서 4분간 두고, 1500 g에서 10분간 원심 분리시켜 제단백을 수행한다. 상청액을 3회 더 원심 분리하고, 상기한 바와 같이 0.025 ml의 최종의 맑은 상청액을 락트산 측정에 사용한다. NADH의 형성은 340 nm에서의 벡크만 DU r 520 UV/vis 분광광도계로 측정하는데, 이는 락테이트 표준 곡선에 의하여 결정되는 바와 같이 락트산 수치에 직접 대응되는 것이다.

ATP 정량 측정

ATP 수치를 정량하기 위하여 ATP 라이트 키트 (Perkin Elmer)를 사용할 수 있다. 세포 용해 용액 약 50 ml를 백색 바닥의 96-웰 플레이드 중의 세포 현탁액 100 ml에 가한다. 플레이트를 5분간 쉐이커 (700 rpm) 위에서 실온 배양한다. 그런 후에 기질 용액 약 50 ml를 웰에 가하고, 실온에서 추가 5분간 흔든다 (700 rpm). 그런 후에 플레이트를 10분간 어두운 곳에 적응시키고, 발광 측정을 한다.

웨스턴 블롯 분석

세포를 10⁴ 세포 cm^-2에 두고, 지정된 시간 동안 약물 처리 하에서 성장시킨다. 처리 기간이 끝날 때, 세포를 모아서, 단백질 분해 효소 억제제 칵테일로 보충된 80 mM Tris-HCL (ph 7.4) 완충 용액 중의 1% SDS와 함께 용해시킨다. DNA를 음파 처리하여 단편화시키고, 단백질 농도를 microBCA 단백질 측정 키트 (Pierce, USA)로 측정한다. 시료를 2x 램나이 시료 완충 용액 (Bio-Rad, USA)과 혼합하고, SDS-폴리아크릴아미드 겔 위에서 이동시킨다. 겔을 니트로셀룰로스 막 (Amersham, USA)으로 전달시키고, 항-KDEL (Stressgen, Canada) (for Grp78 및 Grp94); 다클론성 항-CHOP/GADD154 (Santa Cruz, USA), 다클론성 항-erbB2 (DAKO, USA)으로 탐지한다. 탐지 후, 막을 세척하고, HRP 결합 제2 항체와 함께 배양한다. 필름에 노출시켜 화학 발광을 검출한다. 지시된 곳의 막을 스트립핑 완충 용액 (Pierce, USA)으로 스트립핑시키고, 항-액틴 (Sigma, USA) 제1 항체로 재탐지한다. 콘코나발린 A (ConA) 결합을 분석하기 위하여, 막을 0.2 micro g/ml HRP-결합 ConA과 함께 배양하고, 상기한 바와 같이 화학 발광을 검출한다.

결과

2-DC 및 2-플루오로-D-만노스 (2-FDG는 아님)는 정상 산소 조건 하에서 성장하는 SKBR3 세포를 사멸시킨다.

수많은 종양 세포주의, 정상 산소 대 저산소 조건 하에서 해당 억제제에 대한 상이한 민감도를 조사하는 중에, 인간 유방암 세포주 SKBR3가 정상 산소 조건 하에서 성장할 때 2-DG에 민감성이라는 것이 발견되었다. 도 IA 및 B는 SKBR3이 3 mM의 2-DG로 72 시간 동안 처리될 때, 그 성장의 50%가 억제되는 반면 (ID₅₀), 12 mM에서 세포의 60%가 사멸되는 것을 보인다. 이전의 연구는 미토콘드리아 호흡이 결함되거나, 화학적으로 차단될 때, 2-DG가 비슷한 투여량으로 처리될 때, 종양 세포가 사멸되는 것을 보여주었다. 그러므로, 이들 세포가 미토콘드리아 호흡에 있어 결함이 있는지를 결정하기 위하여, 그 산소 소비를 측정하였다. 아래의 표 1에서 보이는 바와 같이, 정상 산소 조건 하에서 성장시 SKBR3 세포와, 2-DG 처리에 내성인 2개의 기타 세포주의 평균 산소 소비 간에는 큰 차이가 없었다. 반면, 미토콘드리아 결함 세포주, p⁰는 산소 소비가 급격히 감소되는 것을 보여주었고, SKBR3가 일반적으로 호흡하는 것을 확인시켜 주었다. 또한, 2개의 기타 세포주, 1420 및 HELA (정상 산소 하에서 2-DG에 민감성)도 내성 세포주 (표 1 참조) 만큼 또는 더 잘 호흡하였다. 따라서, 정상 산소 하에서 이들 세포 내의 2-DG의 독성은 해당 작용의 차단이 아닌 다른 메카니즘으로 인한 것이다. 이를 확인하기 위하여, SKBR3 세포를 2개의 기타 해당 억제제, 즉 2-데옥시-2-플루오로-글루코스 (2-FDG) 및 옥사메이트로 처리하였다. 도 IA 및 B에서, 이들 제제 중 어느 것도 정상 산소 하에서 성장시 SKBR3 세포에 독성을 일으키지 않는다는 것을 확인할 수 있다.

2-DG 민감성 세포주 대 내성 세포주에 있어서의 산소 소비 비교
세포주	조직 타입	평균 O 2 소비 ( nmol /10 6 세포/분)
143B	골육종	2.81 ± 0.11
P0	골육종	0.09 ± 0.004
SKOV3	난소 암종	2.38 ± 0.32
SKBR3	유방 선암종	2.01 ± 0.29
1420	췌장 선암종	4.70 ± 0.03
HELA	자궁 경부 선암종	2.76 ± 0.04

또한, 2-플루오로-D-만노스 (2-FDM)는 2-DG와 유사하지만, 그럼에도 SKBR3 세포에 세포 독성을 일으키는 데 있어 덜 효율적이다 (도 1 참조). 2-DG 및 2-FDM는 (2-FDG는 아님) 둘다 만노스의 구조를 닮아서, 만노스 대사를 방해할 수 있다. 이 자료에 의해 수많은 단백질의 N-결합 당화에 주로 포함되는 만노스 대사를 2- DG 및 2-FDM로 방해가 SKBR3 세포에서의 세포 사멸 뿐 아니라 성장 억제를 가져온다는 것을 보여준다. 2-FDG는 2-DG에 비하여 해당 작용을 더 잘 억제하여 SKBR3 세포 내의 ATP를 더 잘 고갈시킨다.

이전의 보고에서, 정상 산소 하에서 성장하는 SKBR3 세포 내의 2-DG 독성은 해당 작용의 억제 및 ATP 생산을 통하여 매개된다는 것이 제시되었다 (Aft, R.L., 등, Evaluation Of 2- Deoxy -D- Glucose As A Chemotherapeutic Agent : Mechanism Of Cell Death, Br J Cancer 2002;87:805-812). 그러나, 위에서 언급한 바와 같이, 또 하나의 해당 억제제, 2-FDG는 이들 세포 내에서 비독성이다. 또한, 2- FDG 유사체는 해당 작용을 억제하고 저산소 세포를 사멸시키는 데에 있어 2-DG 보다 더 우수하다 (Lampidis, TJ. , 등, Efficacy of 2- Halogen Substituted D- Glucose Analogs in Blocking Glycosis and Killing " Hypoxic Tumor Cells ," Cancer Chemother Pharmacol (인쇄중)). 사실상, SKBR3 세포를 2-FDG 대 2-DG로 처리할 때, 전자는 후자보다 락테이트 수치 (해당 작용 측정)을 더 잘 억제하였다 (도 2A 참조). 또한, ATP 고갈은 2-FDG 처리로 더욱 현저해지고, 또한 이러한 당 유사체가 이들 세포 내에서 해당 작용 및 ATP 생산을 더 잘 억제한다는 것을 확인하여 준다 (도 2B 참조). 또한, SKBR3 세포가 저산소 상태에서 증식될 때, 2-FDG가 2-DG 보다 더 독성이고, 또한 이것이 SKBR3 세포 내의 해당 작용을 더 잘 억제한다는 것을 확인시켜 준다 (자료는 제시되지 않음)는 것이 발견되었다. 따라서, 이전의 보고서와는 달리, 정상 산소 조건 하에서 2-DG에 의하여 유도된 독성은 해당 작용을 억제하고 ATP 풀을 감소시키는 그의 능력과는 관련이 없는 것으로 보인다.

정상 산소 하에서 SKBR3 세포 내의 2- DG 독성은 외래성 만노스에 의하여 역행될 수 있다.

바이러스성 단백질, 2-DG는 N-결합 올리고당의 회합을 억제하고, 이러한 억제는 외래성 만노스에 의하여 역행될 수 있다는 것이 알려져 왔다 (Datema, R., 등, Interference With Glycosylation Of Glycoproteins, Biochem J 1979;184: 113-123). 도 3A 및 3B는 세포 사멸이 비슷한 메카니즘에 의한 당화 방해로 매개된다는 것을 제시하면서, 만노스 (기타 당, 즉 글루코스, 프락토스 및 푸코스는 아님)의 첨가로, 정상 산소 하의 2-DG 노출로 인하여 세포 사멸이 역행될 수 있다는 것을 보여준다 (Datema, R., 등, Interference With Glycosylation Of Glycoproteins, Biochem J 1979;184: 113- 123). 음성 제어로서, 만노스는 동일한 조건 하에서 SKBR3 세포 내에서 튜니카마이신 유도 독성을 역행시키지 않는다는 것이 확인되었다. 이것은 튜니카마이신이 올리고당 사슬에 만노스 첨가하기 전 단계에서 당화를 방해하고, 그 결과 이것이 만노스 대사를 독립적이게 한다는 사실에 의하여 설명될 수 있다 (자료는 제시되지 않음).

' 저산소 '의 3개 모델에서의 2- DG 독성은 외래성 만노스에 의하여 역행될 수 없다.

상기한 바와 같이, 저산소 조건 하에서 성장하는 세포는 에너지 생산을 해당 작용에만 의존한다. 따라서, 해당 억제제의 의한 이러한 대사 경로의 억제는 이전에 설명되어온 바와 같이 세포 사멸로 이끈다 (Maher, J. C, 등, Greater Cell Cycle Inhibition And Cytotoxicity Induced By 2- Deoxy -D- Glucose In Tumor Cells Treated Under Hypoxic vs Aerobic Conditions, Cancer Chemother Pharmacol 2004; 53: 116-122). 2-DG가 정상 산소 하에서 성장하는 SKBR3 세포에 독성인 메카니즘을 구별하기 위하여 만노스를 '저산소'의 3개의 상이한 조건 하에서 성장하는 세포에 가하였다. 도 3C 및 D에서 보는 바와 같이, 정상 성장 배지 내 또는 동일 배지에 2 mM 만노스를 보충한 배지 내 중 어느 하나에서의 성장 억제 및 세포 사멸에 있어서 큰 차이를 보이지 않는다는 것이 확인되었다. 이러한 결과는 정상 산소 하에서 성장하는 SKBR3 세포 내의 2-DG의 독성이 외래성 만노스에 의하여 역행되는 것이 해당 작용과는 관계가 없다는 증거를 제공하고, 또한 당화의 방해를 정상 산소 하에서 성장하는 이들 세포 내의 세포 사멸 모드로서 관련시킨다.

2- DG 및 2- FDM 은 정상 산소 조건 하에서 성정하는 선택된 수의 종양 세포주에만 독성이다.

정상 산소 조건 하에서 2-DG의 독성이 특정 타입의 암 조직에 제한되는지 여부를 조사하기 위하여, 수많은 세포주를 시험하였다. 표 2에 보이는 이러한 시험 결과는, 정상 산소 텐션 하에서 성장하는 선택된 수의 종양 세포주 (15 중 6) 만이 6 mM의 2-DG 또는 2-FDM (2-FDG는 아님) 중 어느 하나로 처리시 상당한 세포 사멸을 진행한다는 것을 보인다. 2-DG에 민감성인 것으로 확인된 세포주는 SKBR3, 유방암 세포주; 1420, 췌장암 세포주; 환자로부터 직접 얻은 2 비-소세포 폐암 세포주; RT 8226, 다발 골수종 세포주; HELA, 자궁 경부 암종 및 TG98, 교모세포종 세포주이다. 그러나, 비슷한 조직으로부터 얻은 암 세포주는 정상 산소 텐션 하에서 2-DG 및 2-FDM 둘다에 내성인 것으로 확인되었고, 이들 당 유사체의 독성은 조직 타입 특정에 필수적이지 않음을 나타내었다.

내성 세포주 대 민감성 세포주 (정상 산소 하에서 2-DG)
2- DG 민감성 세포주	2- DG 내성 세포주
SKBR3, 유방암	SKOV3, 난소암
1420, 췌장암	1469, 췌장암
HELA, 자궁암	143B, 골육종
S-1 및 S-2, 비소세포폐암	Ra-1,2 및 3, 소세포폐암
TG98, 뇌암 (교모세포종)	MCF-7, 유방암
RT 8228, 다발골수종	U266, 다발골수종 HEPA-1, ras 간암 MDA-MB-231, 유방암 MDA-MB-468, 유방암

2- DG 및 2- FDM 은 SKBR3 세포 내의 콘코나발린 A ( ConA ) 결합 및 글리코단백질의 분자량을 감소시킨다.

ConA는 만노스를 글리코단백질에 특히 결합시키고, 고 만노스 타입 글리코단백질을 검출하는데 사용되어 온 렉틴이다 (Protein Purification Methods : A Practical Approach, In: Harris ELV, Angal S, editors. New York: IRLPress at Oxford University Press; 1994. 270 페이지). 이 기술은 2-DG 및 2-FDM 둘다를 비롯하여 튜니카마이신이 수많은 글리코단백질 내의 ConA 결합을 감소시키는 것을 보여주는데 사용되었다 (도 4A 참조). 또한, 외래성 만노스는 2-DG 및 2-FDM (튜니카마이신는 아님) 처리된 세포 내의 조절 ConA 결합 수치를 복구시키는 반면, 2-FDG 처리된 세포는 ConA 결합에 있어서의 어떠한 감소도 보이지 않는다. 또한, 웨스턴 블롯으로 공지의 글리코단백질, erbB2 (2-DG 처리에 따라 SKBR3 세포 중에 발현된 티로신-키나아제 수용체임)의 크기에 있어서의 변화를 분석하였다. 도 4B는 2-DG 및 2-FDM 둘다 erbB2의 분자량을 감소시키는 반면, 2-FDG는 어떠한 효과도 나타내지 않음을 보여준다. ConA 자료와 관련하여, 외래성 만노스는 단백질의 크기를 그 원 무게로 복구시켰다. 또한, 이들 자료는 2-DG 및 2-FDM (2-FDG는 아님)이 N-결합 당화를 방해하여 선택된 종양 세포에 독성이고, 이러한 방해가 만노스에 의하여 역행될 수 있다는 결론을 뒷받침한다.

2- DG 또는 2- FDM 중 어느 하나에 의한 처리는 정상 산소 하 SKBR3 세포 내에서의 전개된 단백질 반응으로 이끈다.

단백질 당화의 정상 프로세스가 영향받을 때, 잘못 겹쳐진 단백질이 소포체 (ER) 내에 축적되어 전개된 단백질 반응 (UPR)으로 알려진 신호 연쇄 반응을 유도한다. 당화를 방해하는 약물은 UPR을 유도하여, 차프론 즉 Grp78/Bip 또는 Grp94를 상향 조절함으로써 ER을 접는 능력을 단백질 내에서 증가시키도록 한다는 것이 알려져 있다. 도 5A에서 보이는 바와 같이, SKBR3 세포를 정상 산소 하에서 2-DG, 2-FDM, 또는 튜니카마이신, 공지의 당화 억제제로 처리할 때, Grp78 및 Grp94는 둘다 상향 조절된다. 또한, 2 mM 만노스를 가하면 차프론의 2-DG 및 2-FDM 상향 조절을 역행시키지만 튜니카마이신의 경우는 그러하지 아니하다. UPR을 유도하는 2-DG의 만노스 역행은 2-DG의 독성이 외래성 만노스의 첨가에 의하여 역행되고; 유사한 결과가 2-FDM 처리 세포에서 확인된다 (자료는 제시되지 않음)는 것을 설명하는 도 3D 내의 자료와 관련이 있다. 예상되는 바와 같이, 2-FDG는 2-DG 또는 2-FDM에서 만큼 이들 차프론의 수치를 증가시키지 않고, 이는 정상 산소 조건 하에서 처리시 SKBR3 세포 내에 세포 사멸이 없음을 보이는 독성 자료 (도 IB)와 관련된다. 반대로, 2-DG 또는 2-FDM을 저산소의 3개의 상이한 실험 조건 하에서 성장하는 세포에 적용할 때, 양 차프론이 상향 조절되는 모델 C와 대비시 모델 A 및 B 내에서는 의미 있는 UPR의 상향 조절이 관찰되지 않는다. 또한, 양성 제어로서, 튜니카마이신은 이들 3개의 모델 내에서의 이들 차프론의 합성을 유도하는 것으로 보인다 (도 5B). 이들 결과는 세포를 2-DG 또는 2-FDM으로 처리할 때, 세포 사멸 메카니즘이 "저산소" (해당 작용 차단) 대 정상 산소 (당화 방해) 조건 하에서 구별된다는 것을 나타낸다.

2- DG 및 2- FDM 의 독성은 SKBR3 세포 내의 UPR -특정 아포토시스 경로의 유도와 관련이 있다.

세포가 ER 스트레스를 해소할 수 없을 때, UPR은 GADD154/CHOP의 유도에 의한 특정 아포토시스 경로를 유도한다는 것이 보고되어 왔다 (Xu, C, 등, Endoplasmic Reticulum Stress : Cell Life And Death Decisions, J Clin Invest 2005; 115: 2656-2664; Obeng, E. A., 등, Caspase -12 and Caspase -4 Are Not Required For Caspase - Dependent Endoplasmic Reticulum Stress - Induced Apoptosis, J Biol Chem 2005; 280: 29578-29587). 따라서, 2-DG 및 2-FDM이 정상 산소 하에서 ER 스트레스로 인하여 SKBR3 세포를 사멸시키는지 여부를 결정하기 위하여, 이 UPR-특정 아포토시스 단백질을 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 분석하였다. 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 2-DG, 2-FDM, 및 튜니카마이신 (2-FDG가 아님) 처리에 따라, GADD154/CHOP가 유도된다. 이러한 아포토시스 경로가 2-DG 또는 2-FDM 중 어느 하나에 의하여 유도되면, 이는 만노스와 함께 처리함으로써 역행될 수 있지만; 튜니카마이신으로 유도된 GADD154/CHOP는 이러한 당의 첨가에 의하여 역행될 수 없다. 이들 자료는 도 2B에서 보이는 바와 같이, 만노스에 의한 세포 독성의 역행과 관련이 있다.

실시예 1 및 2의 검토

고형 종양은 불충분한 혈관 형성, 종양의 빠른 증식 및 종양 맥관의 산소 운반 능력의 감소로 인하여 저산소 뿐 아니라 정상 산소 부위를 포함한다 (Gillies, RJ. , 등, MRI Of The Tumor Microenviroment, J Magn Reson Imaging 2002; 16:430-450; Maxwell, P. H., 등, Hypoxia - Inducible Facoro -1 Modulates Gene Expression In Solid Tumors And Influences Both Angiogenesis And Tumor Growth, PNAS 1997; 94:8104-8109; Semenza, G.L., Targeting HIF -I For Cancer Therapy, Nature Rev 2003;3:721- 732). 저산소 세포 내에서의 유일한 에너지 생산 경로는 해당 작용이기 때문에, 해당 억제제 2-DG는 이들 세포에 대하여 선택적으로 독성이지만, 호기성 세포에 대하여는 비독성이고 증식을 억제할 뿐임을 보여 왔다 (Maher, J. C, 등, Greater Cell Cycle Inhibition And Cytotoxicity Induced By 2-Deoxy-D-Glucose In Tumor Cells Treated Under Hypoxic vs Aerobic Conditions, Cancer Chemother Pharmacol 2004; 53: 116-122; Maschek, G., 등, 2- Deoxy -D-Glucose Increases The Efficacy Of Adriamycin And Paclitaxel In Human Osteosarcoma And Non - Small Cell Lung Cancers In Vivo, Cancer Res 2004;64:31-4; Liu, H., 등, Hypersensitization Of Tumor Cells To Glycolytic Inhibitors, Biochemistry 2001; 40:5542-5547; Liu, H., 등, Hypoxia Increases Tumor Cell Sensitivity To Glycolytic Inhibitors : A Strategy For Solid Tumor Therapy (Model C,. Biochem Pharmacol 2002; 64: 1745-1751). 그러나, 선택된 수의 종양 세포주는 산소의 존재하에서 2-DG에 의하여 사멸된다. 이들 민감성 세포 타입 중에 인간 유방암 세포주 SKBR3이 있다. 미토콘드리아 호흡의 결함은 2-DG에 대한 이들 세포의 민감도를 설명할 수 있는데, 이는 세포 내의 해당 작용을 타협 미토콘드리아로 차단하는 것이 ATP 수치를 낮추고, 괴사 세포 사멸을 유도하기 때문이다 (Gramaglia, D., 등, Apoptosis To Necrosis Switching Downstream Of Apoptosome 형성 Requires Inhibition Of Both Glycolysis And Oxidative Phosphorylation In A BCL - X _L And PKB / AKT - Independent Fashion, Cell Death Differentiation 2004; 11: 342-353). 그러나, 이러한 가능성은 산소 소비 실험에 의하여 배제되는데, 이 실험은 SKBR3 세포가 정상 산소 하에서 2-DG에 대하여 내성인 것으로 확인된 2개의 기타 세포주와 유사하게 호흡하는 것을 보이는 것이다 (표 1). 또한, 정상 산소 하에서 2-DG에도 역시 민감성인 세포주 1420의 호흡율은 2-DG 내성 세포주에서 보다 더 높은 것으로 확인되었다. 따라서, 정상 산소 하에서의 SKBR3 내의 2-DG의 독성은 미토콘드리아의 기능에 있어서의 결함에 의하여 설명될 수 없고, 세포 사멸의 메카니즘이 해당 작용을 차단하는 이러한 당의 효과와는 무관한 것을 나타낸다.

이전에, SKBR3 세포는 해당 작용의 억제로 인하여 정상 산소 하에서 2-DG에 민감성이고, 이는 ATP 풀의 고갈을 유도하여 글루코스 전달체-I의 발현을 증가시키고, 2-DG의 흡수를 높이는 결과를 내는 것으로 보고되었다 (Aft, R.L., 등, Evaluation Of 2- Deoxy -D- Glucose As A Chemotherapeutic Agent : Mechanism Of Cell Death, Br J Cancer 2002;87:805-812). 그러나, 2-FDG는 2-DG에 비하여 해당 작용의 더 강력한 억제제이지만 (11, 도 2), 정상 산소 하에서 성장하는 SKBR3 세포에 비독성이고, 또한 2-DG가 해당 작용의 저지 및 ATP 생산 억제가 아닌 다른 메카니즘에 의하여 이들 세포를 사멸시킨다는 결론을 뒷받침한다.

SKBR3 세포가 만노스 유사체 2-FDM에도 민감성이라는 것을 보이는 자료는 당 유사체의 만노- 배열이 정상 산소 하에서 성장하는 선택 종양 세포 내에서의 그 독성 활성에 있어 중요하다는 것을 나타낸다. 2-DG의 2번째 탄소에서의 산소 원자의 부족은 이 화합물이 글루코스 및 만노스 유사체 양자가 되도록 하고, 반면 2-FDG 내의 플루오로 기는 이것이 글루코스 유사체만 되도록 한다. 만노-배열이 당- 유사체의 독성과 관련된다는 결론은 슈와츠가 선두에 선 그룹에 의하여 1970년대 후반에 출판된 작업에 의하여 뒷받침된다.

이 그룹은 2-DG, 2-FDG 및 2-FDM이 닭 배아 섬유 모세포 내에서의 N-결합 당화를 방해할 수 있고, 이것은 조류 흑사병 바이러스로 감염되어 글리코단백질 합성 및 바이러스성 재생산을 감소시키는 결과를 낳는다는 결과를 보인다 (Datema, R., 등, Interference With Glycosylation Of Glycoproteins, Biochem J 1979;184: 113-123; Datema, R., 등, Formation Of 2- Deoxy Glucose - Containing Lipid - Linked Oligosaccharides, Eur J Biochem 1978;90: 505-516; Datema, R., 등, Fluoro -Glucose Inhibition Of Protein Glycosylation In Vivo, Eur J Biochem 1980; 109:331-341; Schmidt, M.F.G., 등, Nucleoside - diphosphate derivatives Of 2-Deoxy-D-Glucose In Animal Cells, Eur J Biochem 1974; 49: 237-247; Schmidt, M.F.G., 등, Metabolism Of 2- Deoxy -2- Fluoro -D-[ ³ H] Glucose And 2- Deoxy -2-Fluoro-D-f H] Mannose In Yeast And Chick - Embryo Cells, Eur J Biochem 1978; 87: 55-68; McDowell, W., 등, Mechanism Of Inhibition Of Protein Glycosylation By The Antiviral Sugar Analogue 2- Deoxy -2- Fluoro -D- Mannose : Inhibition Of Synthesis Of Man ( Gicnac )2 PP - DoI By The Guanosine Diphosphate Ester, Biochemistry 1985; 24:8145-8152). 그들은 2-DG가 세포의 소포체 내의 단백질에 전달되는 지질 결합 올리고당의 회합을 억제한다고 보고하였다. 2-DG, GDP- 2DG의 대사는 올리고당 회합의 종결을 조숙시켜 단백질에 전달하기에 적절하지 않은 짧은 지질 결합 올리고당으로 유도한다고 보고하고 있다 (Datema, R., 등, Formation Of 2-Deoxy Glucose - Containing Lipid - Linked Oligosaccharides, Eur J Biochem 1978;90: 505-516). 결국, 이들 결과는 바이러스성 글리코단백질 합성을 억제하는 이들 유사체의 효능이 2-DG>2-FDM>2- FDG의 순으로서, 이는 정상 산소 하에서 성장하는 SKBR3 세포 내의 이들 유사체의 독성의 순과 비슷한 것으로 보였다 (Datema, R., 등, Fluoro - Glucose Inhibition Of Protein Glycosylation In Vivo, Eur J Biochem 1980; 109:331-341). 이들은 또한 이들 유사체의 억제 효과가 저용량의 외래성 만노스의 첨가로 역행될 수 있다는 것을 보고하였다 (Datema, R., 등, Interference With Glycosylation Of Glycoproteins, Biochem J 1979;184: 113-123). 유사하게, 2 mM 만노스는 SKBR3 세포 내의 2-DG 및 2-FDM 독성을 완전히 역행시키고, 만노스 유사체 둘다는 N-결합 당화를 방해하여 이들 세포를 사멸시킨다는 것을 보였다 (Datema, R., 등, Interference With Glycosylation Of Glycoproteins, Biochem J 1979;184: 113-123.; Datema, R., 등, Formation Of 2- Deoxy Glucose - Containing Lipid - Linked Oligosaccharides, Eur J Biochem 1978;90: 505-516; Datema, R., 등, Fluoro -Glucose Inhibition Of Protein Glycosylation In Vivo, Eur J Biochem 1980; 109:331- 341 ; Schmidt, M.F.G., 등, Nucleoside - diphosphate derivatives Of 2-Deoxy-D-Glucose In Animal Cells, Eur J Biochem 1974; 49: 237-247; Schmidt, M.F.G., 등, Metabolism Of 2- Deoxy -2- Fluoro -D-[ ³ H] Glucose And 2- Deoxy -2-Fluoro-D-[ ³ H] Mannose In Yeast And Chick - Embryo Cells, Eur J Biochem 1978; 87: 55-68; McDowell, W., 등, Mechanism Of Inhibition Of Protein Glycosylation By The Antiviral Sugar Analogue 2- Deoxy -2- Fluoro -D- Mannnose : Inhibition Of Synthesis Of Man ( Gicnac ) ₂ PP-DoI By The Guanosine Diphosphate Ester, Biochemistry 1985; 24:8145-8152).

만노스는 N-결합 당화 단백질 내의 중심 당이지만, 이것은 또한 해당 경로 내에 참가할 수 있는데, 이는 포스포만노 이성질화 효소에 의하여 프락토스-6-포스페이트로 전환될 수 있기 때문이다. 따라서, 만노스가 2-DG가 억제하는 해당 단계를 회피하여 SKBR3 세포 내의 2-DG 독성을 역행시키는 것을 가능성 있는 것으로 남겨 둘 수 있다 (도 7). 그러나, 이러한 가능성은 그리 커 보이지 않은데, 이는 2 mM 만노스가 "저산소" 모델 A 및 B 내에서 2-DG에 의하여 유도되는 증식 억제 및 세포 사멸을 역행시킬 수 없는 반면 (도 3C 및 3D 참조), 세포가 실질적으로 저산소 하에서 성장하는 모델 C에서는 미미한 회복 효과가 있었기 때문이다. 이러한 미미한 회복은 (1) 2-DG 및 2-FDM가 심지어 저산소 조건 하에서 당화를 방해하고, 및/또는 (2) 만노스가 모델 C에서 해당 작용의 억제를 역행시키는 것에 의하여 설명될 수 있으며, 이는 이들 세포가 0.5% 저산소 하에서 감소되었기는 하지만 산화성 인산화를 아직도 진행하기 때문이다. 정상 산소 하에서 이들 당 유사체에 민감성인 세포 내 (미토콘드리아가 막힌 세포 (모델 A 및 B) 내가 아님)에서 만노스에 의하여 2-DG 및 2-FDM 독성의 전체적인 역행은 해당 작용의 억제가 아닌 당화의 방해가 정상 산소 저산소의 원인이라는 것을 뒷받침한다.

N-결합 당화가 억제될 때, 단백질은 잘 접힐 수 없고, ER 내에 유지된다 (Ellgaard, L., 등, Quality Control In The Endoplasmic Reticulum, Nat Rev MoI Cell Biol 2003; 4: 181- 191 ; Parodi, AJ. , Protein Glycosylation And Its Role In Protein Folding, Annu Rev Biochem 2000; 69: 69-93). 전개된 단백질의 축적은 소기관의 확장 뿐 아니라 단백질 번역의 교란이라는 결과를 낳는다. 그러한 경우에 있어, 세포는 전개된 단백질 반응으로 알려진 복합이나 아직 보존은 아닌 신호 연쇄 반응을 개시하여, (UPR)이 ER 내에 항상성을 재건한다. 3개의 ER 막 단백질이 전개된 단백질 신호를 핵에 도입시킨다: 이노시톨 필요 효소 1 (IREl); 이중 가닥 RNA 활성 단백질 키나아제 (PERK), 및 활성 전사 요소 6 (ATF6) (Schroder, M., 등, ER Stress And Unfolded Protein Response, Mutat Res 2005; 569:29-63). 전개된 단백질이 ER 내에 축적될 때, 분자적 샤프론, 글루코스 조절 단백질 78 (Grp78/Bip)은 이들 3개의 ER 막 단백질로부터 분리되고 그에 따라 그들이 활성화된다 (Pahl, H.L., Signal Transduction From The Endoplasmic Reticulum To The Cell Nucleus, Physiol Rev 1999; 79: 683-701). 당 전달체의 상향 조절을 포함하여 수많은 대사 및 분자 변형에 있어서의 이러한 결과는, 인지질 합성, 아미노산 전달, 및 분자적 샤프론 Grp78/ Bip 및 Grp94의 발현을 증가시킨다 (Ma, Y., 등, The Unfolding Tale Of The Unfolded Protein Response, Cell 2001 ; 107: 827-830; Doerrler. W.T., 등, Regulation Of Dolichol Pathways In Human Fibroblasts By The Endoplasmic Reticulum Unfolded Protein Response, PNAS 1999; 96: 13050-13055; Breckenridge, D. G., 등, Regulation Of Apoptosis By Endoplasmic Reticulum Pathways, Oncogene 2003;22: 8608-8618).

2-DG 및 2-FDM은 정상 산소 조건 하에서 성장하는 SKBR3 세포 내의 Grp78 및 Grp94 둘다의 발현을 상향 조절하고, 이는 외래성 만노스의 첨가에 의하여 역행될 수 있는데, 이는 이들 당 유사체가 N-결합 당화를 방해하여 단백질의 전개를 유도하고 그에 의하여 UPR을 개시한다는 것을 강하게 뒷받침한다. 또한, 2-FDG는 2-DG 또는 2- FDM 중 어느 하나 보다 더 좋은 해당 작용 억제제인데, 이는 UPR 반응을 유도하는 데에 있어 그렇게 효과적이지는 않다. 이들 유사체에 대한 UPR 반응의 강도는 당화를 방해하는 정도를 반영하는 것으로 보이고, 이는 바이러스성 외피 단백질 내의 지질 결합 올리고당의 회합을 차단하는데 있어서의 2- DG>2-FDM>2-FDG를 설명하는 보고와 부합된다 (Datema, R., 등, Fluoro - Glucose Inhibition Of Protein Glycosylation In Vivo, Eur J Biochem 1980; 109:331-341; Schmidt, M.F.G., 등, Nucleoside - diphosphate derivatives Of 2- Deoxy -D- Glucose In Animal Cells, Eur J Biochem 1974; 49: 237-247; Schmidt, M.F.G., 등, Metabolism Of 2-Deoxy-2-Fluoro-D-[ ³ H] Glucose And 2- Deoxy -2- Fluoro -D-[ ³ H] Mannnose In Yeast And Chick - Embryo Cells, Eur J Biochem 1978; 87: 55-68; McDowell, W., 등, Mechanism Of Inhibition Of Protein Glycosylation By The Antiviral Sugar Analogue 2- Deoxy -2- Fluoro -D- Mannose : Inhibition Of Synthesis Of Man ( Gicnac )2 PP-DoI By The Guanosine Diphosphate Ester, Biochemistry 1985; 24:8145-8152). 또한, 이러한 UPR 자료는 세포 독성 결과와 관련되고, 이는 정상 산소 조건 하에서 SKBR3 세포의 성장 억제 및 사멸에 있어서의 2-DG>2-FDM >≫2-FDG을 유사하게 보인다.

반면, "저산소" 모델 A 및 B에서, Grp78 및 Grp94는 2-DG에 의하여 상향 조절되지는 않는데, 이는 이들 세포가 당화의 방해에 의해서가 아니라 해당 작용의 억제에 의하여 사멸되는 것을 나타낸다. UPR이 이들 모델 내에서 유도되지 않는 이유를 설명하는 가능한 메카니즘은 Grp78/Bip의 전개된 단백질에의 결합 및 그에 따라 UPR을 활성화시키는 데에 필수적인 것으로 알려진 ATP 수치에 관한 것이다. 모델 A 및 B와는 반대로, UPR는 모델 C에서는 유도되는데 (도 5B), 여기서의 ATP 수치은 2-DG에 의하여 덜 감소된다. 또한, ATP 수치에 상당한 영향을 미치지 않는 것으로 알려진 튜니카마이신은 "저산소" 모델 내에서의 차프론을 상향 조절하고 이는 이들 세포 내의 기능성 UPR 경로를 설명한다.

UPR은 p53과 매우 비슷한데, 여기서 DNA 손상은 세포 주기 정지, DNA 보수 효소의 활성, 및 이들 프로세스의 결과에 따라, 아포토시스를 신호한다. 따라서, 만약 UPR이 소포체 내의 항상성을 세우는 데 실패한다면, ER-스트레스 특정 아포토시스 경로가 활성화된다 (Breckenridge, D. G., 등, Regulation Of Apoptisis By Endoplasmic Reticulum Pathways, Oncogene 2003;22: 8608-8618). 카스파제 4, 카스파제 12, 및 CHOP/GADD154을 포함하는 아포토시스 경로의 매개체 중에, 후자의 증가된 활성은 다른 것들보다 ER-유도성 포유 동물 아포토시스 경로를 더 잘 보이는 지표로 보여 왔다 (Obeng, E. A., 등, Caspase -12 And Caspase -4 Are Not Required For Caspase - Dependent Endoplasmic Reticulum Stress - Induced Apoptosis, J Biol Chem 2005; 280: 29578-29587). 따라서, 도 6은 CHOP/GADD154 발현이 정상 산소 하에서 성장하는 SKBR3 세포 중의 2-DG 및 2-FDM 세포 독성과 관련된다는 것을 보이는 것으로, 이는 이들 당 유사체가 ER 스트레스를 유발하는 당화의 방해를 통하여 독성이라는 것을 뒷받침한다. 또한, 글루코스가 아닌 만노스의 첨가에 의한 CHOP/GADD154 유도의 역행은 2-DG 및 2-FDM이 이 메카니즘을 통하여 독성이라는 것을 뒷받침한다.

기본적인 의문은 특정 종양 세포 타입이 O₂ 존재하에서 2-DG와 처리시 사멸되는 반면, 대부분의 종양 세포 뿐 아니라 정상 세포는 그러하지 않는 이유이다. 이 질문에 대한 답은 포스포만노스 이성질화 효소가 탄수화물 결함 글리코단백질 신드롬 타입 Ib으로 설명되는 병을 앓고 있는 환자에 있어서 제거된 것으로 보인다는 유전자 연구로부터 기인한다 (Niehues, R., 등, Carbohydrate - Deficient Glycoprotein Syndrome Type Ib ., J Clin Invest 1998; 101: 1414- 1420; Freeze, H.H., Human Disorders in N- Glycosylation And Animal Models, Biochim Biophys Acta 2002; 1573:388-93). 이 효소의 제거는 혈청 글리코단백질의 저당화를 초래하고, 이는 단백질-소실 창자병증으로 특징지워지는 혈전증 및 위창자 질환을 유도한다. 이들 환자의 식이에 외래성 만노스가 첨가될 때, 그들의 혈청 글리코단백질은 정상으로 돌아오고, 그들의 증상은 사라진다 (Freeze, H. H., Sweet Solution: Sugars to the Rescue, J Cell Biol 2002; 158:615-616; Paneerselvam, K., 등, Mannose Corrects Altered N- glycosylation in Carbohydrate - Deficient Glycoprotein Syndrome Fibroblasts, J Clin Invest 1996; 97: 1478-1487). 이것은 정상 산소에서 2-DG와 처리시 사멸되는 선택 종양 세포를 외래성 만노스가 구하는 것을 보이는 본원 자료와 관련된다. 이들 타입의 종양 세포는 포스포만노스 이성질화 효소를 하향 조절하거나 결함되게 하거나, 또는 2-DG가 정상 산소 내에서 2-DG 처리에 내성인 것으로 보여지는 대부분의 다른 세포보다는 이들 종양 세포 내에서 이 효소에 효과를 미칠 수 있다. 그러나, 도 7에서 보이는 바와 같이, 2-DG 및 2-FDM이 N-결합 당화를 포함하는 만노스 대사를 억제할 수 있는 수많은 다른 단계가 있다.

2-DG, 2-CM, 및 2-FDM (2-FM)은 ER 스트레스 및 아포토시스로 이끄는 당화를 방해하여 특정 종양 타입을 사멸시킨다. 2-FDG가 이들 세포를 사멸시키지 않는다는 것의 발견은 2-DG 및 2-FDM 독성이 해당 작용의 억제 및 ATP 고갈에 기인한다는 가능성을 제거한다. 이들 제제는 선택 고형 종양을 처리함에 있어 단일 제제 치료 요법으로서 사용될 수 있다 (도 7 참조).

실시예 3

도 8 및 9는, 다중성 MTT 분석을 통해 선택된 고질의 신경아교종 세포주 및 여러 다양한 당 기재 해당 억제제에 대한 민감도를 그래프로 도시한 것이다. 다양한 조건은 정상 산소 또는 저산소 중 어느 하나에 대한 노출 및 이들 화합물에 대한 민감도에 미치는 영향을 포함하여 이용된다. 그 결과는 다양한 당 기재 해당 억제제의 상대적으로 균일한 민감도를 나타낸다 (미묘한 차이를 가짐). 저산소 조건에서 민감도에 대한 영향과 관련하여 일부 세포주에 있어서 분명한 차이가 있다. 일반적으로 대부분의 세포주는 저산소 조건에서 성장할 때 해당 억제제에 더 민감성이며, 이는 예견될 것이다. 그러나, U87 MG와 같은 일부 세포주는 락트산의 수치 (해당 작용의 대리 표지자)가 정상 산소 조건 하에서 최대이고, 저산소 조건 내에서 증가하지 않는다는 (아래의 락테이트 자료 참조) 호기성 해당 작용 표현형 (완전한 "바르부르크 효과")에 완전하게 관련되어 있다. 이러한 환경 하에서, 민감도에 있어서의 차이는 저산소 조건 하에서 성장하는 세포가 더 느리게 성장하고, 그러므로 아마도 세포에 에너지를 덜 요구하게 된다는 실험적인 관찰에 의하여 설명된다.

도 8 A는 저산소 (<1% 산소) 또는 정상 산소 (20% 산소)의 존재 하에서 2-FG로 처리된 U87 인간 뇌종양 세포주의 MTT 분석을 보인다. 도 8B 및 8C는 둘다 비슷한 실험으로 보이지만, 당 기재 해당 억제제는 상이하다. 패널 B의 경우에, 2-DG가 사용되고, 패널 C의 경우에 2-FM이 사용된다. 보여지는 바와 같이, U87은 그 대사 필요에 해당 작용을 지속적으로 이용하는 비정상적인 표현형을 보이고, 따라서 이 세포주는 저산소에서 이들 제제에 대한 증가된 민감도를 보이지 않는다.

도 9는 2-FG 또는 2-FM 중 어느 하나의 존재 하에서 6일에 걸친 성장 곡선을 보인다. 이 패널은 2-FG가 2-FM보다 약간 더 효과적인 것으로 보이는 U87 세포주의 상당한 성장 억제를 나타낸다. 패널 B 및 패널 C는 저산소 및 정상 산소 조건 모두에서 증식되는 세포주 D-54에 대한 성장 곡선의 비슷한 억제를 나타낸다. 이 경우에, 세포가 저산소 조건에서 성장할 때 분명히 효과가 증가되고, 이것은 저산소에서 이 특정 세포주에 대한 추가의 해당 대사를 자극할 수 있는 능력과 관련이 있다.

실시예 4

도 10A, 도 10B 및 11은 2-DG에 노출시키는 정상 산소 및 저산소 조건에서의 인간 U87 MG 교모세포종- 별아교세포종 세포주 (U87) 대 D-54 인간 신경아교종 세포주의 민감도에 있어서의 차이를 보인다. U87 MG 세포는 저산소 조건 또는 호기성 조건 (산화성 해당 작용 또는 "바르부르크 효과") 중 어느 하나에서 고 비율의 해당 작용을 보이고, 따라서, U87 MG 세포의 2-DG에 대한 민감도는 그들이 저산소 조건 하에서 성장시 변하지 않는다. 반면, D54 세포는 호기성 성장 조건 하에서 부분적으로 해당 대사로 변화하고, 따라서 2-DG에 대한 민감도는 이 세포주가 저산소 조건에서 성장할 때 더 크다.

도 10A 및 도 10B는 이들 2개의 세포주와 U87의 상대적 무감도 간의 상당한 차이를 보이는데, 이는 상당히 현저하다.

도 11은 U87 및 D54 간의 이러한 표현형의 차이 뒤의 이론적 근거를 보인다. 이러한 패널은 D54에 의하여 더 큰 해당 작용이 유도되는 것을 보이는 반면, U87은 이미 최대로 생산적인 락테이트 수치를 보인다.

도 10A, 도 10B 및 도 11에서 보이는 결과는 세포주를 해당 억제제로 처리할 때 저산소의 상이한 효과를 설명한다. 높은 해당적 의존성을 보이는 세포주 (U87 MG와 같은)는 해당 억제제에 대하여는 이미 최대로 민감하고, 민감도를 보이기 위하여 무산소 환경 내에 있을 것을 요하지 않는다. 이것은 U87 MG와 같은 세포주에 의한 락테이트 생산의 높고도 변하지 않는 수치에 의하여 설명되는 반면, D54는 저산소에 대한 반응에서의 그 민감도 및 락테이트 수치 둘다를 증가시킨다.

놀랍게도, 신경아교종 세포주는 저산소 조건에 상당한 내성을 보인다. 도 12에서 보이는 바와 같이, 정상 산소 조건 또는 완전한 저산소 조건 (<1%) 중 어느 하나에서 성장한 세포주는 해당 작용에 상당히 의존하는 성장을 계속하여 세포에 에너지를 요구한다.

실시예 5

2- DG 유사체 2- 플루오로 ^{1 8} - 글루코스 (2-F ¹⁸ G)의 종양 흡수의 설명 . 도 13은 일상적인 PET 스캔 연구 중 신경아교종 내에 과하게 흡수된 2-F¹⁸G를 나타낸다. 다형 교모세포종을 앓고 있는 환자의 PET 스캔은 이 종양 내로의 2-FG의 상당한 흡수를 설명한다. 패널은 CT 비조영 (A), CT 조영 (B) 및 환자에게 17 mCi 2-F¹⁸G를 준 후 CT 기록 PET 스캔을 보인다. 이러한 약물동력학적 현상은 놀랍게도 이들 종양이 당기재 해당 작용 억제제에만 독특하게 적절하다는 설명을 제공한다.

실시예 6

마우스 내의 인간 신경아교종의 처리. 인간 신경아교종의 마우스 동소 이종 이식은 2-DG 단독으로 또는 템모졸로마이드 (Temodar)와 함께 처리하였다. 이들 동물은 고질의 신경아교종의 동소 이종 이식 모델을 보인다. 이들 실험을 3회 반복하였고, 도 14에서 보이는 바와 같이 비슷한 결과를 얻었다. 동물에 U87 MG 세포를 두개내적으로 이식하고 5일 후에 음성 제어 (PBS), 양성 제어 (Temodar), 실험적 단일 제제 (2-DG) 또는 실험적 조합 (2-DG + Temodar) 중 어느 하나로 처리하였다.

도 12에 보여지는 결과는 동소 종양 모델에 대한 2-DG의 단일 제제 효능을 처음으로 설명한다. 이들 결과는 각각의 군 내의 전체 18마리로 하는 3개의 연속적인 동물 실험에서 반복되었고 일정하게 유지되었다 (자료는 제시되지 않음). 이러한 특정한 동물 모델은 매우 엄격하고, 조사되어지는 새로운 약물의 사용으로 인한 생존에 있어서 단지 수수한 증가만이 드러났다. 보이는 바와 같이, 2-DG는 뇌종양에 대하여 현재 이용할 수 있는 최적의 약물인 테모졸로마이드 (양성 제어로서)와 동등한 효과를 가진다.

놀랍게도, 2-DG는 테모다르와 동등한 효과를 보이고, 조합 치료 요법은 단일 제제 치료 요법보다 심지어 더 월등하다. 2-DG는 경구 투여되고 더 내성이 있다. 2-DG 및 테모다르가 기능적으로 균등한 것을 확인할 수 있는데, 이는 테모다르가 뇌종양 치료에 있어서 현재의 "절대 표준"이기 때문이다. 최종적으로, 단일 제제 효능은 또한 이러한 클래스의 제제에 대하여 설명되어 왔는데, 이는 이 질병에 대하여 독특한 것이다.

이들 결과는 동물의 생존을 증가시키는 해당 작용의 억제가 테모졸로마이드가 사용된 양성 제어의 그것과 유사하다는 것을 설명한다. 이러한 치료 요법은 동물에 의하여 잘 견디어지고, 어떠한 독성도 보이지 않았다. 최종적으로, 우리는 리드 후보 선택을 위한 관련 당 기재 해당 억제제 군으로부터 화합물을 선택하고 있는데, 이는 생체 외 및 생체 내 효능, 약물동력학적인 성질, 화학 물질 안정성 및 화학 물질 합성 비용에 기초할 것이다. 리드 선택에 따라, 형식적인 동물 독성 시험 뿐 아니라 더 진행하는 연구가 개시될 것이다.

본 발명 원리의 적용을 설명하기 위하여 본 발명의 특정 구체 실시 상태를 보이고 상세히 설명하였지만, 본 발명은 그 원리로부터 벗어나지 않고서 기타의 방법으로 구체화될 수 있음이 이해될 것이다.

Claims (6)

1. 교모세포종의 치료를 필요로 하는 환자에게 6탄당 화합물의 치료학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 것인 교모세포종의 치료 방법.
2. 췌장암의 치료를 필요로 하는 환자에게 6탄당 화합물의 치료학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 것인 췌장암의 치료 방법.
3. 종양 증식의 치료를 필요로 하는 환자에게 2-FM의 치료학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 것인 종양 증식의 치료 방법.
4. 췌장암의 치료를 필요로 하는 환자에게 만노스 화합물의 치료학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 것인 췌장암의 치료 방법.
5. 뇌암의 치료를 필요로 하는 환자에게 만노스 화합물의 치료학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 것인 뇌암의 치료 방법.
6. 6탄당 화합물의 치료학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 것인, 췌장암 및 교모세포종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 효과를 환자에게 달성하는 방법.