KR20080083105A - 아이코사노이드 대사의 조절 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아이코사노이드 대사 과정의 조절을 필요로 하는 동물의 세포 내에서의 아이코사노이드 대사 과정의 조절 방법에 관한 것으로, 아이코사노이드 옥시게나아제(oxigenase)의 활성 조절에 효과적인 상당한 양의 발명 조성물을 동물에게 투여하는 것을 포함한다. 특히, 본 발명은 리폭시게나아제 및 시클로옥시게나아제의 활성 조절에 효과적인 상당한 양의 발명 조성물을 투여하여 아라키돈산) 대사를 조절하기 위한 방법에 관한 것이다.

아이코사노이드, 암, 옥시게아아제

Description

아이코사노이드 대사의 조절 방법{METHODS FOR MODULATING EICOSANOID METABOLISM}

본 출원은 2005년 6월 14일에 출원된 미국 가출원 번호 60/690,161 및 2006년 4월 17일에 출원된 미국 가출원 번호 60/792,330의 이익을 청구한다. 이로써 그들의 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조 인용된다.

본 발명은 아이코사노이드 대사 과정의 조절을 필요로 하는 동물 세포 내에서의 아이코사노이드 대사 과정(metabolic process)의 조절 방법에 관한 것으로, 아이코사노이드 옥시게나아제(oxigenase)의 활성 조절에 효과적인 상당한 양의 발명 조성물을 동물에게 투여하는 것을 포함한다. 특히, 본 발명은 리폭시게나아제(lipoxygenase) 및 시클로옥시게나아제(cyclooxygenase)의 활성 조절에 효과적인 상당한 양의 발명 조성물을 투여하여 아라키돈산(arachidonic acid) 대사를 조절하기 위한 방법에 관한 것이다.

암, 예를 들어 전립선암(prostate cancer) 등의 초기 진단 및 치료가 향상되고 있으나, 전립선암은 여전히 가장 흔한 악성 종양으로, 미국에서 사망과 관련된 남성 암 중에서 두번째로 손꼽힌다. 이 질병의 더욱 흥미로운 점은, 잠복성 전립선 암이 아시아 및 미국 남성에게 동일한 비율로 발생하는 데 반해, 임상적으로 의미 있는 전립선암의 발병률(incidence)은 아시아에서 보다 미국에서 더욱 크다는 것이다. 이러한 불일치는 상이한 집단들의 음식물 섭취(dietary intake)와 관련된 것이라고 할 수 있는 여러가지 근거들이 있고, 이러한 관찰은 전립선암의 진행에 영향을 줄 수 있는 다양한 식이 요법의 요소들에 대한 광범위한 연구를 고취시켰다. 몇몇의 전염병학적 연구들은 전형적인 서양식 식이 요법은 전립선 암의 위험성을 상승시키는 고지방 식이 요법인 것에 비하여, 아시아의 식이 요법에서는 더욱 낮은 지방을 섭취하는 것에 기인한 것 중 일부일 것이라고 한다.

발명자들은 발명 조성물의 투여가, 골수성 백혈병(myeloid leukemia) KBM-5 세포에서 TNF-유도(induced) NF-κB 활성화(activation) 및 폐선암(lung adenocarcinoma) H1299 세포에서 담배 연기 응축물(cigarette smoke condensate)-유도 NF-κB 활성화를 억제한다는 것을 발견하였다. 또한, 발명 조성물의 투여는 TNF-유도 세포 침입(invasion) 및 폐기된(abrogate) RANKL-유도 파골세포형성(osteoclastogenesis)의 억제를 야기한다. 나아가, 발명 조성물의 투여는 다양한 항세포자살(antiapoptotic), 증식성(proliferative), 및 전이 유전자 생성물(metastasis gene product)의 TNF-유도 발현을 억제한다.

본 발명의 개요

본 발명은 아이코사노이드 대사 과정의 조절을 필요로 하는 동물의 세포 내에서의 아이코사노이드 대사 과정의 조절 방법에 관한 것으로, 아이코사노이드 옥시게나아제(oxigenase)의 활성 조절에 효과적인 상당한 양의 발명 조성물을 동물에게 투여하는 것을 포함한다. 이 때, 상기 조성물은 로즈마리(rosemary), 터메릭(turmeric), 오레가노(oregano) 및 생강(ginger)의 초임계 추출물(supercritical extract)의 치료학적 유효량을 포함하고; 상기 조성물은 홀리 바질(holy basil), 생강, 터메릭, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스(Scutellaria baicalensis), 로즈마리, 녹차, 감제풀(huzhang), 중국산 황련(Chinese goldthread), 및 바베리(barberry)의 수알코올 추출물(hydroalcoholic extract)의 치료학적 유효량을 포함한다.

나아가, 본 발명은 13-S-HODE의 전달을 필요로하는 동물에게의 13-S-HODE의 전달 방법을 제공하되, 로즈마리, 터메릭, 오레가노 및 생강의 초임계 추출물의 치료학적 유효량; 및 홀리 바질, 생강, 터메릭, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스, 로즈마리, 녹차, 감제풀, 중국산 황련, 및 바베리의 수알코올 추출물의 치료학적 유효량을 포함하는 조성물을 동물에게 투여하는 것을 포함한다.

부가적으로, 본 발명은 아라키돈산-매개 염증의 억제를 필요로 하는 동물에 아라키돈산-매개 염증의 억제 방법을 제공하되, 로즈마리, 터메릭, 오레가노 및 생강의 초임계 추출물의 치료학적 유효량; 및 홀리 바질, 생강, 터메릭, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스, 로즈마리, 녹차, 감제풀, 중국산 황련, 및 바베리의 수알코올 추출물의 치료학적 유효량을 포함하는 조성물을 동물에게 투여하는 것을 포함한다.

또한, 본 발명은 NF-κB-조절 유전자 생성물의 레벨 조절을 필요로 하는 동물의 세포내의 NF-κB-조절 유전자 생성물의 레벨 조절 방법을 제공하되, 로즈마리, 터메릭, 오레가노 및 생강의 초임계 추출물의 치료학적 유효량; 및 홀리 바질, 생강, 터메릭, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스, 로즈마리, 녹차, 감제풀, 중국산 황련, 및 바베리의 수알코올 추출물의 치료학적 유효량을 포함하는 조성물을 동물에게 투여하는 것을 포함한다.

발명의 상세한 설명

정의

"조절(modulating)"은 유기체의 일반적인 건강 및 웰빙(well-being)에 적합한 방식으로 생물학적 활성, 기능, 건강, 또는 건강 상태 등을 유지, 강화, 감소, 또는 치료하는 것 등과 같은 유기체의 생물학적 활성, 기능, 건강, 또는 건강 상태에 영향을 주는 과정을 지칭한다.

유기체의 생물학적 활성, 기능, 건강, 또는 건강 상태의 "강화(enhancing)"는 증가(augmenting), 강화(fortifying), 증강(strengthening), 또는 개선(improving) 등의 과정을 지칭한다.

"아이코사노이드(eicosanoid)"는 아라키돈산 및 리놀렌산(linolenic acid) 등과 같은 고도불포화 지방산(polyunsaturated fatty acid)에서 유래하며, 세포 활성과 연관된 화합물의 어떤 종류를 지칭한다.

"옥시게나아제"는 산소 분자가 그것의 기질(substrate)로 병합되는 것을 촉진시키는 임의의 클래스의 효소를 지칭한다.

본 명세서에 사용된 "초임계 가스(supercritical gas)" 또는 "초임계 유체(supercritical fluid)"는 임계 온도 이상에서는 압력에 상관없이 가스가 자신의 가스 상태를 유지하면서 액체로 전환되지 않는 임계 온도까지 가열된 가스를 지칭한다. 자신의 임계점을 넘는 온도로 가열된 가스는 압축으로 매우 고밀도가 될 것이므로, 그것의 특성은 유체와 유사하지만 액체로 되지는 않는다. 초임계 유체를 필요로하는 응용에서는 일반적으로 이산화탄소(carbon dioxide)를 사용한다. 추출 과정에서 초임계 유체의 일반적인 특징 및 초임계 유체의 일반적인 사용은, 예를 들어 Taylor, Supercritical Fluid Extraction, Wiley, 1996; McHugh and Krukonis, Supercritical Fluid Extraction: Principles and Practice, 2nd ed., Butterworth-Heinemann, 1994; 및 Williams and Clifford, Supercritical Fluid Methods and Protocols, Humana Press, 2000, 등에 개시되어 있으며, 그 내용은 본 명세서에 참조 인용된다.

발명자들은 허브 추출물(herbal extract)을 포함하는 혼합물을 개발하였으며, 상기 혼합물은 COX-2 억제 활성을 가진다. 발명자들의 조성물은 조성물의 몇몇 성분들을 초임계 CO2 추출 과정을 통해 제조했다는 점에서 독특하다. 추출 방법에 기초한 종래의 용제와는 달리, 초임계 CO₂ 추출은 제조 후에 남겨지는 화학적 잔류물 없이 허브 내의 천연 생산물을 수득할 수 있도록 한다.

"초임계 추출"은 초임계 유체를 이용하여 시료들로부터 소수성 화합물(hydrophobic compound)을 추출할 수 있는 기법을 지칭한다. 압력 및 온도가 소수성 분자의 분리에 효과적인 용제를 제공하는 임계점을 넘어 증가함에 따라, 초임계 유체의 용매화(salvation) 능력은 감소된다. "초임계의 추출물"은 초임계의 추출에 의해 제조된 추출물들을 지칭한다.

"수알코올 추출(hydroalcoholic extraction)"은 용액을 증발시켜 용해된 고체로 이루어진 추출물을 생산함으로써, 알코올 및 물의 용액을 이용하여 시료에서 친수성 화합물(hydrophilic compound)을 추출할 수 있는 기법을 지칭한다. "수알코올 추출물"은 수알코올 추출에 의해 제조된 추출물들을 지칭한다.

"13-S-HODE"는 13-하이드록시옥타데카-9Z,11E-디엔산(13-hydroxyoctadeca-9Z,11E-dienoic acid)을 지칭한다.

"NF-κB" 또는 "핵 인자 카파 B(nuclear factor kappa B)"는 유전자 발현과 연관된 복합서브유닛 전사 인자(multisubunit transcription factor) 인자를 지칭한다. 활성 NF-κB는 REL 패밀리(family)/p65 서브유닛 및 p50 또는 p52 서브유닛의 이합체(dimer)로 이루어진다. NF-κB는 그것의 억제제 IκB와의 상호 작용을 통해 세포질(cytoplasm)내에서 유지되나, 해리 시에는 핵 내로 이동한다.

발명 조성물

발명 조성물은 항증식성, 항염증, 산화방지제(antioxidant), 항-혈관생성(anti-angiogenic), 및 세포자살 활성(apoptotic activity)을 보이는 성분을 포함하는 폴리 허브(polyherbal) 조제약의 한 종류이다. 발명 조성물은 로즈마리, 터메릭, 오레가노 및 생강의 초임계 추출물의 치료학적 유효량; 및 홀리 바질, 생강, 터메릭, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스, 로즈마리, 녹차, 감제풀, 중국산 황련, 및 바베리의 수알코올 추출물의 치료학적 유효량을 포함한다.

이러한 관점에서, 활성 조성물은 다음을 포함한다.

(A) 생강의 수알코올 추출물 약 4.5중량% 내지 약 7.5중량%, 더욱 바람직하게는 약 5.5중량% 내지 약 6.5중량%;

(B) 생강의 초임계 추출물 약 5.5중량% 내지 약 8.5중량%, 더욱 바람직하게는 약 6중량% 내지 8중량%;

(C) 터메릭의 초임계 추출물 약 1.0중량% 내지 약 1.5중량%, 더욱 바람직하게는 약 1.2중량% 내지 약 1.4중량%;

(D) 로즈마리의 초임계 추출물 약 10.0중량% 내지 약 16.0중량%, 더욱 바람직하게는 약 11.5중량% 내지 약 14.5중량%;

(E) 오레가노의 초임계 추출물 약 4.0중량% 내지 약 6.0중량%, 더욱 바람직하게는 약 4.5중량% 내지 약 5.5중량%;

(F) 터메릭의 수알코올 추출물 약 10.0중량% 내지 약 16.0중량%, 더욱 바람직하게는 약 11.5중량% 내지 약 14.5중량%;

(G) 로즈마리의 수알코올 추출물 약 5.5중량% 내지 약 8.0중량%, 더욱 바람직하게는 약 6.0중량% 내지 약 7.0중량%;

(H) 홀리 바질의 수알코올 추출물 약 10.0중량% 내지 약 16.0중량%, 더욱 바람직하게는 약 11.5중량% 내지 약 14.5중량%;

(I) 녹차의 수알코올 추출물 약 10.0중량% 내지 약 16.0중량%, 더욱 바람직하게는 약 11.5중량% 내지 약 14.5중량%;

(J) 감제풀의 수알코올 추출물 약 8.0중량% 내지 약 12.0중량%, 더욱 바람직하게는 약 9.0중량% 내지 약 11.0중량%;

(K) 중국산 황련의 수알코올 추출물 약 4.0중량% 내지 약 6.0중량%, 더욱 바람직하게는 약 4.5중량% 내지 약 5.5중량%;

(L) 바베리의 수알코올 추출물 약 4.0중량% 내지 약 6.0중량%, 더욱 바람직하게는 약 4.5중량% 내지 약 5.5중량%; 및

(M) 스쿠텔라리아 바이칼렌시스의 수알코올 추출물 약 2.0중량% 내지 약 3.0중량%, 더욱 바람직하게는 약 2.25중량% 내지 약 2.75중량%.

선택적으로, 본 발명에서 사용된 생강, 로즈마리, 터메릭, 또는 오레가노의 수알코올 추출물은 다음과 같이 제조될 수 있다. 바람직하게는 극저온으로 빻아 열에 민감한 요소들을 보존한 식물 또는 그것의 일부를 바람직하게는 이산화탄소를 이용한 초임계의 추출에 적용하여, "초임계 추출물"로 지칭되는 기름(oil) 추출물을 수득할 수 있다. 추가적인 선택적 실시예에서는, 오일-프리(oil-free) 잔류물을 첫번째 단계에서 분리하고, 그리고 나서 60 내지 80 부(part)의 알코올 및 40 내지 20 부의 물을 포함하는 물/알코올, 바람직하게는 물/에탄올 혼합물에서 추출한다. 그리고 나서, 상기 알코올/물 액체를 "수알코올 추출물"로 지칭되는 분말화된 추출 잔류물을 남기고 증발시킨다.

본 발명에서 선택적으로 사용되는 생강, 로즈마리, 터메릭 및 오레가노의 초임계 추출물들은 예를 들어, E. Stahl, K. W. Quirin, D. Gerard, Dense Gases for Extraction and Refining, Springer Verlag 4 1988,에 개시된 바와 같은 이미 알려진 초임계 추출에 따라 제조될 수 있으며, 그 내용은 본 명세서에 참조 인용된다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 생강의 수알코올 추출물에 대한 생강의 초임계 추출물의 중량비는 약 0.8:1 내지 약 1.4:1일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 로즈마리, 터메릭, 홀리 바질, 녹차, 감제풀, 중국산 황련, 바베리 및 스쿠텔라리아 바이칼렌시스의 수알코올 추출물은 종래의 수알코올 추출 기법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 수알코올 추출물들은 바람직하게는 60 내지 80 부의 알코올 및 40 내지 20 부의 물을 포함하는 물/알코올, 바람직하게는 물/에탄올 혼합물에서 식물(plant) 부분을 추출하고, 그리고 나서 상기 알코올/물 액체를 "수알코올 추출물"로 지칭되는 분말화된 추출 잔류물을 남기고 증발시킨다.

본 발명의 다른 실시예에 있어서, 터메릭의 초임계 추출물에 대한 터메릭의 수알코올의 중량비는 약 8:1 내지 약 12:1일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 로즈마리의 초임계 추출물에 대한 로즈마리의 수알코올의 중량비는약 1.6:1 내지 약 2.4:1일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 생강의 수알코올 추출물은 펀전트(pungent) 화합물 약 2.4중량% 내지 약3.6중량%를 포함하되, 더욱 바람직하게는 약 2.7중량% 내지 약 3.3중량%, 가장 바람직하게는 약 3.0중량%일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 생강의 초임계 추출물은 바람직하게는 펀전트 화합물 약 24중량% 내지 약36 중량%를 포함하되, 더욱 바람직하게는 약 27 중량% 내지 약 33 중량%, 가장 바람직하게는 약 30 중량%; 및 진저베렌(zingiberene) 약 6.4 중량% 내지 약9.6 중량%를 포함하되, 더욱 바람직하게는 약 7.2 중량% 내지 약 8.8 중량%, 가장 바람직하게는 약 8 중량%를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 터메릭의 초임계 추출물은 투메론(turmerone) 약 36 중량% 내지 약 54 중량%를 포함하되, 더욱 바람직하게는 약 40.5 중량% 내지 약 49.5 중량%, 가장 바람직하게는 약 45 중량%를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 로즈마리의 초임계 추출물은 전체의 페놀 산화방지제 약 18.4 중량% 내지 약 27.6 중량%를 포함하되, 더욱 바람직하게는 약 20.7 중량% 내지 약 25.3 중량%, 가장 바람직하게는 23 중량%를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 오레가노의 초임계 추출물은 전체의 페놀 산화방지제 약 4.0 중량%보다 더 큰 값을 포함하되, 더욱 바람직하게는 약 4.5 중량% 내지 약 5.5 중량%, 가장 바람직하게는 약 5.0 중량%를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 터메릭의 수알코올 추출물은 커큐민(curcumin) 약 5.6 중량% 내지 약 8.4 중량%를 포함하되, 더욱 바람직하게는 약 6.3 중량% 내지 약 7.7 중량%, 가장 바람직하게는 약 7 중량%를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 로즈마리의 수알코올 추출물은 전체의 페놀 산화방지제 약 18.4 중량% 내지 약 27.6 중량%를 포함하되, 더욱 바람직하게는 약 20.7 중량% 내지 약 25.3 중량%를, 가장 바람직하게는 약 23 중량%를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 홀리 바질의 수알코올 추출물은 우르솔산(ursolic acid) 약 1.6 중량% 내지 약 2.4 중량%를 포함하되, 더욱 바람직하게는 약 1.8 중량% 내지 약 2.2 중량%를, 가장 바람직하게는 2 중량%를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 녹차의 수알코올 추출물은 폴리페놀(polyphenol) 약 36 중량% 내지 약 54 중량%를 포함하되, 더욱 바람직하게는 약 40.5 중량% 내지 약 49.5 중량%를, 가장 바람직하게는 약 45 중량%를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 감제풀의 수알코올 추출물은 리저바트롤(reservatrol) 약 6.4 중량% 내지 약 9.6 중량%을 포함하되, 더욱 바람직하게는 약 7.2 중량% 내지 약 8.8 중량%를, 가장 바람직하게는 약 8 중량%를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 중국산 황련의 수알코올 추출물은 베르베린(berberine) 약 4.8 중량% 내지 약 7.2 중량%를 포함하되, 더욱 바람직하게는 약 5.4 중량% 내지 약 6.6 중량%를, 가장 바람직하게는 약 6 중량%를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 바베리의 수알코올 추출물은 베르베린 약 4.8 중량% 내지 약 7.2 중량%를 포함하되, 더욱 바람직하게는 약 5.4 중량% 내지 약 6.6 중량%를, 가장 바람직하게는 약 6 중량%를 포함할 수 있다.

또 다른 실시예에 있어서, 상기 조성물은 다음을 포함한다.

(A) 생강의 수알코올 추출물 약 4.5 중량% 내지 약 7.5 중량%로, 상기 추출물은 펀전트 화합물 약 2.4 중량% 내지 약 3.6 중량%;

(B) 생강의 초임계 추출물 약 5.5 중량% 내지 약 8.5 중량%로, 상기 추출물은 펀전트 화합물 약 24 중량% 내지 약 36 중량%, 및 진저베렌 약 6.4 중량% 내지 약 9.6 중량%;

(C) 터메릭의 초임계 추출물 약 1.0 중량% 내지 약 1.5 중량%로, 상기 추출물은 투메론 약 36 중량% 내지 약 54 중량%;

(D) 로즈마리의 초임계 추출물 약 10.0 중량% 내지 약 16.0 중량%로, 상기 추출물은 전체의 페놀 산화방지제 약 18.4 중량% 내지 약 27.6 중량%;

(E) 오레가노의 초임계 추출물 약 4.0 중량% 내지 약 6.0 중량%로, 상기 추출물은 전체의 페놀 산화방지제 약 4.0 중량%이상;

(F) 터메릭의 수알코올 추출물 약 10.0 중량% 내지 약 16.0 중량%로, 상기 추출물은 커큐민 약 5.6 중량% 내지 약 8.4 중량%;

(G) 로즈마리의 수알코올 추출물 약 5.5 중량% 내지 약 8.0 중량%로, 상기 추출물은 전체의 페놀 산화방지제 약 18.4 중량% 내지 약 27.6 중량%;

(H) 홀리 바질의 수알코올 추출물 약 10.0 중량% 내지 약 16.0 중량%로, 상기 추출물은 우르솔산 약 1.6 중량% 내지 약 2.4 중량%;

(I) 녹차의 수알코올 추출물 약 10.0 중량% 내지 약 16.0 중량%로, 상기 추출물은 폴리페놀 약 36 중량% 내지 약 54 중량%;

(J) 감제풀의 수알코올 추출물 약 8.0 중량% 내지 약 12.0 중량%로, 상기 추출물은 리저바트롤 약 6.4 중량% 내지 약 9.6 중량%;

(K) 중국산 황련의 수알코올 추출물 약 4.0 중량% 내지 약 6.0 중량%로, 상기 추출물은 베르베린 약 4.8 중량% 내지 약 7.2 중량%;

(L) 바베리의 수알코올 추출물 약 4.0 중량% 내지 약 6.0 중량%로, 상기 추출물은 베르베린 약 4.8 중량% 내지 약 7.2 중량%; 및

(M) 스쿠텔라리아 바이칼렌시스의 수알코올 추출물 약 2.0 중량% 내지 약 3.0 중량%;

그리고 상기 조합물은 다음을 더 포함한다.

(ⅰ) 수알코올 추출물 1 중량부 당 초임계 추출물 약 0.8 내지 약 1.4 중량부의 생강의 초임계 추출물 및 생강의 수알코올 추출물;

(ⅱ) 초임계 추출물 1 중량부 당 수알코올 추출물 약 8 내지 약 12 중량부의 터메릭의 수알코올 추출물 및 터메릭의 초임계 추출물; 및

(ⅲ) 수알코올 추출물 1 중량부 당 초임계 추출물 약 1.6 내지 약 2.4 중량부의 로즈마리의 초임계 추출물 및 로즈마리의 수알코올 추출물.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 조성물은 항종양성 약품, 성장 억제제, 및 영양제로 이루어진 군으로부터 선택된 부가적인 약품을 포함한다.

본 발명의 방법에서 사용된 것으로 비활성 성분을 제외하고 경구 투여된 조성물의 일 실시예를 표 1에 나타내었다. 표 1에서 인용된 양(amount)은 나열된 성분들의 적절한 투여량을 나타낸다.

표 1

허브	추출물의 종류	식물의 부분	양( mg )
로즈마리	초임계	잎	100
로즈마리	수알코올(23% TPA 34.5 mg)	잎	50
터메릭	초임계(45% 투메론 4.5 mg)	뿌리줄기	10
터메릭	수알코올(7% 커큐민 7 mg)	뿌리줄기	100
생강	초임계 (30% 펀전트 화합물 16.2 mg 8% 진저베렌)	뿌리줄기	54
생강	수알코올(3% 펀전트 화합물)	뿌리줄기	46
홀리 바질	수알코올(2% 우르솔산 2 mg)	잎	100
녹차	수알코올(45% 폴리페놀 45 mg)	잎	100
감제풀	수알코올(8% 리저바트롤 6.4 mg)	뿌리 및 뿌리줄기	80
중국산 황련	수알코올(6% 베르베린)	뿌리	40
바베리	수알코올(6% 베르베린 2.4 mg)	뿌리	40
오레가노	초임계(≥4.0% TPA 1.8 mg)	잎	40
스쿠텔라리아 바이칼렌시스	수알코올(5:1)	뿌리	20

바람직하게는 표 1에 나타낸 조성물은 또한 엑스트라 버진 올리브 오일(extra virgin olive oil) 및 황색 밀랍(yellow beeswax)을 포함한다.

본 발명의 방법

본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은, 일반적으로 동양의 식이 요법에서 전형적으로 소비되는 식물 제품(생강, 로즈마리, 터메릭 뿌리, 홀리 바질, 녹차, 감제풀, 중국산 황련, 바베리, 오레가노, 및 바이칼 황금(Baikal skullcap))으로부터, 표준화된 초임계의 CO₂ 농축 추출물을 포함한다.

인간 PC3 세포에 대한 발명 조성물의 항증식성 효과에 대하여 조사하고, 전립선암 세포계에서 아이코사노이드 대사에 대한 그들의 효과를 구체적으로 분석하였다. 발명 조성물을 관찰하여 PGE2 형성의 경우보다 더욱 큰 5-HETE 생산 억제와 함께, 복제된 COX-1, COX-2 및 5-LOX 활성의 농도-의존성 억제를 유도하였다.

손상되지 않은(intact) PC3 세포에 대한 적용에서, 발명 조성물이 12-LOX 활성에 대항하여 가장 잠재성이 있고, 다음으로 5-LOX, 및 그 다음 COX 임을 발견하였다. 놀랍게도, PC3 세포에서의 13-S-HODE의 출현은 아닌, 발명 조성물 자체에서의 상기 아이코사노이드의 존재에 기인한 것이며, 15-LOX 활성 세포 내의 15-LOX 자극에 기인한 것은 아니었다. 아넥신V 및 포스파티딜 이노시톨(phosphatidyl inositol)을 이용한 PC3 세포의 유동 세포 측정 염색에 의해 증명된 것처럼, PC3 세포 증식의 농도 의존성 억제는 세포 주기의 선택적 G2/M 정지(arrest) 및 세포자살의 유도과 연관되어 있었다.

또한, 발명 조성물은, 비록 고농도에서의 COX-2 발현의 상방 제어를 언급하였지만, 5-LOX 및 12- LOX 발현의 농도-의존성 하방 제어를 야기하였다. 몇몇의 세포 신호 형질도입 단백질(cell signal transduction protein)들의 인산화반응(phosphorylation) 상태를 측정하였다. 발명 조성물은 p21 인산화반응을 증가시켰으나, Rb 및 STAT1 단백질의 인산화반응은 하방 제어하였다. pRb 단백질의 감소는 세포 내 12-HETE 레벨의 감소 및 12-LOX 억제에 기인한 것으로 나타났다. 발명 조성물로 처리된 세포에 12-HETE를 첨가하는 것은 발명 조성물의 능력을 극복하여 세포 증식을 억제하였고, 이와 함께 12-HETE는 발명 조성물의 능력을 막아 Rb 단백질의 인산화반응을 하방 제어하였다.

발명 조성물을 이용한 인간 전립선암 세포 증식의 효과적인 조절은 복합적인-메커니즘이라고 할 수 있으나, 부분적으로 12-LOX와 같은 변종 종양 세포 아이코사노이드 대사의 조절, 그것의 인산화반응 상태의 조절을 통한 Rb 종양 억제 단백질 기능의 회복, 뿐만 아니라 13-(S)-HODE 등의 식물에서 비롯된 아이코사노이드 생산물의 응용과 관련된다고 할 수 있다.

나아가, 또 다른 실험들은 상기 조성물이 시클로옥시게나아제(복제된 COX-1 및 COX-2) 활성의 강력한 억제를 나타낸 것에 반하여, 상기 생성물에 의해 유도된 인간 전립선 종양 세포 성장을 감소시키는 능력은 대부분 COX-2 독립적 메커니즘에 기인한 것이라고 판단할 수 있는 증거가 되었다. 세포 및 조직 내의 복합적인 아이코사노이드를 동시에 측정하는 LC/MS/MS에 기초한 방법을 이용하여, 상기의 독특한(unique) 허브 조성물에 의해 생성된 세포 및 조직 내의 아이코사노이드 대사의 변화를 조사하였다.

세포 내(intracellular) PGE2, 5-HETE뿐만 아니라 12-HETE의 내생 레벨(endogenous level)은 조성물에 대한 노출에 대하여 농도-의존성 방식으로 감소하였다. 대조적으로, 15-HETE 및 13-HODE의 세포 레벨(cellular level)은 상승하였다. 상술한 바와 같이, 13-HODE의 상승은 극적(dramatic)이었으나, 허브 조성물 자체 내 고함량의 13-HODE가 존재하였기 때문이며, 이렇게 중요한 아이코사노이드의 세포 세대(generation)에 의존적이지 않았다. 종양 세포 배지에 출처가 분명한 13-HODE를 첨가함으로써 독립적으로 증명한 종양 세포 성장의 억제를 설명하기에 매우 충분하도록 13-HODE 레벨을 고려하였다.

인간 종양 세포(PC3 전립선 암 세포)의 발명 조성물에 대한 노출은 또한 5-LOX 발현의 하방 제어를 야기하였으며, 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다. 아라키돈산 매개 마우스 귀 염증을 차단하는 발명 조성물의 능력을 평가하였다. 발명 조성물은 LTB4 합성을 현저히 억제하였고, 15-HETE 생산을 상방 제어하였다.

따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 동물 세포에서 아이코사노이드 대사 과정의 조절 방법은 아이코사노이드 옥시게나아제의 활성을 효과적으로 조절하는 상당한 양의 조성물을 동물에게 투여하는 것을 포함하되, 상기 조성물은 로즈마리, 터메릭, 오레가노 및 생강의 초임계 추출물의 치료학적 유효량; 및 홀리 바질, 생강, 터메릭, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스, 로즈마리, 녹차, 감제풀, 중국산 황련, 및 바베리의 수알코올 추출물의 치료학적 유효량을 포함한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 세포는 암세포일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 암 세포는 전립선암 세포, 유방암 세포, 폐암 세포, 결장암 세포, 또는 이들의 조합을 포함한다.

본 발명의 다른 실시예에 있어서, 아이코사노이드 대사 과정은 암, 암 세포 증식, 암 세포 전이, 암 세포 침투, 암 세포-변형 혈관 생성, 암 세포-변형 세포자살 억제, 또는 이들의 조합에 대한 세포 변형과 관련된 변종적인 대사이다.

아이코사노이드 대사. 아라키돈산 및 그 전구체(precursor), 리놀레산(linoleic acid), 및 리놀렌산은, 일반적으로 동양의 식이 요법에 비해 전형적인 서양의 식이 요법에서 더 많은 양을 소비하는 것으로 생각되는 동물 지방(animal fat) 및 다양한 식물성 기름에 존재한다. 이러한 지방산들의 섭취 증가는, 아라키돈산 등의 아이코사노이드를 프로스타글란딘(prostaglandin), 류코트리엔(leukotriene), 리폭신(lipoxin), 13-S-HODE, 5-HETE, 및 12-HETE과 같은 신호 물질로 전환시키는 효소인 리폭시게나아제(LOX) 및 시클로옥시게나아제(COX)과 같은 옥시게나아제에 대한 기질 효용성을 증가시킨다. 또한, 수많은 중요한 생물학적 경로에서 2차 전달자(messenger)로서의 매우 중요한 역할외에도, 아이코사노이드 대사의 이러한 생산물들은 모든 방면의 종양 발달, 진행, 증식, 및 전이와 관련되어 있다.

리폭시게나아제 및 아이코사노이드 대사. 리폭시게나아제 효소(LOX)는 세포 내에서의 세포 생존(survival) 및 세포 자살(apoptosis)의 주요 조절자로 알려져있다. 이들은 아라키돈산 산화의 국부적인 특이성 관점에서 분류된 지질 과산화 효소의 이종 패밀리(heterogeneous family)를 구성한다. LOX는 5-, 8-, 12-, 및 15-LOX 아이소폼(isoform)으로 지칭되어 왔으며, 이들은 5(S)-, 8(S)-, 12(S)-, 및 15(S)-HETE로 알려진 최종 생성물을 생성한다. 이전에 발표된 기법들을 이용하여 PC3 세포의 COX 및 LOX 대사의 LC/MS/MS 분석에 대한 응용에 착수하였다. 기대했던 바와 같이, 그 결과는 발명 조성물들이 효소 활성이 복제된 COX-1 및 COX-2 모두에 대한 억제제임을 나타내었다. 게다가, 그것은 또한 복제된 5-LOX 활성을 억제하였고, 사실상 COX 억제제로서 보다는 5-LOX 억제제로서 더욱 강력하였다. 배지에서 PC3 세포에 대한 처리는, COX의 억제를 통한 PGE2 형성을 방지하는 발명 조성물의 능력이 5-LOX를 방지하는 능력보다 낮았고, 따라서 이것은, 이번에는 인간 전립선암의 증식 및 전이에서 중요한 효소로 알려진 12-LOX의 발명 조성물-매개 억제보다 낮다는 점을 나타내었다.

12- HETE . 증거의 몇몇 계통(line)들은 이제 암 세포 발달의 조절자(regulator)로서 12-LOX를 명백하게 포함한다. 특히, K. Honn 실험실은 인간 전립선 암내의 혈소판(platelet) 타입 12-LOX 및 그것의 생산물인 12(S)-HETE의 역할을 이해하는데 크게 공헌하였다. 예를 들어, 그들은 몇몇의 전립선 암 세포계에서 12-LOX가 발현되고, 바이칼레인(baicalein) 또는 BHPP와 같은 12-LOX 억제제는 전립선 종양 전이를 상당히 억제하며, 12-LOX 레벨은 인간 전립선 종양의 혹독성(severity) 및 진행도(grade)와 관련된다는 것을 보고하였다. 또한 최근 이 그룹의 훌륭한 보고에서는 전립선 세포 성장 및 증식의 바이칼레인 억제는 특이적으로 12-LOX 억제와 관련되고, 12-HETE의 감소는 인산화된 Rb 단백질의 손실과 관련된다는 것을 나타내었다. 이번에는, RB의 감소된 인산화반응은, RB 단백질이 DNA 합성에서 요구되는 전사 인자와 결합된 채로 남도록하여, 암 세포 증식의 억제를 유도한다.

초기 단계의 전립선암과 같은 암과 관련된 염증과 연관된 생활성(bioactive) 지질이 많이 있다. 이들은 문서에 의해 충분히 입증된 PGE₂의 종양 세포 증식을 자극하는 능력을 포함한다. 이것은 전형적으로 종양 내 COX-2의 과발현뿐만 아니라 더욱 최근에 발견된 PGE2의 대사를 유발하는 효소인 PGDH 활성 감소를 통해 일어난다. 5-리폭시게나아제로부터의 5-HETE 및 12-리폭시게나아제로부터의 12-HETE와 같은 리폭시게나아제 생산물은 또한 전립선 종양 세포 증식을 특이적으로 유도하는 것으로 보였다. 12-HETE가 전립선암 증식, 전이 및 혈관 생성과 연관된 것으로 보이기 때문에, 전립선암의 치료에서 12-LOX의 억제는 잠재적인 치료학적 접근을 대표한다는 제안이 최근 발생하고 있다. 또 다른 아이코사노이드는, 예를 들어 15-LOX-1의 생산물인 13-S-HODE, 및 15-LOX-2의 생산물인 15-HETE 등은, 암, 특히 전립선암에서 신호전달에 대한 저지 효과를 수행하는 것으로 보이며, 사실, 그들의 효과에서는 종양 타입 선택적일 수 있다.

악성 질환으로 향하는 조직 염증의 진행에서 선택된 생활성 아이코사노이드의 역할을 이해하기 위해, 발명자들이 개발한 전자분무 탄뎀 질량 분석(electrospray tandem mass spectrometry analysis)을 이용하여 염증 프로파일과 관련된 전립선 세포의 조사에 착수하였다. 이러한 방법은 아이코사노이드에서 유래한 10 시클로옥시게나아제, 리폭시게나아제 및/또는 시토크롬 P450까지의 동시 분석을 통하여, 아라키돈산 또는 리놀레산 등의 외인성(exogenous) 기질을 첨가할 필요 없이 한 번에, 세포 또는 조직 시료들 내의 "소형-리피도믹스(mini-lipidomics)"의 측정을 가능하게 하였다.

인간 암에서의 아이코사노이드의 역할을 더욱 잘 이해하기 위해, 발명자들은 PC3 세포에 상기 신규한 조직 염증 분석을 사용하여 이러한 인간 질병의 증식에서 중요하다고 여겨지는 아이코사노이드에서 유래한 시클로옥시게나아제 및 리폭시게나아제에 대한 발명 조성물의 효과를 관측하였다. 발명자들은 만약 있다면, 시클로옥시게나아제 활성 억제를 넘어 아이코사노이드 대사에서 생성되는 발명 조성물이 어떤 효과를 주는지를 관찰하였다. 우리의 자료는 이러한 폴리 허브 생산물이 5-LOX 및 12-LOX 활성을 억제한다는 것을 암시한다. 더욱 최근의 발견에서는 12-LOX 활성의 억제가 세포 증식 및 Rb 인산화반응의 억제와 특이적으로 연관되어, 따라서 종양 억제자 활성을 호르몬 불응성 PC3 전립선 종양 세포로 복귀시킨다는 점이 밝혀져 각별한 관심의 대상이 될 수 있다.

따라서, 본 발명의 적합한 실시예에 있어서, 아이코사노이드를 아라키돈산 및 리놀렌산으로 이루어진 군으로부터 선택하였다.

본 발명의 더욱 적합한 실시예에 있어서, 아이코사노이드는 아라키돈산이다.

본 발명의 다른 실시예에 있어서, 아이코사노이드 옥시게나아제는 시클로옥시게나아제-1, 시클로옥시게나아제-2, 5-리폭시게나아제, 12-리폭시게나아제, 또는 이들의 조합이다.

본 발명의 다른 적합한 실시예에 있어서, 아이코사노이드 옥시게나아제는 12-리폭시게나아제이다.

본 발명의 또 다른 적합한 실시예에 있어서, 아이코사노이드 옥시게나아제는 5-리폭시게나아제이다.

시클로옥시게나아제 . 아이코사노이드 대사를 매개하는 시클로옥시게나아제 효소는, 많은 조직(tissue)에서 구조적으로 발현되는 시클로옥시게나아제-1 (COX-1), 및 염증 및 암과 같은 질병 상태 동안 전형적으로 유도되는 시클로옥시게나아제-2 (COX-2)의 두 종(species)으로 표시된다. 많은 분자 및 세포 생물학 연구에서의 자료들은 또한 COX-2 유전자는 세포자살, 증식, 유착(adhesion), 혈관 형성 및 분화를 조절하는 경로에 영향을 주는 초기 성장 반응 유전자라는 것을 암시한다.

COX 및 특히 COX-2 억제는 수년 동안 항염증 약품 설계의 주요 목표였으나, COX-2 발현 및 암 사이의 관계는 더욱 최근에 단지 인식될뿐 이었다. 몇몇의 개체군-기초 연구로부터의 관찰은 강력한 COX 억제 활성을 가지는 비-스테로이드성 항염증 약품을 규칙적으로 복용하는 사람들에서 결장암 위험이 상당히 감소하는 것을 문서로 증명하였다. 결장 종양 발달에 대한 조직학적 연구에서 인접한 일반 결장 상피 세포는 감지할 수 없는 COX-2 레벨로 저하되는 것에 반하여, 대부분의 인간 및 동물 결장 종양은 증가된 COX-2 레벨을 나타내는 것으로 관찰되었다. 이러한 관찰들과 유사하게, 몇몇의 실험실은 또한 일반 상피 세포에 비해 전립선 종양 세포에서는 개시 및 진행 동안 모두 COX-2 발현이 상승한다는 것을 보고하였으나, 이러한 발견은 논쟁의 여지가 있을 수 있다.

그러나, 명백한 것은 몇몇의 약리학적 COX-2 억제 약품들이, TRAMP 마우스와 같은 전립선암 유전자 도입 모델 또는 면역 결여 마우스 모델에서 생체 밖 전립선 암 세포 성장을 억제하고, 세포자살을 유도하며, 인간 전립선 종양 이종 이식(xenograft)의 성장을 억제하는 능력을 나타냈다는 점이다. COX-2가 전립선암 발달 또는 진행에서의 한 인자(factor)인지 아닌지에 대한 논쟁을 가정한다면, 몇몇의 공지된 COX 억제제들을 다양한 COX-독립적 항암 효과를 가지는 것으로 생각되며 이러한 반응들은 억제제들과는 구별되는 것처럼 보인다.

이러한 점에 있어서, 지역적인 식이 요법에서 두드러진 많은 식물들이 COX 억제 활성을 가지는 물질(substance)을 포함한다는 점은 매우 흥미롭다. 이러한 식물들로부터의 추출물들은, 천연의 형태 및 분리된 형태 모두 포함하여, 강력한 항염증 및 항암 활성을 가지는 것으로 발견되었다. 예를 들어, 살리실산(salicylic acid)은 버드나무 껍질(willow tree bark)에서 발견된 전통적인 염증성 억제제이며, 상기 물질의 화학 유도체인 아스피린은 여전히 세계에서 가장 일반적으로 사용되는 COX 억제 물질 중 하나이다. 본 연구에서, 발명자들은 발명 조성물인 유일하고 상업적으로 허용가능한 허브 조제약의, COX-1 및 COX-2 효소 활성에 영향을 주고, 일반적으로 사용되는 인간 전립선암 세포 모델 시스템인 LNCaP 세포의 행동에 영향을 주는 그들의 능력에 대한 잠재성을 고려하였다. 상술한 바와 같이, 발명 조성물은 10개의 표준화된 허브 추출물(로즈마리, 터메릭, 생강, 홀리 바질, 녹차, 감제풀, 중국산 황련, 바베리, 오레가노, 및 스쿠텔라리아 바이칼렌시스)을 포함한다. 이러한 각각의 허브들은 COX 활성 또는 발현에 영향을 주는 독특한 화학적 성분을 포함하는 것으로 나타났으며, 또한, 각각을 항염증 또는 항암 활성에 대하여 연구하였다. 상기 테스트는 어떤 주어진 허브에서 발견된 우세한 화합물에 초첨을 맞춘 경향이 있으나, 암과 같은 질병에 대한 복합적인 허브/식이 요법 약품의 조합에서의 부가적인 이익이 있는 것으로 여겨지는 이유가 있다. 발명 조성물에 존재하는 복합적이고 화학적으로 다양한 성분들은, 각각 전형적인 아시아 식이 요법의 필수 구성 요소이며, 어떤 하나의 허브 추출물 단독의 경우 보다 전립선암에 대하여 더욱 효과적일 수 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 아이코사노이드 옥시게나아제는 시클로옥시게나아제-1, 시클로옥시게나아제-2, 또는 이들의 조합이다.

본 발명의 적합한 실시예에 있어서, 아이코사노이드 옥시게나아제는 시클로옥시게나아제-1이다.

본 발명의 더욱 나아간 실시예에 있어서, 아이코사노이드 옥시게나아제는 시클로옥시게나아제-2이다.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 아이코사노이드 옥시게나아제의 활성 조절(regulation)은 옥시게나아제 억제이다.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 아이코사노이드 대사 과정의 조절은 동물 세포에서 NF-κB 활성을 억제하는 것을 포함한다.

나아가, 본 발명은 이를 필요로하는 동물에게 13-S-HODE를 전달하는 방법을 제공하되, 로즈마리, 터메릭, 오레가노 및 생강의 초임계 추출물의 치료학적 유효량; 및 홀리 바질, 생강, 터메릭, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스, 로즈마리, 녹차, 감제풀, 중국산 황련, 및 바베리의 수알코올 추출물의 치료학적 유효량을 포함하는 조성물을 동물에게 투여하는 것을 포함한다.

부가적으로, 본 발명은 아라키돈산-매개 염증 억제를 필요로하는 동물에서 아라키돈산-매개 염증을 억제하는 방법을 제공하되, 로즈마리, 터메릭, 오레가노 및 생강의 초임계 추출물의 치료학적 유효량; 및 홀리 바질, 생강, 터메릭, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스, 로즈마리, 녹차, 감제풀, 중국산 황련, 및 바베리의 수알코올 추출물의 치료학적 유효량을 포함하는 조성물을 동물에게 투여하는 것을 포함한다.

NF -κB. 핵 인자 κB는 모든 세포의 세포질 내에 존재하는 단백질을 포함하는 Rel-도메인 패밀리로, 그곳에서 IκBα, IκBβ, IκBγ, IκBε, bcl-3, p105 및 p100을 포함하는 안코린(anchorin)-도메인-포함 단백질 집단에 의해 비활성 상태를 유지한다. 휴지(resting) 조건하에서, NF-κB는 세포질 내에서 p50, p65, 및 IκBα의 이종삼합체(heterotrimer)로 구성된다. 오직 활성화되어 핵으로 전이되었을 때만이 전사 개시를 유도하는 사건(event)의 순서이다. 대부분의 발암물질(carcinogen), 염증성 약품, 및 종양 프로모터(promoter)는, 담배 연기 응축물, 포르볼 에스테르(phorbol ester), 오카다산(okadaic acid), H₂O₂, 및 종양 괴사 인자(Tumor Necrosis Factor; TNF)를 포함하고, NF-κB 활성화 경로를 활성화시키는 것으로 나타났다. NF-κB의 활성화는 IκBα의 인산화반응, 유비퀴틴화(ubiquitination), 및 퇴화(degradation) 및 p65의 인산화반응과 관련되며, 교대로 DNA 에서 특이적 반응 요소와 결합하는 장소인 세포 핵으로 NF-κB가 전이되는 것을 유도한다. IκBα의 인산화반응은 IκBα 키나아제(IκBα kinase; IKK)에 의해 촉진되며, 이는 대부분의 약품에 의한 NF-κB 활성화에 필수적이다. NF-κB는 종양발생과 관련된 생산물의 수많은 유전자들의 발현을 조절하는 것으로 나타났다. 이들은 항세포자살 유전자(예를 들어, ciap, 수르비빈(survivin), traf, cflip, bfl-1, bcl-2 및 bcl-xl), 혈관 생성(cox-2, mmp-9, vegf), 유착 분자, 케모카인(chemokine), 및 염증성 사이토카인(cytokine)을 부호화한 유전자; 및 세포 주기 조절 유전자(예를 들어, 사이클린 d1, c-myc)를 포함한다.

특정 작동 메커니즘에 구속됨 없이, 발명자들은 발명 조성물이 종양 세포의 증식, 침입, 및 전이를 조절하는 핵 인자 κB (NF-κB)의 활성을 조절하고, 피드백(feedback) NF-κB 활성화를 억제하며, NF-κB-조절 유전자 생성물의 발현을 조절하한다는 것이라고 여긴다. 특히, 발명자들은 발명 조성물이 파골세포형성을 유도하는 NF-κB 리간드의 수용체 활성체를 억제하고, 종양 괴사 인자(TNF)-유도 침입을 억제하며, 화학 요법의 약품 및 TNF에 의해 유도된 세포자살을 강력하게 한다는 것을 발견하였다. 나아가, 발명 조성물은 TNF 및 담배 연기 응축물 모두에 의해 유도된 NF-κB 활성화를 억제한다. 게다가, 발명 조성물은 세포자살 억제 단백질 1/2, Bcl-2, Bcl-xL, FADD 유사 인터루킨-1 전환 효소(FLICE)/캐스페이즈-8(caspase-8) 억제 단백질, TNF 수용체-결합 인자 1, 및 수르비빈을 포함하는 항-세포자살과 관련된 NF-κB-조절 유전자 생성물의 발현을 하방 제어하고, 나아가 혈관 내피 성장 인자, 시클로옥시게나아제-2, 세포 간 유착 분자, 및 매트릭스 메탈로프로테이나아제(matrix metalloproteinase)를 포함하는 혈관 생성에 관련된 유전자 생성물의 발현을 조절한다. 이러한 결과들은 TNF 및 화학 요법의 약품에 의해 유도된 세포자살의 약효 증가와 관련된다. 전반적인 발명자들의 결과는 NF-κB 활성화의 하방 제어 및 NF-κB-조절 유전자 생성물의 하방 제어를 통해 발명 조성물이 파골세포형성을 억제하고, 침입을 억제하며, 세포자살을 강력하게 하는 것을 나타낸다.

발명자들은 종양 세포 생존, 증식, 침입, 혈관 형성, 및 전이를 조절하는 NF-κB 활성화 경로 및 NF-κB-조절 유전자 생성물에 대한 발명 조성물의 몇몇 효과를 측정하여, 발명 조성물이 다양한 종양 세포계에서 RANKL-유도 파골세포형성 및 TNF-유도 침입을 억제하고, TNF 및 화학 요법의 약품에 의해 유도된 세포자살을 강력하게 한다는 것을 발견하였다. 또한, 발명 조성물은, IAP1, Bfl-1/A1, Bcl-2, TRAF1, 및 cFLIP를 포함하는 항-세포자살에 관련된 유전자 생성물의 발현 및 MMP-9, COX-2, ICAM-1, 및 VEGF를 포함하는 전이와 관련된 유전자 생성물의 발현을 하방 제어하였다.

발명자들의 자료는 발명 조성물이 인간 골수성 백혈병 KBM-5 세포 내의 TNF 및 폐선암 H1299 세포 내의 담배 연기 응축물에 의해 활성화된 NF-κB를 억제한다는 것을 나타낸다. 이것은 다양한 자극에 의해 활성화된 NF-κB에 대한 발명 조성물의 효과를 시험하기 위한 첫 번째 조사이다. 이러한 결과들은 발명 조성물이 이러한 약품들 둘 모두에 일반적으로 한 단계에서 행동한다는 것을 암시한다. 암의 증식 및 전이와 관련된 몇몇의 유전자들은 NF-κB에 의해 조절되는 것으로 보였다(예를 들어, Aggarwal, B. B. (2004) Nuclear factor-kappa B: the enemy within. Cancer Cell, 6, 203-208 참조). 발명자들은 발명 조성물이 NF-κB에 의해 조절된 COX-2, MMP-9, 및 VEGF의 발현을 억제하는 것을 나타냈다.

나아가, 최근 보고들이 발명 조성물은 COX-1 및 COX-2 효소 활성 모두를 억제한다고 암시한 것(See, 예를 들어, Bemis, D. L., Capodice, J. L., Anastasiadis, A. G., Katz, A. E. and Buttyan, R. (2005) Zyflamend, a unique herbal preparation with nonselective COX inhibitory activity, induces apoptosis of prostate cancer cells that lack COX-2 expression. Nutr. Cancer., 52, 202-212 참조)에 반하여, 발명자들은 발명 조성물이 COX-2 단백질의 발현을 방지한다는 것을 나타냈다.

발명자들의 자료는 발명 조성물이 NF-κB의 직접적인 억제를 통해 NF-κB-조절 경로에 대한 그것의 항암 특성에 영향을 준다는 것을 암시한다. NF-κB는 IAP1, xIAP, Bfl-1/A1, TRAF1, Bcl-2, cFLIP, 및 수르비빈의 발현을 조절하고, 수많은 종양에서의 그들의 과발현은 생존, 항생제 저항성(chemoresistance), 및 방사성 저항성(radioresistance)과 연관되었다는 것으로 알려져있다(예를 들어, Takada, Y., Singh, S. and Aggarwal, B. B. (2004) Identification of a p65 peptide that selectively inhibits NF-kappa B activation induced by various inflammatory stimuli and its role in down-regulation of NF-kappa B-mediated gene expression and up-regulation of apoptosis. J. Biol. Chem, 279, 15096-15104 참조). 발명자들의 자료는 발명 조성물 처리가 대부분의 이러한 유전자 생성물을 하방 제어한다는 것을 나타낸다. 이전의 보고들은 발명 조성물이 인간 전립선암 세포에서 캐스페이즈-매개 경로를 통해 세포자살을 유도하는 것으로 제시하였다(예를 들어, Bemis, et al., (2005) 참조). 발명자들의 결과들은 또한 발명 조성물이 TNF, 택솔, 및 독소루비신의 세포자멸 효과를 강력하게 한다는 것을 나타낸다. 이러한 효과들은 NF-κB의 특이적인 억제제와 함께 보고된 것들과 유사하다(예를 들어, Takada, et al. (2004) 참조).

다시 행동(action)의 특정 메커니즘에 구속됨 없이, 발명자들은 발명 조성물들의 투여에서 관찰된 항증식성, 전세포사멸성(pro-apoptotic), 항-침입성(anti-invasive), 항-파골세포형성, 항-혈관생성, 및 항-전이성 효과들이 NF-κB-조절 유전자 생성물들의 억제를 통해 매개되었다고 여긴다. 발명 조성물의 제제에서 사용된 각각의 허브가 독특한 항염증 및 항암 화합물을 포함하는 것으로 알려져있는 것에 반하여, 발명 조성물의 구성 요소의 하나의 일반적인 특성은 NF-κB 활성화를 억제하는 능력인 것으로 보인다.

발명 조성물이 천연 허브 출처에서 유래된 것이고, 건강 식품 및 영양 보충 출처에 용이하게 적용가능하다는 사실을 고려하여, 처방 암 약품보다 암의 예방 및 치료에 더욱 편리하고 바람직한 방법으로 제조한다.

따라서, 본 발명은 또한 이를 필요로 하는 동물의 세포내의 NF-κB-조절 유전자 생성물의 레벨(level)를 조절하는 방법을 제공하되, 로즈마리, 터메릭, 오레가노 및 생강의 초임계 추출물의 치료학적 유효량; 및 홀리 바질, 생강, 터메릭, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스, 로즈마리, 녹차, 감제풀, 중국산 황련, 및 바베리의 수알코올 추출물의 치료학적 유효량을 포함하는 조성물을 동물에게 투여하는 것을 포함한다.

상술한 본 발명의 모든 방법에서의 동물은 마우스, 쥐, 고양이, 개, 말, 소, 또는 그외의 가축, 또는 인간과 같은 포유류일 수 있다. 적합한 실시예에 있어서, 상기 동물은 인간이다. 인간 질병, 장애, 및 건강 상태에 대한 사용에 부가하여, 본 발명의 방법은 수의학적 응용을 포함할 수 있다.

투여 경로

본 발명의 적합한 실시예에 있어서, 경구 투여된 조성물은 하나 또는 그 이상의 캡슐(capsule), 하나 또는 그 이상의 정제(tablet), 하나 또는 그 이상의 알약(pill)의 형태이다.

발명 조성물은 바람직하게 약학적으로 허용가능한 담체에 의해 환자에게 전달된다. 그러한 담체들은 당해 기술 분야에서 잘 알려져있고, 일반적으로 고체 또는 액체 형태일 것이다. 본 발명의 일 실시예에 따라 제조될 수 있는 고체 형태의 약학적 조제약(pharmaceutical preparation)은 분말, 정제, 분산성 입자(dispersible granule), 캡슐, 카세(cachet) 및 좌약(suppository)을 포함한다. 일반적으로, 고체 형태 조제약은 활성제(active agent) 약 5 중량% 내지 약 90 중량%를 포함할 것이다.

고체 담체는 희석제, 향료 약품, 가용화제(solubilizer), 윤활제(lubricant), 현탁 약품, 결합제(binder) 또는 정제 분해 약품으로 작용할 수 있는 하나 또는 그 이상의 물질일 수 있고, 캡슐화하는 물질일 수도 있다. 분말에서, 담체는 점성의 활성 화합물과의 혼합물(admixture)에 있는 고체를 미세하게 분리한다. 정제에서, 활성 화합물을 적합한 비율에서 필요한 결합 특성을 가지는 담체와 혼합하고, 소정의 형태 및 크기로 압축한다. 적절한 고체 담체는 마그네슘 카보네이트, 마그네슘 스테아레이트, 활석(talc), 당, 락토오스, 펙틴, 덱스트린, 녹말(starch), 젤라틴(gelatin), 트래거캔스(tragacanth), 메틸셀룰로오스(methylcellulose), 소듐 카르복시메틸셀룰로오스(sodium carboxymethylcellulose), 저용해 왁스(low melting wax), 및 코코아 버터 등등을 포함할 수 있다. "조제약(preparation)"은 활성 성분(또 다른 담체와 함께 또는 없이)이 담체에 의해 둘러싸여, 그것과 결합한 캡슐을 제공할 수 있는 담체로서 캡슐화하는 물질과 활성 화합물의 제제를 포함하는 것을 의미할 수 있다. 유사하게, 카세(cachet)도 포함된다. 정제, 분말, 카세, 및 캡슐은 경구 투여에 대하여 적합한 고체 투약 형태로서 사용될 수 있다. 만약 편의 또는 환자 용인(patient acceptance)을 이유로 요구되는 경우, 기술 분야에서 잘 알려진 기법을 사용하여 본 발명의 일 실시예 따라 제조된 약학적 정제를 씹어먹을 수 있는(chewable) 형태로 제공할 수 있다.

좌약을 제조하기 위해, 지방산 글리세리드(glyceride) 또는 코코아 버터의 혼합물과 같은 저용해 왁스를 먼저 용해하고(melt), 교반하여 활성 성분을 균질하게 분산한다. 그리고 나서, 용융 균질 혼합물을 적당한 크기의 몰드(mold)에 부어, 냉각하고 이로써 고체화시킨다.

액체 형태 조제약은 용액, 서스펜젼(suspension), 및 에멀젼(emulsion)을 포함한다. 한 예로, 비경구 투여에 대해 물 또는 물/프로필렌 글리콜 용액을 들 수 있다. 액체 조제약은 수용성 폴리에틸렌 글리콜 용액에서 용액으로 제제화될 수 있다. 경구 사용에 대하여 적합한 수용성 용액은 물에 활성 성분을 용해하고, 소정의 적합한 착색제(colorant), 향미료(flavor), 안정제(stabilizer) 및 농후제(thickener)를 첨가함으로써 제조할 수 있다. 경구 사용에 대하여 적합한 수용성 서스펜젼은 물에서 점성 물질, 즉, 천연 또는 합성 껌, 수지(resin), 메틸셀룰로오스, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 및 잘 알려진 또 다른 현탁 약품들로 활성 성분을 미세하게 분리하여 제조할 수 있다. 액체 약학적 조제약은 주된 활성 약품 100 중량% 이하를 포함할 수 있다.

적합한 담체로 숙고된 것은 사용 직전에 경구 또는 비경구 투여를 위한 액체 형태 조제약으로 전환될 고체 형태 조제약이다. 이러한 액체 형태는 용액, 서스펜젼, 및 에멀젼을 포함한다. 이러한 특별한 고체 형태 조제약들은 대부분 단위 용량의 형태로 편리하게 제공될 수 있고, 하나의 액체 투여량 단위를 제공하는 것으로 사용될 수도 있다. 별법으로, 충분한 고체를 제공하여 액체 형태로 전환된 후 시린지(syringe), 티스푼, 또는 그외의 부피 측정 용기로 액체 형태 조제약의 정해진 부피를 측정함으로써 복합적인 개별 액체 용량을 수득할 수 있다. 복합적인 액체 용량을 그렇게 제조하였을 때, 상기 액체 용량의 사용되지 않은 부분을 저온에서(즉, 냉동 저장 하에서) 보관함으로써 발생가능한 분해(decomposition)을 방지할 수 있다. 액체 형태로 전환될 고체 형태 조제약은 활성 물질, 향미료, 착색제, 안정제, 완충제(buffer), 인공 및 천연 감미료, 분산제(dispersant), 농후제(thickener), 및 용해성 약품 등등을 포함할 수 있다. 유용한 액체 형태 조제약을 제조하는데 이용되는 액체는 물, 등장성 물, 에탄올, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 및 그들의 혼합물 등일 수 있다. 물론, 투여 경로에 따라, 이용되는 액체를 선택할 것이다. 예를 들어, 많은 양의 에탄올을 함유하는 액체 조제약은 비경구 사용에 허용가능하지 않다.

본 발명의 약학적 조제약은 벤조산(benzoic acid), 소르빈산(sorbic acid), 메틸파라벤(methylparaben), 프로필파라벤(propylparaben) 및 에틸렌디아민테트라아세트산(EthyleneDiamineTetraAcetic acid; EDTA) 등의 기술 분야에서 잘 알려진 하나 또는 그 이상의 방부제(preservative)를 포함할 수 있다. 방부제들은 일반적으로 약학적 조성물 약 1 중량% 이하, 바람직하게는 약 0.05 내지 약 0.5 중량% 이하의 양으로 존재한다.

본 발명의 몇몇 실시예들의 목적들에 대하여 유용한 완충제는 약학적 조성물 약 1 중량% 이하, 바람직하게는 약 0.05 내지 약 0.5 중량 %의 양을 포함하는 시트르산-소듐 시트레이트, 인산-소듐 포스페이트, 및 아세트산-소듐 아세테이트를 포함한다. 유용한 현탁 약품 또는 농후제는 약학적 조성물 약 20 중량% 이하, 바람직하게는 약 1 중량% 내지 약 15 중량%의 양으로, 메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스 화합물(cellulosics), 알긴산(alginic acid) 및 그것의 유도체 등의 카라기난(carrageenan), 산탄검(xanthan gum), 젤라틴, 아카시아, 및 미정질 셀룰로오스 등을 포함한다.

적용될 수 있는 감미료는 기술 분야에서 잘 알려진 천연 및 인공적 모두에 해당하는 감미료를 포함한다. 크실로오스(xylose), 리보오스(ribose), 글루코오스(glucose), 만노오스(mannose), 갈락토오스(galactose), 프룩토오스(fructose), 덱스트로오스(dextrose), 수크로스(sucrose), 말토오스(maltose), 부분적으로 가수분해된 녹말, 또는 옥수수 시럽 고체 등의 단당류(monosaccharide), 이당류(disaccharide), 및 다당류(polysaccharide)와 같은 감미료 및 소르비톨(sorbitol), 자일리톨(xylitol), 만니톨(mannitol), 및 그들의 혼합물과 같은 당알코올은 약학적 조성물의 중량으로 약 10% 내지 약 60%를, 바람직하게는 약 20% 내지 약 50%의 양을 사용할 수 있다. 소듐이나 칼슘, 시클라메이트염(cyclamate salt), 아에설팜-K(acesulfame-K), 아스파르탐(aspartame) 등등 및 이들의 혼합물 등의 사카린(saccharin) 및 사카린염(saccharin salt)과 같은 수용성 인공 감미료를 약 0.001% 내지 약 5% 조성물의 중량으로 약 0.001% 내지 약 5%의 양으로 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 조제학적 생산물에 사용될 수 있는 향미료는 천연 및 인공적인 향미료 모두, 페퍼민트와 같은 민트, 멘톨(menthol), 바닐라(vanilla), 인공 바닐라, 초콜릿, 인공 초콜릿, 시나몬, 다양한 과일 향미료 등의 각각 및 혼합된 경우 모두를 약학적 조성물의 중량으로 약 0.5% 내지 약 5%의 양으로 포함한다.

본 발명의 일 실시예에서 유용한 착색제는 조성물의 중량으로 약 6%에 이르는 양과 혼합된 색소를 포함한다. 적절한 색소인, 티타늄 디옥사이드(titanium dioxide)는 약 1%에 이르는 양과 혼합될 수 있다. 또한, 착색제는 F.D.&C. 염색제 등으로 알려진 식품, 약품, 및 코스메틱(cosmetic) 응용에 허용가능한 또 다른 염색제를 포함할 수 있다. 이러한 염색제들은 일반적으로 약학적 조성물의 중량으로 약 0.25%에 이르되, 바람직하게는 약 0.05% 내지 약 0.2%의 양으로 존재한다. 모든 F.D.&C. 및 D.&C. 염색제들 및 그들에 상응하는 화학 구조에 대한 전체적인 상술은 Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 5권, 857-884페이지에서 찾을 수 있으며, 그 내용은 본 명세서에 참조 인용되어 있다.

유용한 가용화제는 알코올, 프로필렌 글리콜, 및 폴리에틸렌 글리콜 등을 포함하며, 향미료를 용해시키는 것으로 사용할 수 있다. 용해성 약품은 일반적으로 약학적 조성물 약 10 중량% 이하; 바람직하게는 약 2% 내지 약 5 중량%의 양으로 존재할 수 있다.

인스턴트 조성물에 요구되는 경우 사용될 수 있는 윤활제는 치환되거나 치환되지 않은 폴리실록사인(polysiloxane), 예를 들어 디메티콘(dimethicone)으로도 알려진 디메틸 폴리실록사인과 같은 실리콘유(silicone oil) 또는 액체를 포함한다. 그외의 잘 알려진 윤활제를 사용할 수 있다.

약학적 조제약을 단위 투약 형태로 제조할 수도 있다. 이러한 형태에서, 상기 조제약을 적절한 양의 활성 성분을 함유하는 단위 용량으로 세분한다. 단위 투약 형태는 패키지된(packaged) 조제약일 수 있으며, 분리된(discrete) 양의 조제약을 함유하는 패키지(package), 예를 들어, 약병 또는 앰플에 포장된 정제, 캡슐, 및 분말일 수 있다. 단위 투약 형태는 또한 캡슐, 카세, 또는 정제 그 자체일 수 있거나, 포장된 형태에서 이들의 적절한 수일 수 있다.

본 발명에 따른 화합물이 또 다른 합성물 또는 자연적으로 발생한 물질과 의미있는 유해 상호작용을 보일 것이라는 점은 예상되지 않는다. 따라서, 본 발명에 따른 화합물을, 예를 들어 암치료에 유용하도록 또 다른 화합물 및 조성물과의 조합으로 투여할 수 있다. 특히 본 발명에 따른 화합물을 화학 요법의 물질 등등의 본 발명의 또 다른 화합물들과의 조합으로 투여할 수 있다.

최적의 약학적 제제는 투여 경로 및 소정의 투여량과 같은 고려사항에 따라 당해 기술 분야의 당업자에 의해 정해질 수 있다. 예를 들어, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 18th ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), pp. 1435-1712를 참고할 수 있으며, 그 개시 내용은 본 명세서에 참조 인용된다. 이러한 제제들은 본 발명의 현재 치료학적 약품의 물리적 상태, 안정성, 생체 내 배출 비율, 및 생체 내 클리어런스(clearance) 비율에 영향을 줄 수 있다.

투여량

활성 성분 화합물 또는 조성물의 킬로그램 체중 당 약 0.001 mg 내지 약 100 mg 정도의 투여량 레벨은 상기 상태들의 처리에 유용하며, 바람직하게는 하루에 200 mg 내지 하루에 1600 mg 범위의 레벨을 가질 수 있다. 본 발명에 따른 화합물 및 조성물을 매일 2 또는 3 용량으로 제공하는 것이 일반적이다. 필요하다면 하루에 두 번씩 저용량 (200-300mg)으로 하루에 두 번으로 시작하여, 천천히 더욱 높은 용량으로 진행하는 것이 바람직한 전략이다. 투여의 특정 모드 및 처리된 숙주(host)에 따라 담체 물질과 결합하여 단일 투약 형태를 생산할 수 있는 활성 성분의 양을 변화시킬 수 있다.

그러나, 어떤 특정 환자에 대한 특이적 용량 레벨은 사용된 특이적 화합물의 활성은 다양한 인자들에 의해 좌우될 것으로 여겨진다; 환자의 나이, 체중, 일반적인 건강, 성 및 식이 요법; 투여 시간; 배설율; 약품 조합; 치료되고 있는 특정 질환의 혹독성; 및 투여의 형태 등. 본 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 인자의 다양성을 인식할 수 있을 것이며, 일상적인 실험 이상을 사용하지 않고도 특이적 용량 레벨을 설정할 수 있을 것이다.

실시예

이하의 실시예들은 본 발명의 실제적인 예이나, 이로써 본 발명이 제한되지는 않는다. 별도로 나타내지 않는 한, 모든 백분율은 최종 조성물의 중량으로 100%를 기초로 한다.

일반적인 물질 및 방법

New Chapter Inc. (St. Louis, MO)에서 수득한 자이플라멘드®(Zyflamend®)를 10 mg/ml 스톡(stock) 용액으로 디메틸 술폭사이드(DiMethyl SulfOxide; "DMSO")에 용해하였고, -20℃에서 저장하였다. 5×10⁷ U/mg의 특이적 활성을 가지는 균질로 정제된 박테리아-유래 인간 종양 괴사 인자 알파("TNF-α")는 Genentech, Inc. (South San Francisco, CA)에서 무리없이 준비한 것이다. 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), RPMI 1640 배지, 이스코브의 변형된 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco Medium; "IMDM"), D-MEM/F12 배지 및 우태혈청 (Fetal Bovine Serum; "FBS")을 Invitrogen (Grand Island, NY)으로부터 수득하였다. 이하의 다클론 항체(polyclonal antibodiy)는 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA)에서 수득하였다.: 항-매트릭스 메탈로프로테이나아제 9 (anti-matrix metalloproteinase 9; "MMP-9"); 항-세포 간 유착 분자 (anti-InterCellular Adhesion Molecule; "ICAM"); 세포자살 단백질의 항억제제 1/2 (antiInhibitor-of-Apoptosis Protein 1/2; "IAP 1/2"); 항-Bcl-2; 항-Bfl-1/A1; 및 항-TNF 수용체-결합 인자 (anti-TNF Rceptor Associsated Factor; "TRAF1"). 항-COX-2 및 XIAP는 BD Biosciences (San Diego, CA)에서 수득하였다. 담배 연기 응축물(Cigarette Smoke Condensate; "CSC")은, Anto, R.J., Mukhopadhyay, A., Shishodia, S., Gairola, CG. and Aggarwal, B. B. (2002) Cigarette smoke condensate activates nuclear transcription factor-kappa B through phosphorylation and degradation of I kappa B (alpha): correlation with induction of cyclooxygenase-2. Carcinogeneesis, 23, 1511-1518에 기재된 바와 같이 제조되었고, Dr. G. Gairola (University of Kentucky, Lexington, KY)에 의해 무리없이수득하였다. 항-혈관 내피 성장 인자 (anti-Vascular Endothelial Growth Factor; "VEGF")를 NeoMarkers (Fremont, CA)에서 구매하였다. 수르비빈 항체는 R&B Systems (Minneapolis, MN)에서 수득하였다. FADD-유사 인터루킨-1β-전환 효소 (FADD-Like Interleukin-1β-Cnverting Enzyme; "FLICE")/캐스페이즈-8-억제 단백질 (caspase-8-Inhibitory Protein; "cFLIP") 항체들은 Imgenex (San Diego, CA)에 의해 무리없이 제공되었다.

발명자들의 작업에 사용된 세포계는 인간 비소(non-small) 세포 폐 암종 (H1299), 인간 골수성 백혈병(myelogenous leukemia) (KBM-5), 및 인간 다발성 골수종 (U266)를 포함하고, 마우스 마크로파지(macrophages) (RAW 264.7) 세포계들은 American Type Culture Collection (Manassas, VA)에서 수득하였다. H1299, 및 U266 세포는 10% FBS를 가지는 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. KBM-5 세포는 15% FBS를 가지는 IMDM에서 배양하였다. RAW 264.7 세포는 10% FBS로 보충된 D-MEM/F12 배지에서 배양하였다. 모든 배지를 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신으로 보충하였다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물의 인간 A549 폐암 및 인간 PC3 전립선암 세포계(cell line)의 성장에 대한 억제 효과를 나타낸 그래프이다.

도 2는 PGE2의 형성에 대한 발명 조성물의 효과를 나타낸 그래프이다.

도 3은 PC3 세포의 PGE2 및 5-HETE의 형성에 대한 발명 조성물의 효과를 나타낸 그래프이다.

도 4는 인간 A549 폐암 세포에서 아이코사노이드 대사에 대한 발명 조성물의 농도-의존성 효과를 나타낸 그래프이다.

도 5는 발명 조성물 내의 13-S-HODE의 존재를 나타낸 질량 분석 자료이다.

도 6은 마우스 귀 부종(edema)에서 본 발명의 화합물의 항염증 효과를 나타낸 그래프이다.

도 7은 다양한 암 세포계의 증식에 대한 13-S-HODE의 효과를 나타낸 그래프이다.

도 8은 인간 유방암 MCF7 및 MDA231 세포계의 성장에 대한 본 발명의 화합물의 억제 효과를 나타낸 그래프이다.

도 9는 인간 종양 세포계(예를 들어, PC3)에서 5-리폭시게나아제의 농도-의존성 방식 존재에서 하방 제어에 대한 발명 조성물의 능력을 나타내는 웨스턴 블롯(Western blot)이다.

도 10은 아라키돈산 (Arachidonic Acid; AA) 매개 마우스 귀 부종에 대한 발명 조성물의 효과를 나타낸 그래프이다.

도 11a는 5일 동안 0.8 mg/ml의 발명 조성물 단독 또는 5 nM RANKL의 존재하에서 배양한 다음의 TRAP-양성(positive) RAW 264.7 세포를 나타낸 일련의 사진이다.

도 11b는 5일 동안 0.8 mg/ml의 발명 조성물 단독 또는 5 nM RANKL의 존재하에서 배양한 다음의 RAW 264.7 세포에서 집계된 다핵(3 핵) 파골세포의 수를 나타낸 그래프이다.

도 12는 1 % 혈청(serum)의 존재 및 부존재에서 24시간 동안 0.3 mg/ml 발명 조성물 및 1 nM TNF을 밤새도록 함께 배양한 후, 마트리겔 침입 챔버(Matrigel invasion chamber)의 침입 분석을 나타낸 그래프이다.

도 13은 칼세인(calcein) AM 기초 LIVE / DEAD 분석에 의해 측정된, 1 nM의 TNF, 1 nM의 택솔, 및 300 nM의 독소루비신(doxorubicin) 단독 또는, 0.5 mg/ml의 발명 조성물과 조합하여 함께 배양된 인간 다발성 골수종(multiple myeloma) U266 세포의 세포 사멸을 나타낸 일련의 사진이다. 빨간색은 사멸 세포를 강조하고, 초록색은 생존 세포를 강조한다. 도 13은 대리인이 보내온 컬러 파일로 대체

도 14a는 표시된 농도의 발명 조성물로 선배양하고 0.1 nM TNF로 30분 동안 처리한 KBM-5 세포의 NF-κB 활성화를 나타낸 그래프이다.

도 14b는 1 mg/ml 발명 조성물로 선배양하고 0.1 nM TNF로 30분 동안 처리한 KBM-5 세포의 NF-κB 활성화를 나타낸 사진이다.

도 14c는 1 mg/ml 발명 조성물로 선배양하고 담배 연기(10 ㎍/ml)로 1시간 동안 처리한 KBM-5 세포의 NF-κB 활성화를 나타낸 사진이다.

도 15a는 1 mg/ml 발명 조성물로 1시간 동안 배양하고 배양된 시간 동안 1nM TNF로 처리한 KBM-5 세포 내의 증식성 및 전이성 단백질의 발현을 나타낸 사진이다.

도 15b는 1 mg/ml 발명 조성물로 1시간 동안 배양하고 배양된 시간 동안 1 nM TNF로 처리한 KBM-5 세포 내의 항세포자살 단백질의 발현을 나타낸 사진이다.

도 16a는 세포 주기 분포 플롯(distribution plot)을 나타낸 일련의 그래프이다. 왼쪽 상부 플롯은 PC3 세포의 일반적인 세포 주기 분포를 나타낸다. 오른쪽 상부 플롯에서, G2/M 피크(peak)의 크기가 증가한다. 왼쪽 하부 및 오른쪽 하부의 플롯은 발명 조성물의 농도 증가에 기인한 세포 주기 블록의 증가를 나타낸다.

도 16b는 도 16a에서 유동 세포 측정법(flow cytometry) 분석에서 얻은 자료를 히스토그램으로 나타낸 그래프이다.

도 17a 내지 도 17d는 표시된 농도에서 발명 조성물울 처리하고, 이어서 아넥신(Annexin) V 및 PI 용액으로 염색한 PC3 세포를 나타낸 일련의 그래프이다.

도 17e는 도 17a에서 유동 세포 측정법(flow cytometry) 분석에서 얻은 자료를 히스토그램으로 나타낸 그래프이다.

도 18a는 제시된 발명 조성물의 농도에 대한 PGE2 형성을 나타낸 그래프이다.

도 18b는 제시된 발명 조성물의 농도에 대한 5-HETE 형성을 나타낸 그래프이다.

도 18c는 제시된 발명 조성물의 농도에 대한 12-HETE 형성을 나타낸 그래프이다.

도 18d는 발명 조성물로 PC3 세포의 처리 및 5-LOX 단백질의 세포 함량(cellular content)을 나타낸 웨스턴 블롯의 사진이다.

도 19a는 인산화되지 않은(Rb) 단백질 및 인산화된(pRb) 단백질 모두에 대한 레티노블라스토마(retinoblastoma) 단백질을 나타낸 웨스턴 블롯의 사진이다.

도 19b는 도 19a에서 광도계 스캐닝 장치(photometric scanning device)로 겔(gel)을 스캐닝하여 밴드(band) 밀도를 정량화(quantification)한 후의 자료를 나타낸 그래프이다.

도 20a는 표시된 농도의 발명 조성물로 처리하여 세포 증식을 억제한 PC3 세포를 나타낸 그래프이다.

도 20b는 발명 조성물에 의해 생산된 pRb의 발현에서 농도 의존적 감소를 나타내는 웨스턴 블롯의 사진이다.

실험예 1

세포 성장의 억제

일반적인 시작점으로, 배지 내에 확립된 설치 동물 및 인간 세포계를 이용하여 생산물 또는 약품의 세포 성장을 억제하는 상대적 능력을 조사하였다. 이것의 목표는 효과가 없거나 독성이 있는 농도를 상당히 억제하거나 "효과적"인 농도와 간단히 분별할 수 있도록 하기 위함이다. 주어진 생산물의 작용 메커니즘들에 대한 어떠한 조사는, 어떤 것을 생산하되 성장 억제 또는 대량의 세포 사멸을 유발하지 않는 농도에서 진행되어야 할 것이다. 부가적으로, 이런 종류의 연구들은 세포 사건(event)에서 시간-의존성 변화의 최초 평가를 제공한다. 즉, 약물-매개 사건이 성장 억제 또는 세포 사멸의 첫번째 징후에 비례하여 일어나는 때는 식별이 가능하다. 이것은 다시관련 사건의 서열을 암시할 수 있다.

초점을 맞춘 대부분의 연구들은 인간 전립선암 세포계를 사용하는 것을 포함한다. 그 이유는 이것이 관심 세포계이고, 상기 세포계들은 아이코사노이드 대사가 상기 세포계들을 특성화한다는 사실을 포함하기 때문이며, 발명자들은 PIN의 치료/예방에서 진행 중인 발명 조성물의 임상 실험에 참가하였다. 그러나, 획득한 자료에 따르면, 전립선암 자체와 거의 관련이 없는 또 다른 세포계 및 동물 모델의 사 용은 일반적인 항염증 활성 및 대사를 이해하는데 유용하다

도 1은 인간 A549 폐암 및 인간 PC3 전립선암 세포계의 성장에 대한 발명 화합물의 억제효과를 나타낸다. 상기 조성물의 경구 제제를 사용하였다. 조성물을 배지 내의 세포에 첨가하였고, 약품에 대한 72시간의 지속적인 노출 후에 세포 성장의 상대적인 억제를 관찰하였다. "MTT" 방법을 사용하여 처리되지 않은 대조군 세포 개체군에 대한 세포 증식을 평가하였다. 전립선 PC3 세포 성장의 억제가 폐선암 세포의 경우에 비해 더욱 큰 것이 명백하였다.

마찬가지로, 도 8 및 표 2는 인간 유방암 MCF7 및 MDA231 세포계 성장에 대한 상기 화합물의 억제 효과를 나타낸다. 다시, 발명 조성물의 경구 제제를 사용하였다. 조성물을 배지 내의 세포에 첨가하였고, 약품에 대한 72시간의 지속적인 노출 후에 세포 성장의 상대적인 억제를 관찰하였다. "MTT" 방식을 사용하여 처리되지 않은 대조군 세포 개체군에 대한 세포 증식을 평가하였다. MCF7 세포는 MDA231 세포보다 조성물 노출에 더욱 민감하였다.

표 2

*IC₅₀은 약품에 대한 노출의 정해진 조건(전형적으로 지속기간)하에서 50%(처리되지 않은 세포에 비하여)까지 세포 성장의 억제를 유발한 때의 물질의 농도(㎍/ml)로 정의된다.

테스트된 "일반적인" 인간 상피 세포계에 대항해서만 세포 독성이 상대적으로 부족한 것은 약물치료의 환자 저항성 및 투여 프로토콜에 대한 환자 순응성의 목적에 명백히 중요하였다. 인간 유방 MCF-7 에스트로겐 민감성 세포계의 상기 조성물에 대한 민감성은 특별한 관심사이며, 상기 세포계는 확실히 지금까지 테스트된 것 중 가장 민감하다. 발명자들은 에스트로겐 결합을 차단하는 것이 발명 조성물을 제조하는 데 사용된 식물 추출물 내의 어떤 화합물인지 알지 못하며, 발명자들은 고 민감성(high sensitivity)이 관찰된 것에 대해 이러한 다른 설명을 배제할 것으로 여겼다.

실험예 2

시클로옥시게나아제 ( COX ) 및

리폭시게나아제 ( LOX ) 효소를 방지하는 발명 조성물의 능력.

발명자들은 흥미있는 COX-1, COX-2, 및 또 다른 아이코사노이드에 대항하는 발명 조성물의 상태적 효과를 측정하였다. 발명 조성물을 포함하는 여러가지 허브 추출물에서 수득된 다양한 항염증 성분을 기초로 발명자들이 예상했던 바와 같이, 이러한 연구들은 상기 조성물이 COX-1 및 COX-2 (복제된 효소로서) 모두를 억제한다는 것을 나타내었다. 상기 자료는 또한 상기 조성물이 5-리폭시게나아제 (5-LOX)의 유용한 억제제이기도 하다는 것을 나타낸다. 15-LOX-2에서 유래된 아이코사노이드 생산물에서는 어떠한 선택적인 변화도 관찰되지 않았다. 상기 조성물은 또한 농도-의존성의 방식에서 12- 리폭시게나아제를 억제하는 것을 증명한다. 도 2 및 3의 자료는 상기 조성물이 배지에서 세포 내의 효소뿐만 아니라, 복제된 COX 효소의 억제를 유도한다는 점에서 강력하다는 것을 나타낸다. 액체에서 발명 조성물의 마이크로리터의 적은 양만으로 시클로옥시게나아제 효소의 상당한 억제를 유도하기에 충분하였다. 리콜(reall)이 될 때 상기 조성물의 이러한 독특한 제제의 60%는, 아이코사노이드 대사에 대하여 그 자체로는 어떠란 영향을 끼치 않는 올리브 오일이라는 점은 특히 인상적이다.

도 2는 복제된 COX-1 (양) 및 COX-2 (인간) 효소를 사용한 PGE2 형성에 대한 조성물의 효과를, 5 mM EDTA, 2 mM 페놀, 및 1 μM 헤마틴(hematin)을 포함하는 pH 8.0의 0.1M 트리스-HCl 버퍼에, 효소 (15 IU)를 가지는 10 μM AA를 배양하여 측정한 것을 나타내었다. 조성물의 알리쿼트(aliquot)를 AA 첨가 전의 튜브에 첨가하였 다. 대조군 배양에는 상기 조성물을 포함하지 않았다. 별표가 표시된 막대는 "올리브 오일" 대조군을 나타낸다. 37℃에서 15분 동안 배양하였다. 1N 시트르산을 첨가하여 반응을 중단하였다. 그리고 나서, 헥산(hexane) : 에틸아세테이트 (1:1) 용제 혼합물을 사용하여 아이코사노이드를 추출하였다. 상기 추출물을 옮겨 질소하에서 건조하였다. 상술한 바와 같이 배양하는 동안 형성된 PGE2를 추출하였고, 그리고 나서 우리가 공표한 LC/MS/MS 방법(Yang et al. Anal Biochem. 308: 168-177, 2002)을 이용하여 분석하였다. 도 2에 도시된 자료는 비록 상기 생산물이 COX-2보다 COX-1를 억제하는 것에 더욱 강력할지라도, 발명 조성물이 COX-1 및 COX-2 모두에 의해 PGE2의 형성을 방지한다는 것을 암시한다.

도 3은 PC3 세포에서 PGE2 및 5-HETE 형성에 대한 상기 조성물의 효과를 나타낸다. 다양한 농도의 조성물을 15 μM BSA로 보충한 신선한 무(free)-혈청 배지 내의 세포 배지에 첨가하였고, 37 ℃에서 10분 동안 배양하였다. 아라키돈산 (100 μM) 및 공인자(cofactor)를 첨가하였다. 10 분 후에, 세포를 헹구고, 추출하여 세포 내에서 형성된 아이코사노이드를 측정하였다(도 2의 범례 참조). 상기 자료는 PC-3 세포에서 5-HETE뿐만 아니라 PGE2 모두가 농도-의존성 억제를 나타냈다. 자료는 Mean ± SD (n = 3)으로 나타냈다. *은 대조군에 비하여 P<0.05를 나타낸다.

실험예 3

5- 리폭시게나아제의 세포 발현에 대한 발명 조성물의 효과

항염증 약품은 수많은 다양한 메커니즘을 통해 그것의 약리학적 효과를 달성할 수 있다. 주어진 생산물은, 예를 들어 COX-2를 억제하여 PGE2의 형성을 감소시 키거나, 5-리폭시게나아제를 억제하여 5-HETE의 형성을 감소시키는 것과 같이, 염증 관련 분자의 형성과 연관된 선택적인 효소를 억제할 수 있다. 상기 조성물들은 또한, 예를 들어 NF-κB 활성화의 커큐민-매개 억제와 같이, 염증 관련 유전자의 활성화와 직접적으로 관련된 것으로 알려진 활성화 전사 인자를 억제한다.

또한, 주어진 생산물은 그것을 직접적으로 억제하는 것보다 세포 또는 조직내 효소의 실제적인 합성, 및 발현을 감소시키는 역할을 할 수도 있다. 우리가 얻었던 최초의 자료는, 발명 조성물의 효소 활성 억제에 추가하여 세포 내에서 5-리폭시게나아제의 상대적 발현의 농도-의존성 억제를 유발한다는 것을 나타냈다. 효소 발현의 상대적 억제는, 상기 조성물이 COX-2의 상대적 조직 발현을 억제하는 것으로 보이지 않는다는 점에서, 일반적인 현상이 아니다.

실험예 4

발명 조성물 내의 13-S- HODE 의 확인( identification )

도 4는 인간 A549 폐암 세포에서 아이코사노이드 대사에 대한 발명 조성물의 농도-의존성 효과를 나타내며, 13-S-HODE의 형성에서는 농도-의존성 증가를 나타낸다. 세포 (1×10⁶)를 밤새도록 조직 배양 플레이트에 부착하였고, 이어서 도면에 도시된 바와 같이 다양한 농도의 조성물과 함께 24시간 동안 처리하였다. 이어서 세포를 수확하고, LC/MS/MS에 의한 아이코사노이드 분석을 위해 추출하였다. 상기 자료는 조성물 농도 2 ㎕/ml에서 PGE2의 적은 억제 (32%)를 나타내었지만, 또한 1 및 2 ㎕/ml에서 13-S-HODE의 "분명한" 극적인 형성을 나타내었다.

몇몇의 세포계에서 아라키돈산의 다양한 아이코사노이드 생산물로의 전환에 대한 조성물의 효과를 시험하였다. 앞에서 나타낸 자료는, 조성물이, 최소한 인간 폐 A459 세포에 대하여는, 시클로옥시게나아제 또는 리폭시게나아제 효소에 대한 큰 효과를 가지지 않는다는 것을 암시한다. 그러나, 15-LOX-1 효소의 생산물인, 13-S-HODE에서는 농도-의존성 증가로 나아가고 있다. 13-S-HODE에서의 이러한 증가는, 효소 자체의 유도 또는 효소 활성, 13-S-HODE를 우선적으로 증가시킨다고 할 수 있는 리놀산과 같은 적절한 기질의 첨가, 또는 또 다른 메커니즘을 통하여 발생할 수 있다. 사실, NSAID를 결장암 세포에 첨가하였을 때, 15-LOX-1 용량의 유도가 일어난다. 이는 결장암의 예방 약품인 아스피린의 유익한 영향에 대한 부분적인 설명이 된다. 그러나, 웨스턴 블롯에 의해, 상기 조성물을 포함한 배양의 결과로서 15-LOX-1 효소의 의미있는 유도는 관찰되지 않았다. 15-LOX-1 효소를 통해 13-S-HODE를 증가시킬 수 있는 기질인 리놀산의 상대적 함량에 대하여 발명 조성물을 조사하였다. GC/MS/MS 기구를 이용하여, 리놀산의 최소량을 확인하였다. 그러나, 상기 조성물 그 자체의 조사는 아래의 실험예 6에서 논의할 내용처럼, 많은 양의 13-S-HODE가 존재함을 나타냈다.

도 5는 발명 조성물에서 13-S-HODE의 존재를 나타내는 질량 분석 자료를 나타낸다. 도 5는 관련된 정보에 대한 3개 플롯을 나타낸다. 가장 상부의 플롯은 중수소화된 13-S-HODE(13-S-HODE-d4로 설계됨)의 전체 이온 크로마토그램(ion chromatogram)이다. 4개의 중수소 원자는 13-S-HODE 자체의 질량에 더욱 높은 분자량 (4 추가)을 제공한다. 질량에 대한 차지(charge) 비율로 상부 오른쪽에 나타낸 중수소화된 생산물의 질량은 "299"이다. 이것은 기본적으로 상기 생산물의 질량이다. 299>281이라는 표시는 발명자들이 299의 질량에 대하여 기구 선택을 하였고, 그리고나서 281에서 아르곤 (비활성 기체)으로 분자를 충돌시켜 특징적인 "딸(daughter)" 이온을 생산하였다는 것을 의미한다. 상기 딸 이온은 정량적인 목적으로 사용될 수 있다.

중간의 플롯은 Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI)에서 구입한 출처가 분명한 13-S-HODE (25 ng/ml)에 대한 이온 추적을 나타낸다. 그것은 295.3의 질량을 가지고, 이는 상기 플롯에 나타냈다. 발명자들은 277.2에서 딸 이온을 관찰하여 상기 화합물을 특징 지웠다. 즉, 277.2의 질량을 포함하고, 또한 "부수어서(break)" 277.2의 딸 이온을 생산하는 어떤 하나의 주어진 분자의 가능성은 관심의 실제 분자인 13-S-HODE를 제외하면 거의 없다.

하부 플롯은 발명 조성물의 추출물이다. 295.3의 질량을 가진 모든 분자를 찾도록 질량 분석기에 지시하였다. 그리고 나서, 발명자들은 기계를 맞추어 277.2에서 특징적인 딸 이온만을 관찰하였다. 기계가 그들을 발견하였다는 사실은 13-S-HODE가 발명 조성물에 존재한다는 의심을 넘어섬을 나타낸다.. 단지 5 ㎕의 조성물에서 추출물을 수득하였다. 각 피크의 두 개의 숫자는 피크의 체류 시간(예를 들어, 6.69분) 및 상대적 이온 존재도를 나타낸다. 그 이후는 피크 내의 생산물의 "양"과 비슷하다. 단지 5 ㎕의 조성물이 6,338,606의 피크 "양"을 생산하는 것에 반하여, 출처가 분명한 13-S-HODE의 기준 25 ng/ml에서 864,412의 피크양을 제공한다는 사실은 조성물 내에 높은 양의 아이코사노이드를 명백하게 나타낸다. 중요하게 알아두어야 할 것은 이것이 상기 조성물이 많은 양의 13-S-HODE를 포함한다는 "은행에 가져가다(take it to the bank)" 증명이다. 13-S-HODE이 취급되는 물질이라는 것을 확신하기위해, 항체 기초 효소 면역 측정 키트(Enzyme ImmunoAssay kit)를 사용하여 발명 조성물 내의 13-S-HODE의 존재를 분석하였다. 항체는 13-S-HODE의 감지에 대한 특이성을 제공한다. EIA 분석으로 발명 조성물 내에 높은 양의 13-S-HODE가 존재한다는 것을 확인하였다.

항염증 약품은 다수의 다양한 메커니즘들을 통해 그것의 약리학적 효과를 성취할 수 있다. 예를 들어, 주어진 생산물은 염증 관련 분자 형성과 연관된 선택적인 효소를 억제할 수 있다(예를 들어, PGE2 형성을 감소시키는 COX-2의 억제 또는 5-HETE 형성을 감소시키는 5-리폭시게나아제의 억제). 상기 생산물은 또한, 염증 관련 유전자의 활성화와 직접적으로 연관된 것으로 알려진 활성화 전사 인자를 억제할 수 있을 것이다 (예를 들어, NF-κB 활성화의 커큐민 매개 억제). 게다가, 주어진 생산물은 그것을 직접적으로 억제하는 것보다 세포 또는 조직 내 효소의 실제적인 합성, 및 발현을 감소시키는 역할을 할 수도 있다. 우리가 얻었던 최초의 자료는, 발명 조성물이 사실상 효소 활성 억제에 추가하여 세포 내에서 5-리폭시게나아제의 상대적 발현의 농도-의존성 억제를 유도할 수 있다는 것을 나타냈다. 효소 발현의 상대적 억제는, 상기 조성물이 12-LOX의 상대적 조직 발현을 억제하는 것으로 보이지 않는다는 점에서, 일반적인 현상이 아니다. 또한, 5-LOX 발현의 소멸(하방 제어)은 세포에서 5-LOX 억제제에 대한 노출의 일반적인 결과가 아니다. 비록 이러한 보고는 아니지만, PC3 세포를 확립된 5-LOX 억제제 질류톤(Zileuton)에 노 출한 후에 5-LOX 단백질 함량의 상대적 효과 (웨스턴 블롯)를 관찰하였다. 도 9에 도시한 바와 같이, 질류톤이 강력한 5-LOX 억제제 (이러한 이유로 천식 치료에 유용함)인 것에 반하여, 세포 내의 상대적 5-LOX 효소 함량에는 어떠한 변화도 생기지 않았다.

흥미로운 것 중 하나는 상기 조성물에 대한 세포의 노출 결과로 인해 발생한 COX-2 단백질 발현이 농도 의존성 증가라는 것이다. 얼핏 보기에 이것은 정확히 말하면 발명자들이 발생하기를 원하지 않았던 것처럼 보일 수 있다. 어쨌든, COX-2의 억제는 대형 약제학 사업에 대한 기초이다. 그러나, 셀레브렉스(Celebrex) (셀레콕시브(celecoxib))는 COX-2의 유도제로 알려져있다는 사실은 거의 인식되지 않았다. 어머니인 자연이 효소의 합성을 증가함으로써 그것을 극복하려고 최선을 다하는 동안 효소 활성이 억제되기 때문에 염증은 체크 상태에 머무른다. 다시 말하면, 사람들이 COX-2 억제제를 섭취하는 것을 멈출 때까지만 COX-2 억제제에 대한 사람들은 단지 양호하다.

실험예 5

발명 조성물의 항염증 효과의 생체 내 측정: 마우스 귀 모델

효과적인 염증 동물 모델은 매우 간단하지만 지난 몇 년동안 사용되었다. 테스트 마우스의 오른쪽 귀를 소정의(presumed) 항염증 약품으로 전처리하고, 그리고나서 30분 동안 혼자 남겨두었다. 그리고 나서, 염증성 약품 (전형적으로 아세톤 내의 아라키돈산 (AA))을 같은 귀에 사용하였다. 대조군으로 비히클을 왼쪽 귀에 사용하였다. AA 사용 후 정해진 기간의 시간에, 상기 마우스를 마취시키고, 그리 고나서 원형 귀 펀치(ear punch)를 사용하여 조직의 표준 단편을 수득하였다. 각각의 마우스 귀 펀치으로부터 조직의 무게 차이는 염증의 상대적인 예방에 대한 상대적 지표의 역할을 한다. 무게를 측정한 후, 우리의 LC/MS/MS 방법을 통한 특이적 아이코사노이드 대사의 후속되는 분석을 위해 귀 펀치 시료를 급속 냉동하였다.

도 6은 마우스 귀 부종에 대한 발명 조성물의 항염증 효과를 나타낸다. 상기 조성물 (10 ㎕)을 오른쪽 귀에 국북적으로 투여하였고, 왼쪽 귀에는 아세톤 비히클만을 사용하였다. AA 처리 1 시간 후에, 마우스를 마취시켰고, 귀를 "펀치"하여 조직의 표준 단편을 수득하였다. 그리고나서 오른쪽 귀의 무게를 왼쪽 귀의 무게에서 제하여 부종을 측정하였다. 상기 자료는 주어진 테스트 물질의 AA-매개 귀 부종을 억제하는 상대적 능력을 나타낸다. 자료는 10 동물들로부터 +/- SD 방식으로 나타낸다. * AA (부종) 대조군 (AA 매개 염증)에 대한 P < 0.001 처리.

도 6의 자료는 조성물이 아라키돈산 매개 염증을 상당히 억제한다는 것을 나타낸다.

마찬가지로, 도 10은 아라키돈산 매개 마우스 귀 부종에 대한 발명 조성물의 효과를 나타낸다. 처리 그룹을 1) 올리브 오일 대조군, 2) 아세톤 대조군, 3) 올리브 오일 + AA, 4) 발명 조성물 (10 ㎕) + AA, 5) 발명 조성물 (5 ㎕) + AA, 및 6) 발명 조성물 (2.5 ㎕) + AA로 구성하였다. 평균(Mean) ± SD (n = 10 마우스/그룹)으로 자료를 제공하였다. 다시 한번, 조성물은 AA에 의해 유도된 부종을 억제하였다. 도 10에 도시한 바와 같이, 비록 조성물 2.5 ㎕를 사용한 경우는 더 높은 농도의 다른 2 경우보다 약간 덜 효과적일 수 있는 것으로 나타났지만, 3개의 조성물 " 용량" 모두에서 부종의 최대 억제를 수득하였다.

실험예 6

발명 조성물 내 13-S- HODE 의 허브 원천 및 상대적 중요성

상기 조성물의 액체 형태의 상대적 아이코사노이드 함량을 분석함에 있어서, 대량의 13-S-HODE가 보이는 것은 놀라웠다. 이러한 분석들은 정확한 피크 일치를 수득하였음을 확신하기 위해 출처가 분명한 중수소화된 표준을 사용한 LC/MS/MS를 이용하여 수행하였다. 상기 관찰을 이중적으로 확신하기 위해, 13-S-HODE의 측정을 위해 특별히 제조된 효소 연결 면역 측정 키트를 이용하여 상기 액체 조성물도 분석하였다. EIA 분석으로부터의 결과를 질량 분석 자료로 확인하였고, 그 결과를 표 3에 나타냈다.

표 3

발명 조성물 내에 포함된 아이코사노이드의 상대적 함량

*자료는 ng 아이코사노이드/5 ㎕ 경구 조성물로 제공하였다.

상기 조성물의 경구 형태가 60% 올리브 오일 (13-S-HODE를 포함하지 않음)이라는 사실은 추출 물질 내 13-S-HODE의 상대적 함량이 위에서 나타낸 것보다 훨씬 높다는 것을 나타낸다.

도 7은 다양한 암 세포계의 증식에 대한 13-S-HODE의 효과를 나타낸다. 상기 자료는 효소 15-LOX-2의 생산물인 13-S-HODE가 인간 종양 전립선 (PC3) 및 결장 (LS174)의 성장을 완전히 억제할 수는 있으나, 폐선암 (A549) 세포 성장에 대해서는 그렇지 않다는 것을 나타낸다. 전립선 및 결장암 세포계를 억제하는 13-S-HODE의 상대적 능력은 약3-4 μM의 IC₅₀을 가질 수 있다. 이는 발명 조성물 내 13-S-HODE의 함량을 비교하였을 때 중요성을 가진다. 즉, 표 2에 나타낸 바와 같이 상기 조성물 내에 충분한 13-S-HODE가 있어 세포 성장 억제의 원인이 된다. 조성물 내에 또 다른 인자가 전립선 및 결장 종양 세포 성장을 억제하는 조성물의 능력에 또한 기여한다는 것은 의심의 여지가 없으나, 이것이 가능한 조성물 내의 13-S-HODE의 능력은 분명한 관심사이다.

상기 조성물의 액체 형태의 상대적 아이코사노이드 함량을 조사하였고, 대량의 13-S-HODE가 보이는 것은 놀라웠다. 이러한 분석들은 정확한 피크 일치를 수득하였음을 확신하기 위해 출처가 분명한 중수소화된 표준을 사용한 LC/MS/MS를 이용하여 수행하였다. 상기 관찰을 이중적으로 확신하기 위해, 13-S-HODE의 측정을 위해 특별히 제조된 효소 연결 면역 측정 키트를 이용하여 상기 액체 조성물도 분석하였다. EIA 분석으로부터의 결과를 질량 분석 자료로 확인하였다. 상기 조성물의 경구 형태가 60% 올리브 오일 (13-S-HODE를 포함하지 않음)이라는 사실은 추출 물질 내 13-S-HODE의 상대적 함량이 위에서 나타낸 것보다 훨씬 높다는 것을 나타낸다.

조성물을 제조하기 위해 사용된 다양한 허브 및 식물 추출 성분 중에서 아이코사노이드 생산물 13-S-HODE의 원천에 대한 탐색에 착수하였다. 이러한 접근은 상 기 추출물을 가용성화하거나 상기 추출물을 유기(organic) 용제 혼합물에 종속시키며, 이것은 지질 용해성 아이코사노이드를 만들어 낼 수 있다. 그리고 나서 질소 하에서 건조하고, 질량 분석기에 호환가능하도록 정해진 부피의 버퍼로 재구성하였다. GC/MS/MS를 이용한 상대적 리놀산 함량 분석에 또 다른 알리쿼트를 사용하였다. 이를 뒷받침하는 이론적 근거는 13-S-HODE가 상기 추출물에서 그렇게 존재하거나, 만약 세포가 15-LOX-1을 함유하고 기질 리놀산을 공급받고 있었다면 배지 내의 세포에서의 효소에 의한 반응을 통해 유래될 수 있을 것이라는 점이다.

아래 표 4의 자료는, 비록 리놀산 및 13-S-HODE를 모두 함유한 추출물들이 있기는 하나, 아이코사노이드는 발명 조성물을 제조하는 데 사용되는 몇몇의 허브 추출물의 조성 그자체라는 것에 대하여 매우 설득력이 있는 것으로 보인다. 13-S-HODE이 몇몇의 추출물들 (예를 들어, 녹차)에 존재하지 않는다는 사실은 또한 흥미롭고, 측정이 정확하다는 사실에 대한 믿음을 더해준다.

표 4

리놀산뿐만 아니라 13-HODE의 측정 모두를 비교가능한 결과로 3 번 수행하였다. 리놀산 함량은 GC/MS/MS를 이용하여 측정한 것에 반해 13-S-HODE는 LC/MS/MS를 이용하여 측정하였다. 조성물의 13-S-HODE의 원천은 대부분 생강 및 터메릭에서 기인한 것으로 나타났다. 이러한 특별한 아이코사노이드가 생강의 PSE 및 SCE 추출물들 모두에 존재하며 터메릭 뿌리에서 더욱 작은 범위에서 존재한다는 것은 매우 흥미로웠다. 특히, 높은 양의 13-HODE가 존재하는 것은, 13-S-HODE를 유도하는 15-LOX-1에 대한 기질인 높은 양의 리놀산과 언제나 연관된 것은 아니다.

실험예 7

파골세포 분화 분석

NF-κB 리간드 (RANKL)-유도 파골세포형성의 수용체 활성체(rexceptor activator)에 대한 발명 조성물의 효과를 측정하기 위해, 발명자들은 세포 밖에서(in vitro) RANKL에 의해 파골세포로 분화될 수 있는 RAW 264.7 세포를 배양하였다. 24웰 디쉬(24-well dish)에서 웰 당 1×10⁴ 세포의 밀도로 RAW 264.7 세포를 배양하고, 밤새 부착되도록 유도하였다. 그리고 나서, 배지를 교체하였고, 세포를 다양한 농도의 발명 조성물 및 5 nM RANKL와 함께 공배양하였다. 5일째에, 상술한 바와 같이 산성 포스파타아제 키트(Sigma-Aldrich)를 이용하여, 세포를 타르트레이트 저항성 산성 포스파타아제(Tartrate-Resistant Acid Phosphatase; TRAP) 발현에 대하여 염색하였고, 웰 당 TRAP-양성 다핵 파골세포(>3핵)를 집계하였다.

RAW 264.7 세포(1×10⁴ 세포/웰)를 5일 동안 0.8 mg/ml 발명 조성물 단독 또는 5 nM RANKL의 존재하에서 배양하고, TRAP 발현에 대하여 염색하였다. 도 11a에 나타낸 바와 같이, TRAP-양성 세포를 촬영하였다(원 배율, 100×).

RAW 264.7 세포(1×10⁴ 세포/웰)를 5일 동안 표시된 농도의 발명 조성물 단독 또는 5 nM RANKL 존재 하에서 배양하고, TRAP 발현에 대하여 염색하였다. 다핵(3핵) 파골세포를 집계하여, 그 결과를 도 11b에 그래프로 도시하였다.

이는 발명 조성물이 RANKL-유도 파골세포형성을 억제한다는 것을 나타낸다. TNF 상과(superfamily)의 하나인 RANKL은 NF-κB의 활성화를 통한 파골세포형성을 유도하기 때문에, 발명자들은 발명 조성물이 RANKL-유도 파골세포형성을 억제할 수 있는지를 확인하였다. 발명자들은 도 11a에 도시된 바와 같이 TRAP 발현이 나타내는 것처럼 RANKL가 파골세포 분화를 유도하였다는 것과, 도 11b에 도시된 바와 같이 발명 조성물이 용량-의존성 방식에서 그것을 억제하였다는 것을 발견하였다.

실험예 8

침입 분석

세포 밖 매트릭스를 통한 침입은 종양 전이에서 결정적 단계이므로, 세포막 침입 배지 시스템을 사용하여 세포 침입을 평가하였다. BD BioCoat Tumor Invasion System은 8 ㎛-직경 구멍(pore)을 가지는 차광(light-tight) 폴리에틸렌 테레프탈레이트 세포막을 포함하고, 재구성된 기저부 세포막 젤 (BD Biosciences, San Diego, CA)로 코팅된 챔버이다. 전체의 H1299 (2.5 × 10⁴ 세포)를 무-혈청 배지에서 현탁하고, 상부 웰에 시드(seed)하였다. 밤새도록 배양한 후, 세포를 1% FBS 의 존재하에서 추가로 24시간 동안 다양한 농도의 발명 조성물 및 1 nM TNF와 함께 공배양하였다. Matrigel을 통해 침입된 세포(다시 말하면, 배양하는 동안 하부 챔버로 이동된 것들)를 4 ㎍/ml Calcein AM (Molecular Probes, Eugene, OR) PBS에서 37 ℃, 30분 동안 염색하였고, 빅터3 멀티-플레이트 리더(Victor3 multi-plate reader)(Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Boston, MA)로 형광을 스캔하였다. 형광 세포를 집계하였다.

H1299 세포 (2.5 × 10⁴ 세포/웰)를 혈청 부존재하에서 밤새도록 Matrigel Invasion 챔버의 상부 웰에 시드하고, 1 % 혈청 존재하에서 24시간 동안 0.3 mg/ml 발명 조성물 및 1 nM TNF와 함께 공배양하였다. 그리고 나서 도 12에 도시된 바와 같이, 그 결과를 그래프로 도시하여 침입 분석에 종속하였다. 발명 조성물 및 TNF 값 중 어떤 것도 1.0에 맞춰진 것은 없었다.

이는 발명 조성물이 TNF-유도 종양 세포 침입 활성을 억제한다는 것을 나타낸다. NF-κB가 종양 세포 침입을 매개하는 유전자 생성물 (예를 들어, MMP- 9, COX-2, 및 VEGF)의 발현을 조절한다는 것을 알려준다. 발명 조성물이 TNF-유도 종양 세포 침입 활성을 조절할 수 있는지 어떤지를, 생체 밖에서 조사하였다. 이를 확인하기 위해, 발명 조성물의 존재 또는 부존재하에서 TNF와 함께 종양 세포를 시드하였고, 그리고 나서 침입에 대한 조사를 하였다. 도 12에 도시된 바와 같이, TNF-유도 종양 세포 침입은 거의 2배가 되었으며, 발명 조성물은 용량-의존성의 방식에서 이러한 활성을 억제하였다. 발명 조성물 단독은 침입 활성에 대해 효과를 미치지 않았다.

실험예 9

LIVE / DEAD 분석

세포자살을 측정하기 위해, 발명자들은 세포내의 에스테라아제(esterase) 활성 및 원형질 세포막 보전을 측정하는 LIVE/DEAD 분석 (Molecular Probes, Eugene, OR)을 사용하였다. 상기 분석은 살아있는 세포 내에 보유되어 녹색 형광을 나타내는 칼세인(calcein), 중합음이온(polyanionic) 염색제를 사용하였다. 또한 에티듐(ethidium) 모노머 염색제 (적색 형광)를 사용하였는데, 이것은 손상된 세포막만을 통하여 세포로 들어가서 핵산과 결합할 수 있으나, 살아있는 세포의 손상되지 않은 원형질 세포막은 이를 배출시킨다. 간단히, 1 × 10⁶ 세포를 0.5 mg/ml 발명 조성물과 함께 24 시간 동안 배양하였고, 그리고 나서 16시간 동안, 37℃ 에서 1 nM TNF 또는 다양한 화학 요법 약품으로 처리하였다. 세포를 LIVE/DEAD 시약 (5 μM 에티듐 호모다이머(ethidium homodimer), 5 μM 칼세인-AM)으로 염색하였고, 그리고 나서 30분 동안, 37 ℃에서 배양하였다. 세포를 형광 현미경 (Labophot 2; Nikon, Tokyo, Japan)에서 분석하였다.

인간 다발성 골수종 U266 세포 (1 × 10⁶ 세포/ml)를 24시간 동안 혈청 고갈시키고, 그리고나서 1 nM TNF, 1 nM 택솔 및 300 nM 독소루비신 단독 또는 0.5 mg/ml 발명 조성물과의 조합으로 24시간 동안 배양하였다. 도 13에 나타낸 바와 같이, LIVE/DEAD 분석에 기초하여 칼세인 AM에 의해 세포 사멸을 측정하였다. 적색은 사멸 세포를 나타내며, 녹색은 살아있는 세포를 나타낸다.

발명 조성물은 TNF 및 화학 요법의 약품의 세포자멸 효과를 강력하게 한다. NF-κB 활성화가 다양한 약품들에 의해 유도된 세포자살을 억제하는 것으로 나타났기 때문에, 발명 조성물이 TNF 및 화학 요법의 약품에 의해 유도된 세포자살을 조절할 것인지 아닌지를 조사하였다. TNF 및 화학 요법의 약품-유도 세포자살에 대한 발명 조성물의 효과를 LIVE/DEAD 분석으로 관찰하였다. LIVE/DEAD 분석은, 세포 내의 에스테라아제 활성 및 원형질 세포막 보존을 측정하는 것으로, 발명 조성물이 종양 세포에 대항하여 TNF, 택솔, 및 독소루비신의 세포자멸 효과를 증가시켰다는 것을 나타냈다.

실험예 10

NF -κB 활성화의 전기영동 이동도 시프트 분석

NF-κB 활성화를 측정하기 위해, 발명자들은 Chaturvedi, M.M., Mukhopadhyay, A. and Aggarwal, B. B. (2000)의 산화환원-민감성의 전사 인자에 대한 분석 Methods Enzymol., 319, 585-602에 이미 본질적으로 기재된 바와 같이 전기영동 이동도 시프트 분석(EMSA:Electrophoretic Mobility Shift Assays)을 수행하였다. 요약하면, 인간 면역 결핍 바이러스 장말단반복(LTR: Long Terminal Repeat)인 5'- TTGTTACAA GGGACTTTC CGCTG GGGACTTTC CAGGGAGGCGTGG- 3'(굵은글씨체는 NF-κB-결합 부위임)로부터의 32P-말단-라벨링된 45-머 이중 가닥 NF-κB 올리고뉴클레오티드(15 ㎍의 단백질과 16 fmol의 DNA)를 이용하여 핵추출물(1 x 10⁶ 세포/ml)을 37℃에서 30분 동안 배양하였고, 형성된 DNA-단백질 복합체를 6.6%의 천연 폴리아크릴아미드 겔 상에서 유리 올리고뉴클레오티드로부터 분리하였다. 이중 가닥 돌연변이 올리고뉴클레오티드인 5'-TTGTTACAA CTCACTTTC CGCTG CTCACTTTC CAGGGAGGCGTGG-3'를 이용하여 DNA에 대한 NF-κB의 결합 특이성을 조사하였다. Storm 820 포스포리마거(phosphorimager) 및 ImageQuant 소프트웨어 프로그램(Amersham, Piscataway, NJ)을 이용하여 건조된 겔을 시각적으로 나타내고, 방사성 밴드를 정량화하였다.

KBM-5 세포(2 x 10⁶ 세포/ml)를 본 발명의 조성물의 지시된 농도로 1시간 동안 예비 배양하였고, 30분 동안 0.1nM의 TNF로 처리하였다. 도 14A에 도시한 바와 같이 EMSA에 의해 NF-κB 활성화에 대하여 핵 추출물을 분석하였다.

본 발명의 조성물은 용량 및 시간 의존 방식으로 NF-κB 활성화를 억제하였다. NF-κB가 세포자살 및 세포 침입에 중요한 역할을 수행하므로, 본 발명자들은 이러한 전사 인자의 활성화에 대한 본 발명의 조성물의 효과를 조사하였다. 본 발명자들은 먼저, 인간 골수성 백혈병 (KBM-5) 세포내의 TNF에 의해 유도된 NF-κB의 활성화에 대한 본 발명의 조성물의 효과를 조사하였다. DNA-결합 분석(EMSA) 결과는 본 발명의 조성물 단독으로는 NF-κB 활성화에 영향이 없다는 점을 나타내었다. 그러나, 도 14A에 도시한 바와 같이, 이것은 용량-의존성 방식으로 TNF-중개된 NF-κB 활성을 억제하였다.

KBM-5 세포(2 x 10⁶ 세포/ml)를 본 발명의 조성물 1mg/1ml로 지시된 시간 동안 예비 배양하였고, 이어서 30분 동안 0.1nM의 TNF로 처리하였다. 도 14B에 도시한 바와 같이 EMSA에 의해 NF-κB 활성화에 대하여 핵 추출물을 분석하였다. 본 발명의 조성물에 의한 NF-κB 활성화의 억제 또한 시간-의존성인 것으로 확인되었다.

본 발명의 조성물은 담배 연기-유도 NF-κB 활성화를 억제하였다. H1299 세포를 본 발명의 조성물(1mg/1ml)로 1 시간 동안 예비 배양하였고, 이어서 30분 동안 담배 연기(10㎍/ml)로 처리하였다. 도 14C에 도시한 바와 같이 EMSA에 의해 NF-κB 활성화에 대하여 핵 추출물을 분석하였다.

본 발명의 조성물 블록 NF-κB 활성화는 담배 연기 응축물로부터 유도되었다. 이어서, 발명자들은 비소 폐선암 H1299 세포 내에서 담배 연기 응축물에 의해 유도된 NF-κB 활성화에 대한 본 발명의 조성물의 효과를 조사하였다. DNA-결합 분석(EMSA) 결과는 도 14C에 도시한 바와 같이 본 발명의 조성물은 담배 연기 응축물에 의해 유도된 NF-κB 활성화를 억제한다는 점을 나타내었다. 이러한 결과는 본 발명의 조성물은 TNF 및 담배 연기 응축물에 공통적인 NF-κB 활성화 통로 중의 단계에서 작동한다는 점을 암시한다.

실험예 11

TNF -유도 유전자 발현의 웨스턴 블롯 분석

처리된 세포(2 x 10⁵ 세포/ml)의 전체 세포 추출물 중의 COX-2, VEGF, ICAM-1, MMP-9, cIAP-1/2, 수르비빈, Bfl-1/Al, Bcl-2, Bclx_L, cFLIP, TRAF1 및 XIAP의 TNF 유도 발현에 대한 본 발명의 조성물의 영향을 측정하기 위해, 30 ㎍의 단백질을 SDS-PAGE 상에 용해시키고, 제조자의 추천 프로토콜에 따라 특이적 항체를 이용하여 웨스턴 블롯에 의해 프로브하였다. 블롯을 세척하고 1시간 동안 HRP-콘쥬게이트된 2차 항체에 노출시켰으며, 마지막으로 ECL 시약(Amersham Pharmacia Biotechnology, Piscataway, NJ)에 의해 측정하였다.

본 발명의 조성물은 종양 세포의 증식 및 전이에 연관된 TNF-유도 NF-κB 의존성의 유전자 생성물을 억제하였다. 발명자들은 본 발명의 조성물이 종양 세포의 증식 및 전이에 연관된 NF-κB 의존성의 유전자 생성물을 조절할 수 있는지 여부도 조사하였다. TNF는 COX-2, MMP-9, ICAM-1, 및 VEGF를 유도하는 것으로 나타났으며, 이들 모두는 이들의 프로모터에 NF-κB 결합 부위를 가졌다. 도 15A에 도시한 바와 같이, TNF 처리는 COX-2, VEGF, ICAM-1, 및 MMP-9 유전자 생성물의 발현을 유발하였고, 본 발명의 조성물은 이 발현을 소멸시켰다.

KBM-5 세포(2 x 10⁶ 세포/ml)를 본 발명의 조성물 1mg/1ml로 1 시간 동안 배양하였고, 이어서 지시된 시간 동안 0.1nM의 TNF로 처리하였다. 도 15B에 도시한 바와 같이, 전체 세포 추출물을 제조하였고, 지시된 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.

본 발명의 조성물은 TNF-유도 NF-κB 의존성의 항세포자살 유전자 생성물을 억제하였다. NF-κB는 항세포자살 단백질인 IAP1, IAP2, 수르비빈, Bfl-1/Al, Bcl-2, BcI-XL, cFLIP, TRAF1, 및 XIAP의 발현을 상방 제어(upregulate)하였다. 이어서 발명자들은 본 발명의 조성물들이 이러한 유전자 생성물들의 발현에 영향을 미치는지 여부를 조사하였다. 도 15B에 도시한 바와 같이, 발명자들은 본 발명의 조성물이 이들 단백질 전부의 기저 발현뿐만 아니라, TNF-유도를 억제한다는 점을 확인하였다.

실험예 12

본 발명의 조성물에 의해 중재된 PC3 세포의 G ₂ /M 정지 증거

도 16에 도시한 바와 같이, 본 발명의 조성물로 PC3 세포를 처리하여 세포 주기의 농도-의존성 억제를 생성시켰다. 약초 생성물은 심지어 0.28㎕/ml 만큼 낮은 농도에서도 명확한 세포의 클리어(clear) G₂/M 축적을 생성하였다. 보다 높은 농도에서, G₂/M기는 세포자살을 지시하는 서브 G₀ 피크인 것처럼 명확하였다. G₂/M내 세포의 수의 증가에 수반하여 세포 주기의 G1 부위내 세포의 점진적 농도-의존성 감소가 있었다. G₂/M기에 단지 10%의 대조 세포가 일상적으로 존재하는 반면, 본 발명의 조성물 0.57㎕/ml로 처리하여 G₂/M기에 40% 이상의 세포를 수득하였다.

도 16A에 도시한 바와 같이, 좌상부의 플롯은 PC3 세포의 일반적인 세포 주기 분포를 예증하였다. 세포의 G₂/M 백분율은 작았다(도면 우측의 음영처리된 소형 피크). 2번째 플롯에서(우상부) PC3 세포는 본 발명의 조성물 0.28㎕/조직 배양 미디어 ml로 처리하였다. G₂/M 피크의 크기가 증가하였다. 좌하부(본 발명의 조성물0.57㎕/ml) 및 우하부(1.14㎕/ml)의 플롯은 본 발명의 조성물의 증가하는 농도에 따른 증가하는 세포 주기 블록을 나타내었다.

도 16B에 도시한 바와 같이, 도 16A의 유동 세포 측정 분석으로부터의 데이터를 도 16B의 히스토그램에 재플롯하였다. 도면에 도시한 바와 같이 세포 주기의 G₂/M기의 세포의 백분율에 명확한 농도 의존 증가가 있다. 반면, 이것은 세포 주기의 G1기의 세포의 감소와 연관되어 있다.

실험예 13

본 발명의 조성물에 의해 중재된 세포 자살의 유동 세포 측정 분석

도 17에 도시한 바와 같이, 단지 낮은 레벨의 G₂/M 블록을 생성하는 본 발명의 조성물의 농도는 아넥신 V 및 포스파티딜리노시톨(PI)을 이용한 세포의 얼룩에 의해 확인되는 바와 같이 조기 세포 자살의 유도와 연관되어 있음을 확인하였다. 가장 낮은 농도인 0.28㎕/ml에서 조사하더라도, 전환된 멤브레인 포스파티딜세린에 대한 아넥신 V 결합의 명확한 증거는 본 발명의 조성물로 처리된 PC3 세포의 유동 세포 측정에 의해 명백해졌다. 세포 자살의 멀티허브(mult-iherb) 매개 생성의 추가 증거는, 멤브레인 신뢰도의 균열 이후 세포 사멸의 후속 단계에서 핵산에 대한 프로피디움 요오드 결합의 농도 반응이었다.

도 17A에 도시한 바와 같이, PC3 세포를 지시된 농도에서 24시간 동안 발명 조성물로 처리하였다. 이어서, 아넥신 V 및 PI 용액을 이용하여 세포를 얼룩 처리 하였다. 세포자살은 유동 세포 측정 분석(FACS)에 의해 측정하였다. 가장 낮은 농도 0.28㎕/ml에서도 조기 세포자살의 명확한 표시가 있었다. 1.1㎕/ml을 초과하는 농도에서 대부분의 세포가 건조되었고, 후기 세포자살(세포 사망) 단계로 나타났다.

도 17B에 도시한 바와 같이, 본 발명의 조성물로 처리한 PC3 세포의 유동 세포 측정 분석으로부터 얻은 데이터(도 17A)를 도 17B에 도시하였다. 세포 멤브레인 변경을 지시하는 PI 얼룩의 명확한 농도-의존성의 증가가 있었으며, 이는 조기 세포 자살을 보증하는 것이었다. 본 발명의 조성물의 가장 낮은 농도에서 아넥신 V 얼룩은 세포자살과 연관된 DNA 얼룩을 지시하였다. 세포 사망에 의한 본 발명의 조성물의 농도가 증가함에 따라 아넥신 V로 얼룩진 세포의 백분율은 감소하였다.

실험예 14

본 발명의 조성물에 의해 중재된 아이코사노이드 대사의 변화

도 18A-18D에 도시한 바와 같이, 클로닝된 인간 COX-1, COX-2 및 5-LOX 효소 의 처리는 각각의 아이코사노이드 생성물 PGE₂ 및 5-HETE의 농도 의존성 억제를 생성시키고, COX-1 또는 COX-2 중 어느 하나보다 강력하게 억제된 5-LOX를 형성하였다. 이어서, 본 발명의 조성물을 이용한 배양에 기인한 아이코사노이드 대사의 세포적 변화를 조사하였다. 도 18A-18D에 도시한 바와 같이, 본 발명의 조성물로 PC3 세포롤 처리하여 PGE₂ (도 18A) 및 5-HETE (도 18B)의 형성의 감소를 생성하였다. 그러나, 보다 분명한 것은, 12-LOX 활성의 억제에 기인한 것으로 예측되는 12-HETE 레벨의 감소였다. 0.25㎕/분과 같이 낮은 본 발명의 조성물의 농도는 미처리된 대조 세포에 비해 12-HETE 레벨을 현저하에 감소시켰다. 조사된 본 발명의 조성물의 가장 높은 농도(1㎕/ml)는 PC3 세포 내에서 12-HETE 레벨을 약 80% 감소시키는 결과를 가져왔다(도 18C).

본 발명의 조성물을 이용하여 PC3 세포를 처리하여, 웨스턴 블롯 분석에 의해 증거로 제시되는 바와 같이 5-LOX 단백질의 세포적 함량의 분명한 감소도 생성하였다(도 18D). 12-LOX 단백질 함량의 감소는 0.25 ㎕/ml보다 높은 본 발명의 농도에서도 명확하였다. 보다 높은 농도의 본 발명의 조성물을 이용하여 PC3 세포를 배양시킨 것에 기인한 COX-2 단백질의 증가는 셀레코씨브(celecoxib)와 같은 다른 항염증제로 세포를 처리한 것에 기인한 이 효소의 상승을 암시하였다.

표 5의 데이터는 본 발명의 조성물 또는 스쿠텔라리아(Scutellaria)의 성분인 바이칼레인 중 어느 하나의 비독성 농도로 처리한 이후에 PC3 세포의 분리물(lysate)을 인단백질 분석하여 유도될 수 있었다. 단백질들은 겔 전기 영동을 이 용하여 분리하였고, 이어서, 상기 겔을 단백질에 대한 모노클로날(monoclonal) 항체로 검침하였다. 항체는 단백질의 인산화반응 상태의 차이를 검출할 수 있었다. 이어서, 농도계를 이용하여 겔을 정량화하였다. (현저하더라도) 오직 상대적인 변화만 표에 기재하였다. 세포 주기 블록에 연관된 단백질(예, 사이클린 D1, 사이클린 D3 및 pRB) 및 세포 자살과 연관된 단백질(예, 수르비빈, Bcl-X_L 및 Bcl-2)의 유사한 상방 제어 또는 하방 제어(down regulation)를 시그널링하는(signaling) 인산화반응 상태의 변화에 많은 유사점이 있었다. 본 발명의 조성물 및 바이칼레인 모두 12-LOX 활성을 억제하였다. 그러나, 본 발명의 조성물 및 바이칼레인 중 어느 하나로 처리한 이후 이들 중요한 단백질의 인산화반응 상태의 변화가 전부 동일한 것은 아니었으며, 이는, 본 발명의 조성물의 동작 메커니즘이 복잡하고, 이의 성분인 바이칼레인에만 기인한 것은 아니라는 점을 암시하였다.

표 5

↓: 감소, 억제 또는 하방 제어를 나타냄

↑: 향상, 활성화 또는 상방 제어를 나타냄

실험예 15

발명 조성물에 의해 매개된 Rb 단백질 인산화반응의 감소

도 19에 도시된 바와 같이, Rb 인산화반응의 농도 의존성 억제가 있다. pRb가 감소함에 따라 Rb의 양이 감소하는 것에 반하여, 0.25 ㎕/ml 정도의 낮은 농도는 대조군에 비하여 상당히 감소하였다. 발명 조성물의 농도에서 일어나는 Rb 단백질 인산화반응의 감소는 G₂/M 세포 주기 차단(block) 및 초기의 세포자살과 관련되었다. 웨스턴 블롯 자료의 정량화를 도 19b에 나타내었다.

도 19a 에 도시된 것은, 인산화되지 않은 (Rb) 및 인산화된 (pRb) 단백질 모 두에 대한 레티노블라스토마 단백질의 웨스턴 블롯이다. 아래쪽 밴드(band)(β-액틴)는 적재(loading) 대조군을 나타낸다. 상기 자료는 24시간 동안 표시된 농도에서 발명 조성물로 처리한 PC3 세포에서 기인한 것이다. 그리고 나서, 세포를 용해(lyse)하여 단백질을 젤 상에 분리하였다. Rb 또는 pRb 단백질의 존재를 특이적 단일클론 항체들을 사용하여 확인하였다. 상기 자료들은 밴드 밀도의 정량이 가능한 광측정 스캐닝 기구(photometric scanning device)에서 젤을 스캐닝한 후에 아래쪽 도면에 나타내었다. 상기 자료는 발명 조성물이 0.25 ㎕ /ml의 농도에서도 pRb의 뚜렷한 억제 (인산화된 형태) 및 Rb의 증가 (인산화되지 않은 형태)가 있다는 것을 나타낸다.

2 ㎕/ml 농도의 발명 조성물과 함께 24 시간 동안 PC3 세포를 배양한 결과로, Rb 인산화반응의 감소는 T356 (대조군대 비하여 59% 감소), S807 (62% ↓), T821 (62% ↓) 및 T826 (78% ↓; 다른 자료에는 나타나지 않음)을 포함하는 복합적 아미노산 자리에서 발생하였다.

표 6

발명 조성물 ^a 로 처리된 PC3 세포로부터의

단백질 인산화반응 스크리닝 자료

^a약자는 다음과 같다: PC3, 안드로겐 불감성 인간 전립선암; Rb, 레티노블라스토마 단백질; STAT1, 신호 전환체(signal transducer) 및 전사 1의 활성체; Fos, Fos-c FBJ 뮤린 골육종(murine osteosarcoma) 종양단백질-관련 전사 인자; HspBl, 열 쇼크 27 kDa 단백질; p21, p21-활성 단백질 세린 키나아제.

실험예 16

발명 조성물에 의한 PC3 증식 억제를 차단하는 12- HETE 의 능력

도 20a 내지 20c에 도시된 바와 같이, 발명 조성물의 성장 억제 농도로 처리된 PC3 세포에 대한 PGE₂ 또는 5-HETE 첨가는 세포 증식을 차단하는 데 실패하였다. 이와 대조적으로, 도 20a는 발명 조성물 (1 ㎕/ml; 세포자살 및 G₂/M 정지를 강력히 유도하는 농도)로 처리된 세포에 첨가된 12-HETE는, 비록 처리되지 않은 세포 레벨을 조절하는 것으로 돌아가지 않았지만, 세포 증식을 거의 배가(doubling)시킨다는 것을 나타낸다.

12-HETE (12-H로 나타냄)의 첨가 또한 발명 조성물의 PC3 세포에서 PB 단백질의 인산화된 상태를 전환하는 능력을 차단시킨다 (도 20b); PGE2 및 5-HETE (5H로 나타냄) 어느 것도 발명 조성물의 pRb 상태를 전환하는 능력에 어떤 영향을 주지 않았다. 결국, PC3 세포에 첨가된 12-HETE는 발명 조성물 매개 G2/M 차단의 부분적인 전환(reversal)을 유도하여, 발명 조성물에 의해 매개된 PC3 세포 증식 억제에서의 이러한 특별한 아이코사노이드의 중요성을 지적하였다. 따라서, "애드-백(add-back)" 실험에 대하여 도 20a에 나타낸 바와 같이, 표시된 농도에서 세포 증식의 농도 의존성 억제를 유도하는 발명 조성물로 PC3 세포를 처리하였다 (상대적인 형광도는 세포 수를 나타냄). 12-리폭시게나아제의 생산물인 12-HETE를 첨가하는 것은 PC3 세포 성장에서 중간 정도의 증가를 유도하였다. 그러나, 발명 조성물로 처리된 세포에 대한 12-HETE의 첨가는 종양 세포 증식 억제 발명 조성물에 의해 매개된 종양 세포 증식 억제를 크게 차단하였다.

도 20b에 도시된 바와 같이, 발명 조성물은 pRb 발현에서 농도 의존성 감소를 유도하였다. 5-HETE (5-H) 또는 PGE2를 첨가하는 것은 이러한 효과를 차단하지 않았다. 그러나, 12-LOX 생산물인 12-HETE의 첨가는 pRb 발현의 유도를 부분적으로 복구(return)하였다. 이것들을 토대로 한 자료는 12-HETE가 종양 억제자 단백질 Rb 발현을 회복시키는 발명 조성물의 능력 및 항증식성 활성을 차단할 수 있다는 점에서 발명 조성물에 의해 매개된 12-LOX의 억제는 중요하다는 것을 나타낸다.

참고문헌

하기 참고 문헌들은 본 발명의 내용을 이해하는 데 유용할 것으로 생각된다. 관련 기술에서 여기서의 언급은 인용된 어떠한 참고문헌이 본 발명의 특허성에 대한 근거라는 단정이나 용인으로 해석되어서는 안된다. 각 참고문헌의 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조 인용된다.

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지금까지 설명된 본 발명의 실시예는, 다양한 방식으로 변형하거나 변화하여 사용될 수 있는 것은 명백하다. 이러한 변형 및 변화들은 본 방명의 범위와 동떨어진 것으로 여겨지지 않으며, 그러한 모든 변형 및 변화들은 하기의 청구항들의 범위 내에 포함되는 것으로 인식되어야 한다.

Claims (21)

1. 아이코사노이드 옥시게나아제의 활성 조절에 효과적인 양의 조성물을 동물에게 투여하는 것을 포함하며, 아이코사노이드 대사 과정의 조절을 필요로하는 동물의 세포 내에서의 아이코사노이드 대사 과정의 조절 방법으로,

   상기 조성물은 로즈마리, 터메릭, 오레가노 및 생강의 초임계 추출물의 치료학적 유효량; 및

   홀리 바질, 생강, 터메릭, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스, 로즈마리, 녹차, 감제풀, 중국산 황련, 및 바베리의 수알코올 추출물의 치료학적 유효량을 포함하는 아이코사노이드 대사 과정의 조절 방법
2. 제1 항에 있어서,

   상기 세포는 암 세포인 아이코사노이드 대사 과정의 조절 방법.
3. 제2 항에 있어서,

   상기 암세포는 전립선암 세포, 유방암 세포, 폐암 세포, 결장암 세포, 또는 이들의 조합을 포함하는 아이코사노이드 대사 과정의 조절 방법.
4. 제2 항에 있어서,

   상기 아이코사노이드 대사 과정은 암, 암 세포 증식, 암 세포 전이, 암 세포 침투, 암 세포-조절 혈관 형성, 암 세포-조절 세포자살 억제, 또는 이들의 조합에 대한 세포 변형과 연관된 변종 대사인 아이코사노이드 대사 과정의 조절 방법.
5. 제2 항에 있어서,

   상기 아이코사노이드는 아라키돈산 및 리놀렌산으로 이루어진 군으로부터 선택된 아이코사노이드 대사 과정의 조절 방법.
6. 제5 항에 있어서,

   상기 아이코사노이드는 상기 아라키돈산인 아이코사노이드 대사 과정의 조절 방법.
7. 제1 항에 있어서,

   상기 아이코사노이드 옥시게나아제는 시클로옥시게나아제-1, 시클로옥시게나아제-2, 5-리폭시게나아제, 12-리폭시게나아제, 또는 이들의 조합인 아이코사노이드 대사 과정의 조절 방법.
8. 제7 항에 있어서,

   상기 아이코사노이드 옥시게나아제는 상기 12-리폭시게나아제인 아이코사노이드 대사 과정의 조절 방법.
9. 제7 항에 있어서,

   상기 아이코사노이드 옥시게나아제는 상기 5-리폭시게나아제인 아이코사노이드 대사 과정의 조절 방법.
10. 제7 항에 있어서,

    상기 아이코사노이드 옥시게나아제는 상기 시클로옥시게나아제-1, 시클로옥시게나아제-2, 또는 이들의 조합인 아이코사노이드 대사 과정의 조절 방법.
11. 제10 항에 있어서,

    상기 아이코사노이드 옥시게나아제는 상기 시클로옥시게나아제-1인 아이코사노이드 대사 과정의 조절 방법.
12. 재10 항에 있어서,

    상기 아이코사노이드 옥시게나아제는 상기 시클로옥시게나아제-2인 아이코사노이드 대사 과정의 조절 방법.
13. 제1 항에 있어서,

    상기 아이코사노이드 옥시게나아제의 활성 조절은 억제하는 것인 아이코사노이드 대사 과정의 조절 방법.
14. 제1 항에 있어서,

    상기 아이코사노이드 대사 과정의 조절은 동물 세포 내의 NF-κB 활성을 억제하는 것을 포함하는 아이코사노이드 대사 과정의 조절 방법.
15. 제1 항에 있어서,

    상기 동물은 인간인 아이코사노이드 대사 과정의 조절 방법.
16. 로즈마리, 터메릭, 오레가노 및 생강의 초임계 추출물의 치료학적 유효량; 및 홀리 바질, 생강, 터메릭, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스, 로즈마리, 녹차, 감제풀, 중국산 황련, 및 바베리의 수알코올 추출물의 치료학적 유효량을 포함하는 조성물을 동물에게 투여하는 것을 포함하며, 13-S-HODE의 전달을 필요로하는 동물게의 대한 13-S-HODE의 전달 방법.
17. 제16 항에 있어서,

    상기 동물은 인간인 13-S-HODE의 전달 방법.
18. 로즈마리, 터메릭, 오레가노 및 생강의 초임계 추출물의 치료학적 유효량; 및 홀리 바질, 생강, 터메릭, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스, 로즈마리, 녹차, 감제풀, 중국산 황련, 및 바베리의 수알코올 추출물의 치료학적 유효량을 포함하는 조성물을 동물에게 투여하는 것을 포함하며, 아라키돈산-매개 염증의 억제를 필요로 하는 동물에 대한 아라키돈산-매개 염증의 억제 방법.
19. 제18 항에 있어서,

    상기 동물은 인간인 아라키돈산-매개 염증의 억제 방법.
20. 로즈마리, 터메릭, 오레가노 및 생강의 초임계 추출물의 치료학적 유효량; 및 홀리 바질, 생강, 터메릭, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스, 로즈마리, 녹차, 감제풀, 중국산 황련, 및 바베리의 수알코올 추출물의 치료학적 유효량을 포함하는 조성물을 동물에게 투여하는 것을 포함하며, NF-κB-조절 유전자 생성물의 레벨 조절을 필요로하는 동물의 세포에서 NF-κB-조절 유전자 생성물의 레벨 조절 방법.
21. 제20 항에 있어서,

    상기 동물은 인간인 NF-κB-조절 유전자 생성물의 레벨 조절 방법.

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