KR20080080129A - 단백질의 고압 리폴딩을 위한 장치 및 방법 - Google Patents

Abstract

고압 처리 동안 샘플들, 특히 액체 샘플을 보유하기 위한 장치가 개시된다. 상기 장치는 멀티-구획 장치 실시 예에 있어서 샘플의 고효율 스크리닝과, 고압 처리 동안의 용액 조건의 조절과 같은 다양한 기능이 가능하다. 상기 장치는 고압 조건 동안에 완결성을 유지하도록 설계되고, 산소에 대해 실질적으로 불투과성을 나타낸다.

단백질 리폴딩, 멀티-웰 플레이트, 컨테이너, 산소-불투과성, 액체 샘플.

Description

단백질의 고압 리폴딩을 위한 장치 및 방법{DEVICES AND METHODS FOR HIGH-PRESSURE REFOLDING OF PROTEINS}

[관련출원의 상호 참조]

본 출원은 2005년 11월 21일 출원된 미합중국 임시 특허출원 제 60/739,094호에 대한 우선권의 이익을 주장한다. 그 출원의 전체 내용은 이곳에서 참조로서 포함된다.

본 발명은 높은 정수압(hydrostatic pressure)에서 작동하도록 설계된 콘테이너, 멀티웰(multiwell) 플레이트와 같은 장치와, 콘테이너 및 멀티웰 플레이트에 유체를 펌핑하기 위한 장치에 관한 것이다. 본 발명은 또한 고압하에서 단백질을 리폴딩(refolding)하기 위해 그러한 장치를 사용하는 방법에 관한 것이다.

많은 단백질들이 치료제(therapeutic agent)로서 가치가 있다. 그러한 단백질들은, 체내에서 불충분한 성장 호르몬이 만들어지는 경우에 비정상적 성장을 치료하는데 사용되는 인간 성장 호르몬, 그리고 종양 및 바이러스 질환 치료에 사용되는 인터페론-감마(interferon-gamma)를 포함한다. 단백질 약제들은 종종 DNA 재조합 기술을 이용하여 생산되는데, 그 기술은 자연적으로 발생하는 소스(naturally-occurring source)로부터 분리될 수 있는 것보다 많은 양의 단백질 생산을 가능하게 하고, 자연적으로 발생하는 소스로부터 분리되는 단백질에서 종종 발생하는 오염을 방지한다.

단백질의 적절한 폴딩(folding)은 그 단백질의 정상적인 기능에 필수적이다. 부적절하게 폴디드된(folded) 단백질들은, 알츠하이머 병, 소해면상뇌증(bovine spongiform encephalopatahy)(BSE, 또는 "광우(mad cow)" 병), 크루츠펠트-야곱(Creutzfeldt-jakob)병 (CJD), 그리고 파킨슨병을 포함하는 여러 질환들의 병리(pathology)에 기여하는 것으로 믿어지고 있으며, 전술한 질병들은 적절한 단백질 폴딩의 중요성을 알려준다.

재조합 인간 성장 호르몬 및 재조합 인간 인터페론 감마와 같은 인간에 대한 치료적 가치가 있는 여러 단백질들은 박테리아, 효모균 및 다른 미생물들에서 발현될 수 있다. 많은 양의 단백질이 그러한 시스템에서 생성되지만, 단백질들은 종종 미스폴디드(misfolded)되고, 종종 봉입체(inclusion body)로 불리는 큰 덩어리로 함께 뭉친다. 단백질은 미스폴디드된 뭉친 상태로는 사용될 수 없다. 따라서, 그러한 단백질들을 분해하여 적절하게 리폴딩하는 방법들이 많은 연구의 주제가 되어 왔다.

단백질 리폴딩의 한 방법은, 단백질들을 분해하여 언폴드 및 적절하게 리폴드하기 위해서 단백질 용액에 대하여 고압을 사용하는 것이다. 그러한 방법들은 미합중국 특허 제 6,489,450 호, 미합중국 특허출원 공개번호 제 2004/0038333 호 및 국제특허출원 제 WO 02/062827 호에 개시되었다. 그러한 문헌들은 뭉친 단백질들 또는 미스폴디드된 단백질들에 대한 고압 처리가 생물학적 활성을 유지하는 분해된 단백질의 양호한 수율로의 회복(즉, 생물학적 활성에 대해 요구되는 바와 같이, 단백질이 적절하게 폴디드됨)을 가져왔다는 것을 보여주었다. 상기 미합중국 특허 제 6,489,450 호, 미합중국 특허출원 공개번호 제 2004/0038333 호 및 국제특허출원 제 WO 02/062827 호는 여기에서 전체가 참조로서 포함되었다.

미합중국 특허출원 제 2004/0038333 호에 개시된 바와 같이, 단백질에 대한 적정한 리폴딩 조건을 결정하기 위해 실험적 스크리닝(screening) 과정이 때때로 요구된다. 따라서, 멀티웰 플레이트, 1회용 싱글-샘플 컨테이너 및 고압하에서 용액 조건을 변화시키도록 고압하에서 용액을 혼합하기 위한 장치와 같은, 그 적정 조건들을 신속하게 결정하는 방법에 사용될 수 있는 적정한 장비의 필요성이 존재한다.

96-웰 플레이트(통상적으로 8 x 12 배열의 웰들을 갖는)가 생물학 및 생화학에서의 고-효율 스크리닝에 통상적으로 사용된다. 그러나, 현재 상업적으로 이용가능한 플레이트들은 고압 적용(즉, 250bar 이상)에는 적절하지 못하다. 본 발명은 고압하에서 사용하기에 적합한 장비를 제공한다.

고압 연구에 현재 사용되는 싱글-샘플 컨테이너들은 또는 결점들이 있다. 저밀도 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌과 같은 재료로 만들어진 컨테이너들은 고압하에서 산소의 상당한 매스 이동(significant mass transfer)을 허용한다. 용액의 산화환원(redox) 환경에 민감한 반응에 대해서, 그러한 산소 이동은 매우 바람직하지 못하다. 본 발명은 원하는 경우에 컨테이너의 벽들을 통한 산소 매스 이동을 감소하거나 제거하는 장비를 또한 제공한다.

현재 사용되는 장비의 다른 결점은 고압 처리 동안에 용액 조건들이 조정될 수 없다는 점이다. 본 발명은, 컨테이너 및 용액들이 고압 장비 내부에 있는 동안에, 다양한 컨테이너 및 용액들의 조작이 가능하여 고압 처리 중에도 용액 조건들의 변화를 가능하게 하는 장비를 제공한다.

발명의 개요

본 발명은, 싱글-샘플 보유 장치, 멀티-샘플 보유 장치 및 고압에서의 사용에 적합한 용액 교환 장치들을 제공한다. 몇몇 실시 예들에 있어서, 상기 장치들은 중합체로 제조되므로 비교적 저가의 제조를 가능하게 한다. 이것은 또한 편리한 제조를 위해 장치들의 사출 성형을 가능하게 한다. 몇몇 실시 예들에 있어서, 상기 장치들은 편리한 사용을 위해 1회용으로 구성될 수 있다. 용액 교환 장치들은 샘플이 고압 하에 유지되는 동안에 샘플의 용액 조건들의 변경을 허용한다. 선택적인 실시 예에 있어서, 상기 장치들은 산소-불투과성(oxygen-impermeable) 재료로 제조될 수 있다.

일 실시 예에 있어서, 본 발명은 액체 샘플을 수용하기 위한 적어도 두 개의 구획(compartments)을 포함하고, 상기 장치는 구획이 고압을 받는 경우에 그 구획을 실질적으로 폐쇄된 시스템으로서 유지하는 멀티-샘플 보유 장치를 제공한다.

다른 실시 예에 있어서, 본 발명은 a) 고압하에서 완결성(integrity)을 유지하는 재료로 제조된 몸체와, b) 액체 샘플들을 수용하기에 적합한 몸체에 제공된 다수의 샘플 구획들을 포함하는데, 여기에서 상기 장치는 다수의 구획들 사이 또는 소정 샘플 구획과 주위 사이에서 액체 샘플의 상당한 이동을 허용하지 않는 멀티- 샘플 보유 장치를 제공한다.

전술한 멀티-샘플 보유 장치의 또 다른 실시 예에 있어서, 다수의 샘플 구획은 적어도 2개의 샘플 구획, 적어도 10개의 샘플 구획, 적어도 16개의 샘플 구획, 적어도 25개의 샘플 구획, 적어도 36개의 샘플 구획, 적어도 48개의 샘플 구획, 적어도 72개의 샘플 구획, 또는 적어도 96개의 샘플 구획을 포함한다. 전술한 멀티-샘플 보유 장치의 또 다른 실시 예에 있어서, 다수의 샘플 구획은 적어도 96개의 샘플 구획을 포함한다.

멀티-샘플 보유 장치의 일 실시 예에 있어서, 샘플 구획은 그 장치의 정부(top side)에 개구부를 가지며, 샘플 구획의 개구부는 그 개구부를 덮도록 장치의 정부에 밀봉 매트를 위치시킴으로써 밀봉된다. 그 밀봉 매트는 일정한 텐션의 클램프에 의해서 제자리에 유지된다. 멀티-샘플 보유 장치의 다른 실시 예에 있어서, 샘플 구획들은 구획들에 샘플들을 로딩하기 전에 구획들의 개구부에 열적으로 밀봉된 격벽들을 위치시킴으로써 밀봉된다. 샘플들은 그 격막을 통과하는 니들 주입을 통해서 로딩된다. 점착성 중합체 멤브레인이 장치 및 격막 정부에 위치되어 적절한 밀봉을 보장한다.

전술한 멀티-샘플 보유 장치의 다른 실시 예에 있어서, 장치의 몸체는 폴리에틸렌테레프탈레이트, 고밀도 폴리에틸렌, 폴리스티렌 및 폴리스티렌-부타디엔 블록 공중합체들로 구성된 그룹으로부터 선택된 재료로 형성된다. 전술한 멀티-샘플 보유 장치의 다른 실시 예에 있어서, 장치의 몸체는 폴리에틸렌테레프탈레이트로부터 형성된다. 전술한 멀티-샘플 보유 장치의 다른 실시 예에 있어서, 장치의 몸체 는 폴리스티렌-부타디엔 블록 공중합체들부터 형성된다.

다른 실시 예에 있어서, 본 발명은, 액체 샘플을 보유하기 위한 적어도 하나의 구획을 포함하고, 상기 컨테이너는, 파손 또는 파괴 없이 약 5kbar, 양호하게는 약 10kbar까지 지탱할 수 있고 선택적으로 고압에서 산소에 불투과성인 신축성 재료로 제조되는 액체 샘플의 압력 처리용 컨테이너를 제공한다. (표시된 압력은 차압이 아닌 전체 컨테이너상의 다차원 압력이다.) 일 실시 예에 있어서, 컨테이너는 액체 샘플 보유 목적의 단지 하나의 구획을 갖는다. 일 실시 예에 있어서, 상기 컨테이너는 표준 압력에서 일정한 로딩 부피를 갖는다. 다른 실시 예에 있어서, 상기 컨테이너는 표준 압력에서 가변 로딩 부피를 갖는다.

다른 실시 예에 있어서, 가변 로딩 부피를 갖는 컨테이너는, 제 1 단부 및 제 2 단부를 갖는 실린더를 포함한다. 가동 플러그가 실린더 제 1 단부 내에 삽입되고, 실린더 내용물을 제거할 수 있도록 탈착될 수 있는 제거 가능한 부분이 실린더 제 2 단부에 고정된다. 제거 가능한 부분은 캡일 수 있는데, 그것은 실린더 제 2 단부 상에 제공된 보완적인 나사와 결합될 수 있거나, 스냅방식으로 결합될 수 있거나, 또는 자기적으로 고정될 수 있다. 다른 실시 예에 있어서, 짧고 좁은 돌출부가 실린더 제 2 단부로부터 연장되고, 베어링 나사 또는 캡을 결합시키는 다른 방법이 존재하며; 캡이 실린더 내용물을 제거할 수 있도록 하기 위하여 돌출부상에 위치된다. 일 실시 예에 있어서, 좁은 돌출부는 Luer-Lok® fittings(Luer-Lok®은 Franklin Lakes, New Jersey 소재의 Becton, Dickinson & Co.의 인터로킹 커넥션 시스템에 대한 등록 상표이다)를 지탱할 수 있다.

다른 실시 예에 있어서, 가변 로딩 부피를 갖는 컨테이너는, 제 1 단부 및 제 2 단부를 갖는 실린더를 포함한다. 가동 플러그가 상기 실린더의 제 1 단부에 삽입된다. 밀봉된 팁이 실린더의 제 2 단부에 부착되는데, 그 팁은 실린더 내용물의 제거를 허용하도록 탈착될 수 있다. 밀봉된 팁은 실린더 제 2 단부로부터 연장되는 짧고 좁은 돌출부일 수 있는데, 그것은 실린더 내용물의 제거를 허용하도록 부서질 수 있다. 몇몇 실시 예들에 있어서, 팁은 수동으로 파손이 가능하고, 다른 실시 예들에 있어서 팁은 수동으로는 파손되지 않고 절단 공구를 사용하여야 파손된다.

다른 실시 예에 있어서, 가변 로딩 부피 컨테이너에서의 사용을 위한 가동 플러그는 원-웨이 밸브를 갖는다. 원-웨이 밸브는 컨테이너 내의 에어와 샘플이 대기압에서 누설되도록 하는 반면에, 컨테이너 외부의 어떤 에어, 가스 또는 액체가 밸브를 통해서 컨테이너 내로 다시 유동하는 것을 방지한다. 일 실시 예에 있어서, 원-웨이 밸브는 체크 밸브이다. 다른 실시 예에 있어서, 원-웨이 밸브는 볼 및 스프링 체크 밸브이다. 또 다른 실시 예에 있어서, 원-웨이 밸브는 플랩 체크 밸브이다. 또 다른 실시 예에 있어서, 원-웨이 밸브는 덕 빌(duck bill) 역류 밸브이다. 또 다른 실시 예에 있어서, 원-웨이 밸브는 엄브렐라(umbrella) 밸브이다. 또 다른 실시 예에 있어서, 원-웨이 밸브는 스윙-체크(swing-check) 밸브이다. 또 다른 실시 예에 있어서, 원-웨이 밸브는 리프트-체크 밸브이다.

전술한 컨테이너의 다른 실시 예들에 있어서, 컨테이너는 폴리에틸렌테레프탈레이트, 고밀도 폴리에틸렌, 폴리스티렌 및 폴리스티렌-부타디엔 블록 공중합체 들로 구성된 그룹으로부터 선택된 재료로 형성된다. 전술한 컨테이너의 다른 실시 예에 있어서, 컨테이너는 폴리에틸렌테레프탈레이트로부터 형성된다. 전술한 컨테이너의 또 다른 실시 예에 있어서, 컨테이너는 폴리스티렌-부타디엔 블록 공중합체들부터 형성된다.

다른 실시 예에 있어서, 본 발명은 고압에서의 용액 교환(용액 혼합)용 장치를 제공하는데, 그 장치는, 제 1 액체 샘플을 보유하는 적어도 하나의 제 1 컨테이너와, 추가적인 샘플을 보유하는 하나 이상의 추가적인 컨테이너를 포함하고, 상기 제 1 액체 샘플 및 상기 추가적인 액체 샘플 또는 샘플들은 동일하거나 상이할 수 있으며, 여기에서 상기 컨테이너는, 파손 또는 파괴 없이 5kbar, 양호하게는 10kbar 압력(차압이 아니고, 시스템상의 다차원 압력임)까지 지탱할 수 있고 선택적으로 고압에서 산소에 대하여 실질적으로 불투과성인 신축성 재료로 제조되고, 하나 이상의 추가적인 컨테이너의 상기 액체 샘플은 제 1 컨테이너의 액체 샘플과 혼합될 수 있고, 반면에, 제 1 컨테이너 및 추가적인 컨테이너들과 그들 각각의 액체 샘플들은 혼합 전, 그동안, 그리고 그 후에 고압으로 유지될 수 있다. 상기 하나 이상의 추가적인 컨테이너가 다수의 컨테이너, 즉 두 개 이상의 컨테이너를 포함하는 경우에, 두 개 이상의 추가적인 컨테이너 내용물은 두 개 이상의 컨테이너들과 독립적으로(즉, 상이한 시간에) 또는 두 개 이상의 컨테이너들과 관련해서(즉, 동시에 또는 미리-결정된 시간으로) 제 1 컨테이너 내용물과 혼합될 수 있다. 혼합 또는 접촉 전의 고압, 혼합 또는 접촉 동안의 고압, 그리고 혼합 또는 접촉 후의 고압은 모두 동일한 압력일 수 있거나, 또는 두 개는 동일한 압력이고 나머지 하나는 상이한 압력일 수 있거나, 또는 모든 세 압력이 상이할 수 있다.

압력하의 용액 교환(용액 혼합)용 장치의 다른 실시 예에 있어서, 그 장치는, 예비-혼합 컨테이너로 지칭된 액체 샘플들(이 경우 액체 샘플들은 동일하거나 상이할 수 있다)을 보유하는 적어도 두 개의 예비-혼합 컨테이너들과, 이동 전에 비거나 또는 이동 전에 액체 또는 고체 조성물을 함유할 수 있는 수용 컨테이너로 지칭된 적어도 하나의 추가적인 컨테이너를 포함하고, 상기 컨테이너들은 파손 또는 파괴 없이 약 5kbar, 양호하게는 약 10kbar까지(표시된 그 압력은 차압이 아닌 전체 컨테이너상의 다차원 압력이다) 지탱할 수 있고 선택적으로 고압에서 산소에 불투과성인 재료로 제조되고, 액체 샘플을 보유하는 적어도 두 개의 예비-혼합 컨테이너들에 있는 액체 샘플들은, 액체 샘플들이 서로 각각 접촉할 수 있는 적어도 하나의 수용 컨테이너 안으로 이동할 수 있고, 그리고 액체 샘플을 보유하는 적어도 두 개의 예비-혼합 컨테이너와, 적어도 하나의 수용 컨테이너와 액체 샘플들 자체는 혼합 전후 및 혼합 동안에 고압으로 유지될 수 있다. 일 실시 예에 있어서, 스태틱 믹서(HPLC 용매 혼합을 위해 사용된 것과 같은)가 액체 샘플들의 혼합을 용이하게 하도록, 액체 샘플을 보유하는 적어도 두 개의 예비-혼합 컨테이너와 적어도 하나의 수용 컨테이너 사이의 유동 통로에 개재될 수 있다. 다른 실시 예들에 있어서, 하나 이상의 예비-혼합 컨테이너로부터의 유동은 밸브에 의해 독립적으로 제어되어, 예비-혼합 컨테이너로부터 배출된 소정 내용물이 수용 컨테이너 내로 유인되도록 하는 반면에, 그 후에 다른 하나의 선택된 예비-혼합 컨테이너들로부터의 유동을 방지하며, 그 밸브들은 다른 선택된 예비-혼합 컨테이너들의 내용물이 수용 컨테이너 안으로 유동할 수 있도록 설정될 수 있다.

용액 교환(혼합)용 시스템의 다른 실시 예에 있어서, 본 발명은, 제 1 액체 샘플을 보유하기 위한 구획을 포함하고, 파손 또는 파괴 없이 약 5kbar, 양호하게는 약 10kbar까지(차압이 아닌 다차원 압력이다) 지탱할 수 있고 선택적으로 고압에서 산소에 불투과성인 신축성 재료로 제조되는 제 1 컨테이너와; 파손 또는 파괴 없이 약 5kbar, 양호하게는 약 10kbar까지(차압이 아닌 다차원 압력이다) 지탱할 수 있고 선택적으로 고압에서 산소에 불투과성인 신축성 재료로 제조되는 하나 이상의 추가적인 컨테이너를 포함하고, 상기 하나 이상의 추가적인 컨테이너들은 제 1 컨테이너에 의해 완전히 둘러싸이고, 서로에 대하여 그리고 제 1 컨테이너 샘플과 동일하거나 또는 상이할 수 있는 추가적인 샘플들을 함유하고; 상기 하나 이상의 추가적인 컨테이너들은 제 1 컨테이너 내에 있는 동안에 개방(다른 추가적인 컨테이너들과 독립적으로, 또는 추가적인 컨테이너들과 조화되어서)되어 제 1 컨테이너 샘플들과 추가적인 컨테이너 샘플의 혼합을 허용한다. 일 실시 예에 있어서, 하나 이상의 추가적인 컨테이너들은 밀폐 위치에 유지될 수 있는 캡을 포함하고, 그 캡은 제 1 컨테이너가 개방되지 않아도 개방될 수 있는 반면에, 상기 제 1컨테이너, 하나 이상의 추가적인 컨테이너 및 모든 액체 샘플들은 혼합 전후 및 혼합하는 동안에 고압으로 유지될 수 있다. 다른 실시 예에 있어서, 상기 캡은 또한 제 1 컨테이너에 함유된 액체 샘플들을 하나 이상의 추가적인 컨테이너의 액체 샘플들과 혼합시킬 수 있다. 다른 실시 예에 있어서, 상기 캡은 자기 디스크와 같은 자기화 부분을 포함한다.

용액 교환(혼합)용 시스템의 다른 실시 예에 있어서, 본 발명은 액체 샘플의 압력 처리용 컨테이너 시스템을 제공하는데, 그 시스템은 액체 샘플을 보유하기 위한 구획을 포함하고, 파손 또는 파괴 없이 약 5kbar, 양호하게는 약 10kbar까지(차압이 아닌 다차원 압력이다) 지탱할 수 있고 선택적으로 고압에서 산소에 불투과성인 신축성 재료로 제조되는 제 1 컨테이너와; 파손 또는 파괴 없이 약 5kbar, 양호하게는 약 10kbar까지(차압이 아닌 다차원 압력이다) 지탱할 수 있고 선택적으로 고압에서 산소에 불투과성인 신축성 재료로 제조되는 하나의 추가적인 컨테이너를 포함하는데, 상기 제 1 컨테이너 및 적어도 하나의 추가적인 컨테이너는 유동 루프에 의해 연결된다. 상기 유동 루프는 유동 루프에서 단지 한 방향으로의 유동을 허용하는 체크 밸브와 컨테이너 시스템이 고압을 받을 경우에 작동할 수 있는 펌프를 포함한다. 상기 펌프는 마이크로프로세서에 의해 제어될 수 있다. 상기 마이크로프로세서가 고압 장치에 포함되는 경우에는, 고압 장치에 또한 포함될 수 있는 배터리 또는 고압 장치 내로 이어지는 동력선에 의해 동력을 공급받는다. 이와는 달리, 그 장치는 고압 챔버로 통하는 적절하게 밀봉된 개구부를 통해서 고압 챔버로 들어가는 구동 샤프트에 의해 제어될 수 있다. 유동 루프는 바이패스 분기를 경유하여 하나 이상의 추가적인 컨테이너 중의 하나 이상을 바이패스시킬 수 있고, 밸브들은 바이패스 분기들을 밀폐시키고 하나 이상의 추가적인 컨테이너들을 유동 루프에 다른 추가적인 컨테이너와 독립적으로 또는 조합해서 유동 루프에 연결시킬 수 있다.

용액 교환(혼합)용의 모든 실시 예들에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 컨 테이너에서 액체 샘플 또는 샘플들은 제 1 컨테이너의 액체 샘플과 혼합되는 경우에, 제 1 컨테이너의 제 1 액체 샘플의 용액 조건들을 변경시킬 수 있고, 그래서 조합 액체는 제 1 액체 샘플 및/또는 적어도 하나의 추가적 액체 샘플과는 다른 용액 조건에 있게 된다. 변화될 수 있는 용액 조건들은, 하기의 예로서 제한되지 않지만, pH, 염 농도, 환원 반응제 농도, 산화 반응제 농도, 유발제 농도, 아르기닌 농도, 계면 활성제 농도, 양호하게 배제시키는 화합물 농도, 리간드 농도, 액체 샘플에 원시적으로 존재하는 어떤 화합물 농도 또는 용액에 첨가되는 추가적인 반응물 또는 반응제의 첨가를 포함한다.

장치들의 전술한 모든 실시 예에 있어서, 장치는, 고압 처리 지속 동안에 샘플에서 약 0.2mM 이하의, 재료를 가로지르는 산소 매스 이동으로 인한 산소 농도에서의 변화를 허용하는 재료를 포함한다. 다른 실시 예에 있어서, 재료는 고압 처리 지속 동안에 샘플에서 약 0.1mM 이하의, 재료를 가로지르는 산소 매스 이동으로 인한 산소 농도에서의 변화를 허용한다. 다른 실시 예에 있어서, 그 재료는 고압 처리 지속 동안에 샘플에서 약 0.05mM 이하의, 재료를 가로지르는 산소 매스 이동으로 인한 산소 농도에서의 변화를 허용한다. 또 다른 실시 예에 있어서, 그 재료는 고압 처리 지속 동안에 샘플에서 약 0.025mM 이하의, 재료를 가로지르는 산소 매스 이동으로 인한 산소 농도에서의 변화를 허용한다. 다른 실시 예에 있어서, 그 재료는 고압 처리 지속 동안에 샘플에서 약 0.01mM 이하의, 재료를 가로지르는 산소 매스 이동으로 인한 산소 농도에서의 변화를 허용한다. 다른 실시 예에 있어서, 그 재료는 고압 처리 지속 동안에 샘플에서 초기 산소 함량의 약 10% 이하의, 재료를 가로지르는 산소 매스 이동으로 인한 산소 농도에서의 변화를 허용한다. 다른 하나의 실시 예에 있어서, 그 재료는 고압 처리 지속 동안에 샘플에서 초기 산소 함량의 약 5% 이하의, 재료를 가로지르는 산소 매스 이동으로 인한 산소 농도에서의 변화를 허용한다. 또 다른 실시 예에 있어서, 그 재료는 고압 처리 지속 동안에 샘플에서 초기 산소 함량의 약 2.5% 이하의, 재료를 가로지르는 산소 매스 이동으로 인한 산소 농도에서의 변화를 허용한다. 또 다른 실시 예에 있어서, 그 재료는 고압 처리 지속 동안에 샘플에서 초기 산소 함량의 약 1% 이하의, 재료를 가로지르는 산소 매스 이동으로 인한 산소 농도에서의 변화를 허용한다. 전술한 일 실시 예에 있어서, 고압 처리는 약 6시간 동안, 약 12시간 동안, 약 18시간 동안, 약 24시간 동안, 약 30시간 동안, 약 36시간 동안, 약 42시간 동안, 또는 약 48시간 동안 지속될 수 있다.

또 다른 실시 예에 있어서 본 발명은, 고압하에서 용액 조건들을 변경하는 방법을 제공하는데, 그 방법은, 제 1 컨테이너 용액에 적어도 하나의 조성물을 제공하는 단계와, 적어도 하나의 추가적인 컨테이너의 용액 조건들을 변경하기 위한 적어도 하나의 반응제를 제공하는 단계와(이 경우에, 적어도 하나의 추가적인 컨테이너의 내용물은 제 1 컨테이너의 내용물과 접촉하지 않음), 컨테이너들을 고압하에 위치시키는 단계와, 그리고 적어도 하나의 추가적 컨테이너 내용물을 제 1 컨테이너 내용물과 접촉하도록 하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시 예에 있어서, 제 1및 적어도 하나의 추가적인 컨테이너들의 내용물들은 대류에 의해서 혼합된다. 또 다른 실시 예에 있어서, 제 1 및 적어도 하나의 추가적 컨테이너들의 내용물들은 교반에 의해 혼합된다. 또 다른 실시 예에 있어서, 제 1 및 적어도 하나의 추가적 컨테이너들의 내용물들은 확산에 의해 혼합된다. 또 다른 실시 예에 있어서, 제 1 및 적어도 하나의 추가적 컨테이너들의 내용물들은 스태틱 믹서와 같은 믹서에 통과시키는 것에 의해서 혼합된다. 또 다른 실시 예에 있어서, 제 1 및 적어도 하나의 추가적인 컨테이너들의 내용물들은 수용 컨테이너로 이동하는데, 그곳에서 수용 컨테이너는 이동 전에 비거나, 또는 이동 전에 액체 또는 고체 조성물을 함유할 수 있고, 제 1 및 적어도 하나의 추가적 컨테이너들의 내용물들은 수용 컨테이너로의 이동과정 동안에 또는 그 후에 혼합될 수 있다. 또 다른 실시 예에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 컨테이너는 상기 제 1 컨테이너 내부에 포함될 수 있다. 또 다른 실시 예에 있어서, 상기 적어도 하나의 추가적인 컨테이너는 제 1 컨테이너와 같이 유동 통로에 있다.

일 실시 예에 있어서, 본 발명은 고압하에서 용액 조건들을 변경하는 방법을 제공하는데, 그 방법은, 제 1 컨테이너 용액에 적어도 하나의 조성물을 제공하는 단계와, 적어도 하나의 추가적인 컨테이너의 용액 조건들을 변경하기 위한 적어도 하나의 반응제를 제공하는 단계와(이 경우에, 적어도 하나의 추가적 컨테이너의 내용물은 제 1 컨테이너의 내용물과 접촉하지 않음), 컨테이너들을 고압하에 위치시키는 단계와, 그리고 적어도 하나의 추가적 컨테이너 내용물이 제 1 컨테이너 내용물과 일정시간 동안 접촉하도록 하는 단계를 포함한다. 일 실시 예에 있어서, 적어도 하나의 추가적 컨테이너 내용물은 제 1 컨테이너 내용물과 연속적인 방법으로 접촉하도록 하는데, 그것에 의해 제 1 컨테이너 내용물의 용액 조건들은 시간이 지 남에 따라서 연속적으로 변화된다. 또 다른 실시 예에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 컨테이너 내용물은 제 1 컨테이너 내용물과 단계적(비연속적)방법(즉, 용액의 일부를 혼합하고, 대기하고, 용액의 추가적인 부분을 혼합함으로써)으로 접촉하도록 하는데, 이것에 의해 제 1 컨테이너 내용물의 용액 조건들은 시간이 지남에 따라서 단계적으로 변화된다. 용액 조건들의 이 단계적 변화에 대한 일 실시 예에 있어서, 제 1 컨테이너의 내용물 pH는 약 9-11, 또는 약 9.5-10.5, 또는 약 10이다. 용액 조건들의 단계적 변화에 대한 일 실시 예에 있어서, 제 1 컨테이너의 내용물 pH는 약 9-11, 또는 약 9.5-10.5, 또는 약 10이고, 약 7-8.9, 또는 약 7.5-8.5, 또는 약 8.5, 또는 약 8로 낮아진다. 단계적 방법의 다른 실시 예에 있어서, pH는, 매 24 시간마다 약 0.01-2pH 단위, 또는 매 24 시간마다 약 0.1-1pH 단위, 매 24 시간마다 약 0.1-0.5pH 단위, 매 24 시간마다 약 0.1-0.4pH 단위, 매 24 시간마다 약 0.1-0.3pH 단위, 또는 매 24 시간마다 약 0.2pH 단위 정도 낮아진다.

상기 방법의 일 실시 예에 있어서, 제 1 컨테이너 용액 속의 적어도 하나의 조성물은 단백질이다. 단백질은 변성 단백질 또는 집합 단백질과 같은 비-천연 상태일 수 있고, 집합 단백질은 용융성 집합체, 불용성 집합체 또는 포함 몸체 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

본 방법의 일 실시 예에 있어서, 용액 조건들을 변경하기 위한 적어도 하나의 반응제는 용액의 pH를 변화시키기 위한 반응제이다. 다른 실시 예에 있어서, 용액 조건들을 변경하기 위한 적어도 하나의 반응제는 용액의 염 농도를 변화시키기 위한 반응제이다. 또 다른 실시 예에 있어서, 용액 조건들을 변경하기 위한 적 어도 하나의 반응제는 환원제 농도, 산화제 농도 또는 용액의 환원제 농도 및 산화제 농도 양자를 변화시키기 위한 반응제이다. 또 다른 실시 예에 있어서, 용액 조건들을 변경하기 위한 적어도 하나의 반응제는 유발제 농도를 변화시키기 위한 반응제이다. 또 다른 실시 예에 있어서, 용액 조건들을 변경하기 위한 적어도 하나의 반응제는 용액의 아르기닌 농도를 변화시키기 위한 반응제이다. 또 다른 실시 예에 있어서, 용액 조건들을 변경하기 위한 적어도 하나의 반응제는 용액의 계면 활성제 농도를 변화시키기 위한 반응제이다. 또 다른 실시 예에 있어서, 용액 조건들을 변경하기 위한 적어도 하나의 반응제는 용액을 양호하게 배제시키는 화합물 농도를 변화시키기 위한 반응제이다. 또 다른 실시 예에 있어서, 용액 조건들을 변경하기 위한 적어도 하나의 반응제는 리간드 농도를 변화시키기 위한 반응제이다. 또 다른 실시 예에 있어서, 용액 조건들을 변경하기 위한 적어도 하나의 반응제는 액체 샘플에 원시적으로 존재하는 어떤 화합물 농도를 변화시키기 위한 반응제이다. 또 다른 실시 예에 있어서, 용액 조건들을 변경하기 위한 적어도 하나의 반응제는 용액에 첨가되는 추가적인 반응물 또는 반응제의 첨가제 농도를 변화시키기 위한 반응제이다.

다른 실시 예에 있어서, 컨테이너들은 적어도 약 250bar 압력에 놓인다. 또 다른 실시 예에 있어서, 컨테이너들은 적어도 약 400bar 압력에 놓인다. 또 다른 실시 예에 있어서, 컨테이너들은 적어도 약 500bar 압력에 놓인다. 또 다른 실시 예에 있어서, 컨테이너들은 적어도 약 1000bar 압력에 놓인다. 또 다른 실시 예에 있어서, 컨테이너들은 적어도 약 2000bar 압력에 놓인다. 또 다른 실시 예에 있어 서, 컨테이너들은 적어도 약 2500bar 압력에 놓인다. 또 다른 실시 예에 있어서,컨테이너들은 적어도 약 3000bar 압력에 놓인다. 또 다른 실시 예에 있어서, 컨테이너들은 적어도 약 4000bar 압력에 놓인다. 또 다른 실시 예에 있어서, 컨테이너들은 적어도 약 5000bar 압력에 놓인다. 또 다른 실시 예에 있어서, 컨테이너들은 적어도 약 6000bar 압력에 놓인다. 또 다른 실시 예에 있어서, 컨테이너들은 적어도 약 7000bar 압력에 놓인다. 또 다른 실시 예에 있어서, 컨테이너들은 적어도 약 8000bar 압력에 놓인다. 또 다른 실시 예에 있어서, 컨테이너들은 적어도 약 9000bar 압력에 놓인다. 또 다른 실시 예에 있어서, 컨테이너들은 적어도 약 10,000bar 압력에 놓인다.

도 1은 멀티-웰 플레이트 구조에 대한 본 발명의 일 실시 예의 평면도이다.

도 2A는 멀티-웰 플레이트 구조에 대한 하나의 가능한 실시 예의 측면도로서, 모든 공기의 통기를 보장하도록 웰들의 정부들이 부분적으로 "돔(dome)"의 형태로 덮힌 것을 나타낸 도면이다.

도 2B는 도 2A의 웰들을 덮는 "돔"의 측면도이다.

도 3은 도 2A 및 도 2B의 "돔" 입구를 밀봉하기 위해 사용될 수 있는 밀봉 매트 및 클램프 조립체를 구비한 96-웰 플레이트의 예를 나타낸 도면이다.

도 4는 본 발명의 다른 실시 예를 나타낸 도면으로서, 열 밀봉된 격막(septum)이 본 발명의 멀티-웰 실시 예의 웰들을 밀봉하는데 사용된 것을 나타낸 도면이다.

도 5는 본 발명의 다른 실시 예를 나타낸 도면으로서, 일정 로딩 부피 컨테이너를 도시한 도면이다.

도 6은 본 발명의 다른 실시 예를 나타낸 도면으로서, 가변 로딩 부피 컨테이너를 도시한 도면이다.

도 7A는 가변 로딩 부피 컨테이너에서 사용하기 위한 원-웨이 밸브 조립체의 단면도이다. 도 7B는 원-웨이 밸브 조립체가 가변 로딩 부피 컨테이너에 설치된 상태를 나타낸 도면이다.

도 8은 고압에서 용액을 혼합하는데 유용한 본 발명의 한 실시 예를 도시한 도면이다. 도 8A는 제 2 컨테이너가 폐쇄 위치에 있는 상태를 나타낸 도면이다. 도 8B는 제 2 컨테이너가 개방 위치에 있는 상태를 나타낸 도면이다.

도 9는 고압에서 용액을 혼합하는데 유용한 본 발명의 다른 실시 예를 도시한 도면이다.

도 10은 고압에서 실질적으로 산소가 투과할 수 없는 재료를 통한 산소 이동을 보여 주는 실험 결과를 나타낸 도면이다. 산소 이동에서의 저장 및 가압 조건의 효과와 GSH 농도가 도시되었는데, 용액 조건들은 pH 8.0, 4 mM GSH, 2 mM GSSG, 500 ml 용액을 25℃에서 17 시간 동안 실험하였다.

도 11은 주위 산소 농도함수로서 다양한 중합체((맨위 곡선, 저밀도 폴리에틸렌(low density polyethylene; LDPE); 위에서 두 번째 곡선, 고밀도 폴리에틸렌(high density polyethylene; HDPE); 위에서 세 번째 그리고 아래에서 두 번째 곡선, 폴리스티렌(Polystyrene; PS); 그리고 맨 아래 곡선, 폴리에틸렌-테레프탈레 이트(polyethylene-terephthalate; PET))로 제조된 시린지 벽을 통과하는 산소의 계산된 이동을 나타낸 것이다. 1/16인치 두께와 1.5인치 길이와 0.25인치 외경의 시린지 벽에 대해 24 시간 동안의 이동을 가정하여 중합체형의 함수로서 산소 이동이 계산되었다.

도 12는 샘플에서의 버블 크기 함수로서 기포를 함유하는 샘플에 로딩된 산소 량을 나타낸 도면으로서, 여기에서 버블 크기는 샘플의 부피퍼센트로서 계산된 그래프이다. 이 곡선은 이 계산에 있어서 적절한 근사식인 PV=nRT를 가정하였다.

도 13은 용액 교환장치의 개략도이다.

도 14는 도 13의 용액 교환장치의 단면도이다.

도 15는 용액 혼합 전의 도 13 및 도 14에 도시된 용액 교환장치의 압력챔버을 나타낸 도면이다.

도 16은 용액 혼합 후의 도 13 및 도 14에 도시된 용액 교환장치의 압력챔버을 나타낸 도면이다.

도 17은 도 13 및 도 14에 도시된 용액 교환장치의 예비-혼합 컨테이너 중 하나를 나타낸 도면이다.

도 18은 도 13 및 도 14에 도시된 용액 교환장치의 수용컨테이너를 나타낸 도면이다.

도 19는 본 발명의 가변 로딩 부피 실시 예들 중의 하나에서 유용한 체크밸브 어댑터를 나타낸 도면이다.

도 20은 도 19에 도시된 체크밸브 어댑터와 같은 본 발명의 다양한 실시 예 들에 유용한 체크밸브를 나타낸 도면이다. 화살표는 허용된 유량의 방향을 보여준다.

도 20A는 도 19의 체크밸브 어댑터에 장착된 도 20의 체크밸브를 나타낸 도면이다.

도 21은 본 발명의 가변 로딩 부피 실시 예를 나타내는데, 체크밸브 어댑터(도 20A에 도시된 바와 같이, 체크밸브가 장착됨)가 그곳에 액체를 함유하도록 장치에 삽입되어 있다.

도 22는 압력하에서 쿠마시블루(Coomassie Blue) 용액 교환을 수행하는 실험을 나타낸 도면이다. 개방된 사각형은 실제 샘플(실선에 놓인 상부 우측 사각형은 초기 조건에 대응하고, 에러 바(error bars)를 갖는 하부 좌측 사각형은 용액 교환 후의 조건에 대응함)을 나타낸다. 실선은 다이(dye)의 공지된 농도로부터의 조정 라인을 나타낸다.

도 23은 용액 조건들의 함수로서 회수된 리소자임(lysozyme)의 백분율을 나타내고 있다. 좌측에서 우측으로, 1M GdnHCl 압력 처리 집합체에 대해 용액 교환 없음; 0.5M GdnHCl 압력 처리 집합체에 대해 용액 교환 없음; 집합체 용액은 압력하에서 1 내지 0.5M GdnHCl로 교환됨; 1M GdnHCl 대기압 조절 집합체에서 용액 교환 없음; 0.5M GdnHCl 대기압 집합체에서 용액 교환 없음; 그리고 대기압하에서 1 to 0.5M GdnHCl로 집합체 용액이 교환됨을 각각 나타낸다. 모든 샘플들은 pH 8.0의 25℃에서 50 mM Tris-HCl, 5mM GSSG, 2mM DTT 의 리폴딩 버퍼에 위치되었다.

"고압"은 적어도 약 250bar의 압력을 의미한다. 본 발명의 장치가 사용되는 압력은 적어도 약 250bar의 압력, 적어도 약 400bar의 압력, 적어도 약 500bar의 압력, 적어도 약 1kbar의 압력, 적어도 약 2kbar의 압력, 적어도 약 3kbar의 압력, 적어도 약 5kbar의 압력, 적어도 약 6kbar의 압력, 적어도 약 7kbar의 압력, 적어도 약 8kbar의 압력, 적어도 약 9kbar의 압력, 그리고 적어도 약10kbar의 압력일 수 있다.

"폐쇄 시스템"은, 물질(matter)이 시스템과 그 주위 사이에서 이동될 수 없으나 기계적 또는 열적 에너지의 이동은 폐쇄 시스템과 그 주위 사이에 발생할 수 있는 표준 화학 열역학 용어를 의미한다. 이와 대조적으로, "개방 시스템"은 시스템과 그 주위 사이에 물질 및/또는 기계적 및/또는 열 에너지의 이동을 허용한다. "고립 시스템(isolated system)"은 그것의 주위와 기계적 또는 열적 접촉을 허용하지 않는, 즉 기계적 또는 열적 에너지의 어떤 이동도 고립 시스템에 대해서 또는 그로부터 일어나지 않는 폐쇄 시스템이다. "실질적인 폐쇄 시스템"은, 샘플 매스(mass)의 약 1% 미만, 더욱 양호하게는 약 0.5% 미만, 더욱 양호하게는 약 0.2%미만, 더욱 양호하게는 약 0.1%미만, 더욱 양호하게는 약 0.05%미만, 그리고 더욱 양호하게는 약 0.01%미만이 시스템과 그 주위 사이에 이동될 수 있는 시스템이다.

"액체 샘플의 상당한 이동(significant transfer)"은 샘플에 함유된 액체 부피의 약 1% 이상(표준 대기압에서 측정됨)의 이동을 의미한다. 본 발명의 장치가 액체 샘플의 상당한 이동을 방지하기 위해서 설계된 경우에, 본 장치 사용 동안 이동된 샘플의 양은 샘플의 가압하지 않은 부피의 약 1% 미만, 더욱 양호하게는 약 0.5% 미만, 더욱 양호하게는 약 0.2%미만, 더욱 양호하게는 약 0.1%미만, 더욱 양호하게는 약 0.05%미만, 그리고 더욱 양호하게는 약 0.01%미만이다.

"고압에서 산소에 대한 실질적인 불투과성", "고압에서 실질적인 산소-불투과성", 또는 "고압에서 산소 매스 이동에 대한 불투과성"은, 고압 처리 지속 동안에 샘플에서 약 0.3mM 이하의 재료를 가로지르는 산소 매스 이동으로 인한 산소 농도에서의 변화를 허용하는 재료를 의미한다. 다른 실시 예에 있어서, 그 재료는, 고압 처리 지속 동안에 샘플에서, 약 0.2mM 이하, 양호하게는 약 0.1mM 이하, 양호하게는 0.05mM 이하, 더욱 양호하게는 0.025mM 이하, 더욱 양호하게는 약 0.01mM 이하의 재료를 가로지르는 산소 매스 이동으로 인한 산소 농도에서의 변화를 허용한다. 백분율 관점에서, 그 재료는, 고압 처리 지속 동안에 샘플의 초기 산소 함량의 약 10%이하, 양호하게는 약 5%이하, 더욱 양호하게는 약 2.5%이하, 더욱 양호하게는 약 1%이하의 재료를 가로지르는 산소 매스 이동으로 야기된 샘플에서의 산소 농도의 변화를 허용한다.

고압 장치용 재료

고압 장치 몸체는 다양한 재료로 제조될 수 있다. 하나의 장치가 압력 전달을 할 수 있는(즉, 도 6에 도시된 가변 로딩 부피 장치와 같은)적어도 하나의 이동면(moveable surface)을 갖지 않는 경우에, 장치가 제조되는 재료는 신축성이 있어 압력전달을 가능하게 해야 한다. 적절한 재료는 파손, 파괴 또는 고압 처리에서 어떤 고장 또는 일체성의 손실을 겪지 않아야 하는데, 그런 것들은 하나 이상의 샘플 구획으로부터 외부 환경으로 샘플의 유출을 허용하거나, 또는 컨테이너의 외부 환경에 존재하는 유체, 가스 또는 다른 재료가 하나 이상의 샘플 구획 안으로의 유출되는 것을 허용하거나, 샘플 구획들 사이에서 샘플들의 유출을 허용할 수 있다. 물론 그러한 유출은 하나 이상의 샘플 구획들과 외부 환경 사이의 의도된 전달들 또는 두 개 이상의 샘플 구획들 또는 다른 구획들 사이의 의도된 전달을 포함하는 것을 의미하지는 않는데, 그런 전달들은 기능공에 의해서 차분하게 이루어져야 한다.

고압 장치는 적어도 약 250bar 압력을 지탱할 수 있고 또는 일체성을 유지할 수 있는 재료로 구성된다. 다른 실시 예에 있어서, 그 재료는 적어도 약 500bar 압력을 지탱하고 일체성을 유지할 수 있어야 한다. 다른 실시 예에 있어서, 그 재료는 적어도 약 1kbar 압력을 지탱하고 일체성을 유지할 수 있어야 한다. 다른 실시 예에 있어서, 그 재료는 적어도 약 2kbar 압력을 지탱하고 일체성을 유지할 수 있어야 한다. 다른 실시 예에 있어서, 그 재료는 적어도 약 3kbar 압력을 지탱하고 일체성을 유지할 수 있어야 한다. 다른 실시 예에 있어서, 그 재료는 약 5kbar 까지, 양호하게는 약 10kbar까지의 압력을 지탱하고 일체성을 유지할 수 있어야 한다. 그 지정된 압력은 장치상의 다차원 압력이지 장치를 가로지르는 차압 또는 압력 강하가 아니다. 즉, 고압 장치로서 사용된 컨테이너 또는 컨테이너들이 그 지정된 압력까지 가압되는 압력챔버에 놓여지는데, 그 압력챔버는, 압력챔버 대 그 외부 대기압 내에서 5kbar 또는 10kbar까지의 차압 또는 압력 강하를 견딜 수 있어야 하고, 컨테이너의 그 재료는 그러한 극적인 차압을 겪지 않고 모든 방향에서 균일한 압력을 받는다.

사용된 재료는 또한 주위로부터 샘플 구획으로의 압력 전달을 허용해서 장치를 가로지르는 압력이 대략 동등해야 하는데, 즉 장치 내의 어떤 두 위치가 받는 압력 차이는 전체 압력의 약 1% 이하, 양호하게는 약 0.5%이하, 더욱 양호하게는 약 0.1%이하이다. 다른 실시 예에 있어서, 장치 내의 어떤 두 위치가 받는 압력의 절대적 차이는 약 5bar 미만, 양호하게는 약 2bar 미만, 더욱 양호하게는 약 1bar 미만이다. 외부에 인가된 압력과 장치의 어떤 내부 사이의 어떤 차이도, 전체 인가된 외부 압력의 약 5% 이하, 양호하게는 약 2% 이하, 더욱 양호하게는 약 1% 이하, 더욱 양호하게는 약 0.5% 이하, 더욱 양호하게는 약 0.1% 이하이다. 따라서, 재료는 압력 전달을 위해 신축성이 있어야 한다.

하나의 실시 예에 있어서, 그 재료는 중합체이다. 다른 실시 예에 있어서, 그 중합체 재료는 저렴한 대량 생산을 위해 사출 성형될 수 있다. 적절한 중합체 재료는 폴리에틸렌테레프탈레이트, 고밀도 폴리에틸렌, 폴리스티렌 및 폴리스티렌-부타디엔 블록 공중합체를 포함한다. 반드시 산소 불투과성일 필요는 없지만 고압 처리에 견딜 수 있는 다른 중합체 재료는 저밀도 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 및 폴리카본에이트를 포함한다.

샘플의 산소 함량의 고려

시스테인-함유 단백질들의 리폴딩과 같은 많은 반응들은 샘플의 산소 함량에 영향을 받을 수 있다. 일반적으로, 단백질 리폴딩 실험은 티올(thiols)(즉, 환원형, 산화형 또는 이황화 셔플링(disulfide shuffling)을 위한 환원형 및 산화형의 혼합물 형태의 글루타치온(glutathione) 시스타민(cystamine), 시스틴(cystine),디티오쓰레이톨(dithiothreitol), 디씨오에리쓰리톨(dithioerythritol))과 같은 산화환원 반응제의 지정된 농도의 사용을 수반한다. 샘플에서의 산소 농도는 샘플에서 기포의 존재에 의해 영향을 받을 수 있는데, 기포가 고압에서 용액 안으로 가압되고 그 샘플에서 O₂ 농도를 변화시킬 수 있기 때문이다. 샘플에서의 산소 농도는 또한 장치 벽들을 가로지르는 산소 확산에 의해 영향을 받을 수 있다. 샘플 장치는 일반적으로 압력이 인가되는 챔버에 놓여질 것이고, 그 챔버에 사용된 유체가 물인 경우에, 샘플 장치를 감싸는 챔버의 물에 용해된 산소가 장치 벽들을 가로질러서 확산될 수 있다.

이들 고려들은 다음의 "기포로 야기된 산소 농도 변화" 및 "고압에서의 산소 투과성" 란에서 언급된다.

기포로 야기된 산소 농도 변화

산소 농도에서의 변동의 약 80%가 샘플에서의 기포에서 일어나는 반면에, 그 변동의 약 20%가 시린지형 장치(그 장치가 고압에서 산소 전달에 실제적으로 불투과성이 아닌 경우)의 벽을 가로지르는 산소 확산에서 일어난다. 이것은 샘플 바이알(sample vial)에서 가능한 한 많은 기포 제거의 중요성을 예고한다. 1ml 샘플에서 각 25㎕ 에어에 대해서, 0.2mmole O₂가 로딩되고, 고압이 에어를 액체 샘플 안으로 용해시키면서, 산소의 양이 0.8mM 환원 티올과 반응할 것이다. 약 1mM 내지 약 10mM의 전형적인 환원 티올 농도 범위(Clark E.D., "산업적 공정에 대한 단백질 리폴딩(Protein refolding for industrial processes)" Curr. Opin. Biotechnol. 12:202-207 (2001))와, 이 범위를 넘어 환원 티올 농도에서 0.8mM 변화는 약 8% 내지 약 80%의 농도에서의 변화를 가져올 것이다. 4mM 환원 티올의 전형적인 농도에서, 환원 티올의 0.8mM 환원은 환원된 티올의 용액 농도에서 약 20% 변화를 가져온다. 이것은 모든 기포 제거의 중요성을 예고하는데, 종래의 샘플 바이알의 현재 상태로는 달성이 어렵고, 본 발명이 이점을 부각하기 위해 설계되었다.

도 12는 다양한 크기의 기포로 야기된 산소 로딩을 도시하고 있다. 기포의 부피 퍼센트는 샘플 부피의 약 10% 이하, 더욱 양호하게는 샘플 부피의 5% 이하, 더욱 양호하게는 샘플 부피의 약 2.5% 이하, 더욱 양호하게는 샘플 부피의 1% 이하까지 가능하면 낮게 유지되어야 한다.

고압에서의 산소 투과성

고압 장치에 사용된 재료는 고압에서 산소 매스 전달에 실제적으로 불투과성이다. 산소 전달이 연구되는 또는 장치를 사용하여 처리되는 샘플에 영향을 줄 수 있는 경우에, 산소에 실제적으로 불투과성인 재료가 사용되어야 한다. 선택적으로, 사용된 그 재료는 또한 고압에서 이산화 탄소와 같은 다른 가스들의 전달에 실제적으로 불투과성이고, 그것은 연구되는 또는 장치를 사용하여 처리되는 샘플에 영향을 줄 수 있다. 고압에서 산소 매스 전달에 실제적으로 불투과성인 재료들은, 하기의 예로서 제한되지는 않지만, 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET 또는 PETE), Mylar®(Mylar는 DuPont의 등록 상표인데, 양축방향으로 배향된 폴리에틸렌 테레프탈레이트 폴리에스터 필름을 가리킨다), 고밀도 폴리에틸렌 및 폴리스티렌을 포함한다. 이와는 달리, 용기 벽이 충분히 두껍게 만들어진 경우에는, 산소에 덜 투과적인 재료가 사용될 수 있다. 마지막으로, 하기의 예로서 제한되지는 않지만, Styrolux®(예를 들면, Styrolux® 684D)과 같은 폴리스티렌-부타디엔 블록 공중합체를 포함하는 산소에 더 투과적인 재료가, 산소에 대한 투과성을 감소시키도록 다른 중합체들 또는 다른 재료들의 적절한 코팅으로 사용될 수 있다(Styrolux®은 스티렌 수지에 대한 BASF Aktiengesellschaft Corp., Ludwigshafen, Germany 소재, 그리고 Westlake Plastics Company, Lenni, Pennsylvania 소재의 등록 상표이다.).

산소가 연구되거나 장치를 사용하여 처리되는 샘플에 영향을 미치는 경우에, 실험적 증거는 고압에서의 산소 불투과성 재료 사용에 대한 유용성을 확인하고 있다. O₂ 약 0.35mM 까지가 전형적인 압력 실험 동안에 전달될 수 있는데, 이것은 용액의 산화환원 환경을 상당히 변경하는데 충분하다. 도 10은 고압 처리에 현재 사용된 통상적인 시린지를 구비한 실험 돔(dome)을 도시하고 있다. 사용된 그 시린지들은 Becton Dickinson사의 1ml 저밀도 폴리에틸렌 시린지들이었다. pH 8.0의 4mM GSH(환원된 글루타치온) 및 2mM GSSG(산화된 글루타치온)의 500ml의 수용성 용액이 17시간 동안 2150bar에 유지되었다. 도 10에 도시된 바와 같이, 충분한 산소가 4.0mM로부터 3.5mM 정도까지 환원된 글루타치온의 농도를 낮추도록 이동되었다.

도 11은 고압에서 사용된 시린지 벽들을 가로지르는 산소 이동 량에 대한 계산을 도시하고 있다. 그 계산은 1/16인치 두께, 1.5인치 길이 및 0.25인치 외경의 시린지에 대한 것이다. 그 계산은 가변적인 주위 산소 농도에서 2000bar 압력으로 24시간을 가정하였고, 주위 유체에서 기대된 산소 농도는 약 0.3mM(주위 부피의 약 10%가 압축 전에 기포로 이루어지는 것을 가정함)일 가능성이 있고, 이것은 도 11에서 수직 점선으로 표시되었다. 버블에서의 산소는, 표준 온도 압력에서 버블의 공기 량을 계산하는 이상기체 법칙을 단순히 이용하여 계산되고, 보다 높은 압력에서, 에어는 용액에 용해될 것이다. 계산은 정상상태에서 확산에 대한 픽스 법칙(Fick's law)을 이용하여 수행되었고, 중합체에서 O₂의 용해도가 고압에서 극적으로 증가되므로 확산 계수가 투과 계수 대신에 사용되었다. 확산 계수는 Polymer Handbook, 4^th Edition; editors, J. Brandup, E.H. Immergut, 및 E. A. Grulke; associate editors, A. Abe, D. R. Bloch; New York : Wiley, 1999 로부터 이용하였다.

이런 가정들을 통해서, 계산들은, 주위 액체의 산소 농도의 가능한 값에서, O₂의 약 0.2mM이 LDPE로 이루어진 튜브에 이동되고 LDPE로 이루어진 경우 O₂의 0.6mM의 이동이 있음을 보여주고 있다. 폴리프로필렌 장치를 가로지르는 산소 이동은 계산되지 않았으나, 상대적인 투과도 값에 근거하면, HDPE 및 LDPE에 대한 값들 사이에 있을 것으로 믿어진다. 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET 또는 PETE)는 가정된 조건에서 산소의 거의 어떤 이동도 갖지 않았다고 계산된다. 따라서, 이 계산은 재료들이 슬기롭게 선택되어 장치의 중합체 벽들을 통과하는 산소 이동을 상당히 감소 또는 예방할 수 있음을 보여주고 있다.

장치 실시 예: 멀티-웰 플레이트

일 실시 예에 있어서, 고압 장치는 몸체 또는 플레이트("멀티-웰 플레이트")에 다수 웰(well)을 포함한다. 그러한 실시 예의 한 예가 도 1에 도시되었다. 도시된 실시 예는 96-웰 플레이트인데, 고압에서 산소 매스 이동에 실제적으로 불투과성을 나타내는 재료로 제조된 몸체(1)는 액체 샘플을 보유하기 위한 96 웰(2)을 갖는다. 그 재료는 (반드시 그런 것은 아니지만) 플레이트가 사출 성형될 수 있도록 선택되는 것이 바람직하다.

멀티-웰 플레이트 실시 예의 몸체용으로 적절한 재료가 한 번 선택되면, 샘플들은 샘플 구획 내로 도입되어야 한다. 샘플 웰들에 에어 포켓의 포함은 바람직하지 못한데, 에어의 산소가 고압에서 용액 안으로 몰리고, 샘플의 산화환원 환경을 변경시키며, 그리고 에어 포켓의 존재는 또한 재료상에 과도한 응력을 야기시킬 수 있다. 따라서 웰들은 가능하면 상당한 정도로 웰에 남겨진 잔류 에어를 제거하도록 설계된다.

도 2A는 웰 구성(1)의 가능한 하나의 실시 예에 대한 측면도이다. 월들(3)은 "돔(4)"에서 부분적으로 커버되어 모든 공기의 통기를 보장한다. 그 돔(4)은 도 2b에 매우 상세하게 도시되었다. 영역(6)은 샘플 로딩을 위한 입구이고, 돔을 형성하는 솔리드(solid) 재료(5)로 감싸진다. 입구(6)는 충분히 커서 반응제 공급 및 통기를 위한 적절한 크기의 피펫 팁(pipette tip)의 삽입을 가능하게 해야 한다. 이 돔 구조는 밀봉 전에 웰에서 모든 에어를 통기시키도록 넘칠만큼 가득 채우는 것을 가능하게 한다. 또한, 넘칠만큼 가득 채우는 동안에, 여분의 샘플이 돔의 측부 아래로 빠질 것이고, 샘플들 사이의 교차-오염을 방지할 것이다. 돔(4)은 적절한 밀봉표면을 제공하도록 입구를 근접하여 감싸는 정부 영역(4A) 상에 거의 편평한 표면을 갖는다. 그 치수들은, 표준-크기 피펫 팁으로 샘플 로딩이 가능하도록, 샘플 통기가 가능하도록, 크로스-오염을 방지하기 위해 돔 기부에 충분한 홈통(trough)을 갖도록, 그리고 적절한 밀봉 표면을 제공하기 위해 이미 언급한 편평한 정부(top)를 제공하도록 결정된다.

멀티-웰 장치의 일 실시 예에 있어서, 매트가 웰들을 밀봉하도록 멀티-웰 플레이트의 정부에 놓여진다. 그러한 매트에 적절한 재료는, 이것으로서 제한되지는 않지만, 실리콘 고무를 포함한다. 일 실시 예에 있어서, 그 매트는 약 1/8인치 두께와, 매트가 사용되는 멀티-웰 플레이트의 것과 동일한 길이 및 폭을 갖는다. 그 매트는 충분히 신축적인 재료로 제조되어 돔 정부에서 양호한 밀봉이 가능하고 샘플 내에서의 압력-유도 체적 변화로 인한 변형을 허용할 수 있어야 한다. 이 실시 예에 있어서, 밀봉 표면을 가로지르는 차압(differential pressure)이 없기 때문에, 즉 웰 내부 샘플이 받는 압력이 매트가 받는 압력과 실제적으로 비슷하므로, 그 밀봉 매트는 대기압에서 기대되는 것 외에 어떤 추가적인 밀봉 능력을 제공할 필요가 없다. 만일, 사용된 밀봉 재료가 고압에서 산소에 실제적인 불투과성이 아닌 경우에, 고압에서 산소에 실제적인 불투과성인 필름이 산소 이동을 막기 위해 밀봉 매트상에 놓여질 수 있다. 그 필름은, 이것으로서 제한되지 않지만, Mylar®을 포함하는 재료로 제조될 수 있다. 밀봉 매트를 사용하는 멀티-웰 장치에 대한 이 실시 예에 있어서, 밀봉 매트에 힘을 가하고 웰의 밀봉을 가능하게 하도록 플레이트상에 클램프(clamp)가 고정된다. 그 클램프는 장치를 가로지르는 균일한 힘을 제공하고, 적절한 밀봉을 보장하도록 충분한 힘을 제공해야 한다. 그 클램프는 또한 가압 사이클에 걸쳐서 일정한 힘을 제공해야하는데, 그것은 고압에서 재료(특히 밀봉 매트)의 수축으로 인한 일정한 인장 클램프(일정한 힘 클램프가 아님)를 필요로 한다. 도 3은 밀봉 매트(3-1) 및 클램프 조립체(3-2)를 구비한 96-웰 플레이트 실시 예를 도시하고 있다.

도 4에 도시된 멀티-웰 플레이트의 다른 실시 예에 있어서, 플레이트 웰들은 돔에 의해 커버되지 않고, 대신에 웰들을 샘플로 로딩하기 전에 열-밀봉된 격벽들(septa)(4-2)로 커버된다. 그러한 격벽들은 의료용 바이알을 밀봉하는 경우에 통상적으로 사용된다. 열-밀봉된 격벽은 밀봉된 웰을 보장하고 샘플 오염을 방지한다. 샘플들이, 피펫 대신에 니들을 구비한 멀티-채널 피펫터(multi-channel pipetter)로 사출에 의해 이 실시 예의 멀티-웰 플레이트 내에 로딩된다. 니들들은 샘플 웰들을 충전시키기 위해 격벽을 침투한다. 제 2 니들이 또한 에어를 통기하고 웰을 완전히 충전시키기 위해 충전과 동시에 샘플을 천공한다. 멀티-채널 피펫터들은 용액을 멀티-웰 플레이트 내로 피펫팅하도록 설계된 상업적으로 이용가능한 것이고, 그러한 피펫터는 피펫 팁 대신에 샘플 로딩용 니들을 사용할 수 있도록 용이하게 구성될 수 있다. 샘플 로딩 후에, 격벽이 제 2 점착성 중합체 멤브레인(4-1)으로 커버된다. 그 멤브레인은 샘플 로딩 동안에 발생한 천공된 홀을 밀봉한다. 선택적으로, 그 멤브레인은 또한 격벽을 가로지르는 산소 확산을 방지할 수 있는데, 즉 그 멤브레인은 산소에 실제적으로 불투과성일 수 있다. 부착성 중합체 멤브레인용의 잠재적 재료는, 이것으로서 제한되지 않지만, Mylar®을 포함한다.

장치 실시 예: 일정 로딩 부피 장치

다른 실시 예에 있어서, 고압 장치는 컨테이너 부피가 표준 압력에서 고정되는 컨테이너를 포함하는데, 이 실시 예를 일정 로딩 부피 장치로 지칭한다. 전체 컨테이너는 고압에의 노출에 따라서 비례적으로 축소되는데, 일반적으로 그 컨테이너는 2kbar에서 그 부피의 약 5%-10%, 그리고 4kbar에서 그 부피의 약 20%(추정됨) 축소되는데, 이 장치를 제조하기 위해 신축성 재료가 사용되어야 한다. 그러한 실시 예의 한 예가 도 5에 도시되었다. 이 장치는 원추형 저부를 갖는 원통형 배럴(cylindrical barrel)로 구성된다. 그 컨테이너는 매우 다양한 내부 부피를 갖도록 제조될 수 있는데, 250㎕, 500㎕, 750㎕ 또는 1000㎕를 갖는 컨테이너들의 치수 예가 표 1에 지정되었다. 컨테이너의 내부는 예를 들면 50㎕ 증가로 점차로 변화될 수 있다. 원통형 배럴 정부는 밀봉을 위해 스크류 캡(screw cap)(도 5의 원추형 저부로서 모양이 이루어지거나 또는 원통형일 수 있다)으로 나사식(threaded)일 수 있다. 그 나사식 스크류 캡은 내부 및 외부 사이의 적어도 약 5psig의 차압(5psig는 전체 압력이 아닌 차압인데, 이 크기의 차압은 탄산 음료를 포함하는 상업적인 병의 차압과 비슷하다)이 존재하는 경우에 밀봉을 유지할 수 있어야 한다. 일정 로딩 부피 장치의 일반적인 크기의 실시 예들이 표 1(일정 로딩 부피 장치의 이들 특수한 실시 예들의 벽 두께는 1/6인치이다)에 주어진다.

장치 실시 예: 가변 로딩 부피 장치

다른 실시 예에 있어서, 고압 장치는 가변 로딩 부피의 컨테이너를 포함한다. 이 실시 예의 한 예가 도 6에 도시되었다. 이 실시 예에서, 시린지와 비슷한 방법으로 가동 플러그(6-2)와 제거 가능한 캡(6-3)을 구비한 실린더(6-1)가 구비된다. 일 실시 예에 있어서, 그 실린더가 수직으로 배향되는 경우에, 플러그는 샘플 구획의 저부를 형성하고, 샘플 구획과 외부 환경 사이의 밀봉으로서 작용한다. 그 플러그는 부착 플런저 로드(attached plunger rod) 또는 별도 플런저 로드(6-4)를 가질 수 있는데, 그것들은 플러그를 실린더 충전 전에 원하는 부피까지 이동시키는데 사용될 수 있다. 그 실린더는 플러그의 위치를 원하는 부피까지 안내하도록 예를 들면 50㎕ 증가로 점차 변화될 수 있다. 샘플은 장치 내부 공간(6-5)에 포함된다. 실린더는 이어서 가능한 한 많은 잔류 에어를 제거하도록 주위 깊게 원하는 샘플로 충전된다. 탈착 가능한 캡이 이어서 실린더 정부에 놓여진다. 다른 실시 예에 있어서, 그 실린더는 반대 방향으로 충전될 수 있는데, 즉 실린더가 캡이 실린더 저부상에 놓여지도록 배향될 수 있고, 플러그가 실린더 정부안으로 삽입된다. 일 실시 예에 있어서, 탈착 가능한 캡은 나사식이고, 실린더 정부상에 단순히 나사결합될 수 있다. 그 나사식의 탈착가능한 캡은 내부 및 외부 사이의 적어도 약 5psig의 차압은 전체 압력이 아닌 차압인데, 이 크기의 차압은 탄산 음료를 포함하는 상업적인 병의 차압과 비슷하다)이 존재하는 경우에 밀봉을 유지할 수 있어야 한다. 샘플은 이어서 압력하에 처리될 수 있고, 압력 처리 후에 그 캡은 제거되어 실린더 내용물이 플러그를 플런저 로드로 밀어서 밖으로 쏟아지거나 또는 밀려나올 수 있다.

다른 실시 예에 있어서, 제거 가능한 캡이 실린더의 밀폐 단부상에서 부러질 수 있는 팁(breakable tip)으로 대체될 수 있다. 이 실시 예에 있어서, 액체 샘플이 실린더에 놓여지고, 플러그가 실린더 정부에 삽입된다. 그 부러질 수 있는 팁은 고압 처리 동안에 비접촉 상태를 유지한다. 처리 후에 그 부러질 수 있는 팁이 부러지고, 실린더 내용물이 쏟아지거나 혹은 가동 플러그를 플런저 로드로 미는 동작에 의해서 밖으로 밀려나온다. 상기 팁은 손으로 부러뜨릴 수 있도록 설계될 수 있거나, 또는 절삭 공구에 의해 파손되도록 설계될 수 있는데, 팁이 샘플을 축출하기 위해 절삭공구에 의해 제거되는 가변 로딩 부피 장치의 예인 도 21을 참조하라.

다른 실시 예에 있어서, 하나의 니들이, 샘플을 실린더 안으로 삽입시키기 위해 가동 플러그와 실린더 벽 사이에서 작동할 수 있다. 가동 플러그 상의 원-웨이 밸브는 샘플이 도입됨에 따라서 실린더의 에어를 추방할 수 있다(도 7A 및 도 7B와 아래의 원-웨이 밸브에 대한 설명을 참조).

가동 플러그가 인가된 압력에 반응하여 이동하는 경우에, 가변 로딩 부피 장치 제조에 사용된 재료는 본 발명의 다른 장치에 사용된 재료와 같이 신축적일 필요는 없다는 것을 이해하여야 한다.

도 7A 및 도 7B에서, 고압 적용에 특별하게 구성되고, 원-웨이 밸브 플러그로 작용하는 가동 플러그(7)가 도시되었다. 도 7A 및 도 7B에 도시된 실시 예는 플랩(flap) 플러그 또는 플랩 밸브인데, 그것이 액체의 원-웨이 유동을 허용하도록 하나의 플랩 상에 놓인다. 도 7A에서, 신축성 플랩(7-1)이 오(O)-링(7-2)으로 밀봉을 형성한다. 그 플랩(7-1)과 오(O)-링(7-2)은 외부 환경(7-6)을 가변 로딩 부피 장치 내부의 개구부(7-7)로 개방되는 내부 통로(7-4)로부터 밀봉한다. 영역(7-3)은 솔리드(solid)이다. 원-웨이 밸브 플러그가 도 7B에 도시된 가변 로딩 부피 장치의 중합체 배럴(6-1) 안으로 삽입되는 경우에, 그 플러그는 샘플이 원-웨이 밸브로부터 누설(bleed)될 때까지 아래로 가압될 수 있다. 이것은, 신축성 플랩(주형 플랩)이 도 7B에서 화살표로 표시된 통로를 경유하여 샘플이 방출되도록 구부러지는 경우에 일어난다. 샘플이 밸브로부터 누설될 때까지 아래로 가압하는 것은, 그 샘플로부터 가능한 한 많은 에어의 배제를 보장하고, 또한 장치에서 샘플 양의 조절을 가능하게 한다. 그 플랩이 단지 한 방향(오(O)-링에서 멀어지는)으로 구부러질 수 있기 때문에, 샘플 외부에 존재하는 공기 또는 다른 물질이 다시 샘플 안으로 유동할 수 없다.

고압 샘플 바이아로서의 사용에 적절한 다른 가변 로딩 부피 장치가 도 21에 도시되었는데, 그 장치는 중합체 샘플 배럴, 체크 밸브 어댑터, 체크 밸브 조립체 및 오(O)-링 밀봉재로 구성되었다. 도 19에서, 고압 적용에 특히 유용하고, 원-웨이 밸브 플러그로서 기능할 수 있는 가동 플러그(19-0)가 도시되었는데, 이 가동 플러그는 또한 체크 밸브 어댑터(즉, 체크 밸브가 가동 플러그(19-0)안으로 삽입될 수 있다)로서 기능한다. 상기 플러그는, 하기의 예로서 제한되지 않지만, Delrin®(Delrin®은 E. I. Du Pont de Nemours and Company, Wilmington, Delaware 사의 아세탈 수지에 대한 등록상표이다)을 포함하고, 사출 성형 또는 기계적 가공에 의해 제조될 수 있다. 액체 샘플과 접촉하는 플러그 영역은 만곡되는데(19-1)(플러그는 유체를 보유하는 컨테이너에 삽입될 때에 도 19에 도시된 방향으로부터 전도될 수 있다), 이 곡률은 가능한 한 많은 에어가 컨테이너로부터 가압되는 것을 보장한다. 압입부(indentation)(19-3)는 오(O)-링의 장착을 가능하게 하여 컨테이너 벽으로 가동 밀봉을 형성한다. 이 플러그는 그것의 내부 루멘(lumen)(19-4)에서 체크 밸브를 수용하도록 구성되는데, 그것은 체크 밸브를 어댑터 내로 수동으로 삽입시킴으로써 쉽게 장착이 가능하다. 밸브 플러그/체크 밸브 어댑터는 양호하게 볼-스프링 체크 밸브를 사용한다. 도 20은 상업적으로 이용가능한(The Lee Co, PN#CCPX0003349S A, Westbrook, Connecticut 소재) 그러한 체크 밸브(20-1)를 도시하고 있다. 도 20에서 화살표는 그 체크 밸브에서 허용된 액체 유동의 방향을 나타내고 있다. 액체는 체크 밸브의 루멘(20-2)을 통과하여 밸브의 볼(20-3)을 아래로 푸싱하여 밸브 스프링(20-4)을 압축한다. 일단 유체가 더 이상 유동하지 않으면, 스프링(20-4)은 볼(20-3)을 다시 푸싱하여 밸브를 밀봉시킨다. 도 20에 도시된 체크 밸브는 도 19에 도시된 체크 밸브 어댑터 부품 안으로 삽입되는데, 도 20A는 체크 밸브(20-1)가 장착된 체크 밸브 어댑터(19-0)를 도시하고 있다. 체크 밸브를 포함하는 그 체크 밸브 어댑터는 컨테이너 안으로 삽입되어 도 21에 도시된 가변 로딩 부피 컨테이너를 형성한다. 그 컨테이너(21-1)는 약 5kbar, 양호하게는 약 10kbar가지의 가압에 견딜 수 있고, 선택적으로 산소에 실제적으로 불투과성인 신축성 재료로 제조된다. 가변 로딩 부피 장치의 컨테이너(21-1)는 Styrolux® 684D를 이용하여 싱글 공동 몰드(PTG Global Inc., Orange County, California 소재로부터 상업적으로 이용할 수 있는 것과 같은)에서 사출 성형될 수 있다. 구성 재료는 Styrolux®에 제한되지 않고, 산소 투과성을 조정하기 위해 더욱 조절될 수 있다. 컨테이너는 액체 샘플(21-2)을 포함한다. 일 실시 예에 있어서, 가변 로딩 부피 장치는 1.2ml까지의 액체 부피를 보유할 수 있고, 150-1200㎕의 부피 범위에 사용될 수 있다. 체크 밸브(21-4)를 구비한 어댑터(21-3)가 컨테이너(21-1)의 정부안으로 삽입되고, 체크 밸브는, 컨테이너의 에어 및 유제가 컨테이너로부터 상부로 유동하나 유체는 컨테이너 안으로 아래로 유동하는 것이 차단되도록 배향된다. 어댑터가 아래로 컨테이너 안으로 밀림에 따라서, 에어는 체크밸브로부터 가압되고, 어댑터의 오목한 저부는 액체 샘플이 컨테이너로부터 가압을 시작하기 전에 가능한 한 많은 에어를 외부로 가압하는 것을 보장한다. 도시된 가변 로딩 부피 장치는 이어서 고압을 받는다.

장치 실시 예: 용액 교환(용액 혼합) 장치

다른 실시 예에 있어서, 고압 장치는 다수의 구획들을 포함하는데, 구획에서 구획 내용물들이 분리를 유지하거나 또는 함께 혼합될 수 있다. 그러한 장치들을 용액 교환 또는 용액 혼합 장치로 지칭된다. 고압에서 액체 샘플을 처리하는 경우에, 컨테이너의 내용물들은 혼합되어 액체 샘플의 화학적 용액 조건들을 변경시킬 수 있다. 그 변화될 수 있는 화학적 용액 조건들은 이것들에 제한되지 않지만, pH, 염 농도, 환원제 농도, 산화제 농도, 유발제(chaotrope) 농도, 아르기닌 농도, 계면 활성제 농도, 양호하게 배제시키는 화합물 농도, 리간드 농도, 액체 샘플에 원시적으로 존재하는 어떤 화합물 농도 또는 용액에 첨가되는 추가적인 반응물 또는 반응제의 첨가를 포함한다. 다른 실시 예에 있어서, 화학적 용액 조건들은 액체 샘플에 추가적인 반응제 또는 반응물을 첨가함으로써 변화된다. 그러한 반응제 또는 반응물은, 효소 저해제, 약제, 작은 유기 분자(약 1000 Dalton 아래의 분자량), 또는 단백질 유도체화 반응제의 하나 이상을 포함할 수 있다.

컨테이너-인-컨테이너 실시 예

구획 내용물들이 분리 상태를 유지하거나 또는 함께 혼합될 수 있는 다수의 구획들을 포함하는 그러한 하나의 실시 예에 있어서, 고압 장치는 하나 이상의 제 2 구획들을 감싸는 제 1 구획을 포함하는데, 그 고압 장치에서 하나 이상의 제 2 구획들이 제 1 구획을 개방시키지 않고 개방될 수 있으므로, 하나 이상의 제 2 구획들의 내용물들이 방출되어 제 1 구획 내용물과 접촉하게 된다. 이 실시 예의 한 예가 도 8A 및 도 8B에 도시되었다. 도 6 및 도 21의 가변 로딩 부피 컨테이너와 같은 가변 로딩 부피 컨테이너가 제 1 구획으로서 사용되고, 반면에 하나 이상의 제 2 구획(8-1)들이 가변 로딩 부피 컨테이너의 내부(6-5)에 놓인다. (가변 로딩 부피 컨테이너는 단순히 한 예로서 사용된 것이고, 일정 로딩 부피 컨테이너와 같은 본 발명의 다른 장치들의 어떤 것들도 제 1 구획으로서 사용될 수 있음을 이해하여야 한다) 제 2 구획의 일 단부가 밀봉된다. 자기 디스크(8-3)가 제 2 구획의 나머지 단부에 놓이는데, 그것은 제 2 구획의 벽 또는 측부와 디스크 중심을 통과하여 제 2 구획의 벽 또는 측부 내로 통과하는 부설된 축(axle)을 가질 것이다. 디스크는 제 2 컨테이너 내부에 가능한 한 정확하게 끼워지도록 공차를 구비하게 설계되어야 한다. 그 디스크는 축 상에서 자유롭게 회전하여 통상적인 버터플라이 밸브와 유사한 방법으로 제 2 컨테이너를 효과적으로 개방 및 밀폐시키도록 설계된다. 모서리를 깍아 내거나 경사진 에지가, 디스크 후방에서 가능한 한 타이트한 공차로 자기 디스크의 자유 회전을 보장하도록 사용된다. 이 구조는 자기 디스크가 자유롭게 회전할 수 있도록 하는 반면에, 디스크가 밀폐 위치에 있을 때에 효과적인 밀봉을 제공한다. 이 구조가 사용되는 경우에, 중력이 자기 디스크를 그것의 밀폐 위치에 유지시키는 것을 돕기 위해서 제 2 컨테이너 또는 컨테이너들을 수직 위치에 놓이도록 하는 위치에 제 1 컨테이너를 유지시키는 것이 양호하다. 제 1 구획(제 2 구획을 포함한다)이 놓이는 고압 용기 외부 주위에 수직 및 수평의 방법으로 놓인 전기적 코일에 의해 스위치가 작동된다. 자기 디스크를 밀폐 또는 밀봉 위치에 유지시키는 자기장을 발생시키도록 수평 코일은 기본적으로 압력 용기 내의 자기 디스크와 평행하다. 이것은 도 8A에 도시되었다. 압력 용기가 통상적으로 스테인리스 스틸로 제조되므로, 압력 용기내부를 침투하기에 충분히 강한 자기장 발생을 가능하게 하는 적절한 수의 루프, 게이지 두께 및 전류를 구비하도록 코일이 설계된다. 이와는 달리, 그 압력 용기는, 스틸 또는 다른 그런 강자성 재료에서와 같은 양으로 자기장을 감쇄시키지 않는 재료로 제조될 수 있다. 자기 디스크 제어를 위한 전기 코일의 다른 배열은 샘플 래크(rack)를 중심으로 코일을 수평 및 수직의 방법으로 위치시키는 것을 포함한다. 이 구조에서, 자기장은 압력 용기의 스틸 벽을 침투할 필요가 없으나, 전류를 운반하는 와이어가 압력 용기 내부로 이어져야 한다. 이것은, 스틸보다는 절연 세라믹으로 통상적인 압력 용기의 밀봉 플러그 베이스를 제조하는 것에 의해 달성될 수 있다.

자기 디스크가 밀폐 위치에 유지되는 경우에, 수평 자기장이 턴 온되고 수평 자기장이 턴 오프되어 자기 디스크를 수평 위치에 유지시키고 제 2 컨테이너의 용액 내용물을 제 1 컨테이너의 내용물로부터 밀봉시킨다. 용액 교환을 가능하게 하도록, 수평 및 수직 코일의 전류가 적절한 방법(즉, 수평 코일 전류를 턴 오프하고 수직 코일 전류를 턴 온하는)으로 조작하여 도 8B에 도시된 디스크를 개방시키고, 제 2 컨테이너의 내용물(제 2 컨테이너 내부 공간(8-2)에 함유된)이 제 1 컨테이너 내용물(제 1 컨테이너 내부 공간(6-5)에 함유된)과 접촉하도록 한다. 디스크는 혼합 작용을 발생하도록 사용될 수 있는데, 수평 및 수직 코일의 전류가 교번(alternated) 되어 교류 전류로 회전 전자기장을 발생시키어 자기 디스크를 뒤집(flip)는다. 이것은 제 2 컨테이너의 내용물을 제 1 컨테이너로 개방시키는 반면에, 디스크 동작이 대류와 용액 교환을 가능하게 한다. 변형에서, 제 2 컨테이너상의 캡은, 고압 챔버내로 열린 적절하게 밀봉된 개구부를 통하여 고압 챔버로 들어가고 또한 적절한 밀봉을 통하여 제 1 컨테이너를 통과하는 샤프트를 구동시키어 제어될 수 있다.

유동-루프 실시 예

구획 내용물들이 분리되어 유지되거나 또는 함께 혼합될 수 있는 다수의 구획들을 포함하는 그러한 다른 실시 예에 있어서, 고압 장치는 유동 통로에 의해 연결된 적어도 두 개의 구획들을 포함하는데, 그 장치에서 구획과 유동 통로는 적어도 하나의 펌프를 구비한 밀폐 원형 루프를 형성한다. 이 실시 예의 일 예가 도 9에 도시되었다. 액체 샘플이 "분리(dissociation)" 챔버(9-1)에 놓여지는 반면에, 제 2 용액이 "리폴딩" 챔버(9-2)에 놓여진다. 추가적인 분리 챔버, 리폴딩 챔버 및 통로들이 원하는 바에 따라 추가될 수 있다. 고압 장치는 이어서 압력 챔버(도시되지 않음)에 놓여지고 가압된다. 액체 샘플과 제 2 용액의 혼합을 원하는 경우에, 피스톤 펌프(9-5)가 턴 온되어 그 액체를 밀폐 원형 루프(9-3)를 통해 순환시킨다. 피스톤(9-7)은 자기화 재료로 제조되어 자기장에 의해 펌프 비율의 제어가 가능하다. 마이크로프로세서-제어 배터리 동력 코일이 피스톤 펌프를 제어하도록 챔버와 유동 루프를 따라서 압력 챔버 내부에 놓여질 수 있다. 마이크로프로세서(9-8) 및 배터리(9-9)는 양호하게 에폭시 블록(9-4)에 내장되어 마이크로프로세서 자체에의 압력 이동을 감소시킨다. 또한, 제 1 컨테이너/제 2 컨테이너 장치의 제 2 구획 금속 디스크 제어를 위한 금속 코일에 대한 배열이 피스톤을 제어하기 위해 사용될 수 있다. 또한 다른 변형에서, 그 장치는, 고압 챔버 내로 형성된 적절하게 밀봉된 개구부를 통해서 고압 챔버로 들어가는 샤프트를 구동시키어 제어될 수 있다. 하나 이상의 체크 밸브(9-6)가 단방향 유동을 보장한다. 컨테이너들이 도면의 용이한 이해를 위해 "분해 챔버" 및 "리폴딩 챔버"로 표기되었지만, 다른 화학적 및 생화학적 공정들이 어느 하나의 챔버 또는 양 챔버에서 발생할 수 있다.

예비-혼합 컨테이너/수용(후-혼합) 컨테이너 실시 예

구획들의 내용물이 분리되어 유지되거나 또는 함께 혼합될 수 있는 다수 구획들을 포함하는 그러한 다른 실시 예에 있어서, 고압 장치는, 예비-혼합 컨테이너로 지칭된 액체 샘플들을 보유하는 적어도 두 개의 컨테이너를 포함하는 시스템을 구비한다. 액체 샘플들은 일반적으로 염 농도 및 pH등과 같은 하나 이상의 조건들 및 조성들이 상이하다(액체 샘플들은 원하는 경우 동일한 것일 수 있다). 그 시스템은 또한 수용 컨테이너 또는 후-혼합 컨테이너로 지칭된 적어도 하나의 추가적인 컨테이너를 포함하는데, 그 시스템에서, 수용(후-혼합) 컨테이너는 이동 전에 비거나 또는 이동 전에 액체 또는 고체 조성을 함유할 수 있다. 그러한 시스템(100)이 도 13에 도시되었고, 도 14에 상세한 단부가 도시되었다. 도 14에서, 플러그(112)에 의해 밀봉된 압력 챔버(102)는 별개의 액체 샘플을 함유하는 두 개의 예비-혼합 컨테이너(120, 122)를 지지한다. 예비-혼합 컨테이너들은 도 14에서 대략 동일한 크기로 도시되었으나, 컨테이너들의 크기는 서로 각각에 대해서 변할 수 있어서, 예를 들면, 하나의 예비-혼합 컨테이너가 다른 예비-혼합 컨테이너의 두 배 부피를 가질 수 있다. 또한, 단순화를 위해서, 단지 두 개의 예비-혼합 컨테이너만 도시되었으나, 원하는 경우에 더 많은 예비-혼합 컨테이너가 사용될 수 있다. 예비-혼합 컨테이너들은 모바일(mobile) 피스톤(128), 믹서(126)로 이어지는 액체 도관(124)을 갖는다. 그 믹서는 피스톤(132)을 포함하는 수용(후-혼합) 컨테이너(130)로 이어지는데, 그 피스톤은 도 14에서 수용 컨테이너 정부에 대해서 같은 높이로 도시되었다. 밸브(104), 압력 발생기(108) 및 압력 라인(110)이 압력 챔버(102) 내부(103)와 연통하고, 압력 챔버(102) 내부를 예를 들면, 2,000~2,500bar까지 압축할 수 있다. 밸브(106), 압력 발생기(108) 및 유압 라인(111)은 피스톤(132) 아래에 놓인 액체와 연통한다. 도 15는 압력 챔버(102)를 상세히 도시하고 있다. 유압 출구(134)가 수용 컨테이너(130)로부터 액체를 제거하여, 피스톤(132)을 밀봉부(131)로부터 떨어지게 하는데, 즉 피스톤(132)이 믹서(126) 입구로부터 빠진다. 이것은 이어서 예비-혼합 컨테이너(120, 122)의 액체를 수용 컨테이너(130) 도중에 액체가 혼합되는 믹서(126)를 통하여 당긴다. 액체가 컨테이너들(120, 122)을 나감에 따라서 피스톤들(128)은 끌어 내려지고, 예비-혼합 컨테이너들(120, 122)이 비는 경우에, 피스톤들(128)은 밀봉부(125)에 놓이게 된다. (도시되지 않은) 다른 실시 예에 있어서, 유압이 피스톤(128)의 외측에 인가되어 예비-혼합 컨테이너들(120, 122)로부터 유체 방출을 용이하게 할 수 있다. 도 16은 예비-혼합 컨테이너들(120, 122)의 액체 샘플들이 수용 컨테이너(130)로 이동된 후의 장치를 도시하고 있다. 예비-혼합 컨테이너들(120, 122)로부터 유체 방출 후에는 피스톤(128)은 밀봉부(125)와 같은 평면이 된다. 수용 컨테이너(130)의 피스톤(132)은 밀봉부(131)로부터 멀리 밀려서 수용 컨테이너로 이동하는 액체를 수용한다. 도 17은 예비-혼합 컨테이너(120)를 보다 상세히 도시하고 있다. 샘플이 입구(121)를 통하여 예비-혼합 컨테이너(120)내로 도입되고, 샘플의 도입 후에 플러그 또는 체크 밸브가 입구(121)에 삽입되어 예비-혼합 컨테이너를 밀봉할 수 있다. 피스톤(128)은 피스톤과 컨테이너 벽 사이에 밀봉을 형성하도록 오(O)-링(129B)이 안착되는 환상의 함입부(129A)를 갖는다. 도 18은 수용 컨테이너(130)을 보다 상세히 도시하고 있다. 액체는 밀봉부(131)의 개구(136)을 통하여 수용 컨테이너로 유입되는데(역류를 방지하도록 도시되지 않은 체크 밸브가 선택적으로 개구(136)에 놓여진다), 오(O)-링(135)은 밀봉부를 보강한다. 부압이 개구(134)를 경유하여 인가되는데, 그 유압은 피스톤(132)을 아래로 당기고, 차례로 액체를 예비-혼합 컨테이너(도 18에는 도시되지 않음)로부터 수용 컨테이너(130)내로 인도한다. 피스톤(132)은 피스톤 주위의 유체 이동을 방지하기 위해 오(O)-링(135)을 갖는다.

압력 챔버(102)는 액체 샘플상에 2000~2500bar(250bar~10kbar, 1kbar~10kbar 또는 1kbar~5kbar와 같이 높은 또는 낮은 값이 사용될 수 있다)를 생성시키도록 압축될 수 있다. 따라서 예비-혼합 컨테이너, 수용 컨테이너, 그리고 따라서 액체 샘플들 자체가 혼합 전에, 동안에 그리고 그 후에 고압에 유지될 수 있다. 고압 장치는 따라서 두 개 이상의 용액이 고압에서 제 1기간 동안에(예를 들면, 약 1분-약 1주, 약 10분-약 48시간, 약 1시간-약 48시간, 약 10분-약 24시간, 약 1시간-약 24시간, 약 10분-약 12시간, 약 1시간-약 12시간, 또는 약 1시간-약 6시간) 별개로 처리 또는 배양하는 것이 가능하다. 용액은 이어서 함께 혼합될 수 있는데, 혼합된 용액은 제 2기간 동안에(예를 들면, 약 1분-약 1주, 약 10분-약 48시간, 약 1시간-약 48시간, 약 10분-약 24시간, 약 1시간-약 24시간, 약 10분-약 12시간, 약 1시간-약 12시간, 또는 약 1시간-약 6시간) 배양될 수 있다. 두 배양 기간이 종료한 후에, 압력 챔버는 감압되고, 다양한 특성들(단백질의 리폴딩과 같은)을 위해 분석될 수 있고/있거나 원하는 목적을 위해 사용될 수 있는 수용챔버로부터 용액은 제거된다.

사용될 수 있는 장치의 예들은: 고압 발생기(PN# 37-5.75-60, High Pressure Equipment Co., Erie, Pennsylvania) (시린지 펌프형태로서 60,000 psi까지 등급됨); 고압 튜빙(PN# 60-9H4-304, High Pressure Equipment Co.); 고압 밸브(PN# 60-11HF4, High Pressure Equipment Co.);고압 글랜드(PN# 60-2HM4) 및 칼라(PN# 60-2H4 from High Pressure Equipment Co.)를 포함한다. 예비-혼합 컨테이너는 쿼츠 수프라실(quartz Suprasil) 실린더(Wilmad Glass, Buena, New Jersey)로부터 제조될 수 있고, 쿼츠 실린더는 오(O)-링(McMaster-Carr, Aurora, Ohio, PN 9396Kl 6, 2-011, 실리콘 고무로 제조됨)을 장착한 제조된 스테인레스 스틸 피스톤(High Precision Devices, Boulder, Colorado)으로 캡(capped)될 수 있다. 제 1 챔버 출구는 HPLC 크로마토크래프 피팅스(fittings)((PN# F-300-01, F-113, F-126x, 1576, Upchurch, Oak Harbor, Washington)의 사용을 통해서 스태틱(static) 믹서에 연결된다. 도면에 도시된 혼합 장치는 선택적인데, 단순한 확산보다 높은 혼합 비율을 원하는 경우에 또는 완전한 혼합을 원하는 경우에, 그러한 믹서가 사용될 수 있다. HPLC에 사용된 것과 같은 스태틱 믹서가 사용될 수 있는데, 이것들은 여러 공급자들(예를 들면, Analytical Scientific Instruments, El Sobrante, California, static mixer PN# 40200000.5)로부터 얻을 수 있다. 스택틱 믹서 출구는 표준 HPLC 크로마토그래프 피팅스(즉, 전술한 Upchurch fittings)의 사용을 통해서 제 2 리폴딩 챔버에 연결된다.

용액 조건들의 단계적 조절

예비-혼합 컨테이너/수용(후-혼합) 컨테이너 실시 예에 있어서, 용액은 한 단계에서 그들 전체가 혼합될 필요는 없는데, 즉 예비-혼합 컨테이너의 용액 일부가 수용 챔버안으로 인도되고, 수용 챔버에서 뿐 아니라 예비-혼합 챔버에서의 잔류 용액에 대 압력이 가해진 상태로 연속적인 배양이 이어진다. 이런 방법으로, 용액 조건들의 단계적 조절이 구현될 수 있다. 추가적인 실시 예에 있어서, 예비-혼합 컨테이너는 상이한 포인트에서 제시간에 상이한 예비-혼합 용액들을 첨가를 위한 개별적으로 작동되는 밸브를 가질 수 있다. 따라서, 예를 들면, A,B,C 및 D로 표기된 예비-혼합 컨테이너에 대해서, 단백질 용액과 같은 예비-혼합 컨테이너A에 있는 액체 샘플이 일정기간 동안에 배양되고, 이어서(밸브 A 및 B는 개방, 그리고 밸브 C 및 D는 밀폐됨) 예비-혼합 컨테이너A 및 B의 내용물이 수용 챔버안으로 인도되어 컨테이너A로부터의 최초 용액 조건들을 변경시킨다. 배양의 또 다른 기간 후에, 예비-혼합 컨테이너C로 이어지는 밸브가 개방되고, 컨테이너C의 내용물이 수용 챔버안으로 인도되고, 원하는 경우에, 또 다른 배양 기간을 가질 수 있다. 이것은 단계적으로 액체 샘플의 용액 조건들을 조절하기 위해서 원하는 수의 예비-혼합 컨테이너를 통해서 구현될 수 있다.

유동-루프 실시 예에 있어서, 용액 조건들의 단계적 조절은 여러 컨테이너, 예를 들면, 컨테이너 A,B,C 및 D로 지정된 컨테이너들을 갖는 것에 의해 구현될 수 있다. 용액은 일정 시간 동안 고압하에서 배양될 수 있다. 컨테이너A 및 B로 이어지는 밸브들이 개방되어 그 컨테이너들 사이의 유동(컨테이너A의 내용물이 컨테이너 B의 내용물과 혼합됨에 따라서 컨테이너A의 용액 조건의 변경)을 가능하게 하는 반면에, 컨테이너 C 및 D로 이어지는 밸브들은 배양기간 동안에 컨테이너 C 및 D를 바이-패스(by-pass) 하는 위치에 유지될 수 있다. 밸브는 이어서 컨테이너 C의 내용물이 유동 루프안에 놓여지도록 세팅되는데(즉, 컨테이너C 주위의 바이-패스 분기(shunt)를 차단시키고, 밸브를 개방하여 컨테이너C를 유동 루프에 놓여짐), 이곳에서 컨테이너 C의 내용물이 이제 유동 루프에서 컨테이너 A 및 B의 내용물과 혼합(그것들의 내용물이 컨테이너 C의 내용물과 혼합됨에 따라서 유동 루프에서 용액의 조건들이 변경됨)되는 반면에, 또 다른 배양기간 동안에 유동은 컨테이너 D의 바이-패스를 계속한다. 마지막으로, 밸브들이 개방되어 컨테이너 D를 유동 루프에 위치시킬 수 있고, 반면에 그것들의 내용물이 컨테이너 D 내용물과 혼합됨에 따라서 유동 루프에서 용액의 용액 조건들의 또 다른 조절을 위해, 그리고 또 다른 배양기간 동안에 컨테이너 D 주위의 바이-패스 분기(shunt)를 차단시킨다. 이것은 단계적 방법으로 액체 샘플의 용액 조건들의 조정을 위해 적절한 밸브와 바이-패스 분기를 통해서 유동 루프에서 원하는 수의 컨테이너에 의해 구현될 수 있다.

이들 실시 예들은 여러 조건하에서 단백질의 리폴딩을 위해 사용될 수 있다. Lin의 미합중국 특허 제 6,583,268호 및 Li, M. and Z. Su (2002), Chromatographia 56(1-2): 33-38은 유발제로 높은 pH에서 단백질 리폴딩을 제안하고 있는데, pH의 단계적 감소, 단백질 용액의 희석 및 울트라 여과 및 겔 크로마토그래피가 이어진다. 전술된 고압 장치를 이용하여, 압력 조절 리폴딩(250-5000bar)이 비-변성 유발제 용액에서 알칼리성 pH(10.0 부근)에서 수행될 수 있고, 이어서 용액의 pH는 그 값이 pH 8.0이 얻어질 때까지 단계적 방법으로 점차적으로 감소될 수 있다. pH를 10에서 8로 낮추는데 10일의 기간이 될 수 있는, 24시간당 0.2 단위 비율이 미합중국 특허 제 6,583,268호에 제안되어 있는데, 이 비율은 일반적인 조건으로 채용될 수 있거나 또는 선택적인 조건이 단백질-바이-단백질(protein-by-protein) 베이스로 결정될 수 있다. 높은 압력의 유압을 사용하는 것은 총 분해를 촉진시키기 위한 높은 농도의 유발제 사용의 필요성을 감소 또는 제거할 수 있다. 압력 및 유발제/pH 조절 리폴딩 방법들의 조합에 의해서, 보다 높은 리폴딩 수율달성이 기대된다.

하나의 실시 예에 있어서, 본 발명은 고압하에서 용액 조건들을 변경시키는 방법을 제공하는데, 그 방법은, 적어도 하나의 제 1 컨테이너 용액에 적어도 하나의 조성물을 제공하는 단계와, 적어도 하나의 다른 컨테이너에서 용액 조건을 변경시키기 위한 반응제를 제공하는 단계와; 여기서 적어도 하나의 추가 컨테이너의 내용물은 적어도 하나의 제 1 컨테이너 내용물과 접촉하지 않고, 컨테이너들을 고압하에 처리하는 단계와, 그리고 적어도 하나의 다른 컨테이너의 내용물을 적어도 하나의 제 1 컨테이너 내용물과 접촉시키는 단계를 포함하는데, 적어도 하나의 다른 컨테이너 내용물이 초과 시간에 걸쳐서 적어도 하나의 제 1 컨테이너 내용물과 접촉을 일으킨다. 하나의 실시 예에 있어서, 적어도 하나의 다른 컨테이너의 내용물은 연속적인 방법으로 적어도 하나의 제 1 컨테이너 내용물과 접촉을 일으키는데, 그것에 의해 제 1 컨테이너 내용물 용액 조건들이 기간 동안에 연속적으로 변화된다. 다른 실시 예에 있어서, 적어도 하나의 다른 컨테이너 내용물은 적어도 하나의 제 1 컨테이너 내용물과 연속적인 방법으로 접촉을 일으키는데, 그것에 의해 적어도 하나의 제 1 컨테이너 내용물의 용액 조건들이 시간에 걸쳐 단계적으로 변화된다. 용액 조건들의 이 단계적 변화에 대한 실시 예에 있어서, pH가 변화되고, 제 1 컨테이너 내용물 pH가 약 9-11, 또는 약 9.5-10.5, 또는 약 10이 된다. 용액 조건들의 이 단계적 변화에 대한 다른 실시 예에 있어서, 제 1 컨테이너 내용물 pH는 약 9-11, 또는 약 9.5-10.5 또는 약 10이 되고, 그리고 약 7-8.9, 또는 약 7.5-8.5, 또는 약 8로 낮아진다. 단계적 방법의 다른 실시 예에 있어서, pH는 매 24 시간 정도마다 약 0.01-2pH 단위, 또는 매 24 시간 정도마다 약 0.1-1pH 단위, 매 24 시간 정도마다 약 0.1-0.5pH 단위, 매 24 시간 정도마다 약 0.1-0.4pH 단위, 매 24 시간 정도마다 약 0.1-0.3pH 단위, 또는 매 24 시간 정도마다 약 0.2pH 단위 정도 낮아진다. 용액 조건들의 조절 전에, 그 동안에, 그리고 그 후에, 배양 기간은 적절한 리폴딩 수율에 요구되는 것으로 변화될 수 있는데, 예를 들면, 고압하에서의 배양은 용액 조건들의 조절 전에, 약 1분-1주일, 또는 약 10분-48시간, 또는 약 1시간-48시간, 또는 약 10분-24시간, 또는 1시간-24시간, 또는 약 10분-12시간, 또는 약 1시간-12시간, 또는 약 1시간-6시간의 어느 기간 동안에 수행될 수 있다. 용액 조건들의 점진적인 연속적 변화에 대해서, 조절이, 약 1분-1주일, 또는 약 10분-48시간, 또는 약 1시간-48시간, 또는 약 10분-24시간, 또는 1시간-24시간, 또는 약 10분-12시간, 또는 약 1시간-12시간, 또는 약 1시간-6시간의 어느 기간 동안에 수행될 수 있다. 용액 조건들의 단계적 조절을 위해서, 조절들 사이의 인터벌은, 약 1분-1주일, 또는 약 10분-48시간, 또는 약 1시간-48시간, 또는 약 10분-24시간, 또는 1시간-24시간, 또는 약 10분-12시간, 또는 약 1시간-12시간, 또는 약 1시간-6시간의 어느 기간 동안일 수 있다. 마지막으로, 원하는 목표 조건들로의 용액의 조건들이 조절된 후에 고압하에서의 배양이 약 1분-1주일, 또는 약 10분-48시간, 또는 약 1시간-48시간, 또는 약 10분-24시간, 또는 1시간-24시간, 또는 약 10분-12시간, 또는 약 1시간-12시간, 또는 약 1시간-6시간의 어느 기간 동안 수행될 수 있다.

전술된 방법에서, 적어도 하나의 제 1 컨테이너의 내용물이, 용액 교환을 위한 컨테이너-인-컨테이너 실시 예의 경우와 같이, 용액 조건들이 변화됨에 따라서 제 1 컨테이너에 잔류할 수 있다. 또한, 제 1 컨테이너 내용물의 변경이 제 1 컨테이너와 부분적으로 또는 전체적으로 분리된 위치에서 발생하는 유동-루프 또는 예비-혼합 컨테이너/수용(후-혼합)컨테이너 실시예의 경우와 같이, 용액 조건들이 변화됨에 따라서 적어도 하나의 제 1 컨테이너의 내용물 전부 또는 일부는 더 이상 제 1 컨테이너에 존재하지 않는다. 그러한 경우에, 적어도 하나의 제 1 컨테이너 내용물 조건들을 변화시키는 것에 대한 참조는 적어도 하나의 제 1 컨테이너에 최초에 존재했던 내용물의 용액 조건들의 변화를 의미하는 것으로 이해된다(즉, "적어도 하나의 제 1 컨테이너 내용물"은 "용액 교환 전에 적어도 하나의 제 1 컨테이너의 최초 내용물"로 표시된 것으로 이해된다).

샘플 구획 안으로의 샘플 도입

일단 적적한 재료가 장치 몸체용으로 선택되었다면, 샘플들은 그 샘플 구획안으로 도입되어야 한다. 그 장치는 샘플을 수용하도록 구성되고, 따라서 액체 이동을 위한 다양한 표준 방법이 사용될 수 있다. 당 업계에 잘 알려진 핸드-헬드 또는 로보틱 피펫, 시린지, 펌프 및 다른 액체 이동 장비들이 사용될 수 있다. 압축 전에 그 어떤 장치들로부터 가능한 한 많은 잔류 에어를 배출시키는데 주의하여야 하는데, 그것은 재료 장애를 방지하고 에어에 함유된 산소가 시스템에서 용해되는 것을 방지한다. 그 장치들은 압력이 인가되는 경우에, 배출될 수 없는 잔류 에어가 액체의 산소 함량을 변경시키는 것을 방지하도록 질소 또는 아르곤과 같은 불활성 대기에서 충전될 수 있다.

일부 다른 실시 예에 있어서, 액체 샘플의 구획안으로의 로딩 전에, 하나 이상의 가스가 샘플에 살포될 수 있다. 그러한 가스는 이것에 제한되지 않지만, 헬륨, 질소, 네온, 아르곤, 또는 크립톤과 같은 비교적 비반응성인 가스를 포함하는데, 그 경우에 가능한 한 많은 용해 가스를 치환키는 것이 바람직하다. 통상적으로 강력한 산소 방출이 바람직하지만, 용액에 정상적인 것보다 높은 산호 함량이 필요한 경우에는, 에어 또는 산소 자체가 샘플에 살포될 수 있다. 또 다른 실시 예에 있어서, 진공이 샘플의 탈-가스를 위해서 샘플에 인가된다. 또 다른 실시 예에 있어서, 불활성 가스의 살포에 이어서 가능한 한 많은 용해 산소를 제거하도록 진공 처리를 하는데, 살포-펌프 사이클은 필요한 경우 반복될 수 있다.

샘플 구획의 밀봉과 샘플의 도입

본 발명의 여러 장치는 그 자체 밀봉을 제공하는데, 즉 가변 로딩 부피 장치는 밀봉 목적을 위해서 원-웨이 밸브 플러그를 사용한다. 96-웰 플레이트와 같은 그 자체 밀봉을 갖지 않는 장치들에 대해서, 샘플 구획들이 실리콘, 고무 또는 다른 재료로 제조된 밀봉재로 밀봉될 수 있다. 일 실시 예에 있어서, 그 밀봉 재료는 샘플 웰의 성분에 대해서 불활성인데, 액체 샘플이 실험 동안에 밀봉부와 접촉이 될 수 있기 때문이다. 고압에서 산소에 실제적으로 불투과성이 아닌 고무와 같은 밀봉이 사용되는 경우에, 고압에서 산소에 실제적으로 불투과성인 제 2 밀봉이 제 1 밀봉 위에 인가되어 산소 매스 이동을 감소 또는 예방할 수 있다. 원-웨이 밸브 플러그가 96-웰 플레이트와 같은 가변 로딩 부피 장치 외에 다양한 다른 장치에 사용될 수 있다(구획들을 밀봉하는데 96 원-웨이 밸브 플러그까지 사용되는 경우이다).

샘플 구획들이 액체 샘플의 도입 전에 또는 그 후에 밀봉될 수 있다. 샘플 구획이 액체 샘플의 도입 전에 밀봉되는 경우에는, 밀봉 침투 필요성이 없어진다. 그러나, 샘플 구획이 액체 샘플 도입 전에 밀봉되는 경우에는, 밀봉은 샘플의 도입을 허용해야 한다. 고무 또는 실리콘과 같은 재료로 제조된 밀봉은 액체 샘플 도입을 위해서 니들로 천공되는데, 제 2 니들이 구획으로부터 에어를 통기시키도록 사용될 수 있다. 제 2의 통기 니들은, 가능한 한 많은 에어를 회수하도록 밀봉을 침투해서 챔버내로 최소한으로 연장되는데 필요한 정도만이 삽입된다. 일단 에어가 완전히 추출되고 액체가 챔버로부터 추출이 시작되면 챔버의 충전이 완료된다. 고무 및 어떤 실리콘이 고압에서 비교적 산소에 투과성을 가지므로, 제 2밀봉층이 고압에서 산소의 매스 이동을 방지하도록 인가될 수 있다. 고압에서 실제적으로 산소 불투과성인 Mylar® 또는 다른 적절한 재료 층이 제 1밀봉 위에 놓일 수 있다.

다른 응용

약제를 배경으로 하여, 특히 단백질 리폴딩에 적합한 고압 장치가 전술되었지만, 이들 장치들의 적용은 약제 또는 단백질 리폴딩에 제한되지 않는다. 그 장치들은 샘플, 특히 액체 샘플의 압력 처리를 필요로 하는 어떤 적용에도 사용될 수있다. 예를 들면, Kunugi et al., Langmuir, 15:4056 (1999)는 다양한 압력에서 수용성 용액의 열적반응 중합체의 압력 및 온도 반응 결과를 연구했다. 압력은 잘 공지된 바와 같이 화학 반응에 영향을 미치는데, 압력은 반응 역학(네가티브 활성 부피를 갖는 반응은 고압에 의해 촉진된다. Vaneldik et al., Chemical Reviews 89:549 (1989) and Drljaca et al., Chemical Reviews 98:2167 (1998) 참조) 및 반응 열역학(낮은 시스템 부피가 고압에 의해 선호되는 변화, J. M. Smith et al., Introduction to Chemical Engineering Thermodynamics, New York: McGraw-Hill, 2001, 참조) 양자에 영향을 미친다.

본 발명은 본 발명을 제한하지 않는 다음의 예들에 의해서 더욱 잘 이해될 것이다.

실시예 1

쿠마쉬 블루 다이(Coomassie Blue dye)를 이용한 모델 용액 교환(용액 혼합) 실험

용액 교환은 도 13-18에 기술된 용액 혼합 장치로 압력 처리 동안에 연구되었다. 쿠마쉬 블루 다이의 공지된 농도 희석액이 하나의 예비-혼합 컨테이 너(0.015mg/ml dye의 1.0ml)에 놓여졌다. 다른 예비-혼합 샘플 컨테이너에 순수한 물 1ml가 놓여졌다. 압력은 서서히 2000bar로 증가시켰다. 이 압력에서 10분 후에, 챔버의 측부 입구에 연결되는 고압 밸브가 밀폐되고, 고압 시린지가 회수되어 피스톤 유동을 조절한다(교정이 미리 수행되어 예비-혼합 및 수용 컨테이너의 피스톤 위치에 대해서 시린지 펌프의 피스톤 위치를 동일하게 했다). 교환 후에 최종 농도를 결정하기 위해 샘플들이 수집되었고 UV/VIS 흡수가 570nm에서 측정되었다(도 22). 이 데이터는 쿠마쉬 블루의 표준과 비교되었다. 세 개의 연속적인 실험이 수행되어 도 13-18에 기술된 용액 교환 장치의 작동 후에 발생한 혼합의 정도를 결정하였다. 0.55+/-0.5의 흡수 값이 측정되었고, 이것은 0.0092 mg/ml dye의 다이 농도에 대응한다. 다이 용액의 순수한 물로의 1:1 희석과 포스트 혼합은 570nm에서 0.43의 흡수값을 갖는 0.0075 mg/ml의 다이 농도를 만들어야 한다(도 22). 그 연구는 장치의 세 차례 작동 후에 탈이온수의 0.75 부피과 혼합된 쿠마쉬 블루 다이를 함유하는 용액의 1.24 부피를 갖는 혼합이 발생했음을 보여주고 있다. 이 데이터는 용액 교환이 압력 처리 동안에 발생했음을 보여 주고 있다.

실시예 2

압력 처리 동안 용액 교환과 결부된 계란 흰 리소자임의 압력 리폴딩

이 예는 압력 처리 동안의 용액 교환이 단백질 집합체로부터 천연 단백질의 리폴딩 및 회복을 변경시킨다는 것을 보여 주고 있다. 종래의 연구에서, St.John등은, GdnHCL의 비-변성 레벨이 압력 처리 동안 존재하는 경우에, 단백질 집합체의 압력 유도 리폴딩이 적정화될 수 있다는 것을 보여주었다. St.John등은 2000bar에 서 5일 동안 배양 후에 리소자임 리폴딩 회수가 0.2M GdnHCL에서 약 35%에서 2M GdnHCL에서 약 80%로 선형적으로 증가되었음을 보여주었다. (St John, R. J., J. F. Carpenter, et al. (2002), Biotechnology Progress 18(3): 565-571).

도 23은 2000bar로 압축되기 전에("교환 없는" 샘플) 그리고 압축 동안에("HP-교환")의 두 경우에 GdnHCL 농도가 조작되는 경우의 현재의 리소자임 리폴딩으로부터의 결과를 도시하고 있다(대기 제어 또한 이루어졌고, 압력 처리가 리소자임 집합체를 리폴드하기 위해 필요함을 보여 주었다.) 리소자임이 고압에서 1M GdnHCL로 리폴드 되었고(어떤 용액 교환도 없었음), 이것은 약 53%의 리폴딩 수율을 보여 준다. 리소자임은 또한 용액 교환이 없는 상태에서 고압에서 0.5M GdnHCL로 리폴드되었고, 이것은 약 27%의 리폴딩 수율을 보여주었다. 리소자임이 초기 1M GdnHCL 농도에서 리폴드되고, 압력 처리동안에 용액 교환 및 0.5M GdnHCL 농도로 환원되는 경우에, 약 47%의 리폴딩 수율을 가져왔다. 따라서, 후자의 두 실험이 0.5M GdnHCL 농도를 갖는 반면에, 비-교환된 용액은 교환 용액을 갖는 것보다 많이 낮은 리폴딩 수율을 갖는다. 1.0M GdnHCL 농도에서 리폴디드된 비-교환된 리소자임 용액은 0.5M GdnHCL에서 종료된 용액들의 어느 하나보다 높은 리폴딩 수율을 갖는다.

고압은 소수성 및 정전기적 접촉을 불안정화시키지만, 수고 결합에 영향을 미치지 않는다. 다른 한편, GdnHCL는 수소 결합을 불안정화시킨다. 따라서, GdnHCL의 비-변성 레벨의 첨가는 리소자임의 리폴딩을 용이하기 하도록 도와준다. 이 고압 용액 교환 동안에, 초기의 높은 GdnHCL 농도(1M)는 집합체 분해를 위해서 보다 우호적인 환경을 리소자임 집합체를 인도한다. 압력하의 용액 교환은 이어서 완성되고 최종 GdnHCL 농도를 0.5M로 가져간다. 전술한 바와 같이, 0.5M GdnHCL의 "교환 없음" 샘플과 용액 교환된 샘플 양자의 최종 용액 조건들이 동일하지만, 리폴딩은, 보다 높은 1M 유발제 농도에서 최초로 개시시키는 능력에 의해 용액 교환된 샘플에서 용이하였다. 1M GdnHCL "교환 없음" 리폴딩 수율은, 리소자임이 2000bar의 1M의 구아니딘의 존재하에서 천연의 입체 구조로 잔류한다는 것을 강조하고 있다(Randolph, T. W., M. Seefeldt, et al. (2002), Biochimica Et Biophysica Acta-Protein Structure and Molecular Enzymology 1595(1-2): 224-234). 따라서, 리소자임의 리폴딩 수율은 고농도 유발제의 존재로 리소자임의 리폴딩 수율이 감소되지 않는다. 유발제 농도를 낮추는 압력 처리 동안의 용액 교환은 구아니딘 HCl의 존재에 보다 민감한 단백질에 대한 수율을 증가시키는 방향에서 보다 더 유리할 수 있을 것이다. 이들 결과들은 고압 처리 동안에 용액 교환 기술을 이용하여 단백질 집합체의 리폴딩 수율을 성공적으로 증가시키는 능력을 보여 준다.

사용된 실험적 조건들은 다음과 같다. 집합된 계란의 흰 리소자임의 수용성 현탁액이 pH 8에서 50 mM Tris-HCl, 1M GdnHCl, 5 mM GSSG, 2mM DTT로 하나의 예비-혼합 컨테이너에 놓였다. 제 2 예비-혼합 컨테이너는 아무런 단백질을 함유하지 않는 pH 8의 50 mM tris-HCl, 0M GdnHCl, 5mM GSSG, 2mM DTT로 충전되었다. 샘플들은 10분에 걸쳐서 최종 압력 2000bar까지 가압되었다. 단백질은 6시간 동안 버퍼(buffer)를 강화하도록 용해 상태를 유지하였고, 그 포인트에서 도 14에 도시된 용액 교환 장치를 이용하여 용액 교환이 개시되었다. 최종 조합 용액(이제 수용 컨테이너에 존재)이 감압 전에 또 다른 6시간 동안 2000bar에 잔류하였다. 2000 및 1 bar의 pH 8에서 50mM Tris-HCl, 0.5 또는 1M GdnHCl, 5mM GSSG, 2mM DTT을 함유하는 용액에서 동일한 리소자임 집합체들에 대한 리폴디드하는 제어가 시험되었다. 샘플은 수용 컨테이너로부터 수집되었고, 리소자임 촉매성 활동도가 Jolles (Jolles, P. (1962). "Lysozymes from Rabbit Spleen and Dog Spleen." Methods of Enzymology 5: 137)에 의해 기술된 것과 유사한 방법으로 측정되었다.

식별 인용으로서 이곳에 참고한 모든 공보들, 특허들, 특허 공보들 및 공표된 특허 출원들은 그 전체가 이곳에 참조로서 포함된다.

비록 전술한 발명은 도시적인 방법으로 그리고 분명한 이해를 돕기 위한 목적의 예로서 설명되었지만, 당업자에게는 어떤 사소한 변화와 변형이 이루어질 수 있음이 명백하다. 따라서, 상기한 설명 및 예들은 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지 말아야 한다.

Claims (32)

1. 액체 샘플의 압력 처리용 컨테이너로서,

   액체 샘플을 보유하기 위한 적어도 하나의 구획을 포함하고, 상기 컨테이너는, 파손 또는 파괴 없이 10kbar의 다차원 압력까지 지탱할 수 있고 고압에서 산소에 임의적으로 그리고 실질적으로 불투과성인 신축성 재료로 제조되는 것을 특징으로 하는 액체 샘플의 압력 처리용 컨테이너.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 컨테이너는 표준 압력에서 가변 로딩 부피를 갖는 것을 특징으로 하는 액체 샘플의 압력 처리용 컨테이너.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 컨테이너는 제 1 단부와 제 2 단부를 갖는 실린더, 상기 실린더의 상기 제 1 단부에 삽입된 가동 플러그, 및 상기 실린더의 상기 제 2 단부에 부착된 제거 가능한 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 액체 샘플의 압력 처리용 컨테이너.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 제거 가능한 부분이 나사식 스크류-캡인 것을 특징으로 하는 액체 샘플의 압력 처리용 컨테이너.
5. 제 3 항에 있어서, 상기 제거 가능한 부분은 상기 컨테이너로부터 절단되거 나 부서질 수 있는 팁인 것을 특징으로 하는 액체 샘플의 압력 처리용 컨테이너.
6. 제 2 항에 있어서, 상기 가동 플러그가 체크 밸브로 이루어진 것을 특징으로 하는 액체 샘플의 압력 처리용 컨테이너.
7. 샘플의 고압처리 방법에 있어서,

   샘플을 상기 청구항 1의 컨테이너 내로 도입하는 단계와, 상기 컨테이너에 고압을 가하는 단계와, 상기 고압을 대기압으로 감소시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 샘플의 고압처리 방법.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 샘플은 집합된 단백질 및/또는 변성된 단백질의 용액인 것을 특징으로 하는 샘플의 고압처리 방법.
9. 제 1 항에 있어서, 상기 컨테이너는, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 고밀도 폴리에틸렌, 폴리스티렌 및 폴리스티렌-부타디엔 블록 공중합체들로 구성된 그룹으로부터 선택된 재료로 형성되는 것을 특징으로 하는 액체 샘플의 압력 처리용 컨테이너.
10. 제 1 항에 있어서, 상기 컨테이너는 표준 압력에서 일정한 로딩 부피를 갖는 것을 특징으로 하는 액체 샘플의 압력 처리용 컨테이너.
11. 고압에서의 용액 교환용 장치에 있어서,

    제 1 액체 샘플을 보유하는 적어도 하나의 제 1 컨테이너와, 추가적인 샘플을 보유하는 하나 이상의 추가적인 컨테이너를 포함하고,

    상기 제 1 액체 샘플 및 상기 추가적인 액체 샘플 또는 샘플들이 동일하거나 상이할 수 있으며,

    상기 컨테이너는, 파손 또는 파괴 없이 5kbar 압력까지 지탱할 수 있고 선택적으로 고압에서 산소에 불투과성인 신축성 재료로 제조되고,

    하나 이상의 추가적인 컨테이너의 상기 액체 샘플은 상기 제 1 컨테이너의 액체 샘플과 혼합 또는 접촉할 수 있는 반면에, 혼합 또는 접촉 전, 그동안, 그리고 그 후에 상기 제 1 컨테이너 및 추가적인 컨테이너들과 그들 각각의 액체 샘플들이 고압에 유지되는 것을 특징으로 하는 고압에서의 용액 교환용 장치.
12. 제 11 항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가적인 컨테이너가 두 개 이상의 컨테이너를 포함하고, 두 개 이상의 추가적인 컨테이너 내용물이 두 개 이상의 컨테이너들과 독립적으로 또는 두 개 이상의 컨테이너들과 관련해서 제 1 컨테이너 내용물과 혼합될 수 있는 것을 특징으로 하는 고압에서의 용액 교환용 장치.
13. 제 11 항에 있어서,

    상기 적어도 하나의 제 1 컨테이너는 액체 샘플을 보유하는 예비-혼합 컨테 이너이고(이 경우 액체 샘플들은 동일하거나 상이할 수 있음),

    추가적인 액체 샘플 또는 샘플들을 보유하는 하나 이상의 추가적인 컨테이너가 다른 예비-혼합 컨테이너이고, 이 경우 제 1 액체 샘플 및 추가적인 액체 샘플 또는 샘플들이 동일하거나 상이할 수 있으며,

    상기 장치는 적어도 하나의 추가적인 수용 컨테이너를 또한 포함하는데, 이 경우 상기 수용 컨테이너는 이동 전에 비거나 또는 이동 전에 액체 또는 고체 조성물을 함유할 수 있으며,

    상기 모든 컨테이너들이 파손 또는 파괴 없이 5kbar 압력까지 지탱할 수 있고 선택적으로 고압에서 산소에 불투과성인 신축성 재료로 제조되고,

    액체 샘플을 보유하는 상기 예비-혼합 컨테이너의 액체 샘플들이 상기 적어도 하나의 수용 컨테이너 내로 이동되고, 그것에 의해 액체 샘플들이 서로 각각 접촉 및/또는 혼합될 수 있고,

    액체 샘플들을 보유하는 상기 예비-혼합 컨테이너, 상기 적어도 하나의 수용 컨테이너 및 액체 샘플들 자체가 접촉 및/또는 혼합 전, 그 동안, 그리고 그 후에 고압에 유지될 수 있는 것을 특징으로 하는 고압에서의 용액 교환용 장치.
14. 제 13 항에 있어서, 액체 샘플을 보유하는 상기 예비-혼합 컨테이너와 상기 적어도 하나의 수용 컨테이너 사이의 유체 통로에 개재되는 혼합 장치를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 고압에서의 용액 교환용 장치.
15. 제 14 항에 있어서, 상기 혼합 장치가 스태틱 믹서(static mixer)인 것을 특징으로 하는 고압에서의 용액 교환용 장치.
16. 제 11 항에 있어서, 상기 제 1 컨테이너는 제 1 액체 샘플을 보유하기 위한 구획과 하나 이상의 추가적인 컨테이너를 포함하며, 상기 제 1 컨테이너는 파손 또는 파괴 없이 5kbar 압력까지 지탱할 수 있고 선택적으로 고압에서 산소에 불투과성인 신축성 재료로 제조되고, 상기 하나 이상의 추가적인 컨테이너는 파손 또는 파괴 없이 5kbar 압력까지 지탱할 수 있고 선택적으로 고압에서 산소에 불투과성인 신축성 재료로 제조되고, 상기 제 1 컨테이너에 의해서 완전히 감싸지고, 상기 제 1 액체 샘플과 동일하거나 서로 다를 수 있는 추가적인 액체 샘플들을 함유하며, 상기 제 1 컨테이너 내에 있는 동안에 개방될 수 있고, 그것에 의해서 상기 제 1 액체 샘플과 추가적인 액체 샘플이 접촉 및/또는 혼합될 수 있는 것을 특징으로 하는 고압에서의 용액 교환용 장치.
17. 제 16 항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가적인 컨테이너들은, 폐쇄 위치에서 유지될 수 있는 캡을 포함하며, 상기 캡은 상기 제 1 컨테이너를 개방시킴이 없이 개방될 수 있고, 상기 제 1 컨테이너, 상기 하나 이상의 추가적인 컨테이너, 그리고 모든 액체 샘플들은 상기 하나 이상의 추가적인 컨테이너의 상기 캡을 개방하기 전, 개방하는 동안 및 개방한 후에 고압에서 유지될 수 있는 것을 특징으로 하는 고압에서의 용액 교환용 장치.
18. 제 17 항에 있어서, 상기 캡은 상기 제 1 컨테이너에 함유된 액체 샘플을 상기 하나 이상의 추가적인 컨테이너의 액체 샘플과 또한 혼합시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 고압에서의 용액 교환용 장치.
19. 제 17 항에 있어서, 상기 캡은 자기 디스크와 같은 자기화된 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 고압에서의 액체 교환용 장치.
20. 제 11 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 제 1 컨테이너와 하나 이상의 추가적인 컨테이너들은 유동 루프에서 연결된 것을 특징으로 하는 고압에서의 액체 교환용 장치.
21. 제 20 항에 있어서, 체크밸브를 더 포함하며, 이에 의해서 유체가 루프에서 단지 한 방향으로 유동할 수 있는 것을 특징으로 하는 고압에서의 액체 교환용 장치.
22. 제 11 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 제 1 컨테이너 액체가 상기 적어도 하나의 추가적인 컨테이너 액체와 혼합 및/또는 접촉할 때에, 상기 적어도 하나의 제 1 컨테이너의 적어도 하나의 액체 샘플의 하나 이상의 용액 조건들이 변화되는 것을 특징으로 하는 고압에서의 용액 교환용 장치.
23. 제 22 항에 있어서, 상기 하나 이상의 용액 조건들이, pH, 염 농도, 환원제 농도, 산화제 농도, 유발제 농도, 아르기닌 농도, 계면 활성제 농도, 양호하게 배제시키는 화합물 농도, 리간드 농도, 용액에 원시적으로 존재하는 어떤 화합물 농도 또는 다른 반응물 또는 반응제의 첨가로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 고압에서의 용액 교환용 장치.
24. 고압하에서 용액 조건들을 변경하는 방법에 있어서,

    제 1 액체 샘플을 보유하는 적어도 하나의 제 1 컨테이너를 제공하는 단계와;

    추가적인 샘플 또는 샘플들을 보유하는 하나 이상의 추가적인 컨테이너를 제공하는 단계로서, 적어도 하나의 제 1 액체 샘플과 추가적인 샘플 또는 샘플들 중의 적어도 하나가 나머지 샘플들과 상이하며, 상기 컨테이너들은 파손 또는 파괴 없이 5kbar 압력까지 지탱할 수 있고 선택적으로 고압에서 산소에 불투과성인 신축성 재료로 제조되는, 단계와;

    혼합 또는 접촉 전, 그동안, 그리고 그 후에 고압을 유지하면서, 상기 하나 이상의 추가적인 컨테이너의 액체 샘플을 상기 제 1 컨테이너의 액체 샘플과 혼합 또는 접촉시켜서 상기 적어도 하나의 제 1 액체 샘플의 용액 조건들을 변경시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 고압하의 용액 조건들의 변경 방법.
25. 제 24 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 제 1 액체 샘플의 하나 이상의 용액 조건들이, pH, 염 농도, 환원제 농도, 산화제 농도, 유발제 농도, 아르기닌 농도, 계면 활성제 농도, 양호하게 배제시키는 화합물 농도, 리간드 농도, 용액에 원시적으로 존재하는 어떤 화합물 농도 또는 다른 반응물 또는 반응제의 첨가로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 고압하의 용액 조건들의 변경 방법.
26. 제 25 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 제 1 액체 샘플의 하나 이상의 용액 조건들이 pH인 것을 특징으로 하는 고압하의 용액 조건들의 변경 방법.
27. 제 26 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 제 1 액체 샘플의 pH가 용액이 교환되기 전에 약 9 내지 약 11이고, 용액 교환이 완성된 후에는 상기 적어도 하나의 제 1 액체 샘플의 pH가 약 7 내지 8.9인 것을 특징으로 하는 고압하의 용액 조건들의 변경 방법.
28. 제 27 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 제 1 액체 샘플의 pH가 단계적인 방법으로 변화되는 것을 특징으로 하는 고압하의 용액 조건들의 변경 방법.
29. 멀티-샘플 보유 장치로서,

    액체 샘플을 수용하기 위한 적어도 두 개의 구획을 포함하고, 상기 장치는 상기 구획이 고압을 받는 경우에 상기 구획을 실질적으로 폐쇄된 시스템으로서 유 지시키는 것을 특징으로 하는 멀티-샘플 보유 장치.
30. 멀티-샘플 보유 장치로서,

    a)고압하에서 완결성을 유지하는 재료로 제조된 몸체와,

    b)액체 샘플들을 수용하기에 적합한 몸체에 제공된 다수의 샘플 구획들을 포함하고,

    상기 장치는 다수의 구획들 사이 또는 어떤 샘플 구획과 주위 사이에서 액체 샘플의 상당한 이동을 허용하지 않는 것을 특징으로 하는 멀티-샘플 보유 장치.
31. 제 30 항에 있어서, 상기 다수의 샘플 구획들은 적어도 96의 샘플 구획들을 포함하는 것을 특징으로 하는 멀티-샘플 보유 장치.
32. 제 30 항에 있어서, 상기 몸체는, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 고밀도 폴리에틸렌, 폴리스티렌 및 폴리스티렌-부타디엔 블록 공중합체들로 구성된 그룹으로부터 선택된 재료로 형성되는 것을 특징으로 하는 멀티-샘플 보유 장치.

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