BRPI0611848A2 - métodos para modulação do metabolismo de eicosanóides - Google Patents

Abstract

MéTODOS PARA MODULAçãO DO METABOLISMO DE EICOSANóIDES. A presente matéria inventiva se refere a métodos para modulação de um processo metabólico de eicosanóides nas células de um animal que dela necessita, os quais compreendem administrar ao animal uma quantidade efetiva das composições inventivas para regular a atividade de uma oxigenase de eicosanóides. Em particular, a presente matéria inventiva se refere a métodos para a modulação do metabolismo de ácido araquidónico pela administração de uma quantidade eficaz das composições inventivas para regular a atividade das lipoxigenases e ciclooxigenases.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS PARA MODULAÇÃO DO METABOLISMO DE EICOSANÓIDES".

O presente pedido reivindica o benefício dos Pedidos de Patente US Provisórios Ns 60/690.161, depositado em 15 de junho de 2006, cujo conteúdo é incorporado na íntegra neste documento para fins de referência.

ANTECEDENTES DA PRESENTE

MATÉRIA INVENTIVA

1. Campo da Presente Matéria Inventiva

A presente matéria inventiva se refere a métodos para modulação de um processo metabólico de eicosanóides nas células de um animal que dela necessita, os quais compreendem administrar ao animal uma quantidade efetiva das composições inventivas para regular a atividade de uma oxigenase de eicosanóides. Em particular, a presente matéria inventiva se refere a métodos para a modulação do metabolismo de ácido araquidônico pela administração de uma quantidade eficaz das composições inventivas para regular a atividade das lipoxigenases e ciclooxigenases.

2. Antecedentes

Embora se tenha obtido progresso no diagnóstico e tratamento precoce de cânceres, como o câncer de próstata, o câncer de próstata continua sendo a malignidade mais comum e a segunda causa principal de mortes relacionadas a câncer em homens nos Estados Unidos. Um dos aspectos mais interessantes dessa doença é o fato de que o câncer de próstata latente ocorre com a mesma incidência em homens Asiáticos e Americanos, enquanto que a incidência do câncer de próstata com significância clínica é muito maior nos US do que na Asia. Há várias razões para se crer que essa discrepância esteja relacionada ao consumo alimentar das diferentes populações, e essas observações incentivaram uma grande pesquisa sobre os vários fatores alimentares que poderiam influenciar na progressão do câncer de próstata. Alguns estudos epidemiológicos sugerem que isso pode se deve, em parte, ao menor consumo de gordura nas dietas Asiáticas em comparação com a típica dieta ocidental, visto que as dietas com muita gordura estão relacionadas a altos riscos de câncer de próstata.

Os requerentes descobriram que a administração das composições inventivas inibe a ativação do NF-kB induzida por TNF nas células KBM-5 da leucemia mielóide e a ativação do NF-kB induzida por condensado de fumaça de cigarro nas células Hl299 do adenocarcinoma pulmonar. A administração das composições inventivas também leva à supressão da invasão celular induzida por TNF e à abolição da osteoclastogênese induzida por RANKL. Além disso, a administração das composições inventivas suprime a expressão induzida por TNF de vários produtos gênicos antiapoptóticos, proliferativos e da metástase.

SUMÁRIO DA PRESENTE MATÉRIA INVENTIVA A presente matéria inventiva se refere a um método para modulação de um processo metabólico de eicosanóides nas células de um animal que dela necessita, os quais compreendem administrar ao animal uma quantidade de uma composição efetiva para regular a atividade de uma oxigenase de eicosanóides,

em que a composição compreende quantidades efetivas, do ponto de vista terapêutico, de extratos supercríticos de alecrim, açafrão-da-índia, orégano e gengibre; e quantidades efetivas, do ponto de vista terapêutico, de extratos hidroalcoólicos de manjericão sagrado, gengibre, açafrão-da-índia, Scutellaria baicalensis, alecrim, chá verde, huzhang, Coptis chinensis e uva- espim. A presente matéria inventiva também se refere a um método de administração de 13-S-HODE a um animal que dele necessita, compreendendo administrar ao animal uma composição que compreende quantidades efetivas, do ponto de vista terapêutico, de extratos supercríticos de alecrim, açafrão-da-índia, orégano e gengibre; e quantidades efetivas, do ponto de vista terapêutico, de extratos hidroalcoólicos de manjericão sagrado, gengibre, açafrão-da-índia, Scutellaria baicalensis, alecrim, chá verde, Coptis chinensis e uva-espim.

Além disso, a presente matéria inventiva se refere a um método de inflamação mediada por ácido araquidônico em um animal que dela necessita, compreendendo administrar ao animal uma composição que compreende quantidades efetivas, do ponto de vista terapêutico, de extratos supercríticos de alecrim, açafrão-da-índia, orégano e gengibre; e quantidades efetivas, do ponto de vista terapêutico, de extratos hidroalcoólicos de manjericão sagrado, gengibre, açafrão-da- índia, Scutellaria baicalensis, alecrim, chá verde, huzhang, Coptis chinensis e uva-espim.

Além disso, a presente matéria inventiva se refere a um método para modular o nível de produtos de produtos gênicos regulados por NF-KB nas células de um animal que dela necessita, compreendendo administrar ao animal uma composição que compreende quantidades efetivas, do ponto de vista terapêutico, de extratos supercríticos de alecrim, açafrão-da-índia, orégano e gengibre; e quantidades efetivas, do ponto de vista terapêutico, de extratos hidroalcoólicos de manjericão sagrado, gengibre, açafrão-da-índia, Scutellaria baicalensis, alecrim, chá verde, huzhang, Coptis chinensis e uva-espim.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 é um gráfico que representa o efeito inibitório das composições da presente matéria inventiva sobre o crescimento das linhagens celulares do câncer pulmonar A549 humano e da próstata PC3 humana.

A Figura 2 é um gráfico que representa o efeito das composições inventivas sobre a formação de PGE2.

A Figura 3 é um gráfico que representa o efeito das composições sobre a formação de PGE2 e 5-HETE nas células PC3. A Figura 4 é um gráfico que representa o efeito dependente da concentração das composições inventivas no metabolismo de eicosanóides nas células do câncer pulmonar A549 humano.

A Figura 5 ilustra dados de espectro de massa, que mostram a presença do 13-S-HODE nas composições inventivas.

A Figura 6 é um gráfico que representa o efeito antiinflamatório dos compostos inventivos sobre o edema de orelha em camundongos.

A Figura 7 é um gráfico que representa o efeito do 13-S-HODE sobre a proliferação de várias linhagens de células cancerosas.

A Figura 8 é um gráfico que representa o efeito inibitório dos compostos inventivos sobre o crescimento das linhagens celulares MCF7 e MDA231 do câncer de mama humano.

A Figura 9 é um Western blot que representa a capacidade das composições inventivas em promover a infra- regulação, de forma dependente da concentração, a presença da 5- lipoxigenase nas linhagens de células tumorais humanas (por exemplo, PC3).

A Figura 10 é um gráfico que representa o efeito das composições inventivas sobre o edema de orelha em camundongos, mediado por ácido araquidônico (AA). A Figura 11 (A) é uma série de fotografias representando células RAW 264.7 positivas ao ensaio TRAP após a incubação isoladamente ou na presença de 5 nm de RANKL com 0,8 mg/ml da composição inventiva durante 5 dias.

A Figura 11 (B) é um gráfico que representa o número de osteoclastos multinucleados (três núcleos) contados nas células RAW 264.7 após incubação, quer isoladamente ou na presença de 5 nm de RANKL com 0,8 mg/ml das composições inventivas durante 5 dias.

A Figura 12 é um gráfico que representa um ensaio de invasão de uma câmara de invasão em Matrigel após co-incubação noturna de 0,3 mg/ml das composições inventivas e 1 nM de TNF durante 24 horas na presença e na ausência de 1% de soro.

A Figura 13 é uma série de fotografias representando a morte celular das células U2 66 do mieloma múltiplo humano incubadas com 1 nm de TNF, 1 nM de taxol e 300 nM de doxorubicina, isoladamente ou em combinação com 0,5 mg/ml das composições inventivas, determinada pelo ensaio LIVE/DEAD à base de calceína-AM conforme descrito no presente documento. A cor vermelha realça as células mortas, e a cor verde realça as células vivas.

A Figura 14 (A) é uma fotografia que representa a ativação do NF-kB das células KBM-5 pré-incubadas com concentrações indicadas das composições inventivas, e tratadas com 0,1 nM TNF durante 30 minutos. A Figura 14 (B) é uma fotografia que representa a ativação do NF-kB das células KBM-5 pré-incubadas com 1 mg/ml das composições inventivas, e tratadas com 0,1 nM TNF durante 30 minutos.

A Figura 14 (C) é uma fotografia que representa a ativação do NF-kB das células KBM-5 pré-incubadas com 1 mg/ml das composições inventivas, e tratadas com fumaça de cigarro (10 μg/ml) durante 1 hora.

A Figura 15 (A) é uma fotografia que representa a expressão de proteínas proliferativas e metastáticas em células KBM-5 incubadas com 1 mg/ml das composições inventivas durante 1 hora e tratadas com 1 nM de TNF durante os tempos indicados.

A Figura 15 (B) é uma fotografia que representa a expressão de proteínas antiapoptóticas em células KBM-5 incubadas com 1 mg/ml das composições inventivas durante 1 hora e tratadas com 1 nM de TNF durante os tempos indicados.

A Figura 16 (A) é uma série de gráficos que representa gráficos de distribuição do ciclo de células. O gráfico superior-esquerdo representa uma distribuição do ciclo de células normal das células PC3. No gráfico superior-esquerdo, o tamanho do pico G2/M aumenta. O gráfico no canto inferior-esquerdo e no canto inferior-direito apresentam um bloco de ciclo de células crescente devido à concentração aumentada das composições inventivas. A Figura 16 (B) é um gráfico que representa os dados das análises de citometria de fluxo na Figura 16 (A) como um histograma.

A Figura 17 (A) é uma série de gráficos que representa células PC3 tratadas com as composições inventivas em concentrações indicadas, e então coradas com solução de Anexina V e PI.

A Figura 17 (B) é um gráfico que representa os dados das análises de citometria de fluxo na Figura 17 (A) como um histograma.

A Figura 18 (A) é um gráfico que representa a formação de PGE2 em relação às concentrações das composições inventivas apresentadas.

A Figura 18 (B) é um gráfico que representa a formação de 5-HETE em relação às concentrações das composições inventivas apresentadas.

A Figura 18 (C) é um gráfico que representa a formação de 12-HETE em relação às concentrações das composições inventivas apresentadas.

A Figura 18 (D) é uma fotografia de um "Western Blot" que representa o tratamento das células PC3 com as composições inventivas e o conteúdo celular da proteína 5-LOX.

A Figura 19 (A) é uma fotografia de um Western blot representando a proteína retinoplastoma tanto como proteínas não fosforiladas (Rb) quanto fosforiladas (pRb). A Figura 19 (B) é um gráfico que representa os dados na Figura 19 (A) após a varredura dos géis em um dispositivo de varredura fotométrica para permitir a quantificação da densidade das bandas.

A Figura 20 (A) é um gráfico que representa as células PC3 tratadas com as composições inventivas nas concentrações indicadas e a inibição da proliferação celular.

A Figura 20 (B) é uma fotografia de um Western blot representando um declínio dependente da concentração na expressão das pRb produzidas pelas composições inventivas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA PRESENTE MATÉRIA INVENTIVA

Definições

O termo "modulação" refere-se ao processo de produzir um efeito sobre a atividade biológica, função, saúde ou condição de um organismo em que tal atividade biológica, função, saúde ou condição é mantida, melhorada, diminuída ou tratada de maneira consonante com a saúde geral e bem-estar do organismo.

O termo "melhoramento" da atividade biológica, função, saúde ou condição de um organismo refere-se ao processo de aumentar, fortificar, reforçar ou aperfeiçoar.

O termo "eicosanóide" refere-se a qualquer um da classe de compostos derivada de ácidos graxos poliinsaturados, como ácido araquidônico e ácido linolínico, e envolvida na atividade celular. O termo "oxigenase" refere-se a qualquer uma da classe de enzimas que catalisa a incorporação de oxigênio molecular em seu substrato.

O termo "gás supercrítico" ou "fluido supercrítico", conforme usados neste documento, referem-se a um gás que é aquecido a um ponto crítico de temperatura, acima do qual o gás mantém seu estado gasoso e não vira líquido, seja qual for a pressão. Um gás aquecido a uma temperatura acima de seu ponto crítico se tornará muito denso sob compressão, fazendo com que suas características se assemelham a de um fluido, mas se tornará líquido. Costuma-se usar dióxido de carbono em aplicações que exigem um fluido supercrítico. As propriedades gerais dos fluidos supercríticos e o uso geral dos fluidos supercríticos em processos de extração são descritos, por exemplo, em Taylor, Supercritical Fluid Extraction, Wiley, 1996; McHugh and Krukonis, Supercritical Fluid Extraction: Principies and Practice, 2nd ed., Butterworth-Heinemann, 1994; e em Williams and Clifford, Supercritical Fluid Methods and Protocols, Humana Press, 2000, cujo conteúdo é incorporado a este documento para fins de referência.

Os requerentes desenvolveram uma mistura composta de extratos de ervas, e a mistura possui atividade inibitória de COX-2. As composições dos requerentes são únicas, uma vez que alguns dos componentes da composição são preparados via um processo de extração supercrítica de CO2. Ao contrário dos tradicionais métodos de extração baseados em solvente, a extração supercrítica de CO2 permite que os produtos naturais nas ervas sejam obtidos sem deixar para trás resíduos químicos na preparação.

O termo "extração supercrítica", conforme usado neste documento, refere-se à técnica em que os compostos hidrófobos podem ser extraídos de amostras utilizando um fluido supercrítico. A força de solvatação de um fluido supercrítico é aumentada à medida que a pressão e a temperatura são aumentadas acima de seus pontos críticos, produzindo um solvente eficaz para a isolação das moléculas hidrófobas. O termo "extratos supercríticos" refere-se a extratos preparados por extração supercrítica.

O termo "extração hidroalcoólica", conforme usado neste documento, refere-se à técnica em que os compostos hidrófobos podem ser extraídos de uma amostra utilizando uma solução de álcool e água, seguido pela evaporação da solução para produzir um extrato consistindo de partículas sólidas dissolvidas.

O termo "extratos hidroalcoólicos" refere-se a extratos preparados por extração hidroalcoólica.

O termo "1—S-HODE" refere-se ao ácido 13- hidroxioctadeca-9Z, HE-dienóico.

O termo "NF-kB" ou "fator nuclear kappa B" refere-se a um fator de transcrição de transcrição de subunidades múltiplas envolvido na expressão gênica. O NF-kB ativo consiste de um dímero de uma subunidade da família REL/p65 e uma subunidade p50 ou p52. O NF-kB é mantido no citoplasma por meio de interações com seu inibidor IkB, mas ao sofrer dissociação, transloca-se para dentro do núcleo.

Composições Inventivas

As composições inventivas são um tipo de preparação de várias ervas compreendendo constituintes que apresentam atividades antiproliferativas, antiinflamatórias, antioxidantes, antiangiogênicas e apoptóticas. As composições inventivas são compostas de quantidades efetivas, do ponto de vista terapêutico, de extratos supercríticos de alecrim, açafrão-da- índia, orégano e gengibre; e quantidades efetivas, do ponto de vista terapêutico, de extratos hidroalcoólicos de manjericão sagrado, gengibre, açafrão-da-índia, Scutellaria baicalensis, alecrim, chá verde, Coptis chinensis e uva-espim.

Em um aspecto, a composição ativa compreende:

(A) de cerca de 4,5% a cerca de 7,5%, e mais preferivelmente, de cerca de 5,5% a cerca de 6,5%, em peso, do extrato hidroalcoólico de gengibre;

(A) de cerca de 5,5% a cerca de 8,5%, e mais preferivelmente, de cerca de 6% a cerca de 8%, em peso, do extrato supercrítico de gengibre;

(C) de cerca de 1,0% a cerca de 1,5%, e mais preferivelmente, de cerca de 1,2% a cerca de 1,4%, em peso, do extrato supercrítico de açafrão-da-índia; (D) de cerca de 10,0% a cerca de 16,0%, e mais preferivelmente, de cerca de 11,5% a cerca de 14,5%, em peso, do extrato supercrítico de gengibre;

(E) de cerca de 4,0% a cerca de 6,0%, e mais preferivelmente, de cerca de 4,5% a cerca de 5,5%, em peso, do extrato supercrítico de orégano;

(F) de cerca de 10,0% a cerca de 16,0%, e mais preferivelmente, de cerca de 11,5% a cerca de 14,5%, em peso, do extrato hidroalcoólico de açafrão-da-índia;

(G) de cerca de 5,5% a cerca de 8,0%, e mais preferivelmente, de cerca de 6,0% a cerca de 7,0%, em peso, do extrato supercrítico de alecrim;

(H) de cerca de 10,0% a cerca de 16,0%, e mais preferivelmente, de cerca de 11,5% a cerca de 14,5%, em peso, do extrato hidroalcoólico de manjericão sagrado;

(I) de cerca de 10,0% a cerca de 16,0%, e mais preferivelmente, de cerca de 11,5% a cerca de 14,5%, em peso, do extrato hidroalcoólico de chá verde;

(J) de cerca de 8,0% a cerca de 12,0%, e mais preferivelmente, de cerca de 9,0% a cerca de 11,0%, em peso, do extrato supercrítico de huzhang;

(K) de cerca de 4,0% a cerca de 6,0%, e mais preferivelmente, de cerca de 4,5% a cerca de 5,5%, em peso, do extrato hidroalcoólico de Coptis chinensis; (L) de cerca de 4,0% a cerca de 6,0%, e mais preferivelmente, de cerca de 4,5% a cerca de 5,5%, em peso, do extrato hidroalcoólico de uva-espim; e

(M) de cerca de 2,0% a cerca de 3,0%, e mais preferivelmente, de cerca de 2,25% a cerca de 2,75%, em peso, do extrato hidroalcoólico de Scutellaria baicalensis.

Como opção, o extrato hidroalcoólico de gengibre, alecrim, açafrão-da-índia ou orégano usado na presente invenção é, de preferência, preparado como se segue. A planta, ou uma parte dela, que, de preferência, é triturada criogenicamente para conservar os componentes sensíveis ao calor, é submetida à extração supercrítica, de preferência com dióxido de carbono, para obter um extrato de óleo, aqui denominado "extrato supercrítico". Em uma concretização opcional adicional, um resíduo livre de óleo é isolado da primeira etapa e é então extraído em uma mistura de água, de preferência água/etanol, composta de 60 a 80 partes de álcool e 40 a 20 partes de água. O líquido de álcool/água é então evaporado, deixando um resíduo de extrato em pó, aqui denominado "extrato hidroalcoólico".

Os extratos supercríticos de gengibre, alecrim, açafrão-da-índia e orégano, opcionalmente usados na presente invenção, podem ser preparados de acordo com métodos conhecidos de extração supercrítica, como os revelados, por exemplo, em E. Stahl, K. W. 5 Quirin, D. Gerard, Dense Gases for Extraction and Refining, Springer Verlag 4 1988, incorporado a este documento para fins de referência. Em um aspecto preferido, a razão de peso do extrato supercrítico de gengibre para o extrato hidroalcoólico de extrato de gengibre é de cerca de 0,8:1 a cerca de 1,4:1.

Os extratos hidroalcoólicos de alecrim, açafrão- da-índia, manjericão sagrado, chá verde, huzhang, Coptis chinensis, uva-espim e Scutellaria baicalensis usados na presente invenção podem ser preparados de acordo com técnicas de extração hidroalcoólica convencionais. Por exemplo, os extratos hidroalcoólicos podem ser preparados extraindo-se a parte da planta em uma mistura de água/álcool, de preferência água/etanol, de preferência composta de 60 a 80 partes de álcool e 40 a 20 partes de água, e em seguida evaporando o líquido de água/álcool, deixando um resíduo de extrato em pó, aqui denominado "extrato hidroalcoólico".

Em ainda outro aspecto , a razão de peso do extrato hidroalcoólico de açafrão-da-índia para o extrato supercrítico de extrato de açafrão-da-índia é de cerca de 8:1 a cerca de 12:1.

Em um aspecto alternativo, a razão de peso do extrato supercrítico de alecrim para o extrato hidroalcoólico de extrato de gengibre é de cerca de 1,6:1 a cerca de 2,4:1.

Em ainda outro aspecto, o extrato hidroalcoólico de gengibre compreende de cerca de 2,4% a cerca de 3,6%, mais preferivelmente de cerca de 2,7% a cerca de 3,3%, e ainda mais preferivelmente cerca de 3,0%, em peso, de componentes pungentes. Em ainda outro aspecto, o extrato supercrítico de gengibre compreende de cerca de 24% a cerca de 36%, mais preferivelmente de cerca de 27% a cerca de 33%, e ainda mais preferivelmente cerca de 30%, em peso, de componentes pungentes, e de cerca de 6.4% a cerca de 9,6%, mais preferivelmente de cerca de 7,2% a cerca de 8,8%, e mais preferivelmente de cerca de 8%, em peso, de zingibereno.

Em ainda outro aspecto, o extrato supercrítico de gengibre compreende de cerca de 36% a cerca de 54%, mais preferivelmente de cerca de 40,5% a cerca de 49,5%, e ainda mais preferivelmente cerca de 45%, em peso, de turmeronas.

Em outro aspecto, o extrato supercrítico de alecrim compreende de cerca de 18,4% a cerca de 27,6%, mais preferivelmente de cerca de 20,7% a cerca de 25,3%, e ainda mais preferivelmente cerca de 23%, em peso, de antioxidantes fenólicos totais.

Em ainda outro aspecto, o extrato supercrítico de orégano compreende mais do que cerca de 4,0%, mais preferivelmente de 4,5% a cerca de 5,5%, e mais preferivelmente cerca de 5,0%, em peso, de antioxidantes fenólicos totais.

Em ainda outro aspecto, o extrato hidroalcoólico de açafrão-da-índia compreende de cerca de 5,6% a cerca de 8,4%, mais preferivelmente de cerca de 6,3% a cerca de 7,7%, e ainda mais preferivelmente cerca de 7%, em peso, de curcumina.

Em outro aspecto, o extrato hidroalcoólico de alecrim compreende de cerca de 18,4% a cerca de 27,6%, mais preferivelmente de cerca de 20,7% a cerca de 25,3%, e ainda mais preferivelmente cerca de 23%, em peso, de antioxidantes fenólicos totais.

Em uma concretização adicional, o extrato hidroalcoólico de manjericão sagrado compreende de cerca de 1,6% a cerca de 2,4%, mais preferivelmente de cerca de 1,8% a cerca de 2,2%, e ainda mais preferivelmente cerca de 2%, em peso, de ácido ursólico.

Em outro aspecto, o extrato hidroalcoólico de chá verde compreende de cerca de 36% a cerca de 54%, mais preferivelmente de cerca de 40,5% a cerca de 49,5%, e ainda mais preferivelmente cerca de 45%, em peso, de polifenóis. Em outro aspecto, o extrato hidroalcoólico de huzhang compreende de cerca de 6,4% a cerca de 9,6%, mais preferivelmente de cerca de 7,2% a cerca de 8,8%, e ainda mais preferivelmente cerca de 8%, em peso, de antioxidantes fenólicos totais.

Em outra concretização, o extrato hidroalcoólico de Coptis chinensis compreende de cerca de 4,8% a cerca de 7,2%, mais preferivelmente de cerca de 5,4% a cerca de 6,6%, e ainda mais preferivelmente cerca de 6%, em peso, de berberina.

Em outro aspecto, o extrato hidroalcoólico de uva-espim compreende de cerca de 4,8% a cerca de 7,2%, mais preferivelmente de cerca de 5,4% a cerca de 6,6%, e ainda mais preferivelmente cerca de 6%, em peso, de berberina. Em um aspecto alternativo, a referida composição compreende:

(A) de cerca de 4,5% a cerca de 7,5%, em peso, do extrato hidroalcoólico de gengibre, em que o extrato compreende de cerca de 2,4% a cerca de 3,6%, em peso de compostos pungentes;

(B) de cerca de 5,5% a cerca de 8,5%, em peso, do extrato supercrítico de gengibre, em que o extrato compreende de cerca de 24% a cerca de 36%, em peso, de compostos pungentes, e de cerca de 6,4% a cerca de 9,6%, em peso, de zingibereno;

(C) de cerca de 1,0% a cerca de 1,5%, em peso, do extrato hidroalcoólico de gengibre, em que o extrato compreende de cerca de 36% a cerca de 54%, em peso, de turmeronas;

(C) de cerca de 10,0% a cerca de 16,0%, em peso, do extrato supercrítico de alecrim, em que o extrato compreende de cerca de 18,4% a cerca de 27,6%, em peso, de antioxidantes fenólicos totais;

(E) de cerca de 4,0% a cerca de 6,0%, em peso, do extrato supercrítico de orégano, em que o extrato compreende maior do que 4,0%, em peso, de antioxidantes fenólicos totais;

(F) de cerca de 10,0% a cerca de 16,0%, em peso, do extrato hidroalcoólico de açafrão-da-índia, em que o extrato compreende de cerca de 5,6% a cerca de 8,4%, em peso, de curcumina; (G) de cerca de 5,5% a cerca de 8,0%, em peso, do extrato hidroalcoólico de alecrim, em que o extrato compreende de cerca de 18,4% a cerca de 27,6%, em peso, de antioxidantes fenólicos totais;

(H) de cerca de 10,0% a cerca de 16,0%, em peso, do extrato hidroalcoólico de manjericão sagrado, em que o extrato compreende de cerca de 1,6% a cerca de 2,4%, em peso, de ácido ursólico;

(I) de cerca de 10,0% a cerca de 16,0%, em peso, do extrato hidroalcoólico de chá verde, em que o extrato compreende de cerca de 36% a cerca de 54%, em peso, de polifenóis;

(J) de cerca de 8,0% a cerca de 12,0%, em peso, do extrato hidroalcoólico de huzhang, em que o extrato compreende de cerca de 6,4% a cerca de 9,6%, em peso, de reservatróis;

(K) de cerca de 4,0% a cerca de 6,0%, em peso, do extrato hidroalcoólico de Coptis chinensis, em que o extrato compreende de cerca de 4,8% a cerca de 7,2%, em peso, de berberina;

(L) de cerca de 4,0% a cerca de 6,0%, em peso, do extrato hidroalcoólico de uva-espim, em que o extrato compreende de cerca de 4,8% a cerca de 7,2%, em peso, de berberina; e

(M) de cerca de 2,0% a cerca de 3,0%, em peso, do extrato hidroalcoólico de Scutellaria baicalensis; e em que a referida composição adicionalmente compreende:

(i) o extrato supercrítico de gengibre e o extrato hidroalcoólico de gengibre, em uma razão de peso de cerca de 0,8 a cerca de 1,4 partes de extrato supercrítico por 1 parte de extrato hidroalcoólico;

(ii) o extrato hidroalcoólico de açafrão-da-índia e o extrato supercrítico de açafrão-da-índia, em uma razão de peso de cerca de 8 a cerca de 12 partes de extrato hidroalcoólico por 1 parte de extrato supercrítico; e

(iii) o extrato supercrítico de alecrim e o extrato hidroalcoólico de alecrim, em uma razão de peso de cerca de 1,6 a cerca de 2,4 partes de extrato supercrítico por 1 parte de extrato hidroalcoólico.

Em um aspecto alternativo, a composição compreende um agente adicional selecionado dentre o grupo que consiste de agentes antineoplásicos, agentes de inibição do crescimento e nutrientes.

Na Tabela 1, é apresentada uma concretização preferida da composição administração por via oral, excluindo-se os ingredientes inativos, conforme usados nos métodos inventivos.

As quantidades citadas na Tabela 1 representam a dosagem preferida dos ingredientes listados.

TABELA 1 <table>table see original document page 22</column></row><table> Baicalensis (5:1)

De preferência, a composição apresentada na Tabela 1 também inclui azeite de oliva extra virgem e cera de abelha amarela.

Métodos da Presente Matéria Inventiva

As composições da presente matéria inventiva compreendem, em geral, extratos concentrados supercríticos de CO2 de produtos de plantas (gengibre, alecrim, raiz de tumérico, manjericão sagrado, chá verde, huzhang, Coptis chinensis, uva- espim, orégano e solidéu de Baical), geralmente consumidos na dieta Oriental.

As composições inventivas foram investigadas em relação a seus efeitos antiproliferativos em células PC3 humanas, e analisadas especificamente em relação a seus efeitos sobre o metabolismo de eicosanóides nesta linhagem de células de câncer de próstata. Foi observado que as composições inventivas produzem uma inibição dependente da concentração de atividades de COx-1, COx-2 e 5-LOX clonada, com a inibição da produção de 5-HETE sendo maior do que a da formação de PGE2.

Aplicadas a células PC3 intactas, as composições inventivas revelaram ser as mais potentes contra as atividades de 12-LOX, seguido por 5-LOX e então COX. Por incrível que pareça, a aparição do 13-S-HODE nas células PC3 deveu-se à presença desse eicosanóide na própria composição inventiva, e não a uma estimulação da atividade de 16-LOX dentro das células. A inibição dependente da concentração da proliferação das células PC3 estava associada a um bloqueio seletivo em G2/M do ciclo celular e à indução da apoptose, conforme evidenciado pela coloração da citometria de fluxo das células PC3 com anexina V e fosfatidil inositol.

As composições inventivas também produziram uma infra-regulação dependente da concentração da expressão de 5-LOX e 12-LOX, apesar de ter sido observada, em altas concentrações, uma supra-regulação da expressão de COX-2. A condição de fosforilação das várias proteínas de transdução de sinal celular foi determinada. As composições inventivas produziram um aumento na fosforilação de p21, mas promoveram a infra-regulação da fosforilação das proteínas Rb e STATl. A diminuição nas proteínas pRb revelou ser 0 devido à inibição de 12-LOX e um declínio nos níveis de 12-HETE nas células. A adição de 12-HETE de volta às células tratadas com as composições inventivas superou a capacidade das composições inventivas em inibir a proliferação celular, portanto, o 12-HETE bloqueou a capacidade das composições inventivas em infra- regular a fosforilação da proteína Rb.

Conclui-se que o controle eficaz da proliferação das células de câncer de próstata humanas com as composições inventivas é multi-mecanístico, mas em parte, envolve a regulação do metabolismo de eicosanóides de células tumorais aberrantes como 12-LOX, a aplicação de produtos de eicosanóides derivados de plantas, como 13-(S)-HODE, bem como a restauração da função da proteína supressora do tumor Rb pela regulação de sua condição de fosforilação.

Além disso, outros experimentos demonstraram que, embora as composições tenham apresentado uma possível inibição das atividades da ciclooxigenase (COX-1 e COX-2 clonadas), acredita—se a capacidade de reduzir o crescimento do crescimento das células tumorais da próstata humana produzido por esse produto deva-se, em grande parte, a mecanismos independentes da COX-2. Usando um método baseado em LC/MS/MS que determina simultaneamente múltiplos eicosanóides nas células e tecidos, foram examinadas as alterações no metabolismo de eicosanóides nas células e tecidos produzidos por essa composição única de ervas.

Os níveis endógenos de PGE2 intracelular, 12- HETE, bem como de 5-HETE, declinaram de forma dependente da concentração ao serem expostos às composições. Em contrapartida, os níveis celulares de 15-HETE e 13-HODE foram elevados. A elevação do 13-HODE foi drástica, mas, conforme discutido acima, deveu-se ao alto teor de 13-HODE presente na própria composição de ervas, e não dependeu da geração celular desse importante eicosanóide. Os níveis de 13-HODE foram considerados suficientemente altos para explicar a inibição do crescimento celular do tumor que foi verificado independentemente pela adição de 13-HODE autêntico às culturas de células tumorais. A exposição das células tumorais humanas (células de câncer de próstata PC3) à composição inventiva também resultou na infra-regulação da expressão de 5-LOX, conforme determinado por análises Western blot. A capacidade da composição inventiva em bloquear inflamação da orelha em camundongos mediada por ácido araquidônico também foi avaliada. As composições inventivas produziram inibição significativa da síntese de LBT4 e promoveram a supra-regulação da produção de 15-HETE.

Assim, a presente matéria inventiva se refere a um método para modulação de um processo metabólico de eicosanóides nas células de um animal que dela necessita, que compreende compreendem administrar ao animal uma quantidade de uma composição efetiva para regular a atividade de uma oxigenase de eicosanóides,

em que a composição compreende quantidades efetivas, do ponto de vista terapêutico, de extratos supercríticos de alecrim, açafrão-da-índia, orégano e gengibre; e quantidades efetivas, do ponto de vista terapêutico, de extratos hidroalcoólicos de manjericão sagrado, gengibre, açafrão-da-índia, Scutellaria baicalensis, alecrim, chá verde, huzhang, Coptis chinensis e uvaespim.

Em um aspecto da presente matéria inventiva, as células são células cancerosas. Em uma concretização, as células cancerosas compreendem células de câncer de próstata, células de câncer de mama, células de câncer de pulmão, células de câncer de cólon ou uma combinação destas.

Em uma concretização alternativa o processo metabólico de eicosanóides é um metabolismo aberrante associado à transformação celular para câncer, proliferação de células cancerosas, metástase de células cancerosas, invasividade de células cancerosas, angiogênese modulada por células cancerosas, supressão de apoptose modulada por células cancerosas, ou uma combinação destes.

Metabolismo de Eicosanóides.

O ácido araquidônico e seu precursor, o ácido linoléico, junto com o ácido linolínico, estão presentes em gorduras animais e em uma grande variedade de óleos vegetais, que, em geral, são consumidos em quantidade mais abundante do que na típica dieta ocidental em comparação com as dietas ocidentais. O consumo elevado desses ácidos graxos resulta em maior disponibilidade do substrato para oxigenases, tais como lipoxigenases (LOX) e ciclooxigenases (COX), enzimas responsáveis por converter os eicosanóides, tal como ácido araquidônico, em moléculas de sinalização, como prostaglandinas, leucotrienos, lipoxinas, 13-S-HODE, 5-HETE e 12-HETE. Além de sua função vital como mensageiros secundários em muitas vias biológicas importantes, esses produtos do metabolismo de eicosanóides estão envolvidos em todos os aspectos do desenvolvimento, progressão, proliferação e metástase tumoral. Lipoxigenases e Metabolismo de Eicosanóides.

As enzimas lipoxigenases (LOXs) são conhecidas por serem reguladores fundamentais da sobrevivência celular e apoptose nas células. Elas constituem uma família heterogênea de enzimas de peroxidação que são categorizadas com respeito a sua especificidade regional da oxigenação do ácido araquidônico. As LOXs são nomeadas como isoformas 5-, 8-, 12- e 15-LOX, que produzem produtos finais conhecidos como 5(S)-, 8(S)-, 12(S)-, and 15(S)-HETEs. A aplicação das análises LC/MS/MS do metabolismo de COX e LOX nas células PC3 foi realizada usando uma técnica já publicada. Os resultados mostraram que as composições inventivas foram, como esperado, um inibidor da atividade enzimática clonada tanto de COX-I como de COX-2. Além disso, ela também inibiu a atividade de 5- LOX clonada, e, de fato, foi mais potente como um inibidor de 5- LOX do que como um inibidor de COX. O tratamento das células PC3 em cultura mostrou que a capacidade da composição inventiva em inibir a formação de PGE2 pela inibição de COX foi menor do que sua capacidade de inibir 5-LOX, e esta, por sua vez, foi menor do que a inibição mediada pela composição inventiva de 12-LOX, uma enzima conhecida por ser importante na proliferação e nas metástases do câncer de próstata humano.

12-HETE. Muitas linhas de evidência agora envolvem claramente a 12-LOX como um regulador do desenvolvimento das células cancerosas. O laboratório de K. Honn, em particular, contribuiu muito para o entendimento do papel da 12-LOX tipo plaqueta e seu produto 12(S)-HETE no câncer de próstata humano. Eles relataram, por exemplo, que 12- LOX é expressa em várias linhagens celulares do câncer de próstata, que os inibidores de 12-LOX, como baicaleína ou BHPP, inibem significativamente as metástases tumorais da próstata e que os níveis de 12-LOX estão correlacionados com o tipo e gravidade dos tumores de próstata humanos. Um virtuoso relatório recente desse grupo também mostrou que a inibição da baicaleína do crescimento celular da próstata e da proliferação está associada, especificamente, à inibição de 12-LOX, e que o declínio no 12-HETE se correlaciona com uma perda de proteínas Rb fosforiladas. A fosforilação diminuída da RB, por sua vez, resulta em que a proteína RB permanece ligada a fatores de transcrição necessários para a síntese do DNA, e, assim, resulta na inibição da proliferação das células cancerosas.

Há muitos lipídios bioativos envolvidos na inflamação associada a cânceres, tal como o câncer de próstata em estágio precoce. Isso inclui a capacidade bem documentada do PGE2 em estimular a proliferação das células tumorais.

Geralmente, isso ocorre mediante uma superexpressão de COX-2 nos tumores, bem como pela descoberta mais recente de uma diminuição na atividade de PGDH, a enzima responsável pelo metabolismo de PGE2. Os produtos da lipoxigenase, como 5-HETE da 5-lipoxigenase e 12- HETE da 12-lipoxigenase, também foram revelados como impulsionadores específicos da proliferação das células tumorais da próstata. Devido ao fato de 12-HETE ter sido apresentado como associado à proliferação do câncer de próstata, às metástases e à angiogênese, foi levantada recentemente a hipótese de que a inibição de 12-LOX representa um método terapêutico em potencial no tratamento do câncer de próstata. Outros eicosanóides, como 13-S-HODE, o produto de 15-LOX-l, e 15- HETE, o produto de 15-LOX-2, parecem desempenhar efeitos opostos na sinalização nos cânceres, especialmente no câncer de próstata, e podem, de fato, terem efeitos seletivos quanto ao tipo de tumor.

Para entender melhor o papel dos eicosanóides bioativos selecionados na progressão da inflamação de tecido em direção à doença maligna, os Requerentes realizaram uma análise dos perfis de inflação relacionados às células da próstata usando um ensaio de espectrometria de massa seqüencial com ionização por eletropulverização. Esse método permite a determinação de "minipartículas lipidômicas" em amostras de células ou tecidos por meio de análises simultâneas de até 10 eicosanóides derivados de ciclooxigenase, lipoxigenase e/ou citocromo P450 de uma só vez, sem a necessidade de adicionar substratos exógenos, como ácido araquidônico ou ácido linoléico.

Para entender melhor o papel dos eicosanóides no câncer humano, os Requerentes usaram essa nova análise de inflamação de tecido nas células PC3 para determinar o efeito das composições inventivas sobre os eicosanóides derivados da ciclooxigenase e da lipoxigenase tidos como importantes na proliferação dessa doença humana.

Os requerentes determinaram quais efeitos, ou se houve efeito, das composições inventivas sobre o metabolismo de eicosanóides além da inibição da atividade da ciclooxigenase. Nossos dados indicam que esse produto de várias ervas inibe as atividades de 5-LOX e 12-LOX. A última descoberta pode ser de especial interesse, uma vez que foi descoberto que a supressão da atividade de 12-LOX está associada especificamente à inibição da proliferação de células tumorais e à fosforilação de Rb, e assim, ao retorno da atividade supressora tumoral às células tumorais da próstata PC3 refratárias a hormônio.

Portanto, em uma concretização preferida, o eicosanóide é selecionado dentre o grupo que consiste de ácido araquidônico e ácido linolínico.

Em uma concretização mais preferida, o eicosanóide é ácido araquidônico.

Em um aspecto adicional da presente matéria inventiva, a oxigenase de eicosanóides é ciclooxigenase-1, ciclooxigenase-2, 5-lipoxigenase, 12-lipoxigenase ou uma combinação destas.

Em uma concretização preferida, a oxigenase de eicosanóides é 12-lipoxigenase.

Em outra concretização preferida, a oxigenase de eicosanóides é 5-lipoxigenase. Ciclooxigenases. As enzimas da ciclooxigenase que mediam o metabolismo de eicosanóides são representadas por duas espécies, ciclooxigenase-1 (COX-1), que é expressa de maneira constitutiva em muitos tecidos, e ciclooxigenase-2 (COX-2), que geralmente é induzida durante estados de doença, como inflamação e câncer. Dados de muitos estudos de biologia molecular e celular também apontam que o gene da COX-2 é um gene de resposta precoce ao crescimento que afeta vias que modulam a apoptose, a proliferação, a adesão, a angiogênese e a diferenciação.

A inibição da COX, em especial da COX-2, durante muitos anos foi a meta principal da elaboração de fármacos antiinflamatórios; porém, a ligação entre a expressão da COX-2 e o câncer só foi reconhecida mais recentemente. Observações de vários estudos baseados na população documentaram uma diminuição significativa no risco de câncer em 10 pessoas que tomam com freqüência antiinflamatórios não- esteróides com potente atividade inibitória de COX. Estudos histológicos que seguiram o desenvolvimento do tumor colorretal determinaram que a maioria dos tumores colorretais humanos e animais expressam elevados níveis de COX-2, ao passo que as células epiteliais colorretais normais adjacentes possuem desde níveis de COX-2 baixos até indetectáveis. De forma similar a essas observações, vários laboratórios também relataram que a expressão de COX-2 é elevada nas células tumorais da próstata tanto durante a iniciação quanto durante a progressão, se comparado as células epiteliais normais, mas, no entanto, esta descoberta é controversa.

Entretanto, é claro que vários fármacos inibitórios de COX-2 farmacológicos mostraram a capacidade de suprimir o crescimento das células cancerosas da próstata in vitro, induzir a apoptose e suprimir o crescimento de xenoenxertos tumorais da próstata humana em 15 modelos de camundongos de camundongos imunodeficientes ou modelos transgênicos de câncer de próstata, tal como o camundongo TRAMP. Dada a controvérsia quanto a se COX-2 é um fator no desenvolvimento ou na progressão do câncer de próstata, imagina-se que vários dos inibidores de COX conhecidos tenham uma variedade de efeitos contra o câncer, e essas ações parecem divergir entre os inibidores.

Nesse aspecto, é muito interessante que diversas plantas predominantes em dietas regionais contenham substâncias com atividade inibitória da COX. Os extratos dessas plantas, tanto na forma bruta quanto como componentes isolados, demonstraram ter potentes atividades antiinflamatórias e contra o câncer. O ácido salicílico, por exemplo, é um agente inibidor inflamatório tradicional encontrado na casca de salgueiro, e o derivado químico desse agente, aspirina, continua sendo uma das substâncias inibitórias de COX mais usadas no mundo. Nesse estudo, os requerentes consideraram o potencial de uma única preparação de ervas disponível para comercialização, as composições inventivas, pela sua capacidade de afetar as atividades das enzimas COX-I e C0X-2 e influenciar no comportamento de um sistema de modelo de células de câncer de próstata humano geralmente utilizado, células LNCap. Conforme discutido em detalhes acima, as composições inventivas são compostas de dez extratos de ervas padronizados (alecrim, açafrão-da-índia, gengibre, manjericão sagrado, chá verde, huz hang, Coptis chinensis, uva-espim, orégano e Scutellaria baicalensis). Foi comprovado que cada uma dessas ervas contém constituintes químicos únicos que influenciam a atividade ou expressão da COX, e cada uma foi estudada em relação à atividade antiinflamatória ou anti-câncer. Esse teste tende a focar- se no composto predominante encontrado em qualquer uma de tais ervas, mas, no entanto, há razões para se acreditar que pode existir benefício adicional na combinação de várias ervas / agentes de dieta para doenças como o câncer. Os vários constituintes diversos, do ponto de vista químico, presentes na composição inventiva, cada um dos quais é um componente integral da típica dieta asiática, podem ser mais eficazes contra o câncer de próstata do que qualquer extrato de ervas separado.

Assim, em um aspecto alternativo da presente matéria inventiva, a oxigenase de eicosanóides é ciclooxigenase- 1, ciclooxigenase-2 uma combinação destas.

Em uma concretização preferida, a oxigenase de eicosanóides é ciclooxigenase-1.

Em outra concretização preferida, a oxigenase de eicosanóides é ciclooxigenase-2. Em um aspecto alternativo da presente matéria inventiva, a regulação da atividade da oxigenase de eicosanóides é a inibição da oxigenase.

Em um aspecto alternativo da presente matéria inventiva, a modulação de um processo metabólico de eicosanóides compreende a inibição da atividade de NF-kB nas células do animal.

A presente matéria inventiva também se refere a um método de administração de 13-S-HODE a um animal que dele necessita, compreendendo administrar ao animal uma composição que compreende quantidades efetivas, do ponto de vista terapêutico, de extratos supercríticos de alecrim, açafrão-da- índia, orégano e gengibre; e quantidades efetivas, do ponto de vista terapêutico, de extratos hidroalcoólicos de manjericão sagrado, gengibre, açafrão-da-índia, Scutellaria baicalensis, alecrim, chá verde, Coptis chinensis e uva-espim.

Além disso, a presente matéria inventiva se refere a um método de inflamação mediada por ácido araquidônico em um animal que dela necessita, compreendendo administrar ao animal uma composição que compreende quantidades efetivas, do ponto de vista terapêutico, de extratos supercríticos de alecrim, açafrão-da-índia, orégano e gengibre; e quantidades efetivas, do ponto de vista terapêutico, de extratos hidroalcoólicos de manjericão sagrado, gengibre, açafrão-da- índia, Scutellaria baicalensis, alecrim, chá verde, huzhang, Coptis chinensis e uva-espim. NF-KB. O fator nuclear kB é uma família de proteínas contendo o domínio Rei, presente no citoplasma de toda as células, em que elas são mantidas em um estado inativo por uma família de proteínas contendo domínio da ancorina, que inclui IKBa, IKBβ, IKB, ΙΚΒε, bcl-3, pl05 e p100. Sob condições de repouso, a NF-kB consiste de um heterotrímero de p50, p65 e IKBa no citoplasma; somente quando ativado e translocado para o núcleo, ocorre a seqüência de eventos levando à transcrição iniciada. A maioria dos carcinógenos, agentes inflamatórios e promomotores tumorais, inclusive o condensado de fumaça de cigarro, forbol éster, ácido ocadáico, H2O2 e o fator de necrose tumoral (TNF), demonstraram ativar uma via de ativação de NF-kB. A ativação de NF-kB envolve a fosforilação, ubiquitinação e degradação de IkBa e a fosforilação de p65, o que, por sua vez, resulta na translocação de NF-kB para o núcleo da célula, onde ele se liga a elementos de resposta específicos no DNA. A fosforilação de IkBa é catalisada pela IkBa quinase (IKK), que é essencial para a ativação do NF-kB pela maioria dos agentes. O NF-kB demonstrou ser capaz de regular a expressão de uma série de genes, cujos produtos estão envolvidos na tumorigênese. Estes incluem genes antiapoptóticos (por exemplo, ciap, suvivina, traf, cflip, bfl-1, bcl-2 and bcl-xl), angiogênese (cox-2, mmp-9, vegf), genes codificando moléculas de adesão, quemoquinas e citocinas inflamatórias; e genes reguladores do ciclo celular (por exemplo, ciclina dl, c-mic). Sem se limitar a um mecanismo de ação em particular, os requerentes acreditam que as composições inventivas modulam a atividade do fator nuclear kB ("NF-kB"), que, por sua vez, regula a proliferação, invasão e metástase das células tumorais, inibe a ativação da NF-kB de realimentação, e regula a expressão dos produtos gênicos regulados por NF-kB. Em particular, os Requerentes descobriram que as composições inventivas inibem o ativador do receptor da osteoclastogênese induzida pelo ligante do NF-kB, suprimem a invasão induzida pelo fator de necrose tumoral (TNF) e potencializa a apoptose induzida por TNF e agentes quimioterápicos. Além disso, as composições inventivas suprimem a ativação do NF-kB induzida tanto pelo TNF quanto pelo condensador de fumaça de cigarro. Além disso, as composições inventivas promovem a infra- regulação da expressão de produtos gênicos regulados por NF-KB envolvidos na antiapoptose, inclusive o inibidor da proteína da apoptose /4, Bcl-2, Bcl-xL, enzima de conversão da interleucina-β tipo FADD (FLICE)/proteína inibitória de caspase-8, fator associado ao receptor de TNF 1, e survivina, e adicionalmente promovem a infra-regulação da expressão de produtos gênicos envolvidos na angiogênese, inclusive do fator de crescimento endotelial vascular, ciclooxigenase-2, molécula de adesão intercelular e metaloproteinase de matriz. Esses resultados se correlacionam com a potencialização da apoptose induzida por TNF e agentes quimioterápicos. Os resultados gerais dos Requerentes indicam que as composições inventivas suprimem a osteoclastogênese, inibem a invasão e potencializam a apoptose por meio da infra-regulação da ativação de NF-kB e da infra- regulação de produtos gênicos regulados por NF-kB.

O Requerentes determinaram alguns dos efeitos das composições inventivas sobre a via de ativação de NF-kB e sobre os produtos gênicos regulador por NF-kB, que controlam a sobrevivência, proliferação, invasão, angiogênese e metástase das células tumorais, descobrindo que as composições inventivas inibem a osteoclastogênese induzida por RANKL e a invasão induzida por TNF. e potencializam a apoptose induzida por TNF e agentes quimioterápicos em várias linhagens de células tumorais.

A expressão dos produtos gênicos envolvidos na antiapoptose, inclusive IAP1, Bfl-l/Al, Bcl-2, TRAF1, e cFLIP, e a expressão dos produtos gênicos envolvidos na metástase, inclusive MMP-9, COX-2, ICAM-I e VEGF, também sofreu infra-regulação pelas composições inventivas.

Os dados dos Requerentes indicam que as composições inventivas suprimem o NF-kB ativado por TNF nas células KBM-5 da leucemia mielóide humana e no condensado de fumaça de cigarro nas células H1299 do adenocarcinoma pulmonar. Esta é a primeira investigação a examinar o efeito das composições inventivas sobre o NF-kB ativado por diferentes estímulos. Esses resultados apontam para que as composições inventivas agem como uma etapa comum a ambos os agentes.

Vários genes envolvidos na proliferação e metástase do câncer demonstraram ser regulados por NF-kB. (consulte, por exemplo, Aggarwal, Β.Β. (2004) Nuclear factor-kappa Β: the enemy within. Câncer Cell, 6, 203-208). Os Requerentes comprovaram que as composições inventivas inibem a expressão de COX-2, MMP-9 e VEGF regulado por NF-kB.

Além disso, embora relatórios recentes tenham apontado que as composições inventivas suprime, as atividades enzimáticas tanto de COX-I como de COX-2 (consulte, por exemplo, Bemis, D.L., Capodice, J.L., Anastasiadis, A.G., Katz, A.E. and Buttyan, R. I (2005) Zyflamend, a unique herbal preparation with nonselective COX inhibitory activity, induces apoptosis of prostate câncer cells that Iack COX-2 expression. Nutr. Câncer., 52, 202-212), os Requerentes comprovaram que as composições inventivas inibem a expressão da proteína COX-2.

Os dados dos requerentes revelam que as composições inventivas exercem suas propriedades anti-câncer sobre vias reguladas por NF-kB por meio da inibição direta do NF-kB. O NF-kB é conhecido por regular a expressão de IAP1, xIAP, Bfl-l/Al, TRAF1, Bcl-2, cFLIP e survivina, e sua superexpressão em numerosos tumores está ligada à sobrevivência, quimiorresistência e radioresistência. (consulte, por exemplo, Takada, Y., Singh, S. and Aggarwal, B.B. (2004) Identification of a p65 peptide that selectively inhibits NF-kappa B activation induced by various inflammatory stimuli and its role in down-regulation of NF-kappa B-mediated gene expression and up-regulation of apoptosis. J. Biol Chem, 279, 15096-15104). Os dados dos requerentes indicam que o tratamento com as composições inventivas promove a infra-regulação da maioria desses produtos gênicos. Relatórios anteriores revelaram que as composições inventivas induzem a apoptose por meio de uma via medida por caspase nas células de câncer de próstata humano (Consulte, por exemplo, Bemis, et al., (2005)). Os resultados dos Requerentes também mostram que as composições inventivas potencializam os efeitos apoptóticos de TNF, taxol e doxorubicina. Esses efeitos são similares aos que foram relatados com um inibidor específico de NF-kB (Consulte, por exemplo, Takada, et al. (2004)).

Novamente, sem se limitar a um mecanismo de ação em particular, os Requerentes acreditam que os efeitos antiproliferativos, pró-apoptóticos, anti-invasivos, antiosteoclastogênicos, antiangiogênicos e antimetastáticos observados após a administração das composições inventivas são mediados pela supressão dos produtos gênicos regulados por NF- kB. Tendo em vista que as ervas usadas na formulação das composições inventivas são conhecidas por conterem compostos antiinflamatórios e anti-cancerígenos únicos, uma propriedade comum das composições inventivas parece ser a capacidade de suprimir a ativação do NF-kB.

Considerando o fato de que as composições inventivas são derivadas de fontes de ervas naturais e estão prontamente disponíveis em fontes de suplementos nutricionais e alimentos naturais, isso faz delas um meio mais conveniente e desejável para a prevenção e o tratamento do câncer do que a prescrição de fármacos contra câncer.

Assim, a presente matéria inventiva também se refere a um método para modular o nível de produtos de produtos gênicos regulados por NF-KB nas células de um animal que dela necessita, compreendendo administrar ao animal uma composição que compreende quantidades efetivas, do ponto de vista terapêutico, de extratos supercríticos de alecrim, açafrão-da-índia, orégano e gengibre; e quantidades efetivas, do ponto de vista terapêutico, de extratos hidroalcoólicos de manjericão sagrado, gengibre, açafrão-da-índia, Scutellaria baicalensis, alecrim, chá verde, huzhang, Coptis chinensis e uva-espim.

O animal em todos os métodos inventivos revelados acima pode ser um mamífero, como um camundongo, rato, gato, cachorro, cavalo, vaca ou outro animal domesticado, ou um ser humano. Em uma concretização preferida, o animal é humano. Além dos usos no tratamento de doenças, distúrbios e síndromes humanas, os métodos inventivos podem ter aplicações veterinárias.

Vias de Administração

Em uma concretização preferida, uma composição administrada via oral está na forma de uma ou mais cápsulas, um ou mais tabletes ou uma ou mais pílulas.

As composições inventivas são, de preferência, distribuídas para o paciente por meio de um veículo aceitável do ponto de vista farmacêutico. Tais veículos são bem conhecidos na técnica, e, geralmente, estão na forma sólida ou líquida. As preparações farmacêuticas em forma sólida que podem ser preparadas de acordo com a presente matéria inventiva incluem pós, tabletes, grânulos dispersíveis, cápsulas, cápsulas medicamentosas e supositórios. Em geral, as preparações em forma sólida irão compreender de cerca de 5% a cerca de 90%, em peso, do agente ativo.

O veículo sólido pode ser uma ou mais substâncias que também podem agir como diluentes, agentes aromatizantes, solubilizantes, lubrificantes, agentes de suspensão, aglutinantes ou agentes de desintegração de tablete; ele também pode ser um material de encapsulação. Em pós, o veículo é um sólido finamente dividido que está em mistura com o composto ativo viscoso. Em tabletes, o composto ativo é misturado com um veículo que possui as propriedades de ligação necessárias em proporções adequadas e compactado à forma e tamanho desejados. Veículos sólidos adequados incluem magnésio, carbonato, estearato de magnésio, talco, açúcar, lactose, pectina, dextrina, amido, gelatina, tragacanto, metilcelulose, carboximetilcelulose de sódio, uma cera de baixo ponto de fusão, manteiga de cacau, entre outros. O termo "preparação" pretende abranger a formulação do composto ativo com materiais de encapsulação como um veículo que pode propiciar uma cápsula na qual O componente ativo (com ou sem outros veículos) é circundado pelo veículo, que, assim está em associação com ele. De maneira similar, incluem-se cápsulas medicamentosas. Podem ser usados tabletes, pós, cápsulas medicamentosas e cápsulas como formas de dosagem sólidas adequadas para administração via oral. Caso seja desejado por questões de conveniência ou aceitação do paciente, os tabletes farmacêuticos preparados de acordo com a presente matéria inventiva podem ser fornecidos em forma mastigável, usando técnicas bem conhecidas.

Para a preparação de supositórios, uma cera de baixo ponto de fusão, tal como uma mistura de glicerídeos de ácidos graxos ou manteiga de cacau, é primeiramente derretida, e o ingrediente ativo é disperso homogeneamente, por exemplo, por agitação. A mistura homogênea derretida é então agitada em moldes de tamanho adequado, deixada resfriar para, dessa forma, solidificar-se.

As preparações em forma líquida incluem soluções, suspensões e emulsões. Como exemplo, podem ser mencionadas soluções de água ou água/propileno glicol para injeção parenteral. As preparações líquidas também podem ser formuladas em solução, em solução aquosa de polietileno glicol. Soluções aquosas adequadas para uso oral podem ser preparadas dissolvendo-se o componente ativo em água e adicionando corantes, aromas, estabilizadores e agentes espessantes adequadas conforme desejado. As suspensões aquosas adequadas para uso via oral podem ser produzidas dispersando o componente ativo finamente dividido em água com um material viscoso, isto é, gomas naturais ou sintéticas, resinas, metilcelulose, carboximetilcelulose de sódio, e outros agentes de suspensão bem conhecidos. As preparações líquidas farmacêuticas podem compreender até 100%, em peso, do agente ativo em questão.

Também são contempladas, como veículos adequados, preparações em forma sólida que devem ser convertidas, logo após o uso, em preparações em forma líquida para administração oral ou parenteral. Tais formas líquidas incluem soluções, suspensões e emulsões. Essas preparações em forma sólida específicas são fornecidas, para maior comodidade, em forma de dose única, e como tal, são usadas para fornecer uma única unidade de dosagem líquida. Como alternativa, podem ser fornecidas substâncias sólidas o suficiente, de modo que, após a conversão em forma líquida, possam ser obtidas várias doses líquidas individuais medindo-se volumes predeterminados da preparação em forma líquida, como por exemplo, com uma seringa, colher de chá ou outro recipiente volumétrico. Quando várias doses líquidas são preparadas dessa forma, é preferível manter a parte não utilizada das referidas doses líquidas em baixa temperatura (isto é, sob refrigeração) de modo a retardar uma possível decomposição. As preparações em forma sólida que devem ser convertidas em forma líquida podem conter, além do material ativo, aromatizantes, corantes, estabilizadores, soluções- tampão, adoçantes artificiais e naturais, dispersantes, espessantes, agentes solubilizantes, entre outros. O líquido utilizado para preparar preparações úteis em forma líquida pode ser água, água isotônica, tanol, glicerina, propileno, glicol e similares, assim como misturas destes. Naturalmente, o líquido utilizado será escolhido com respeito à via de administração. Por exemplo, preparações líquidas contendo grandes quantidades de etanol não são adequadas para uso parenteral.

As preparações farmacêuticas inventivas podem incluir um ou mais conservantes bem conhecidos na técnica, como ácido benzóico, ácido sórbico, metilparabeno, propilparabeno e ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Os conservantes geralmente estão presentes em quantidades de até 1%, e preferivelmente de cerca de 0,05 a cerca de 0,5% em peso da composição farmacêutica.

Tampões úteis para os fins da presente matéria inventiva incluem ácido cítrico - citrato de sódio, ácido fosfórico - fosfato de sódio e ácido acético - acetato de sódio em quantidades de cerca de 1%, e, preferivelmente, de cerca de 0,05 a cerca de 0,5% em peso da composição farmacêutica. Agentes de suspensão ou espessantes úteis incluem celulósicos, como metilcelulose, caragenas como ácido algínico e seus derivados, gomas xantanas, gelatina, acácia e celulose microcristalina em quantidades de até cerca 20%, e preferivelmente de cerca de 1% a cerca de 15% em peso da composição farmacêutica.

Podem ser empregados adoçantes que incluam adoçantes, tanto naturais como artificiais, bem conhecidos na técnica. Agentes adoçantes, como monossacarídeos, dissacarídeos e polissacarídeos, tal como xilose, ribose, glicose, manose, galactose, frutose, dextrose, sucrose, maltose, amido parcialmente hidrolisado ou partículas sólidas de xarope de milho e álcoois de açúcares, como sorbitol, xilitol, manitol e suas misturas, podem ser utilizados em quantidades de cerca de 10% a cerca de 60%, e, de preferência, de cerca de 20% a cerca de 50% em peso da composição farmacêutica. Adoçantes artificiais solúveis em água, tal como sacarina e sais de sacarina, tal como sódio ou cálcio, sais de ciclamato, acesulfame-K, aspartame, entre outros, e suas misturas, podem ser utilizados em quantidades de 0,001% a cerca de 5% em peso da composição.

Aromatizantes passíveis de serem empregados nos produtos farmacêuticos da presente matéria inventiva incluem tanto aromas artificiais quanto naturais, e hortelãs como hortelã- pimenta, baunilha, baunilha artificial, canela, vários aromas de fruta, tanto individualmente quanto misturados, em quantidades de cerca de 0,5% a cerca de 5%, em peso, da composição farmacêutica.

Corantes úteis na presente matéria inventiva incluem pigmentos que podem ser incorporados em quantidades de até cerca de 6% em peso da composição. Um pigmento preferido, dióxido de titânio, pode ser incorporado em quantidades de até cerca de 1%. Além disso, os corantes podem incluir outros corantes adequados para alimentos, fármacos e aplicações cosméticas, conhecidos como corantes F.D.&C, entre outros. Tais conservantes geralmente estão presentes em quantidades de até 0,25%, e preferivelmente de cerca de 0,05% a cerca de 0,2% em peso da composição farmacêutica. Um relatório completo de todos os corantes F.D.&C e D.&C. e de suas estruturas químicas correspondentes pode ser encontrado na Kirk- Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, Volume 5, nas páginas 857 a 884, cujo texto é incorporado aqui para fins de referência.

Solubilizantes úteis incluem álcool, propileno glicol, polietileno glicol, entre outros, e podem ser usados para solubilizar os aromas. Os agentes solubilizantes geralmente estão presentes em quantidades de até 10%; preferivelmente, de cerca de 2% a cerca de 5% em peso da composição farmacêutica.

Agentes lubrificantes que podem ser usados, quando desejado, nas presentes composições, incluem óleos ou fluidos de silicone, tais como polisiloxanos substituídos e não substituídos, por exemplo, polisiloxano de dimetila, também conhecido como dimeticona. Outros agentes de lubrificação bem conhecidos podem ser empregados.

A preparação farmacêutica também pode ser preparada em uma forma de dosagem unitária. Em tal forma, a preparação é subdividida em doses unitárias contendo quantidades apropriadas do componente ativo. A forma de dosagem unitária pode ser uma preparação acondicionada, em que o acondicionamento contém quantidades distintas da preparação, por exemplo, tabletes, cápsulas e pós acondicionados em frascos ou ampolas. A forma de dosagem unitária também pode ser uma cápsula, cápsula medicamentosa ou o próprio tablete, ou pode ser qualquer quantidade adequada destes na forma acondicionada. Espera-se que os compostos da presente matéria inventiva não apresentem interações adversas significativas com outras substâncias de ocorrência natural ou sintética. Assim, um composto da presente matéria inventiva pode ser administrado em combinação com outros componentes e composições úteis, por exemplo, para o tratamento de câncer. Em particular, os compostos da presente matéria inventiva podem ser administrados em combinação com outros compostos da presente matéria inventiva, substâncias quimioterápicas, e assim por diante.

As formulações farmacêuticas ideais serão determinadas pelos versados na técnica, baseando-se em considerações como a via de administração e a dosagem desejada. Consulte, por exemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) páginas 1435-1712, cuja revelação é incorporada neste documento para fins de referência. Tais formulações podem influenciar a condição física, a estabilidade, a velocidade de liberação in vivo e a velocidade de depuração in vivo dos presentes agentes terapêuticos da matéria inventiva.

Dosagem

Níveis de dosagem da ordem da cerca de 0,001 mg a cerca de 100 mg por quilograma de peso corporal dos compostos ou composições do ingrediente ativo são úteis no tratamento das condições citadas acima, com níveis preferidos variando de 200 mg por dia a 1600 mg por dia. Os compostos e composições da presente matéria inventiva podem, normalmente, serem administrados em duas ou três doses diariamente. Uma estratégia preferida é a de começar com uma dose pequena (200 a 300 mg) duas vezes por dia, atingindo lentamente doses maiores, caso necessário. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com os materiais de veículo para produzir uma forma de dosagem única irá variar, dependendo do hospedeiro tratado e do modo de administração em particular.

Entretanto, compreende-se que um nível de dose específico para qualquer paciente em particular dependerá de uma variedade de fatores, inclusive a atividade do composto específico empregado; a idade, peso corporal, saúde em geral, sexo e dieta do paciente; o tempo de administração; a velocidade de excreção; a combinação de fármacos; a gravidade da doença específica sendo tratada; e a forma de administração. Os versados na técnica irão apreciar a variabilidade de tais fatores, sendo capazes de definir níveis de dose específicos usando nada mais do que a experimentação rotineira.

EXEMPLOS

Os exemplos a seguir servem somente para ilustrar a presente matéria inventiva, não tendo a menor intenção de limitá-la. Salvo indicação ao contrário, todas as porcentagens se baseiam em 100% em peso da composição final.

Materiais e Métodos Gerais

Zyflamend®, obtido com a New Chapeter Inc. (St. Louis, MO), foi dissolvido em sulfóxido de dimetila ("DMSO") como uma solução estoque de 10 mg/ml e armazenado a 20°C. G fator de necrose tumoral alfa humano ("TNF-a"), purificado à homogeneidade com uma atividade específica de 5 χ 10^7 U/mg, foi gentilmente doado pela Genentech, Inc. (South San Francisco, CA). Penicilina, estreptomicina, meio RPM 1640, meio de dulbecco modificado por Iscove ("IMDM"), meio D- MEM/F12 e soro bovino feral ("FBS") foram obtidos com a Invitrogen (Grand Island, NY). Os seguintes anticorpos policlonais foram obtidos com a Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA): metaloproteinase anti-matriz 9 ("MMP-9"); molécula de adesão anti-intercelular ("IC AM"); proteína antiinibidor da apoptose 1/2 ("IAP 1/2"); anti-Bcl-2; anti-Bfl- 1/A1; e fator anti-TNF associado ao receptor ("TRAF1"). Anti- COX-2 e XIAP foram obtidos com a BD Biosciences (San Diego, CA). Condensado de fumaça de cigarro ("CSC"), preparado conforme descrito em Anto, R.J., Mukhopadhyay, A., Shishodia, S., Gairola, C.G. and Aggarwal, B.B. (2002) Cigarette smoke condensate activates nuclear transcription factor-kappa B through phosphorylation and degradation of I kappa B(alpha): correlation with induction of cyclooxygenase-2. Carcinogenesis, 23, 1511- 1518, was kindly supplied by Dr. G. Gairola (University of Kentucky, Lexington, KY). Um fator de crescimento endotelial antivascular ("VEGF") foi adquirido com a NeoMarkers (Fremont, CA). O anticorpo survivina foi obtido com a R&B Systems (Minneapolis, MN). Uma enzima de conversão de interleucina-ΐβ tipo FADD "(FLICE)" / anticorpos da proteína inibitória de caspase-8 ("cFLIP") foram gentilmente fornecidos pela Imgenex (San Diego, CA).

As linhagens celulares usadas no trabalho dos Requerentes incluem linhagens celulares do carcinoma pulmonar de células não pequenas (H1299), da leucemia mielóide humana (KBM-5) e mieloma múltiplo humano (U266), e de macrófagos de camundongo (RAW 264.7) foram obtidas com a American Type Culture Collection (Manassas, VA). As células Hl299 e U266 foram cultivadas no meio RPMI 1640 com 10% de FBS.

As células KBM-5 foram cultivadas em IMDM com 15% de FBS. As células RAW 264.7 foram cultivadas no meio D-MEM/F12 suplementado com 10% de FBS. Todos os meios foram suplementados com 100 U/ml de penicilina e 100 μg/ml de estreptomicina.

EXEMPLO 1

Inibição do crescimento celular

Como ponto de partida geral, é investigada a capacidade relativa de um produto ou fármaco em inibir o crescimento celular usando linhagens celulares conhecidas de humanos e roedores. O objetivo disso é simplesmente poder discernir as concentrações que são ineficazes ou tóxicas das que são significativamente inibitórias ou "efetivas". Qualquer exploração dos mecanismos de ação de um dado produto deve ser realizada em concentrações que produzem uma certa inibição do crescimento, mas não intensa, ou morte celular generalizada. Além disso, esses tipos de estudos fornecem uma estimativa inicial de alterações dependentes do tempo em eventos nas células. Isto é, é possível discernir quando ocorrem eventos mediados por fármaco relativos às primeiras indicações de inibição do crescimento ou morte celular. Isso, por sua vez, pode indicar uma seqüência de eventos que estão envolvidos.

A maioria dos estudos direcionados inclui o uso de linhagens celulares de câncer de próstata humano. A razão para isso inclui o fato de que essa é uma linhagem celular de interesse, as linhagens celulares tem sido caracterizadas por nós para o metabolismo de eicosanóides e os Requerentes estão envolvidos em uma tentativa clínica contínua das composições inventivas no tratamento/prevenção do PIN. Entretanto, à medida que se obtêm os dados, podem ser usadas outras linhagens celulares e modelos animais que têm pouca relação com o câncer de próstata em si, mas que, em vez disso, são úteis para entender a atividade e os mecanismos antiinflamatórios em geral.

A Figura 1 ilustra o efeito inibidor dos compostos inventivos sobre o crescimento das linhagens celulares do câncer pulmonar A549 humano e do câncer de próstata PC3 humano. Usou-se a formulação oral da composição. A composição foi adicionada às células na cultura e a inibição relativa do crescimento celular foi avaliada após 72 horas de exposição contínua ao fármaco. O método "MTT" foi usado para avaliar a proliferação celular versus populações de células- controle não tratadas. É evidente a inibição maior do crescimento das células PC3 da próstata se comparado à das células do adenocarcinoma pulmonar.

De modo similar, A Figura 8 e a Tabela 2 representam o efeito inibitório do composto sobre o crescimento das linhagens celulares MCF7 e MDA231 do câncer de mama humano. Novamente, usou-se a formulação oral das composições inventivas. A composição foi adicionada às células na cultura e a inibição relativa do crescimento celular foi avaliada após 72 horas de exposição contínua ao fármaco. O método "MTT" foi usado para avaliar a proliferação celular versus populações de células- controle não tratadas. As células MCF7 foram mais sensíveis à exposição à composição do que as células MDA231.

Tabela 2

<table>table see original document page 53</column></row><table>

*Define-se IC50 como a concentração do (ug/ml) do material que produz a inibição do crescimento das células em 50% (em relação às células não tratadas) sob condições definidas (geralmente duração) de exposição a esse agente.

A falta de citotoxicidade relativa contra a única linhagem celular epitelial humana "normal" testada é, claramente, de interesse para fins de tolerência do paciente ao medicamento e conformidade com o protocolo de administração. A sensibilidade da linhagem celular sensível a estrógeno MCF-7 do câncer de mama humano à composição é de especial interesse, e essa linhagem celular é definitivamente a mais sensível testada até o presente momento. Os Requerentes não tem notícia de quaisquer compostos nos extratos de plantas usados para formar a composição inventiva que bloqueiem a ligação estrógena, o que leva os Requerentes a crer na exclusão dessa explicação alternativa para a alta sensibilidade observada.

EXEMPLO 2

Capacidade da Composição Inventiva em Inibir as Enzimas Ciclooxigenase (COX) e Lipoxigenase (LOX). Os Requerentes determinaram o efeito relativo das composições inventivas contra COX-1, COX-2 e outros eicosanóides de interesse. Esses estudos indicaram que a composição inibe tanto COX-I quanto COX-2 (como enzimas clonadas), como esperavam os Requerentes, com base nos variados componentes antiinflamatórios obtidos dos diferentes extratos de ervas que compreendem a composição inventiva. Os dados também indicam que a composição é também um inibidor útil da 5-lipoxigenase (5-LOX). Não foi observada nenhuma alteração seletiva nos produtos de eicosanóides derivados de 15-LOX-2. Os dados também demonstram que as composições inibem 12-lipoxigenase de maneira dependente da concentração. Os dados nas Figuras 2 e 3 indicam que a composição é potente em termos de produzir a inibição das enzimas COX clonadas, bem como das enzimas nas células na cultura. Apenas pequenas quantidades de microlitros da composição inventiva em líquido foram suficientes para produzir uma inibição significativa das enzimas de ciclooxigenase. Isso é particularmente impressionante, tendo em mente que 60% dessa formulação específica da composição é azeite de oliva, que, por si próprio, não tem efeito sobre o metabolismo de eicosanóides.

A Figura 2 representa o efeito da composição sobre a formação de PGE2 usando enzimas COX-I (ovina) e COX-2 (humana) clonadas, medido por incubação de 10 uM AA com as enzimas (15 IU) em solução-tampão Tris-HCL de 0,1 M, pH 8,0, contendo 5mM de EDTA, 2 mM de fenol e 1 uM de hematina. As alíquotas da composição foram adicionadas aos tubos antes da adição de AA. As incubações-controle não continham a composição. As barras com o asterisco representam o controle "azeite de oliva". As incubações foram realizadas a 37°C durante 15 minutos. As reações foram interrompidas pela adição de 1 N de ácido cítrico. Em seguida, extrairam-se os eicosanóides usando uma mistura solvente de hexano:acetato de etila (1:1); o extrato foi evaporado à secura sob nitrogênio. O PHE2 formado durante a incubação foi extraído conforme descrito anteriormente e então analisado usando nosso método LC/MS/MS publicado (Yang et ai. Anal Biochem. 308: 168-177, 2002). Os dados representados na Figura 2 indicam que a composição inventiva inibe a formação de PGE2 tanto por COX-I como COX- 2, embora o produto seja potente na inibição de COX-I do que de COX-2. A Figura 3 ilustra o efeito da composição sobre a formação de PGE2 e 5-HETE nas células PC3. Concentrações variáveis da composição foram adicionadas às culturas de células em meio fresco, livre de soro, suplementado com 15 uM de BSA e incubado a 37°C durante 10 minutos. Em seguida, adicionou-se ácido araquidônico (100 uM) e cofatores. Após 10 minutos, as células foram lavadas e extraídas para determinar o eicosanóide formado dentro das células (vide legenda da Figura 2). Os dados indicam uma inibição dependente da concentração, tanto de PGE2 como de 5-HETE, nas células PC-3. Os dados são apresentados como Média + SD (n = 3). * Indica P<0,05 em relação aos controles.

EXEMPLO 3

Efeito das Composições Inventivas sobre a Expressão Celular da 5-Lipoxigenase

Um agente antiinflamatório pode atingir seu efeito farmacológico por muitos mecanismos diferentes. Um dado produto pode inibir as enzimas seletivas envolvidas na formação de moléculas relacionadas à inflamação, por exemplo, inibição de COX-2 para diminuir a formação de PGE2 ou inibição de 5- lipoxigenase para diminuir a formação de 5-HETE. As composições também inibem a ativação dos fatores de transcrição conhecidos por estarem envolvidos diretamente na ativação dos genes relacionados à inflamação, tal como a inibição mediada por curcumina da ativação do NF-kB. Além disso, um dado produto também pode agir de forma a diminuir a síntese real, e, portanto, a expressão da enzima em uma célula ou tecido, em vez de inibi-la diretamente. Os dados iniciais que obtivemos indicam que as composições inventivas proporcionam uma inibição dependente da concentração da expressão relativa de 5-Iipoxigenase nas células, além de sua inibição da atividade enzimática. A inibição relativa da expressão enzimática não é um fenômeno geral, uma vez que a composição não parece inibir a expressão de tecido relativa da COX-2.

EXEMPLO 4

Identificação do 13-S-HODE na Composição Inventiva

A Figura 4 ilustra o efeito dependente da concentração da composição inventiva sobre o metabolismo de eicosanóides nas células de câncer pulmonar A549 humano, mostrando um aumento dependente da concentração visível na formação do 13-S-HODE. As células (1 χ IO6) foram deixadas para se ligarem, à noite, à placa de cultura de tecido, e foram então tratadas durante 24 horas com diferentes concentrações da composição conforme ilustrada na Figura.

Em seguida, as células foram coletadas e extraídas para análises de eicosanóides por LC/MS/MS. Os dados indicam uma pequena inibição (32%) de PGE2 a uma concentração de composição de 2 ul/ml, mas também mostram uma formação drástica "visível" de 13-S-HODE a 1 e 2 ul/ml. Foi examinado o efeito da composição sobre a conversão do ácido araquidônico em vários produtos de eicosanóides nas várias linhagens celulares. Os dados apresentados acima indicam que, pelo menos para as células A459 de câncer pulmonar humano, a dose da composição não tem um grande efeito sobre as enzimas ciclooxigenase ou lipoxigenase. No entanto, é notável o aumento dependente da concentração em 13-S-HODE, o produto da enzima 15-LOX-l.

Tal aumento em 13-S-HODE pode ocorrer a partir de uma indução da própria enzima, ou atividade enzimática, da adição de um substrato adequado, tal como ácido linoléico, que preferivelmente daria origem a 13-S-HODE, ou por meio de outro mecanismo. A indução de 15-LOX-l acontece, de fato, quando NSAIDs são adicionados às células de câncer de cólon, e isso serve como uma explicação parcial para o efeito benéfico da aspirina como agente de prevenção no câncer de cólon. Entretanto, por Western blot, não foi observada nenhuma indução significativa da enzima 15-LOX-l como resultado da incubação com a composição. A composição inventiva também foi examinada em relação ao conteúdo relativo de ácido linoléico, um substrato que pode dar origem a 13-S-HODE por meio da enzima 15-LOX-l. Usando um instrumento GC/MS/MS, foi encontrada apenas uma quantidade mínima de ácido linoléico. Entretanto, a análise da própria composição indicou a presença de uma quantidade elevada de 13-S-HODE, conforme discutido no Exemplo 6 abaixo. A Figura 5 ilustra dados de espectro de massa, que mostram a presença do 13-S-HODE nas composições inventivas. A Figura 5 representa três gráficos de informações relacionadas. O gráfico mais em cima é um cromatograma de íons totais de 13-S-HODE deuterado (designado como 13-S-HODE- d4). Os quatro átomos de deutério proporcionam um peso molecular mais elevado (adição de 4) ao peso de massa do próprio 13-S-HODE. O peso de massa do produto deuterado (indicado pela razão massa-carga no canto superior-direito) é "299". Isso é basicamente o peso de massa desse produto. A notação de 299>281 reflete o fato de que os Requerentes selecionaram o instrumento para o peso de massa de 299 e então colidiram a molécula com argônio (um gás inerte) para produzir um íon "filho" característico em 281. Esse íon filho pode ser usado para fins quantitativos.

O gráfico do meio indica o traço de íon para 13- S-HODE autêntico (25 ng/ml) adquirido na Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI). Ele tem um peso de massa 295,3 e isso é indicado no gráfico. Os requerentes examinam o íon filho em 277.2 para caracterizar o composto. Isto é, as chances de qualquer dada molécula ter um peso de massa de 277.2 que também se "rompa" para produzir um íon filho de 277.2 são quase nulas, com exceção da molécula real de interesse: 13-S-HODE.

O gráfico inferior é um extrato da composição inventiva. A espectrometria de massa foi instruída a procurar por todas as moléculas com um peso de massa igual a 295.3. Em seguida, os Requerentes configuraram o instrumento para examinar íons filho característicos em 277.2. O fato de que o instrumento os encontrou... em abundância... indica, sem sombra de dúvidas, que 13-S-HODE está presente nas composições inventivas. O extrato foi obtido a partir de apenas 5 ul da composição. Os dois números por cada pico representado o tempo de retenção do pico (por exemplo, 6,69 minutos) e a abundância de íons relativa. O último é análogo à "quantidade" de produto dentro do pico. O fato de que um padrão autêntico de 13-S-HODE a 25 ng/ml produziu uma quantidade de pico de 864.412, ao passo que apenas 5 ul da composição produz uma "quantidade" de pico de 6.338.606, indica claramente a quantidade elevada desse eicosanóide dentro da composição. O que é importante saber é que isso é uma prova inegável de que a composição contém 13-S- HODE em abundância.

Para assegurar-se de que 13-S-HODE é a substância sendo lidada, a presença de 13-S-HODE na composição inventiva foi examinada usando um kit de Imunoensaio Enzimático baseado em anticorpo. O anticorpo proporciona a especificidade para detectar 13-S-HODE. As análises EIA confirmaram a presença de uma grande quantidade de 13-S-HODE nas composições inventivas.

Um agente antiinflamatório pode atingir seu efeito farmacológico por muitos mecanismos diferentes. Por exemplo, um dado produto pode inibir as enzimas seletivas envolvidas na formação de moléculas relacionadas à inflamação (por exemplo, inibição de COX-2 para diminuir a formação de PGE2 ou inibição de 5-Iipoxigenase para diminuir a formação de 5-HETE). O produto também poderia inibir a ativação dos fatores de transcrição conhecidos por estarem envolvidos diretamente na ativação dos genes relacionados à inflamação (por exemplo, a inibição mediada por curcumina da ativação do NF-kB). Além disso, um dado produto também pode agir de forma a diminuir a síntese real, e, portanto, a expressão da enzima em uma célula ou tecido, em vez de inibi-la diretamente. Os dados iniciais obtidos indicam que a composição inventiva pode, de fato, levar a uma inibição dependente da concentração da expressão relativa da 5- lipoxigenase nas células, além de sua inibição da atividade enzimática. A inibição relativa da expressão enzimática não é um fenômeno geral, uma vez que a composição não parece inibir a expressão de tecido relativa da 12-LOX. O desaparecimento (infra-regulação) da expressão de 5-LOX também não é um resultado geral da exposição dos inibidores de 5-LOX às células. Embora não esteja neste relatório, foi examinado o efeito relativo da concentração de proteína 5-LOX (Western blot) após as células PC3 terem sido expostas ao inibidor de 5-LOX convencionado Zileuton. Conforme ilustrado na Figura 9, embora Zileuton seja um potente inibidor de 5-LOX (e seja útil para o tratamento de asma em virtude disso), ele não produziu nenhuma alteração na concentração relativa de enzimas 5-LOX dentro das células.

Um dos fatores interessantes é o aumento dependente da concentração na expressão da proteína COX-2 que ocorre como resultado de as células serem expostas à composição.

À primeira vista, isso pareceria ser exatamente o que os Requerentes NÃO querem que aconteça. No final das contas, a inibição de COX-2 é o alicerce para um grande negócio farmacêutico. Entretanto, não se dá a importância merecida para o fato de que o Celebrex (celecoxib) é um indutor conhecido de COX-2! A inflamação permanece sob controle, pois a atividade enzimática é inibida, enquanto que a mãe natureza faz o possível para superar isso com o aumento da síntese da enzima. Em outras palavras, as pessoas que usam inibidores de COX-2 ficam bem... até pararem de tomá-los.

EXEMPLO 5

Determinação in vivo do efeito antiinflamatório das composições inventivas: Modelo de orelha de camundongo

Nos últimos anos, têm-se usado um modelo animal de inflamação simples, mas eficaz. A orelha direita do camundongo de teste é pré-tratada com um agente antiinflamatório plausível, sendo deixado em seguida sozinho durante 30 minutos. Um agente inflamatório (geralmente ácido araquidônico (AA) em acetona) é então aplicado à mesma orelha.

O veículo é aplicado à orelha esquerda como um controle. Um período de tempo fixo após a aplicação do AA5 os camundongos são anestesiados, e depois um punção redondo de orelha é usado para obter um segmento uniforme de tecido. A diferença em peso do tecido de cada punção de orelha de camundongo serve como um índice relativo da prevenção relativa da inflamação. Após a pesagem, a amostra de punção de orelha é então congelada rapidamente para análises subseqüentes do metabolismo de eicosanóides específicos por meio do uso de nosso método LC/MS/MS.

A Figura 6 ilustra o efeito antiinflamatório da composição inventiva sobre o edema de orelha em camundongos. A composição (10 ul) foi administrada por via tópica à orelha direita, e apenas o veículo de acetona foi aplicado à orelha esquerda. Passada uma hora do tratamento com AA, o camundongo foi anestesiado e as orelhas "seccionadas" para obter um segmento de tecido uniforme. O peso da orelha direita é então subtraído do peso da orelha esquerda para medir o edema. Os dados refletem a capacidade relativa de uma determinada substância de teste em inibir o edema de orelha mediado por AA. Os dados são apresentados como Média +/- SD de 10 animais. * P < 0,001 tratamento versus AA (edema) controle (inflamação mediada por AA).

Os dados na Figura 6 mostram que a composição produz inibição significativa da inflamação mediada por ácido araquidônico.

De modo similar, a Figura 10 ilustra o efeito da composição inventiva sobre o edema de orelha em camundongos mediado por ácido araquidônico. Os grupos de tratamento consistiam de: 1) controle de azeite de oliva, 2) controle de acetona, 3) azeite de oliva + AA, 4) A composição inventiva (10 ul) + AA, 5) a composição inventiva (5 ul) + AA, e 6) a composição inventiva (2,5 ul) + AA. Os dados são apresentados como Média + SD (n = 10 camundongos/grupo). Novamente, a composição inibiu o edema produzido pelo AA. Como ilustrado na Figura 10, foi obtida uma inibição máxima do edema em todas as três "doses" da composição, ainda que tenha parecido que o uso 2,5 ul da composição possa ter sido ligeiramente menos eficaz do que o das concentrações maiores.

EXEMPLO 6

Fonte Herbácea e Importância Relativa do 13-S- HODE nas Composições Inventivas

Ao analisar a concentração relativa de eicosanóides da forma líquida da composição, fomos surpreendido por uma grande quantidade de 13-S-HODE. Essas análises foram feitas usando LC/MS/MS, em que um padrão deuterado autêntico foi usado para assegurar-se de que tínhamos a identidade de pico correta. Para ter total certeza dessa observação, a composição líquida também foi analisada usando um kit de imunoensaio ligado a enzima especialmente preparado para determinação do 13-S-HODE. Os resultados da análise EIA confirmaram os dados da espectrometria de massa e são ilustrados na Tabela 3.

Tabela 3

Concentração relativa de eicosanóides contidos na composição inventiva

<table>table see original document page 64</column></row><table> <table>table see original document page 65</column></row><table>

* Os dados são fornecidos como ng eicosanóide/5 ul de composição oral

O fato de que a forma oral da composição é 60% de azeite de oliva (que não contém 13-S-HODE) indica que o teor relativo de 13-S-HODE no material do extrato é até mesmo maior do que o apresentado acima.

A Figura 7 ilustra o efeito do 13-S-HODE sobre a proliferação de várias linhagens de células cancerosas. Os dados acima indicam que 13-S-HODE, produto da enzima 15-LOX-2, é capaz de inibir totalmente o crescimento da próstata tumoral humana (PC3) e do cólon (LS174), mas não o crescimento celular do adenocarcinoma pulmonar (A549). A capacidade relativa do 13-S-HODE em inibir as linhagens celulares de câncer de próstata e de cólon com um IC50 de cerca de 3-4 uM. Isso é de importância, quando comparado ao teor de 13-S-HODE na composição inventiva. Isto é, conforme ilustrado na Tabela 2 acima, há 13-S-HODE suficiente dentro da composição para explicar a inibição do crescimento celular. Não restam dúvidas de que outros fatores dentro da composição também contribuem em sua capacidade de inibir o crescimento celular do tumor de próstata e cólon, mas a capacidade do 13-S-HODE dentro da composição em fazer isso é de evidente interesse.

A concentração relativa de eicosanóides da forma líquida da composição foi examinada, surpreendendo-nos pela grande quantidade de 13-S-HODE. Essas análises foram feitas usando LC/MS/MS, em que um padrão deuterado autêntico foi usado para assegurar-se de o pico correto foi identificado. Para ter total certeza da observação, a composição líquida também foi analisada usando um kit de imunoensaio ligado a enzima especialmente preparado para determinação do 13-S-HODE. Os resultados da análise EIA confirmaram os dados da espectrometria de massa. O fato de que a forma oral da composição é 60% de azeite de oliva (que não contém 13-S- HODE) indica que o teor relativo de 13-S-HODE no material do extrato é até mesmo maior do que o apresentado acima.

Foi realizada uma busca pela fonte do produto de eicosanóide 13-S-HODE entre os diferentes componentes de extratos de ervas e plantas usados para formar a composição. A abordagem consiste em solubilizar o extrato ou submeter o extrato a uma mistura solvente orgânica, que irá, por sua vez, remover os eicosanóides solúveis em lipídeos. Estes são então secos sob nitrogênio e reconstituídos em um volume fixo de solução-tampão compatível com o equipamento de espectrometria de massa. Outra alíquota é usada para análises do teor relativo de ácido linoléico usando um GC/MS/MS. O raciocínio por trás disso é que o 13-S- HODE pode estar presente como tal nos extratos ou também pode ser derivado por meio de uma derivado por meio de uma reação enzimática nas células na cultura se as células contivessem 15- LOX-I e fossem suplementadas com o ácido linoléico do substrato. Os dados na Tabela 4 a seguir mostram, com bastante convicção, que, embora existam extratos contendo tanto ácido linoléico quanto 13-S-HODE, o eicosanóide é, em si, um componente de vários dos extratos herbáceos usados para formar a composição inventiva. O fato de que 13-S-HODE está ausente de alguns extratos (por exemplo, chá verde) também é interessante e dá credibilidade ao fato de que as medições estão corretas.

Tabela 4

<table>table see original document page 67</column></row><table>

Tanto as determinações de 13-HODE como do ácido linoléico foram realizadas três vezes com resultados comparáveis. O 13-S-HODE foi determinado usando-se LC/MS/MS, enquanto que o teor de ácido linoléico foi medido usando um GC/MS/MS. As fontes do 13-S-HODE das composições parecem ser, em sua grande maioria, oriundas do gengibre e do açafrão-da-índia. E interessante o fato de esse eicosanóide específico estar presente tanto nos extratos PSE e SCE de gengibre, e também, em menor proporção, na raiz de tumérico. Particularmente, a presença de quantidades elevadas de 13-HODE não está sempre associada a quantidades elevadas de ácido linoléico, o substrato para 15-LOX-1 que produz 13-S- HODE.

EXEMPLO 7

Ensaio de Diferenciação em Osteoclastos

Para determinar o efeito das composições inventivas sobre o ativador do receptor da osteoclastogênese induzida por ligante de NF-kB (RANKL), os Requerentes cultivaram células RAW 264, que podem se diferenciar em osteoclastos por RANKL in vitro. As células RAW 264.7 foram cultivadas em cápsulas de 23 poços a uma densidade de 1 χ 10^4 células por poço e deixadas se aderirem à noite. Em seguida, o meio foi substituído, e as células foram co-incubadas com diferentes concentrações das composições inventivas e 5 nM RANKL. no 5o dia, as células foram coradas pela expressão de fosfatase ácida resistente a tartarato (TRAP), conforme descrito anteriormente usando um kit de fosfatase ácida (Sigma-Aldrich), e os osteoclastos multinucleados positivos ao ensaiO TRAP (>3 núcleos) por poço foram contados.

As células RAW 264.7 (1 χ 10^4 células/poço) foram incubadas, ou separadamente ou na presença de 5 nM de RANKL com 0,8 mg/ml das composições inventivas durante 5 dias, e coradas pela expressão TRAP. Conforme apresentado na Figura 11 (A), as células positivas ao ensaio TRAP foram fotografadas (ampliação original, IOOx).

As células RAW 264.7 (1 χ IO4 células/poço) foram incubadas, ou separadamente ou na presença de 5 nM de RANKL com as composições inventivas, à concentração indicada, durante 5 dias, e coradas pela expressão TRAP. Os osteoclastos multinucleados (três núcleos) foram contados, com os resultados sendo representados grafícamente na Figura 11 (B).

E ilustrado que as composições inventivas suprimem a osteoclastogênese induzida por RANKL. Em razão do fato do RANKL, membro da superfamília do TNF, induzir a osteoclastogênese por meio da ativação do NF-kB, os Requerentes determinaram se as composições inventivas podem suprimir a osteoclastogênese induzida por RANKL. Os requerentes descobriram que o RANKL induziu a diferenciação em osteoclastos, conforme indicada pela expressão do TRAP, ilustrada na Figura Il(A), e que as composições suprimiram-na de maneira dependente da dose, conforme ilustrado na Figura 11 (B).

EXEMPLO 8

Ensaio de Invasão

O sistema de cultura de invasão da membrana foi usado para avaliar a invasão celular, uma vez que a invasão através da matriz extracelular é uma etapa crucial na metástase tumoral. O sistema de Invasão Tumoral BioCoat BD é uma câmara que possui uma membrana de poli(tereftalato de polietileno) à prova de luz com poros de 8 um de diâmetro, e é revestido com um gel de membrana basal reconstituída (BG Biosciences, San Diego, CA). Um total de H1299 (2,5 χ IO4 células) foram suspensas em meio livre de soro e semeadas nos poços superiores. Após incubação noturna, as células foram co- incubadas com diferentes concentrações das composições inventivas e 1 nM TNF para 24 horas adicionais na presença de 1% de FBS. As células que invadiram através do Matrigel (isto é, que migraram para a câmara inferior durante a incubação) foram coradas com 4 ug/ml de Calceína AM (Molecular Probes, Eugene, OR) em PBS durante 30 minutos, a 37 °C, e varridas por fluorescência com uma leitora multi-placa Victor3 (Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Boston, MA); as células fluorescentes foram contadas.

As células H1299 (2,5 χ IO4 células/poço) foram semeadas nas paredes superiores de uma câmara de invasão de Matrigel à noite na ausência de soro, co-incubadas com 0,3 mg/ml das composições inventivas e nM de TNF durante 24 horas na presença de 1% de soro, e então submetidas ao ensaio de invasão, com os resultados representados graficamente conforme ilustrado na Figura 12. O valor para nenhuma das composições inventivas e nenhum TNF foi definido como 1,0.

É mostrado que as composições inventivas suprimem a atividade da invasão das células tumorais induzida por TNF. Sabe-se que o NF-kB regula a expressão dos produtos gênicos (por exemplo, MMP-9, COX-2 e VEGF) que mediam a invasão das células tumorais. Foi investigado, in vitro, se as composições inventivas podem modular a atividade de invasão das células tumorais induzida por TNF. Para determinar isso, as células tumorais foram semeadas na câmara superior da câmara de invasão em matrigel com TNF na presença ou ausência das composições inventivas, e então examinadas em relação à invasão. Conforme ilustrado na Figura 12, a invasão das células tumorais induzida por TNF foi quase o dobro, e as composições inventivas suprimiram essa atividade de maneira dependente da dose. As composições inventivas isoladamente não tiveram efeito sobre a atividade de invasão.

EXEMPLO 9

Ensaio LIVE/DEAD

Para medir a apoptose, os Requerentes usaram o ensaio LIVE/DEAD (Molecular Probes, Eugene, OR), que determina a atividade da esterase intracelular e a integridade da membrana plasmática. Esse ensaio emprega calceína, um corante polianiônico, que é retido dentro das células vivas e proporciona fluorescência verde. Ele também emprega o corante monomérico de etídio (fluorescência vermelha), que pode entrar nas células apenas através das membranas danificadas e se ligar a ácidos nucléicos, mas é excluído pela membrana plasmática interna das células vivas. Em suma, 1 χ IO6 células foram incubadas com 0,5 mg/ml das composições inventivas durante 24 horas e então tratadas com 1 nM TNF ou vários agentes quimioterápicos durante 16 horas a 37°C. As células foram coradas com o reagente LIVE/DEAD (5 uM de homodímero de etídio , 5 uM de calceína- AM) e então incubadas a 37°C durante 30 minutos.

As células foram analisadas sob um microscópio de fluorescência (Labophot 2; Nikon, Tykon, Japan).

Células U2666 do mieloma múltiplo humano (1 χ 10^6 células/ml) foram privadas de soro durante 24 horas e então incubadas com 1 nM de TNF, 1 nM de taxol e 300 nM de doxorubicina separada ou em combinação com (0,5 mg/ml) das composições inventivas, conforme indicado, durante 24 horas. A morte celular foi determinada pelo ensaio LIVE/DEAD baseado em calceína AM, conforme ilustrado na Figura 13. A cor vermelha realça as células mortas, e a cor verde realça as células vivas.

As composições inventivas potencializam os efeitos apoptóticos do TNF e dos fármacos quimioterápicos. Em virtude de a ativação do NF-kB ter demonstrado inibir a apoptose induzida por vários agentes, foi investigado se as composições inventivas modulam a apoptose induzida por TNF e agentes quimioterápicos. O efeito das composições inventivas sobre o TNF e a apoptose induzida por agente quimioterápico foi examinado pelo ensaio LIVE/DEAD. O ensaio LIVE/DEAD, que mede a atividade da esterase intracelular e a integridade da membrana plasmática, indicou que as composições inventivas aperfeiçoam os efeitos apoptóticos do TNF, taxol e doxorubicina contra células tumorais. EXEMPLO 10

Ensaios de Desvio de Mobilidade Eletroforética do NF-kB

Ativação

Para determinar a ativação do NF-kB, os Requerentes realizaram ensaios de desvio de mobilidade eletroforética (EMSA), basicamente como descrito anteriormente em Chaturvedi, M.M., Mukhopadhyay, A. and Aggarwal, B.B. (2000) Assay for redox-sensitive transcription factor. Methods Enzymol., 319, 585-602. Em suma, extratos nucleares (1 χ IO6 células/ml) foram incubadas com oligonucleótideo NF-KB de cadeia dupla constituído por 45 monômeros e com marcação no fósforo 32P terminal (15 ug de proteína com 16 fmol de DNA) da repetição terminal longa do vírus daimunodeficiênciahumana, 5- TTGTTACAA GGGACTTTC CGCTG GGGACTTTC CAGGGAGGCGTGG- 3' (o negrito indica sítios de ligação ao NF-KB), durante 30 minutos a 37°C, e o complexo de proteína de DNA formado foi separado do oligonucleotídeo livre em géis de poliacrilamida nativos a 6,6%. Um olignucleotídeo mutado de fita dupla, 5 '--TTGTT ACAA CTCACTTTC CGCTG CTCACTTTC C AGGGAGGCGTGG-3', foi usado para examinar a especificidade da ligação do NF-kB ao DNA. Os géis secos foram visualizados, e as bandas radioativas foram quantificadas usando um Storm 820 phosphorimager com o programa de software ImageQuant (Amersham, Piscataway, NJ). As células KBM-5 (2 χ 10^6 células/ml) foram pré-incubadas com concentrações indicadas das composições inventivas durante 1 hora, tratadas com 0,1 nM de TNF durante 30 minutos. Os extratos nucleares foram analisados em relação à ativação do NF-kB por EMSA, conforme apresentado na Figura 14(A).

As composições inventivas suprimem a ativação do NF-kB de forma dependente da dose e do tempo. Uma vez que o NF-kB desempenha uma importante função na apoptose e na invasão celular, os Requerentes examinaram o efeito das composições inventivas sobre a ativação desse fator de transcrição. Os Requerentes investigaram primeiramente o efeito das composições inventivas sobre a ativação do NF-kB induzida por TNF em células de leucemia mielóide humana (KBM-5). Os resultados do ensaio de ligação ao DNA (EMSA) mostraram que as composições inventivas, estando isoladas, não tiveram efeito sobre a ativação do NF-kB. Entretanto, elas inibem a ativação do NF-kB mediada por TNF de maneira dependente da dose, conforme ilustrado na Figura 14(A).

Células KBM-5 (2 χ 10^6 células/ml) foram pré- incubadas com 1 mg/ml das composições inventivas durante os tempos indicados e então tratadas com 0,1 nM de TNF durante 30 minutos. Os extratos nucleares foram analisados em relação à ativação do NF-kB por EMSA, conforme apresentado na Figura 14(B). Também foi descoberto que a supressão da ativação do NF-kB pelas composições inventivas é dependente do tempo. As composições inventivas inibem a ativação do NF-kB induzida por fumaça de cigarro. Células Hl299 foram pré- incubadas com as composições inventivas (1 mg/ml) durante 1 hora, e então tratadas com fumaça de cigarro (10 ug/ml) durante 1 hora. Os extratos nucleares foram analisados em relação à ativação do NF-kB por EMSA, conforme apresentado na Figura 14(C).

As composições inventivas bloqueiam a ativação do NF-kB induzida por condensado de fumaça de cigarro. Em seguida, os Requerentes examinaram o efeito das composições inventivas sobre a ativação do NF-kB induzida por condensado de fumaça de cigarro em células Hl299 do adenocarcinoma pulmonar não-pequenas. Os resultados do ensaio de ligação ao DNA (EMSA) mostraram que as composições inventivas suprimiram a ativação do NF-kB induzida pelo condensado de fumaça de cigarro, conforme ilustrado na Figura 14(C). Esses resultados indicam que as composições inventivas agiram como uma etapa na via de ativação do NF-kB que é comum ao TNF e ao condensado de fumaça de cigarro.

EXEMPLO 11

Análise Western Blot da Expressão Gênica induzida por TNF

Para determinar o efeito das composições inventivas sobre a expressão induzida por TNF de COX-2, VEGF, ICAM-1, MMP-9, cIPA-1/2, survivina, Bfl-l/Al, Bcl-2, BcIxl, cFLIP, TRAFl e XIAP em extratos de células inteiros de células tratadas (2 χ 10^5 células/ml), 30 ug de proteína foram dissolvidas em SDS-PAGE e sondadas por Western blot com anticorpos específicos, como pelo protocolo recomendado pelo fabricante. As manchas foram lavadas, expostas a anticorpos secundários conjugados com HRP durante 1 hora, e finalmente detectadas pelo reagente ECL (Amersham Pharmacia Biotechnology, Piscataway, NJ).

As composições inventivas inibem produtos gênicos dependentes do NF-kF induzidas por TNF envolvidos na proliferação e na metástase das células tumorais. Os Requerentes também investigaram se as composições inventivas podem modular os produtos gênicos dependentes do NF-kB envolvidos na proliferação e na metástase das células tumorais. Foi descoberto que o TNF induz COX-2, MMP-9, ICAM-I e VEGF, todos os quais possuem sítios de ligação ao NF-kB em seus promotores. Conforme apresentado na Figura 15(A), o tratamento com TNF induziu a expressão dos produtos gênico de COX-2, VEGF, ICAM-I e MMP-9 e as composições inventivas aboliram a expressão.

Células KBM-5 (2 χ 105 células/ml) foram incubadas com 1 mg/ml das composições inventivas durante 1 hora e então tratadas com 1 nM de TNF durante os tempos indicados. Extratos de células inteiros foram preparados e submetidos à análise Western blot usando os anticorpos indicados, conforme ilustrado na Figura 15(B). As composições inventivas inibem os produtos gênicos antiapoptóticos dependentes do NF-kB induzidos por TNF. O NF-kB promove a supra-regulação da expressão das proteínas antiapoptóticas IAP1, IAP2, survivina, Bfl-l/Al, Bcl-2, Bcl-XL, cFLIP, TRAF1, e XIAP Em seguida, os Requerentes investigaram se as composições inventivas afetam a expressão desses produtos gênicos. Os Requerentes descobriram que as composições inventivas inibem a expressão induzida por TNF e basal de todas essas proteínas, conforme apresentado na Figura 15(B).

EXEMPLO 12

Evidência do bloqueio em G2/M das células PC3 mediadas pelas composições inventivas

Conforme ilustrado na Figura 16, o tratamento das células PC3 com as composições inventivas produz a inibição dependente da concentração do ciclo celular. O produto herbáceo produz uma acumulação de células clara em G2/M que é evidente mesmo a concentrações tão baixas quanto 0,28 ul/ml. A concentrações mais elevadas, a fase G2/M é mais evidente, por ser um sub-pico G0 que indica a apoptose. Junto com o aumento no número de células em G2/M, há uma queda progressiva dependente da concentração de células na parte Gl do ciclo celular. Apenas 10% das células-controle estão presentes rotineiramente na fase G2/M, enquanto que o tratamento com 0,57 ul/ml das composições inventivas resulta em mais de 40% das células em um bloco G2/M. Conforme ilustrado na Figura 16A, a mancha superior-esquerda demonstra uma distribuição normal do ciclo celular das células PC3. A porcentagem G2/M das células é pequena (pequeno pico em sombra escura à direita na figura). Na segunda mancha (superior-direita), as células PC3 foram tratadas com 0,28 ul das composições inventivas/ml de meio de cultura de tecido. O tamanho do pico em G2/M aumenta. A mancha na parte inferior-esquerda (0,57 ul das composições inventivas/ml) e na parte inferior-direita (1,14 ul/ml) mostra um bloco de ciclo celular crescente devido à concentração aumentada das composições inventivas.

Conforme ilustrado na Figura 16B, os dados das análises de citometria de fluxo na Figura 16A são representados novamente no histograma, aqui, na Figura 16B. Como visto nessa figura, há um claro aumento dependente da concentração na porcentagem de células nas fases G2/M do ciclo celular, enquanto há uma diminuição associada nas células na fase Gl do ciclo celular.

EXEMPLO 13

Análises de citometria de fluxo da apoptose mediada pelas composições inventivas

Conforme ilustrado na Figura 17, foi descoberto que as concentrações das composições inventivas que produziram apenas níveis baixos de bloqueio em G2/M estão associadas à indução da apoptose precoce, conforme evidenciado pela coloração das células com anexina V e fosfatidilinositol (PI). Mesmo na menor concentração examinada, de 0,28 ul/ml, são obtidas claras evidências da ligação da anexina V à fosfatidilserina de membrana invertida pela citometria de fluxo das células PC3 tratadas com as composições inventivas. Outra evidência da produção da apoptose mediada por várias ervas está na resposta de concentração da ligação do iodeto de propídio a ácidos nucléicos em estágios posteriores de morte celular após a ruptura da integridade da membrana.

Conforme ilustrado na Figura 17A, as células PC3 foram tratadas com as composições inventivas nas concentrações indicadas durante 24 horas. Em seguida, as células foram coradas com solução de Anexina V e PI. A apoptose foi medida por análises de citometria de fluxo (FACS). Mesmo a uma baixa concentração de 0,28 ul/ml, há uma clara indicação de apoptose precoce. A concentrações em excesso de 1,1 ul/ml, a maioria das células morreu e apareceu em um estágio tardio de apoptose (morte celular).

Conforme ilustrado na Figura 17B, os dados das análises de citometria de fluxo das células PC3 tratadas com as composições inventivas (Figura 17A) são representados em um histograma na Figura 17B. Há um claro aumento dependente da concentração na coloração PI, que indica a alteração da membrana celular, uma marca característica da apoptose precoce. A coloração com Anexina V, mesmo na menor concentração das composições inventivas, indica a coloração do DNA associada à apoptose. A porcentagem de células coradas com Anexina V diminui com o aumento da concentração das composições inventivas devido à morte celular.

EXEMPLO 14

Mudanças no metabolismo de eicosanóides mediadas pelas composições inventivas

Conforme ilustrado nas Figuras 18A a 18D, o tratamento das enzimas COX-1, COX-2 e 5-LOX humanas clonadas produz uma inibição dependente da concentração da formação dos respectivos produtos de eicosanóides, PGE2 e 5- HETE, com a formação de 5-LOX sendo inibida com mais potência do que a de COX-I ou COX-2 (dados não ilustrados). As mudanças celulares no metabolismo de eicosanóides devido à incubação com as composições inventivas foram então examinadas. Como visto nas Figuras 18(A) a (D), o tratamento das células PC3 com as composições inventivas produziu uma diminuição na formação de PGE2 (Figura 18A) e 5-HETE (Figura 18B). Entretanto, o que mais impressionou foi o declínio celular nos níveis de 12-HETE, aparentemente originados da inibição da atividade de 12-LOX. Concentrações das composições inventivas tão pequenas quanto 0,25 ul/min produziram uma redução expressiva nos níveis de 12-HETE se comparado às células- controle não tratadas. A maior concentração das composições inventivas examinadas (1 ul/ml) resultou em uma redução de aproximadamente 80% nos níveis de 12-HETE dentro das células PC2 (Figura 18C). O tratamento das células PC3 com as composições inventivas também produziu uma redução evidente na concentração celular da proteína 5-LOX, conforme evidenciado pela análise Western blot (Figura 18D). Um declínio na concentração da proteína 12-LOX também foi evidente a concentrações superiores a 0,25 ul/ml das composições inventivas. O aumento na proteína COX-2 devido à incubação das células PC3 com níveis maiores das composições inventivas é recordatório das elevações dessa enzima devido ao tratamento das células com outros agentes antiinflamatórios, como celecoxib.

Os dados na Tabela 5 foram derivados de análises de fosfoproteína dos lisados de células PC3 após o tratamento com concentrações atóxicas das composições inventivas ou baicaleína, um componente da Scutellaria. As proteínas foram separadas usando eletroforese em gel, e depois o gel foi sondado com anticorpos monoclonais para as proteínas. Os anticorpos poderiam detectar diferenças na condição de fosforilação das proteínas. Em seguida, os géis foram quantificados usando um densitômetro. Apenas as mudanças relativas (embora significativas) são indicadas na tabela abaixo. Existem muitas similaridades nas mudanças na condição de fosforilação sinalizando a supra-regulação ou infra-regulação das proteínas envolvidas no bloco do ciclo celular (por exemplo, ciclina Dl, ciclina D3 e pRB) ou das proteínas associadas à apoptose (por exemplo, sobrevivência, BcI-Xl e Bcl-2). Tanto as composições inventivas quanto a baicaleína também inibem a atividade de 12-LOX. Entretanto, nem todas as mudanças na condição de fosforilação dessas proteínas importantes são idênticas após o tratamento com as composições inventivas ou baicaleína, o que indica que o mecanismo de ação das composições inventivas é complexo e não se deve apenas a seu teor de baicaleína.

Tabela 5

<table>table see original document page 82</column></row><table>

indica redução, inibição ou infra-regulação

indica aperfeiçoamento, ativação ou supra-regulação

EXEMPLO 15 Declínio na fosforilação da proteína Rb mediado pelas composições inventivas

Conforme ilustrado na Figura 19A, há uma inibição dependente da concentração da fosforilação de Rb.

Concentrações tão baixas quanto 0,25 ul/ml reduziram significativamente a pRb, comparado aos controles, enquanto a quantidade de Rb aumentou à medida que a de pRb diminuiu. A diminuição na fosforilação da proteína Rb ocorreu a concentrações das composições inventivas também associadas ao bloco do ciclo celular de G2/M e à apoptose precoce. A quantificação dos dados do Western blot é apresentada na Figura 19B.

Na Figura 19A é ilustrado um Western blot da proteína retinoplastoma tanto como proteínas não fosforiladas (Rb) quanto fosforiladas (pRb). A banda inferior (β-actina) é ilustrada apenas como um controle de carregamento. Os dados são derivados de células PC3 tratadas com as composições inventivas nas concentrações apresentadas durante um período de tempo de 24 horas. Em seguida, as células foram submetidas à lise e as proteínas foram separadas em um gel. A presença das proteínas Rb ou pRb foi determinada com o uso de anticorpos monoclonais específicos. Os dados também são apresentados na figura inferior após ler os géis em um dispositivo de leitura fotométrica para permitir a quantificação da densidade das bandas. Os dados mostram que, mesmo a uma concentração de 0,25 ul/ml das composições inventivas, há uma clara supressão da pRb (forma fosforilada) e um aumento em Rb (forma não fosforilada).

A diminuição na fosforilação de Rb ocorreu em vários sítios de aminoácidos, inclusive T356 (59% de diminuição em relação ao controle), S807 (62% l), T821 (62% i) e T826 (78% i; outros dados não apresentados) devido à incubação das células PC3 com as composições inventivas a uma concentração de 2 ul/ml durante 24 horas.

Tabela 6

Dados de leitura de fosforilação de proteínas das células PC3 tratadas com as composições inventivas^a

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aSeguem as abreviações: PC3, câncer de próstata humano insensível a andrógeno; Rb, proteína retinoblastoma; STAT1, transdutor de sinal e ativador da transcrição 1; Fos, Foc-s FBJ fator de transcrição relacionado à oncoproteína osteosarcoma murino; HspB 1, proteína 27 kDa de choque térmico; p21, serina quinase na proteína ativada por p21. EXEMPLO 16

Capacidade do 12-HETE em bloquear a inibição da proliferação PC3 pelas composições inventivas

Conforme apresentado nas Figuras 20A a 20C, a adição de PGE2 ou 5-HETE a células PC3 tratadas com concentrações inibitórias do crescimento das composições inventivas falhou ao bloquear a proliferação celular. Em contrapartida, a Figura 20A mostra que o 12-HETE adicionado a células tratadas com as composições inventivas (1 ul/ml; uma concentração que produziu potente indução da apoptose e bloqueio em G2/M) resultou em uma duplicação próxima da proliferação celular, embora não retorne para controlar os níveis de células não tratados.

A adição de 12-HETE (designado como 12-H) também resultou em um bloco da capacidade das composições inventivas em inverter a condição fosforilada da proteína RB nas células PC3 (Figura 20B); nenhum dentre o PGE2 ou o 5-HETE (designado como 5H) teve algum efeito sobre a capacidade das composições inventivas em alterar a condição da pRb. Finalmente, o 12-HETE adicionado às células PC3 também proporcionou inversão parcial do bloco G2/M mediado pelas composições inventivas, enfatizando assim a importância desse eicosanóide específico na inibição da proliferação de células PC3 mediada pelas composições inventivas.

Assim, conforme apresentado na Figura 20A em um experimento de "acréscimo", as células PC3 foram tratadas com as composições inventivas nas concentrações indicadas, o que resultou em uma inibição dependente da concentração da proliferação celular (a fluorescência relativa indica os números de células). A adição de 12-HETE, o produto da 12-lipoxigenase, resultou em um aumento moderado no crescimento das células PC3. Entretanto, a adição de 12-HETE às células tratadas com as composições inventivas bloqueou consideravelmente a inibição da proliferação de células tumorais mediada pelas composições inventivas.

Conforme apresentado na Figura 20B, as composições inventivas produziram um declínio dependente da concentração na expressão de pRb. A adição de 5-HETE (5-H) ou PGE2 não bloqueou esse efeito. Entretanto, a adição do produto de 12-LOX, 12-HETE, retornou parcialmente a produção da expressão de pRb. Juntando esses dados, vemos que a inibição da 12-LOX mediada pelas composições inventiva é importante, uma vez que o 12-HETE pode bloquear a atividade antiproliferativa e a capacidade das composições inventivas em restaurar a expressão da proteína supressora tumoral Rb.

Referências

Acredita-se que as seguintes publicações serão úteis para entender a matéria inventiva no contexto de seu local na técnica relevante. As citações aqui contidas não devem ser interpretadas como uma declaração ou pressuposto de que qualquer referência citada é relevante para a patenteabilidade da presente matéria inventiva. Os Requerentes irão revelar informações adequadas relevantes à patenteabilidade em uma Declaração de Revelação de Informações. O conteúdo de cada referência é incorporado na íntegra a este documento.

1. Singh, S. and Aggarwal, B.B. (1995) Activation of transcription factor NF-kappa B is suppressed by curcumin (diferuloylmethane) [corrected]. J. Biol. Chem., 270, 24995-25000.

2. Aggarwal, S., Ichikawa, H., Takada, Y., Sandur, S.K., Shishodia, S. and Aggarwal, B.B. (2006) Curcumin (diferuloylmethane) down-regulates expression of cell

proliferation and antiapoptotic and metastatic gene products through suppression of I kappa B alpha kinase and Akt activation. Mol. Pharmacol., 69, 195- 206.

3. Plummer, S.M., Holloway, K.A., Manson, M.M., Munks, R.J., Kaptein, A., Farrow, S. and Howells, L. (1999) Inhibition of cyclooxygenase 2 expression in colon cells by the chemopreventive agent curcumin involves inhibition of NF kappa B activation via the NIK/IKK signalling complex. Oncogene, 18, 6013-6020.

4. Paschka, A.G., Butler, R. and Young, C.Y. (1998) Induction of apoptosis in prostate câncer cell lines by the green tea component, (-)-epigallocatechin-3-gallate. Câncer Lett, 130, 1-7.

5. Kim, D.S., Kim, H.R., Woo, E.R., Hong, S.T., Chae, H.J. and Chae, S.W. (2005) Inhibitory effects of rosmarinie acid on adriamycin-induced apoptosis in H9c2 cardiac muscle cells by inhibiting reactive oxygen species and the activations of c-Jun N-terminal kinase and extracellular signal- regulated kinase. Biochem. Pharmacol., 70, 1066-1078.

6. Huang, S.S. and Zheng, R.L. (2005) Rosmarinie acid inhibits angiogenesis and its mechanism of action in vitro. Câncer Lett.

7. Shishodia, S., Majumdar, S., Banerjee, S. and Aggarwal, B.B. (2003) Ursolic acid inhibits nuclear factor- kappaB activation induced by carcinogenic agents through suppression of I kappa B alpha kinase and p65 phosphory lation: correlation with down-regulation of cyclooxygenase 2, matrix metalloproteinase 9, and cyclin DL CancerRes., 63, 4375-4383.

8. Choi, Y.H., Baek, J.H., Yoo, M.A., Chung, H.Y., Kim, N.D. and Kim, K.W. (2000) Induction of apoptosis by ursolic acid through activation of caspases and downregulation of c-IAPs in human prostate epithelial cells. Int. J. Oneol., 17, 565- 571.

9. Kim, S.O., Kundu, J.K., Shin, Y.K., Park, J.H., Cho, M.H., Kim, T.Y. and Surh, Y.J. (2005) [6]-Gingerol inhibits COX-2 expression by blocking the activation of p38 MAP kinase and NF-kappaB in phorbol ester-stimulated mouse skin. Oneogene, 24, 2558-2567.

10. Atsumi, T., Murakami, Y., Shibuya, K., Tonosaki, K. and Fujisawa, S. (2005) Induction of cytotoxicity and apoptosis and inhibition of cyclooxygenase-2 gene expression, by curcumin and its analog, alpha-diisoeugenol. Anticancer Res., 25, 4029-4036.

11. Tjendraputra, E., Tran, V.H., Liu- Brennan, D., Roufogalis, B.D. and Duke, C.C. (2001) Effect of ginger constituents and synthetic analogues on cyclooxygenase-2 enzyme in intact cells. Bioorg. Chem., 29, 156- 163.

12. Manna, S.K., Mukhopadhyay, A. and Aggarwal, B.B. (2000) Resveratrol suppresses TNF-induced activation of nuclear transcription factors NF-kappa B, activator protein-1, and apoptosis: potential role of reactive oxygen intermediates and lipid peroxidation. J. Immunol., 164, 6509- 6519.

13. Fukuda, K., Hibiya, Y., Mutoh, M., Koshiji, M., Akao, S. and Fujiwara, H. (1999) Inhibition by berberine of cyclooxygenase-2 transcriptional activity in human colon câncer cells. J. Ethnopharmaeol., 66, 227-233.

14. Kelm, M.A., Nair, M.G., Strasburg, G.M. and DeWitt, D.L. (2000) Antioxidant and cyclooxygenase inhibitory phenolic compounds from Ocimum sanctum Linn. Phytomedieine, 7, 7-13.

15. Bemis, D.L., Capodice, J.L., Anastasiadis, A.G., Katz, A.E. and Buttyan, R. (2005) Zyflamend, a unique herbal preparation with nonselective COX inhibitory activity, induces apoptosis of prostate câncer cells that Iack COX-2 expression. Nutr. Câncer., 52, 202-212.

16. Aggarwal, B.B. (2004) Nuclear factor- kappaB: the enemy within. Câncer Cell, 6, 203-208.

17. Anto, R.J., Mukhopadhyay, A., Shishodia, S., Gairola, C.G. and Aggarwal, B.B. (2002) Cigarette smoke condensate activates nuclear transcription factor-kappaB through phosphorylation and degradation of IkappaB(alpha): correlation with induction of cyclooxygenase- 2. Carcinogenesis, 23, 1511-1518.

18. Bharti, A.C., Takada, Y., Shishodia, S. and Aggarwal, B.B. (2004) Evidence that receptor activator of nuclear factor (NF)-kappaB ligand can suppress cell proliferation and induce apoptosis through activation of a NF- kappaBindependent and TRAF6-dependent mechanism. J. Biol. Chem., 279, 6065-6076.

19. Takada, Y., Ichikawa, EL, Badmaev, V. and Aggarwal, B.B. (2006) Acetyl-11-ketobeta- boswellic acid potentiates apoptosis, inhibits invasion, and abolishes osteoclastogenesis by suppressing NF-kappaB and NF-kappaB- regulated gene expression. J. Immunol., 176, 3127-3140.

20. Chaturvedi, M.M., Mukhopadhyay, A. and Aggarwal, B.B. (2000) Assay for redox-sensitive transcription factor. Methods Enzymol., 319, 585-602. 21. Abu-Amer, Y. and Tondravi, M.M. (1997) NF-kappaB and bone: the breaking point. Nat. Med., 3, 1189- 1190.

22. Liotta, L.A., Thorgeirsson, U.P. and Garbisa, S. (1982) Role of collagenases in tumor cell invasion. Câncer

Metastasis Rev., 1,277-288.

23. Van Antwerp, D.J., Martin, S.J., Kafri, T., Green, D.R. and Verma, I.M. (1996) Suppression of TNF-alpha- induced apoptosis by NF-kappaB. Science, 21 A, 787- 789.

24. Wang, C.Y., Mayo, M.W. and Baldwin, A.S., Jr. (1996) TNF- and câncer therapyinduced apoptosis:

potentiation by inhibition of NF-kappaB. Science, 274, 784-787.

25. Yamamoto, K., Arakawa, T., Ueda, N. and Yamamoto, S. (1995) Transcriptional roles of nuclear factor kappa B and nuclear factor-interleukin-6 in the tumor necrosis factor alpha-dependent induction of cyclooxygenase-2 in MC3T3-E1 cells. J. Biol Chem., 270, 31315-31320.

26. Esteve, P.O., Chicoine, E., Robledo, 0., Aoudjit, F., Descoteaux, A., Potworowski, E.F. and St-Pierre, Y. (2002) Protein kinase C-zeta regulates transcription of the

matrix metalloproteinase-9 gene induced by IL- 1 and TNF-alpha in glioma cells via NF-kappa B. J. Biol. Chem., 277, 35150-35155. 27. van de Stolpe, A., Caldenhoven, E., Stade, B.G., Koenderman, L., Raaijmakers, J.A., Johnson, J.P. and van der Saag, P.T. (1994) 12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate and tumor necrosis factor alpha-mediated induction of intercellular adhesion molecule-1 is inhibited by dexamethasone. Functional analysis of the human intercellular adhesion molecular-1 promoter. J. Biol. Chem., 269, 6185-6192.

28. Zhu, L., Fukuda, S., Cordis, G., Das, D.K. and Maulik, N. (2001) Anti-apoptotic protein survivin plays a significant role in tubular morphogenesis of human coronary arteriolar endothelial cells by hypoxic preconditioning. FEBS Lett., 508, 369-374.

29. Chu, Z.L., McKinsey, T.A., Liu, L., Gentry, J.J., Malim, M.H. and Ballard, D.W. (1997) Suppression of tumor necrosis factor-induced cell death by inhibitor of apoptosis C-IAP2 is under NF-kappaB control. Proc. Natl Acad. Sei. U S A., 94, 10057-10062.

30. You, M., Ku, P.T., Hrdlickova, R. and Bose, H.R., Jr. (1997) ch-IAPl, a member of the inhibitor-of- apoptosis protein family, is a mediator of the antiapoptotic activity of the v-Rel oncoprotein. Mol. Cell Biol., 17, 7328-7341.

31. Catz, S.D. and Johnson, J.L. (2001) Transcriptional regulation of bcl-2 by nuclear factor kappa B and its significance in prostate câncer. Oncogene, 20, 7342-7351.

32. Stehlik, C, de Martin, R., Kumabashiri, I., Schmid, J.A., Binder, B.R. and Lipp, J. (1998) Nuclear factor (NF)-kappaB-regulated X-chromosome-linked iap gene expression protects endothelial cells from tumor necrosis factor alpha-induced apoptosis. J. Exp. Med., 188, 211-216.

33. Tamatani, M., Che, Y.H., Matsuzaki, H., Ogawa, S., Okado, H., Miyake, S., Mizuno, T. and Tohyama, M. (1999) Tumor necrosis factor induces Bcl-2 and Bclx expression through NFkappaB activation in primary hippocampal neurons. T.Biol Chem., 274, 8531-8538.

34. Schwenzer, R., Siemienski, K., Liptay, S., Schubert, G., Peters, N., Scheurich, P., Schmid, R.M. and Wajant, H. (1999) The human tumor necrosis factor (TNF) receptor-associated factor 1 gene (TRAFl) is up-regulated by cytokines of the TNF ligand family and modulates TNF-induced activation of NF-kappaB and c- Jun N-terminal kinase. J. Biol. Chem., 274, 19368-19374.

35. Kreuz, S., Siegmund, D., Scheurich, P. and Wajant, H. (2001) NF-kappaB inducers upregulate cFLIP, a cycloheximide-sensitive inhibitor of death receptor signaling. Mol. Cell Biol., 21, 3964-3973.

36. Shishodia, S. and Aggarwal, B.B. (2004) Nuclear factor-kappaB activation mediates cellular transformation, proliferation, invasion angiogenesis and metastasis of câncer. Câncer TreatRes., 119, 139-173.

37. Takada, Y., Singh, S. and Aggarwal, B.B. (2004) Identification of a p65 peptide that selectively inhibits NF- kappa B activation induced by various inflammatory stimuli and its role in down-regulation of NF-kappaB-mediated gene expression and up-regulation of apoptosis. J. Biol. Chem, 279, 15096-15104.

Tendo descrito a presente matéria inventiva, será óbvio que esta pode ser modificada ou variada de diversas formas. Tais modificações e variações não devem ser interpretadas como um afastamento do espírito e âmbito da presente matéria inventiva, e todas tais modificações e variações devem ser incluídas no âmbito das reivindicações a seguir.

Claims (21)

1. Método de modulação de um processo metabólico de eicosanóides nas células de um animal que dele necessita, que compreende administrar ao animal uma quantidade de uma composição efetiva para regular a atividade de uma oxigenase de eicosanóides, caracterizado pelo fato de que a composição compreende quantidades efetivas, do ponto de vista terapêutico, de extratos supercríticos de alecrim, açafrão-da-terra, orégano e gengibre; e quantidades efetivas, do ponto de vista terapêutico, de extratos hidroalcoólicos de manjericão sagrado, gengibre, açafrão-da-terra, Scutellaria baicalensis, alecrim, chá verde, Coptis chinensis e uva-espim.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células são células cancerosas.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as células cancerosas compreendem células de câncer de próstata, células de câncer de mama, células de câncer de pulmão, células de câncer de cólon ou uma combinação destes.

4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o processo metabólico de eicosanóides é um metabolismo aberrante associado à transformação celular para câncer, proliferação de células cancerosas, metástase de células cancerosas, metástase de células cancerosas, invasividade de células cancerosas, angiogênese modulada por células cancerosas, supressão de apoptose modulada por células cancerosas, ou uma combinação destes.

5. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o eicosanóide é selecionado dentre o grupo composto de ácido araquidônico e ácido linolínico.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o eicosanóide é ácido araquidônico.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a oxigenase de eicosanóides é ciclooxigenase-1, ciclooxigenase-2, 5-lipoxigenase, 12- lipoxigenase ou uma combinação destes.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a oxigenase de eicosanóides é 12- lipoxigenase.

9. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a oxigenase de eicosanóides é 5- lipoxigenase.

10. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a oxigenase de eicosanóides é ciclooxigenase-1, ciclooxigenase-2 ou uma combinação destes.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a oxigenase de eicosanóides é ciclooxigenase-1.

12. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a oxigenase de eicosanóides é ciclooxigenase-2.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a regulação da atividade de uma oxigenase de eicosanóides é a inibição.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a modulação de um processo metabólico de eicosanóides compreende inibir a atividade de NF- DB nas células do animal.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que animal é um ser humano.

16. Método de administração de 13-S-HODE a um animal que dele necessita, caracterizado por compreender administrar ao animal uma composição que compreende quantidades efetivas, do ponto de vista terapêutico, de extratos supercríticos de alecrim, açafrão-da-terra, orégano e gengibre; e quantidades efetivas, do ponto de vista terapêutico, de extratos hidroalcoólicos de manjericão sagrado, gengibre, açafrão-da-terra, Scutellaria baicalensis, alecrim, chá verde, Coptis chinensis e uva-espim.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que animal é um ser humano.

18. Método de inibição de inflamação mediada por ácido araquidônico em um animal que dela necessita, caracterizado por compreender administrar ao animal uma composição que compreende quantidades efetivas, do ponto de vista terapêutico, de extratos supercríticos de alecrim, açafrão-da- terra, orégano e gengibre; e quantidades efetivas, do ponto de vista terapêutico, de extratos hidroalcoólicos de manjericão sagrado, gengibre, açafrão-da-terra, Scutellaria baicalensis, alecrim, chá verde, huzhang, Coptis chinensis e uva-espim.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que animal é um ser humano.

20. Método de modulação do nível de produtos gênicos regulados por NF-DB nas células de um animal que dela necessita, caracterizado por compreender administrar ao animal uma composição que compreende quantidades efetivas, do ponto de vista terapêutico, de extratos supercríticos de alecrim, açafrão-da-terra, orégano e gengibre; e quantidades efetivas, do ponto de vista terapêutico, de extratos hidroalcoólicos de manjericão sagrado, gengibre, açafrão-da-terra, Scutellaria baicalensis, alecrim, chá verde, Coptis chinensis e uva-espim.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que animal é um ser humano.