KR20080075552A - 다발성 골수종 세포를 사멸시키기 위한 ｅＩＦ-５Ａ의 용도 - Google Patents

다발성 골수종 세포를 사멸시키기 위한 ｅＩＦ-５Ａ의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 암 세포 성장 및 전이를 억제하는 진핵생물 개시 인자 5A 및 상기 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 용도와 관련이 있다. 바람직한 구체예에서, eIF-5A1은 다발성 골수종 세포를 사멸시키는데 사용된다.
Figure P1020087016649
eIF-5A, 다발성 골수종 세포, 사멸, 아폽토시스, 폴리뉴클레오티드

Description

다발성 골수종 세포를 사멸시키기 위한 ｅＩＦ-５Ａ의 용도{Use of eIF-5A to kill multiple myeloma cells}
관련 출원
본원은 2005년 12월 13일에 출원된, 미국 임시 특허 출원 제 60/749,604호 및 2006년 4월 27일에 출원된, 미국 임시 특허 출원 제 60/795,168호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 두 특허문헌은 이의 전제내용이 본원에서 인용된다.
발명의 분야
본 발명은 다발성 골수종 세포뿐만 아니라, 그 외 다른 암세포를 사멸시키기 위한 아폽토시스-특이적(apotosis-specific) 진핵생물 개시 인자("eIF-5A (eukaryotic initiation factor 5A)") 및 상기 인자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 용도와 관련이 있다. 본 발명은 다발성 골수종을 억제시키고, 다발성 골수종 세포를 사멸시키며, 그 외 다른 암세포 성장을 억제시키고/시키거나 사멸시키는, 아폽토시스에 특이적인 eIF-5A(또는 "아폽토시스-특이적 eIF-5A" 또는 "eIF-5A1"으로도 지칭됨)의 용도뿐만 아니라, eIF-5 아형(isoform)의 용도와 관련이 있다.
아폽토시스는 유전자적으로 프로그램된 세포적 사건인데, 잘-규명된 형태학적 특징들, 예컨대, 세포 수축, 염색질 응축, 핵 무사분열 및 세포막 기포형성(membrane blebbing)에 의해 특징 지워진다. 하기 참고문헌 참조: Kerr et al., Br. J. Cancer, 26, 239-257; Wyllie et al. (1980) Int. Rev. Cytol., 68. 251-306. 아폽토시스는 정상적인 조식 발달 및 항상성 유지에 중요한 역할을 하며, 아폽토시스 프로그램의 결함은 신경퇴행성 및 자가면역성 질환으로부터 신생물에 이르는 광범위한 인간 질환에 기여하는 것으로 여겨진다. 하기 참고문헌 참조: Thompson (1995) Science. 267. 1450-1462.; Mullauer et al. (2001) Mutat. Res, 488, 211-231. 아폽토시스 세포의 형태학적 특징들이 잘 규명되어 있을지라도, 상기 과정을 조절하는 분자적 경로들은 현재 밝혀지고 있다.
아폽토시스에 관여하는 또 다른 중요 단백질은 종양 억제 유전자 p53에 의해 인코딩되는 단백질이다. 이 단백질은 세포 성장을 조절하며, 손상을 입고 유전자적으로 불안정한 세포들에서 아폽토시스를 유발하는(추정컨대, Bax의 상향-조절을 통해) 전사 인자이다. 하기 참고문헌 참조: Bold et al. (1997) Surgical Oncology, 6. 133-142.; Ronen et al., 1996.; Schulet & Green (2001) Biochem. Soc. Trans., 29. 684-688.; Ryan et al. (2001) Curr. Opin. Cell. Biol., 13. 332- 337.; Zorriig et al. (2001) Biochem. Biophys. Acta, 1551, F1-F37.
아폽토시스 경로에서의 변형은 암을 포함하는 수많은 질병 과정에 있어서 중용한 역할을 하는 것으로 여겨지고 있다. 하기 참고문헌 참조: Wyllie et al. (1980) Int. Rev. Cytol., 68. 251-306: Thompson (1995) Science. 267, 1456- 1462; Sen & D'Incalei (1992) FEBS Letters, 307. 122-127; McDonnell et al. (1995) Seminars in Cancer and Biology, 6, 53-60. 암 발달 및 진행에 대한 조사는 전통적으로 세포 증식에 초점을 맞추어 왔다. 그러나, 종양발생에서 역할하는 아폽토시스의 중요한 역할은 최근에서야 규명되기 시작하였다. 사실상, 아폽토시스의 조절은 종양 세포에서 어떤 식으로든 반드시 변형되기 때문에, 지금까지 아폽토시스에 대하여 알려진 많은 사실들은 종양 모델을 이용하여 규명되어 왔다. 다음 참고문헌 참조: Bold et al. (1997) Surgical Oncology. 6, 133-142.
사이토카인이 또한 아폽토시스 경로에 관여한다. 생물학적 시스템은 상기 사이토카인의 조절에 대한 세포의 상호작용을 필요로 하며, 세포들 사이의 크로스-토크(cross-talk)가 일반적으로 매우 다양한 사이토카인들을 포함한다. 사이토카인은 수많은 상이한 세포 유형에 의한 매우 다양한 자극에 대한 반응으로 생산되는 매개자이다. 사이토카인은 다수의 상이한 세포 유형에 다수의 상이한 영향을 미칠 수 있는 다면발현성 분자(pleiofropic molecules)이나, 특히 면역 반응의 조절 및 조혈 세포 증식 및 분화에 중요한 역할을 한다. 표적 세포에 대한 사이토카인의 작용 은 세포 생존, 증식, 활성화, 분화, 또는 특정, 사이토카인, 상대적 농도, 및 그 외 다른 매개자의 존재에 좌우되는 아폽토시스를 촉진할 수 있다.
데옥시하이푸신 합성효소(Deoxyhypusine synthase, DHS) 및 하이푸신-함유 진핵생물 번역 개시 인자-5A(eIF-5A)는 세포 생장과 분화를 포함하는 세포내 여러 과정에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 독특한 아미노산인, 하이푸신은 시험된 모든 진핵생물 및 고세균에서 발견되나, 진정세균에서는 발견되지 아니하며, eIF-5A는 유일하게 공지된 하이푸신-함유 단백질이다. 다음 참고문헌 참조: Park (1988) J. Biol. Chem., 263. 7447-7449; Schumann & Klink (1989) System. Appl. Microbiol., 11, 103- 107: Bartig et al. (1990) System. Appl. Microbiol., 13, 1 12-1 16; Gordon et al. (1987a) J. Biol. Chem.. 262, 16585-16589. 활성화된 eIF-5A는 다음 2가지 번역후 단계에서 형성된다: 첫번째 단계는 데옥시하이푸신 합성효소에 의해 촉매되는 스페르미딘(spermidine)의 4-아미노부틸 부분의 eIF-5A 전구체의 특정 리신의 α-아미노기로의 전이에 의한 데옥시하이푸신 잔기의 형성단계이고; 두번째 단계는 하이푸신을 형성하기 위한 데옥시하이푸신 합성효소에 의한 상기 4-아미노부틸 부분의 히드록실화(hydroxylation)를 포함한다.
eIF-5A의 아미노산 서열은 종들 간에 잘 보존되어 있으며, eIF-5A 중의 하이푸신 잔기 주위의 아미노산 서열의 엄격한 보존이 존재하는데, 이의 변형은 생존에 중요할 것으로 생각되고 있다. 다음 참고문헌 참조: Park et al. (1993) Biofactors, 4, 95-104. 이러한 추정은 추가로 효모에서 현재까지 발견된 eIF-5A의 두 아형의 불활성화 또는, 상기 아형들의 첫 번째 활성화 단계를 촉매하는, DHS 유전자의 불활성화가 세포 분열을 막는다는 관찰에 의해 뒷받침된다. 다음 참고문헌 참조: Schnier et al. (1996) Mol. Cell. Biol., 11, 3105-3114; Sasaki et al. (1996) FEBS Lett, 384. 151-154; Park et al. (1998) J. Biol. Chem., 273, 1677- 1683. 그러나, 효모에서 eIF-5A 단백질의 고갈은 결과적으로 총 단백질 합성에서의 적은 감소로 귀결되는데, 이는 eIF-5A가 특정 서브세트의 mRNA의 번역보다는 단백질의 전체적인 합성(global synthesis)에 필요할 수 있음을 시사한다. 다음 참고문헌 참조: Kang et al. (1993). "Effect of initiation factor eIF-5A depletion on cell proliferation and protein synthesis." in Tuile. M. (ed.), K Protein Synthesis and Targeting in Yeast, NATO Series H. eIF-5A에 결합하는 리간드가 고도도로 보존된 모티프들을 공통적으로 지니고 있다는 최근의 발견은 또한 eIF-5A의 중요성을 뒷받침한다. 다음 참고문헌 참조: Xu & Chen (2001) J. Biol. Chem., 276, 2555-2561. 또한, 변형된 eIF-5A의 하이푸신 잔기는 RNA에 대한 서열-특이적 결합에 필수적인 것으로 확인되었으며, 결합은 리보뉴클레아제에 대한 보호를 제공하지 못하였다.
또한, 세포내 eIF-5A의 고갈은 결국 핵 내에 특이한 mRNA들의 상당한 축적을 초래하는데, 이는 eIF-5A가 핵으로부터 세포질로의 특이한 부류에 속하는 mRNA 왕복운송(shuttling)에 관여할 수 있음을 나타낸다. 다음 참고문헌 참조: Liu & Tartakoff (1997) Supplement to Molecular Biology of the cell. 8, 426a. Abstract No. 2476, 37th American Society for Ceil Biology Annual Meeting. 핵공-연관 핵내 필라멘트에 eIF-5A의 축적 및 일반적인 핵 유출 수용체(nuclear export receptor)와 eIF-5A의 상호작용은, 추가로 eIF-5A이 폴리솜의 구성원이라기보다, 핵세포질간 이송 단백질(nucleocytoplasmic shuttle protein)이라는 것을 제시한다. 다음 참고문헌 참조: Rosoriυs et al. (1999) J. 세포 Science. 112. 2369-2380.
eIF-5A에 관한 cDNA는 스미트-맥브라이드 등(Smit-McBride et al.)에 의해서 1989년에 인간으로부터 제일 처음 클로닝되었고, 이후 eIF-5A의 cDNA들 또는 유전자들은 효모, 래트, 닭 태아, 알팔파, 및 토마토를 포함하는 다양한 진핵생물로부터 클로닝되었다. 다음 참고문헌 참조: Sniit-McBride et al. (1989) J. Biol Chem., 264, 1578-1583; Schnier et al. (1991)(효모); Sano, A. (1995) in Imahori, M. et al. (eds). Polyamines. Basic and Clinical Aspects. VNU Science Press, The Netherlands, 81-88(래트); Rmaudo & Park (1992) FASEB J., 6. A453(닭 태아): Pay et al. (1991) Plant Mot. Biol., 17. 927-929(알팔파): Wang et al. (200I) J. Biol. Chem., 276, 17541-17549(토마토).
다발성 골수종은 진행성(progressive)이며 골수 내의 악성 형질 세포(plasma세포)의 확장 및 골용해성 병변(osteolytic lesions)에 의해 특징지워지는 치명적 인 질환이다. 다발성 골수종은 치료 불가능하나 형질 세포의 암은 치료가능하다. 형질 세포는, 감염 및 질병에 대항하는데 도움을 주는 면역글로불린(항체)을 생산하는, 면역 체계에 중요한 일부분이다. 다발성 골수종은 골수 내에 존재하는 과도한 숫자의 비정상 형질 세포 및 온전한 단일클론 면역클로불린(IgG, IgA, IgD, 또는 IgE; "M-단백질") 또는 벤스-존스 단백질(유리 단일클론 경쇄)의 과생산으로 특징 지워진다. 저칼슘혈증, 빈혈, 신장 손상, 박테리아 감염에 대한 민감도의 증가, 및 정상 면역글로불린 생산의 손상은 여러 골수종의 공통적인 임상 소견(manifestations)이다. 여러 골수종은 종종 일반적으로 골반(pelvis), 척추, 갈비뼈, 및 두개골 내의, 미만성 골다공증(diffuse osteoporosis)에 의해 특징지어지기도 한다.
다발성 골수종의 경우에 관용적인 요법은 화학요법, 줄기 세포 이식, 줄기 세포 이식을 수반하는 고-용량 화학요법, 및 구제 요법(sa1vage therapy)를 포함한다. 화학요법은 Thalomid 탈리도미드), 보르테조미브, Aredia파미드로네이트), 스테로이드, 및 Zometa 조레드론산)을 이용한 처치를 포함한다. 그러나, 많은 화학요법 약물은 활발히 분열하는, 예컨대, 골수, 위 및 내장의 라이닝(lining) 및 모낭의 비-암성 세포에 유독하다. 따라서, 화학요법은 결국 혈액 세포 수의 감소, 구역질, 구토, 설사 및 탈모를 초래할 수 있다.
관용적인 화학요법, 또는 표준-용량 화학요법은 일반적으로 여러 골수종을 앓고 있는 환자에 대한 일차적 또는 초기 처치이다. 환자들은 또한 고-용량 화학요법 및 줄기 세포 이식을 위한 준비 시에 화학요법을 처치 받을 수 있다. 유발 요법(Induction therapy)(줄기 세포 이식 전의 관용적인 화학요법)은 이식이전에 종양 부피를 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 특정 화학요법 약물은 다른 것들보다 유발 요법에 더 적합할 수 있는데, 이는 상기 약물이 골수 세포에 덜 유독하고 그 결과 골수로부터 줄기 세포가 더 많이 생성되도록 하기 때문이다. 유발 요법에 적합한 화학요법 약물의 예는 덱사메타손, 탈리도미드/덱사메타손, VAD(빈크리스틴, Adriamycin독소루비신), 및 덱사메타손의 조합), 및DVd(페길화된 리포좀성 독소루비신(Doxil Caelyx, 빈크리스틴, 및 스케줄이 감소된 덱사메타손의 조합).
여러 골수종에 대한 표준 처치는 프레드니손(코르디토스테로이드 약물)과 조합된 멜팔란인데, 50%의 반응률(response rate)에 도달하게 한다. 불행하게도, 멜팔란은 알킬화 제제이며 유발 요법에 대한 적합성이 떨어진다. 코르티코스테로이드(특히 덱사메타손)는 때때로 여러 골수종 요법에서, 특히 고령 환자 및 화학요법을 견딜 수 없는 환자들에 대하여 단독으로 사용된다. 덱사메타손은 또한 유발 요법에서 단독으로 다른 제제들과 조합되어 사용된다. VAD는 가장 흔하게 사용되는 유발 치료제이나, DVd는 유발 요법에 효과적임이 최근에 밝혀졌다. 보그테조미브는 다발성 골수종을 위한 처치와 관련하여 최근에 승인되었으나 독성이 매우 강하다. 그러나, 기존 치료제들 중 어느 것도 완치에 대한 가능성을 제공하지 못하고 있다. 그리하여, 골수종 세포를 사멸시킬 수 있는 적당한 치료제에 대한 요구가 여전히 존재한다. 본 발명은 이러한 요구를 제공한다.
발명의 요약
본 발명은 암 세포 성장을 억제하고/하거나 암 세포를 사멸시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 전이할 수 있는 암 세포의 활성을 억제하거나 지연(slowing down)시키는 방법을 제공한다. 암 성장 억제는 종양 크기의 감소, 종양 성장의 감소를 포함하며, 종양의 완전한 관해(remission)를 포함할 수도 있다. 암은 대장암, 결장직장 선암(colorectal adenocarcinoma), 방광암, 자궁경부 선암, 및 폐암을 포함하나, 이에만 국한되는 것은 아닌, 임의의 암을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법은 상기 암을 지니고 있는 환자(포유동물, 바람직하게는, 인간)에게 eIF-5A, 바람직하게는 인간 eIF-5A1을 투여하는 것을 포함한다. eIF-5A1이 바람직하지만, eIF-5A2 아형도 사용될 수 있다. eIF-5A는 당분야에 공지된 임의의 적당한 방법에 의해 이것이 필요한 피검체에게 전달될 수 있다. 이것은 나출형(naked) DNA, 예컨대, 생물학적으로 적당한 매질 중의 DNA로서 운반될 수 있으며 IV 또는 피하 주입 또는 생물학적으로 적당한 임의의 기타 전달 메카니즘을 통해 전달될 수 있다. 대안적으로, eIF-5A은 아데노바이러스 벡터와 같은 벡터로 전달될 수 있다. 대안적으로, DNA는 리포좀 또는 표적 암 세포로의 DNA의 전달을 제공하는 임의의 다른 적당한 "담체"로 전달될 수 있다. eIF-5A는 또한 종양 부위에 직접적으로 전달될 수 있다. 당분야의 통상의 기술자는 eIF-5A의 전달을 위한 치료 섭생의 용량 및 기간을 결정할 수 있을 것이다.
eIF5A1 및 eIF-5A2가 공지되어 있으며 더 일찍 동시-출원된 특허출원, 예컨대, 09/909,796호(미국 특허 제 6,867,237호); 10/341,647호(등록결정됨): 10/200,148호; 10/277,969호; 10/383,614호; 10/792,893호; 11/287,460호; 10/861,980호; 11/134,445호; 11/184,982호; 11/293,391호; 60/749,604호; 및 60/795,168호에 소개되었는데, 상기 특허문헌 모두는 참고문헌으로써 본원에서 인용된다. eIF-5A는 종들 간에 고도로 보존되어 있기 때문에, eIF-5A 중 임의의 것(인간, 래트, 마우스, 개 등의 eIF-5A)이 본 발명에서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 인간 eIF-5A이 인간 등의 치료에 사용될 것이다. 돌연변이체가 eIF-5A의 발현을 상향-조절 또는 증가시킬 수 있고 그에 따라 암 세포의 성장을 억제하거나 암 세포를 사멸시키는 한, eIF-5A는 돌연변이 eIF-5A도 포함한다.
본 발명은 또한 eIF-5A1을 인코딩하는 뉴클레오티드를 상기 세포에 제공함으로써 세포 내의 MAPK/SAPK 신호전달 경로를 활성화시키는 방법을 제공한다. eIF-5A1 폴리뉴클레오티드 및 eIF-5A1 단백질은 위에 기재된 것과 같다.
본 발명은 또한 eIF5A를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 골수종 세포를 사멸시키는데 유용한 약제 조성물을 제공한다. eIF5A는 eIF5A1, eIF5A2 또는 돌연변이 eIF5A1일 수 있다. 바람직하게는, eIF5A는 eIF5A1이다. 조성물은 추가로 전달 운반체(vehicle)를 포함할 수 있다. 상기 전달 운반체는, 벡터, 플라스미드, 리포좀, 또는 덴드리머(dendrimer)일 수 있으나, 이에만 국한되는 것은 아니다.
본 발명은 또한 다발성 골수종을 지니는 피검체에서 다발성 골수종 세포를 사멸시키기 위한 약제를 제조하기 위한 eIF5A(바람직하게는, eIF5A1)의 용도를 제공한다.
본 발명은 추가로 eIF5A1을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 골수종 세포에 투여하는 단계를 포함하는 다수의 골주종 세포를 사멸시키는 방법을 제공하는데, 여기서 상기 조성물은 상기 다발성 골수종 세포를 사멸시킨다. eIF5A1은 돌연변이체일 수 있는데, 여기서 상기 돌연변이체는 보존된 리신이 또 다른 아미노산으로 변형되어 있으며 상기 돌연변이체는 하이푸신화화(hypusinated)될 수 없다. 치료 방법에 유용한 조성물은 본원에 소개된 것과 같다.
본 발명은 추가로 다발성 골수종 세포를 사멸시키는 방법을 제공하는데, 여기서 eIF-5A1에 대해 유발되는 siRNA를 포함하는 조성물이 eIF5A를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물과 더불어 제공된다. siRNA는 eIF-5A1의 내생성 발현을 하향-조절시키고, 그리하여 IL-6의 발현을 하향-조절시키는데, 이는 차례로 골수종 세포에서 아폽토시스를 유발시킨다. eIF-5A1 siRNA를 포함하는 조성물은 정맥내로 투여되거나 플라스미드, 벡터, 리포좀 또는 덴드리머와 같은 전달 운반체에 담겨서 투여될 수 있다.
진핵생물 번역 개시인자 5A1(eIF5A1)은 세포 증식에 관여하는 mRNA 서브세트들의 번역을 촉진하는 핵세포질성 왕복 단백질로서 기능하는 것으로 가정되었다. eIF5A1은 또한 아폽토시스의 조절자로서(Taylor et al., Invest Ophthalmol Vis Sci.; 45(10): 3568-76(2004)) 그리고 p53의 발현을 조절할 수 있는 프로-아폽토시스(pro-apoptotic) 단백질로서(Li et al. (2004). J Biol Chem.: 279: 49251-4925; 및 상기 문헌의 도 23) 확인되었다. 종양 억제 단백질 p53은 스트레스 및 DNA 손상에 반응하여 세포 주기 정지(arrest) 및 아폽토시스를 조절하는데 중심적인 역할을 한다. eIF5A1의 과발현이 암 세포에서 p53 발현을 상향-조절할 수 있을지라도(Li et al. (2004). J Biol Chem.: 279: 49251-4925; 및 상기 문헌의 도 23), eIF5A1의 과발현은 p53-결함 세포 계열에서의 아폽토시스를 유발할 수도 있다(테일러의 문헌[Taylor et al., (2006) Journal of Molecular and Cellular Bioiogy, Feb 9 2006 (유지 결정(decision pending)]은 eIF5A1 과발현이 다수의 메카니즘으로 아폽토시스를 유발한다는 것을 제시한다).
eIF5A1의 발현은 아폽토시스와 상호관련되어 있다. 토포이소머라제 억제자 악티노마이신 DFH 처리한 정상 대장 섬유아세포의 웨스턴 블랏(도 1A)은 eIF5A1 단백질 발현이 악티노마이신 D 처리의 개시 24시간 경과 후 p53과 함께 나란히 상향 조절된다는 것을 입증하였다. 산화질소(NO)-공여자, SNP에 대한 노출에 따른 결과로 일어나는 아폽토시스를 겪는 RKO 세포도 또한 eIF5A1 단백질 발현을 상향조절시킨다(도 1B). eIF5A1에 대한 RNA 전사체 수준은 이러한 조건 하에서 증가하지 아니하는데, 이는 eIF5A1 단백질이 mRNA의 전사후 조절의 결과로서 축적된다는 것을 제시한다(도 1A 및 1B). 이러한 결과는 eIF5A1가 유전자독성 스트레스 또는 산화질소로부터 기인한 아폽토시스에 관여할 수 있다는 것을 제시한다.
세포 증식에 있어서 eIF5A1의 필요는, DHS 및 DHH 억제자가 세포 주기 정지 및 아폽토시스를 유발한다는 결과 및 하이푸신화된 eIF5A1이 세포 성장을 지연시키는데 반드시 요구된다는 결론에 부분적으로 근거하여, 제안되었다. 그러나, siRNA의 사용을 통한 eIF5A1 발현의 특이적 억제가 세포 성장에 영향을 미치지 아니하였다는 것이 확인되었다. HT-29 세포에서 > 90%의 eIF5A1 발현의 억제는 5일 내내 세포 증식에 영향을 미치지 아니하였다(도 2A-F). 그러나, DKS 억제자 GC7는 이러한 세포의 성장에 심오한 영향을 미쳤다(도 2C). 이러한 결과들은 eIF5A1이 세포 성장에 필요하지 아니할 수 있다는 것을 제시한다. eIF5A1의 억제가 악티노마이신 D-유발성 세포독성으로부터 HT-29 세포를 부분적으로 보호할 수 있었다는 사실이 또한 흥미로운데, 이는 유전자독성 스트레스의 결과로 기인하는 아폽토시스에 eIF5A1가 관여한다는 것을 추가로 뒷받침한다.
아폽토시스로부터 세포를 보호하는 eIF5A1 siRNA의 활성은 p53 발현에 관한 eIF5A1 단백질 억제 효과에 대한 시험을 자극하였다. RKO 세포는 스트레스 조건하의 경우를 예외로 하고 축적되지 않는 기능적 p53 단백질이다. siRNA에 의한 eIF5A1의 억제는 악티노마이신 D 처리 24시간 경과 후, 69%까지 p53 단백질의 축적을 저해할 수 있었는데(도 3A 및 3B), 이는 eIF5A1이 유전자독성 스트레스를 받는 동안의 p53의 적절한 발현에 요구된다는 것을 제시한다. 상이한 서열을 갖는 eIF5A1에 대한 제 2 siRNA가 또한 악티노마이신 D에 반응하여 p53 상향조절을 막을 수 있었는데(도 8B), 이는 이러한 효과가 siRNA의 비-특이적 효과가 아니라는 것을 제시한다. 그러나, eIF5A1은 RKO 세포(기능성 p53과 함께) 및 RKO-E6 세포(기능성 p53 없이; 도 8A) 둘 모두에서 아폽토시스를 유발할 수 있었는데(도 4A 및 4B), 이는 eIF5A1이 또한 p53-비의존성 메카니즘에 의해 아폽토시스를 유발할 수 있다는 것을 제시한다.
하이푸신 변형{eIF5A1(K5OA)}에 필요한 보존된 리신(K)(위치 50) 내에 점 돌연변이를 포함하는 eIF5A1 또는 eIF5A1 중 어느 하나를 발현하는 아데노바이러스 컨스트럭트를 제작하였다. 점 돌연변이는 리신이 알라닌(A)이 되도록 유발되었다. 상기 둘 중 어느 한 컨스트럭트의 HT-29세포의 감염은 이러한 세포에서 아폽토시스를 유발하였고(도 50과 5D 및 도 6) 세포 생존율을 상당히 증가시켰다(도 5E). 2차원 겔 전기영동을 이용하여 어느 형태의 eIF5A1이 AdeIF5A1 또는 Ad-eIFA1(K50A)의 감염의 결과로서 축적되었는지를 결정하였다(도 5B). 예상한 바와 같이, Ad-eIF5A1(K5OA) 감염 후 비변형된 eIF5A1이 축적되었다. eIF5A1의 감염은 결과적으로 비변형 eIF5A1 및 데옥시하이푸신-변형 eIF5A1 둘 모두의 축적에 있어서 현저한 증가를 초래하였는데, 이는 바이러스에 의해 생성되는 대부분의 eIF5A1 단백질을 하이푸신화시키는데 DHS 및 DHH 활성이 불충분하였다는 것을 제시한다(도 5B). 이러한 결과들은 비변형된 eIF5A1 및 추정컨대, 데옥시하이푸신-변형 eIF5A1이 세포의 아폽토시스를 이끄는 형태임을 강하게 시사한다. 하이푸신화된 eIFA1이 이러한 활성을 공유하는지 여부는 아직 명확하지 않다.
eIF5A1에 대한 핵세포질 왕복 기능이 제안되었으나, eIF5A1은 세포질에서 우세하게 발현되는 것으로 보고되었다(Shi et al., Exp Cell Res., 225 348-356(1996b)). 핵세포질 왕복 단백질은 또한 핵내 위치화를 지닐 것으로 기대될 것이다. 아폽토시스가 일어나는 동안의 eIF5A1의 기능이 확인되었기 때문에, 아폽토시스가 일어나는 동안 변화하는 eIF5A1의 위치화가 연구되었다. 아폽토시스는 2개의 상이한 메카니즘, IFN-γ 및 TNF-α의 처리를 통한 사멸 수용체 활성화 및 악티노마이신 D의 처리를 통한 유전자독성 스트레스에 의해 HT-29 세포에서 유발되었다. 간접 면역형광은 eIF5A1 위치화가 비처리된, 성장 중인 세포에서 세포질에 존재한다는 것을 드러냈다(도 7). 그러나, 아폽토시스 자극제의 처리는 우세한 세포질 위치화로부터 우세한 핵 위치화로의 eIF5A1의 이동을 매우 빠르게 자극하였다(도 7A 및 7B). 이러한 eIF5A1 위치롸에서의 변이(shift)는 매우 빨리 발생하였는데, IFN-γ/TNF-α 처리 세포의 경우 10분 이내(도 7A), 및 악티노마이신 DFH 처리된 세포의 경우 90분 이내(도 7B)였다. 이러한 결과들은 eIF5A5가 사멸 수용체 활성화 및 유전자독성 스트레스 둘 모두에 의해 유발된 아폽토시스가 일어나는 동안 핵내 기능을 발휘한다는 것을 제시한다.
비변형, 데옥시하이푸신-변형, 또는 하이푸신-변형 형태 중 어느 것이 아폽토시스네 관여하는지 여부를 명확히 하기 위해, 아폽토시스가 발생하는 동안 축적되는 eIF5A1의 형태를 2-D 겔-전기영동분석으로 시험하였다. HT-29 세포는 악티노마이신 D(유전자독성 스트레스) 또는 Fas에 대한 작용제성 항체와 인큐베이션(사멸 수용체 경로) 둘 중 어느 한 자극으로 아폽토시스를 겪도록 유발하였다. 세포 용해물을 1 내지 24시간에 걸친 다양한 시점이 경과한 후 수집하였고 이후 2-D 겔 전기영동분석 및 eIF5A 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅으로 분석하였다(도 9). 비처리된 세포에서, eIF5A1 단백질은 하이푸신화된 형태로 우세하게 존재하였는데, 이는 문헌에 보고된 바와 합치하였다. 두 아폽토시스 유발자들은 하이푸신화된 eIF5A1 형태의 존재에 있어서 증가를 자극하였는데, 이는 처리 후 1시간 경과시 개시되어 처리 후 24시간 경과 후 사라졌다. 비변형된 eIF5A1의 축적은 또한 처리 2시간 경과 후에도 관찰되었다. 이러한 결과들은 데옥시하이푸신화되고/되거나 비변형된 eIF5A1가 아폽토시스를 조절하는데 관여한다는 사실과 일치한다.
아폽토시스를 유발하고 증식을 억제하는 eIF5A1, eIF5A(K50A){돌연변이 eIF5A1}, 및 eIF5A2의 활성을 다양한 암 세포주에서 시험하였다. eIF5A1 및 eIF5A(K50A) 둘 모두 대장암 세포주 HT-2V(도 5, 6, 및 10) 및 방광암 세포주 HTB-9(도 11)와 HTB-4(도 12)에서 아폽토시스를 유발할 수 있었다. 또한 eIF5A2를 발현하는 아데노바이러스의 감염은 방광암 세포주 HTB-9(도 11) 및 HTB-4(도 12)에서 아폽토시스를 유발할 수 있었다. Ad-eIF5A1, Ad-eIF5A1(K50A), 및 Ad-eIF5A2는 모두 방광암 세포주 HTB-4(도 13), HTB-9(도 14), J82 HTB-1(도 15), 및 UMUC-3(도 16)의 성장을 억제할 수 있었다. 이러한 바이러스 컨스트럭트들은 또한 HeLa 자궁경부 선암 세포(도 17)의 성장을 억제할 수 있었다. HTB-4 세포에서의 아폽토시스는 또한 Ad-eIF5A1, Ad-eIF5A1(K50A) 및 Ad-eIF5A2 감염에 대한 반응으로 PARP 절단에 의해 관찰되었다(도 18). 일반적으로 DNA 복구, DNA 안정도 및 기타 세포내 사건에 관여하는, PARP는 초기 아폽토시스가 일어나는 동안 카스파제 패밀리의 구성원에 의해 절단된다. PARP의 카스파제 절단의 검출은 아폽토시스의 증표가 되는 것으로 판단되어 왔다. Lazebnik Y, et al. Nature 371, 346-347(1994). 이러한 결과들은 eIF5A1 및 eIF5A2가 아폽토시스가 일어나는 동안 사실상 충분한 기능을 발휘할 수 있다는 것을 제시한다. 더욱이, eIF5A1로부터의 돌연변이는 다양한 세포주에서 성장을 지연시키고 아폽토시스를 유발할 수 있었다. 아폽토시스를 유발하는 야생형 eIF5A1(및 eIF5A2)의 활성은 DHS 및 DHH의 활성을 제한시킴으로 인하여 Ad-eIF5A1이 세포내로 도입될 때 일어나는 데옥시하이푸신화된 eIF5A1 및 비변형된 eIF5A1의 축적과 관련되어 있을 수 있다(도 5B.) 최근의 보고는 이종성 eIF5A1을 세포 내에서 하이푸신화된 형태로 과발현시키기 위해, DHS 및 DHH 둘 모두를 동일 세포에서 과발현되도록 하여야 했음을 보여주었다(Park et al., 2006, PNAS: 103(1); 51-56). 이러한 결과들은 세포 성장을 억제하는 DHS 및 DHH 억제자의 활성이 세포 증식에 요구되는 하이푸신화된 eIF5A1에서의 감소에 기인하지 아니할 수 있으며, 그 대신 비변형(DHS 억제자) 또는 데옥시하이푸신-변형(DHH 억제자) eIF5A1의 축적에 기인할 수 있다는 것을 제시한다. DHS가 특정 세포주 내에서 과발현된다는 것이 발견되었으며(Clement et al. 2006, FEBS. J; 273(6) 1102-14), DHS가 암 전이에 있어서 증폭된 유전자의 시그너처 세트 중 하나로서 확인되었다는데(Ramaswams et al., 2003. Nut Genet; 33. 49-54) 주목하는 것은 흥미롭다. 이러한 정보에 대한 한가지 가능한 해석은 특정 암 세포들은 비변형 또는 데옥시하이푸신트화된 eIF5A1(이는 세포가 아폽토시스를 겪게 될 때 축적되는 것으로 밝혀짐, 도 9를 참조)의 축적에 의해 촉발된 아폽토시스를 막기 위해 DHS를 과발현시킨다는 것이다. DHS에 의해서, 암 세포는 유전자독성 스트레스 및 기타 스트레스에 의해 유발된 아폽토시스를 하이푸신화하여 "안전한" 형태로 eIF5A1을 유지함으로써 감소시킬 수 있다.
eIF5A1의 과발현에 의해 어느 신호전달 경로가 영향을 받는지를 밝히기 위해, 미토젠 활성화 단백질 키나제(MARK)/스트레스 활성화 단백질 키나제(SAPK)[MARK/SAPK] 경로의 활성화를 A549 폐암 세포에서 Ad-eIF5A1 또는 Ad-eIF5A1(K50A) 감염에 대한 반응으로 시험하였다. 3가지 주요한 MAPK 경로는 ERK MAPK 경로, p38 MAPK 경로, 및 JNK SAPK 경로이다. ERK MAPK 경로는 주로 성장 호르몬 유사 상피세포 성장 인자(EGF)와 같은 미토겐 자극에 반응하여 촉발되며 광범위한 종양의 성장 및 생존을 지지한다. p38 MAPK 경로는 세포 스트레스, UV 광, 성장 인자 철수, 및 전-염증성(pro-infiammatory) 사이토카인에 반응하여 활성화된다. 인산화를 통한 p38의 활성화는 p53과 같은 전사 인자의 인산화를 유발하는데, 이는 차례로 p53의 활성 또는 안정도의 증가를 유발할 수 있다. p53의 활성화는 프로-아폽토시스와 항-아폽토시스 경로 두 경로뿐만 아니라, 염증에 관여한다. JNK SAPK 경로는 UV 광, DNA 손상 및 전-염증성 사이토카인을 포함하는 세포 스트레스에 대한 반응을 매개하며 그 결과 인산화 및 c-jun과 같은 전사 인자의 활성 증가를 초래한다. JNK 경로의 활성화는 성장, 변형 및 아폽토시스를 포함하는 수많은 세포내 반응을 유발할 수 있다. JMK 경로는 A549 세포에서 EGF-유발성 성장에 관한 주요한 이펙터(effector) 경로인 것으로 생각된다(Bost et al. 1997, JBC: 272:33422-33429). Ad-eIF5A1의 A549 세포로의 감염은 이러한 경로들 중 세 경로 모두의 활성화를 유발한다. EGF로 30분간 자극시킨 A549 세포에서 증가된 양의 Ad-eIF5A1의 감염은 ERK 및 이의 하류(downstream) 표적 p90RSK의 인산화/활성화를 증가시키는 결과를 초래하는 한편, 비인산화된 ERK의 양은 변화하지 않은 채 유지되었다(도 20). 인산화/활성화 p38 및 인산화/활성화 JNK의 강한 상향조절은 또한 용량 반응적인 방식으로 Ad-eIF5A1 감염에 반응한다는 것이 관찰되었다(도 20). Ad-eIF5A1 감염의 시간 경과는 ERK, p38, 및 JNK 경로의 활성화가 감염 후 24 내지 72시간 경과 후에 지속되었다는 것을 보여주었다(도 21). 비하이푸신화된 돌연변이 eIF5A1, Ad-eIF5A1(K50A)의 감염에 대한 반응에서 이들 경로의 용량-반응적 활성화가 확인되었다(도 22). MEKl 억제자, U1026을 사용한 ERK의 활성화 억제가 또한 JNK의 활성화를 억제시켰다는 것에 주목할 필요가 있는데(도 22), 이는 이들 세포에서, JNK가 ERK 활성화에 반응하여 활성화된다는 것을 확신시킨다(Bost et al. 1997. JBC: 272:33422-33429). 대조적으로, MEK1 억제자는 Ad-eIF5A1 또는 AdeIF5A1(KSOA) 감염에 반응하여 p53 활성화의 증가를 초래하였는데, 이는 ERK 경로의 활성화가 eIF5A1에 반응하여 p38 경로의 활성화를 음성적으로 조절한다는 것을 시사한다(도 22).
도 38은 A549 폐암 세포에서 MAPK/SAPK 경로 및 아폽토시스에 대한 eIF-5A1의 영향에 관한 가상 모델을 제공한다. eIF5A1(하이푸신화될 수 없는 야생형 또는 돌연변이)(K50A)의 과발현은 A549 세포에서 아폽토시스를 유발한다. eIF5A1의 과발현은 또한 p38, JNK, 및 ERK를 포함하는, MAPK/SAPK 경로의 증가를 수반한다. eIF5A1의 과발현은, p53의 안정도 및 활성의 증가와 관련이 있는 인산화된 형태의 P53의 증가를 포함하는, p53 단백질 수준의 증가를 유발한다. p53의 이러한 증가는 MEK/ERK 경로의 활성 및 p53 전사 활성에 좌우된다. 그러나, MEK/ERK 경로의 억제, 및 JNK 경로의 보다 적은 수준의 억제는 결과적으로 eIF5A1에 의해 유발된 아폽토시스의 의존성(potentiation)을 초래한다. 이러한 결과들은 eIF5A1이 암 세포에서의 아폽토시스를 유발하기 위하여 또한 MEK 억제자 부류에 속하는 항암제의 암 세포 사멸 활성을 증가시키기 위하여 치료제(therapeutic)로 사용될 수 있다는 것을 시사한다.
p53의 발현 및 인산화에 관한 Ad-eIF5A1 및 Ad-eIF5A1(KSOA)의 효과는 도 23에서 확인할 수 있다. 야생형 및 돌연변이 eIF5A1의 과발현은, 용량-반응적 방식으로, p53 단백질의 전반적인 발현에 있어서 증가를 가져왔다(도 23). 세린 46 상의 p53에서의 증가는 Ad-eIF5A1(K50A)를 위한 용량 반응성 방식으로 관찰된다. p53은 ATM, ATR 및 p38을 포함하는 여러 카나아제에 의해 세린 15에서 인산화될 수 있고, 이 변경은 MDM2의 능력을 줄여 p53을 결합하고 유비퀴틴화(ubiquination)를 위해 이를 표적하고, 이로써 p53의 축척 및 기능적 능력을 조장한다. p53는 PKC델타 및 p38를 포함하는 여러 키나아제에 의해 세린 46에서 인산화되고 이 변경은 프로-아폽토시스(pro-apoptotic) 프로모터를 위한 p53의 친화성을 증가시키고 p53-유발된 아폽토시스를 위해 중요한 것으로 간주된다.
종양의 내습 및 전이는 부착하는 이의 능력을 지니고, 주위 세포 밖 매트릭스를 분해하고, 제 2 부위에서 이주 및 증식하고, 마지막으로 증가된 성장을 지속하도록 신생혈관형성(혈관형성)을 증진시키는 종양 세포를 요구하는 복잡한 과정이다. 기초 막은 모든 기간을 둘러싸고 거대분자 및 세포들에 대한 장벽으로서 작용하는 세포외 매트릭스(extracellular 매트릭스: ECM)의 인접하는 시트이다. 종양 세포의 내습은 재구성된 ECM(MatrigelTM)으로 8 μm 막을 가진 트랜스웰을 코팅하고 화학주성 자극에 대한 반응으로 막의 다른 측면에 도달되고 이의 층을 통과할 수 있는 세포를 염색함에 의해 측정될 수 있다. A549 폐 암종 세포는 매우 내습성이고 ECM의 성분을 소화할 수 있는 젤라티나제인 매트릭스 금속 단백질 분해 효소와 같은 단백질을 분비할 수 있다. A549 세포의 내습성에서의 eIF5A1 과발현의 효과는 시험되었고, Ad-eIF5A1 또는 AdeIF5A1(K50A)의 감염은 코팅된 트랜스웰인 MatrigelTM를 통해 내습되는 세포의 수가 크게 감소되었다(도 24).
따라서 제공된 결과들은 eIF5A1로의 종양의 치료가 치료적 이점이 있을 수 있다는 가능성을 제안하였다. 따라서, 마우스에서의 실험적 전이의 모델을 사용하였다. 실험 II에서, 실험적 전이는 매우 내습성 마우스 흑색종 세포 라인 B16F10을 마우스에 주입함에 의해 개시되었다(일수 0). LacZ 유전자 (DNA 대조군) 또는 eIF5A1을 암호화하는 플라스미드 DNA는 2, 4, 7, 11, 16, 21, 26, 및 31일 날에 꼬리 정맥에 주입되었다. DNA의 세 개의 상이한 농도를 사용하였다: 1× (3.3 mg/kg), 0.1× (0.3 mg/kg), 및 2× (6.6 mg/kg). 마우스가 죽게 되는 경우에, 이 마우스들은 희생되고 폐들은 제거되고 사진을 찍었다(도 25). 종양 부하량(tumor burden)에서의 용량-반응성 감소는 마우스가 eIF5A1를 암호화하는 플라스미드 DNA로 치료되는 경우에 관찰된다(도 25 및 26). 비록 2× 용량이 1× 용량보다 덜 효과적인 것으로 드러나지만, 0.1× 용량과 1× 용량 사이에서 관찰되는 종양 부하량에서 큰 감소가 있었다. 거시적으로 성장하는 종양의 능력은 신혈관의 형성(혈관형성(angiogenesis))에 의존된다.
혈관 내피세포 성장 인자(Vascular endothelial growth factor: VEGF)는 많은 종양 세포에 의해 분비되고는 사이토카인이고, 종양 혈관형성을 증진하는데 있어서의 주요 인자이다. 실험 II에서 분리되는 B16F10-지닌 폐로부터의 세포 용해질은 ELISA에 의해 VEGF 발현을 위해 분석된다(도 27). eIF5A 플라스미드 DNA를 받은 마우스에 VEGF 수준에서의 큰, 용량-반응성 감소가 있었으며 이는 eIF5A1가 VEGF를 조절할 수 있음을 가리킨다.
실험 III에서, 꼬리 정맥 주입된 B16F10 세포를 사용하여 실험적 전이의 모델은 다시 사용되었지만, 이때 플라스미드 DNA는 혈청에서 DNA의 반감기를 증가시키기 위해 그리고 폐 종양으로 플라스미드의 섭취(uptake)를 증가시키기 위해 DOTAP으로 혼성화되었다. DNA/DOTAP 복합체의 주입은 7, 14 및 21일에 이뤄졌다. 마우스는 희생되었고 이때 이들은 죽게 되었고 폐는 제거되었고, 사진을 찍었다(도 28). LacZ 플라스미드 DNA/DOTAJP 복합체를 받은 마우스와 비교되는 때 eIF5A1 플라스미드 DNA/DOTAP 복합체(도 29)로 처리된 마우스에서의 폐 무게에서의 평균 60% 감소가 있었다.
eIF5A1 치료가 흑색종 종양에서의 세포 자멸을 유발하는지를 결정하기 위해, B16F0 또는 B16F10 피하조직 종양을 지닌 마우스는 Ad-eIF5A1으로 내부에 종양을 갖도록 주입되었다(실험 IV). 48 시간 후 종양을 제거하고, 파라핀으로 봉하고, 절개하였다. 이 절개된 조직의 TUNEL 얼룩은 Ad-eIF5A1가 종양 세포의 세포 자멸을 유발했음을 나타내었다(도 30). 실험 V는 세포 자멸을 유도하는 내부에 종양을 지니도록 주입된 Ad-eIF5A1의 능력이 피하조직 B16F10 종양의 감소된 종양 성장의 결과를 가져오고 생존을 증가시키는지를 결정하도록 고안되었다. B16F10 세포는 C57BL/6 마우스의 옆구리 속으로 피하조직으로 주입되었다. 종양이 약 8 mm의 직경에 도달하는 경우에, 이들은 Ad-LacZ, AdeIF5A1, 또는 버퍼로 내부에 종양을 갖도록 주입된다. 주입은 매일 총 3일 동안 그 다음 그 다음날 종양이 15 또는 16 mm 직경이 될 때까지 반복되었고, 이 지점에서 마우스는 희생되었다. 종양 크기를 매일 칼리퍼를 사용하여 측정하였고, 종양 부피를 어림잡기 위해 사용되었다. 종양 성장에서의 지체는 마우스가 AdeIF5A1로 처리되는 때에 명백히 관찰되었다(도 31). 버퍼가 유일하게 주입된 마우스는 치료의 개시 후 최대 4 내지 6일을 살았으며, 한편 Ad-LacZ를 단지 주입받은 마우스는 치료를 시작한 후 4일 더 살아남았다(도 32). Ad-eIF5A1를 주입받은 마우스는 치료 후 8일 이상 살았고 치료 후 25일정도 생존하였으며, 이는 AdeIF5A1로 치료는 종양을 지닌 마우스의 생존에서의 큰 개선의 결과를 가져올 수 있음을 증명하고 있다(도 32).
따라서, 본 발명은 암 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 전이하는 암 세포의 능력을 억제하거나 느리게 하는 방법을 제공한다. 암 성장을 억제하는 것은 종양의 크기에서의 감소, 종양의 성장에서의 감소를 포함하고, 종양의 완전한 회복을 포함할 수 있다. 암 성장을 억제하는 것은 또한 암 세포를 죽이는 것을 의미한다. 암은 임의의 암 또는 종양일 수 있으며, 결장암, 직장 샘암종, 방광 암종, 자궁경부 샘암종, 및 폐 암종를 포함하지만 이에 한정적인 것은 아니다.
본 발명의 방법은 상기 암을 지니는 환자(포유동물, 바람직하게는 인간)에 eIF-5A, 바람직하게는 인간 eIF-5A1, 바람직하게 eIF-5A1 수납 번호 NM 001970를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 투여를 포함한다. eIF-5A2 이소폼은 또한 사용될 수 있다. (즉 비록 eIF-5A1이 바람직하지만, 수납 번호 NM 020390). eIF-5A는 당분야에 알려진 임의의 적합한 방법에 의해 전달될 수 있다. 생물학적으로 적합한 나출형 DNA 예를 들어 배지에서의 DNA로서 운반될 수 있고, IV 또는 피하조직 주입을 통해 또는 임의의 다른 생물학적으로 적합한 운반 메카니즘을 통해 운반될 수 있다. 대안적으로, eIF-5A는 플라스미드, 백터 예를 들어 아데노바이러스 벡터 또는 임의의 적합한 발현 백터에서 운반될 수 있다.
대안적으로, DNA는 리포솜 및 표적 종양 또는 암 세포로 DNA (또는 플라스미드 또는 발현 벡터)의 운반을 위해 제공되는 임의의 다른 적합한 "담체" 또는 "운반체"에서 배달될 수 있다. 합성 DNA 운반 시스템의 재고를 위해 예를 들어 [Luo, Dan, et al., Nature Biotechnology, Vol. 18, January 2000, pp. 33-37] 참조된다. 비록 본 발명자들은 eIF-5A1이 정상 조직에 비독성임을 더욱 쉽게 증명하였지만(본원에 참조로서 그대로 통합되어 있는 계류중 출원 2005년 11월 28일에 출원된 제 11/293,391호를 참조), 운반 시스템(eIF5A 폴리뉴클레오티드/플라스미드/발현 벡터의 직접 투여에 비교하여)은 바람직하다. 바람직한 운반 시스템은 종양 또는 암 세포의 군에 유효량의 eIF-5A를 제공하고, 뿐만 아니라 바람직하게 암 세포의 군 또는 종양에 표적화된 운반을 제공한다. 따라서, 리포솜, 덴드리머 또는 유사한 비독성 나노-입자와 같은 나노미터 크기의 운반체를 경유하여 eIF-5A 뉴클레오티드/플라스미드/발현 벡터를 운반하는 것이 바람직하다. 추가로, 운반체는 바람직하게 미성숙 제거(premature clearance)로부터 또는 면역 반응을 일으키는 것으로부터 eIF-5A 뉴클레오티드/플라스미드/발현 벡터를 차단하며, 한편 종양 또는 세포의 군에 eIF-5A 뉴클레오티드/플라스미드/발현 벡터의 유효량을 운반한다. 예시적인 운반체는 특정 세포 수용체를 표적하기 위해 eIF-5A 뉴클레오티드/플라스미드/발현 벡터와 관련된 간단한 나노-입자로부터 이의 표면에 부착되어 있는 리간드를 지니는 페길레이트된(pegylated) 리포솜과 같은 더욱 복잡한 페길레이트된 운반체로의 범위일 수 있다.
리포솜 및 페길레이트된 리포솜은 당분야에 알려져 있다. 통상적 리포솜에서, 운반되는 분자(즉 작은 약, 단백질, 뉴클레오티드 또는 플라스미드)는 리포솜의 중심 동공 내에 포함된다. 당업자는 분자 운반에 유용한 표적된 "stealth," 및 양이온의 리포솜이 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, [Hortobagyi, Gabriel N., et al., J. Clinical Oncology, Vol. 19, Issue 14 (July) 2001:3422-3433 and Yu, Wei, et al., Nucleic Acids Research. 2004, 32(5);e48]가 참조된다. 리포솜은 정맥 내로 주입될 수 있고, 이들의 표면이 이중 층에 대해 (폴리에틸렌 글리콜("pegylated")을 첨가함에 의해) 더욱 친수성이 되도록 변경될 수 있으며, 이는 혈류에서의 이의 순환 시간을 증가시킨다. 이것들은 "stealth" 리포솜으로 알려져 있고 특히 독소루비신 및 미톡산트론와 같은 친수성(물 용해성) 항암제를 위한 담체로서 활용된다. 추가로 약 운반 리포솜의 종양 세포와 같은 표적 세포, 항체, 단백질, 펩티드 등과 같은 특정 분자에의 특정 결합 특성은 리포솜 표면에 부착될 수 있게 한다. 예를 들어, 암 세포에 존재하는 수용체에 대한 항체는 암 세포에 리포솜을 표적하기 위해 사용될 수 있다. 다발골수종을 표적하는 경우에, 엽산, II-6 또는 트랜스페린는 다발 골수종 세포에 리포솜을 표적하기 위해 사용될 수 있다.
덴드리머는 당분야에 또한 알려져 있고, 바람직한 운반 운반체를 제공한다. 예를 들어 덴드리머의 논의를 위해, [Marjoros, Istvan, J., et al, "PAMAM 덴드리머-Based Multifunctional Conjugate for Cancer Therapy: Synthesis, Characterization, and Functionality," Biomacromolecules, Vol. 7, No. 2, 2006; 572-579, and Majoros, Istvan J., et al., J. Med. Chem, 2005. 48, 5892-5899]가 참조된다.
eIF-5A는 또한 종양의 부위에 직접 운반될 수 있다. 당업자는 eIF-5A의 운반을 위한 치료 표본의 용량 및 길이를 결정할 수 있을 것이다.
본 발명의 또 다른 구체예는 다발 골수종 세포에서의 세포 사멸을 유도하는 방법을 제공한다. 다발골수종은 뼈 병변 및 종양 진행을 이끌 수 있는, 높은 수준의 염증성 사이토카인을 생산하는 한 타입의 골수 암이다. 사이토카인 IL-1B 및 IL-6은 골수종 세포를 위한 성장 요소로서 작용한다.
eIF-5A1를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 아데노바이러스 벡터 구조는 다발골수종 세포 라인, KAS 6/1 세포에 투여된다. KAS 6/1 세포 라인은 Mayo Clinic에서 만들어졌고, [Westendorf, J J., et al., Leukemia (1996) 10, 866-876]에 보고되어 있다. 세포 라인은 공격적인 다발골수종로 환자로부터의 분리물로부터 직접 만들어졌다. 본 발명자들은 eIF-5A를 함유하는 아데노바이러스 구조가 KAS 6/1 세포에 투여되는 경우에 대조군 벡터 단독으로(도 1에서 "CTL"로 나타내어짐) 치료되는 세포에 비해, 죽어가거나 죽은 세포(더 적게 보이는 암 세포를 남김)(도 41에서 "WT"로 나타내어짐)의 수의 증가가 있음을 보여주었다. 도 41 참조. 인자(Factor) 5A1로 치료되는 암 세포의 약 90%는 사멸되었고, 치료되지 않은 세포의 약 25%에 비교된다. 따라서, 본 발명의 한 구체예는 eIF-5A1의 발현을 상향 조절하고 다발골수종 세포를 죽도록 하는 eIF-5A1를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공함에 의해 골수종 세포를 사멸시키는 방법을 제공한다.
추가로, IL-6는 대조군("CTL+IL-6"로 나타내어짐) 및 eIF-5A 구조(도 41에서 "WT+11-6"로 나타내어짐)와 함께 투여된다. IL-6는 골수종 세포를 위한 성장 요소로서 작용하는 사이토카인이다. 이 결과는 IL-6이 eIF-5A 구조와 함께 투여될 때조차도, 세포 자멸에서의 증가가 여전히 달성됨을 보여준다. 도 41 참조. 이는 Factor 5A1가 골수종 세포를 사멸시킬 수 있을 뿐만 아니라 IL-6의 존재에서 골수종 세포를 제거할 수 있음을 보여준다. 이 발견은 덱사메타손와 같은 표준 치료로 IL-6의 존재에서 골수종 세포에서의 세포 자멸을 유도하는 것이 매우 어려움이 증명되고 있다는 점에서 흥미롭다.
추가로, 변이 eIF-5A(K50A)를 가진 아데노바이러스 구조(50 위치에서 보존된 라이신을 또 다른 아미노산으로 변화시키기 때문에 하이푸신화(Hypusine)될 수 없다)는 단독으로 ("MUT") 투여되거나 IL-6와 함께 ("MUT+IL-6") 투여되었다. 그 결과는 변이 eIF-5A1가 IL-6의 존재에서조차도, 대조군 세포에 비해 세포 자멸을 또한 증가시킬 수 있음을 보여준다. 도 41 참조. 따라서, 본 발명의 한 구체예는 변이 eIF-5A1를 투여함에 의해 골수종 세포를 사멸하는 방법을 제공하며, 상기 변이는 하이푸신화될 수 없다. 변이 eIF-5A1는 하이푸신화되지 않은 eIF-5A1의 발현에서의 증가를 가져오며, 이는 골수종 세포에서의 세포 사멸을 증가시킨다.
IL-6가 골수종 세포를 위한 성장 요소로서 작용하기 때문에, IL-6의 하향 조절 발현은 또한 골수종 세포를 사멸하는 방법을 제공할 것이다. 본 발명자들은 eIF-5A1에 대항하는 siRNA(siRNA 구조를 위해 도 43 및 46A 및 46B 참조)는 내인성 eIF-5A1의 발현을 하향 조절할 뿐만 아니라 여러 프로-염증성 사이토카인의 발현을 하향 조절한다. 따라서, 본 발명의 한 구체예는 세포 자멸-특이적 eIF-5A에 대항하는 siRNA를 투여함에 의해 골수종 세포를 사멸하는 방법을 제공하여 IL-1B의 내인성 발현을 하향 조절하며, 차례로 IL-6의 내인성 발현을 하향 조절하고, 이는 차례로 골수종 세포를 위한 성장 요소로서 작용하도록 IL-6를 덜 제공한다. IL-6의 발현을 하향 조절함에 의해, 골수종 세포의 계속되는 성장 및 생존을 위해 필요한 덜 IL-6의 이용가능성이 있다.
또 다른 구체예에서, eIF-5As를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 eIF-5A1에 대항하는 siRNA와 함께 골수종 세포에서 세포 자멸의 증가를 제공하도록 투여된다. eIF-5A1를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 아데노바이러스 벡터와 같은 벡터에서 바람직하게 투여될 수 있어서, siRNA는 외인성 eIF-5A1의 발현을 억제하지 않는다. 예를 들어, siRNA는 3' UTR을 표적하지만, 외인성 eIF5A1를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 전체 열린 리딩 프레임(open reading frame: ORF)을 포함하고, 따라서 siRNA에 의해 표적되는 3'UTR를 지니지 않는다. 적합한 siRNA 구조는 No. 11/287,460; 11/134,445; 11/184,982; 및 11/293,391에 이전에 기재되어 있으며, 이들은 본원에 그대로 참조로서 통합되어 있다. 또한 도 43 및 46A 및 46B를 참조한다. eIF-5A1는 골수종 세포에서 발현되고 세포 사멸을 이끈다. 추가로, eIF-5A1 siRNA는 eIF-5A의 내인성 발현의 발현을 감소하고, 이는 차례로 IL-6의 발현을 감소시키고, 차례로 골수종 세포에서의 세포 사멸을 증가시킨다. 이 방법에서, 상기 기재되어 있는 변이 eIF-5A는 벡터 구조에서 또한 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 다발골수종 세포를 사멸시키기는 조합 치료를 제공한다. eIF5A, 바람직하게 eIF5A1를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 표준 치료와 함께 투여될 수 있다. eIF5A 조성물은 통상 치료 전, 중 또는 후에 투여될 수 있다. eIF5A는 약제학적 조성물로서 투여될 수 있거나 상기 논의된 운반 운반체 내에서 투여될 수 있다.
도 1은 eIF5A1 발현이 유전독성(genotoxic) 스트레스 및 산화질소에 의해 증가됨을 나타낸다. A) 0, 1, 4, 8, 및 24시간 동안 0.5㎍/ml 악티노마이신 D을 처리한 정상 대장 섬유아세포에서의 eIF5A 발현에 대한 노던 블랏(상단 패널) 및 웨스턴 블랏(하단 패널) 분석. 웨스턴 블랏은 eIF5A, p53, 및 β-액틴에 대한 항체로 탐침(probing)되었다. B) 0, 2, 4, 8, 및 24시간 동안 3mM 니트로프루시드나트륨(sodium nitroprusside)을 처리한 RKO 세포에서의 eIF5A 발현에 대한 노던 블랏(상단 패널) 및 웨스턴 블랏(하단 패널) 분석. 웨스턴 블랏은 eIF5A 및 β-액틴에 대한 항체로 탐침되었다. RKO 세포는 유의한 수준으로 eIF5A2를 발현시키지 않는다. 더욱이 eIF-5A2는 크기에 있어서 eIF-5A보다 단지 아미노산 한 개가 더 길지만, SDS PAGE 겔 상에서 훨씬 더 높은 위치로 이동하므로, 만일 eIF5A2가 발현되었다면, eIF5A2는 eIF-5A1와는 별개의 밴드로서 확인될 수 있을 것이다.
도 2는 eIF5A1 발현의 억제가 CM 세포 증식에 영향을 미치지 않음을 나타낸다. A) eIF5A1 siRNA 또는 대조군 siRNA로 트랜스펙션시키고 72시간 경과 후 HT-29 세포로부터 분리된 세포 용해물의 웨스턴 블랏. 2개의 독립 실험으로부터의 웨스턴 블랏이 제시되어 있다. 블랏은 eIF5A 및 β-액틴에 대한 항체로 탐침되었다. B) eIF5A1 siRNA로 트랜스펙션된 세포의 대사 활성을 XTT 세포 증식 시험을 이용하여 측정하였다. HT-29 세포를 대조군 siRNA 또는 eIF5A1 siRNA로 트랜스펙션하기 24시간 전에 플레이트에 파종하였다. 트랜스펙션시키고 24시간 경과 후, 대사 활성을 측정하기 전에 48시간 동안 세포를 비처리하여 방치하거나 악티노마이신 D(1.O ㎍/㎖)을 처리하였다. 수치는 4회 반복 수행된 2개의 실험에 대한 평균이며 1로 설정된 0시 대조군에 대해 획득된 수치에 대해 표준화하였다. C) 대조군 또는 eIF5A1 siRNA로 트랜스펙션된 HT-29 세포의 증식 활성을 72시간 동안 50μM GC7와 함께 인큐베이션된 세포의 활성과 비교하였다. 세포 증식을 BrdU 통합으로 측정하였다. 수치는 평균 ± SE(n = 4)이며 1로 설정된 GC7(+) 혈청 샘플에 대한 수치에 대하여 표준화되었다. 별표(*)는 한 쌍의 스튜던트(paired Student) t-검정에 의해 상당히 상이한 것으로 고려되는 수치를 나타낸다(p < 0.01). 트랜스펙션 당일(0일)부터 트랜스펙션 후 5일까지의 대조군 siRNA 또는 eIF5A siRNA로 트랜스펙션된 HT-29 세포에 대한 D) XTT 및 E) BrdU 통합 세포 증식 시험. 0일째의 수치를 1로 설정하였다.
도 3은 eIF5A1이 악티노마이신 D에 반응하여 p53의 발현을 조절함을 나타낸다. RKO 세포를 대조군 siRNA(C) 또는 eIF5A siRNA(5A-1)로 트랙스펙션시켰다. 트랜스펙션 72시간 경과 후, 세포를 0, 4, 8, 또는 24시간 동안 0.5㎍/㎖ 악티노마이신 D로 처리하였다. A) eIF5A, p53, 또는 β-액틴에 대한 항체로 블랏팅시킨 세포 용해물에 대한 웨스턴 블랏. 결과는 3개의 독립 실험들을 나타낸다. B) 대응하는 액틴 밴드에 대해 표준화된 웨스턴 블랏에서의 p53의 상대적 강도에 대한 플 롯(plot). 수치는 최소 n = 3인 경우의 평균 ± SE이다.
도 4는 과발현된 인간 eIF5A1이 p53과 독립적으로 아폽토시스를 유발함을 나타낸다. RKO 세포(A) 또는 RKO-E6 세포(B)를 pHM6-LacZ, pHM6 eIF5A, 또는 pHM6-eIF5AΔ37(C-말단으로부터 절단된 37개 아미노산)으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 48시간 경과 후, 세포를 고정시키고 TUNBL 방법을 이용하여 라벨링하였다. 핵을 Hoescht 33258로 염색시키고, 라벨링된 세포를 형광 현미경으로 관찰하였다. 밝은 녹색으로 염색된 세포를 아폽토시스 세포로 계수하였다. Hoescht로 염색된 핵을 이용하여 총 세포 갯수를 측정하였다. 수치는 n = 4(A) 또는 n = 3(B)인 경우의 평균 ± SE이다. 별표(*)는 한쌍의 스튜던트 t-검정에 의한 대조군(pHM6-LacZ)과의 유의한 차이를 의미한다(p < 0.02). C) 0.5 ㎍/㎖ 악티노마이신 D로 처리한 후 0, 4, 8 및 24시에 수확된 RKO 및 RKO-F6 세포 용해물에 대한 웨스턴 블랏. p53 및 β-액틴에 대한 항체로 블랏을 탐침하였다.
도 5는 eIF5A1 아데노바이어스 컨스트럭트가 대장암 세포에서 아폽토시스를 유발함을 나타낸다. A) Ad-LacZ(L), AdeIF5A1(K50) 또는 AdcIF5A(K5OA)(K50A)로 감염시키고 72시간 경과 후 HT-2 세포로부터 분리된 세포 용해물에 대한 웨스턴 블랏. B) 72시간 동안 또는 아데노바이러스 컨스트럭트로 감염시키고 뒤이어 eIF5A에 대한 항체로 웨스턴 블랏을 실행하고 나서 72시간 동안 또는 GC7 또는 DFO로 처치한 후 HT-29 세포로부터 분리한 세포 용해물에 대한 3-D 겔 전기영동분석. 0.3㎍의 단백질이 분리되는 eIF5A를 과발현시키는 아데노바이러스로 감염된 세포로부터의 용해물을 제외하고 7㎍의 단백질을 분리하였다. C) 상단 패널: 아데노바이러스 컨스트럭트로 감염시키고 48시간경과 후 HT-29 세포에 대한 TUNEL 염색. 하단 패널: 동일 필드 내의 Hoechst로 염색된 세포의 핵. 모든 사진을 400 X 배율로 찍었다. 결과는 3개의 독립된 실험을 대표한다. D) 아데노바이러스 컨스트럭트로 감염되고 48시간 경과 후의 HT-29 세포의 아폽토시스 비율. 수치는 n = 3인 경우의 평균 ± SE이다. E) 아데노바이러스 컨스트럭트로 감염되고 7일 경과 후의 HT-29 세포에 대한 XTT 세포 증식 검정. 숯치는 n = 4인 경우의 평균 ± SE이다.
도 6은 eIFA1 아데노바이러스 컨스트럭트로 감염시킨 HT-29 세포에 대한 어넥신(Annexin V) 및 PI 염색을 도시한다. A) 아데노바이러스 컨스트럭트로 감염시키고 48시간 경과 후의 HT-29 세포에 대한 히스토그램 어넥센-FITC 및 요오드화프로피디움(propidium iodide, PI) 라벨링. B) 아데노바이러스 컨스트럭트로 감염시킨 후 또는 아폽토시스-유발제, 악티노마이신 D 또는 브레펠딘(Brefeldin) A를 처리한 후, 24시간, 48시간, 및 72시간 경과 후의 어넥신 V 라벨링 및 유세포 분석에 의하여 결정된, HT-29 세포의 아폽토시스 비율. 수치는 n =2 인 경우의 평균 ± SE이다(사건의 ＃ > 5000).
도 7은 eIFA1의 면역형광 위치화를 나타낸다. INF-γ 및 TNF-α(A) 또는 악티노마이신 D(B)로 자극시킨 eIF5A 단백질의 세포하 위치화를 직접 면역형광으로 측정하였다. Hoecnst 33258을 사용하여 핵을 염색하였다. A) HT -29 세포를 비처리하거나 0분, [(-) TNF-α], 10분, 또는 30분 동안 TNF-α로 자극하기 전에 16시간 동안 INF-γ로 프라이밍시켰다. 상단 패널: eIF5A1에 대한 면역형광 검출; 가운데 패널: 동일 필드 내의 세포에 대한 Hoechst-염색 핵; 하단 패널: 병합 이미지. B) HT-29 세포를 비처리하거나 악티노마이신 D로 0.5시간, 1.5시간, 또는 4시간 동안 처리하였다. 상단 패널: eIF5A1에 대한 면역형광 검출; 가운데 패널: 동일 필드 내의 세포에 대한 Hoechst-염색 핵; 하단 패널: 합병된 이미지. 모든 사진을 400 X 배율로 찍었다. 결과는 3개의 독립된 실험을 대표한다.
도 8은 eIF5A1이 악티노마이신 D에 반응하여 p53의 발현을 조절함을 나타낸다. RKO-E6 세포는 p53을 발현하지 아니한다. A) RKO 또는 RKP-E6 세포를 4, 8, 또는 24시간 동안 0.5㎍/㎖의 악티노마이신 D로 처리하였다. 세포 용해물을 수확하고 웨스턴 블랏팅을 이용하여 p53 발현에 대해 분석하였다. B) RKO 세포를 대조군 siRNA(C), eIF5A siRNA(5A-1) 또는 eIF5A의 다른 지역을 표적으로 삼는 제 2의 eIF5A siRNA(5A-2) 중 어느 하나로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 72시간 경과 후, 세포를 0, 4, 8, 또는 24시간 동안 0.5㎍/㎖의 악티노마이신 D로 처리하였다. A) eIF5A, p53, 또는 β-액틴에 대한 항체로 블랏팅된 세포 용해물에 대한 웨스턴 블랏. 결과는 3개의 독립된 실험을 대표한다.
도 9는 데옥시하이푸신화(deoxyhypusinated) eIF5A1이 아폽토시스가 진행되 는 동안 축적됨을 나타낸다. 상기 도면은 1 내지 24 시간에 이르는 시간 동안 악티노마이신 D(A) 또는 작용제(agonist) Fas 항체(B)로 처리하고 난 후 eIF5A에 대한 항체로 웨스턴 블랏팅을 실시한 후 HT-29 세포로부터 분리된 세포 용해물에 대한 2-D 전기영동분석을 제공한다.
도 10은 Ad-eIF5A1 또는 Ad-eIF5A1(K50A)(Ad-eIF5A1M)의 감염이 HT-29 결장직장 선암 세포에서 아폽토시스를 유발함을 나타낸다. 상기 도면은 아데노바이러스 컨스트럭트로 감염시킨 후 또는 아폽토시스-유발제인, 악티노마이신 D 또는 브레펠딘 A를 처리한 후, 24시간, 48시간, 및 72시간 경과 후의 어넥신 V 라벨링 및 유세포 분석기 분석에 의해 측정된, HT-29 세포의 아폽토시스 비율을 제공한다. 수치는 n = 2인 경우의 평균 ± SE이다(사건의 # > 5000).
도 11은 Ad-eIF5A1 또는 Ad-eIF5A2의 감염이 HT-29 방광 암 세포에서 아폽토시스를 유발함을 나타낸다. 상기 도면은 아데노바이러스 컨스트럭트로 감염시킨 후 또는 아폽토시스-유발제인, 악티노마이신 D 또는 브레펠딘 A를 처리한 후, 24시간, 48시간, 및 72시간 경과 후의 어넥신 V 라벨링 및 유세포 분석기 분석에 의해 측정된, HT-29 세포의 아폽토시스 비율을 제공한다. 수치는 n = 2인 경우의 평균 ± SE이다(사건의 # > 5000).
도 12는 Ad-eIF5A1 또는 Ad-eIF5A2 감염이 HTB-4 방광 암 세포에서 아폽토시 스를 유발함을 나타낸다. 상기 도면은 아데노바이러스 컨스트럭트로 감염시킨 후 또는 아폽토시스-유발제인, 악티노마이신 D 또는 브레펠딘 A를 처리한 후, 24시간, 48시간, 및 72시간 경과 후의 어넥신 V 라벨링 및 유세포 분석기 분석에 의해 측정된, HT-29 세포의 아폽토시스 비율을 제공한다. 수치는 n = 2인 경우의 평균 ± SE이다(사건의 # > 5000).
도 13은 Ad-eIF5A1, Ad-elF5A1(K50A){Ad-eIF5A1M}, 또는 Ad-eIF5A2의 감염이 HTB-4 방광 암 세포의 성장을 억제함을 나타낸다. 상기 도면은 아데노 바이러스 컨스트럭트 감염 24시간, 48시간, 및 72시간 경과 후의 HTB-4 세포의 XTT 세포 증식 시험 결과를 제공한다. 수치는 n = 2인 경우의 평균 ± SE이다.
도 14는 Ad-eIF5A1, Ad-elF5A1(K50A){Ad-eIF5A1M}, 또는 Ad-eIF5A2의 감염이 HTB-9 방광 암 세포의 성장을 억제함을 나타낸다. 상기 도면은 아데노 바이러스 컨스트럭트 감염 24시간, 48시간, 및 72시간 경과 후의 HTB-9 세포의 XTT 세포 증식 시험 결과를 제공한다. 수치는 n = 2인 경우의 평균 ± SE이다.
도 15는 Ad-eIF5A1, Ad-elF5A1(K50A){Ad-eIF5A1M}, 또는 Ad-eIF5A2의 감염이 HTB-1 방광 암 세포의 성장을 억제함을 나타낸다. 상기 도면은 아데노 바이러스 컨스트럭트 감염 24시간, 48시간, 및 72시간 경과 후의 HTB-1 세포의 XTT 세포 증식 시험 결과를 제공한다. 수치는 n = 2인 경우의 평균 ± SE이다.
도 16은 Ad-eIF5A1, Ad-elF5A1(K50A){Ad-eIF5A1M}, 또는 Ad-eIF5A2의 감염이 UMUC-3 방광암 세포의 성장을 억제함을 나타낸다. 상기 도면은 아데노 바이러스 컨스트럭트 감염 24시간, 48시간, 및 72시간 경과 후의 UMUC-3세포의 XTT 세포 증식 시험 결과를 제공한다. 수치는 n = 2인 경우의 평균 ± SE이다.
도 17은 Ad-eIF5A1, Ad-elF5A1(K50A){Ad-eIF5A1M}, 또는 Ad-eIF5A2의 감염이 HeLa 자궁경부 선암 세포의 성장을 억제함을 나타낸다. 상기 도면은 아데노 바이러스 컨스트럭트 감염 24시간, 48시간, 및 72시간 경과 후의 HeLa 세포의 XTT 세포 증식 시험 결과를 제공한다. 수치는 n = 2인 경우의 평균 ± SE이다.
도 18은 Ad-eIF5A1, Ad-elF5A1(K50A){Ad-eIF5A1M}, 또는 Ad-eIF5A2의 감염이 HTB-4 세포에서 PARP 절단을 유발함을 나타낸다. 상기 도면은 아데노바이러스 컨스트럭트로 감염시키고 나서 48시간 또는 72시간 경과 후에 PARP, eIF5A 및β-액틴 항체를 사용하여 HTB-4로부터 분리된 세포 용해물의 웨스턴 블랏 결과를 제공한다.
도 19는 Ad-eIF5A1, Ad-elF5A1(K50A){Ad-eIF5A1M}, 또는 Ad-eIF5A2의 감염이 HTB-1 세포에서 PARP 절단을 유발함을 나타낸다. 상기 도면은 아데노바이러스 컨스트럭트로 감염시키고 나서 48시간 또는 72시간 경과 후에 PARP, eIF5A 및β-액틴 항체를 사용하여 HTB-1으로부터 분리된 세포 용해물의 웨스턴 블랏 결과를 제공한 다.
도 20은 A549 폐암 세포에서 eIF5A1의 과발현이 MAPK/SAPK 신호전달 경로를 활성화시킴을 나타낸다. A549 세포에 Ad-eIF5A1(5A)를 증가된 다중감염도(multiplicities of infection, MOI)로 감염시켰다. 비교를 위하여 세포에 Ad-LacZ(Lac)를 감염시켰다. 감염 48시간 경과 후, 세포에 EGF를 30분 동안 처리하였으며, 웨스턴 블랏 분석을 위해 세포 용해물을 수확하였다.
도 21은 A549 폐암 세포에서 eIF5A1의 과발현이 MAPK/SAPK 신호전달 경로를 활성화시킴을 나타낸다. A549 세포에 Ad-eIF5A1(5A) 또는 Ad-LacZ(L)를 50 MOI로 감염시켰다. 비교를 위하여 세포에 Ad-LacZ(Lac)를 감염시켰다. 감염 6, 24, 48, 또는 72시간 경과 후, 세포에 EGF를 30분 동안 처리하였으며, 웨스턴 블랏 분석을 위해 세포 용해물을 수확하였다.
도 22는 하이푸신화될 수 없는 돌연변이 eIF5A1의 과발현이 MAPK/SAPK 신호전달 경로를 활성화시킴을 나타낸다. A549 세포에 AdeIF5A1(K50A)(M)을 증가된 다중감염도로 감염시켰다. 비교를 위하여 세포에 AddF5A1(5A) 및 Ad-LacZ(Lac)를 감염시켰다. 세포를 MEK 억제자 U1026과 함께 또는 상기 U1026 없이 인큐베이션하였다. 감염 48시간 경과 후, 세포에 EGF를 30분 동안 처리하였으며, 웨스턴 블랏 분석을 위해 세포 용해물을 수확하였다.
도 23은 A549 폐암 세포에서 eIF5A1 또는 돌연변이 eIF5A1(K50A)의 과발현이 p53의 발현을 증가시킴을 나타낸다. A549 세포에 Ad-eIF5A1(5A) 또는 Ad-eIF5A1(K50A)(M)을 증가된 다중감염도로 감염시켰다. 비교를 위하여 세포에 Ad-LacZ(Lac)를 감염시켰다. 세포를 MEK 억제자 U1026와 함께 또는 상기 U1026 없이 인큐베이션하였다. 감염 48시간 경과 후, 세포에 EGF를 30분 동안 처리하였으며, 웨스턴 블랏 분석을 위해 세포 용해물을 수확하였다.
도 24는 eIF5A1 또는 돌연변이 eIF5A1(K50A)의 과발현이 마트리겔(MatrigelTM) 세포외 매트릭스를 통해 침습할 수 있는 A549 폐암 세포의 능력을 감소시킴을 나타낸다. 아데노바이러스 컨스트럭트로 감염시키고 나서 24시간 경과 후, A549 세포를 무혈청 배지 안의 마트리겔(MatrigelTM)-코팅된 트랜스웰(tanswells) 상에 파종하였다. 화학주성인자(chemoattractant)로서 역할할 수 있도록 하단에 혈청-함유 배지를 잘 배치하였다. 플레이팅하고 나서 24시간 경과 후, 상기 트랜스웰의 하단 표면을 통해 침습된 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하였고 필드 당 평균 세포 갯수를 광 현미경 하에서 세포를 계수함으로써 측정하였다. 표본 당 최소 6개의 필드를 계수하였다.
도 25는 실험 II의 결과를 제시한다: 폐 종양 부하(Lung tumor load)는 B16F10를 지니는 C57BL6 마우스에서 eIF5A1에 의해 상당히 감소되었다. 200,000개 의 B16F10 세포를 6주령 C57BL6 마우스의 꼬리 정맥을 통해 주입하였다. LacZ 유전자(DNA 대조군으로써) 또는 eIF5A1 중 어느 하나를 포함하는 플라스미드 DNA를 2, 4, 7, 11, 16, 21, 26, 및 31일에 꼬리 정맥을 통해 주입하였다. 3가지 상이한 농도의 DNA를 사용하였다: 1X(3.3mg/kg), 0.1X(0.3mg/kg), 2X(6.6mmg/kg). B16F10 세포 대신에 PBS를 투여받은 마우스를 음성 대조군으로 사용하였으며, 한편 PBS 보다는 플라스미드 DNA를 투여받은 B16F10를 지니는 마우스를 양성 대조군으로 사용하였다. 마우스가 빈사상태가 되었을 때, 마우스를 절명시키고 폐를 절제해 내고 사진을 찍었다.
도 26은 실험 II의 결과를 제시한다: 폐 중량은 B16F10를 지니는 C57BL6 마우스에서 eIF5A1에 의해 상당히 감소되었다. 200,000개의 B16F10 세포를 6주령 C57BL6 마우스의 꼬리 정맥을 통해 주입하였다. LacZ 유전자(DNA 대조군으로써) 또는 eIF5A1 중 어느 하나를 포함하는 플라스미드 DNA를 2, 4, 7, 11, 16, 21, 26, 및 31일에 꼬리 정맥을 통해 주입하였다. 3가지 상이한 농도의 DNA를 사용하였다: 1X(3.3mg/kg), 0.1X(0.3mg/kg), 2X(6.6mmg/kg). B16F10 세포 대신에 PBS를 투여받은 마우스를 음성 대조군으로 사용하였으며, 한편 PBS 보다는 플라스미드 DNA를 투여받은 B16F10를 지니는 마우스를 양성 대조군으로 사용하였다. 마우스가 빈사상태가 되었을 때, 마우스를 절명시키고 폐를 적출해 내고 무게를 측정하였다.
도 27은 실험 II의 결과를 제시한다: VEGF 발현은 B16F10를 지니는 C57BL6 마우스에서 eIF5A1에 의해 상당히 감소되었다. 200,000개의 B16F10 세포를 6주령 C57BL6 마우스의 꼬리 정맥을 통해 주입하였다. LacZ 유전자(DNA 대조군으로써) 또는 eIF5A1 중 어느 하나를 포함하는 플라스미드 DNA를 2, 4, 7, 11, 16, 21, 26, 및 31일에 꼬리 정맥을 통해 주입하였다. 3가지 상이한 농도의 DNA를 사용하였다: 1X(3.3mg/kg), 0.1X(0.3mg/kg), 2X(6.6mmg/kg). B16F10 세포 대신에 PBS를 투여받은 마우스를 음성 대조군으로 사용하였으며, 한편 PBS 보다는 플라스미드 DNA를 투여받은 B16F10를 지니는 마우스를 양성 대조군으로 사용하였다. 마우스가 빈사상태가 되었을 때, 마우스를 절명시키고 폐를 적출해 내고 무게를 측정하였다. 일단 폐 무게를 측정하고 나서, 폐를 동결시키고 추후 VEGF ELISA에 사용하였다. 폐 조직을 용해 완충액 중에서 분쇄하고 용해물 중에 존재하는 VEGF의 양을 ELISA로 측정하였다.
도 28은 실험 III의 결과를 제시한다: eIF51 유전자 요법의 항-종양 효능은 DOTAP와 복합체를 형성한 DNA에 의해 개선되었다. 50,000개의 B16F10 세포를 6주령 C57BL6 마우스의 꼬리 정맥을 통해 주입하였다(0일). 7, 14 및 21일에 꼬리 정맥을 통해 주입하기 전에 LacZ 유전자(DNA 대조군으로써) 또는 eIF51 중 어느 하나를 포함하는 플라스미드 DNA가 DOTAP와 복합체를 형성하도록 하였다. 플라스미드 DNA 없이 DOTAP의 주입을 투여받은 무종양 마우스를 DOTAP의 효과에 대한 대조군으로 사용하였다. 마우스를 25일째에 절명시키고 폐를 적출해내고 사진을 찍었다.
도 29는 실험 III의 결과를 제시한다: eIF51 유전자 요법의 항-종양 효능은 DOTAP와 복합체를 형성한 DNA에 개선되었다. 50,000개의 B16F10 세포를 6주령 C57BL6 마우스의 꼬리 정맥을 통해 주입하였다(0일). 7, 14 및 21일에 꼬리 정맥을 통해 주입하기 전에 LacZ 유전자(DNA 대조군으로써) 또는 eIF51 중 어느 하나를 포함하는 플라스미드 DNA가 DOTAP와 복합체를 형성하도록 하였다. 플라스미드 DNA 없이 DOTAP의 주입을 투여받은 무종양 마우스를 DOTAP의 효과에 대한 대조군으로 사용하였다. 마우스를 25일째에 절명시키고 폐를 적출해내고 무게를 계량하였다.
도 30은 실험 IV의 결과를 보여준다: Ad-eIF5A1 주입은 B16F0 및 B16F16 종양에서 아폽토시스를 유발한다. 50,000개의 B16F10 세포를 피하주사로 C57BL6 마우스의 오른쪽 옆구리에 주입하였다. 종양의 직경이 약 4㎜에 도달하였을 때(B16 세포 주입 후 10-12일째), 50 ㎕의 PBS 중의 1×109 pfu Ad-5A1을 종양에 주입하였다. 마우스를 48시간 후 절명시키고 종양을 절제, 고정 및 파라핀에서 함몰시켰다. 각 세포 종양 유영의 2개 부분을(Ad-5A1-1 및 Ad-5A1-2) 제조업자의 프로토콜에 따라서 TUNEL(Promega)로 염색시켰다. TULE 반응으로부터 나온 TdT 효소가 잔류하고 있는 음성 대조군 슬라이드((Ad-5A1-neg)는 각 세포 유형에 대해 포함되었다.
도 31은 실험 V의 결과를 보여준다: 종양 성장이 Ad-eIF5A1의 감염에 의해 상당히 지연되었다. 피하 B16-F10을 지니는 C57BL/6에 1 X 109 pfu의 Ad-eIF5A1 또는 Ad-LacZ 또는 동일 부피의 완충액을 주입하였다. 종양의 직경이 대략 8㎜에 도 달되었을 때 제1일째 처치를 개시하였고 0일로 지정하였다. 처음 3일 동안 매일 마우스에게 주입하고 나서 그 후 마우스를 절명시킬 때까지 이틀에 한번 주입하였다. 1차원적으로 종양 크기가 15 내지 16㎜를 초과되었을 때, 마우스를 절명시켰다. 각 그룹에는 3마리의 마우스가 있었다. 그룹 1 마우스(l-1, 1-2, 1-3)를 Ad-eIF5A1으로 처리하였으며, 그룹 2 마우스(2-1, 2-2, 2-3)를 Ad-LacZ로 처리하였고, 그룹 3 마우스(3-1, 3-2, 3-3)에게 완충액만을 주입하였다. 종양 크기를 캘리퍼스를 이용하여 매일 측정하였고 종양 부피를 평가하는데 사용하였다.
도 32는 실험 V의 결과를 보여준다: 생존이 Ad-eIF5A1의 감염에 의해 상당히 지연되었다. 피하 B16-F10을 지니는 C57BL/6에 1×109 pfu의 Ad-eIF5A1 또는 Ad-LacZ 또는 동일 부피의 완충액을 주입하였다. 종양의 직경이 대략 8㎜에 도달되었을 때, 1일째 처치를 개시하였고 0일로 지정하였다. 처음 3일 동안 매일 마우스에게 주입하고 나서 그 후 마우스를 절명시킬 때까지 이틀에 한번 주입하였다. 일 차원적으로 종양 크기가 15 내지 16㎜를 초과되었을 때, 마우스를 절명시켰다. 각 그룹에는 3마리의 마우스가 있었다. 그룹 1 마우스(l-1, 1-2, 1-3)를 Ad-eIF5A1으로 처리하였으며, 그룹 2 마우스(2-1, 2-2, 2-3)를 Ad-LacZ로 처리하였고, 그룹 3 마우스(3- 1, 3-2, 3-3)에게 완충액만을 주입하였다.
도 33은 eIF-5A1이 A549 폐암 세포에서 p53 종양 억제 단백질의 축적 및 인 산화를 증가시킨다는 것을 보여준다.
도 34는 eIF-5A1이 A549 폐암 세포에서 p53 mRNA 수준을 증가시킨다는 것을 보여준다.
도 35은 p53 수준의 증가가 eIF-5A1이 A549 폐암 세포에서 p53 전사 활성에 의존적이라는 것을 보여준다.
도 36은 TNFR1 mRNA 수준이 A549 폐암 세포에서 eIF-5A1의 감염으로 상향조절된다는 것을 보여준다.
도 37은 eIF-5A1이 A549 폐암 세포에서 아폽토시스를 유발하였으며 MEK 억제자의 사용은 eIF-5A1에 의해 유발된 아폽토시스의 양을 증가시킨다는 것을 보여준다.
도 38은 eIF-5A1의 가상 모델이 MAPK/SAPK 경로 및 A549 폐암 세포에서 아폽토시스에 영향을 미친다는 것을 보여준다.
도 39는 eIF-5A1이 종양 성장의 억제에 있어서 eIF-5A2보다 낫다는 것을 보여준다(마우스 이종이식 모델(B16-F0 흑색종 세포)에서).
도 40은 eIF-5A1이 마우스의 연장된 생존에 있어서 eIF-5A2보다 낫다는 것을 보여준다(마우스 이종이식 모델(B16-F0 흑색종 세포)에서).
도 41은 eIF-5A가 IL-6를 지니거나 지니지 아니하는 대조군으로 처리된 세포와 비교하여 사멸되었거나 사멸 중인 세포의 갯수를 증가시킨다는 것을 보여준다. IL-6를 지니거나 지니지 아니하는 대조군으로 처리된 세포와 비교하여 도 42는 eIF-5A2의 서열을 제공한다.
도 43은 eIF-5A1 siRNA의 위치 및 서열을 제공한다.
도 44는 인간 eIF-5A1와 인간 eIF-5A2의 뉴클레오티드 정렬을 제공한다.
도 45는 인간 eIF-5A1와 인간 eIF-5A2의 아미노산 정렬을 제공한다.
도 46A 및 46B는 eIF-5A1 siRNA의 위치 및 서열을 제공한다.
실시예 1: 시험관내 실험에서
화학물질( Chemicals )
N1-구아닐-1,7-디아미노헵탄(GC7; Biosearch Technologies), DHS의 억제자를 50 μM의 농도에서 사용하였다. 액티노미신 D(Calbiochem)를 0.5 또는 1.0 μg/ml에서 사용하였다. 소듐 니트로프루사이드 및 데스페리옥사민을 시그마로부터 구입하였고, 각각 3 mM 및 500 μM의 농도에서 사용하였다. 브레펠딘 A를 시그마로부터 또한 얻었고 4 nM의 농도에서 사용하였다.
세포 배양 및 치료
인간 콜론 샘암종 세포 라인, HT-29은 세포 증식 및 eIF5A 국소 연구를 위해 사용되었고, Anita Antes(뉴저지의 University of Medicine and Dentistry)로부터의 호의적 선물이었다. HT-29 세포를 1 mM 소듐 피루베이트, 10 mM HEPES, 및 10% (FBS: 치명적 소의 세럼)으로 보충된 RPMI 1640에서 유지시켰다. 모든 다른 세포 라인을 "American Type Culture Collection"으로부터 수득하였다. CCD112Co은 정상 콜론 섬유아세포 세포 라인이다. RKO는 와일드 타입 p53을 함유하는 인간 직장 암종 세포 라인 (CRL-2577)이다. RKO-E6 세포 라인(CRL-2578)을 RKO 세포 라인으로부터 얻었다. 이는 안정적으로 통합된 인간 유두종 바이러스 E6 암유전자를 함유하고 그래서 상당한 기능적 p53 종양 억제자 단백질이 부족하다. RKO, RKO-E6, A549, 및 세포 라인 CCD112Co를 2 mM L-글루타민을 가진 'Modified Eagle Minimum Essential Medium' 및 1.5 g/L 중탄산나트륨, 0.1 mM 비본질적 아미노산, 1 mM 피루브산나트 륨을 함유하도록 조절되어 있는 'Earle's Balanced Salt Solution'에서 성장시켰고, 10% FBS로 보충시켰다. 세포를 5% CO2를 함유하는 습윤화된 환경에서 37℃에서 유지시켰다.
플라스미드의 클로닝 및 구조
인간 eIF5A를 부착성 세포를 위한 생산사자의 프로토콜에 따라 젠엘루트(GenElute) 포유류 RNA 미니프렙 키트(Sigma)를 사용하여 RKO 세포로부터 분리된 총 RNA로부터 RT-PCR에 의해 클로닝하였다. 사용되는 프라이머는 정방향, 5'-CGAGTTGGAATCGAAGCCTC-3'이고 역방향 5'-GGTTCAGAGGATCACTGCTG-3이다. 그 결과 532 염기 쌍 생성물을 pGEM-T Easy(Promega)로 하위복제하였고, 서열화하였다. 그 결과 얻은 플라스미드를 프라이머를 사용하여 PCR을 위해 모형으로서 사용하였다: 정방향, 5'-GCCAAGCTTAATGGCAGATGATTTGG-3'; 및 역방향, 5'-CCTGAATTCCAGTTATTTTGCCATGG-3', 및 PCR 생성물을 pHM6(hemagglutinin [HA] tagged; Roche Molecular Biochemicals)의 HindIII 및 EcoRI 사이트로 하부복제하여 pHM6-eIF5A 벡터를 생성하였다. eIF5A(pHM6-eIF5AA37)의 C-말단 절단된 구조를 하기 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 생성하였다: 앞쪽으로 5'-GCCAAGCTTAATGGCAGATGATTTGG-3'; 및 역방향, 5'-GCCGAATTCTCCCTCAGGCAGAGAAG-3'. 그 결과 얻은 PCR 생성물을 pHM6 벡터로 하부복제된다. pHM6-LacZ 벡터(Roche Molecular Biochemicals)를 세포자멸 트랜스펙션의 효과를 위해 대조군으로서 그리고 트랜스펙션을 최적화하기 위해 사용하였다.
노던 블로팅
RKO 세포를 6-웰 플레이트에서 합류점(confluence)으로 성장시켰고, 1.0 μg/ml 액티노미신 D으로 0, 1, 4, 또는 8 시간 동안 처리하였다. 총 RNA를 젠엘루트 맘말리안(GenElute Mammalian) RNA 미니프렙 키트(Sigma)를 사용하여 세포로부터 분리하였고, 5 μg의 RNA를 1.2% 아가로즈/포름알데히드 젤에서 분획시켰다. 막을 확립된 방법에 따라 eIF5A의 3'-번역되지 않은 영역(3'-UTR)과 동종인 32P-라벨화된 cDNA로 탐침시켰다. 노던 블로팅을 위해 사용되는 eIF5A 3'-UTR cDNA를 하기 프라이머를 사용하여 RKO 세포로부터 RT-PCR에 의해 클로닝하였다: 정방향, 5'-GAGGAATTCGCTGTTGCAATCAAGGC-3'; 및 역방향, 5'-TTTAAGCTTTGTGTCGGGGAGAGAGC-3'. 노던 블로팅을 위해 로딩 대조군으로서 사용되는 β-액틴 cDNA를 하기 프라이머를 사용하여 RT-PCR에 의해 클로닝하였다: 정방향, 5'-GATGATATCGCCGCGCTCGT-3'; 및 역방향, 5'-GTAGATGGGCACAGTGTGGGTG-3'.
플라스미드의 트랜스펙션 및 세포 자멸의 탐지
RKO 및 RKO-E6 세포를 제조자의 추천 프로토콜에 따라 리포펙타민(Lipofectamine) 2000(Invitrogen)을 사용하여 플라스미드 DNA로 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후 48 시간, 분절된 DNA를 함유하는 아폽프토틱(apoptotic) 세포를 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소-매개된 dUTP-디곡시제닌 닉 말단 라벨링(TUNEL)에 의해 제조자의 프로토콜에 따라 DNA 프라그멘테이션 디텍 션 키트(Fragmentation Detection Kit)(Oncogene Research Products)를 사용하여 탐지하였다. 형광 현미경 검사 분석을 위해 세포를 8-웰 배양 슬라이드에서 트랜스펙션하였고, 4% 포름알데히드로 고정시켰고, 그 다음에 TUNEL에 의해 라벨하였고 [Taylor et al. (2004)]에 의해 기재되어 있는 방법에 따라 호데스쉬트(Hoescht) 33258로 착색시켰다.
siRNA 의 트랜스펙션
모든 siRNA를 다르마콘(Dharmacon)으로부터 얻었다. eIF5A mRNA(Accession No. BC085015)의 3'UTR를 표적하는 eIF5A siRNA는 하기 서열을 지녔다: 센스 가닥, 5'-GCUGGACUCCUCCUACACAdTdT-3'; 및 안티센스 가닥, 3'-dTdTCGACCUGAGGAGGAUGUGU-5'. eIF5A에 대항하게 방향되어 있는 제 2 siRNA(5A-2)를 하기 서열을 지녔다: 센스 가닥, 5'-AGGAAUGACUUCCAGCUGAdTdT-3'; 및 안티센스 가닥, 3'-dTdTUCCUUACUGAAGGUCGACU-5'. 사용되는 대조군 siRNA는 eIF5A-특이적 siRNA의 역 서열을 지녔고 임의의 알려진 인간 유전자 생성물과 동일성이 없다. 대조군 siRNA는 센스 가닥, 5'-ACACAUCCUCCUCAGGUCGdTdT-3'; 및 안티센스 가닥, 3'-dTdTUGUGUAGGAGGAGUCCAGC-5'를 지녔다. 세포는 리포펙타민(Lipofectamine) 2000을 사용하여 siRNA12로 트랜스펙션하였고, 증식 연구에서 또는 웨스턴 블로팅을 위해 사용하였다.
웨스턴 블로팅
웨스턴 블로팅을 위한 단백질을 보일 용해 완충액[2% SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7.4)]을 사용하여 분리하였다. 단백질 농도를 비신코닌산 키트(Bicinchoninic Acid Kit)(Sigma)를 사용하여 결정하였다. 웨스턴 블로팅을 위해, 5 μg의 총 단백질을 12% SDS-폴리아크릴아미드 젤에서 분획시켰고, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막으로 전달시켰다. 사용되는 제 1 항체는 5% 우유에서 1:20,000의 희석 상태인, 안티-eIF5A(BD 트랜스덕션 라보라토리(Transduction Laboratories); 마우스 IgG) 및 안티-β-액틴 (암유전자; 마우스 IgM)이었다. 제 2 항체는 호스라디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)(HRP; Sigma) 및 항-마우스 IgM-HRP (암유전자)에 접합되어 있는 항-마우스 IgG이었다. 항체-단백질 복합체는 증가된 화합발광 방법(ECL, Amersham Biosciences)을 사용하여 가시화되었다. eIF5A의 탐지에 후속하여, 블롯은 ECL Plus 웨스턴 블로팅 탐지 시스템에 의해 제공되는 프로토콜에 따라 제거되었고, 안티-β-액틴 항체로 재탐침시켜서 동일한 로딩을 확인하였다.
MAPK/SAPK 경로 분석을 위해 사용되는 A549 세포로부터의 용해질의 웨스턴 블로팅은 MAPK 용해 완충액(10 mM Tris-pH 7.4, 2% SDS, 10% 글리콜)에서 모집된 용해질을 사용하여 수행되었다. 10 밀리그램의 용해질은 10% SDS-PAGE 젤에서 분리되었고 PVDF 막으로 전달되었다. 막은 PBS에서 5% 탈지 스킴 밀크에서 한 시간 동안 차단되었고, PBS로 세척되었고 4℃로 흔들면서 밤새 5% BSA/PBS-T에서 1:1000로 제 1 항체로 배양시켰다. MAPK/SAPK 항체(P-p38, p38, P-JNK, JNK, P-ERK, ERK, p90RSK)를 Cell Signaling로부터 구입하였다. A549 연구에서 사용되는 p53 항체는 또한 셀 시그널링(Cell Signaling)으로부터 수득하였고 유사한 방식으로 사용되었다.
2-D 젤 전기영동
2-D 젤 전기영동를 위해, HT-29 cell 용해질을 찬 용해 완충액(7M 우레아, 2M 티오우레아, 30 mM 트리스, 4% CHAPS, 프로티아제 억제자 칵테일)에서 수확하고, 고주파로 분해하였고 원심분리에 의해 데브리스를 제거하였다. 단백질 농도를 Bradford 방법을 사용하여 결정하였다. 제 1 차원적 등전 포커싱(dimensional isolelectric focusing)을 제조자의 지시에 따라 에탄 IPG포어 등전 포커싱 시스템(Ettan IPGphor Isoelectric Focusing System)(Amersham Biosciences)으로 수행하였다. 임모빌린 드라이스트립(Immobiline DryStrips)(7 cm pH 4-7; Amersham Biosciences)을 재수화 완충액(8M 우레아, 2% CHAPS, 0.2% DTT, 0.5% pH 4-7 IPG 완충액, 0.002% Bromophenol blue)에서 12 시간 동안 상온에서 세포 용해질로 재수화시켰다. 등전 포커싱은 30분 동안 500 V에서, 30분 동안 1000V에서 그리고 1시간 40분 동안 5000V에서 수행하였다. IPG 스트립 젤 상의 단백질은 그 다음에 SDS-PAGE에 의해 분리하였고 PVDF 막(Amersham Biosciences)을 전달하였다. 웨스턴 블로팅을 eIF5A 항체(BD Biosciences)를 사용하여 수행하였다.
아데노바이러스의 생성
하이푸신화(hypusination)를 차단하는 단일 점 돌연변이(K50→A50)를 지닌 인간 eIF5A 또는 eIF5A를 발현하는 아데노바이러스(아데노바이러스 5 세레오타입, E1,E3-삭제됨)[eIF5A(K50A)]는 AdMaxTM Hi-IQ 시스템(Microbix Biosystems Inc., Toronto, Canada)을 사용하여 만들었다. 사이트-특이적 변이는 PCR을 사용하여 eIF5A cDNA에서 만들었다. eIF5A cDNA를 플라스미드 DNA를 사용하여 PCR로 크게 하였고 아데노바이러스 서틀 벡터 pDC516(io)의 SmaI 사이트로 결찰시켰다. PCR 프라이머의 서열은 전방향, 5'-GCCAAGCTTAATGGCAGATGATTTGG-3'; 및 역방향, 5'-CCTGAATTCCAGTTATTTTGCCATGG-3'이다. 아데노바이러스 게놈 플라스미드 벡터 pBHGfrt(del)E1,3FLP 및 서틀 벡터는 E. coli DH5a에서 증식시켰고 퀴아젠 엔도프리(Qiagen EndoFree) 플라스미드 메가 키트(Mega Kit)를 사용하여 정제시켰다. 5 μg 각각의 아데노바이러스 제노믹 플라스미드 pBHGfrt(del)E1,3FLP 및 서틀 벡터, pDC516(io)-eIF5A 또는 pDC516(io)-eIF5A(K50A)를 마이크로빅스 바이오시스템스(Microbix Biosystems Inc.)에 의해 추천되는 CaCl2 방법을 사용하여 60 mm 배양 플레이트에서 60-80% 합류 293-IQ 세포(Microbix Biosystems)로 트랜스펙션시켰다. 37℃에서 7 내지 10일 배양 후 플라크(Plaque)가 나타났고 그 결과 얻은 아데노바이러스 입자[Ad-eIF5A 및 Ad-eIF5A(K50A)]를 293-IQ 세포로 크게 하였다. 순수한, 높은 적정 아데노바이러스 원액을 마이크로빅스 바이오시스템스(Microbix Biosystems Inc.)에 의해 공급되는 프로토콜에 따라 CsCl 구배 울트라원심분리(gradient ultracentrifugation)에 의해 제조하였다. LacZ를 발현하는 아데노바이러스 벡터(Ad-LacZ; 세로타입 5; E1,E3-삭제됨)를 Qbiogene(California, USA)로 부터 구입하였고 대조군으로서 그리고 이 실험에서 리포터로서 사용하였다. Ad-LacZ 아데노바이러스를 크게 하였고 Ad-eIF5A 및 AdeIF5A(K50A) 바이러스에서와 동일한 방법으로 정제하였다.
아데노바이러스 감염 및 아넥신 ( Annexin ) V 표지화
HT-29, HTB-9, 또는 HTB-4 세포를 100 mm 조직 배양 플레이트에서 플레이트 당 1×106 세포에서 성숙시켰고, 5 ml의 RPMI 1640+2% FBS에서 세포당 3000 감염 유닛에서 후속하는 날 아데노바이러스를 감염시켰다. 4시간 후 추가 매질을 세포에 첨가하였고 FBS의 농도가 10%가 되었다. 감염 후 24, 38 또는 72시간, 세포를 트립신화에 의해 분리시켰고, 세척하였고, 제조자의 프로토콜(BD Biosciences)에 따라 아넥신(Annexin) V-FITC로 염색하였다. 세포를 488 nm 아르곤 레이저 공급원으로 흐름 시토메트리(flow cytometry)(Coulter Epics XL-MCL)에 의해 소팅하였고, 형광 탐지를 위해 필터 그리고 데이터를 WinMDI 2.8에 의해 분석하였다.
HT-29 세포를 세포 당 3000 감염 유닛으로 감염시켰고 A549 세포로의 실험을 세포 당 1500 감염 유닛을 사용하여 수행하였다.
증식 분석
HT-29 세포를 리포펙타민(Lipofectamine) 2000(Invitrogen)을 사용하여 96- 웰 플레이트에서 siRNA로 트렌스펙션시켰다. 증식성 세포의 대사 활성을 XTT 세포 증식 키트(Roche Applied Science)로 측정시켰다. BrdU Cell 증식 키트(Roche Applied Science)를 제조자의 프로토콜에 따라 DNA 합성을 측정하기 위해 사용하였다. 아데노바이러스 감염을 후속하여 수행되는 XTT 분석을 위해, 5000 세포를 96-웰 플레이트에서 웰 당 플레이트에 두었다. 다음 날 세포를 음성 대조군으로서 Ad-lacZ, Ad-eIF5A1 및 Ad-eIF5A1(K50A)(Ad-eIF5A1M)로 그리고 양성 대조군으로서 액티노미신 D 처리된 세포로 각각 감염시켰다. XTT 기질을 첨가하였고, A475 nm를 참조로서 A690 nm로 측정하였다.
간접적 면역형광
HT-29 세포를 폴리-L-라이신-코팅된 유리 커버 슬립에서 배양시켰다. 미혼탁배양(Subconfluent) 세포를 인터페론 감마(IFN-γ; Roche Applied Science)의 200 유닛으로 16시간 동안 배양시켰고, 10분 내지 8시간으로 다양한 여러 시간 동안 TNF-α(100 ng/ml; Leinco Technologies)가 후속되었다. 대안적으로, 세포를 30분 내지 16시간의 시간의 길이를 증가시키기 위해 1.0 μg/ml 액티노미신 D로 처리하였다. 처리된 세포를 3% 포름알데히드(메탄올 없는; Polysciences Inc.)로 20분 동안 고정시켰고, PBS로 5분 동안 두 번 세척하였고, 100 mM 글리신을 함유하는 PBS로 5분 동안 한번 세척하였고, 4분 동안 PBS에서 0.2% 트리톤 X-100으로 투과시켰다. 세포를 그 다음에 표준 프로토콜을 사용하여 면역형광을 위해 라벨화시켰다. 제 1 항체는 1 시간 동안 1:250의 희석으로 배양된 항-eIF5A(BD 트랜스덕션 라보라 토리(Transduction Laboratories); 마우스 IgG)이었다. 제 2 항체는 1 시간 동안 1:200의 희석으로 사용되는 항-마우스 IgG-AlexaFluor 488(Molecular Probes)이었다. 항체 라벨을 따라, 핵을 Hoescht 33258으로 염색시켰고, 라벨된 세포는 형광 현미경 검사에 의해 관찰되었다.
Matrige TM 셀 내습 분석
A549 세포는 세포 당 1500 감염된 유닛에서 아데노바이러스로 감염되었고 24 시간 동안 배양되었다. 그 다음에 세포를 티피신으로 탈찰시켰고, 무혈청 매질로 세척하였고, 15 μg의 MatrigelTM Basement 막 매트릭스(BD Biosciences)로 사전코팅시킨 트랜스웰(Falcon 8.0 μm 세포 배양 삽입)에서 웰 당 30,000 세포에서 무혈청 매질에 배치시켰다. 10% FBS 함유 매질을 바닥 웰(트랜스웰이 있는 24-웰 플레이트의 웰)에 배치하였고, 세포를 추가 24 시간 동안 배양시켰다. 배양 후, 매질을 트랜스웰의 상부 챔버로부터 제거하였고, 트랜스웰를 제거하였고, 크리스탈 바이올렛의 500 마이크로리터를 함유하는 24-웰 플레이트의 웰로 배치시켰다. 트랜스웰을 염료에서 20분 배양시켰고, 그 다음에 물의 비이커에서 트랜스웰을 적심에 의해 반복적으로 세척하였다. 미리 젖은 면 스왑(swab)을 트랜스웰의 상부 표현으로부터 세포를 스크랩하기 위해 사용하였다. 트랜스웰의 하부 표면으로 이동된 세포를 빛 현미경 검사에 의해 관찰하였고, 사진을 찍었고, 필드 당 이동된 세포의 수를 샘하였다. 도 24 참조.
통계
스튜던트 t-검정을 통계학적 분석을 위해 사용하였다. 95% (P<0.05) 위의 확신도(confidence level)에 의해 중요성을 결정하였다.
실시예 2: 생체 내 실험에서
마우스 및 종양의 정착
C57BL/6 마우스를 5-7 주의 나이인 찰스 리버(Charles River)(Quebec, Canada)로부터 구입하였다. 마우스는 실험이 시작하기 전에 길들여 지는데 1 주일이 필요하였다. B16F10 생마우스 흑색종 세포를 ATCC로부터 구입하였고 DMEM-10% FBS에서 배양시켰다. 세포 단층을 트립신화시켰고, MEM-10% FBS로 중화시켰다. 세포를 PBS로 두 번 세척하였고 세포 생존능력을 트리판 블루 염색에 의해 결정하였다. 실험적 전이 실험(실험 II 및 III)을 위해, 흑색종 종양을 6주 나이의 마우스에 B16F10 세포의 꼬리 정맥 주입에 의해 폐에 정착시켰다. B16F10 세포를 PBS에서 1×106 가시적 세포/ml로 희석시켰다. 피하조직 종양 실험(실험 IV 및 V)을 위해, 흑색종 종양을 10 내지 14-주 나이의 마우스 나이 마우스의 오른쪽 플라스크로 500,000 B16F10 세포의 피하조직 주입에 의해 정착시켰다. 모든 실험의 말에, (마우스가 죽게 되거나 또는 종양이 미리 정해진 크기로 진행되는 경우에), 마우스는 CO2 흡입에 의해 안락사시켰다.
실시예 3: 실험 II
플라스미드 DNA 의 구조 및 정제
CpG 디뉴클레오티드가 부족한 pCpG-lacZ 발현 벡터를 인비보젠(InvivoGen)(San Diego, USA)으로부터 구입하였다. HA-꼬리있는 eIF5A1 cDNA를 NcoI 및 NheI로 플라스미드를 우선 소화시키고 3.1 kb의 pCpG 벡터 백본(이로써 LacZ 코딩 서열을 제거)을 분리시키고 HA 꼬리(pCpG-HA5A1)를 함유하는 eIF5A1의 PCR 증폭된 cDNA로 결찰시킴에 의해 pCpG-lacZ 벡터로 하부복제시켰다. PCR 프라이머는 eIF5A1(for: HA-5A1 for: 5'-GCTCCATGGATGTACCCATACGACGTCCC-3') 및 eIF5A1(rev: 5'-CGCGCTAGCCAGTTATTTTGCCATCGCC-3')이었다. pCpG-lacZ 및 pCpGHA5A1를 25 μg/ml의 제오신을 함유하는 LB 또는 2XYT 매질에서 배양된 E. coli GT115에서 증폭시켰다. 플라스미드를 추출시켰고 퀴아젠 엔도프리(QIAGEN Endofree) 플라스미드 기가 키트(Giga kit)에 의해 정제시켰다. DNA 농도를 260nm 및 아가로즈 겔 전기영동에서 UV 흡수에 의해 측정하였다.
플라스미드 DNA 의 꼬리 정맥 주입(실험 II ):
1×PBS (몸무게에 기초하여 약 200 μl)에서 용해된 플라스미드 DNA를 2, 4, 7, 11, 16, 21, 26, 31일에 마우스의 꼬리 정맥으로 주입시켰다. 플라스미드 DNA 농도는 660 ng/μl(2× (6.6 mg/kg)), 330 ng/μl(1× (3.3 mg/kg)), 및 33 ng/μ l(0.1× (0.33 mg/kg))였다.
몸 및 폐 무게:
몸무게는 꼬리 정맥 주입 또는 매 월요일 및 금요일 전에 측정하였다. 마우스를 CO2로 안락사시켰고, 이때 이들이 죽음에 도달(lethargic, respiratory distress)되고 폐가 제거되며, 무게를 재고, 사진을 찍고, 동결하고 -70℃에서 저장하였다. 도 25-27 참조.
VEGF E lisa :
수확된 폐 조직을 PBS로 세척하였고, 건조 얼음으로 동결시켰고, -70℃에서 저장시켰다. 단백질 용해질을 분쇄된 폐 조직으로부터 분리하였다. 50 μg의 폐조직 단백질을 마우스 VEGF 이뮤노에세이 키트(Immunoassay kit)(R&D Systems, Inc. Minneapolis, USA)를 사용하여 마우스 폐에서 VEGF 농도를 결정하기 위해 사용하였다.
실시예 4 : 실험 III
플라스미드 DNA / DOTAP 복합체의 주입
6 마우스 나이 마우스를 B16F10 흑색종 세포(200 μl PBS/마우스 내 50,000 세포), 플라스미드 DNA, 및 50 μg의 엔도톡신-없는 키트 정화된 플라스미드 DNA를 함유하는 DNA 담체 복합체로 꼬리 정맥 주사하였고, 80 μg의 DOTAP를 7, 14, 및 21일에 마우스 속으로 주입하였다. 마우스를 25일에 희생시켰다. 폐를 제거하였고, 무게를 측정하였고, 사진을 찍었다. 도 28-29 참조.
실시예 5 : 실험 IV
아데노바이러스 구조 및 TUNEL 의 주입
10-주 나이 C57BL/6 마우스를 500,000 B16F0 또는 B16F10 세포로 오른쪽 플라스크 속으로 피하조직 내로 주입하였다. 50 ul의 PBS 내 1×109 pfu Ad-5A1를 종양 속으로 주입시켰고, 그 때 종양은 직경에서 약 4 mm가 되었다(B16 세포 주입 10-12일 후). 주를 48 시간 후에 희생시켰고, 종양을 절개하였고, 고정시켰고, 파라핀으로 봉하였다. 각 세포 종양 타입(Ad-5A1-1 및 Ad-5A1-2)을 위한 두 섹션을 제조자의 프로토콜에 따라 TUNEL(Promega)에 의해 염색시켰다. TdT 엔자임이 TUNEL 반응에서 남아있는 음성 대조군 슬라이드(Ad-5A1-neg)를 각 세포 타입을 위해 포함시켰다. 도 30 참조.
실시예 6 : 실험 V
종양의 정착
14-주 나이의 C57BL/6 마우스를 오른쪽 플라스크에 500,000 B16F10 세포(PBS 의 100 ul에서)로 피하조직으로 주입시켰다. 종양 형성의 진행을 종양 크기가 직경에서 약 8 mm가 될 때까지 매일 점검하였다.
아데노바이러스로의 주입
종양 크기가 8 mm의 직경일 때 치료를 시작하였다. 마우스를 Ad-eIF5A1 또는 Ad-LacZ의 1×109 플라크 형성 단위(plaque forming units: pfu)로 주입시켰다. 종양에서의 3 개의 사이트로 나눠서 주입하였다. 마우스는 처음 3일 동안 그리고 그 후에 2일에 한 번씩 마우스가 희생될 때까지 주입되었다. 마우스는 종양 크기가 직경에서 15 내지 16 mm일 때 희생시켰다. 완충액만 처리된 마우스는 아데노바이러스가 현탁되어 있는(10 mM Tris-HCl pH 7.4, 10 mM MgCl2, 10% 글리콜) 완충액을 단지 수용하였다. 종양 크기를 칼리퍼를 사용하여 매일 측정하였고 종양 부피를 아래 공식을 사용하여 계산하였다: 종양 부피(mm3)=L*W2*0.52
여기서 L=길이, W=너비 (항상 더 짧은 크기) 도 31 및 32 참조.
실시예 7
A549 폐 암종 세포를 LacZ (Lac) 또는 eIF5A1 (5A) 발현하는 아데노바이러스를 주입시켰다. 주입 4 시간 후, 매질을 DMSO, 10 μM의 p38 억제자 SB203580 (Calbiochem), 10 μM의 JNK 억제자 II(Calbiochem), 10 μM의 MEK 억제자 U1026 (Calbiochem), 또는 30 μM의 p53 억제자 피피트린(Pifithrin)-a(Calbiochem)를 함유하는 매질로 대체시켰다. 48 시간 후, 세포를 30 분 동안 EGF로 처리하였고, 세포 용해질를 수확하였다. 웨스턴 블롯을 총 p53(p53), 또는 세린 15에서 인함유된 p53[P-p53(ser15)], 또는 37에서 인함유된 p53[Pp53(ser37)]에 대항하게 지시된 항체를 사용하여 용해질에서 수행하였다. 도 33 참조.
도 33에 도시된 결과는 Ad-eIF5A1이 주입 48 시간 후까지 p53의 축척을 유발함을 보여준다. 도면은 또한 Ad-eIF5A1이 주입 48 시간 후까지 p53의 인산화를 유발하고; p53의 축척 및 인산화가 MEK의 억제에 의해 억제되며; p53의 축척 및 인산화가 p53 활성의 억제자에 의해 억제되고; eIF5A1이 p53의 MEK-의존 인산화를 자극하며; eIF5A1이 p53의 p53-의존 축척을 자극함을 보여준다.
실시예 8
A549 폐 암종 세포를 LacZ (Ad-LacZ) 또는 eIF5A1를 발현하는 아데노바이러스(Ad-eIF5A1)로 감염시켰다. 48 시간 후, 총 RNA를 세포로부터 분리시켰다. p53의 수준 및 박스(bax) mRNA 전사 수준을 참조 유전자로서 GAPDH를 사용하여 실시간(Real Time) PCR에 의해 결정하였다. p53 프라이머는: 5'-CGCTGCTCAGATAGCGATGGTC-3' (5'-프라이머) 및 5'-CTTCTTTGGCTGGGGAGAGGAG-3' (3'-프라이머) [이 p53 프라이머 서열들은 [Li et al. (2004). A Novel eIF5A/complex Functions as a Regulator of p53 and p53-dependent Apoptosis, J Biol. Chem. 279 49251-49258]로부터 수득된다]. eIF5A1의 과발현이 mRNA 수준에서 p53의 축척을 유발하고 bax에서의 어떠한 효과도 보이지 않음을 보여주는 도 34 참조.
실시예 9
A549 폐 암종 세포를 LacZ (Ad-LacZ) 또는 eIF5A1 (Ad-eIF5A1)을 발현하는 아데노바이러스로 감염시켰다. 감염 4 시간 후, 매질을 DMSO, 10 μM의 MEK 억제자 U1026(Calbiochem), 또는 30 μM의 p53 억제자 피피트린(Pifithrin)-a(Calbiochem)을 함유하는 매질로 대체시켰다. 48 시간 후에, 총 RNA를 세포로부터 분리시켰다. p53 전사 수준의 수준을 참조 유전자로서 GAPDH를 사용하여 실시간(Real Time) PCR에 의해 결정하였다. p53 프라이머는 5'-CGCTGCTCAGATAGCGATGGTC-3' (5'-프라이머) 및 5'-CTTCTTTGGCTGGGGAGAGGAG-3' (3'-프라이머) [이 p53 프라이머 서열은 [Li et al. (2004). A Novel eIF5A/complex Functions as a Regulator of p53 and p53-dependent Apoptosis, J Biol. Chem. 279 49251-49258]로부터 얻었다]. p53의 eIF5A1-의존적 축척이 p53 전사 활성화에 의존적이고, eIF5A1에 대한 반응에서 발생되는 p53 단백질의 상향조절이 p53 mRNA의 증가된 전사의 결과를 가져옴을 보여주는 도 35를 참조.
실시예 10
A549 폐 암종 세포는 LacZ(Ad-LacZ) 또는 eIF5A1(Ad-eIF5A1)를 발현하는 아데노바이러스를 감염시켰다. 감염 48 시간 후, 매질을 DMSO, 10 μM의 MEK 억제자 U1026(Calbiochem), 또는 30 μM의 p53 억제자 피피트린(Pifithrin)-a(Calbiochem)를 함유하는 매질로 대체시켰다. 48 시간 후, 총 RNA는 세포로부터 분리시켰다. p53 전사 수준의 수준은 참조 유전자로서 GAPDH를 사용하여 실시간 PCR에 의해 결정하였다. TNFR1 프라이머는 TNFR1-F 5' ATCTCTTCTTGCACAGTGG 3' 및 TNFR1-R 5' CAATGGAGTAGAGCTTGGAC 3'이었다. TNFR1 mRNA 수준이 Ad-eIF5A1로 감염에 의해 상향조절되고 TNFR1 mRNA의 이 축척이 부분적으로 MEK에 의존적임을 보여주는 도 36을 참조. TNFR1 mRNA의 이 축척은 p53 전사 활성화에 의존적이다.
실시예 11
A549 폐 암종 세포를 LacZ (Lac) 또는 eIF5A1 (5A)를 발현하는 아데노바이러스로 감염시켰다. 감염 48 시간 후, 매질을 DMSO, 10 μM의 p38 억제자 SB203580 (Calbiochem), 10의 JNK 억제자 II (Calbiochem), 10 μM의 MEK 억제자 U1026 (Calbiochem), 또는 30 μM의 p53 억제자 피피트린(Pifithrin)-a (Calbiochem)를 함유하는 매질로 대체시켰다. 48 시간 후, 세포를 수확하였고, 세포 자멸을 겪고 있는 세포의 백분율은 아넥신(Annexin)/PI 착색(staining)(BD Bioscience)에 의해 후속하여 흐름 시토메트리에 의한 분석에 의해 결정하였다. 도 37 참조.
도 37은 Ad-eIF5A1가 감염 후 48 시간에 의해 세포 자멸을 유발하고; JNK의 억제가 eIF5A1에 의해 유발되는 세포 자멸을 증가시키며; MEK의 억제는 eIF5A1에 의해 유발되는 세포 자멸을 증가시키고; p53의 억제는 eIF5A1에 의해 유발되는 세 포 자멸을 감소시키는 것을 보여준다.
실시예 12
마우스가 50,000 B16-F0 흑색종 세포로 피하로 감염시켰다. 종양이 약 5×5 mm (65 mm3)의 크기가 될 때 내부 종양 주입을 시작하였다. 50-100 μl의 PBS/10% 글리콜 완충액에 희석된 Ad-lacZ(그룹 2), Ad-eIF5A1 (그룹 3), 또는 AdeIF5A2(그룹 4) 또는 단지 완충액(그룹 1)의 1×109 pfu를 2일 마다 종양 당 3 사이트에서 종양으로 주입시켰다. 종양 크기는 종양의 크기가 몸무게의 10%에 도달되는 때 마우스의 희생 때까지 2일 마다 측정하였다. 도 39 참조.
실시예 13
마우스는 50,000 B16-F0 흑색종 세포를 피하로 주입시켰다. 종양이 약 5×5 mm (65 mm3)의 크기가 될 때, 내부 종양 주입을 시작하였다. 50-100 μl의 PBS/10% 글리콜 완충액에 희석된 Ad-lacZ(그룹 2), Ad-eIF5A1 (그룹 3), 또는 AdeIF5A2(그룹 4) 또는 단지 완충액(그룹 1)의 1×109 pfu를 2일 마다 종양 당 3 사이트에서 종양으로 주입하였다. 종양 크기가 몸무게의 10%가 될 때 마우스를 희생시켰다. 도 40 참조.
실시예 14: 다발 골수종
첫날에 KAS 6/1 다발 골수종 세포를 4 시간 동안 3000 IFU/세포 와일드 타입 또는 변이 eIF5a(하이푸신화될 수 없고, 보존 라이신이 변이됨) 아데노바이러스 벡터 구조로 감염시켰다. 감염 후 배양 매질에 존재하는 IL-6으로 또는 없는 3 복제물을 설치하였다. 추가로 KAS 세포를 대조군(감염되지 않음)을 위해 판에 두었다.
2 및 4일에, MTT 및 아넥신/PI 분석을 수행하였다. 상청액을 수확하였다. 결과를 도 41에 도시하였다.
SEQUENCE LISTING <110> THOMPSON, JOHN E. TAYLOR, CATHERINE <120> USE OF eIF-5A TO KILL MULTIPLE MYELOMA CELLS <130> 10799/241 <140> <141> 2006-12-13 <150> 60/749,604 <151> 2005-12-13 <150> 60/795,168 <151> 2006-04-27 <160> 95 <170> PatentIn Ver. 3.2 <210> 1 <211> 1139 <212> DNA <213> Rattus sp. <220> <221> CDS <222> (33)..(494) <400> 1 caggtctaga gttggaatcg aagcctctta aa atg gca gat gat ttg gac ttc 53 Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe 1 5 gag aca gga gat gca ggg gcc tca gcc acc ttc cca atg cag tgc tca 101 Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser 10 15 20 gca tta cgt aag aat ggt ttt gtg gtg ctc aag ggc cgg cca tgt aag 149 Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys 25 30 35 atc gtc gag atg tct act tcg aag act ggc aag cat ggc cat gcc aag 197 Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys 40 45 50 55 gtc cat ctg gtt ggt att gat att ttt act ggg aag aaa tat gaa gat 245 Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp 60 65 70 atc tgc ccg tcg act cat aac atg gat gtc ccc aac atc aaa agg aat 293 Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn 75 80 85 gat ttc cag ctg att ggc atc cag gat ggg tac cta tcc ctg ctc cag 341 Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln 90 95 100 gac agt ggg gag gta cga gag gac ctt cgt ctg cct gag gga gac ctt 389 Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu 105 110 115 ggc aag gag att gag cag aag tat gac tgt gga gaa gag atc ctg atc 437 Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile 120 125 130 135 aca gtg ctg tcc gcc atg aca gag gag gca gct gtt gca atc aag gcc 485 Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala 140 145 150 atg gca aaa taactggctt ccagggtggc ggtggtggca gcagtgatcc 534 Met Ala Lys atgagcctac agaggcccct cccccagctc tggctgggcc cttggctgga ctcctatcca 594 atttatttga cgttttattt tggttttcct caccccttca aactgtcggg gagaccctgc 654 ccttcaccta gctcccttgg ccaggcatga gggagccatg gccttggtga agctacctgc 714 ctcttctctc gcagccctga tgggggaaag ggagtgggta ctgcctgtgg tttaggttcc 774 cctctccctt tttcttttta attcaatttg gaatcagaaa gctgtggatt ctggcaaatg 834 gtcttgtgtc ctttatccca ctcaaaccca tctggtcccc tgttctccat agtccttcac 894 ccccaagcac cactgacaga ctggggacca gcccccttcc ctgcctgtgt ctcttcccaa 954 acccctctat aggggtgaca agaagaggag ggggggaggg gacacgatcc ctcctcaggc 1014 atctgggaag gccttgcccc catgggcttt accctttcct gtgggctttc tccctgacac 1074 atttgttaaa aatcaaacct gaataaaact acaagtttaa tatgaaaaaa aaaaaaaaaa 1134 aaaaa 1139 <210> 2 <211> 154 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 2 Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala 1 5 10 15 Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val 20 25 30 Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr 35 40 45 Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe 50 55 60 Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp 65 70 75 80 Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp 85 90 95 Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu 100 105 110 Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp 115 120 125 Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu 130 135 140 Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala Lys 145 150 <210> 3 <211> 462 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atggcagatg acttggactt cgagacagga gatgcagggg cctcagccac cttcccaatg 60 cagtgctcag cattacgtaa gaatggcttt gtggtgctca aaggccggcc atgtaagatc 120 gtcgagatgt ctacttcgaa gactggcaag cacggccacg ccaaggtcca tctggttggt 180 attgacatct ttactgggaa gaaatatgaa gatatctgcc cgtcaactca taatatggat 240 gtccccaaca tcaaaaggaa tgacttccag ctgattggca tccaggatgg gtacctatca 300 ctgctccagg acagcgggga ggtacgagag gaccttcgtc tccctgaggg agaccttggc 360 aaggagattg agcagaagta cgactgtgga gaagagatcc tgatcacggt gctgtctgcc 420 atgacagagg aggcagctgt tgcaatcaag gccatggcaa aa 462 <210> 4 <211> 460 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atggcagacg aaattgattt cactactgga gatgccgggg cttccagcac ttaccctatg 60 cagtgctcgg ccttgcgcaa aaacggcttc gtggtgctca aaggacgacc atgcaaaata 120 gtggagatgt caacttccaa aactggaaag catggtcatg ccaaggttca ccttgttgga 180 attgatattt tcacgggcaa aaaatatgaa gatatttgtc cttctactca caacatggat 240 gttccaaata ttaagagaaa tgattatcaa ctgatatgca ttcaagatgg ttacctttcc 300 ctgctgacag aaactggtga agttcgtgag gatcttaaac tgccagaagg tgaactaggc 360 aaagaaatag agggaaaata caatgcaggt gaagatgtac aggtgtctgt catgtgtgca 420 atgagtgaag aatatgctgt agccataaaa ccctgcaaat 460 <210> 5 <211> 462 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 5 atggcagatg atttggactt cgagacagga gatgcagggg cctcagccac cttcccaatg 60 cagtgctcag cattacgtaa gaatggtttt gtggtgctca aaggccggcc atgtaagatc 120 gtcgagatgt ctacttcgaa gactggcaag catggccatg ccaaggtcca tctggttggc 180 attgacattt ttactgggaa gaaatatgaa gatatctgcc cgtcgactca taatatggat 240 gtccccaaca tcaaacggaa tgacttccag ctgattggca tccaggatgg gtacctatcc 300 ctgctccagg acagtgggga ggtacgagag gaccttcgtc tgcctgaagg agaccttggc 360 aaggagattg agcagaagta tgactgtgga gaagagatcc tgatcacagt gctgtctgcc 420 atgacagagg aggcagctgt tgcaatcaag gccatggcaa aa 462 <210> 6 <211> 606 <212> DNA <213> Rattus sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(453) <400> 6 gct gtg tat tat tgg gcc cat aag aac cac ata cct gtg ctg agt cct 48 Ala Val Tyr Tyr Trp Ala His Lys Asn His Ile Pro Val Leu Ser Pro 1 5 10 15 gca ctc aca gac ggc tca ctg ggt gac atg atc ttt ttc cat tcc tat 96 Ala Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Ile Phe Phe His Ser Tyr 20 25 30 aaa aac cca ggc ttg gtc ctg gac atc gtt gaa gac ctg cgg ctc atc 144 Lys Asn Pro Gly Leu Val Leu Asp Ile Val Glu Asp Leu Arg Leu Ile 35 40 45 aac atg cag gcc att ttc gcc aag cgc act ggg atg atc atc ctg ggt 192 Asn Met Gln Ala Ile Phe Ala Lys Arg Thr Gly Met Ile Ile Leu Gly 50 55 60 gga ggc gtg gtc aag cac cac atc gcc aat gct aac ctc atg cgg aat 240 Gly Gly Val Val Lys His His Ile Ala Asn Ala Asn Leu Met Arg Asn 65 70 75 80 gga gct gac tac gct gtt tat atc aac aca gcc cag gag ttt gat ggc 288 Gly Ala Asp Tyr Ala Val Tyr Ile Asn Thr Ala Gln Glu Phe Asp Gly 85 90 95 tca gac tca gga gcc cgg cca gat gag gct gtc tcc tgg ggc aag atc 336 Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile 100 105 110 cgg atg gat gca cag cca gta aag gtc tat gct gat gca tct ctg gtt 384 Arg Met Asp Ala Gln Pro Val Lys Val Tyr Ala Asp Ala Ser Leu Val 115 120 125 ttc ccc ttg ctg gtg gct gag aca ttc gcc caa aag gca gat gcc ttc 432 Phe Pro Leu Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Gln Lys Ala Asp Ala Phe 130 135 140 aga gct gag aag aat gag gac tgagcagatg ggtaaagacg gaggcttctg 483 Arg Ala Glu Lys Asn Glu Asp 145 150 ccacaccttt atttattatt tgcataccaa cccctcctgg gccctctcct tggtcagcag 543 catcttgaga ataaatggcc tttttgttgg tttctgtaaa aaaaggactt taaaaaaaaa 603 aaa 606 <210> 7 <211> 151 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 7 Ala Val Tyr Tyr Trp Ala His Lys Asn His Ile Pro Val Leu Ser Pro 1 5 10 15 Ala Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Ile Phe Phe His Ser Tyr 20 25 30 Lys Asn Pro Gly Leu Val Leu Asp Ile Val Glu Asp Leu Arg Leu Ile 35 40 45 Asn Met Gln Ala Ile Phe Ala Lys Arg Thr Gly Met Ile Ile Leu Gly 50 55 60 Gly Gly Val Val Lys His His Ile Ala Asn Ala Asn Leu Met Arg Asn 65 70 75 80 Gly Ala Asp Tyr Ala Val Tyr Ile Asn Thr Ala Gln Glu Phe Asp Gly 85 90 95 Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile 100 105 110 Arg Met Asp Ala Gln Pro Val Lys Val Tyr Ala Asp Ala Ser Leu Val 115 120 125 Phe Pro Leu Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Gln Lys Ala Asp Ala Phe 130 135 140 Arg Ala Glu Lys Asn Glu Asp 145 150 <210> 8 <211> 453 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 tccgtgtatt actgggccca gaagaaccac atccctgtgt ttagtcccgc acttacagac 60 ggctcgctgg gcgacatgat cttcttccat tcctacaaga acccgggcct ggtcctggac 120 atcgttgagg acctgaggct catcaacaca caggccatct ttgccaagtg cactgggatg 180 atcattctgg gcgggggcgt ggtcaagcac cacattgcca atgccaacct catgcggaac 240 ggggccgact acgctgttta catcaacaca gcccaggagt ttgatggctc tgactcaggt 300 gcccgaccag acgaggctgt ctcctggggc aagatccggg tggatgcaca gcccgtcaag 360 gtctatgctg acgcctccct ggtcttcccc ctgcttgtgg ctgaaacctt tgcccagaag 420 atggatgcct tcatgcatga gaagaacgag gac 453 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <220> <221> modified_base <222> (12) <223> a, t, c or g <400> 9 tcsaarachg gnaagcaygg 20 <210> 10 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 10 gcgaagcttc catggctcga gttttttttt tttttttttt tt 42 <210> 11 <211> 972 <212> DNA <213> Rattus sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(327) <400> 11 tcg aag acc ggt aag cac ggc cat gcc aag gtc cat ctg gtt ggt att 48 Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile 1 5 10 15 gat att ttt act ggg aag aaa tat gaa gat atc tgc ccg tcg act cat 96 Asp Ile Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His 20 25 30 aac atg gat gtc ccc aac atc aaa agg aat gat ttc cag ctg att ggc 144 Asn Met Asp Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly 35 40 45 atc cag gat ggg tac cta tcc ctg ctc cag gac agt ggg gag gta cga 192 Ile Gln Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg 50 55 60 gag gac ctt cgt ctg cct gag gga gac ctt ggc aag gag att gag cag 240 Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln 65 70 75 80 aag tat gac tgt gga gaa gag atc ctg atc aca gtg ctg tcc gcc atg 288 Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met 85 90 95 aca gag gag gca gct gtt gca atc aag gcc atg gca aaa taactggctt 337 Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala Lys 100 105 ccagggtggc ggtggtggca gcagtgatcc atgagcctac agaggcccct cccccagctc 397 tggctgggcc cttggctgga ctcctatcca atttatttga cgttttattt tggttttcct 457 caccccttca aactgtcggg gagaccctgc ccttcaccta gctcccttgg ccaggcatga 517 gggagccatg gccttggtga agctacctgc ctcttctctc gcagccctga tgggggaaag 577 ggagtgggta ctgcctgtgg tttaggttcc cctctccctt tttcttttta attcaatttg 637 gaatcagaaa gctgtggatt ctggcaaatg gtcttgtgtc ctttatccca ctcaaaccca 697 tctggtcccc tgttctccat agtccttcac ccccaagcac cactgacaga ctggggacca 757 gcccccttcc ctgcctgtgt ctcttcccaa acccctctat aggggtgaca agaagaggag 817 ggggggaggg gacacgatcc ctcctcaggc atctgggaag gccttgcccc catgggcttt 877 accctttcct gtgggctttc tccctgacac atttgttaaa aatcaaacct gaataaaact 937 acaagtttaa tatgaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 972 <210> 12 <211> 109 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 12 Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile 1 5 10 15 Asp Ile Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His 20 25 30 Asn Met Asp Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly 35 40 45 Ile Gln Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg 50 55 60 Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln 65 70 75 80 Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met 85 90 95 Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala Lys 100 105 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 13 caggtctaga gttggaatcg aagc 24 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 14 atatctcgag ccttgattgc aacagctgcc 30 <210> 15 <211> 489 <212> DNA <213> Rattus sp. <220> <221> CDS <222> (33)..(485) <400> 15 caggtctaga gttggaatcg aagcctctta aa atg gca gat gat ttg gac ttc 53 Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe 1 5 gag aca gga gat gca ggg gcc tca gcc acc ttc cca atg cag tgc tca 101 Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser 10 15 20 gca tta cgt aag aat ggt ttt gtg gtg ctc aag ggc cgg cca tgt aag 149 Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys 25 30 35 atc gtc gag atg tct act tcg aag act ggc aag cat ggc cat gcc aag 197 Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys 40 45 50 55 gtc cat ctg gtt ggt att gat att ttt act ggg aag aaa tat gaa gat 245 Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp 60 65 70 atc tgc ccg tcg act cat aac atg gat gtc ccc aac atc aaa agg aat 293 Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn 75 80 85 gat ttc cag ctg att ggc atc cag gat ggg tac cta tcc ctg ctc cag 341 Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln 90 95 100 gac agt ggg gag gta cga gag gac ctt cgt ctg cct gag gga gac ctt 389 Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu 105 110 115 ggc aag gag att gag cag aag tat gac tgt gga gaa gag atc ctg atc 437 Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile 120 125 130 135 aca gtg ctg tcc gcc atg aca gag gag gca gct gtt gca atc aag gct 485 Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala 140 145 150 cgag 489 <210> 16 <211> 151 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 16 Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala 1 5 10 15 Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val 20 25 30 Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr 35 40 45 Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe 50 55 60 Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp 65 70 75 80 Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp 85 90 95 Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu 100 105 110 Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp 115 120 125 Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu 130 135 140 Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala 145 150 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 17 gtctgtgtat tattgggccc 20 <210> 18 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 18 gcgaagcttc catggctcga gttttttttt tttttttttt tt 42 <210> 19 <211> 1299 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 ggcacgaggg cggcggcggc ggtagaggcg gcggcggcgg cggcagcggg ctcggaggca 60 gcggttgggc tcgcggcgag cggacggggt cgagtcagtg cgttcgcgcg agttggaatc 120 gaagcctctt aaaatggcag atgacttgga cttcgagaca ggagatgcag gggcctcagc 180 caccttccca atgcagtgct cagcattacg taagaatggc tttgtggtgc tcaaaggccg 240 gccatgtaag atcgtcgaga tgtctacttc gaagactggc aagcacggcc acgccaaggt 300 ccatctggtt ggtattgaca tctttactgg gaagaaatat gaagatatct gcccgtcaac 360 tcataatatg gatgtcccca acatcaaaag gaatgacttc cagctgattg gcatccagga 420 tgggtaccta tcactgctcc aggacagcgg ggaggtacga gaggaccttc gtctccctga 480 gggagacctt ggcaaggaga ttgagcagaa gtacgactgt ggagaagaga tcctgatcac 540 ggtgctgtct gccatgacag aggaggcagc tgttgcaatc aaggccatgg caaaataact 600 ggctcccagg atggcggtgg tggcagcagt gatcctctga acctgcagag gccccctccc 660 cgagcctggc ctggctctgg cccggtccta agctggactc ctcctacaca atttatttga 720 cgttttattt tggttttccc caccccctca atctgtcggg gagcccctgc ccttcaccta 780 gctcccttgg ccaggagcga gcgaagctgt ggccttggtg aagctgccct cctcttctcc 840 cctcacacta cagccctggt gggggagaag ggggtgggtg ctgcttgtgg tttagtcttt 900 tttttttttt tttttttttt tttaaattca atctggaatc agaaagcggt ggattctggc 960 aaatggtcct tgtgccctcc ccactcatcc ctggtctggt cccctgttgc ccatagccct 1020 ttaccctgag caccacccca acagactggg gaccagcccc ctcgcctgcc tgtgtctctc 1080 cccaaacccc tttagatggg gagggaagag gaggagaggg gaggggacct gccccctcct 1140 caggcatctg ggagggccct gcccccatgg gctttaccct tccctgcggg ctctctcccc 1200 gacacatttg ttaaaatcaa acctgaataa aactacaagt ttaatatgaa aaaaaaaaaa 1260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1299 <210> 20 <211> 462 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 20 atggcagatg atttggactt cgagacagga gatgcagggg cctcagccac cttcccaatg 60 cagtgctcag cattacgtaa gaatggtttt gtggtgctca agggccggcc atgtaagatc 120 gtcgagatgt ctacttcgaa gactggcaag catggccatg ccaaggtcca tctggttggt 180 attgatattt ttactgggaa gaaatatgaa gatatctgcc cgtcgactca taacatggat 240 gtccccaaca tcaaaaggaa tgatttccag ctgattggca tccaggatgg gtacctatcc 300 ctgctccagg acagtgggga ggtacgagag gaccttcgtc tgcctgaggg agaccttggc 360 aaggagattg agcagaagta tgactgtgga gaagagatcc tgatcacagt gctgtccgcc 420 atgacagagg aggcagctgt tgcaatcaag gccatggcaa aa 462 <210> 21 <211> 154 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala 1 5 10 15 Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val 20 25 30 Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr 35 40 45 Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe 50 55 60 Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp 65 70 75 80 Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp 85 90 95 Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu 100 105 110 Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp 115 120 125 Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu 130 135 140 Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala Lys 145 150 <210> 22 <211> 153 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Met Ala Asp Glu Ile Asp Phe Thr Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ser 1 5 10 15 Thr Tyr Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val 20 25 30 Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr 35 40 45 Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe 50 55 60 Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp 65 70 75 80 Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Tyr Gln Leu Ile Cys Ile Gln Asp 85 90 95 Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Thr Glu Thr Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu 100 105 110 Lys Leu Pro Glu Gly Glu Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gly Lys Tyr Asn 115 120 125 Ala Gly Glu Asp Val Gln Val Ser Val Met Cys Ala Met Ser Glu Glu 130 135 140 Tyr Ala Val Ala Ile Lys Pro Cys Lys 145 150 <210> 23 <211> 154 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23 Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala 1 5 10 15 Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val 20 25 30 Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr 35 40 45 Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe 50 55 60 Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp 65 70 75 80 Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp 85 90 95 Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu 100 105 110 Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp 115 120 125 Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu 130 135 140 Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala Lys 145 150 <210> 24 <211> 153 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Met Ala Asp Glu Ile Asp Phe Thr Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ser 1 5 10 15 Thr Tyr Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val 20 25 30 Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr 35 40 45 Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe 50 55 60 Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp 65 70 75 80 Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Tyr Gln Leu Ile Cys Ile Gln Asp 85 90 95 Gly Cys Leu Ser Leu Leu Thr Glu Thr Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu 100 105 110 Lys Leu Pro Glu Gly Glu Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gly Lys Tyr Asn 115 120 125 Ala Gly Glu Asp Val Gln Val Ser Val Met Cys Ala Met Ser Glu Glu 130 135 140 Tyr Ala Val Ala Ile Lys Pro Cys Lys 145 150 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 25 gacttggact tcgagacagg 20 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 26 gcacggccac gccaaggtc 19 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 27 ggacagcggg gaggtacgag 20 <210> 28 <211> 153 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Illustrative consensus sequence <400> 28 Met Ala Asp Glu Ile Asp Phe Thr Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ser 1 5 10 15 Thr Tyr Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val 20 25 30 Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr 35 40 45 Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe 50 55 60 Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp 65 70 75 80 Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Tyr Gln Leu Ile Cys Ile Gln Asp 85 90 95 Gly Cys Leu Ser Leu Leu Thr Glu Thr Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu 100 105 110 Lys Leu Pro Glu Gly Glu Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gly Lys Tyr Asn 115 120 125 Ala Gly Glu Asp Val Gln Val Ser Val Met Cys Ala Met Ser Glu Glu 130 135 140 Tyr Ala Val Ala Ile Lys Pro Cys Lys 145 150 <210> 29 <211> 1309 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 ggcacgaggg tagaggcggc ggcggcggcg gcagcgggct cggaggcagc ggttgggctc 60 gcggcgagcg gacggggtcg agtcagtgcg ttcgcgcgag ttggaatcga agcctcttaa 120 aatggcagat gacttggact tcgagacagg agatgcaggg gcctcagcca ccttcccaat 180 gcagtgctca gcattacgta agaatggctt tgtggtgctc aaaggccggc catgtaagat 240 cgtcgagatg tctacttcga agactggcaa gcacggccac gccaaggtcc atctggttgg 300 tattgacatc tttactggga agaaatatga agatatctgc ccgtcaactc ataatatgga 360 tgtccccaac atcaaaagga atgacttcca gctgattggc atccaggatg ggtacctatc 420 actgctccag gacagcgggg aggtacgaga ggaccttcgt ctccctgagg gagaccttgg 480 caaggagatt gagcagaagt acgactgtgg agaagagatc ctgatcacgg tgctgtctgc 540 catgacagag gaggcagctg ttgcaatcaa ggccatggca aaataactgg ctcccaggat 600 ggcggtggtg gcagcagtga tcctctgaac ctgcagaggc cccctccccg agcctggcct 660 ggctctggcc cggtcctaag ctggactcct cctacacaat ttatttgacg ttttattttg 720 gttttcccca ccccctcaat ctgtcgggga gcccctgccc ttcacctagc tcccttggcc 780 aggagcgagc gaagctgtgg ccttggtgaa gctgccctcc tcttctcccc tcacactaca 840 gccctggtgg gggagaaggg ggtgggtgct gcttgtggtt tagtcttttt tttttttttt 900 tttttttttt aaattcaatc tggaatcaga aagcggtgga ttctggcaaa tggtccttgt 960 gccctcccca ctcatccctg gtctggtccc ctgttgccca tagcccttta ccctgagcac 1020 caccccaaca gactggggac cagccccctc gcctgcctgt gtctctcccc aaaccccttt 1080 agatggggag ggaagaggag gagaggggag gggacctgcc ccctcctcag gcatctggga 1140 gggccctgcc cccatgggct ttacccttcc ctgcgggctc tctccccgac acatttgtta 1200 aaatcaaacc tgaataaaac tacaagttta atatgaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1309 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 aaaggaatga cttccagctg att 23 <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 aagatcgtcg agatgtctac ttc 23 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 aaggtccatc tggttggtat tga 23 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 aagctggact cctcctacac aat 23 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 aaagtcgacc ttcagtaagg att 23 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 cctgtctcga agtccaagtc 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 gacttggact tcgagacagg 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 ggaccttggc gtggccgtgc 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 gcacggccac gccaaggtcc 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 ctcgtacctc cccgctctcc 20 <210> 40 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 ggacagcggg gaggtacga 19 <210> 41 <211> 465 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 atggcagatg acttggactt cgagacagga gatgcagggg cctcagccac cttcccaatg 60 cagtgctcag cattacgtaa gaatggcttt gtggtgctca aaggccggcc atgtaagatc 120 gtcgagatgt ctacttcgaa gactggcaag cacggccacg ccaaggtcca tctggttggt 180 attgacatct ttactgggaa gaaatatgaa gatatctgcc cgtcaactca taatatggat 240 gtccccaaca tcaaaaggaa tgacttccag ctgattggca tccaggatgg gtacctatca 300 ctgctccagg acagcgggga ggtacgagag gaccttcgtc tccctgaggg agaccttggc 360 aaggagattg agcagaagta cgactgtgga gaagagatcc tgatcacggt gctgtctgcc 420 atgacagagg aggcagctgt tgcaatcaag gccatggcaa aataa 465 <210> 42 <211> 462 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42 atggcagacg aaattgattt cactactgga gatgccgggg cttccagcac ttaccctatg 60 cagtgctcgg ccttgcgcaa aaacggcttc gtggtgctca aaggacgacc atgcaaaata 120 gtggagatgt caacttccaa aactggaaag catggtcatg ccaaggttca ccttgttgga 180 attgatattt tcacgggcaa aaaatatgaa gatatttgtc cttctactca caacatggat 240 gttccaaata ttaagagaaa tgattatcaa ctgatatgca ttcaagatgg ttacctttcc 300 ctgctgacag aaactggtga agttcgtgag gatcttaaac tgccagaagg tgaactaggc 360 aaagaaatag agggaaaata caatgcaggt gaagatgtac aggtgtctgt catgtgtgca 420 atgagtgaag aatatgctgt agccataaaa ccctgcaaat aa 462 <210> 43 <211> 154 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala 1 5 10 15 Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val 20 25 30 Leu Lys Gly Trp Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Ala Ser Lys Thr 35 40 45 Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe 50 55 60 Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp 65 70 75 80 Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp 85 90 95 Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Pro Glu Asp Leu 100 105 110 Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp 115 120 125 Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Leu Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu 130 135 140 Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala Lys 145 150 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 44 aaaggaatga cttccagctg a 21 <210> 45 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 45 aaaggaauga cuuccagcug att 23 <210> 46 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 46 ucagcuggaa gucauuccuu utt 23 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 47 aagatcgtcg agatgtctac t 21 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 48 aagaucgucg agaugucuac utt 23 <210> 49 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 49 aguagacauc ucgacgaucu utt 23 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 50 aaggtccatc tggttggtat t 21 <210> 51 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 51 aagguccauc ugguugguau utt 23 <210> 52 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 52 aauaccaacc agauggaccu utt 23 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 53 aagctggact cctcctacac a 21 <210> 54 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 54 aagcuggacu ccuccuacac att 23 <210> 55 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 55 uguguaggag gaguccagcu utt 23 <210> 56 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 56 aaagtcgacc ttcagtaagg a 21 <210> 57 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 57 aaagucgacc uucaguaagg att 23 <210> 58 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 58 uccuuacuga aggucgacuu utt 23 <210> 59 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 59 gccaagctta atggcagatg atttgg 26 <210> 60 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 60 ctgaattcca gttattttgc catgg 25 <210> 61 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 61 aatgaattcc gccatgacag aggaggc 27 <210> 62 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 62 gcgaagcttc catggctcga gttttttttt tttttttttt tt 42 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 63 cctgtctcga agtccaagtc 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 64 ggaccttggc gtggccgtgc 20 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 65 ctcgtacctc cccgctctcc 20 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 66 cgtaccggta cggttccagg 20 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 67 ggaccttggc gtggccgtgc 20 <210> 68 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 68 Cys Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr 1 5 10 15 Asp <210> 69 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 69 aaaggaatga cttccagctg acctgtctc 29 <210> 70 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of 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Claims (21)

  1. eIF5A를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 골수종 세포를 사멸시키기 위한 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 eIF5A는 eIF5A1, eIF5A2 또는 돌연변이 eIF5A1로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 eIF5A는 eIFA1임을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 조성물은 전달 운반체를 더욱 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 전달 운반체는 벡터, 플라스미드, 리포솜, 또는 덴드리머로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 전달 운반체는 벡터임을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 운반 운반체는 아데노바이러스 벡터임을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 5항에 있어서, 상기 전달 운반체는 리포솜임을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 5항에 있어서, 상기 전달 운반체는 덴드리머임을 특징으로 하는 조성물.
  10. 다발성 골수종을 지니는 대상에 다발성 골수종 세포를 사멸시키는 약제를 제조하기 위한 eIF5A의 용도.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 eIF5A는 eIF5A1, eIF5A2, 또는 돌연변이 eIF5A1이고, 상기 돌연변이 eIF5A1는 알라닌 또는 임의의 다른 아미노산으로 변화되는 보존 된 라이신을 지니고, 상기 돌연변이는 하이푸신화(hypusinated)될 수 없음을 특징으로 하는 용도.
  12. eIF5A1을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 다발성 골수종 세포를 사멸시키는 조성물을 골수종 세포에 투여하는 것을 포함하는 다발성 골수종 세포를 사멸시키는 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 eIF5A1는 돌연변이이고, 상기 돌연변이는 알라닌 또는 임의의 다른 아미노산으로 변화되는 보존된 라이신을 지니고, 상기 돌연변이는 하이푸신화될 수 없음을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 12항에 있어서, 상기 조성물은 벡터를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 벡터는 아데노바이러스 벡터임을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 12항에 있어서, eIF-5A1에 대해 지시되는 siRNA를 투여하는 것을 더욱 포함하고, 상기 siRNA는 eIF-5A1의 내인성 발현을 하향 조절하고, 상기 eIF-5A1의 발현의 하향-조절은 IL-6의 발현을 하향 조절하며, 상기 IL-6의 하향 조절은 다발성 골수종 세포를 사멸시킴을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 3항의 조성물을 투여하는 것을 포함하고, 상기 조성물 내 eIF5A1는 다발성 골수종 세포에서 아폽토시스를 유도함을 특징으로 하는 다발성 골수종을 지니는 대상에서 다발성 골수종 세포의 아폽토시스를 유도하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 조성물은 정맥내로 투여됨을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 17 항에 있어서, 상기 조성물이 리포솜을 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 17 항에 있어서, 상기 조성물이 덴드리머를 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 3항의 조성물을 투여하고 통상의 다발성 골수종 치료법을 더욱 처치하는 단계를 포함한 다발성 골수종 세포를 사멸시키는 방법.
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2007226875A1 (en) * 2006-03-20 2007-09-27 Senesco Technologies, Inc. Use of eiF-5A1 siRNA and antisense to treat sepsis or haemorrhagic shock
JP2011516035A (ja) * 2008-02-21 2011-05-26 セネスコ テクノロジーズ，インコーポレイティド 所望のポリヌクレオチドの発現を達成するためのセンス構築物の使用と組合わせた内因的遺伝子のダウンレギュレーションを達成するためのｓｉＲＮＡの使用
CN102282259A (zh) * 2008-03-07 2011-12-14 森尼斯科技术公司 与有义构建体实现期望多核苷酸的表达的用途相组合的、sirna实现内源基因的减量调节的用途
AR073274A1 (es) * 2008-09-03 2010-10-28 Senesco Technologies Inc Composicion. uso de un polinucleotido de eif-5a1 truncado para inducir apoptosis en celulas cancerosas
WO2018024608A2 (en) * 2016-08-03 2018-02-08 Cbmed Gmbh Center For Biomarker Research In Medicine Antitumor compounds and tumor diagnosis

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999001551A2 (en) * 1997-06-30 1999-01-14 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Novel inhibitor of cellular proliferation
US7166467B2 (en) * 2001-07-23 2007-01-23 Senesco Technologies, Inc. Nucleic acids, polypeptides, compositions, and methods for modulating apoptosis
US7968523B2 (en) * 2001-07-23 2011-06-28 Senesco Technologies, Inc. Method for inducing apoptosis using apoptosis-specific EIF5-A
US7381708B2 (en) * 2001-07-23 2008-06-03 Sensco Technologies, Inc. Suppression of eIF5A1 expression by the use of antisense oligonucleotides for the prevention of retinal cell death in the glaucomatous eye
US7261875B2 (en) * 2001-12-21 2007-08-28 Board Of Regents, The University Of Texas System Dendritic poly (amino acid) carriers and methods of use
CN100558410C (zh) * 2002-05-07 2009-11-11 森尼斯科技术公司 调节凋亡的核酸,多肽,以及方法
KR20050098954A (ko) * 2003-03-05 2005-10-12 세네스코 테크놀로지스 인코포레이티드 이아이에프-5에이1의 발현을 억제하기 위한 안티센스올리고뉴클레오타이드 또는 에스아이알엔에이의 이용
NZ574973A (en) * 2003-06-06 2010-10-29 Senesco Technologies Inc Inhibition of apoptosis-specific eIF-5A ("eIF-5A1") with antisense oligonucleotides and siRNAs as anti-inflammatory therapeutics
CN102282259A (zh) * 2008-03-07 2011-12-14 森尼斯科技术公司 与有义构建体实现期望多核苷酸的表达的用途相组合的、sirna实现内源基因的减量调节的用途
US8445638B2 (en) * 2008-09-03 2013-05-21 Senesco Technologies, Inc. Use of a truncated eIF-5A1 polynucleotide to induce apoptosis in cancer cells

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