KR20080070837A - 단백질 보완을 이용한 생체내 실시간 핵산 검출 - Google Patents

Abstract

본 발명은 실시간 단백질 보완 방법을 이용하여 핵산 분자, 예컨대, RNA 분자를 생체내에서 검출하기 위한 방법에 관한 것이다. 더 나아가 본 발명은, 본 발명의 신규한 분리된 생분자 컨주게이트를 사용하여, 살아 있는 세포 내에서 실시간으로 핵산, 예를 들어, RNA를 고 민감도로 검출하기 위한 방법과 관련이 있다.

Description

단백질 보완을 이용한 생체내 실시간 핵산 검출{REAL TIME NUCLEIC ACID DETECTION IN VIVO USING PROTEIN COMPLEMENTATION}

관련 출원에 관한 크로스 레퍼런스

본원은 35 U.S.C. 119(e)에 근거하여 2005년 10월 27일자로 출원된, 미국 가특허 출원 제60/730,746호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허문헌의 전체 내용은 참고문헌으로써 본원에서 인용된다.

기술분야

본 발명은 생체내 핵산 검출에 관한 조성물 및 방법과 관련이 있다. 더 바람직하게는, 상기 조성물과 방법은 생체내에서 RNA에 대한 민감하고 실시간적인 검출을 가능하게 한다.

배경기술

RNA는 유전자 발현으로 폭넓게 결정되는 다단계 과정에 활동적인 참여자인데, 상기 과정은 핵내에서의 RNA의 전사와 가공, 핵 외부로의 이출(export), 세포질을 통한 운송과 리보좀 내에서의 번역을 포함한다. 추가로, 논-코딩 RNA(끊임없이 성장하는 부류에 속하는 RNA 분자)는 세포성 거대분자, 단백질, DNA 및 RNA가 모두 관여하는 다양한 전사 후 사건과 번역 후 사건에 참여한다: RNA 에디팅(editing), RNA 변형(modifications), DNA 메틸화 및 단백질 변형(Kiss, 2002, Mattick, 2004; Huttenhofer et al., 2005). 이러한 여러 가지 기능들을 수행하기 위하여, RNA는 정확한 시간에 정확한 세포 위치에 존재하여야 한다. 달리 말해서, 세포 내의 RNA의 공간적 및 시간적 로컬라이제이션(localization)이 세포 생물학의 중요한 메카니즘으로써 최근에 대두되었다.

RNA의 로컬라이제이션은 단백질 합성을 조절할 뿐만 아니라, 세포 계통(lineages)과 세포 소기관의 형성을 결정한다는 사실이 공지되었다(검토를 위해, 다음 문헌을 참조하라: Kloc et al., 2002). RNA가 적절하게 작동하지 않으면, 다양한 형태의 건강 이상(pathology)을 초래할 수 있다. RNA의 동적이며 불안정한 특성과 이의 움직임과 로컬라이제이션과 관련된 여러 기능에서 이의 중요한 역할은 관심과 도전을 모두 불러 일으켰다.

생체내 RNA 로컬라이제이션 연구 분야에서 현재 직면한 어려움들 중의 한가지 일예는 핵 내 poly(A)⁺-mRNA의 확산 상수(diffusion coefficient)를 평가하기 위한 적절한 방법의 부재이다. 값들은 100배(two orders of magnitude)까지(즉, 0.03-0.6 μ²/초(sec) 및 9 μ²/초) 다른 것으로 보고되었다(Politz et al., 1998, Politz et al., 1999, Molenaar et al., 2004). 따라서, 생체내조건에서 다양한 RNA의 기능과 행동을 더 잘 이해하기 위해, 살아있는 세포 내에서 이들의 로컬라이제이션과 움직임을 연구하기 위한 새로운 방법이 긴박하게 요구되고 있다는 것은 명백하다.

세포 내의 RNA를 가시화(visualization)하기 위해서, RNA는 선택적으로 표지되어야 한다. 생체내 RNA 표지화를 위한 여러 전략들이 제시되었고 사용되어 왔 다(검토를 위하여, 다음 문헌을 참조하라: Pederson, 2001). 이러한 전략들 중 대부분이 상이한 RNA-특이적 혼성화 프로브와 프로브를 핵 또는 세포질로 운반하기 위한 미세주입(microinjection) 또는 리포펙션(lipofection)을 이용한다. 또 다른 가능성은 미리 RNA를 표지하고 상기 RNA를 세포내로 주입하는 것이다. 자가-라이게이션 켄칭 프로브(Self-ligating quenching probe)가 쿨(Kool)과 동료들에 의해 박테리아 세포 내의 RNA 혼성화를 위해 성공적으로 사용되었다(Sando & Kool, 2002). 형광 2'-O-메틸-RNA 프로브는 메틸화되지 않은 올리고뉴클레오티드보다 더 안정한 것으로 밝혀졌으며 몇몇 연구 그룹에 의해 사용되었다(Carmo-Fonseca et al., 1999; Molenaar et al., 2001; Molenaar et al., 2004). 분자 표지(Molecular beacons)와 케이지드 플루오레세인(caged-fluoresein)으로 표지된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 RNA 혼성화 프로브의 개선된 변이체를 제시한다(검토를 위해 다음 문헌을 참조하라: Politz, 1999, Pederson, 2001). 분자 표지와 케이지드 프로브는 다음과 같은 이점이 있는데, 이들은 각각 표적에 혼성화되지 않거나, 조사(illumination)되지 않으면, 시그널을 생산하지 않는다; 이들은 백그라운드를 더 낮추어 결과적으로 민감도를 더 좋게 한다(Sokol et al., 1998; Perlette & Tan, 2001; Matsuo, 1998; Tsuji et al., 2001; Sei-Iida et al., 2000).

상기 혼성화 전략의 가장 심각한 제한은 세포 내의 낮은 RNA 농도로 인한 혼성화의 낮은 민감도이다. 대부분의 경우, 매우 풍부하게 존재하는 RNA 종들만 검출될 수 있다(β-액틴 mRNA, c-fos mRNA, 염기성 섬유아세포 성장 인자 RNA, 또는 총 poly(A)-RNA). 생체내에서 RNA 검출을 위한 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 것의 또 다른 장애는 이들의 급속한 핵내 축적이다(Tsuji et al., 2000; Molenaar et al., 2001).

생체내에서 RNA를 연구하기 위한 또 다른 전략은 RNA-결합 단백질과 형광 단백질 간의 융합과 RNA-표적 내의 단백질-결합 태그의 도입을 이용한다. 두 연구 그룹이 MS2 피막 단백질 및 상응하는 RNA 모티프의 상호작용에 기초한 시스템을 이용하였고(Bertrand et al., 1998; Beach et al., 1999; Beach & Bloom, 2001), 또 다른 연구그룹은 UlA 스플라이싱 단백질에 기초한 시스템을 이용하였다(Takizawa & Vale, 2000). 이 접근법은 효모 세포(Bertrand et al., 1998; Beach et al., 1999; Corral-Debrinski et al., 2000; Beach & Bloom, 2001), 및 뉴런(Rook et al., 2000)에서 특이한 RNA들의 움직임을 실시간으로 모니터링하는 것을 가능하게 할 것으로 기대되었다. 상기 기술은 형광 단백질과 세포 내에서 RNA 연구를 접목시킨 최초의 시도를 대별한다. 그러나, 상기 기술의 본질적인 한계는 RNA-결합 단백질에 융합된 완전히 기능적인 형광 단백질의 높은 백그라운드 시그널이 실제적인 모니터링을 어렵게 만든다는 것이다.

더 나아가, 생체내에서 RNA의 분석은, RNA-특이적 프로브가 세포 내부로 운반되거나(예를 들어, 분자 표지) 세포 내부에서 합성되는(예를 들어, RNA-결합 단백질(예를 들어, MS2 피막 단백질)에 융합된 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP)), 형광 검출 방법에 의존하고 있다[검토를 위하여 참고문헌(14, 15)을 참조하라]. 그러나, 이러한 방법들은 심각한 결점과 제한을 포함하고 있다. 미리-표지된 올리고 뉴클레오티드 검출 프로브는 뉴클레아제에 대해 저항력을 갖추기 위해 변형되어져야 하며, 침습적 기술(invasive techniques)을 이용하여 세포로 운반되어져야 한다(16). RNA-결합 단백질을 이용하는 제2의 접근법은 앞뒤로 나란히(in tandem) RNA-결합 단백질 인지 서열의 다수 카피(최대 96개 까지)를 지니는 관심있는 RNA를 변형시키는 것을 포함하며, 한편, 상기 RNA-결합 단백질은 전장 길이 형광 단백질에 융합된다. 그 결과로, 융합 단백질의 거대한 다합체성(multimeric) 복합체가 관심있는 RNA에 조립되는데(17-20), 상기 복합체는 세포 내에서 RNA의 정상적인 움직임과 이동에 손상을 줄 수 있다. 박테리아에서, 전장 길이 형광 단백질에 의해 초래되는 높은 백그라운드 형광이 또한 존재하는데, 상기 형광 단백질은 회합(aggregation)하는 경향이 있으며 이러한 회합체는 RNA-단백질 복합체와 혼동될 수 있다. 진핵생물에서, 서로 다른 구획(compartments)으로의 형광 단백질과 RNP 복합체의 분리는 일부 경우에 도움이 되나(21), 일반적으로 전장 길이 형광 단백질에 기인하는 높은 형광 백그라운드는 이 접근법의 민감도를 제한한다.

따라서, RNA 표지화에 관한 현재의 모든 방법들은 높은 비특이적 백그라운드와 시그널 증폭의 결여로 제약받고 있으며; 그 결과 이들 대부분은 풍부하게 존재하는 RNA 종들의 검출로 제한된다. 또한, RNA를 실시간으로 검출하기 위한 상당한 요구가 존재한다.

발명의 요약

본 발명의 발명자들은 실시한 단백질 보완 방법을 이용하여, 생체내에서 핵산 분자, 예컨대, RNA 분자를 검출할 수 있는 방법을 개발하였다. 특히, 본 발명 은 높은 신호:백그라운드 비로(그에 따라 RNA 검출 민감도를 높일 수 있음) 생체내에서 핵산(예를 들어, RNA)을 검출하기 위한 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명의 방법은 비침습적(non-invasive) 방법을 이용하여 살아 있는 세포 내의 DNA와 RNA를 검출하기 위한 방법과 성분들을 제공한다. 더 구체적으로, 본 발명의 조성물은 핵산 결합 모티프들(nucleic acid binding motifs)에 부착된 2 이상의 폴피펩티드 단편들로 분절되는 검출 단백질(detector protein)을 내포하는 검출 분자를 포함하는데, 상기 핵산 결합 모티프들은 독립적으로 기능하거나 단일 부위에 결합하기 위해 협력할 수 있다. 검출 폴리펩티드 단백질 단편들의 기능성 활성 검출 단백질로의 재결합(re-association)은, 리포터 핵산 결합 서열(예를 들어, 앱타머)을 포함하도록 변형된, 표적 핵산, 예컨대, RNA 또는 DNA의 존재시에만 일어날 것인데, 상기 표적 핵산은 핵산-결합 모티프들과 리포터 핵산 서열 상의 이들의 동종(cognate) 결합 부위(들)의 상호작용을 가능케 한다. 이러한 상호작용은 검출 단백질의 단편들을 접합시켜, 즉각적인 시그널 검출을 가능케 한다. 검출 분자의 폴리펩티드들, 특히, 검출 단백질 성분들은 활성 배열로 존재하나 단독으로 존재시 활성화되지 아니하나, 재구성되자마자 이들은 즉각적으로 활성 단백질을 형성하고, 그 결과 표적 핵산 존재시 시그널 생성이 실시간으로 발생한다. 한 구체예에서, 표적 핵산은 RNA이다. 또한, 한 구체예는 상기 검출 분자의 핵산 결합 모티프 성분으로써 RNA-결합 단백질 또는 펩티드를 포함한다.

본원에 사용된 것과 같은, "검출 컨스트럭트"는 2개 이상의 활성화된 폴리펩티드 단편들로 분절되는 상기 검출 단백질(형광 또는 효소)을 포함하는 검출 분자 를 엔코딩하는 핵산 서열을 의미하는데, 상기 단편들 각각은 핵산-결합 모티프에 컨주게이션된다. 폴리펩티드 단편들은, 표적 핵산에 대한 컨주게이션된 핵산 결합 모티프의 결합에 의해 접합될 때, 완전하게 활성있는 단백질로 재구성되고, 즉각적으로 검출될 수 있다.

본원에 사용된 것과 같은, "리포터 컨스트럭트"는 리포터 분자를 엔코딩하는 핵산 서열을 의미하는데, 관심있는 유전자를 엔코딩하는 상기 핵산(예를 들어, RNA 또는 DNA)과, 표적 핵산 결합 서열(예를 들어, 앱타머)을 포함한다. 핵산 결합 서열은 검출 컨스트럭트의 핵산-결합 모티프에 의해 인지될 수 있다. 상기 핵산 결합 서열은 핵산, 단백질, 앱타머, 또는 앱타머 태그일 수 있다.

한 구체예에서, 검출 단백질은 예를 들어, EGFP와 같은, 형광 분자이다. 본 발명의 한 구체예에서, 형광 리포터는 알파 단편(대략 아미노산 1-158)과 베타 단편(대략 아미노산 159-239)으로 분절되는 EGFP이다. 알파 단편은 완전하게 형성된(fully formed) 성숙한 발색단을 포함하는데, 단독으로는 형광을 나타내지 아니하나, 형광을 나타내기 위해 프라이밍(priming)되며 베타 단편과 쌍을 이루게 될 때, 즉각적으로 형광을 나타낸다. 형광의 즉시성(immediacy)은 종래 기술에서 현재까지 이용할 수 없었던 생체내에서 RNA의 실시간 검출을 가능케 한다. 중요하게는, 알파 및 베타 단편들은 표적 핵산(예를 들어, 표적 RNA)의 부재시 재회합되지 아니하거나 형광을 나타내지 아니한다.

또 다른 구체예에서, 형광 단백질은 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP)이다. 대안적인 구체예에서, 형광 단백질은 노란색 형광 단 백질(YFP), 강화된 노란색 형광 단백질(EYFP), 파란색 형광 단백질(BFP), 강화된 파란색 형광 단백질(EBFP), 청록색 형광 단백질(CFP), 강화된 청록색 형광 단백질(ECFP) 또는 적색 형광 단백질(dsRED) 또는 기타 임의의 천연 형광 단백질 또는 상기 나열된 단백질의 유전자적으로 조작된 형광 단백질이다. 아직 추가의 구체예에서, 재구성된 형광 단백질은 상기 나열된 형광 단백질들로부터의 단편들의 혼합물 또는 이들의 임의의 조합물이다.

대안적으로, 검출 단백질은 시그널 증폭을 가능케 하는 효소이다. 효소는 예를 들어, 베타-갈락토시다아제, 베타락타메이즈, 베타-글루코시다아제, 베타-글루쿠로니다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제일 수 있다. 특정 구체예에서, 검출 효소는 베타락타메이즈이다.

본 발명의 중요한 구체예에서, 본 발명의 조성물과 방법은 생체내에서 RNA의 실시간 검출을 가능케 하는 리포터 분석을 제공한다. 한 구체예에서, 검출 컨스트럭트를 안정적으로 발현시킬 수 있는 관심있는 세포가 제작된다. 검출 컨스트럭트는 표적 RNA의 부재시 검출 단백질로부터의 시그널을 생성하지 못하고 그리하여 형광을 나타내지 아니하거나 활성을 나타내지 아니하는 검출 분자를 발현한다. 세포는 또한 검출 분자의 핵산 결합 모티프(들)을 위한 결합 부위 및 관심있는 유전자를 포함하는 리포터 분자를 엔코딩하는 리포터 컨스트럭트를 발현할 수도 있다. 그러한 리포터 컨스트럭트의 발현은 유도될 수 있다. 그러한 리포터 분자가 세포 내에서 발현될 때, 검출 분자는 표적 RNA에 결합할 것이고 검출 단백질 재구성 및 활성 단백질과 시그널의 생성을 용이하게 할 것이다. 이것은 생체내에서 RNA 발현 의 실시간 검출을 가능케 하며, 표 10-11과 표 18-19 및 실시예 9 내지 11에 예시되어 있다.

대안적인 구체예에서, 관심있는 세포는 리포터 분자를 포함하는 바이시스트로닉(bicistronic) 핵산 서열을 발현할 수 있는데, 여기서 검출 컨스트럭트는 구조적으로(constitutively) 발현되며 리포터 컨스트럭트의 발현은 관심있는 프로모터에 작동적으로 연결되어 있다. 관련된 구체예에서, 리포터 컨스트럭트(관심있는 프로모터에 작동적으로 연결됨) 및 검출 컨스트럭트는 별개의 핵산 서열에 존재한다. 프로모터가 특정 자극에 의해 세포 내에서 활성화될 때, 표적 핵산 서열을 위한 결합 부위(들)는 이용가능하게 되며 검출 분자의 핵산 결합 단백질의 결합은 즉각적으로 검출될 수 있는 검출 폴리펩티드 단편들의 회합과 활성 검출 단백질의 형성을 용이하게 한다. 이러한 구체예는 생체내에서 프로모터 기능을 실시간으로 연구될 수 있게 한다. 예를 들어, 유전자의 조절(regulation)은 RNA 결합 부위를 운반하는(driving) 프로모터를 발현하는 플라스미드를 트랜스펙션시키고 임의의 검출 컨스트럭트 기준(baseline) 활성을 분석함으로써 실시간으로 연구될 수 있다. 관련된 구체예에서, 세포는 i) 화합물 또는 화합물들로 접촉되거나; ii) 프로모터의 활성을 변화(alteration)시킬 수 있는, 다양한 조건에 처해지게 되며, 그로 인해 RNA의 전사에 있어서 증가, 감소 또는 불변이 초래된다. 이러한 변화는 즉각적으로 검출 컨스트럭트에 의해 검출된다.

유사한 구체예에서, "테트-온(tet-on)" 또는 "테트-오프(tet-off)" 시스템이 본 발명의 방법에서 활용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 검출 컨스트럭트를 안 정하게 발현시킬 수 있는 관심있는 세포가 제작될 수 있다. 또한, 세포는 표적 결합 부위(들)과 검출 분자 핵산 결합 모티프들을 위한 관심있는 유전자의 조절된 전사를 가능케 하는 테트-온 또는 테트-오프 조절가능 리포터 컨스트럭트를 안정적으로 발현시킬 수 있다). 예를 들어, 테트-오프 시스템에서, 세포는 관심있는 유전자를 즉각적으로 발현시키게 될 것이며 리포터 컨스트럭트는 활성화될 것이고 즉각적으로 검출될 수 있을 것이다. tet의 부가에 따라, 리포터 컨스트럭트(관심있는 유전자와 표적 핵산 결합 부위를 포함함)의 전사는 종결(shut off)되고 이미 전사된 전사체들만 실시간으로 분석될 수 있다. 이 테트-오프 예에서, 통상의 기술자는 감소된 리포터 형광 또는 활성을 검출함으로써 생체내에서 실시간으로, 예를 들어, RNA 반감기와 같은 RNA의 안정성을 분석할 수 있을 것이다.

대안적인 구체예에서, "테트-온" 컨스트럭트의 사용은 살아 있는 세포 내에서 관심있는 유전자의 안정적 발현을 가능케 하는데, 시스템에 tet의 부가가 리포터 컨스트럭트의 전사를 개시시키는 결과를 가져온다. 본 발명의 검출 분자는 이후 이의 표적 RNA에 결합할 수 있고 즉각적으로 검출될 수 있다. 이 구체예에서, RNA 로컬라이제이션은 당해 실험을 수행하는 사람에 의해 기록(dictation)됨으로써 실시간으로 연구될 수 있다.

아직 본 발명의 또 다른 구체예에서, 리포터 분석은 임의 개체의 생체내 분석이다. 이에만 국한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 동물, 인간이 아닌 동물, 생쥐, 제브라피쉬, 선충, 또는 개구리가 검출 컨스트럭트와 상기 검출 컨스트럭트에 결합될 RNA 결합 부위를 지닌 관심있는 유전자 둘 모두를 발현시키기 위해 제작될 수 있다. 개체 내에서 두 컨스트럭트들의 발현은 1일째 태아로부터 성체기 내내 샘플을 채취함으로써 발생(development) 전 기간에 걸쳐 관심있는 전사체의 분석을 가능하게 한다. 한 구체예에서, 개체는 포유동물이다. 한 구체예에서, 포유동물은 생쥐이고, 또 다른 구체예에서, 개체는 유전자도입(transgenic) 개체, 이에만 국한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 유전자도입 생쥐이다.

대안적으로, 본 발명의 조성물과 방법은 제자리 혼성화(in situ hybridization)와 유사한 시험관내 RNA 실시간 검출을 제공한다. 그러한 구체예에서, 검출 분자의 핵산 결합 모티프에 결합할 RNA 결합 서열과 더불어 관심있는 RNA를 포함하는 리포터 컨스트럭트를 발현하는 세포는 투과(permeabilization)될 수 있게 되며 본 발명의 검출 컨스트럭트는 세포에 투여된다. 관심있는 RNA가 발현되면, 검출 컨스트럭트는 RNA 결합 서열에 결합할 것이며 RNA의 로컬라이제이션과 풍부도가 결정될 수 있다. 전통적인 제자리 혼성화 기술을 능가하는 이 시스템의 이점은 풍부도가 낮은 RNA(효소 리포터를 이용하는 검출 컨스트럭트에 의해 가시화될 수 있는 시그널 증폭에 기인함)를 검출할 수 있는 능력과 신속하게 그리고 방사능 없이 분석을 끝마칠 수 있는 능력에 있다. 검출 컨스트럭트 검출의 즉시성은 매우 바람직할 수 있다. 현재까지, (예를 들어, 방사능과 함께) 제자리 혼성화를 수행하는 전통적인 방법은 심지어 실험이 유효한지 아닌지를 알기전까지 수주 내지 수개월이 걸릴 수 있다. 또한, 전통적인 제자리 혼성화에 사용된 RNA 프로브는 RNA의 용이한 분해와 방사능의 사용으로 인해 준비하기가 어렵다. 본 발명의 방법에서, 방사능 또는 RNA 프로브는 요구되지 아니한다. 검출 컨스트럭트는, 당업계에 통상의 기술자에게 공지되어 있는 것과 같이, 예를 들어, 박테리아로부터, 용이하게 제조된다. 그러한 분석법은 항체가 시험관내에서 단백질을 검출하기 위해 사용됨으로 인하여 면역조직(immunohisto)-화학 또는 면역세포(immunocyto)-화학 기술과 유사하다. 여기서, RNA가 검출된다.

대안적인 구체예에서, 본 발명의 조성물과 방법은 시험관내에서 핵산, 특히 RNA와 DNA의 실시간 검출을 제공하는데, RNA와 단백질 컨스트럭트 둘 모두가 신체 외부의 세포 내에서, 예를 들어, 시험관내에서, 조작될 때의 본 발명의 용도와 관련되어 있으며, 비제한적인 예로서, 생체외에 존재하는 DNA의 검출이 제공된다.

더욱이, 본 발명의 조성물과 방법은 생체내에서 실시간으로 DNA를 검출하기 위한 구체예에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 검출 컨스트럭트는 2개 이상의 비활성화된 폴리펩티드 단편들로 분절되는 검출 단백질(형광 또는 효소 둘 중 어느 하나)을 포함할 수 있는데, 상기 각각의 단편은 핵산-결합 모티프들과 결합된다. 표적 핵산, 예를 들어, 앱타머의 존재로 접합될 때, 폴리펩티드 단편들은 완전히 활성화된 검출 단백질을 형성하며, 즉각적으로 검출될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 게놈 내의 다양한 유전자좌(loci)의 복제에 대한 실시간 검출을 가능케 한다. 검출 컨스트럭트 내의 검출 단백질과 결합한 핵산-결합 모티프들은 RNA 또는 DNA의 다양한 지역에 특이적이며 이러한 유전자좌의 복제는 생체내에서 실시간으로 검출될 수 있다.

유사하게, 통상의 기술자는 본 발명의 방법과 조성물을 사용하여 생체내에서 염색체를 실시간으로 검출할 수 있다. 예를 들어, 검출 컨스트럭트는 텔로미어 결 합 단백질과 결합된 검출 단백질을 포함하며 세포 내에서 발현될 수 있다. 이렇게, 텔로미어는 세포 생명주기(lifespan) 내내 실시간으로 검출될 수 있다. 본원에서 제시된 조성물과 방법의 이점은 특이성이 2개의 절반(half)으로 분절되는 텔로미어 결합 단백질을 제공함으로써 증가된다는 것인데, 상기 각각의 절반은 검출 단백질의 한 절반과 결합한다. 단일 결합 부위에 대한 2개의 반쪽짜리 텔로미어 결합 단백질들의 협조된 결합은 표적 인지 이전에 검출 활성이 거의 없음을 보장한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 방법, 특히 생체내에서 RNA 검출에 적당한 키트를 제공한다. 한 구체예에서, 키트는 검출 컨스트럭트와 유도성(inducible) 리포터 컨스트럭트를 포함한다. 한 구체예에서, 리포터 컨스트럭트와 검출 컨스트럭트는 별개의 핵산 분자에 존재한다. 또 다른 구체예에서, 이들은 바이시스트로닉 핵산 분자의 두 부분에 존재한다. 또 다른 구체예에서, 리포터 분자는 관심있는 전문의(practitioner)의 유전자를 부가하기 위해 변형될 수 있으며, 또 다른 구체예에서, 리포터 분자의 발현은 테트-온 또는 테트-오프 프로모터에 작동적으로 연결된다. 또 다른 변형 구체예에서, 표적 핵산 서열을 포함하는, 리포터 컨스트럭트는 전문의의 관심있는 프로모터에 의해 조절되도록 상기 전문의에 의해 변형될 수 있다. 이러한 구체예들 각각에 있어서, 키트는 검출 분자 내에 선택된 검출 단백질의 분절된 폴리펩티드들을 포함하며, 또한 사용지침서와 검출 단백질로부터의 시그널을 검출하기 위한 시약을 포함한다. 몇몇 구체예들에서, 키트는 또한 샘플 내에 존재하는 표적 핵산 또는 표적 핵산의 양을 포착(capturing) 및/또 는 검출하는데 적당한 시약들을 포함한다. 존재하는 표적 핵산 또는 표적 핵산의 양을 검출하기 위한 시약들은 효소 활성 시약 또는 조립된 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 항체는 표지될 수 있다.

단백질 보완과 효소 리포터의 조합은 백그라운드의 상당한 감소와 시그널의 증폭을 가능케 한다. 이는 결국 풍부도가 중간 정도인 핵산을 분석할 수 있는 생체내 RNA 검출 기술로 귀결된다.

추가의 구체예에서, 본 발명은 생체내에서 RNA를 검출하기 위한 수단(means)을 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 양상은 아래에 기재되어 있다.

도면의 간단한 설명

도 1: 사카로미세스 세레비지애(Saccharomyces cervisiae)에서의 유전자 발현에 대한 앱타머의 영향을 연구하기 위한 전사 시스템(Blake et al., 2003).

도 2: 마커 유전자의 3' 말단에 앱타머의 삽입은 효모에서의 유전자 발현에 영향을 미치지 아니한다. 앱타머 태그는 EGFP의 3' 말단에 삽입되었다(플라스미드 설명에 관하여 도 1을 참조하라). 배양물(Cultures)은 0.2% 갈락토오스 및 40 ng/ml ATc의 존재하에 대수기(logarithmic phase)까지 배양되었다. 숫자 1-4는 유도성 컨스트럭트의 4개의 상이한 염색체 통합에 해당한다. 각각의 배양물에서 50,000개의 세포가 FACS로 분석되었다.

도 3: 본 연구에 사용된 EGFP와 eIF4A의 단편들을 포함하는 단백질 융합체에 대한 개관. 진핵생물 개시 인자는 2개의 도메인으로 분절되었으며, 각각의 도메인은 2개의 EGFP 단편에 융합되어 EGFP(A)-eIF4A(Fl)과 EGFP(B)-eIF4A(Fl)을 생성하였다. 숫자는 각 간편에 포함된 아미노산의 범위를 나타낸다. (N, N-말단; C, C-말단).

도 4: 앱타머-태그 부재시 박테리아 세포 내에서 2개의 키메라 단백질의 발현은 형광을 복원(reconstitution)시키지 아니한다. EGFP(A)-eIF4A(Fl)와 EGFP(B)-eIF4A(Fl)는 BL21(DE3) 세포 내에서 동시-발현(co-expression)되었다. 배양물은 37℃에서 3시간 동안 1 mM IPTG로 유도되었고 복합체 형성은 형광 유세포 분석기에 의해 모니터링되었다. 전장 길이 EGFP를 발현하는 BL21(DE3) 세포는 유도(bEGFP)에 과한 양성 대조군으로 사용되었고, A-Fl과 B-Fl의 발현은 음성 대조군으로 고려되었다.

도 5: 2개의 인접 앱타머-태그 및 동종 앱타머와 독립적으로 상호작용하는 2개의 펩티드를 이용한 생체내 단백질 보완에 대한 도식. 분절된 마커 단백질은 회색으로, RNA-결합 펩티드(프로브 단백질)는 오렌지색으로 도시되어 있다. (도 5B) 각각 HIV Tat 단백질의 CQ 펩티드(서열번호 2); HIV rev 펩티드(서열번호 l) 및 HTLV Rex 펩티드(서열번호 3)에 대한 시험관내 선별로 발견된 3개의 앱타머(Kd 및 참고문헌(refs)에 대하여 표 1을 참조하라). 이러한 구조 또는 유사한 구조가 대안적인 디자인(분절된 단백질 접근법에 반대되는 디자인)에서 RNA 태그로서 본 발명자들의 프로젝트에서 사용될 수 있다.

도 6: 생체내 RNA 연구에 관한 핵산 상호작용에 의해 뒷받침되는 단백질 보 완 분석법의 개관. 효소 활성 또는 형광체(fluorogenic) 특성을 지닌 단백질은 2개의 비활성 부분들로 분절된다(알파- 및 베타-소단위체로 명명됨). 이러한 부분들은 또 다른 단백질을 지니는 키메라로서 생체내에서 발현되는데, 상기 단백질은 RNA-결합 도메인을 지닌다. 이상적인 RNA-결합 단백질은 두 부분으로 구성될 것인데, 상기 부분들은 그 자체로는 활성이 없으나 회합되면 활성을 띠게 된다. RNA-결합 단백질에 의해 인지될 수 있는 모티프를 포함한, RNA의 존재시, 마커 단백질의 활성은 회복된다. 단백질이 효소인 경우에, 시그널은 증폭된다. 단백질이 형광체인 경우, 시그널 증폭은 없으나, 백그라운드도 또한 없는데, 이는 형광이 표적 RNA의 존재에 완전히 의존적이기 때문이다.

도 7: 생체내 RNA 검출에 대한 도식. 표적 RNA는 생체내에서 합성되거나 세포 내로 주입된다. 2개의 키메라 단백질이 생체내에서 합성되거나 세포 내로 트랜스펙션된다. 각각의 키메라는 마커 단백질 및 도메인의 일부분을 포함하는데, 표적 RNA 내의 특별한 2차 구조(또는 모티프)에 특이적으로 결합한다. RNA-결합 단백질에 의해 특이적으로 인지되는, 태그를 운반하는 표적 RNA의 존재시, 단백질 마커는 조립되는데, 상기 마커는 이의 활성(형광체 또는 효소 활성)에 의해 검출된다.

도 8: RNA 발현이 생체내에서 실시간으로 분석되는 본 발명의 한 구체예에 대한 도식. 관심있는 유전자와 RNA 결합 부위는 플라스미드 상에서 엔코딩되며, 안정적으로 통합된 본 발명의 리포터 컨스트럭트를 지니는 세포 내로 트랜스펙션된다. 유전자(및 RNA 결합 부위)가 발현될 때, 리포터 컨스트럭트는 활성화된다.

도 9: 분절된 EGFP에 대한 단백질 보완은 살아 있는 박테리아 세포에서 RNA를 검출한다. (a) 각각 분절된 eIF4A와 분절된 EGFP의 단편을 포함하는 2개의 단백질 융합체의 발현은 형광 시그널을 초래하지 아니한다. (b) 전장 길이 EGFP의 발현은 결국 대장균 세포에서 불균일한 형광을 초래한다. (c) 2개의 단백질 융합체 및 앱타머를 지닌 RNA 전사체의 동시 발현은 종종 세포 극(poles)에 로컬라이제이션된 형광 시그널을 초래한다. 상단 열: 대장균에서 발현된 분자 컨스트럭트. 제 2 열: 보완 복합체의 성분을 발현하는 플라스미드. 제 3 열: IPTG 유도 전(검정), IPTG 유도 후(적색), EGFP 보완 복합체를 발현하는 세포의 형광 분포가 FACS에 의해 획득되었다. 하단 열: 보완 복합체의 대응하는 성분들을 발현하는 대장균 세포의 형광 현미경사진(micrograph).

도 10: 단일 박테리아 내의 전사에 관한 역학(dynamics). (a) RNA 앱타머-eIF4A 보완 복합체를 발현하는 대장균 세포의 30분 간격의 간헐 촬영(time-lapse) 형광 현미경사진. 위상차(Phase-contrast) 현미경사진은 실험이 진행되는 동안 변화가 없었다.

도 11: 살아 있는 세포 내에서 RNA 검출에 의해 촉진된 형광의 동역학. (b) 여러 단일 세포에서의 형광 변화에 대한 동역학. (c) 필드 내 모든 세포의 총 형광 변화에 대한 동역학. (d) 세포의 장축을 따라 측정된 단일 박테리아 세포에서 실시간 형광 분포의 변화.

도 12: 앱타머 서열 없이 RNA를 발현하는 세포는 FACS로 획득된 lacZ 전사체 존재시의 보완 복합체의 단백질 성분들을 발현하는 세포의 고형광 형광분포를 나타 내지 아니한다. IPTG 유도 전, 검은색; IPTG 유도 후, 적색. 비교를 위하여, 앱타머 서열을 포함하는 RNA와 상호보완하는 단백질을 발현시키는 세포의 형광 분포는 파란색으로 제시된다.

도 13: 고복제수 벡터(~ 100 카피)로부터 앱타머-포함 표적 RNA를 발현하는 세포는 더 강한 형광을 나타낸다. (a) 단백질 융합체 및 앱타머 서열을 포함한 RNA 전사체를 발현하는 플라스미드에 관한 도식. (b) FACS에 의해 획득된 EGFP 보완 복합체를 발현하는 세포의 형광 분포. IPTG 유도 전, 검정; IPTG 유도 후, 적색. 비교를 위하여, 더 낮은 복제수(~40) 플라스미드로부터 발현된 앱타머를 지니는 세포의 형광 분포는 파란색으로 제시된다.

도 14: 전장 길이 EGFP를 발현하는 세포(a)와 분절된 EGFP를 포함하는 재구성된 핵단백질 복합체(b)의 형광 스펙트럼은 서로 다르다. 세포 현탁액을 형광 밀도 0.5(OD₆₀₀=O.5)까지 희석시켰고, F-2500 형광강도측정기(Hitachi)를 사용하여 형광을 기록하였다. 동일 밀도를 지닌 비유도된 세포는 산란(scattering)에 관한 대조군으로 사용되었다.

도 15: 새로 분열된 세포는 형광을 나타내지 아니한다. (a) 표기된 시점에 촬영된 위상차(phase-contrast) 이미지. (b) 대응되는 형광 사진.

도 16: 2성분(Binary) 펩티드-RNA 앱타머 상호작용에 기초한 형광 단백질 보완에 관한 디자인. EGFP의 2개의 단편(α- 및 β- 단편)은 2개의 바이러스 펩티드, HIV-I Rex 펩티드 및 박테리오파지 λN 펩티드에 융합되었다. 2개의 상응하는 앱타머를 지니는 RNA 전사체의 존재시에, 2개의 펩티드들은 동종 앱타머와 상호작용하며 분절된 EGFP의 2개의 단편들과 접합된다. EGFP의 재조립은 결국 강화된 형광의 출현으로 귀결된다.

도 17: 2성분 앱타머/펩티드 상호작용에 기초한 분절된 EGFP의 단백질 보완은 살아있는 박테리아 세포에서 RNA를 검출한다. 저농도의 IPTG(0.01 mM)는 백그라운드로부터의 시그널에 대한 판별을 가능케 한다. A. 1.00 mM IPTG에 의해 유도된 세포의 형광 분포. B. 농도를 감소시킨 IPTG에 의해 유도된 세포의 형광 분포.

도 18: 형광 시그널의 상이한 로컬라이제이션을 지닌 대장균 세포.

도 19: 단일 박테리아 내의 RNA 로컬라이제이션과 농도 변화의 역학. (a) 보완 복합체를 발현하는 대장균 세포의 30분 간격의 간헐 촬영 형광 현미경사진. 위상차 현미경사진은 실험이 진행되는 동안 변화가 없었다. (b) 2개의 단일 세포에서 측정된 총 형광. (c) 세포의 장축을 따라 측정된 단일 박테리아 세포에서의 실시간 형광 분포에서의 변화.

도 2OA 및 2OB: DNA 이중나선(duplex) 형성에 의해 뒷받침되는 기능적 EGFP의 재조립. 실험 개관. 각각 C- 및 N-말단에 Cys 잔기를 지니는 EGFP의 정제된 α- 및 β- 단편을 N-[6-(비오티나미도)헥실]-3'-(2'-피리딜디티오)프로피오나미드(HPDP-비오틴, Pierce)로 비오틴표지화(biotinylation)시키고, 정제하고, 동일 몰당량(equimolar amounts)의 스트렙트아비딘과 함께 인큐베이션하였다. 그 후 이러한 복합체를 동일 몰당량의 21개 뉴클레오티드(nt) 길이의 2개의 상보적인 올리고뉴클레오티드와 함께 별개로 인큐베이션하였다. 각 단계에서 복합체의 수율을 겔 이동도 분석법(gel shift assay)으로 검증하고 100%에 근접되어 있음을 확인하였다. 그 후 2개의 단백질-올리고뉴클레오티드 키메라를 동일 몰 농도로 혼합하였다. 1B: 천연(상단) 및 덧붙여진 21 bp DNA 이중나선(하단)을 지닌 재조립된 EGFP의 형광 방출 스펙트럼, 480 nm에서 여기. 형광 스펙트럼은 Na-인산염 완충액(pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA 중에서 측정되었다.

도 21 : Mg²⁺ 이온은 천연 EGFP와 재구성된 EGFP의 형광에 상이한 영향을 미친다.

도 22A 및 22B: 도 22A: 부가된 상보적인 21-nt 길이의 올리고뉴클레오티드를 지닌 EGFP의 α- 및 β-단편을 혼합하자마자 형광 동역학이 급속하게 증가된다. 도 22B: 모든 단계들의 t_l/2과 함께 S65T에서 발색단 형성에 관한 동력학적 경로(짐머의 문헌(Zimmer, 2002)에 근거).

도 23A-4B: EGFP의 폴딩된 α-단편은 미리 형성된 발색단을 포함할 수 있다. 도 23A: 이산 분자 역학(DMD, discrete molecular dynamics) 시뮬레이션(Dokholyan, 비공개)으로부터의 10개의 정렬된 전형적 폴딩 α-단편 구조의 백본 대표도. 발색단-형성 아미노산은 파란색으로 제시되어 있다. 단편의 촘촘히 쌓인 N-말단 주요부와 분자의 나머지 부분과의 적은 수의 접촉으로 인하여 매우 유연한 잔여 단편의 C-말단부를 주목하라. 도 23B: 폴딩된 α-도메인 및 전장 길이 EGFP의 정렬도. 전장 길이 EGFP는 노란색으로 채색되어 있고 α-도메인은 파란색으로 채색되어 있다. 발색단-형성 잔기(#62-70)는 적색으로 제시되어 있다. 도 23C: 전장 크기 EGFP 내의 아미노산과 비교한 EGFP의 α-단편 내의 각 잔기의 제곱평균제곱근편차(RMSD, root-mean-square-deviation). RMSD 값은 단백질이 폴딩될 때 저온에서 DMD 시뮬레이션에 근거하여 계산된다. 발색단-형성 아미노산은 음영 지역에 존재하며 이들의 편차는 ≤ 2Å이다.

도 24A-24D: EGFP의 α-단편은 미리 형성된 발색단을 포함한다. 도 24A: EGFP의 흡광도 스펙트럼. 도 24B: EGFP의 α- 및 β-단편의 흡광도. 도 24C: EGFP의 형광 스펙트럼(파란색 - 여기, 핑크색 - 방출). 도 24D: α-단편의 형광 스펙트럼(파란색 - 여기, 핑크색 - 방출). 모든 단백질은 동일 몰 농도로 스펙트럼 분석되었다.

도 25-25B: 부분적 단백질가수분해로 GFP에서 동정된 발색단-포함 펩티드(도 25A) 및 산성/중성 pH에서 화학적으로 합성된 발색단(도 25B)의 흡광도(니와 등(Niwa et al., 1996)의 문헌으로부터).

도 26: 단백질 보완 분석을 뒷받침하는 핵산 상호작용의 2가지 가능한 배열.

도 27: 자가-분절(Self-splitting) 인테인(intein)을 지닌 키메라로서 대장균에서 발현된 EGFP의 베타-단편(베타-시스테인(베타-cys))의 정제. 레인 6의 단백질은 EGFP의 인테인의 자가-분절 후 획득된 순수한 β-소단위체이다.

도 28: 자가-분절 인테인을 지닌 키메라로서 대장균에서 발현된 EGFP의 알파-단편의 정제. 레인 5의 단백질은 EGFP의 순수한 α-소단위체이다.

도 29: SH-포함 올리고뉴클레오티드를 지닌 단백질의 컨주게이션은 거의 100% 완료된다. 비변성(Non-denaturing) PAGE를 사용한 분석. 컨주게이션 후, 단 백질은 음 전하를 띠는 올리고뉴클레오티드에 연결된다. 따라서, 변형된 단백질은 비변형된 것보다 더 빨리 이동한다(레인 1과 2, 그리고 3과 4를 비교하라). 올리고뉴클레오티드가 비오틴표지화되면, 스트렙트아비딘과 복합체를 이룰 수 있다. 이와 같은 복합체는 단독의 스트렙트아비딘보다 더 빨리 이동한다(레인 6과 7을 비교하라). 이러한 데이터로부터 본 발명자들은 단백질과 커플링된 올리고뉴클레오티드의 효율이 거의 100%에 달한다는 결론을 얻는다.

도 30: 결합된 알파+A 및 베타+B의 형광은 활성 EGFP의 재구성을 보여주며, 한편 올리고뉴클레오티드의 부재시 활성 EGFP는 존재하지 아니한다.

도 31: 단백질 효소 활성의 회복을 수반하는 단백질 보완의 도식. 원리는 도 6과 유사하다. 효소의 재조립은 RNA와 RNA-결합 단백질의 상호작용에 좌우된다. 활성있는 재조립 효소는 이의 기질로 분절되는데, 색원체성(chromogenic) 또는 형광체성 산물로 귀결된다. 따라서 시그널은 단백질의 효소 활성에 기인하여 증폭된다.

발명의 상세한 설명

본 발명자들은 세포 내에서의 신속한 RNA 검출에 관한 신규한 방법을 개발하였는데, 상기 RNA는 고 민감도 검출을 가능케 하는 높은 시그널 대 백그라운드 비로 검출될 수 있다. 본 발명은 시험관내와 생체내에서 실시간으로 핵산, 예를 들어, RNA와 DNA의 민감한 검출을 위한 조성물과 방법을 포함한다. 특히, 본 발명은 핵산 결합 모티프, 예를 들어, RNA-결합 모티프에 부착되는 2개 이상의 폴리펩티드 단편들로 절단되는 검출 단백질을 포함하는 검출 분자를 사용하는 방법을 포함하는데, 상기 검출 분자는 독립적으로 기능하거나 단일 핵산 결합 부위에 결합하기 위해 협동할 수 있다. 검출 단백질 단편들의 기능성 검출 단백질로의 재회합은 RNA-결합 모티프와 핵산 상의 이들의 동종 결합 부위(들)과의 상호작용의 결과로서 표적 핵산 분자의 존재시에만 일어날 것이다. 이 상호작용은 검출 단백질의 상보적인 폴리펩티드 단편들을 접합시키게 되어, 시그널 검출을 가능케 할 것이다.

본 발명은, 2개 이상의 폴리펩티드 단백질 단편들의 활성 단백질로의 재회합을 의미하는, 단백질 보완에 기초한, 생체내에서 핵산, 예컨대, RNA를 시각화하기 위한 혁신적인 방법을 제공한다. 특히, 분절된 폴리펩티드들은 활성있는 배열로 존재하지만, 단독으로 존재하는 폴리펩티드들은 비활성이며, 그 결과 상보적인 폴리펩티드 단편과의 이들의 회합은 즉각적으로 활성 검출 단백질을 형성한다. 이 경우, 보완은 추가의 핵산/단백질 상호작용에 의해 보조되는 경우에만 일어난다. 한 구체예에서, 고-친화력 및 고-특이성 단백질/RNA 앱타머 상호작용이 소개된다. 앱타머는 표적 RNA 내에 인지 태그로서 발현되는 반면, 핵산 결합 모티프는 분절된 검출 단백질의 단편들에 융합된 2개의 비활성 단편들로 합성된다. 핵산 결합 모티프 단편들과 앱타머의 상호작용은 검출 단백질 단편들을 접합시키는데, 이는 결과적으로 세포 내부에서의 재조립된 검출 단백질의 효소 활성 또는 형광을 초래한다.

한 구체예에서, 본원에 개시된 방법은 핵산의 실시간 검출에 사용될 수 있다. 검출 분자를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함하는 검출 컨스트럭트, 핵산 결합 모티프와 컨주게이션된 검출 단백질의 한 폴리펩티드 단편을 포함하는 검출 분자와 핵산 결합 모티프에 컨주게이션된 검출 단백질의 하나 이상의 다른 폴리펩티드 단편들이 소개된다. 또한, 본 발명의 분석법은 관심있는 뉴클레오티드와 핵산 결합 서열을 포함하는 리포터 분자를 엔코딩하는 리포터 컨스트럭트를 이용한다. 핵산 결합 서열은 검출 분자의 핵산 결합 모티프들에 의해 인지된다. 상기 인지는 검출 단백질이 재구성되고 실시간적으로 그리고 즉각적으로 검출되는 것을 가능케 한다. 검출 단백질은 표적 핵산의 부재시 활성을 갖지 아니하며 따라서 매우 민감하며 낮은 백그라운드를 나타낸다. 또한, 검출 단백질의 단편화(fragmentation)는, 표적 핵산 서열 존재시 인지되자마자, 활성이 즉각적으로 검출될 수 있도록 디자인된다.

본 발명의 한 구체예에서, 핵산은 RNA이다. mRNA, 및 miRNA를 포함하는 군에서 선택된 임의의 RNA가 검출될 수 있다. 대안적으로, 핵산은 DNA이다.

본 발명의 분석법은 핵산 결합 모티프에 대해 설명한다. 한 구체예에서, 모티프는 핵산 결합 모티프가 폴리펩티드 단편으로 분절되는 방식으로 검출 단백질과 결합될 수 있고, 한 단편은 검출 단백질의 한 단편과 컨주게이션되고 핵산 폴리펩티드 단편들의 나머지 단편들은 검출 단백질의 하나 이상의 다른 단편들과 컨주게이션된다. 이 구체예에서, 모티프의 결합은 협조하여 움직이며 각각의 단편은 한 핵산 결합 서열에 결합하기 위해 제시되어져야 한다.

대안적인 구체예에서, 검출 단백질의 한 폴리펩티드 단편과 결합되는 핵산 결합 모티프는 검출 단백질의 하나 이상의 다른 단편들에 컨주게이션되는 다른 핵산 결합 모티프와는 독립된 전장 길이 모티프일 수 있다. 예를 들어, 핵산 결합 단백질은 작은 다-도메인(multi-domain) 핵산 결합 단백질일 수 있는데, 그 결과 각 도메인은 검출 단백질의 하나 이상의 단편들에 결합된다. 이 구체예에서, 핵산 결합 모티프들의 리포터 분자 내의 이들의 동종 핵산 서열들에 대한 결합은 독립적이다.

세포 내에서 컨스트럭트의 발현

본 발명의 한 구체예에서, 검출 및 리포터 분자들은 세포 내의 생체내조건에서 발현된다. 이를 달성하기 위하여, 검출 및 리포터 분자들을 엔코딩하는 핵산 서열들은 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 적당한 기술, 예를 들어, 형질전환(transformation) 또는 트랜스펙션(transfection)에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 한 구체예에서, 컨스트럭트들은, 예를 들어, 단일 핵산 서열 상에 존재할 수 있다. 대안적인 구체예에서, 예를 들어, 이들은 2개의 컨스트럭트들 상에 존재할 수 있다(리포터 컨스트럭트를 포함하는 한 컨스트럭트 및 검출 컨스트럭트를 포함하는 한 컨스트럭트). 그러한 컨스트럭트들은 세포 내로 동시-형질전환(co-transformation)되거나 코트랜스펙션(co-transfection)될 수 있다. 이론에 의해 제한됨이 없이, 동시-형질전환/코트랜스펙션된 컨스트럭트들은 세포의 게놈 DNA 내의 동일 부위에 통합되는 결과를 수반하면서 형질전환/트랜스펙션이 진행되는 동안 재결합될 수 있는 것으로 가정된다.

대안적으로, 검출 및 리포터 컨스트턱트들은 단독 또는 조합되어 세포 내에서 안정적으로 발현될 수 있다. 관심있는 바람직한 유전자들과 우성(dominant) 유전자 마커를 엔코딩하는 발현 벡터로 세포가 트랜스펙션된 후 재조합 단백질을 높은 수준으로 생산하는 안정한 클론들이 획득된다. 다양한 유형의 세포로의 안정적인 통합에 관한 방법은 당업계의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.

한 구체예에서, 핵산은 활성 검출 단백질을 형성하기 위해 재구성되는 분절-폴리펩티드 단편들(검출 단백질과 핵산 결합 모티프를 포함함)을 엔코딩할 수 있다. 그러한 한 구체예에서, 분절-폴리펩티드 단편들은, 예를 들어, 내부 리보좀 진입 위치(IRES, internal ribosome entry site)에 의해 연결될 수 있다. IRES는 2개 이상의 별개 유전자들로부터 단일 전사체의 생산을 가능케 하는데, 상기 유전자들은 상기 전사체 상에 존재하는 추가의 리보좀 진입 위치(들)로 인하여 상응하는 별개 산물로 번역될 수 있다. 대안적인 구체예에서, 분절-폴리펩티드 단편들 및/또는 검출 단백질들 및/또는 핵산 결합 모티프들은 한 핵산에 의해 엔코딩될 수 있는데, 상기 핵산은 요망되는 폴리펩티들이 분리될 수 있도록 하기 위하여 각 핵산 서열들 사이에 분절가능(splittable) 부위들을 지닌다. 비제한적인 예로서, 핵산은 2 이상의 핵산 결합 모티프들을 포함하는 활성 검출 단백질을 엔코딩하는 서열을 포함할 수 있는데, 여기서 상기 검출 단백질을 엔코딩하는 서열은 핵산 결합 모티프를 포함하는 각각의 검출 단백질의 분절-폴리펩티드 단편들의 생성을 가능케 하기 위한 분절가능 부위를 포함한다. 그러한 구체예에서, 분절가능한 부위는 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 수단들, 예를 들어, 이에만 국한되는 것은 아니지만, 효소 절단, 화학적 절단; 열 절단, 산 절단, 방사선 절단, 광절단 등에 의해 분절-폴리펩티드 단편들의 분절을 가능하게 할 수 있다. 또한, 검출 컨스트럭트와 리포터 컨스트럭트는 IRES에 의해 연결된 별개의 성분들과 함께, 단일 컨스트럭트에서 엔코딩될 수도 있다.

핵산 서열을 세포로 도입하기 위한 방법은 당업계의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, 검출 및 리포터 컨스트턱트가 벡터, 바이러스 벡터, 및 비바이러스 수단을 포함하는 여러 수단에 의해 세포로 도입될 수 있다는 것을 포함한다. 비바이러스 수단은 융합, 전기천공법(electroporation), 유전자총법(biolistics), 트랜스펙션, 리포펙션, 원형질체(protoplast) 융합, 인산칼슘 트랜스펙션, 미세주입, 압력-강제 진입(pressure-forced entry), 네이키드(naked) DNA 등 또는 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 다른 수단을 포함하나, 이에만 국한되지 아니한다.

"플라스미드"와 호환되어 사용된, 용어 "벡터"는 이에 연결되는 또 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 벡터에 작동적으로 연결되는 유전자 및/또는 핵산 서열의 발현을 유도할 수 있는 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 흔히 "플라스미드"의 형태인데, 상기 플라스미드는, 이들의 벡터 형태에서, 염색체에 비결합되어 존재하는, 원형 이중 가닥 DNA를 의미한다. 다른 발현 벡터는 본 발명의 다른 구체예들, 예를 들어, 이에만 국한되는 것은 아니나, 플라스미드, 에피좀, 박테리오파지 또는 바이러스 벡터에서 사용될 수 있으며, 그러한 벡터는 숙주 게놈내로 통합되거나 특정 세포 내에서 자율적으로 복제할 수 있다. 동등한 기능을 발휘하는 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 다른 형태의 발현 벡터들이 또한 사용될 수 있다. 발현 벡터는 엔코딩 DNA의 안정적이거나 일시적인 발현을 위한 발현 벡터를 포함한다.

한 구체예에서, 검출 및 리포터 컨스트럭트는 상동성 재조합에 의해 도입될 수 있는데, 여기서 컨스트럭트는 특정 유전자좌에 통합되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 통상의 기술자는 동일 유전자좌 또는 그 외의 다른 유전자좌에서 내생성(endogenous) 유전자를 결실시키고/거나 본 발명의 핵산 컨스트럭트로 대체할 수 있다. 상동성 재조합의 경우, 핵산은 Ω 또는 O-벡터를 포함하나, 이에만 국한 되는 것은 아닌, 특정 벡터에 클로닝된다: 예를 들어, 다음 문헌을 참조하라(Thomas and Capecchi, Cell, (1987), 51;503-512, Mansour et al., nature, (1988) 336;348-352; 및 Joyner et al., nature (1989) 338;153-156).

박테리아 또는 효모 복제 기점, 선별 마커 및/증폭(amplifiable) 마커, 원핵생물 또는 진핵생물에서의 발현을 위한 프로모터/인핸서 엘리먼트, 및 포유동물 발현 조절 엘리먼트 등과 같은 유용한 엘리먼트를 포함하는 벡터가 핵산 컨스트럭트 스톡(stocks)의 제조 및 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 트랜스펙션의 수행을 위해 사용될 수 있으며, 많은 벡터들이 시중에 시판되고 있다.

몇몇 구체예들에서, 바이러스 벡터는 검출 컨스트럭트 및 핵산 컨스트럭트의 핵산 서열을 도입시키고, 이들의 발현을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 바이러스 벡터는 핵산 컨스트럭트의 세포로의 캐리어로서 바이러스, 또는 바이러스-연관 벡터의 용도를 의미한다. 컨스트럭트는 세포로의 감염 또는 형질도입을 위한 아데노바이러스, 아데노부속바이러스(AAV), 또는 단순포진바이러스(HSV) 또는 레트로바이러스와 렌티바이러스 벡터를 포함하는, 기타 바이러스들과 같은 비복제성, 결함 바이러스 게놈에 통합되며 패키징될 수 있다. 벡터는 세포 게놈으로 통합되거나 통합되지 않을 수 있다. 컨스트럭트는, 요망되는 경우, 트랜스펙션을 위한 바이러스 서열들을 포함할 수 있다. 대안적으로, 컨스트럭트는 에피좀성 복제를 할 수 있는 벡터, 예를 들어, EPV와 EBV 벡터에 통합될 수 있다.

핵산 결합 모이어티(moiety)로서 폴리펩티드들을 지니는 검출 컨스트럭트의 분절-폴리펩티드 단편들의 경우, 전체 분절-폴리펩티드 단편과 핵산 결합 모이어티 분자는, 폴리펩티드 부분, 링커 및 핵산 결합 모이어티 폴리펩티드를 포함하는, 단일 컨스트럭트에 의해 엔코딩될 수 있다. 이 컨스트럭트는 세포 내에서 발현되거나 세포로 미세주입될 수 있다. 이러한 컨스트럭트들은 또한 관심있는 핵산의 시험관내 검출에 사용될 수도 있다.

앱타머

앱타머는 비교적 짧은 RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드들인데, 리간드에 결합하며 SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)로 명명된 선별 절차를 이용하여 시험관내에서 동정된다(Tuerk & Gold, 1990; Ellington & Szostak, 1990). 선별 절차가 리간드에 대한 결합에 의해 진행되기 때문에, 앱타머는 고 친화력으로 이들의 리간드에 결합하며 리간드 결합을 위해 최적화된 2차 구조로 폴딩된다(Herman & Patel, 2000). 복잡한 화학적 또는 생물학적 혼합물 중에서 상응하는 리간드에 선택적으로 결합한다는 점에서 앱타머는 항체와 유사하다.

앱타머는 특히 본 발명의 방법에 유용하다. 예를 들어, 검출 컨스트럭트는 핵산 결합 모티프들이 앱타머 결합 서열들을 포함하도록 구성될 수 있고 리포터 컨스트럭트는 앱타머들을 포함하도록 구성될 수 있다. 반대로, 검출 컨스트럭트가 앱타머들을 포함할 수 있고 리포터 컨스트럭트가 앱타머 결합 서열들을 포함할 수 있다.

따라서, 본 발명의 한 구체예에서, 앱타머는 앱타머의 기능을 실질적으로 방해할 수 있는 플랭킹(flanking) 서열들 없이 발현될 수 있는 그러한 앱타머를 포함하는 RNA 올리고뉴클레오티드를 엔코딩하는 벡터를 사용함으로써 세포 내에서 발현된 후 작동할 수 있다. 이와 같은 구체예에서, 이것은 2개의 자가-분절(self-cleaving) 리보자임(ribozymes)으로 플랭킹된 앱타머를 포함하는 RNA 올리고뉴클레오티드로 달성된다. 미국 특허 출원 제20050222400호에서 입증된바와 같이, 올리고뉴클레오티드가 발현될 때, 앱타머는 자가-분절 리보자임이 절단되자마자 방출되며, 방출된 앱타머는 자가-분절 리보자임의 잔존물인 짧은 플랭킹 서열들을 지니는데, 종래 방법학과는 반대로, 이들은 앱타머 서열의 적절한 폴딩을 방해하지 하지 아니할 가능성이 매우 높다. 임의의 특정 메카니즘에 제한됨이 없이, 이러한 플랭킹 서열들은 앱타머 기능을 실질적으로 방해하지 아니하는 것으로 여겨진다.

몇몇 구체예들에서, RNA 올리고뉴클레오티드는 DNA 주형으로부터의 전사체인 것으로 기대되므로, RNA 올리고뉴클레오티드는 전사로 생산될 수 있는 임의의 길이를 지닐 수 있다. 다른 엘리먼트, 예컨대, 추가의 앱타머, 리보자임, 코딩 지역, 선도 서열 등이 RNA 올리고뉴클레오티드의 일부가 될 수 있는데, 단, 이러한 엘리먼트들은 앱타머 또는 자가-분절 리보자임의 기능을 실질적으로 방해하지 아니하는 것을 조건으로 한다.

이와 같은 구체예의 앱타머 올리고뉴클레오티드는 현재 공지되어 있는 임의의 유용한 앱타머이거나 추후에 개발될 수 있다. 앱타머는 세포 내부에 존재하는 표적에 타겟팅될 수 있다. 그러한 표적의 한 유형은 세포의 성분(즉, 천연의 구성성분(constituent))이다. 그러나, 대안적인 구체예에서, 앱타머는 세포의 조작된 성분에 타겟팅된다. 앱타머 결합에 의해 유용하게 영향을 받을 수 있는 세포 성분은 본 발명의 앱타머의 유력한 표적으로 기대된다. 그러한 세포 성분의 비제한적인 예는 단백질, 예컨대, 효소, 구조 단백질, 이온 채널 단백질, 전자 운반 단백질, 리보자임 성분, 지질단백질 및 전사 인자; 프로테오글리칸(proteoglycans); 당단백질; 다당류; 핵산; 지질; 및 스테로이드와 같은 작은 분자를 포함한다.

앱타머 및 앱타머 결합 서열을 디자인하고 합성하는 방법은 당업계의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.

앱타머 - 핵산 결합 단백질 쌍.

임의로 조합된 앱타머-단백질 쌍이 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들어, 한 구체예에서, 검출 분자의 핵산 결합 단백질들은 전사 인자들 또는 RNA 스플라이싱에 연루된 단백질들일 수 있다. 검출 분자의 예는 리포터 분자의 58개의 뉴클레오티드(nt)로 이루어진 앱타머에 결합하는 eIF4A이다(Oguro et al., 2003)(실시예 1-8 참조). 다른 구체예들에서, 핵산 결합 단백질들과 앱타머 쌍들은 2성분 앱타머-펩티드 쌍들을 포함하며 표 1과 실시예 11에 제시되어 있다. 또한, 앱타머와 단백질 쌍들, 특히 본 발명에 포함될 수 있는, RNA-단백질 파트너의 예는 다음을 포함하나, 이에만 국한되는 것은 아니다: (i) MS2 피막 단백질-RNA 스템 루프(stem-loop)(Sawata & Taira, 2003; Valegard et al., 1997); (ii) TAR-Tat BIV-1 스템 루프(Roy et al., 1990; Comolli et al., 1998); (iii) 전사 활성자로 역할하는 것으로 제시된 G3/C3 스템 루프의 3개의 반복단위(repeats)(Jarrell & Ptashne, 2003); (iv) 앱타머의 3개의 반복단위(Yamamoto et al., 2000); (v) eIF4A - 58개 염기로 트림(trim) 될 수 있는, 뉴클레오티드 87개 길이의 앱타머(최고 Kd = 27 nM)(Oguro et al., 2003).

핵산 결합 모티프.

핵산 결합 모티프는 또 다른 분자, 예컨대, 폴리펩티드와 커플링될 수 있는 임의의 폴리펩티드 또는 단백질 또는 펩티드 분자일 수 있으며, 표적 핵산에 아주 근접하여 결합될 수 있다.

본 발명의 다른 구체예들은 폴리펩티드인 핵산 결합 모이에티들을 제공한다. 폴리펩티드는 표적 핵산에 대하여 고 친화력을 갖는 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 이 구체예에서, 표적 핵산은 이중-가닥, 삼중-가닥(triple-standed), 또는 단일-가닥 DNA 또는 RNA가 될 수 있다. 몇몇 구체예들에서, 폴리펩티드는 아미노산 100개 미만의 펩티드, 또는 전장 길이의 단백질일 수 있다. 표적 핵산에 대한 폴리펩티드의 친화력은 적은 나노몰 내지 높은 피코몰 범위 이내일 수 있다. 폴리펩티드들은 천연적이거나 이론적인 접근법 또는 스크리닝 접근법에 의해 디자인된, 징크 핑커를 포함하는 폴리펩티드들을 포함할 수 있다. 징크 핑커의 예는 Zif 2g8, Sp1, Gfi-1의 핑커 5, YYl의 핑거 3, CF2II의 핑거 4와 6, 및 TTK의 핑거 2를 포함한다(PNAS (2000) 97: 1495-1500; J Biol Chem (20010 276 (21): 29466-78; Nucl Acids Res (2001) 29 (24) :4920-9; Nucl Acid Res (2001) 29(11): 2427-36). 기타 폴리펩티드들은, 시험관내 선별로 획득된, 특정 핵산 서열들에 결합하는, 폴리펩티드들을 포함한다. 그러한 앱타머의 예는 혈소판-유래 성장 인자(PDGF, platelet-derived growth factor)(Nat Biotech (2002) 20:473-77)와 트롬빈(Nature (1992) 355: 564-6)을 포함한다. 아직 기타 폴리펩티드들은 시험관내에서 DNA 삼중가닥(triplexes)에 결합하는 폴리펩티들이다; 이의 예는 이핵성 리보핵산 입자(heteronuclear ribonucleic particles, hnRNP) 단백질의 구성원, 예컨대, hnRNP K, L5 El, A2/B1 및 I를 포함한다(Nucl Acids Res (2001)29(11): 2427-36).

각각의 분절-폴리펩티드 핵산 모티프 폴리펩티드의 핵산 결합 모이어티는 표적 핵산에 대한 결합을 가능케 하는 임의의 분자일 수 있다. 몇몇 구체예들에서, 핵산 결합 모이어티는 핵산, 핵산 유사체, 및 폴리펩티드를 포함한다. 한 구체예에서, 핵산 결합 모이어티는 올리고뉴클레오티드이다. 활성화된 분절-폴리펩티드 단편의 주어진 쌍의 핵산 결합 모이어티는 동일한 종류의 분자(예를 들어, 올리고뉴클레오티드)이거나, 이들 모이어티들은 다른 종류의 분자일 수 있는데, 예를 들어, 활성 단백질을 포함하는 쌍의 한 분절-폴리펩티드는 올리고뉴클레오티드 핵산 결합 모이어티를 지닐 수 있고, 상기 쌍의 나머지 다른 구성원은 폴리펩티드 핵산 결합 모이어티를 지닐 수 있다.

검출 단백질

검출 단백질의 분절-폴리펩티드 단편들(검출 분자의 일부분임)은 활성 단백질을 생성시키기 위하여 매우 근접될 때 회합하는 임의의 폴리펩티드일 수 있는데, 조립된 활성 단백질에 대한 인지는 가능하나 개별 폴리펩티들에 대한 인지는 불가능한 임의의 수단에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 2개의 폴리펩티드들이 효소 활성을 지닌 단백질을 생성시키기 위해, 색원체성 또는 형광체성 활성을 지닌 단백질을 생성시키기 위해 또는 항체에 의해 인지되는 단백질을 만들기 위해 재결합할 수 있다. 더욱이, 이들 폴리펩티들은 시험관내 및 생체내에서 단백질 보완으로 전통적으로 드러난 임의의 래그 타임(lag time)을 최소화하기 위하여 활성 상태로 존재하며 활성 단백질의 재구성을 위하여 프라이밍되도록(즉, 준비 상태로 존재) 디자인된다.

한 구체예에서, 검출 분자의 활성화된 분절-폴리펩티드 단편들은 형광 단백질들이다. 그러한 구체예에서, 분절 형광 단백질 단편들 중 하나는 단편들 중 하나는 활성이 있는데, 상기 단편들 중 하나는 이의 동종 활성화 분절-형광 단편(들)로 보완되자마자 즉각적인 형광을 나타내도록 프라이밍되어 있으며 준비-상태로 존재하는 미리형성된 성숙한 발색단을 포함한다는 점에서 그러하다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 검출 단백질은 형광 단백질, 비제한적인 예로서, 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP)이다. 대안적으로, 형광 단백질은 노란색 형광 단백질(YFP), 강화된 노란색 형광 단백질(EYFP), 파란색 형광 단백질(BFP), 강화된 파란색 형광 단백질(EBFP), 청록색 형광 단백질(CFP), 강화된 청록색 형광 단백질(ECFP) 또는 적색 형광 단백질(dsRED) 또는 이의 임의의 기타 천연 단편 또는 유전자적으로 조작된 단편일 수 있는데, 여기서 재구성된 형광 단백질 내의 한 단편은 미리형성된 성숙한 발색단을 포함한다. 위에 언급된 모든 형광 단백질들과 결과적으로 형광을 나타내는 형광 단백질로 귀결되는 이들의 단편들은 본 발명에서의 사용을 위해 포함된다. 또한 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 그러한 형광 단백질들, 이의 단편들 및 유전자적으로 조작된 단백질들도 포함된다.

대안적으로, 검출 단백질은 시그널 증폭을 가능케 하는 효소이다. 효소는, 예를 들어, 베타락타메이즈, 베타-갈락토시다아제, 베타-글루코시다아제, 베타-글루쿠로니다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제일 수 있다. 특정 구체예에서, 검출 효소는 베타락타메이즈이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 검출 단백질 단편들은 재구성될 때, 즉각적으로 활성화되도록 디자인된다. 더욱이, 이들 단편들은 형광 단백질들과 함께 전통적으로 드러나는 임의의 래그 타임을 최소화하기 위해 재구성에 대해 프라이밍되도록 디자인된다.

몇몇 구체예들에서, 성숙 발색단-포함 분절-형광 단편과 결합하는 동종 비형광 폴리펩티드 단편은 하나 이상의 활성 비형광 단편으로 구성될 수 있다. 그러한 활성화된 비형광 폴리펩티드들은 일반적으로 적절한 위치에서 한 형광 단백질의 코딩 뉴클레오티드 서열을 분절시키고 각 뉴클레오티드 서열 단편을 독립적으로 발현시킴으로써 생산된다. 활성화된 분절-형광 단백질 단편들은 단독으로 또는 하나 이상의 단백질 융합 파트너와 융합되어 발현될 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 재구성된 활성 단백질은 활성화된 분절-EGFP 단편들로 구성되는데, 여기서 제 1 단편은 아미노산 번호 1에서부터 대략 아미노산 번호 158까지의 연속된 아미노산 가닥(stretch)을 포함하는 EGFP의 N-말단 단편이다. C-말단 시스테인이 발현 후 다양한 핵산 결합 모티프들의 컨주게이션을 보조하기 위하여 상기 단편에 부가될 수 있다. 또 다른 활성화된 분절-EGFP 단편은 대략 아미노산 번호 159에서 아미노산 번호 239까지의 연속된 아미노산 가닥이다. N-말단 시스테인이 또한 부가될 수 있다. 아미노산 1은 EGFP의 첫번째 아미노산을 나타내려는 의도이다. 아미노산 239는 상기 GFP의 마지막 아미노산을 나타내려는 의도이다. 모든 잔기들은 야생형 A. 빅토리아(A. victoria) GFP(진뱅크 접근 번호 M62653; 서열번호 7)의 넘버링에 따라 번호가 매겨졌고 상기 넘버링은 또한 상동 서열들의 동등한 위치들에도 적용된다. 따라서, 절단된 GFP(야생형 GFP와 비교됨)를 가지고 작업할 때 또는 추가의 아미노산들을 지닌 GFP를 가지고 작업할 때, 넘버링은 이에 따라 변경되어야 한다.

대안적인 구체예에서, 재조립된 형광 단백질은 상이하며 스펙트럼적으로 독특한 형광 단백질들로부터의 활성화된 절단 형광 단편들을 포함할 수 있다. 재구성된 활성 형광 단백질은 보완을 위해 사용된 활성화된 분절-형광 단편들에 좌우되는 독특하고/하거나 유일무이한 스펙트럼 특성을 지닐 수 있다. 예를 들어, 다색(multicolor) 형광 보완이 다색 생분자 형광 보완(multicolorBiFC(biomolecular fluorescent complementation))을 위한 상이한 형광 단백질들로부터 단편들을 재구성함으로써 달성되었다(다음 문헌을 참조하라: Hu et al., Nature Biotechnology, 2003;21;539-545; Kerppola, 2006, 7;449-456, Hu et al., Protein-Protein Interactions (Ed. P. Adams and E. Golemis), Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2005, 상기 문헌의 전체 내용은 본원에서 참고문헌으로 인용된다). 다색 실시간 형광을 위한 다수의 형광 단백질들로부터의 활성화된 분절-형광 단편들의 용도가 본 발명에서의 사용을 위해 포함되는데, 여기서 상기 단편들 중의 하나는 미리-형성된 성숙한 발색단을 포함한다.

한 구체예에서, 형광 단백질은 유세포 분석기, 형광 플레이트 판독기, 형광강도측정기, 현미경, 형광 공명 에너지 전달(FRET, fluorescence resonance energy transfer)에 의해, 육안으로 또는 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 다른 방법에 의해 검출될 수 있다. 대안적인 구체예에서, 형광은 형광 활성화 세포 분류기(FACS, florescence activated cell sorter)를 사용한 유세포 분석기 또는 간헐촬영 현미경에 의해 검출된다.

또 다른 예로, 마커는 색원체성/형광체성 산물을 초래하는, 효소이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 활성화된 분절-폴리펩티드 단편들은 조립된, 활성 효소를 형성하기 위해서 아주 근접하여 접합되는데, 상기 효소는 효소 활성 분석을 이용하여 검출될 수 있다. 바람직하게는, 효소 활성은 색원체성 또는 형광체성 반응에 의해 검출된다. 한 바람직한 구체예에서, 효소는 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 또는 β-락타메이즈이다.

또 다른 구체예에서, 효소는 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR)이다. 예를 들어, 미크닉 등(Michnick et al.)은 DHFR N-말단과 C-말단 단편들로 이루어진 "단백질 보완 분석법"을 개발하였는데, 상기 단편들은 단독으로는 임의의 효소 활성이 결여되어 있으나, 아주 가까이 근접될 때 기능성 효소를 형성한다. 본원에서 참고문헌으로 인용되는, 예를 들어, 미국 특허 제6,428,951호, 제6,294,330호, 및 제6,270,964호를 참조하라. 색원체성 방법과 형광성 방법을 포함하는, DHFR 활성을 검출하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.

대안적인 구체예에서, 다른 절단 폴리펩티드들이 사용될 수 있다. 예를 들어, 기질의 검출가능한 산물로의 전환을 촉매하는 효소들이 사용될 수 있다. 분절-폴리펩티드 재조립에 관한 그러한 몇몇 시스템들은, 이에만 국한 되는 것은 아니나, 다음의 재조립을 포함한다: β-갈락토시다아제(Rossi et al., 1997, PNAS, 94;8405-8410); 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR)(Pelletier et al, PNAS, 1998; 95;12141-12146); TEM-1 β-락타메이즈(LAC)(Galarneau at al, Nat. Biotech. 2002; 20;619-622) 및 반딧불이 루시퍼라아제(Ray et al, PNAS, 2002, 99;3105-3110 and Paulmurugan et al, 2002; PNAS, 99;15608-15613). 예를 들어, 절단 β-락타메이즈는 이중가닥 DNA의 검출에 사용되어 왔다(다음 문헌을 참조하라: Ooi et al, Biochemistry, 2006; 45;3620-3525). 실시간 시그널 검출을 위한 활성화된 절단 폴리펩티드 단편들의 용도가 본 발명에 사용되기 위해 포함되는데, 여기서 상기 단편들은 보완되자마자 급속한 시그널 검출을 가능케 하는 완전히 폴딩된 성숙한 형태로 존재한다.

한 구체예에서, 시그널 증폭을 가능하게 하는 검출 단백질이 사용될 수 있는데, 예를 들어, 베타락타메이즈 시스템은, 약 100배 시스널 증폭을 가능케 하는(Zlokarnik et al., 1998; Galarneau et al., 2002), 세포 투과성 프로-형광 베타락타메이즈 기질, 세팔로스포린 베타-락탐(CCF2)(Zlokarnik et al., 1998; Galarneau et al., 2002; Wehrman et al., 2002)을 지닌다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 활성화된 분절-폴리펩티드 단편들의 회합은 불연속적인 에피토프를 포함하는 조립된 단백질을 형성할 수 있는데, 상기 조립된 단백질 상의 불연속적인 에피토프를 특이적으로 인지하나 어느 한 개별 폴리펩티드에 존재하는 부분적인 에피토프를 인지하지 못하는 항체를 사용하여 상기 조립된 단백질을 검출할 수 있다. 그러한 불연속적인 에피토프의 한 예는 HIV의 gpl20에서 발견된다. 이러한 에피토프 및 다른 유도체들은 잘 알려져 있는 기술에 기초하여 당업계의 통상의 기술자에 의해 용이하게 제작될 수 있고, 항체 자신의 단백질 단편이 아닌 단편에 의해 조립된 단백질을 인지하는 항체에 관하여 스크리닝될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 활성화된 분절-폴리펩티드들은 조립된 단백질을 형성하기 위해 상호작용하는 분자들일 수 있다. 예를 들어, 분자들은 단백질 단편들, 또는 2합체 또는 다합체의 소단위체들일 수 있다.

관심있는 분절-폴리펩티드 단편들을 엔코딩하는 핵산 서열 및 코돈들은, 예를 들어, 코돈들을 바람직한 시스템에서 우선적으로 사용되는 코돈들로 전환시키는데, 최적화될 수 있다. 예를 들어, 포유동물 세포에서. 비포유동물 세포에서 단백질 발현을 위한 최적의 코돈은 당업계에 공지되어 있으며, 숙주 세포가 비포유동물 세포일 때(예를 들어, 곤충 세포에서) 사용될 수 있다.

본 발명의 활성화된 분절-폴리펩티드들은 바람직할 수 있는 임의의 추가의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 한 구체예에서, 활성화된 분절-폴리펩티드들은 또한 유연한 링커를 포함할 수도 있는데, 상기 링커는 핵산 결합 모이어티에 커플링된다.

검출 단백질들은 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 수단에 의해 핵산 결합 모티프에 컨주게이션될 수 있다. 한 비제한적인 예에서, 검출 단백질은 유전자 융합에 의해 핵산 결합 모티프에 컨주게이션된다. 본원에서 사용된 용어 "컨주게이트"는 하나의 실체(entity)를 형성하기 위하여 함께 접합된 2이상의 단백질들의 부착을 의미한다. 단백질들은 링커, 화학적 변형, 펩티드 링커, 화학적 링커, 공유결합성 또는 비공유결합성 결합, 또는 단백질 융합 또는 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 수단에 의해 부착될 수 있다. 접합은 영구적이거나 가역적일 수 있다. 몇몇 구체예들에서, 몇몇 링커들은 컨주게이트 내의 각각의 링커 및 각각의 단백질의 바람직한 특성들을 활용하기 위하여 포함될 수 있다. 유연한 링커 및 컨주게이트의 용해도를 증가시키는 링커는 단독으로 사용되거나 본원에 포함되어 있는 다른 링커들과 함께 사용되는 것이 고려된다. 펩티드 링커들은 링커를 엔코딩하는 DNA를 발현시킴으로써 컨주게이트 내의 하나 이상의 단백질에 연결될 수 있다. 링커들은 산 절단성, 광절단성 및 열 민감 링커들일 수 있다.

용어 "융합 단백질"은 둘 이상의 단백질들의 재조합 단백질을 의미한다. 융합 단백질들은, 예를 들어, 세포내에서 의도된 모든 단백질들을 포함하는 단일 폴리펩티드로 번역될 수 있는 단일의 개방해독틀을 구성하도록, 한 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열을 또 다른 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열에 접합시킴으로써 생산될 수 있다. 단백질들의 정렬 순서는 다를 수 있다. 비제한적인 예로서, 분절-검출 폴리펩티드 단편을 엔코딩하는 핵산 서열은 핵산 결합 모티프를 엔코딩하는 핵산의 말단, 5' 말단 또는 3' 말단에 프레임 내에서 융합된다. 이 방식에서, 유전자의 발현시, 분절-검출 단백질은 기능적으로 발현되며, N-말단 또는 C-말단부에, 융합된, 핵산 결합 모티프를 포함한다. 검출 및/또는 형광 단백질의 변형은 검출 및/또는 형광 단백질의 기능성이 핵산 결합 모티프의 검출 및/또는 형광 단백질에 대한 융합으로 실질적으로 영향받지 아니한체 유지되는 그러한 변형이다. 한 구체예에서, EGFP의 분절-폴리펩티드 단편들은 분절-eIF4A 단편들 또는 RNA 결합 펩티드들과 함께 카르복시 말단에서 프레임내에 융합된다.

용어 "링커"는 융합 단백질의 생산 이외의 다른 수단에 의해 둘 이상의 단백질들을 접합시킬 수 있는 임의의 수단을 의미한다. 링커는 공유결합성 링커 또는 비공유결합성 링커가 될 수 있다. 공유결합성 링커의 예는 공유결합성 결합 또는 연결된 하나 이상의 단백질들에 공유결합적으로 부착된 링커 모이어티를 포함한다. 링커는 또한 비공유결합성 결합, 예를 들어, 백금 원자와 같은 금속 중심을 통한 유기금속성 결합(organometallic bond)이 될 수 있다. 공유결합성 결합의 경우, 탄산 유도체, 에테르, 에스터(유기 및 무기 에스터를 포함함), 아미노, 우레탄, 우레아 및 이와 같은 종류의 다른 것을 포함하는, 예컨대 아미드기와 같은, 다양한 기능기(functionality)가 사용될 수 있다. 예를 들어, 결합을 제공하기 위하여, 핵산 결합 모티프 및/또는 형광 단백질은 산화, 수산화, 치환, 환원 등에 의해 변형되어 커플링을 위한 자리를 제공할 수 있다. 핵산 결합 모티프 및/또는 검출 단백질(예를 들어, 형광 단백질)의 기능을 실질적으로 감소시키지 아니하는 그러한 변형이 고려될 것이다.

발현 벡터

본 발명에 사용하기 위한 검출 및 리포터 컨스트럭트들의 재조합 발현을 위한 벡터의 제작은 당업계의 통상의 기술자에게 상세한 설명이 필요치 않은 통상적인 기술들을 사용하여 수행될 수 있다. 그러나, 검토를 위하여, 통상의 기술자들은 다음 문헌을 찾아보길 원할 수 있다: Maniatis et al., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (NY 1982).

간략히 요약하면, 검출 분자 및 리포터 분자를 엔코딩하는 핵산 서열을 제작은 표준 라이게이션 기술을 이용한다. 생성된 핵산 컨스트럭트들의 정확한 서열들을 확증하기 위한 분석에서, 라이게이션 혼합물들은 숙주 세포를 트랜스펙션/형질도입하는데 사용될 수 있으며 성공적으로 유전자 변형된 세포들은 필요하다면 항생제 내성에 의해 선별될 수 있다.

트랜스펙션/형질도입된 세포들로부터 벡터가 제조되고, 제한(restriction)에 의하여 분석되고/되거나 예를 들어, 메싱 등의 방법(Messing, et al., Nucleic Acids Res., 9: 309-. 1981), 막삼 등의 방법(Maxam, et al., Methods in Enzymology, 65: 499, 1980), 생어 디데옥시(dideoxy) 방법 또는 당업계의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 다른 적당한 방법에 의한 시퀀싱된다.

유전자의 발현은 전사, 번역 또는 번역 후 수준에서 조절된다. 전사 개시는 유전자 발현에서 초기 사건이며 중요한 사건이다. 이것은 프로모터와 인핸서 서열들에 의존하며 이러한 서열들과 상호작용하는 특정 세포 인자들에 의해 영향을 받는다. 많은 원핵생물 유전자들의 전사 단위는 프로모터로 구성되어 있고, 일부 경우에는 인핸서 또는 조절 엘리먼트(Banerji et al., 세포 27: 299 (1981); Corden et al., Science 209: 1406 (1980); 및 Breathnach and Chambon, Ann. Rev. Biochem. 50: 349 (1981))로 구성되어 있다. 레트로바이러스의 경우, 레트로바이러스 게놈의 복제에 관연하는 조절 엘리먼트는 긴 말단 반복체(LTR, long terminal repeat)에 위치하고 있다(Weiss et al., eds., The molecular biology of tumor viruses: RNA tumor viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, (NY 1982)). 몰로니 생쥐 백혈병바이러스(MLV)과 로우스 육종바이러스(RSV) LTR은 프로모터와 인핸서 서열을 포함한다(Jolly et al., Nucleic Acids Res. 11: 1855 (1983); Capecchi et al., In : Enhancer and eukaryotic gene expression, Gulzman and Shenk, eds., pp. 101-102, Cold Spring Harbor Laboratories (NY 1991)). 다른 유력한 프로모터들은 사이토메갈로바이러스(CMV) 및 다른 야생형 바이러스 프로모터들로부터 유래한 프로모터들을 포함한다.

본 발명의 실시는, 달리 명시하지 않는한, 당업계의 기술에 속하는, 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 유전자도입 생물학, 미생물학, 재조합 DNA와 면역학의 통상적인 기술들을 이용한다. 그러한 기술들은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 다음 문헌들을 참조하라: Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. By Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (ON. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait ed., 1984); Mullis et al., 미국 특허 제4,683,195호; Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Culture of Animal Cells (R.I. Freshley, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods in Enzymology, VoIs. 154 and 155 (Wu et al, eds.), Immunochemical methods In Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook of Experimental Immunology, Volumes 1-IV(DM Weir and CC. Blackwell eds., 1986); Manipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor, N. Y., 1986).

그러한 단백질 컨주게이트 또는 융합 단백질과 조절 서열을 위한 컨스트럭트의 디자인, 조립, 플라스미드로의 통합, 및 트랜스펙션에 관하여 실무가를 위한 추가의 배경 정보 및 일반적인 지침은 다음 국제 특허출원 공개공보를 통해 이용가능하다: WO94/18317호; WO95/02684호; WO95/24419호 및 WO 96/41865호(상기 문헌의 전체 내용은 참고문헌으로써 본원에 인용된다).

수많은 비바이러스 프로모터들의 프로모터와 인핸서 지역들이 또한 소개되었다(Schmidt et al., Nature 314: 285 (1985); Rossi and decrombrugghe, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5590-5594 (1987)). 휴지상태의 세포 내에서 도입유전자들의 발현을 유지하고 증가시키는 방법은 I형 콜라겐(1 및 2)(Prockop and Kivirikko, N. Eng. J. Med. 311:376 (1984); Smith and Niles, Biochem. 19:1820 (1980); de Wet et al., J. Biol. Chem., 258:14385 (1983)), SV40 및 LTR 프로모터를 포함하는 프로모터의 사용을 포함한다.

본 발명의 한 구체예에 따라, 프로모터는 하기 프모모터로 구성된 군에서 선택된 구조성 프로모터이다: 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터, CMV 프로모터, JeT 프로모터, SV40 프로모터, 연장인자(Elongation Factor) 1 알파프로모터 (EFl-알파), 닭 베타-액틴, PGK, MT-I(Metallothionin).

유도성/억제성 프로모터들이 또한 본 발명에 포함된다. 본 발명에 포함되는, "테트-온", "테트-오프", 및 라파마이신-유도성 프로모터가 이러한 컨스트럭트들의 비제한적인 예에 해당한다.

도입유전자 발현을 유도하기 위하여 바이러스 및 비바이러스 프로모터들을 사용하는 것 이외에, 인핸서 서열이 도입유전자의 발현 수준을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 인핸서는 이들의 본래 유전자의 전사활성뿐만 아니라, 일부 외래 유전자들의 전사 활성도 증가시킬 수 있다(Armelor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70 : 2702 (1973)). 예를 들어, 본 발명에서 콜라겐 인핸서 서열이 도입유전자의 발현을 증가시키기 위해 콜라겐 프로모터 2(I)와 함께 사용된다. 또한, SV40 바이러스에서 발견된 인핸서 엘리먼트가 도입유전자의 발현을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 이 인핸서 서열은 하기 문헌들에서 소개된 바와 같이 72개의 염기쌍으로 구성되어 있다: Grass et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:943 (1981); Benoist and Chambon, Nature 290:304 (1981), 및 Fromm and Berg, J. MoI. Appl. Genetics, 1:457 (1982), 상기 문헌 모두는 참고문헌으로써 본원에서 인용된다. 이 반복 서열은 다양한 프로모터들과 연이어 존재할 때 다수의 상이한 바이러스 유전자들과 세포 유전자들의 전사를 증가시킬 수 있다(Moreau et al., Nucleic Acids Res. 9:6047 (1981).

도입유전자 발현은 또한 장기간의 안정적 발현을 위하여 프로모터 활성을 변형시키는 사이토카인을 사용하여 증가될 수도 있다. 몇몇 사이토카인들은 콜라겐 2(I)와 LTR 프로모터들로부터의 도입유전자 발현을 변형시키는 것으로 보고되었다(Chua et al., connective Tissue Res., 25:161-170 (1990); Elias et al., Annals N. Y. Acad. Sci., 580:233-244 (1990)); Seliger et al., J. Immunol. 141:2138-2144 (1988) 및 Seliger et al., J. Virology 62: 619-621 (1988)). 예를 들어, 변형 성장 인자(TOF, transforming growth factor), 인터루킨(IL)-I5 및 인터페론(INF)은 LTR과 같은 다양한 프로모터들에 의해 유도된 도입유전자의 발현을 하향 조절시킨다. 종양괴사인자(TNF)와 TGF 1은 프로모터에 의해 유도된 도입유전자의 발현을 상향 조절하며, 상기 유전자의 발현을 조절하는데 사용될 수 있다. 유용하다는 것이 입증될 수 있는 그 외의 사이토카인은 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)와 상피세포성장인자(EGF)를 포함한다.

한 구체예에서, 콜라겐 인핸서서열(Col1(E))을 지니는 콜라겐 프로모터가 뇌의 면역-보호된 상태에도 불구하고 처치된 뇌에서 생성될 수 있는 벡터에 대한 임의의 면역 반응을 추가로 억제함으로써 도입유전자의 발현을 증가시키기 위해 사용될 수도 있다.

또 다른 구체예에서, 벡터는 Cre-리콤비네이즈(recombinase) 단백질을 코딩하기 위한 서열, 및 LoxP 서열과 같은 서열을 추가로 포함할 수 있다. 검출 및/또는 리포터 컨스트럭트의 일시적 발현을 보장하기 위한 또 다른 방법은 Cre-리콤비네이즈가 세포로 투여되자마자(Daewoong et al, Nature Biotechnology 19:929-933) 또는 리콤비네이즈를 코딩하는 유전자가 바이러스 컨스트럭트에 통합됨으로써(Pluck, Int J Exp Path, 77:269-278) 삽입된 DNA 서열 중 일부의 절단이 초래되는 Cre-LoxP 시스템의 사용을 거친다. LoxP 부위와 구조 유전자(본원의 경우, 뉴블라스타틴(neublastin))를 함께 지니는 바이러스 컨스트럭트 내에 리콤비네이즈에 관한 유전자의 통합은 종종 대략 5일 동안의 구조 유전자의 발현을 초래하는 결과를 가져온다.

유전자도입 개체

본 발명의 한 구체예에서, 생체내에서 핵산의 실시간 검출을 위한 리포터 및 검출 컨스트럭트를 발현하는 유전자도입 개체가 포함된다. 유전자도입 개체, 또는 동물은 이들의 모든 세포 또는 세포 전체가 아닌 일부 세포(즉, 모자이크 동물)에 도입유전자를 운반할 수 있다. 도입유전자는 단일 도입유전자로서 또는 나란히 연결되어(in tandem), 예를 들어, 헤드 투 헤드(head to head)로, 또는 헤드 투 테일(head to tail)로, 또는 복수의 카피로 도입될 수 있다. 2중, 3중, 다중(multimeric) 유전자도입 동물은 바람직하게는 둘 이상의 도입유전자들을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 동물은 핵산 결합 모티프에 작동적으로 연결된 EGFP 도입유전자의 두 절반 및 핵산 결합 서열과 관심있는 유전자를 엔코딩하는 도입유전자를 포함하는 검출 컨스트럭트를 포함한다.

단백질을 엔코딩하는 하나 이상의 유전자가 도입유전자로서 사용되는 경우, 상기 유전자는, 도입유전자의 발현을 가능하게 할, 적절한 조절 엘리먼트에 작동적으로 연결되는 것이 바람직할 수 있다. 조절 엘리먼트, 예를 들어, 프로모터, 인핸서(예를 들어, 유도성 또는 구조성 인핸서), 또는 폴리아데닐화 시그널이 당업계에 잘 알려져 있다. 조절 서열은 내생성 조절 서열, 즉, 도입유전자가 도입된 동물과 동일한 동물 종으로부터의 조절 서열일 수 있다. 조절 서열은 또한 도입유전자로 사용된 유전자의 천연 조절 서열일 수도 있다.

본원에 기재된 도입유전자 컨스트럭트는 DNA 서열 상류의 3' 비번역 지역을 포함할 수 있다. 그러한 지역은 발현 시스템의 RNA 전사체를 안정화시킬 수 있으며 그에 따라 상기 발현 시스템으로부터의 요망되는 단백질의 수율을 증가시킨다. 본 발명의 컨스트럭트에 유용한 3' 비번역 지역 중에는 폴리A(polyA) 시그널을 제공하는 서열이 있다. 그러한 서열은, 예를 들어, SV40 소 t 항원(small t antigen), 또는 당업계에 잘 알려져 있는 그 외의 3' 비번역 서열로부터 유래될 수 있다. 3' 비번역 지역의 길이는 중요하지 않지만 이의 폴리A 전사체의 안정화 효과는 발현 서열의 RNA를 안정화시키는데 중요한 것으로 생각된다.

도입유전자 컨스트럭트는 프로모터와 시그널 서열을 엔코딩하는 DNA 서열 사이에 5' 비번역 지역을 포함할 수도 있다. 그러한 비번역 지역은 프로모터가 획득되는 동일한 조절 지역으로부터 유래되거나 상이한 유전자로부터 유래딜 수 있는데, 예를 들어, 이들은 다른 합성, 반합성, 또는 천연 공급원으로부터 유래될 수 있다.

안티센스 핵산이 또한 본 발명의 도입유전자 컨스트럭트에 사용될 수 있다. 예를 들어, 안티센스 폴리뉴클레오티드 서열(DNA 코딩 가닥에 상보적임)이 "정상" 유전자의 발현을 감소기키기 위해 세포 내로 도입될 수 있다. 이러한 접근법은, 예를 들어, 안티센스 핵산 또는 트리플렉스 제제로 mRNA를 마스킹하거나 리보자임으로 이를 절단함으로써, 특정 mRNA의 전사 또는 번역을 막을 수 있는 안티센스 핵산, 리보자임, 또는 트리플렉스(triplex) 제제를 이용한다. 대안적으로, 방법은 유전자 산물의 작용 또는 효과를 모방하거나 유전자의 작용을 방해하는 물질(reagent)의 투여를 포함할 수 있다. 시험관내에서 유전자 번역을 변화시키기 위한 안티센스 방법의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 다음 문헌을 참조하라: Marcus-Sekura, 172 ANAL. BIOCHEM. 289-95, 1988).

본원에 기재된 도입유전자 컨스트럭트는 증폭을 위하여 임의의 적당한 플라스미드, 박테리오파지, 또는 바이러스 벡터에 삽입될 수 있으며, 그 결과 마니아티스 등의 논문(Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989)에 소개된 바와 같이, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 전파될 수 있다. 컨스트럭트는, 당업계에 공지되어 있는 것과 같은, 효율적인 방식으로 컨스트럭트의 클로닝과 분리를 가능하게 하는, 거대 플라스미드의 일부로서 제조될 수 있다. 컨스트럭트는 바람직한 포유동물 내로의 통합을 위한 잔여 플라스미드 서열로부터 용이하게 동정될 수 있도록 플라스미드 상의 편리한 제한 부위에 위치하게 될 수 있다.

본 발명의 방법은 또한 레트로바이러스 벡터를 이용한 난모세포로의 외래성(exogenous) DNA의 도입에 의한 유전자도입 동물 또는 세포의 생산과 관련이 있다. 레트로바이러스 벡터는 바이러스 감염 과정을 활용하여 유전자를 효율적으로 숙주 세포로 운반하는데 사용될 수 있다(Kim et al., 4 ANIM. BIOTECHNOL. 53-69, 1993; Kim et al., 35 MOL. REPROD. DEV. 105-13, 1993; Haskell and Bo본 발명자들n, 40 MOL. REPROD. DEV. 386-90, 1995; Chan et al., 95 PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 14028-33, 1998; Krimpenfort et al., 1991; Bowen et al., 50 BIOL. REPROD. 664-68, 1994; Tada et al., 1 TRANSGENICS 535-40, 1995).

응용

본 발명의 방법은 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 여러 응용에 사용될 수 있다. 본 발명의 중요한 한 구체예는 생체내에서 RNA의 실시간 검출을 위한 리포터 분석법이다. 그러한 한 구체예에서, 관심있는 세포는 표적 RNA 부재시 검출 단백질로부터 시그널을 생성하지 못하고 그 결과 형광을 나타내지 아니하거나 활성을 드러내지 아니하는 검출 분자를 안정적으로 발현시킨다. 세포는 또한 검출 분자의 핵산 결합 모티프(들)을 위한 결합 부위 및 관심있는 유전자를 포함하는 유도성 리포터 분자를 발현시킬 수도 있는데, 상기 검출 분자는, 세포내에서 발현될 때, 표적 RNA에 결합하고 검출 단백질의 재구성 및 활성 단백질 및 시그널의 생성을 촉진할 것이다. 이는 생체내에서 RNA 발현의 실시간 검출을 가능하게 하며 도 10-11과 18-19 및 실시예 9-11에 예시되어 있다.

대안적인 구체예에서, 관심있는 세포는 관심있는 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터 컨스트럭트를 발현시킬 수 있다. 프로모터가 특정 자극에 의해 세포 내에서 활성화될 때, 표적 핵산 서열을 위한 결합 부위(들)은 가용할 수 있게 되며 검출 분자의 핵산 결합 단백질의 결합은 즉각적으로 검출될 수 있는 검출 폴리펩티드 단편들의 결합 및 활성 검출 단백질의 형성을 촉진한다. 이 구체예는 생체내에서 실시간으로 프로모터 기능을 연구할 수 있게 한다. 예를 들어, 유전자의 조절은 RNA 결합 부위를 포함하는 프로모터를 발현하는 플라스미드를 트랜스펙션시키고 임의의 기준 검출 컨스트럭트 활성을 분석함으로써 실시간으로 연구될 수 있다. 관련 구체예에서, 세포는 i) 화합물 또는 화합물들과 접촉되거나; ii) 프로모터의 활성을 변화시킬 수 있는, 다양한 조건에 처해짐으로써, 그 결과 RNA의 전사가 증가되거나, 감소되거나, 아무런 변화가 초래되지 않을 수 있다. 상기 변화는 검출 컨스트럭트에 의해 즉각적으로 검출된다.

대안적으로, 본 발명의 방법은, 심지어 리포터 컨스트럭트의 부재시에도, 생체내에서 표적 핵산의 존재를 검출할 수 있는 방법을 제공한다. 그러한 구체예에서, 예를 들어, 핵산(예를 들어, DNA 및/또는 RNA)는 검출 분자의 핵산 결합 모티프에 결합하는 표적 핵산 서열을 포함한다. 검출 분자의 핵산의 디자인에 따라서, 천연(naive) 또는 비변형된 핵산이 생체내에서 검출될 수 있다.

유사한 구체예에서, "테트-온" 또는 "테트-오프" 시스템이 본 발명의 방법에 활용될 수 있다. 예를 들어, 관심있는 세포는 본 발명의 검출 컨스트럭트를 안정적으로 발현할 수 있도록 제조될 수 있다. 또한, 세포는 검출 분자 핵산 결합 모티프)를 위한 표적 결합 부위(들)과 관심있는 유전자의 조절된 전사를 가능하게 하는 테트-온 또는 테트-오프 조절가능 리포터를 안정적으로 발현할 수 있다. 예를 들어, 테트-오프 시스템에서, 세포는 관심있는 유전자를 즉각적으로 발현할 것이고 리포터 컨스트럭트는 활성화되고 즉각적으로 검출될 수 있을 것이다. tet의 부가 즉시, 리포터 컨스트럭트(관심있는 유전자와 표적 핵산 결합 부위를 포함함)의 전사는 종결되고 이미 전사된 전사체들만이 실시간적으로 분석될 수 있다. 상기 테트-오프 예에서, 통상의 기술자는, 예를 들어, 감소된 리포터 형광 또는 활성을 검출함으로써 생체내에서 실시간으로, RNA의 반감기와 같은, RNA의 안정성을 분석할 수 있을 것이다.

대안적인 구체예에서, "테트-온" 컨스트럭트의 사용은 살아 있는 세포 내의 관심있는 유전자의 안정적인 발현을 가능하게 하는데, 그에 따라 상기 시스템에 tet의 부가는 리포터 컨스트럭트의 전사를 개시시킨다. 그 후 본 발명의 검출 분자는 이의 표적 RNA에 결합할 수 있고 즉각적으로 검출될 수 있다. 이 구체예에서, RNA 로컬라이제이션은 당해 실험을 수행하는 당업자에 의해 기록됨으로써 실시간적으로 연구될 수 있다.

아직 본 발명의 또 다른 구체예에서, 리포터 분석은 개체의 생체내에서 이루어진다. 이에만 국한되는 것은 아니나, 예를 들어, 동물, 비인간 동물, 생쥐, 제브라피쉬, 선충, 또는 개구리가 검출 컨스트럭트와 상기 검출 컨스트럭트에 결합할 RNA 결합 부위를 지니는 관심있는 유전자 둘 모두를 발현할 수 있도록 제조될 수 있다. 개체 내에서의 두 컨스트럭트들의 발현은 관심있는 전사체가 1일째 태아로부터 성체기 전반에 걸쳐 샘플을 채취함으로써 발달과정 전반에 걸쳐 분석될 수 있게 한다. 한 구체예에서, 개체는 포유동물이다. 한 구체예에서, 포유동물은 생쥐이고, 또 다른 구체예에서, 개체는 유전자도입 개체, 예를 들어, 이에만 국한되는 것은 아니지만, 유전자도입 생쥐이다.

대안적으로, 본 발명의 조성물과 방법은 제자리 혼성화, 예를 들어, 형광 제자리 혼성화(FISH)와 유사한 생체내 방법으로써 RNA의 실시간 검출을 제공한다. 그러한 구체예에서, 검출 분자의 핵산 결합 모티프에 결합하게 될 RNA 결합 서열을 지니는 관심있는 RNA를 포함하는 리포터 컨스트럭트를 발현하는 세포는 투과성을 지니게 되고, 본 발명의 검출 컨스트럭트는 세포에 투여된다. 관심있는 RNA가 발현되면, 검출 컨스트럭트는 RNA 결합 서열에 결합할 것이며 RNA의 로컬라이제이션과 풍부도가 결정될 수 있다. 전통적인 제자리 혼성화 기술을 능가하는 본 시스템의 이점은 풍부도가 낮은 RNA를 검출할 수 있는 능력(효소 리포터를 활용하는 검출 컨스트럭트에 의해 달성할 수 있는 시그널 증폭 때문임) 및 신속하고 방사능 없이 분석을 끝마칠 수 있는 능력이다. 검출 컨스트럭트 검출의 즉시성은 매우 바람직할 수 있다. 현재까지, 제자리 혼성화(예를 들어, 방사능을 이용한 혼성화)를 수행하는 전통적인 방법은 실험이 유효한지 여부를 알아내기 전까지 수주 내지 수개월이 소요될 수 있다. 또한, 전통적인 제자리 혼성화에 사용된 RNA 프로브는 RNA 분해의 용이와 방사능의 사용으로 인하여 제조하기가 어렵다. 본 발명의 방법에서는, 방사능 또는 RNA 프로브는 필요치 않다. 검출 컨스트럭트는, 당업계의 통상의 기술자에게 공지되어 있듯이, 예를 들어, 박테리아로부터 용이하게 제조된다. 그러한 분석법은 면역조직- 또는 면역세포-화학 기술과 유사한데, 그에 따라 항체가 시험관내에서 단백질을 검출하기 위해 사용된다. 본원의 경우, RNA가 검출된다.

더욱이, 본 발명의 조성물과 방법은 생체내에서 실시간적으로 DNA를 검출하기 위한 구체예에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 검출 컨스트럭트는 2 이상의 비활성화된 폴리펩티드 단편들(각각의 단편은 DNA-결합 모티프에 결합됨)로 절단되는 검출 단백질(형광 또는 효소)을 포함할 수 있다. DNA일 경우, 표적 핵산의 존재에 의해 접합될 때, 폴리펩티드 단편들은 완전하게 활성을 띠는 검출 단백질을 형성하며, 즉각적으로 검출될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 게놈 내의 다양한 유전자좌의 복제에 대한 실시간 검출이 가능하게 한다. 검출 컨스트럭트 내의 검출 단백질에 결합된 DNA-결합 모티프는 DNA의 다양한 지역에 특이적이며 다양한 유전자좌의 복제는 생체내에서 실시간으로 검출될 수 있다.

유사하게, 통상의 기술자는 본 발명의 방법과 조성물을 사용하여 생체내에서 실시간으로 염색체를 검출할 수 있을 것이다. 예를 들어, 검출 컨스트럭트는 텔로미어 결합 단백질에 결합되며 세포 내에서 발현되는 검출 단백질을 포함할 수 있다. 이렇게 하여, 텔로미어는 세포의 생존주기 내내 실시간으로 검출될 수 있다. 본원에 제공된 조성물과 방법의 이점은 특이성이 2개의 절반(각가의 절반은 검출 단백질의 한 절반에 결합됨)으로 2등분되는 텔로미어 결합 단백질을 제공함으로써 증가된다는데 있다. 단일의 결합 부위에 대한 텔로미어 결합 단백질의 2개의 절반의 협조된 결합은 표적 인지 전에 검출 활성이 거의 없다는 것을 보장한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 실시간으로 PCR 산물을 검출할 수 있는 방법이 개시된다. 본 발명의 방법과 조성물을 사용하여, PCR 반응 산물은 현재 가용한 것보다 더 높은 특이성으로 그리고 실시간으로 검출된다. 이 구체예의 일예에서, PCR 프라이머는 반응의 증폭 산물이 검출 컨스트럭트 상에 존재하는 핵산-결합 모티프에 의해 특이적으로 인지될 수 있는 앱타머에 통합되도록 디자인된다. 증폭이 진행됨에 따라, 검출 단백질은 실시간으로 검출될 수 있다. 본 발명은 SYBR 그린과 같은, 현재 사용되고 있는 기술을 능가하는 이점을 제공하는데, 검출 컨스트럭트가 PCR 산물에 특이적이며 주형 DNA를 검출하지 못할 것이기 때문이다. 상기 구체예를 이용하여, RNA는 PCR 실험을 수행하기 전에 RNA를 cDNA로 전환시킴으로써 실시간으로 검출될 수 있다. 관련 구체예에서, 검출 분자의 핵산 결합 모티프 성분은, 생체내에서 면역PCR(immunoPCR)을 위한 신규한 방법을 제공하면서, PCR 산물의 존재하에 분절-검출 분자의 재조립을 촉진한다. 또한, 또 다른 구체예에서, 검출 분자의 핵산 결합 모티프 성분은 분절-검출 분자의 재조립을 촉진할 수 있으며, 그에 따라, 면역RCA(순환 주기 증폭(rolling circle amplification) 방법에서 핵산의 존재시, 시그널은 결국 생체내에서 고 증폭 시그널이 된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 개체 내의 다형성(polymorphism), 돌연변이 또는 비정상 유전자 발현을 검출하기 위한 방법이 소개된다. 예를 들어, 본 발명의 분석법은 특정 질병, 장애 또는 그러한 질병과 장애에 대한 소인의 진단을 위하여 개체로부터 DNA 및/또는 RNA를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 검출 컨스트럭트들이 질병 또는 장애를 지닌 개체의 게놈 내에 존재할 수 있는 특정 서열들에 특이적인 핵산-결합 모티프들로 디자인될 수 있다면, 본 발명의 방법은 다양한 질병과 장애의 진단 및 예후를 가능하게 한다.

관련 구체예에서, 본 발명은 개체 내의 유전자 돌연변이, 다형성, 또는 변이에 대한 실시간 검출을 가능하게 한다. 설명에 도움이 되는 일예로서, 앱타머는 특이적인 돌연변이 또는 다형성 부위를 태그하거나 이에 일시적으로 부착될 수 있는데, 검출 분자의 핵산 결합 모티프가, 통상의 기술자가 검출을 시도하는, 특이적인 돌연변이, 다형성 또는 변이를 포함하는 관심있는 유전자에 결합된 상기 부착된 앱타머를 인지하도록 디자인된 본 발명의 분절-폴리펩티드 분자에 의해 검출될 수 있다. 대안적으로, 분자 풀(pool)이 사용될 수 있고, 그에 따라 다수의 돌연변이, 다형성, 또는 변이가 검출될 수 있다. 핵산 결합 모티프가 부착된 표적 핵산, 예컨대, 돌연변이(perbutation) 및/또는 변이 유전자에 결합된 앱타머를 인지한다면, 검출 단백질의 단백질 보완은 시그널 및/또는 형광 생성의 즉시성으로 인하여 민감한 검출을 초래하고 및 가능케 한다.

한 중요한 구체예에서, 분자는 병원체의 실시간 검출을 위해 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 분자는 병원체 핵산 서열의 존재 및/또는 병원체 및/또는 병원체 핵산의 존재에 따른 결과로서 핵산 서열 내의 변이를 검출하는데 사용될 수 있다. 병원체는 바이러스 감염 질병, 진균 감염 질병, 박테리아 감염 질병, 기생충 감염 질병 및 그 외의 감염성 질병일 수 있다. 바이러스는 단순포진바이러스 1형, 단순포진바이러스 2형, 사이토메갈로바이러스, 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus), 바리셀라-조스터 바이러스(Varicella-zoster virus), 인간 대상포진 바이러스(Human herpes virus) 6, 인간 대상포진 바이러스 7, 인간 대상포진 바이러스 8, 천연두(Variola) 바이러스, 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus), 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, D형 간염 바이러스, E형 간염 바이러스, 리노바이러스, 코로나바이러스, 인플루엔자바이러스 A, 인플루엔자바이러스 B, 홍역 바이러스, 폴리오마바이러스, 인간 파필로마바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory syncytial virus), 아데노바이러스, 코사키 바이러스(Coxsackie virus), 뎅기 바이러스, 유행성이하선염(Mumps) 바이러스, 폴리오바이러스, 광견병(Rabies) 바이러스, 로우스 육종바이러스, 황열 바이러스, 에볼라 바이러스, 마부르그 바이러스(Marburg virus), 라사 열 바이러스, 동부 말 뇌염 바이러스(Eastern Equine Encephalitis virus), 일본 뇌염 바이러스, 세인트 루이스 뇌염 바이러스(St. Louis Encephalitis virus), 머레이 계곡 열 바이러스(Murray Valley fever virus), 웨스트 나일 바이러스, 리프트 계곡 열 바이러스(Rift Valley fever virus), 로타바이러스 A, 로타바이러스 B. 로타바이러스 C, 신드비스 바이러스(Sindbis virus), 유인원 면역결핍 바이러스(Simian 면역deficiency virus), 1형 인간 T-세포 백혈병 바이러스, 한타바이러스, 루벨라 바이러스, 유인원 면역결핍 바이러스, 1형 인간 면역결핍 바이러스, 및 2형 인간 면역결핍 바이러스를 포함하는 바이러스 군으로부터 선택될 수 있다.

표적 핵산은 또한 식품, 음료, 물, 약학 제품, 개인 의료 용품(personal care products), 유제품 또는 주변 샘플 내의 박테리아와 진핵생물의 검출에 유용할 수 있다. 바람직한 음료는 소다수, 병에 든 물, 과일 주스, 맥주, 와인 또는 주류 제품을 포함한다. 개발된 분석법은 특히 식품, 음료, 물, 약학 제품, 개인 의료 용품, 유제품 또는 주변 샘플을 제조하거나 저장하기 위해 사용되는 원료물질, 장비, 제품 또는 공정의 분석에 유용할 것이다.

본 발명의 또 다른 관련 구체예에서, 활성화된 분절-폴리펩티드 단편의 조립은 불연속적인 에피토프를 포함하는 조립된 검출 분자를 형성하는데, 상기 분자는 상기 조립된 단백질 상의 불연속적인 에피토프는 인지하나 어느 한 개별 폴리펩티드 상에 존재하는 부분적인 에피토프는 인지하지 못하는 항체를 사용함으로써 검출될 수 있다. 불연속적인 에피토프의 한 예는 HIV의 gpl20에서 발견된다. 이러한 에피토프 및 이와 같은 에피토프의 다른 유도체들은 잘 알려져 있는 기술에 기초하여 당업계의 통상의 기술자에 의해 용이하게 제작될 수 있고, 항체 자신의 단백질 단편이 아닌 단백질 단편에 의해 조립된 단백질을 인지하는 항체에 관하여 스크리닝될 수 있다.

표적 핵산은 인간에서 기원될 수 있다. 표적 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 표적 핵산은 용액 내에서 유리되어 있거나 고체 지지체에 고정될 수 있다.

한 구체예에서, 표적 핵산은 유전자적으로 문제가 있는 질병(genetically based disease)에 특이적이거나 유전자적으로 문제가 있는 질병에 대한 소질에 특이적이다. 상기 질병은, 예를 들어, 베타-탈라세미아(thalassemia), 낫형 세포 빈혈 또는 인자-V 라이덴병((Factor-V Leiden), 낭포성 섬유증(CF)와 같이 유전자적으로 문제가 있는 질병, p53과 plO같은 암 관련 표적, 또는 BRC-I and BRC-2 for 유방암 민감성(susceptibility)에 관한 BRC-I와 BRC-2일 수 있다. 아직 또 다른 구체예에서, 동정된 염색체 DNA가 친부 검사(paternity testing), 신원 확인 또는 범죄 조사와 관련하여 조사될 수 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 방법, 특히 생체내에서 RNA를 검출하는데 적당한 키트를 젝공한다. 한 구체예에서, 키트는 검출 컨스트럭트와 유도성 리포터 컨스트럭트를 포함한다. 한 구체예에서, 리포터 컨스트럭트와 검출 컨스트럭트는 별개의 핵산 분자들 상에 존재한다. 또 다른 구체예에서, 이들 둘 모두는 바이시스트로닉 핵산 분자에서 엔코딩된다. 관련 구체예에서, 분절-폴리펩티드 단편은 IRES 부위에 의해 분리된다. 또 다른 구체예에서, 폴리펩티드-단편은 분절가능한 부위를 포함하는 한 핵산으로 엔코딩되며 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 수단, 이에만 한정되는 것은 아니나, 예를 들어, 효소 절단; 화학적 절단, 광절단, 산 절단, 열 또는 가열 절단 등에 의해 별개의 분절-폴리펩티드 단편을 형성하기 위해 절단되어질 수 있다. 또 다른 구체예에서, 리포터 분자는 관심있는 당업자의 유전자를 부가하기 위해 변형될 수 있고, 또 다른 구체예에서, 발현되는 리포터 분자는 테트-온 또는 테트-오프 프로모터에 작동적으로 연결된다. 또 다른 변형 구체예에서, 표적 핵산 서열을 포함하는, 리포터 컨스트럭트는 당업자에게 관심있는 프로모터에 의해 조절되도록 당업자에 의해 변형될 수 있다. 이러한 각각의 구체예들에서, 키트는 검출 분자 내에 검출 단백질을 위한 선택된 절단 폴리펩티드들을 포함하며, 또한 사용지침서와 검출 단백질로부터의 시그널을 검출하기 위한 시약을 포함한다. 몇몇 구체예들에서, 키트는 또한 샘플 내의 표적 핵산의 존재 또는 양을 포착 및/또는 검출하는데 적당한 시약을 포함한다. 표적 핵산의 존재 및/또는 양을 검출하기 위한 시약은 효소 활성 시약 또는 조립된 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 항체는 표지될 수 있다.

단백질 보완과 효소 리포터의 조합은 백그라운드의 실질적인 감소와 시그널의 증폭을 가능하게 한다. 이는 결국 저, 중 및 고 풍부도의 핵산을 분석할 수 있는 생체내 RNA 검출 기술로 귀결된다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 생체내에서 표적 핵산의 존재 및/또는 양을 검출하는데 적당한 키트를 제공한다. 키트는 적어도 제 1 분자에 커플링된 제 1 프로브 및 제 2 분자에 커플링된 제 2 프로브를 포함하는데, 여기서 상기 프로브는 표적 핸산 내의 혼성화 서열에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 프로브는 바이얼(vial) 내에 존재한다. 키트는 또한 샘플 내의 표적 핵산의 존재 또는 양을 포착 및/또는 검출하는데 적당한 시약을 포함한다. 표적 핵산의 존재 및/또는 양을 검출하기 위한 시약은 효소 활성 시약 또는 조립된 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 항체는 표지될 수 있다. 그러한 키트는 선택적으로 RCA 반응, 면역RCA, 면역PCR을 수행하기 위해 필요한 시약, 예컨대, DNA 중합효소, DNA 중합효소 보조인자(cofactors), 및 데옥시리보뉴클레오티드-5'-트리포스페이트를 포함할 수 있다. 선택적으로, 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오티드 분자, DNA 또는 RNA 리가아제, 제한 효소(restriction endonucleases), 역전사효소(reverse transcriptases), 말단 전이효소(termianl transferases), 다양한 완충액과 시약, 항체 및 RNA분해효소(RNase)와 뉴클레아제(nuclease)의 억제자를 포함할 수 있다. 이러한 성분들은 용기, 예컨대, 바이얼 안에 존재한다. 키트는 또한 양성 및 음성 대조 반응을 수행하는데 필요한 시약뿐만 아니라, 사용지침서를 포함할 수 있다. 해당 반응에 사용되어야 하는 시약의 최적량은 본원에 개시된 사항의 이점을 보유하면서 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 동시적으로 다수의 핵산 표적에 대한 단백질 보완에 사용될 수 있다. 예를 들어, 상이한 핵산 결합 모티프들에 결합된 상보적인 분절-폴리펩티드 단편들에 대한 단백질 보완. 한 표적 핵산의 존재는 한 쌍의 활성 분절-폴리펩티드 단편의 단백질 보완을 용이하게 할 것이고, 한편, 또 다른 표적의 존재는 또 다른 쌍의 활성화된 분절-폴리펩티드 단편의 단백질 보완을 용이하게 할 것인데, 이는 결국 다른 활성 단백질 및 검출가능한 시그널로 귀결된다. 이와 같은 구체예에서, 다수의 핵산 표적들이 동시적으로 검출될 수 있다. 대안적인 구체예에서, 표적 핵산, 예컨대, RNA와 DNA의 동시 검출은 실시간 단백질 보완에 의해 모니터될 수 있다.

관련 구체예에서, 상이한 형광 단백질들로부터의 분절-형광 단백질 단편들을 사용한 다수의 단백질 보완. 관련 구체예에서, 본 발명의 방법은 추정되는 표적이나 서로 다른 그 외 다양한 핵산 표적들 중에서 특정 표적 핵산의 실시간 검출과 식별을 가능하게 한다(전체 내용이 본원에서 참고문헌으로 인용되는, 다음 문헌을 참조하라: Hu et al., Nature Biotechnology, 2003;21;539-545; Kerppola, 2006, 7;449-456, Hu et al., Protein-Protein Interactions (Ed. P. Adams and E. Golemis), Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2005).

정의

달리 명시하지 않는한, 본원에서 사용된 하기 용어와 어구는 하기 의미를 갖도록 의도된 것이다:

본원에서 사용된, 용어 "검출 컨스트럭트"는 검출 분자를 포함하는 검출 단백질과 핵산 결합 모티프를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함하려는 의도이다.

본원에서 사용된, 용어 "리포트된(reported) 컨스트럭트"는 관심있는 핵산((예를 들어, DNA 또는 RNA)과 리포터 분자를 포함하는 표적 핵산 서열(예를 들어, RNA 앱타머)을 포함하려는 의도이다.

용어 "진핵생물" 또는 "진핵생물 개체"은 프로토조아, 진균, 효모, 녹조류, 단세포 식물, 다세포 식물, 및 모든 동물(척추동물과 무척추동물 둘 모두)을 포함하는, 동물계, 식물계, 및 원생생물계의 모든 개체를 포함하려는 의도이다. "진핵 세포"는 단수의 "진핵 세포" 뿐만 아니라 복수의 "진핵 세포"를 포함하려는 의도이며, 진핵생물로부터 유래한 세포들을 포함한다.

용어 "척추동물"은 단수의 "척추동물" 뿐만 아니라, 복수의 "척추동물"을 포함하려는 의도이며, 포유동물과 조류뿐만 아니라, 어류, 파충류, 및 양서류를 포함한다.

용어 "포유동물"은 단수의 "포유동물" 및 복수의 "포유동물들"을 포함하려는 의도이며, 이에만 국한되는 것은 아니지만, 다음을 포함한다: 인간; 영장류, 예컨대, 유인원, 원숭이, 오랑우탄, 및 침팬지; 개과 동물, 예컨대, 개 및 늑대; 고양이과 동물, 예컨대, 고양이, 사자, 및 호랑이; 말과 동물, 예컨대, 말, 당나귀, 및 얼룩말; 식용 동물, 예컨대, 소, 돼지, 및 양; 유제 동물(ungulates), 예컨대, 사슴 및 기린; 설치류, 예컨대, 생쥐, 래트, 햄스터 및 기니 피그; 및 곰. 바람직하게는, 포유동물은 인간 피검체이다.

본원에서 사용된, 용어 "생체내"는 개체 내에 존재하는, 살아있는 세포를포함하려는 의도이다. 개체 밖에서 살아있는 세포를 논의할 때, 용어 "생체외(ex vivo)"가 일반적으로 사용된다. 살아있는 세포는, 다세포 개체 및 단 세포 개체, 예컨대, 효모와 박테리아를 포함하는, 임의의 개체를 이루는, 임의의 세포일 수 있다.

살아 있는 세포 내의 핵산 검출과 관련하여, 본원에서 사용된, 용어 "침습적(invasive)"은 침습적 방법, 예컨대, 예를 들어, 리포펙타민과 미세주입과 같은, 침습적 방법을 사용하여 핵산을 검출하는 방법을 의미한다. 따라서, 용어 "비침습적(non-invasive)"은 그러한 침투적 절차 없이 살아있거나 생존중인 세포 내에서 핵산을 검출하기 위한 방법을 의미한다.

용어 "조직 배양" 또는 "세포 배양" 또는 "배양" 또는 "배양하는"은 세포 구조물(architecture)의 보존, 세포 기능의 보존, 추가로 분화, 또는 상기 셋 모두가 허용되는 조건하에서 시험관내의 식물 또는 동물 조직 또는 세포의 유지 또는 생장을 의미한다. "1차 조직 세포(Primary tissue cells)"은 조직으로부터 직접 채취된 세포, 즉 개체 내에서 동일한 기능을 수행하는 동종의 세포 집단이다. 이와 같은 세포에 단백질가수분해 효소 트립신의 처리는, 예를 들어, 이들 세포들을, 배양 플레이트에 파종될 때, 세포 구조물을 성장시키고 유지하는, 개별 1차 조직 세포로 분리시킨다. 조직 배양에서 일차 세포의 조작으로부터 생성되는 세포 배양물은 "이차(secondary) 세포 배양"으로 불리운다. 대부분의 이차 세포는 유한정한 시간 동안 절단하며 그 후 사멸된다. 그러나, 몇몇 이차 세포들은 이러한 "위기 순간"을 통과한 후, 연속 "세포주"를 형성하기 위해 무한정하게 증식하여 연속적인 "세포주"를 형성할 수 있다. 세포가 배양되는 액체 배지는 본원에서 "배양 배지(medium)" 또는 "배양 배지들(media)"로 지칭된다. 세포 배양이 진행되는 동안 바람직한 분자, 예를 들어, 면역글로불린 분자가 배지 내로 분비되는 배양 배지는, 본원에서 "조절된 배지(conditioned medium)"로 지칭된다.

세포는 또한 특정 피검체 세포가 아니라 이와 같은 세포의 자손 또는 특정 변형 또는 환경적 영향(예를 들어, 분화)으로 인한 잠재적 자손을 의미하는데, 상기 자손은 사실상 모세포와 동일하지 아니할 수 있지만, 여전히 본 발명의 영역에 포함된다.

본 발명에 사용되는 세포는, 본원의 실시예에 제시된 것과 같은, 예를 들어, 시험관내 또는 생체외에서 배양된 세포일 수 있다. 예를 들어, 배양 배지 및 환경 자극으로 시험관내에서 배양된 세포가 배양 배지에 첨가될 수 있다. 대안적으로, 생체외에서 배양된 세포의 경우, 세포는 피검체로부터 획득될 수 있는데, 여기서 상기 피검체는 건강하고/거나 질병으로 인한 영향을 받고 있다. 세포는, 비제한적인 예로서, 생검 또는 당업계에 공지된 그 외의 외과적 수단에 의해 획득될 수 있다.

내부 리보좀 진입 부위로 지칭되는 용어 "IRES"(다음 문헌을 참고바람: Kozak (1991) J. Biol. Chem. 266'19867-70)는 컨센서스 리보좀 결합 부위를 엔코딩하는 서열이며, 5' 개시코돈 및/또는 조절 서열 도는 하류 핵산 서열의 발현을 향상시키기 위한 유전자 또는 마커 유전자를 엔코딩하는 그 밖의 5' 핵산 서열에 바로 인접하여 삽입될 수 있다. 바람직하거나, 필요한 이와 같은 변형은 경험적으로 결정될 수 있다.

용어 "폴리뉴클레오티드"는 핵산 또는 컨스트럭트에 존재하는, 하나 이상의 임의의 핵산 세그먼트, 또는 핵산 분자, 예를 들어, DNA 또는 RNA 단편을 의미한다. "관심있는 유전자를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드"는 이와 같은 폴리펩티드의 코딩 지역을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 조절 엘리먼트, 예컨대, 프로모터 또는 전사 종결자를 엔코딩하거나, 폴리펩티드 또는 단백질의 특이 엘리먼트, 예컨대, 2차 시그널 펩티드 또는 기능 도메인을 엔코딩할 수 있다.

"뉴클레오티드"는 중합체성 핵산, 예컨대, DNA 또는 RNA의 단량체 단위이며, 다음 3개의 독특한 소부분(subpart) 또는 모이어티로 구성되어 있다: 당, 인산, 및 핵산염기(nucleobase)(Blackburn, M., 1996). 이중나선의 일부일 경우, 뉴클레오티드는 또한 "염기" 또는 "염기쌍"으로서 지칭되기도 한다. 가장 공통되는 천연적으로 생성되는 핵산염기, 아데닌(A), 구아닌(G), 우라실(U), 시토신(C), 및 티아민(T)은 서열 특이적 방식으로 한 핵산 가닥이 다른 것에 결합하는 수소 결합성 기능성을 지닌다. "뉴클레오시드"는 인산이 결여된 뉴클레오티드를 의미한다. DNA와 RNA에서, 뉴클레오시드 단량체는 포스포디에스터 결합에 의해 연결되는데, 본원에서 사용된 것과 같이, 용어 "포스포디에스터 결합"은, 연결된 짝이온, 예를 들어, IT', NW, Na', 및 이와 동일한 다른 것을 포함하면서, 포스포디에스터 결합 또는, 이의 인산염 유사체를 포함하는 결합을 의미한다.

"폴리뉴클레오티드" 또는 "올리고뉴클레오티드"는 천연 뉴클레오티드 단량체 또는 이의 유사체의 선형 중합체를 의미하는데, 이중 가닥 및 단일 가닥 데옥시리보뉴클레오티드 "DNA", 리보뉴클레오티드 "RNA", 및 이와 동일한 다른 것을 포함한다. 즉, "올리고뉴클레오티드"는 각각, 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함하는 구조적 단위인, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 사슬이다. 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 수개의 단량체 단위, 예를 들어, 8-40개 내지 수천개의 단량체 단위에 달하는 크기이다. DNA 폴리뉴클레오티드가, "ATGCCTG"와 같이, 일련의 문자로 제시되는 어떠한 경우라도, 뉴클레오티드가 왼쪽에서 오른쪽으로 5'->3' 순서로 존재하며, 달리 특별히 명시하지 않는한, "A"는 데옥시아데노신, "C"는 데옥시시티딘, "G"는 데옥시구아오신, 및 "T"는 티미딘을 나타낸다는 것이 이해될 것이다.

"왓슨/크릭 염기쌍 형성(base-paring)"과 "왓슨/크릭 상보성"은 수소 결합을 통해 결합하는(예를 들어, A는 T와 U와 짝을 이루며, G는 C와 짝을 이룸) 특정 쌍의 뉴클레오티드, 및 이의 유사체의 패턴을 의미한다. "혼성화" 또는 "혼성화하는"은 특이적인 염기쌍 형성 행동이다. 혼성체(Hybrid)는 둘 이상의 핵산 또는 핵산 유사체의 상보적인 가닥들이 염기쌍 형성을 겪을 때 형성된다.

"검출"은 검출 표지의 특성에 기초한 컨스트럭트의 검출, 관찰, 또는 측정을 의미한다.

용어 "핵산염기-변형된(nucleobase-modified)"은 DNA와 RNA에서 발견되는 천연적으로 생성되는 핵산염기인, A, G, C, T, U의 염기쌍 유도체를 의미한다.

용어 "프로모터"는 전사를 유도하는데 충분한 최소의 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 프로모터-의존적 유전자 발현이 세포-유형 특이적, 또는 조직 특이적으로 조절되거나, 외부 시그널 또는 물질에 의하여 유도될 수 있게 하는데 충분한 그러한 프모모터 엘리먼트가 또한 본 발명에 포함된다: 이와 같은 엘리먼트는 천연 유전자의 5' 또는 3' 지역 또는 인트론에 위치하고 있을 수 있다. 용어 "유도성 프로모터"는 RNA 중합효소 결합 및 전사 개시의 속도가 외부 자극에 의해 조절될 수 있는 프로모터를 의미한다. 용어 "구조성 프로모터"는 RNA 중합효소 결합 및 전사 개시의 속도가 일정하며 비교적 외부 자극에 비의존적인 프로모터를 의미한다. "일시적으로 조절되는 프로모터"는 RNA 중합효소 결합 및 전사 개시의 속도가 발달이 진행되는 동안의 특정 시간에 조절되는 프모모터이다. 이러한 모든 유형의 프로모터들이 본 발명에 포함된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 본원에서 호환적으로 사용되는 "프로모터" 또는 "프로모터 지역" 또는 "프로모터 엘리먼트"는, 일반적으로 DNA 또는 RNA 또는 이의 유사체에 국한되지 아니하는, 이에 작동적으로 연결된 핵산 서열의 전사를 조절하는, 핵산 서열의 세그먼트를 의미한다. 프로모터 지역은 RNA 중합효소 인지, 결합 및 전사 개시에 충분한 특이 서열을 포함한다. 이 프로모터 지역의 일부는 프로모터로 지칭된다. 또한, 프로모터 지역은 RNA 중합효소의 이러한 인지, 결합 및 전사 개시 활성을 조절하는 서열을 포함한다. 이러한 서열들은 시스-작동(cis-acting) 또는 트랜스-작동(trans-acting) 인자들일 수 있다. 조절의 성격에 따라서, 프로모터는 구조성이거나 조절될 수 있다.

용어 "구조적으로 활성화되는 프로모터(constututively active promoter)"는 해당 세포 내에서 항상 발현되는 유전자의 프로모터를 의미한다. 포유동물 세포에서 사용되는 대표적인 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV)를 포함하며, 원핵생물 세포에서 사용되는 대표적인 예는 박테리오파지 T7와 T3 프로모터, 이와 유사한 것을 포함한다.

용어 "작동적으로 연결된" 또는 "작동적으로 결합된"은 본원에서 호환적으로 사용되며, 핵산 서열과 뉴클레오티드의 조절 서열(예컨대, 프로모터, 인핸서, 전사 및 번역 종결 부위, 및 다른 시그널 서열)의 기능적 관계를 의미한다. 예를 들어, 핵산 서열, 일반적으로 DNA의 조절 서열 또는 프로모터 지역에 대한 작동적 결합은 DNA와 조절 서열 또는 프로모터 간의 물리적 및 기능적 관계를 의미하는데, RNA 중합효소가 상기 DNA를 특이적으로 인지하고, 이에 결합하고 이를 전사함으로써, 조절 서열 또는 프로모터에 의해 그러한 DNA의 전사가 개시된다. 발현 및/또는 시험관내 전사를 최적화하기 위해, 발현을 위한 세포 유형 내의 핵산 또는 DNA의 발현을 위한 조절 서열을 변형시킬 필요가 있을 수 있다. 그러한 변형의 바람직한 상황 또는 필요성은 경험적으로 결정될 수 있다.

용어 "컨주게이트"는 하나의 실체를 형성하기 위하여 접합되는 둘 이상의 단백질들의 부착을 의미한다. 단백질는 링커, 화학적 변형, 펩티드 링커, 화학적 링커, 공유결합성 또는 비공유결합성 결합, 또는 단백질 융합 또는 당업계의 통상이 기술자에게 공지된 임의의 수단에 의해 접합될 수 있다. 접합은 영구적이거나 가역적일 수 있다. 몇몇 구체예들에서, 컨주게이트 내의 각각의 링커와 각각의 단백질의 바람직한 특성을 이용하기 위하여 몇몇 링커들이 포함될 수 있다. 유연한 링커와 컨주게이트의 용해도를 증가시키는 링커가 단독으로 사용되거나 본원에 통합된 다른 링커들과 함께 사용되는 것이 고려된다. 펩티드 링커는 컨주게이트 내의 하나 이상의 단백질에 대한 링커를 엔코딩하는 DNA를 발현시킴으로써 연결될 수 있다. 링커는 산 절단성, 광절단성 및 열 민감 링커일 수 있다. 몇몇 구체예들에서, "컨주게이트" 또는 "컨주게이트된"은 또한 분자의 모이어티들이 결합되며 인접하여 유지되게 되는, 공유결합성, 이온성, 또는 소수성 상호작용을 포함한다.

본 발명에서, "앱타머"는 특정 표적 단백질과 강하고 특이적으로 결합하도록 인공적으로 조작된 핵산 리간드를 의미한다. "변형된 앱타머(Modulate aptamer)"는 앱타머의 핵 부분이 낮은 Tm 값을 가지며, 표적 단백질이 존재할 때에만 결합하여 이중 가닥을 형성하는, 2개의 짧은 올리고뉴클레오티드 사슬로 나뉘어지게 디자인된 앱타머를 의미한다.

실시예

실시예 1

핵산 상호작용에 의해 촉진되는 단백질-보완 방법.

핵산 상호작용에 의해 촉진되는 신속한 단백질 보완의 작동성(workability)를 입증하기 위해, 시험관내에서 몇몇 실험들이 수행되었다. 도 20A와 20B는 본원에서 논의된 핵산 상호작용이 어떻게 작동하는지 보여준다. 이러한 실험들에서, 수많은 이유로 마커-단백질로서 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP)이 선택되었다. 첫째, EGFP의 활성은 특징적인 형광의 존재로 용이하게 결정된다. 둘째, GFP 패밀리에 속하는 형광 단백질들은 이미 다음 몇몇 단백질-단백질 보완 연구에서 마커 또 는 검출 단백질로서 성공적으로 사용되어 왔다: 예를 들어, Ozawa et al., 2000, Ozawa et al., 2001 a,b; Ghosh et al., 2000; Hu et al., 2002; Hu & Kerppola, 2003; Remy & Michnick, 2004; Magliery et al., 2005(상기 문헌들은 성공적으로 절단되는 EGFP에 대한 도식을 소개하고 있다).

이러한 연구들은 EGFP의 아미노산 153-161 사이의 루프가 절단을 위한 편리한 부위임을 보여주었다: 상기 루프 내부로의 단백질 삽입은 생체내에서 단백질 폴딩과 발색단 형성에 영향을 미치지 아니하였다(Ozawa et al., 2000, Ozawa et al., 2001 a,b; Ghosh et al., 2000; Hu et al., 2002; Hu & Kerppola, 2003; Remy & Michnick, 2004; Magliery et al., 2005). 또한, 중요하게도, 2개의 단편이 대장균에서 동시-발현되었을 때, 동시적으로 자가-조립되는 형광발색단(fluorophore) 또는 발색단은 비존재한다는 것이 밝혀졌다(Gosh et al., 2000; Hu et al., 2002; Magliery et al., 2005). 따라서, GFP의 2개의 절단된 폴리펩티드 단편들이 활성 형광 단백질을 형성하기 위해 핵산 상호작용에 의해 회합되도록 유도될 수 있다는 것을 입증하기 위해, 본 발명자들은, 커플링된 올리고뉴클레오티드들의 이중나선 DNA 형성이 활성 EGFP 단백질과 강한 형광 발달을 생산할 수 있는 EGFP 단편들의 재결합을 촉진시킨다는 것을 입증할 수 있도록, EGFP의 2개의 폴리펩티드 단편들이 상보적인 올리고뉴클레오티드에 컨주게이션되게 디자인하였다.

이러한 연구들에서, EGFP는 위치 158에서 α- 및 β-단편으로 명명되는, 2개의 부분으로 유전자적으로 분절되었다. 올리고뉴클레오티드들과의 커플링을 위하여, α- 및 β-EGFP 단편들은 각각 C-말단과 N-말단에 잉여 시스테인 잔기를 지니 도록 디자인되었다. 이들 단편들은 인테인을 지닌 C-말단 융합체로서 대장균에서 발현되었으며 인테인 자가-분절 화학(NE Biolabs)을 사용하여 정제되었다. 정제된 단백질들은 컨주게이트된 올리고뉴클레오티드들에 대한 간편한 Cys-표적화된 비오틴-HPDP 화학(Pierce)을 사용하여 시험관내에서 정량적으로 비오틴표지화되었다. 비오틴표지화된 단백질은 먼저 스트렙트아비딘으로 태그된 다음 뒤이어 5'- 또는 3'-말단에 비오틴을 지니는 올리고뉴클레오티드로 태그되었다. 이렇게 하여, 서로 다른 말단에 비오틴을 지닌 상보적인 21개 뉴클레오티드(nt) 길이의 올리고뉴클레오티드가 4량체 스트렙트아비딘 분자를 통해 EGFP의 α- 및 β-단편에 용이하게 덧붙여졌다(도 20A). 이러한 분자 키메라가 동일 몰당량으로 결합되었을 때, 강한 형광 발생은 EGFP를 닮은 방출 스펙트럼을 지닌 형광발색단의 형성을 나타내었다(도 20b). 대조 실험에서, 상보적인 올리고뉴클레오티드없이 스트렙트아비딘에 융합된 EGFP의 비오틴표지화된 α- 및 β-단편들을 함께 혼합하였고, 유의적인 형광은 검출되지 아니하였다(도 20B). 형광 회복(recovery)은 실험때마다 다소 달랐는데, 최대로 폴딩된 완전한 EGF의 100% 형광에 가깝게 회복되었다. 따라서, 대부분의 경우, 유도된 단백질 보완에 의해 GFP 형광은 100% 회복될 수 있다.

부착된 올리고뉴클레오티드를 지닌 절단된 EGFP 단편들의 재구성으로부터 재구성된 EGFP의 형광 스펙트럼은 천연 EGFP의 형광 스펙트럼은 다소 상이하였다. 첫째, 재구성된 단백질의 최대 방출 및 여기(490/524)는 천연 EGFP(488/ 507 nm, Zimmer, 2002)와 비교하여 적색 파장으로 편이되었다(도 20B). 이것은 재구성된 단백질 내의 β-바렐 구조에 있어서 있음직한 작은 차이로 설명될 수 있다. 둘째, 재구성된 복합체와 EGFP 간의 차이는 Mg^{2 +} 이온의 부가시 식별될 수 있었다. 천연 단백질의 형광은 2 mM Mg^{2 +} 이온의 부가시 약 30% 감소된 반면, 재구성된 EGFP의 형광은 처음에 약 30% 증가되었으며 이후 점진적으로 감소되었다(도 21). Mg^{2 +}의 다른 영향은 재구성된 EGFP에 부착된 이중나선 DNA의 존재로 설명될 수 있다. 실제로, DNA 이중나선은 족집게 그립(pincer grip)과 같이 EGFP의 2개 단편들을 붙들고 있으며, Mg^{2 +} 이온의 첨가가 DNA 이중나선을 더 안정하게 만들기 때문에, 이것은 재조립된 EGFP의 더 높은 안정성을 초래하며 결과적으로 초기의 형광 증가를 초래한다. 반대로, 천연 형광 단백질의 경우, 발색단 근처의 2가 금속 양이온의 존재는 형광을 켄칭시키는 것으로 알려져 있다(Richmond et al., 2000; Zimmer, 2002). 따라서, 재구성된 EGFP에서 형광의 점진적 감소는 하기 2개 과정의 결과이다: Mg^{2 +} 이온의 존재시 DNA 이중나선의 더 높아진 안정도로 인한 복합체의 안정화 및 형광 켄칭.

실시예 2

유도된 신속한 단백질 보완을 위한 검출 단백질.

실시예 1에서, 단백질 보완의 마커-단백질 또는 검출 단백질은 형광 단백질, 즉, 해파리 에쿼리아 빅토리아(Aequorea victoria) GFP의 이중 돌연변이체(F64L, S65T)인, 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP)이다. 잔기 154-158에서 분절된 EGFP와 다른 관련 형광 단백질들은 생체내에서 단백질/단백질 상호작용을 시험하기 위해 디자인된 몇몇 연구에서 성공적으로 사용되었다(Ghosh et al., 2000; Hu & Kerppola, 2003; Remy & Michnick 2004; Magliery et al., 2005). 이러한 연구들은 생체내에서 이의 단편들로부터의 활성 EGFP의 재조립이 동시적으로 일어나지 아니하나 추가의 단백질/단백질 상호작용을 필요로 한다는 것을 밝혀내었다(Maglieri et al., 2005). 추가적으로, EGFP 재조립은 상호작용하는 단백질의 크기에 상당히 관대하다(Ghosh et al., 2000; Hu & Kerppola, 2003; Remy & Michnick 2004; Magliery et al., 2005).

RNA 로컬라이제이션 연구를 위해 단백질 보완을 이용하기 위해, 단편 재조립의 동역학이 충분히 빠르다는 것이 특히 중요하다. 본 발명자들의 시험관내 예비 연구에서, 형광에서의 증가는 활성화된 분절-EGFP 단편들의 매우 급속한 보완에 의해 초래된다(도 22A). 이것은 EGFP의 α-단편이 미리-형성된 성숙한 발색단을 포함하며, 그리하여 활성화된 구조로 존재하며 EGFP의 상보적인 β-단편과의 결합시 활성 형광 단백질을 즉각적으로 형성할 수 있기 때문에 가능하다. EGFP 재조립에 관한 급속한 동역학의 독특한 특성은 생체내에서 표적 RNA의 급속한 움직임에 대한 모니터링을 가능하게 한다. 그 때문에, 본 발명자들은 한 플라스미드로부터의 보완 시스템의 2개 단백질 성분들을 발현시켰으며, 2-3시간 경과 후 앱타머-태그를 지닌 표적 RNA의 합성을 유도하였다. 이렇게 하여, 본 발명자들은 특이 RNA의 움직임을 모니터링할 수 있다.

예를 들어, 노란색 형광 단백질의 변이체인 베누스(Venus)(F64L, M153T, Vl 63 A, S 175G)와 같은, 또 다른 마커-단백질을 사용하는 것이 가능한데, 상기 변이 체는 형광발색단 성숙 속도가 EGFP보다 더 빠르며(K_0x = 8 x 10^-3 s^-1 대 1.5 X lO^-4 s^-1) 양자효율(quantum yield)은 더 높다(Nagai et al. 2002). 추가적으로, 상기 단백질은 광탈색(photobleaching)에 더 안정하며, 이의 스펙트럼 특성은 세포 단백질들의 자가형광(autofluorescence)으로부터 더 나은 분별이 가능하게 한다.

또 다른 실시예에서, 마커는 색원체성/형광체성 산물을 초래하는, 효소이다.

시그널이 증폭되는 단백질 보완 시스템을 개발하기 위해, 본 발명자들은 프로-형광 베타-락타메이즈 기질인, 세포 투과가능한 세팔로스포린 베타-락탐(CCF₂)(Zlokarnik et al., 1998; Galarneau et al., 2002; Wehrman et al., 2002)과 함께 베타락타메이즈 시스템을 이용하였다. 상기 효소 시스템은 약 100배의 시그널 증폭을 가능하게 한다는 것이 밝혀졌다(Zlokarnik et al., 1998; Galarneau et al., 2002). 생체내 정량 분석은 유카트(Jurkat) 세포 당 50개 분자 정도의 적은 베타락타메이즈가 16시간 후 백그라운드를 초월하여 검출될 수 있다는 것을 보여주었다. 기질에 대한 노출 시간을 줄임으로써, 20,000개의 베타락타메이즈 분자들이 정량되었다. 이러한 민감도는 형광 단백질로 얻을 수 있는 민감도보다 상당히 더 높은데, 여기서 백그라운드 자체형광을 초월하여 검출되도록 하기 위해서 10⁵-10⁶ 표적 몰(mol)/세포가 필요하다(Zlokarnik et al., 1998).

그러므로, 효소 활성을 지니는 마커 단백질은 형광 단백질 보다 더 높은 시그널을 생성시킬 것이다. 그러나, 공간해상도(spatial resolution)는 분자량이 적 은 색깔있는 반응 산물의 확산으로 인해 효소적 접근법에서 부분적으로 소실될 수 있다. 따라서, 특정 실험의 필요에 따라서, 이러한 두 시스템들(형광 또는 효소) 중 어느 한 시스템이 사용될 수 있다.

상보적인 핵산 상호작용에 의해 보조되는 단백질 보완의 가능성을 입증하기 위해, 본 발명자들은 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP)의 분자를 모델로 선택하였고 상기 분자를 2개의 단편들(아미노산 1-158 및 아미노산 159-234)로 절단하였다. 상응하는 유전자들은 전장길이 EGFP-1 유전자를 포함하는 플라스미드(Clontech, PaloAlto, CA)를 이용한 PCR에 의해 획득되었다. 두 단편들은 C-말단(알파Cys-단편, 아미노산 1-158)과 N-말단(베타Cys-단편, 아미노산 159-234)에 추가의 Cys 잔기를 지니도록 조작되었다. PCR 산물은, Ssp DNAB 인테인의 C-말단 융합체로서, TWIN-1 벡터(New England Biolabs, MA)에 클로닝되었다. 모든 컨스트럭트들의 구조는 시퀀싱에 의해 확증되었다.

EGFP의 α-단편은 미리 형성된 발색단을 포함한다. 일부 적은 스펙트럼 차이가 있을 지라도, 최대 100% 형광이 핵산-기반 단백질 보완에 의해 회복될 수 있다. DNA-기반(templated) EGFP 재조립의 동역학은 놀랍게도 t 1/2 ~ 100초로 신속하였는데(도 22를 참조하라), 이는 성숙한 발색단을 지니는 변성된 단백질로부터의 EGFP의 재생(renaturation)에 관한 동력학에 근접한다(Reid & Flynn, 1997, Zimmer, 2000). 유명한, 형광 단백질에서의 일반적인 발색단 성숙은 수시간을 필요로 한다(Zimmer, 2000, 도 22b). 급속한 동역학 데이터에 기초하여, 본 발명의 방법은 성숙한 발색단을 포함하는 EGFP α-단편의 생산을 가능하게 할 수 있다. α-단편은 (EGFP 내의 총 239개 아미노산으로부터) N-말단으로부터 158개의 아미노산을 포함할 정도로 충분히 거대하므로, 완전한 발색단 형성을 위한 잠재력을 지닌다.

분자 모델링은 EGFP의 α-단편 내의 완전히 형성된 성숙한 발색단의 존재를 뒷받침한다. 도 23에서, α-단편의 구조적 형태의 도식적인 대표도는 α-단편(이의 댕글링(dangling) C-말단부를 제외함)이 매우 콤팩트한 구조로 폴딩된다는 것을 보여주며, α-단편 및 전장 길이 EGFP 내의 발색단-형성 아미노산들의 공간적 좌표가 매우 가깝다는 것을 보여준다(도 23B, 23C). 이것은 또한 중심 나선에 강한 ~ 800 벤드(bend)를 지니는 특징적 구조의 형광 단백질의 폴리펩티드 사슬을 지닌 라인에 존재하는데, 형광발색단-형성 아미노산, T66, Y67 및 G68를 아주 근접시킨다(Barondeau et al., 2003; Donnely et al., 2001). α-단편 내의 발색단은, 비록 완전하게 형성되기는 하지만, 전장 길이 EGFP에 존재하는, C-말단 β-단편 내의 아미노산들과의 다수의 중요한 접촉이 결여되어 있으며, 용매에 노출되며, 따라서 완전한 단백질 내의 발색단에 의해 특징지워지는 강한 형광을 발달시키는 능력이 결여된다.

α-단편 내의 프로-형광 발새단의 존재를 직접적으로 확증하기 위해, 본 발명자들은 β-단편 단독의 흡수 및 형광 스펙트럼을 분석하였고 이를 전장 길이 EGFP의 스펙트럼과 비교하였다(도 24). 대조군으로서, EGFP β-단편 및 2개의 비형광 단백질(스트렙트아비딘과 키모트립시노겐)의 스펙트럼을 또한 기록하였다. α- 및 β-EGFP 단편 둘 모두의 흡광도 스펙트럼은 도 24b에 제시되어 있다. 통 상의 기술자가 알 수 있듯이, 이들 중 어느 것도 천연 EGFP에서 볼 수 있는, 490 nm에서의 특징적인 최대 흡수를 지니지 아니한다(도 24A). 그러나, α-단편은 β-단편(도 24B, 인세트), 또는 임의의 비형광 단백질(데이터 미제시)에는 없는 300-400 nm 지역에서 다소 더 높은 흡광도를 특징적으로 보여준다. α-단편의 형광 스펙트럼은(도 24D) 명확히 360 nm에서 특징적인 최대 여기 스펙트럼과 460 nm에서 약한 방출 스펙트럼을 보여준다. 이러한 스펙트럼은 전장 길이 EGFP의 스펙트럼과 상당히 다르지만(도 24c), 상기 스펙트럼은 합성 발색단의 스펙트럼과 부분적 단백질가수분해에 의해 GFP로부터 동정된 짧은길이 발색단을 포함하는 펩티드의 스펙트럼과 부합한다(도 25)(Niwa et al., 1996). 용매-노출 발색단(α-단편 내에 존재하는 것과 마찬가지임)은 300-400 nm에서 빛을 흡수하여야 하지만, 450-500 nm에서는 흡수하지 아니하여야 한다는 것에(전장 길이 EGFP에서 마찬가지임) 주목하라. 별개의 실험에서, 분열-EGFP 단편들은 살아 있는 대장균의 생체내 조건에 노출될 때 완전하게 형성된 천연 구조 EGFP와 상이한 스펙트럼을 생산한다(도 25). 따라서 이런 식으로 생산된, EGFP의 α- 및 β-단편은, 비록 단독으로는 비형광 또는 불활성일지라도, 활성화된 형태로 존재하며, 이들은 활성 형광 단백질을 형성하기 위해 재결합할 수 있다.

이러한, 활성화된 상보적인 EGFP 단편들의 재결합은 시험관내와 생체내에서 일어날 수 있고, 그러한 핵산 상호작용은 EGFP 단편들의 보완을 용이하게 할 수 있다. 형광 회복 또는 재구성의 급속한 동역학은 활성화된 상태로 존재하는 단편들과 일치하는데, 상기 단편들은 대응하는 상보적인 단편들과의 재구성시에만 활성화 된다. 특히, EGFP의 α-단편은 성숙한 발색단을 포함하며 그에 따라 활성화된 상태로 존재하나, 성숙한 발색단의 켄칭으로 인하여 단독으로는 비활성 상태로 존재한다. 81개의 C-말단 아미노산을 포함하는 EGFP β-단편의 부가는, 환경으로부터의 발색단을 보호하며, 결과적으로 급속하며 강한 형광 발달을 초래하는, 콤팩트한 2부분으로 나뉜(bi-partite) 단백질 구조의 형성을 유도한다(단 2개의 단백질 단편들이 결합된 DNA-DNA 또는 그 외의 핵산 상보적 상호작용에 의해 함께 유지되는 것을 조건으로 한다).

이러한 다소 예기치못한 결과는 생체내 급속-단백질 보완에 관한 방법의 개발에 매우 중요하다. 미리 성숙한 발색단을 포함하는 EGFP의 α-단편과 β-단편의 재결합을 사용하는 것은 수초내에 일어나는 활성 EGFP 단백질의 형성을 초래한다. 이러한 분열-EGFP 또는 분열-형광 단편들을 발현시키는 것은(여기서 한 단편은 미리-형성된 성숙한 발색단을 포함함) RNA 성분의 유도에 앞서 수행될 수 있다. RNA 성분에 대한 RNA 합성의 유도는 단편들의 급속-단백질 보완과 형광에서의 증가를 용이하게 할 것이다. 이것은 통상의 기술자가 RNA 발현의 조기 움직임으로부터 특정 RNA의 운명을 틀림없이 추적할 수 있게 한다.

실험결과는 상보적인 올리고뉴클레오티드를 지니는 2개의 EGFP 단편들의 인큐베이션이 524 nm에서 형광 방출 스펙트럼(490 nm에서 최대 여기)의 최대 증가를 초래하였음을 보여주었는데, 상기 스펙트럼은 EGFP의 특징적인 스펙트럼이다. GFP 단편들이 상보적인 뉴클레오티드 없이 혼합되었을 때, 형광 스펙트럼에서의 변화는 발견되지 아니하였다.

실시예 3

검출 단백질과 핵산 결합 단백질의 컨주게이션.

본 실험에서, 본 발명자들은 2개의 절단된 단백질 키메라의 발현이 상호작용하는 앱타머 서열의 부재시 재구성된 형광을 초래하지 아니할 것임을 입증하였다. 본 실험은 대장균에서 수행되었다. EGFP 유전자의 단편들은 플라스미드 pEGFP(Clontech)으로부터의 PCR에 의해 획득되었다. EGFP 유전자의 분열은 시험관내 실험에서와 같이 동일한 위치(1-158, 159-239)에서 EGFP 유전자가 분열되었다. 전장 길이 eIF4A를 포함하는 플라스미드(pGEX-4Al)를 사용하였다. eIF4A의 Fl과 F2 단편들을 PCR로 획득하였으며, 오구로 등(Oguro et al.)에 따라 분열을 수행하였다(도 3 참조). SG 링커를 지닌 2개의 융합 단백질들을 2개의 메시지의 동시발현을 위하여 구축된 2개의 플라스미드 pETDuet-1과 pACYDuet-1(Novagen)에 삽입하였다. 이러한 2개의 플라스미드들은 상이한 복제 기점과 상이한 선별 마커를 지닌다. 그 결과 획득된 플라스미드 pMB12와 pMB13를 대장균 종 BL21(DE3)(Novagen) 내에서 동시발현시켰다. pMB12에서, EGFP의 첫번째 158개 아미노산(A로 명명됨)을 (Ser-Gly)₅ 펩티드 링커를 통해, 진핵생물 개시 인자 단백질 4A(eIF-4A)(F1으로 명명됨)에 연결시켰다. 유사하게, EGFP의 C-말단 92개 아미노산을 포함하는 펩티드(B로 명명됨)를 pMB13 내의 eIF-4A의 제 2의 절반(F2로 명명됨)에 연결시켰다(도 3). 두 컨스트럭트들을 T7 프로모터의 조절하에 두었고 1 mM IPTG로 유도시켰다. FACS로 형광 레벨을 측정하였고 비유도된 배양물의 형광 레벨과 비교하였다(도 4). 본 실험의 양성 대조군으로써, 본 발명자들은 벡터 pTWIN(NEB)에서 전장 길이 EGFP를 발현시켰고, 음성 대조군으로서, eIF4A의 동일한 Fl 단편에 융합된 EGFP 단편들(A-Fl, B-Fl)을 발현시켰다(도 4).

또 다른 실험에서, A-EGFP-F1-eIF-4A 핵산과 B-EGFP-F2-eIF-4A 핵산을 pMP33로 명명된 동일 플라스미드에서 발현시켰는데, 대장균에서 발현되었다. pMB33 플라스미드는 pACYCDuetl(Novagen)의 유도체이고, 마커 단백질(예를 들어, EGFP 또는 효소)의 단편과 RNA-결합 단백질의 단편(예를 들어, MS2막 단백질, 또는 eIF4a)를 포함하는, 두 키메라 분열-EGFP-eIF-4A 단편 단백질들을 발현하는 바이시스트로닉 플라스미드이다. 발현된 키메라 분열-단편들은 표적 RNA의 부재시 재결합하지 아니하다(도 9A), 표적 RNA의 존재하에 급속히 재결합하여 기능성 EGFP 마커 단백질을 생산한다(도 9C).

따라서, RNA-결합 단백질과 표적 RNA의 핵산 상호작용은 시험관내 및 생체내에서 급속한 단백질 보완과 분열 EGFP 단편들로부터의 신속한 동역학과 함께 형광의 회복을 촉진할 수 있다. 이것은 재결합된 21-bp 올리고뉴클레오티드 또는 RNA-결합 단백질과 핵산의 상보적인 결합에 의해 촉진될 수 있다.

실시예 4

앱타머-핵산 결합 단백질 쌍의 선택.

본 발명의 한 구체예에서, 단백질 보완은 관심있는 핵산 서열, 예를 들어 RNA에 대한 앱타머 태그의 검출에 기초하고 있다. 앱타머는 검출 단백질에 대하여 컨주게이트된 핵산 결합 단백질에 의해 검출될 수 있다. 특히, 핵산 결합 단백질 은 절단되며 개개의 단편들은 검출 단백질의 폴리펩티드 단편들에 컨주게이션된다. 앱타머/단백질 상호작용에 관한 몇몇 파라미터들은 핵산-기반 단백질 보완의 성공적인 개발에 중요하다. (i) RNA 앱타머와 RNA-결합 단백질 간의 결합 친화력은 마커-단백질의 재조립을 위한 에너지를 제공할 수 있을 정도로 충분히 높아야 한다. (ii) 앱타머의 길이는 너무 길지 않아야 하는데, 그렇지 않으면, RNA로의 앱타머의 도입이 이의 발현과 행동에서의 변화를 초래하게 된다. (iii) RNA-결합 단백질은 단량체이어야 하며, 작은 폴리펩티드, 분리되어 있을 때, 비활성이지만, 함께 발현될 때, 앱타머에 결합할 수 있는 두개의 도멘인들로 구성되는 것이 바람직하다.

eIF4A는 진핵생물 개시 인자이며, 따라서, 진핵생물 번역 시스템의 편재하는 성분이다. 효모 내에서의 이의 천연 농도는 높으며(50 mM) 또 다른 풍부한 세포 단백질인, 액틴의 농도와 비견될 수 있다(Duncan et al., 1987). 이것은 다른 개시 인자(4B, 4H, 4G, 4F)와 함께 복합체 내에서 ATP-의존성 RNA 헬리카제로 역할하는 29 kD의 작은 단백질이다(Kapp & Lorsch, 2004). eIF4A는 2개의 도멘인들로 이루어져 있으며 이의 결정 구조는 덤벨 구조와 닮아있다: 콤팩트한 N-말단과 C-말단 도메인들이 유연한 11개 아미노산 길이의 링커에 의해 연결되어 있다(Johnson & McKay, 1999; Benz et al., 1999; Caruthers et al., 2000). 이러한 구조적 특징은 이 단백질이 도메인 절단을 위한 편리하고 유용한 도구가 되게 한다. 더욱이, 최근 연구는 나노몰 범위의 친화력으로 eIF4A에 결합하는 강한 결합 올리고뉴클레오티드 또는 앱타머를 동정하였다(Oguro et al., 2003). 오구로 등은 강하게 결합하는 앱타머 서열의 길이가 56 nt 정도로 짧을 수 있다는 것을 제시하였으며, eIF4A의 절단된 도메인들은 앱타머에 결합할 수 없으나, 전장 길이 단백질은 고 친화력으로 앱타머에 결합할 수 있다는 것을 발견하였다(Oguro et al., 2003).

이러한 특성들로 인하여, eIF4A은 단백질 보완에 관한 유력한 후보자이며, 단백질 보완을 유도하기 위하여 본 발명자들의 시스템에서 사용되었다. 본 발명자들은 2개의 단편들로 분열된 eIF4A를 사용하였으며, 상기 단편들 각각은 EGFP 검출 단백질의 단편들에 융합되었다. RNA 앱타머의 존재하에 eIF4A의 재조립은 따라서 EGFP 단백질의 2개의 단편들을 회합되게 한다. 앱타머-eIF4A 상호작용의 친화력은 세포 내에서 RNA를 모니터링하기 위해 사용된 MS2 피막 단백질/ MS2 RNA 상호작용와 동일한 범위이다(Bertrand et al., 1998; Beach et al., 1999; Beach & Bloom, 2001; Rook et al., 2000).

대안적으로, 보완하는 쌍들에 대한 디자인은 2개의 상이한 RNA 앱타머와 마커 단백질의 단편들에 덧붙여진 2개의 상이한 단백질들 또는 펩티드들을 포함할 수 있다(도 5). 이 경우에 단백질 또는 펩티드는 시험관내에서 고 결합 친화력을 지닌 앱타머가 동정되게 하기 위하여 바이러스 단백질들의 목록에서 선택될 것이다(표 1을 참조하라).

이의 대안적 디자인의 이점은 2개의 상이한 단백질 또는 펩티드가 하나의 단백질이 2개의 단편들로 절단되는 경우 보다 각각 서로에 대해 상호작용할 가능성이 더 적어질 수 있다는 것이다. 절단된 단백질의 경우, 절단된 단백질의 단편들은 동시적으로 재결합할 가능성이 여전히 있다. 앱타머/단백질 쌍을 선택하기 위한 주요 파라미터는 복합체의 안정도(Kd)이다: 상호작용이 더 강하면 강할수록 마커-단백질 보완의 확률은 더 높아진다. 본 발명자들은 유사한 크기의 단백질(또는 펩티드)가 성분들의 대칭적 기하구조로 인해 활성 보완 복합체의 형성에 유리하다고 추론하고 있다.

시험관내에서 인공 앱타머의 선별은 결합하는 짧은 펩테들에 매우 특이적이며 동종 펩티드에만 결합하는 RNA 구조의 발견을 가능하게 한다. 동시에, 그러한 짧은 펩티드를 포함하는, 더 큰 단백질은 실제로 상이한 앱타머와 교차반응한다(Herman & Patel, 2000). 예를 들어, Rex 단백질이 Rev-반응성 엘리먼트의 일부분에 결합하며 Rev를 기능적으로 대체가능하다는 것이 공지되어 있다(Bogerd et al., 1991; Rimsky et al., 1988); 그러나, 시험관내 선별은 Rev 펩티드와 상호작용하지 않는 항-Rex 특이적 앱타머의 동정을 유도한다(Baskerville et al., 1999). 표적 RNA는 결합 단백질에 관한 구조적 도메인을 포함하도록 디자인될 수 있다. 상기 표적 RNA는 또한 상응하는 플라스미드로부터 발현될 것이다.

표 1은 단백질 보완에서 RNA-태그로 사용될 수 있는 강한 친화력 결합을 지닌 몇몇 앱타머와 펩티드 쌍을 보여준다. 대안적으로, 이에 국한되는 것은 아니지만 하기를 포함하는 목록에서 선택된, 본 발명에 포함될, 유력한 RNA-단백질 파트너의 추가 예가 사용될 수 있다:

(i) MS2 피막 단백질-RNA 스템 루프(Sawata & Taira, 2003; Valegard et al., 1997).

(ii) TAR-Tat BIV-I 스템 루프(Roy et al., 1990; Comolli et al., 1998).

(iii) 전사활성자로서 역할하는 것으로 소개된 G3/C3 스템 루프의 3개의 반복체(Jarrell & Ptashne, 2003).

(iv) 앱타머의 3개 반복체(Yamamoto et al., 2000).

(v) eIF4A - 58개 염기로 재단(trimming)될 수 있는, 87 nt 길이 앱타머(최고 Kd = 27 nM)(Oguro et al., 2003).

실시예 5

앱타머-핵산 결합 단백질 상호작용으로 유도된 단백질 보완.

본 발명의 한 구체예에서, 실시간 단백질-보완 방법은 앱타머-태그의 관심있는 RNA로의 통합에 기초하는데, 상기 RNA는 각각 마커-단백질과 RNA-결합 단백질의 단편을 포함하는 2개의 키메라 단백질로 구성된 단백질 복합체에 의해 인지될 것이다. 본 시스템을 용이하게 사용하기 위해, 앱타머-태그의 통합은 RNA 합성과 행동을 방해하지 아니하여야 한다.

단백질 보완이 관심있는 RNA를 모니터링할 수 있는지를 보기 위하여, 앱타머를 관심있는 유전자에 부가하였다. 앱타머가 진행생물 유전자 발현에 영향을 미치지 아니하였음을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 카로미세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 종 YPH500 내에서 리포터 유전자의 정지 코돈(MATα, ura3-52, lys2-801앰버(amber), ade2-101오커(ochre) trpl-Δ3, his3-Δ200, leu2-Δ1) 바로 다음에 64-nt 올리고머(Oguro et al., 2003)를 도입하였다. 본 발명자들은 리포터 유전자, 예를 들어, EGFP가 인공 Tet-반응성 GALl 프로모터 하에 있는 유도성 시스템을 사용하였다(Blake et al., 2003). 상기 시스템에서, TetR 유전자는 GALlO 프로모터로부터 발현되어 갈락토오스 존재하에 TetR은 EGFP의 억제를 매개한다(도 1A). 상기 억제는 TetR에 직접적으로 결합하는, 유도물질(inducer) 안하이드로테트라사이클린(ATc)의 첨가로 경감될 수 있다(도 1B). 그 후 갈락토오스와 ATc의 존재하에서 EGFP의 발현은 유도성 전사 시스템의 염색체 통합을 포함하는 세포 내에서의 유세포분석(FACS)으로 정량되었다. 본 발명자들은 비변형된 EGFP를 발현하는 세포와 상기 유전자의 3' 말단에 삽입된 앱타머를 발현하는 세포 사이에 형광발광의 차이가 없음을 관찰하였다(도 2). 따라서, 앱타머 서열로 3'-태깅된 유전자는 단백질 레벨에서 유전자 발현에 영향을 주지 아니하는 것으로 보인다. 본 발명자들은 논리적으로 RNA 레벨은 상기 앱타머-태그의 존재에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 도출하였다.

문헌 분석은 앱타머 서열이 RNA 합성을 방해하지 아니하면서 5'- 또는 3 '-비번역 RNA 지역에 통합될 수 있으며(Hanson et al., 2003; Nickens et al., 2003), 한편 특히 통합된 앱타머가 일부 번역 조절자, 예를 들어, 테트라사이클린과 상호작용하게 되면, 상기 앱타머는 번역 효율에 영향을 미칠 수 있다는 것을 제시한다(Hanson et al., 2003). 본 발명자들의 예비연구 결과는 상기 데이터를 보강하며 eIF4A에 대한 앱타머의 3'-비번역 지역으로의 통합이 효모 내에서 마커-단백질 EGFP의 발현에 영향을 미치지 아니한다는 것을 보여준다(이는 EGFP mRNA 레벨 역시 영향을 받지 아니하였다는 것을 제시함).

시스템을 더 유연하게 하기 위해, 통상의 기술자는 5'-비번역 지역이 앱타머 통합을 위해 사용될 수 있는지 여부을 시험함으로써 이러한 실험을 확장할 수 있다. 예를 들어, 마커 단백질로서 EGFP의 사용하면서, 상기 단백질의 발현은 앱타머-태드의 위치에 따라서 생체내에서 측정될 것이다. 뒤이어 형광 세포 분류기(FACS)를 사용하여 총 세포 형광을 측정하고, 직접적으로 RNA 전사 레벨을 평가할, 노던 블랏 분석에 의해 앱타머의 영향이 측정될 것이다. 여전히, 앱타머-태그의 통합을 위한 가장 가능성있는 부위는 3'-비번역 지역이다.

RNA 움직임과 로컬라이제이션에 대한 태그 통합의 영향이 또한 고려된다. mRNA의 3'-UTR은 mRNA 로컬라이제이션을 결정하는 조절 엘리먼트를 포함한다(검토를 위해, 다음 문헌을 참조하라: Hesketh, 2004). 예를 들어, ASHl mRNA의 3' UTR은 초기의 mRNA 운송 및 정착에 충분한 시그널을 엔코딩한다. 그러나, 많은 경우 에 있어서, 메시지의 다른 부분들 내의 서열들이 적절한 RNA 로컬라이제이션을 위해 또한 요구된다(Chartrand et al., 1999, Gonzalez et al., 1999). 예를 들어, 가장 짧은 적절한 앱타머-태그가 메시지의 임의의 부분의 제거없이 사용된다. 그렇게 함으로써, 모든 조절 RNA 서열들이 유지되어 모든 RNA/단백질 상호작용을 보존시키며 결과적으로 RNA의 온전한 로컬라이제이션을 초래한다. RNA 주형 상에서 재조립된 단백질 복합체의 자리잡기(positioning)는 RNA 내부의 앱타머와 상호작용하는 형광 단백질(또는 베타락타메이즈)과 작은 펩티드의 해당 소차원(small dimensions)을 상당히 허용할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 변형된 RNA의 적절한 로컬라이제이션은 해당 mRNA에 특이적인 프로브를 이용한 제자리 혼성화에 의해 대조군 실험에서 직접적으로 확인된다.

실시예 6

각각 형광 마커-단백질과 RNA-결합 단백질의 단편을 포함하는 동일 몰당량의 2개의 키메라 단백질의 동시-발현을 위한 시스템의 개발.

본 발명의 성공적인 실시간 단백질 보완을 위하여, 2개의 폴피펩티드 단백질 단편들이 동등하게 합성되었고(각각의 단편은 RNA-결합 단백질에 컨주게이트된 활성화된 마커-단백질을 포함함), 동일 몰당량(equimolar amounts)으로 생산되었고 재결합을 위해 준비되었다. 단백질 보완에 관한 이전의 연구는 2개의 융합 단백질들이 상기한 복제수를 갖는 플라스미드들로부터 합성되는 경우, GFP의 형광 회복이 검출되지 아니하였음을 보여주었다(Magliery et al., 2005). 따라서, 본 발명자들은 단백질 단편의 합성이 동일 몰당량으로 일어나는 시스템과 RNA 성분의 독립적 합성을 위한 유도 시스템을 개발하였다.

2개의 키메라 단백질들을 동일 몰당량으로 발현시키기 위해, 본 발명자들은 수개의 메시지들의 동시-발현 가능한 발현 벡터를 사용하였다(pETDuet 또는 pACYCDuet 벡터, Novagen). 이러한 플라스미드들은 2개의 T7 프로모터들과 2개의 다중 클로닝 부위를 지니며, 이에 따라 각각의 플라스미드는 2개의 메시지의 발현을 유지할 수 있다. 동시에, 상기 메시지의 동시 발현을 가능케 하는 이러한 플라스미드들 내의 복제 기점은 상이하다. 본 발명자들은, 독립적으로 RNA 발현이 유도될 수 있도록, 2개의 키메라 단백질들을 한 플라스미드 내에 자리잡게 하였고 태그를 지닌 RNA를 다른 플라스미드 내에 자리잡게 하였다. RNA 발현의 독립적인 유도를 위하여 pBAD 플라스미드가 사용될 것이다. 키메라 단백질의 발현 레벨은 항-EGFP 항체(Clontech)를 이용한 웨스턴 블랏 분석에 의해 시험되며, 한편 RNA 합성은 노던 블랏팅에 의해 시험된다.

이러한 실험들은 대장균에서 수행되며 단백질 보완은 FACS 사용하여 총 세포 형광을 측정함으로써 모니터링된다. 대조군으로서, RNA 성분의 부재시에 2개의 키메라 단백질들을 발현하는 세포의 백그라운드는 형광을 나타내지 아니하였으나(도 9A), 반면 형광을 초래한 앱타머 존재하의 상기 단백질들의 발현은(도 9C) 앱타머/RNA-결합 단백질/펩티드 상호작용의 특이성을 입증한다.

실시예 7

분절-폴리펩티드 검출 단백질로서 베타락타메이즈의 용도.

클래스 A 베타락타메이즈는 2개의 독립적인 연구 그룹에 의해 단백질 보완 분석에서 절단 마커-단백질로서 사용되었는데(Wehrman et al., 2002; Galarneau et al., 2002), 상기 클래스의 효소의 몇몇 매력적인 특성에 의해 설명될 수 있다. 첫째, 상기 단백질들은 비교적 작은 단량체 효소이며, 이들의 결정 구조는 잘 알려져 있다(Jelsch et al., 1993). 베타락타메이즈는 박테리아와 진핵 세포 둘 모두에서 발현될 수 있다; 중요하게, 진핵 세포는 내생성 락타메이즈 활성을 갖지 아니한다. 치엥(Tsien) 그룹에 의해 개발된 유용한 세포-투과성 형광 기질의 유용성이 베타락타메이즈를 생체내에서 강력한 도구로서 사용하게 만드는 또 다른 중요한 인자이다(Zlokarnik et al., 1997).

베타락타메이즈가 잔기 196-198에서 절단될 수 있고, 이러한 단편들은 덧붙여진 서로 상호작용하는 단백질들의 존재하에 서로 보완할 수 있다는 것이 상기 언급된 두 연구 그룹에 의해 제시되었다(Wehrman et al., 3 2002; Galarneau et al., 2002). 해당 부위(아미노산 196-198)는 촉매 중심으로부터 반대 부위에 위치해 있고 주기적인(periodic) 2차 구조를 나타내지 아니한다. 블라우(Blau)의 연구그룹은 베타-락타메이즈의 N-말단 단편의 C-말단으로의 Asp-Gly-Arg 트리펩티드의 통합이 효소 활성을 최대 l0,000배 증가시켰음을 제시하였다(Wehrman et al., 2002). 그 결과로, 베타락타메이즈 활성에 기초한 단백질 보완은 약 100배(two of orders)의 시그널 증폭을 가능하게 하고 상기 시그널은 단백질 유도 후 수분 이내에 검출될 수 있다(Wehrman et al., 2002).

효소 활성의 재구성에 기초한 단백질 보완은 민감도의 측면에서 전도유망하다는 것이 강조되어야 한다; 그러나, 시그널의 확산 때문에 공간 분해능(spatial resolution)에서 손실이 있을 수 있다. 따라서, 이러한 형태의 분석은 바람직하게는 공간 분해능이 중요하지 아니한 경우, 예를 들어, 풍부도가 낮은 RNA의 검출이 중요한 경우에 적용되어야 한다.

원핵생물과 진핵생물 세포 내의 생체내 RNA 검출 분석을 위한 검출 단백질로서 α-락타메이즈를 사용하는 방법에서, 베타락타메이즈는 블라우의 연구그룹에서 제시된 바와 같이 활성화된 폴리펩티드 단편들로 절단될 수 있다(Wehrman et al., 2002). 2개의 단편들, 아미노산 잔기 24 내지 197로 구성된 제 1 단편(세포내에서 효소를 유지하기 위한 알파-단편 결여 세포외질(periplasmic) 분비 시그널 시스템)과 잔기 198 내지 240으로 구성된 제 2 단편(베타-단편)이 대장균에서 클로닝된다. 알파- 및 베타-단편들은 제일 먼저 pUC19로부터 PCR 증폭될 것이고, 트리펩티드 NGR은 PCR에 의해 알파-단편의 C-말단에 부가될 것이다. 알파-단편을 코딩하는 PCR 산물은 폴리펩티드 링커를 지니는 eIF4A의 F1 단편의 하류에 클로닝될 것이며, 한편 베타락타메이즈의 베타-단편은 eIF4A의 F2 단편의 하류에 클로닝될 것이다.

원핵생물 발현의 경우, 절단된 락타메이즈-eIF4A 컨주게이션된 키메라 단백질은 pCDF-duet 벡터(Novagen)에 도입되며, 한편 eIF4A 결합 앱타머를 지니는 RNA 표적은 pACYCD 플라스미드로부터 발현될 것이다. 그 결과 획득되는 플라스미드들은 대장균 종 BL21(DE3)(Novagen) 내에서 동시발현될 것이다.

진핵 세포 내에서의 eIF4A 폴리펩티드 단편들에 컨주게이션된 벡타락타메이즈의 발현은 사카로미세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 내에서 행해질 것이다. 효모에서 베타락타메이즈와 eIF4A의 단편들[베타락타메이즈(A)-(Fl) 및 베타락타메이즈(B)-(F2)]을 포함하는 키메라 단백질을 발현시키기 위해 사용된 플라스미들은 이들의 N-말단에 HA 또는 myc 에피토프 태그에 융합된 단백질을 발현시키기 위해 변형된 발현 벡터 pDB20(Becker et al., 1991)의 유도체일 것이다. 상기 벡터는 강한 ADHl 프로모터로부터의 구조 단백질 발현과 웨스턴 블랏에 의한 유전자 분석을 가능하게 할 것이다. 플라스미드 pRS4Dl(Blake et al. 2003)은 유전자의 3' 말단에 위치한 64-nt 길이의 앱타머 태그를 지닌 표적 RNA(EGFP 대신)를 발현시킬 수 있게 변형될 것이다. 상기 플라스미드의 종 YPH500의 게놈내로의 통합은 배양 배지에 갈락토오스와 안하이드로테트라사이클린의 첨가시 태그된 RNA의 조절된 발현을 가능하게 할 것이다(Blake et al. 2003).

베타락타메이즈 활성이 비존재할 때, 409 nm에서 쿠마린의 여기는 FRET를 유도할 것이고 520 mn에서의 방출이 일어날 것이다(녹색 형광). 앱타머와 분열-eIF4A 단편들 간의 상호작용으로 인하여 베타-락타메이즈는 활성을 띠게 될 것이고, 이것은 베타-락탐 고리가 개방되게 할 것이고 플루오레세인이 절단되게 할 것이며, 이 경우에 FRET는 발생하지 아니할 것이며 447 nm에서의 방출이 관찰될 것이다(파란색 형광)(Zlokarnik et al., 1998).

실시예 8

시험관내 및 생체내 급속 단배질 보완에 의한 RNA 분자의 검출.

하기 실시예에서, 본 발명자들은 현재의 검출 레벨을 초과하는 민감도를 갖는 살아 있는 세포 내에서의 RNA 검출을 위한 확고한 방법을 개발하였다. 효소적 단계에 의해 도입되는, 시그널 증폭과 더불어, 활성 검출 단백질의 상당히 빠른 재 구성과 백드라운드의 감소를 가능하게 하는, 활성화된 분열-형광 단편들을 이용한 실시간 급속 동역학 단백질 보완의 조합은(실시예 2 참조) 결국 적당한 풍부도의 핵산을 분석할 수 있는 검출 기술로 귀결된다.

효소 활성 또는 형광 특성을 갖는 단백질은 2개의 부분으로 분절된다(α- 와 β-소단위체로 명명됨). 이러한 부분들은 앱타머-결합 도메인을 갖는 핵산 결합 단백질을 지니는 키메라로서 생체내에서 발현된다. 이상적인 핵산-결합 단백질은 2 부분으로 구성될 것인데, 상기 부분들은 단독으로는 비활성이나 함께하게 되면 활성화된다. 핵산-결합 단백질에 의해 인지될 수 있은 모티프를 포함하는, RNA의 존재하에, 검출 단백질의 활성은 즉각적으로 회복된다. 검출 단백질이 효소인 경우, 시그널은 증폭된다. 단백질이 형광성인 경우, 형광이 표적 RNA의 존재에 완전히 의존적이기 때문에, 시그널 증폭도 없고, 또한 백그라운드도 없다.

본 발명자들은 대장균 BL21(DE)3 세포에서의 단백질 융합체와 앱타머를 포함하는 RNA 전사체의 동시 발현을 위한 컨스트럭트를 제작하였다(도 9). 본 발명자들은 EGFP 단편의 C-말단(잔기 1-158)을 세린과 글리신 잔기들로 구성된 유연한 폴리펩티드 링커를 통해 잔기 1-125를 포함하는 eIF4A 단편의 N-말단에 융합시켰다. 본 발명자들은 상기 융합체를 2개의 T7 프로모터들로부터 2개의 개방해독틀이 발현되도록 디자인된 벡터 pACYCDuet-1(Novagen)의 첫번째 다중클로닝부위(multiple cloning site, MCS)에 클로닝하였다. 유사하게, 본 발명자들은 EGFP 단편의 C-말단(잔기 159-238)을 유연한 폴리펩티드 링커를 통해 아미노산 216-406를 포함하는 eIF4A 단편의 N-말단에 융합시켰다. 상기 융합체를 벡터 pACYCDuet-1의 두번째 MCS에 클로닝하여 2개의 융합 단백질들을 대략 동일몰양으로 발현시킬 수 있는 컨스트럭트를 제조하였다. 벡터, pETDuet-1(Novagen)은 eIF4A-상호작용 앱타머 서열의 복제물 2개를 앞뒤 일렬로 포함하는 360 nt 길이 T7-전사체를 발현시키 위해 사용되었다. 상기 작은 메시지는 33-nt 선도 서열, 뒤어어 앱타머 서열의 2개 복제물, 및 약 200 nt의 뉴클레아제-내성 T7 종결 서열로 구성되어 있다.

전체 보완 복합체와 적절한 대조군을 발현하는 대장균 세포가 단백질과 RNA의 동시 발현을 위한 유도물질, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)의 존재하에 실온에서 배양되었다. 배양물의 광학 밀도가 대략 0.5 (OD600 = 0.5)에 도달되었을 때, 상기 배양물은 형광발광 활성화 세포 분류(FACS)로 분석되었다(도 21). 앱타머를 포함하는 RNA 전사체에 따른 상보적인 융합 단백질의 동시-발현은 평균 형광에서 10-20배의 증가를 초래하였다(도 9C). 그러나, 앱타머를 포함하는 전사체의 부재하에, 상보적인 융합 단백질을 포함하는 대장균 세포는 백그라운드 레벨 이상의 형광을 나타내지 아니하였다(도 9A). 더 중요하게, 본 발명자들은 세포들이 비태그된 전사체에 따라서 보완되는 복합체의 단백질 성분들을 발현할 때, 형광에서의 유의적인 증가를 관찰하지 못하였다(도 12). T7 전사체가 리보좀 결합 부위를 가지거나 가지지 아니할 때 형광 생성도에서의 차이는 없었다. 이것은 메시지의 번역이 이의 검출을 방해하지 아니한다는 것을 시사한다.

실시예 9

생체내 RNA 분자 정량.

온전한 EGFP를 발현하는 세포의 형광은 보완 시스템을 지니는 세포의 형광 보다 약 30-50배 더 높았다(도 9B와 9C). RNA 농도에 의해 이의 농도가 결정되는, 재조립된 EGFP와 비교하여, 전장 길이 EGFP의 양은 훨씬 많기 때문에, 이러한 차이는 놀라운 것은 아니다. 각각의 RNA 분자는 리보좀에 의해 수회 재활용되며, 이는 결국 1을 초과하는 단백질 대 RNA의 몰비를 초래하는 것으로 공지되어 있다.

다음으로 본 발명자들은 세포 당 재조립된 EGFP 분자의 절대 평균 수치를 평가하고 그에 따라 본 발명의 검출 시스템의 효율을 평가하기 위해 EGF 보정 비드(BD Biosciences Clontech)를 이용하였다. 본 발명자들은 약 40의 복제수를 갖는 pET 벡터로부터 RNA를 발현하는 세포가 500-600개의 재조립된 EGFP 분자를 생산하였음을 확인하였는데, 이는 세포 부피가 1.41 x 10^-15 L이면, 1-2 μM RNA에 해당한다(Lee, et al, 2005). 상기 RNA 농도는 50-70개 카피(copies)/세포를 갖는 벡터로부터 대장균에서 획득한 실험 결과와 아주 잘 부합한다(Lee, et al., 2005). 예상 결과와 실험 결과 사이의 일치는 특히 앱타머를 포함하는 모든 RNA 분자들이 재조립된 단백질 복합체에 의해 검출된다는 것을 시사한다. 본 발명자들은 RNA 앱타머를 지니는 플라스미드의 복제수 증가(40-100개 카피/세포)로 상기 추정을 시험하였고 본래의 컨스트럭트와 비교하였을 때 박테리아 세포는 더 강한 형광을 나타냄을 관찰하였다(도 13). 상기 결과는 거의 모든 RNA 분자들이 본 발명에 따른 보완 시스템에 의해 검출된다는 본 발명자들의 결론을 뒷받침한다.

이후 본 발명자들은 재조립된 EGFP를 지니는 세포의 형광 스펙트럼과 전장 길이 단백질을 발현하는 세포의 형광 스펙트럼을 비교하였다. 이러한 실험에서, 본 발명자들은 재조립된 복합체의 최대 여기는 470 nm(대비: 천연 EGFP의 경우 490 nm)에서 일어나며, 최대 방출은 약 520 nm(대비: 천연 EGFP의 경우 508 nm)에서 일어난다는 것을 확인하였다(도 14). 이러한 차이는 천연 EGFP와 재조립된 EGFP-RNA 복합체 간의 단백질 구조에서의 가능한 변화로 설명될 수 있다. 상기 결과는 또한 세포 내의 형광 시그널이 뉴클레오단백질 복합체의 형성에 기인하다는 개념을 뒷받침하는데, 이는 본 발명자들의 시험관내 실험에서 본 발명자들이 또한 덧붙여진 이중나선 올리고뉴클레오티드에 의한 재조립된 절단된 EGFP의 유사한 적색편이(red-shifted) 방출 스펙트럼(최대 524 nm)을 발견하였기 때문이다(Demidov et al., 2006).

실시예 10

박테리아 세포 내에서의 형광의 공간적 변동과 시간적 변동.

RNA 표지 시스템을 발현하는 세포를 관찰하는데 형광현미경(Epifluorescence microscope)과 B&W 카메라를 사용하였다(도 9C와 11). 병행하여, 미분간섭효과(differential interfere contrast) 이미지가 세포 수 및 형태를 분석하기 위해 기록되었다. 복합체 형성과 형광 발생을 위한 충분한 시간이 보장되도록 하기 위해, 세포는 실온에서 밤새 배양되었다. 따라서, 세포들의 대다수는 분열이 거의 일어나지 않거나 전혀 일어나지 않는 정체기에 존재하였다. 일부 경우에, 본 발명자들은 세포 분열을 관찰하였으나, 모든 경우에서, 새롭게 분열된 세포들은 형광을 나타내지 아니하였다(도 15).

단백질 융합체와 앱타머를 포함하는 RNA 전사체의 동시-발현은 세포의 한쪽 또는 양쪽 극에 위치하는 밝은 형광을 지닌 형광 세포를 초래하였다(도 10). 대조적으로, 전장 길이 EGFP의 발현은 세포 전체적으로 독특한 형광 분포를 지니는 강하게 형광을 나타내는 세포를 생산하였다(도 9b). 동시에, 앱타머 발현의 부재시에 단백질 융합체의 발현은 유의한 형광 발달을 유도하지 아니하였는데(도 9a), 이는 본 발명자들의 이전의 유세포 분석 결과를 확증시킨다.

간헐 촬영 현미경은 형광 입자들의 몇몇 놀랄만한 특성뿐만 아니라 세포의 총 형광에서의 변화를 드러내었다. 도 10은 한 대표적인 실험에서 30분 간격으로 촬영된 일련의 이미지를 보여준다. 동일 필드 내의 세포들은 상이한 위상의 동조된 변동을 보여주었다(도 11C). 각각의 세포에서 총 형광은 처음 2시간 동안 점차적으로 감소되었으나, 나중에 다시 증가되었다. 동시에, 총 세포 형광에서의 감소는 세폭 극에서의 고-형광 입자들의 출현을 초래하였다. 흥미롭게도, 본 실험이 과정 동안 몇몇 세포들은 형광을 띠게 되었다(도 11B, 180분 및 그 이후). 이러한 변화의 동역학은 실험시마다 달랐으나, 시간에 따른 형광의 전반적인 증가와 감소의 패턴은 항상 동일하였다.

세포 형광에서의 변화가 실제로 RNA 역학을 드러내는지를 확인하기 위해, 본 발명자들은 세포 배양물로부터 총 RNA를 추출하였고 MALDI-TOF MS 검출과 커플링된 실 경쟁 PCR(real competitive PCR, rcPCR)을 사용하여 앱타머와 mreB RNA(표준화를 위하여 사용된 하우스키핑 유전자)의 절대 농도를 측정하였다. 실 경쟁 PCR은 증폭 이전에 관심잇는 유전자를 유한 내부 기준으로 역할할 수 있는 연속적으로 희석된 DNA 경쟁자를 활용한다. 경쟁자와 관심있는 유전자 사이의 단 한개의 염기 차이가 MALDI-TOF MS를 이용한 1 또는 2nt 염기 신장 반응에 이용되어 신장 산물의 풍부도를 정량할 수 있게 한다.

앱타머 mRNA 레벨의 분석은 통계적으로 유의한 진동을 나타내나, 반편 대조군 유전자인, mreB는 일정하게 유지된다(표 2). 데이터는 1시 지점(mark)에서 앱타머 전사체가 피크에 도달하며 이후 즉시 감소하여 120 내지 150분에 0시 기준선으로 회귀됨을 보여준다. 이것은 170분에서의 또 다른 전사체 피크와 최종적으로 급속한 감소 및 그 후 최초 0시 앱타머 mRNA 수준으로의 회복이 뒤따른다.

농도 값은 각각의 세포 배양 플레이트로부터 추출된 RNA 샘플에 관한 것이다. 폴드 값은 하우스키핑 대조 유전자 mreB에 관해 조정되었으며 0시 기준값과 대비하여 계산되었다. 부트스트랩 P 값은 유전자가 기준값과 상이하게 발현된다는 신뢰도 측정값이다. 분석된 모든 샘플들은 잔차(residual) 값과 적합결여(lack-of-fit) 값에 관하여 < 0.05이다; 양질의 분석에 관한 지표.

실시예 9와 본 실시예에서 사용된 기술들의 응용은 RNA 로컬라이제이션과 움 직임을 검출하는데 사용될 수 있다. 이러한 새로운 기술의 그러한 응용의 한 예에서, 통사의 기술자는 ASHl mRNA를 연구할 수 있다. 상기 RNA는 HO 엔도뉴클레아제의 전사를 억제하며 딸 세포에서의 교배형(mating-type) 상호전환을 차단하는 세포-운명 결정인자(cell-fate determinant)를 코딩한다. 출아된 효모 세포의 출아(bud tip)에 대한 상기 결정인자의 로컬라이제이션은 상이한 방법에 의해 제시되었다. ASHl mRNA는 잘 연구되어 있다; 그리하여 이것은 살아있는 세포 내에서의 RNA 로컬라이제이션과 움직임에 대한 분성의 민감도 및 특이적을 입증하기 위한 실험 모델으로서 사용될 수 있다.

실시예 11

2성분 앱타머-펩티드 상호작용을 이용한 생체내 RNA의 검출.

실험 9와 10에서, 본 발명자들은 생체내에서 RNA의 모니터링을 제시하였는데, 상기 모니터링은 형광 단백질의 보완과 RNA-결합 단백질과 RNA-앱타머의 고 친화력 상호작용의 조합을 이용한다. 이러한 실험들에서, RNA-결합 단백질은 덤벨형 구조로 이루어진 진핵생물 개시 인자 4A(eIF4A)이다. eIF4A은 2개의 단편들로 절단되며, 각각의 단편은 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP)의 절단된 단편에 융합된다. 2개의 보완하는 단백질 융합체와 전사체를 함유하는 eIF4A-특이적 앱타머의 동시-발현은 박테리아에서의 EGFP 형광의 회복을 초래하였다. 이러한 접근법의 주요한 이점은 형광 시그널이 표적 RNA에 의해서만 결정된다는 점인데, 달리 말해서, RNA의 부재시에는 시그널이 검출될 수 없다. 추가적으로 비교적 작은 단백질 복합체가 표적 RNA에 조립되는데, 상기 복합체는 RNA 기능과 로컬라이제이션을 방해하지 아니하여야 한다.

실험 11에서, 본 발명자들은 RNA 시각화를 위한 대안적인 구체예의 개발에 관한 데이터를 제공하는데, 여기서 앱타머-결합 모이어티는 2개의 짧은 펩티드이다. 이 접근법에서, 2개의 상이한 RNA 앱타머가 관심있는 RNA에 태그로서 부착되며 절단된 EGFP의 2개의 단편들에 융합된 2개의 짧은 바이러스 펩티드들에 의해 인지된다(도 16). 이러한 변형에는 몇가지 이유가 있다. 첫째, 표적 RNA에 조립되는 단백질 복합체는 조립된 eIF4A를 포함하는 복합체와 비교할 때 상당히 더 작다. 일반적으로, 검출 도구가 작으면 작을수록, 기능에 대한 방해의 가능성이 더 낮아진다. 둘째, eIF4A는 진핵 세포 내의 번역 기구의 한 성분이며 이것은 또한 박테리아 단백질들 중에 근접한 상동체를 갖는다. 따라서, 이의 과도-발현이 정상적인 세포 기능을 방해할 수 있는 약간의 가능성이 있다. 동시에, 짧은 바이러스 펩티드는 박테리아 또는 진핵 세포 내에 상동 단백질을 갖지 못하고 그에 따라 세포내에서 이들의 발현은 세포 기능을 중화시킬 수 있는 가능성이 더 높다. 마지막으로, RNA를 인지하는 복합체의 대안적인 디자인은 새로운 접근법에 대한 더 많은 유연성을 부여하며 이의 범용성을 제시한다.

생체내 RNA 검출을 위한 보완 복합체의 디자인은 2성분 앱타머-펩티드 상호작용에 기초하였다. 본 발명자들의 설계에 따라, 살아 있는 세포 내에서 RNA를 검출하기 위해, RNA는 2개의 펩티드들과 상호작용할 수 있는 2개의 앱타머 서열들로 공급되어야 한다. 각각의 펩티드들은 절단된 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP)의 2개의 단편들 중 어느 하나와의 융합체로서 세포 내에서 발현되어야 한다(도16). 이와 같은 시스템이 작동하도록 만들기 위해, 하기 몇가지 문제들이 고려되었다: 첫째, 선택된 각각의 상호작용 펩티드/앱타머 쌍의 친화력은 높아야 하며 두 쌍에 대해 거의 동등한 친화력으로 결합하여야 한다. 둘째, 앱타머/펩티드 2쌍들 간에 교차-반응이 없어야 하는데, 달리 말해서 각 상호작용의 특이성이 충분하게 높아야 한다. 셋째, 펩티들 간에 상호작용이 없어야 하는데, 그렇지 아니하면 마커-단백질의 단편들을 회합시킬 수 있고 그에 따라 비특이적인 백그라운드가 증가될 수 있다. 다음으로, 펩티드들의 길이는 보완 복합체의 대칭적인 조립을 가능하게 하기 위해 거의 동등하여야 한다. 마지막으로, 2개의 앱타머들의 위치(placing)는 상기 앱타머들 각각과 대응하는 펩티드의 독립적인 상호작용을 가능하게 하여야 한다. 이것은 앱타머 사이에 위치한 유연한 링커를 사용하여 달성될 수 있다.

아르기닌-풍부 모티프(arginine-rich motifs, ARM)를 지니는 펩티드들은 수많은 RNA-결합 단백질들과 상응하는 RNA 표적들의 상호작용의 높은 친화력과 높은 특이성을 측정하는 단편들이다(22). 이러한 펩티드들의 공통적인 특징은 다른 유사성의 부재하에 우세한 아르기닌이다. ARM-펩티드들과 상응하는 RNA들의 상호작용에 관한 메카니즘을 이해하는 것을 목표로 삼은 최근의 연구들은 아르기닌 위치의 특이 패턴과 펩티드 골격의 유연성이 상응하는 RNA 리간드의 특이적인 결합에 관여한다는 결론을 내렸다(23). 그러나, 더 미약한 친화력에도 불구하고, 많은 ARM-펩티드들이 "카멜레온과 같은(chameleon-like)" 행동을 나타내며 다수의 RNA 표적에 결합한다(24). 이를 마음에 두고서, 본 발명자들은 ARM 바이러스 펩티드들로부터 RNA-결합 펩티드들을 선택하였으나(25-27), 단백질 보완에 상기 펩티드들을 적용하기 전에 상응하는 RNA들과의 이들의 교차-반응성을 시험하였다.

앱타머-펩티드 쌍을 선택하기 위한 시험관내 실험. 가용한 데이터에 근거하여, 본 발명자들은 세쌍의 펩티드/앱타머를 선택하였다: (i) HIV Rex; (ii) 박테리오파지 λN; 및 (iii) HTLV-I Rev(표 1을 참조). 그리고 시험관내에서 동종 파트너와의 이들의 결합 친화력과 다른 2개의 RNA 앱타머와의 교차-반응성을 시험하였다. 본 발명자들은 고정된 RNA 앱타머의 농도가 ARM-펩티드 농도의 증가와 함께 복합체 형성을 가능하게 하는 조건하에서 비방사능 겔-이동 분석을 이용하였다. 본 발명자들은 결합하지 않은 RNA 앱타머의 양과 이동한 복합체의 양을 정량하였다(표 1). 결과는 λN 펩티드와 HIV-I Rex 펩티드가 높은 특이성을 나타내었으며 비정합(non-mathched) RNA 앱타머와 교차반응하지 아니하였음을 보여주었다. 동시에, HTLV-I Rev 펩티드는 2개의 비정합 RNA 앱타머와의 약간의 교차-반응성을 나타내었다. 이러한 결과에 기초하여, 본 발명자들은 HTLV-I의 λN과 Rex 펩티드와 이들의 상응하는 앱타머들이 본 발명자들의 단백질 보완 복합체로 사용하기 위한 최적의 쌍을 제공한다는 결론을 내렸다(표 3을 참조하라).

2성분 펩티드/앱타머 상호작용을 사용한 살아 있는 박테리아 세포 내의 RNA 전사체 검출. 단백질 융합체와 앱타머를 포함하는 RNA 전사체를 클로닝하였으며 대장균 BL21(DE)3 세포 내에서 발현시켰다(도 17). EGFP 단편의 C-말단(잔기 1-158)을 세린과 글리신 잔기로 구성된 유연한 링커를 통해 Rex 펩티드의 N-말단(16 aa)에 융합시켰다. 유사하게, 두번째 EGFP 단편의 N-말단(잔기 159-238)을 또한 폴리펩티드 링커를 통해 λN 펩티드의 C-말단(22 aa)에 융합시켰다. 중간에 단백질 융합체와 T7 프로모터 지역 둘 모두를 코딩하는 전체 DNA 삽입체를 다단계 PCR로 합성하였으며 벡터 pACYCDuet-1의 NcoI와 AvrII 부위 사이에 클로닝하여 2개의 융합 단백질을 동시-발현할 수 있는 컨스트럭트를 제작하였다. 5 또는 10개 dT 잔기들에 의해 연결된 2개의 앱타머 서열을 포함하는 230 nt-길이 T7-전사체의 발현을 위해 벡터, pETDuet-1(Novagen)를 사용하였다. 상기 메시지는 선도 서열, 뒤이어 2개의 앱타머 서열, 및 약 200 nt 길이의 뉴클레아제-내성 T7 종결 서열로 구성된다.

보완 복합체 전체와 적절한 대조군을 발현하는 대장균 세포를 단백질과 RNA의 동시-발현을 위한 유도물질, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)의 존재하에 실온에서 밤새 성장시켰다. 배양물의 광학 밀도가 대략 0.5(OD₆₀₀ = 0.5)에 도달되었을 때, 형광 활성 세포 분류기(FACS)로 상기 배양물을 분석하였다(도 17). 보완 복합체 전체를 발현하는 대장균 세포의 형광을 2개의 단백질 융합체만을 발현하는 세포의 형광과 2개의 단백질 융합체와 더불어 부정확한 조합의 2개의 앱타 머(10개의 dT 뉴클레오티드로 연결된 2개의 동일한 Rex 펩티드-결합 앱타머)를 발현하는 세포의 형광과 비교하였다.

그 결과 1 mM IPTG에 의한 유도는 RNA 발현의 부재하에 높은 세포 형광을 초래하였고(도 17A), 또한 정확한 앱타머 서열과 부정확한 앱타머 서열을 발현하는 세포의 형광 분포에서 차이는 존재하지 아니하였따(도 17A). 본 발명자들은 1 mM IPTG로 유도된 T7 프로모터는, 심지어 RNA 표적의 부재시에도 재조립되는, 단백질 융합체를 매우 높은 농도로 발현시킨다고 생각하였다. 이러한 생각이 옳다면, IPTG 농도 감소는 백그라운드의 감소를 초래할 것이다. 실제로, 10배 감소된 농도의 IPTG는 단백질 융합체만을 발현하는 세포와 2개의 정확한 RNA 앱타머를 지닌 단백질을 발현하는 세포에 대한 형광 분포의 분리를 초래하였다. 그러나, 여전히 특이성은 정확한 앱타머 서열과 부정확한 앱타머 서열을 분별할 수 있을 정도로 충분히 높지 아니하였. 마지막으로, 0.01 mM로 감소된 농도의 IPTG는 정확한 앱타머 서열과 부정확한 앱타머 서열을 지닌 세포에 대한 형광 분포의 분리를 가능하게 하였다. 상기 최적화된 조건하에서, 보완 복합체 전체를 발현하는 세포의 평균 형광은 백그라운드 형광(RNA 성분 없음)의 10-15배 초과하였으며, 정확한 앱타머 서열을 지니는 세포는 부정확한 앱타머 서열을 지니는 세포보다 4-5배 더 높은 형광을 나타내었다.

형광 변화의 역학. 최적화된 조건에서 보완 복합체 전체를 발현하는 박테리아 세포를 형광 현미경을 사용하여 분석하였다. 싱이한 유형의 형광 분포가 관찰되었다(도 18). 대부분의 세포에서, 형광은 극에서 가장 높았는데, 이는 eIF4A-앱 타머 상호작용에 의해 단백질 보완이 촉발된 실험에서 획득된 결과와 유사하였다. 몇몇 세포들(약 10%)은 골딩(Golding)과 코스(Cox)에 의해 보고된 결과와 유사한 세포의 중간에 자리잡은 형광 입자를 지녔다(18).

간헐 촬영 이미지화는 형광에 있어서 시간적 및 공간적 변화를 나타내었는데, 이는 또한 eIF4A-기반 보완 시스템에서 얻은 결과와 유사하였다. 도 18은 한 대표적인 실험에서 30분 간격으로 4시간 동안 촬영한 일련의 이미지를 보여준다. 세포 형광은 진동하는 변화를 나타내었으며 진동은 상이한 세포들에서 동일한 속도로 진행되었다(도 19B).

2성분 앱타머-펩티드 상호작용과 단백질 보완 시스템으로 획득한 결과는 상응하는 앱타머와 절단된 개시 인자 4A(eIF4A)의 상호작용을 이용한 시스템으로 획득한 결과와 몇몇 측면에서 매우 유사하다. 첫째, 거의 대다수의 세포의 극에 자리하는 형광 입자들은 두 방법의 특색이다. 둘째, 시간과 세포내 공간에서의 형광 변화의 역학은 또한 eIF4A-기반 시스템의 역학과 유사하다. 마지막으로, 두 시스템에서 세포들 사이의 형광 변화에 있어서 동조화(synchronization)를 볼 수 있다. 이러한 결과들은 단백질 보완 복합체로 사용된 RNA-단백질 결합 단백질 또는 펩티드의 특성은 시스템을 작동시키는데 중요하지 않으며 다른 분열된 단백질 또는 길이가 짧은 펩티드가 유사한 응용에서 사용될 수 있다는 것을 의미한다. 살아있는 세포에서의 RNA 시각화를 위한 MS2 피막 단백질-기반 시스템을 사용하여 획득한 공개된 결과들이 또한 상기 결론을 뒷받침한다(18, 20).

동시에, 2개의 보완 디자인의 비교가 형광 시그널의 강도와 시그널/백그라운 드 비에 있어서 차이를 나타내었다는데 주목하는 것은 흥미롭다. 본 발명자들이 완전하게 이해하지 못한, 여러 이유로 인하여, 분열된 EGFP에 융합된 길이가 짧은 펩티드를 발현하는 세포의 형광은 EGFP와 융합된 eIF4A의 단편을 발현하는 세포의 형광 보다 훨씬 더 높았다. 본 발명자들은 ARM-펩티드는 이들의 양전하와 음으로 하전된 단백질 및 DNA와 상호작용할 수 있는 이들의 능력으로 인해 중성 eIF4A 단편보다 제 3의 분자를 통해 더 쉽게 결합한다고 추정하고 있다. 이는 결국 EGFP 재조립과 더 높은 백그라운드를 초래한다. 백그라운드를 감소시키려는 시도에서, 본 발명자들은 IPTG의 농도를 감소시켰고 시그널/백그라운드 비가 10-20배 미만인 조건을 발견해내었는데, 이는 eIF4A 시스템의 경우에서와 동일한 범위이다. 더욱이, 올바른 앱타머 서열과 잘못된 앱타머 서열 간의 분별이 또한 상기 조건하에서 달성되었다.

실험재료 및 실험방법.

컨스트럭트 및 종.

pMB33와 pMB38는 pACYCDuet-1(Novagen)의 유도체들인데, 상호작용하는 단백질 단편과 EGFP의 ORF가, 각각, 클로닝된다. 플라스미드 pGEX-4AI(크리스 프라우드(Chris Proud)박사가 감사하게도 기증하였음)로부터의 생쥐 eIF4A 단백질의 PCR-증폭으로 eIF4A 단편 1(Fl: 1-215 aa)의 pACYCDuet-1(pMB09)로의 클로닝; 및 2(F2: 216-406 aa)의 pETDuet-1(Novagen)(pMB11)으로의 클로닝을 수행하였다. 유사하게, EGFP 단편, 알파(A: 1-158 aa) 및 베타(B: 159-238 aa)를 pEGFP(Clonetech)으로부터 PCR-증폭시켰고, 각각, pACYCDuet-1(pMB08)와 pETDuet-1(pMBlO)에 클로닝하였 다. EGFP 단편 A의 C-말단부가 10-aa 유연한 폴리펩티드 링커(Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser)를 통해 eIF4A 단편 Fl의 N-말단에 융합된 키메라 유전자(pMB12)를 바슬 등의 문헌(Vasl et al., 2004)에 따라 생산하였다(상세한 사항은 보충 방법을 참조하라). B-F2 융합체(pMB13)를 제작하기 위해 유사한 프로토콜을 사용하였다. B-F2의 pMB12(pACYCDuet-1(pMB33)의 유도체)로의 클로닝을 이전에 기재한 바와 같이 수행하였다(Geiser et al, 2001). eIF4A-상호작용 앱타머 서열(58 nt-길이)을 포함하는 T7-전사체를 발현하는 pMB23는 pETDuet-1(Novagen)의 유도체이었다. pMB42는 eIF4A-상호작용 앱타머에 관한 서열도 발현시키는 pRSFDuet(Novagen)의 유도체이었다(더 상세한 사항에 관해서는 보충 방법을 참조하라). 클로닝을 위해 대장균 종 XLlO-GoId(Tet^r Δ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endAl supE44 thi-1 recAl gyrA96 relAl lacHte[F' proAB lacIqZΔ15 TnIO(Tet^r) Amy Camr])과 XLlO-GoId Kanr(Tet^r Δ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endAl supE44 thi-1 recAl gyrA96 relAl lacHte[F' proAB lacIqZΔM15 TnIO(Tet^r) Tn5(Kan^r) Amy)(Stratagene)을 사용하였다. 융합 단백질과 표적 RNA의 발현을 위해 BL21(DE)3(대장균 B F^- dcm ompT hsdS(r_B ^- m_B ^-) gal λ(DE3))(Stratagene)을 사용하였다.

EGFP와 eIF4A의 단편을 포함하는 단백질 융합체의 제조는 바시 등의 문헌(Vasi et al, 2004)에 기재된 방법에 따랐다. 2세트의 5'-인산화된 올리고뉴클 레오티드를 디자인하였으며 인테그레이티드 DNA 테크놀로지(Integrated DNA Technology, Coraliville, IA)로 부터 구입하였다: 1. 5'-pCGAAGATCCAGAGGATCCCTGCTTGTCGGCCATGATATAG-3'(서열번호 9) 2. 5'-pGGTTCTGGTAGCATGGAGCCGGAAGGCGTCATCGA-3'(서열번호 10), 3. 5'-pCGAAGA TCCAGAGGATCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3'(서열번호 11) 4. 5'-pGGTTCTGGTAGCATTCGGATTCTTGTCAAGAAGGA-3'(서열번호 12). 상기 올리고뉴클레오티드 내의 밑줄 그어진 부분은 A 단편의 3' 말단(서열번호 9); Fl 서열의 개시부(start)(서열번호 10); 단편 B의 3' 말단(서열번호 11); 및 F2 단편의 개시부(beginning)(서열번호 12)에 해당한다. 상기 올리고뉴클레오티드 서열의 나머지 부분은 펩티드 링커 GSSGSS(서열번호 9 및 11)와 GSGS(서열번호 10 및 12)에 관한 코딩 서열에 해당한다. 플라스미드 pMBO8(EGFP의 단편 A를 운반함)과 pMBO9(eIF4A의 단편 Fl을 운반함)을 XhoI 및 EcoNI 제한효소로 절단하였으며; 상기 제한효소 부위는 올리고뉴클레오티드가 어닐링되는 부위에 대하여 5'에 위치하였다. 하기 프로그램에 따라 익스팬드 롱 템플레이트 포 시스템(Expand Long Template FOR system, Roche Diagnostics)를 사용하여 선형화된 플라스미드와 올리고뉴클레오티드와 함께 PCR을 수행하였다: 94℃에서 30분; 94℃에서 30초간, 61℃에서 30초간, 및 72℃에서 10분간 30주기, 72℃에서 최종 11분간의 신장 단계로 종결. 그 후에 PCR 혼합물에 효소 DpnI를 처리하여 메틸화된 주형 DNA를 제거하였다. 대략 5~5 kbp의 PCR 산물을 겔 여과하고 T4 DNA 리가아제(New England Biolabs) 1U를 사용하여 라이게이션시켰다. 라이게이션된 산물로 XL-10 컴피턴트 세포(competent cell)(Stratagene)를 형질변환시켰다. A-Fl(pMB12)을 운반하는 새로운 키메라 플라스미드를 동정하고 시퀀싱으로 확인하였다. 올리고뉴클레오티드 #3와 #4를 사용하는 유사한 프로토콜을 준수하여 벡터 pETDuet-1(pMB13) 내의 키메라 B-F2 유전자를 제조하였다.

2개의 키메라 단백질의 2개의 ACYCDuet-1 MOS로의 클로닝. 2개의 키메라 유전자 발현을 비슷한 수준으로 유지하기 위하여, 기재된 프로토콜에 따라(Geiser et al, 2001), 다음으로 B-F2 단편을 이미 A-F11을 운반하는 pMB12의 두번째 MCS에 통합시켰다. 간단히 요약하면, B-F2을 플랭킹된 5' 및 3' 벡터 서열을 지니는 플라스미드 pMBI3로부터 PCR-증폭시켰다. 상기 플랭킹된 서열은 pMB12 내의 삽입지점으로부터 바로 상류 및 하류 20bp의 DNA에 해당한다. PCR 반응을 수령체 벡터 및 플랭킹 상동서열(homology)를 통해 비절단된 벡터와 어닐링될 B-F2 단편과 함께 실행하였다. PCR 프로그램은 95℃에서 30분간의 변성 단계, 뒤이어 Pfu 터보 DNA 중합효소를 사용하여 95℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 68℃에서 8-10분 간의 18주기로 이루어진다. 증폭 산물에 3시간 동안 효소 효소 DpnI을 처리하여 메틸화된 본래 주형을 제거하였다. XL-IO 컴피턴트 세포를 정제된 산물의 분취액으로 형질변형시켰다. 두 단백질 단편(A-Fl + B-F2)을 운반하는 플라스미드들을 동정하고 시퀀싱으로 확인하였다(pMB33). 컨스트럭트 A-Fl + B-F2를 또한 음성 대조군으로써 제조하였다(pMB54). 마지막으로, 전장 길이 EGFP를 벡터 pACYC에 클로닝하여 EGFP 발현에 관한 양성 대조군(pMB38)으로 삼았다.

2성분 앱타머-펩티드 키메라의 클로닝. EGFP를 아미노산 잔기 158과 159 사 이에서 2개의 비형광 단편(각각, α-EGFP와 β-EGFP로 명명됨)으로 절단하였다. HTLV-I Rex 펩티드를 10-aa 유연한 폴리펩티드 링커(Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser)를 거쳐 α-EGFP의 C-말단에 융합시켰으며; 박테리오파지 λN 펩티드를 동일한 10-aa 링커를 거쳐 β-EGFP의 N-말단에 융합시켰다(도 18). 다단계 PCR을 수행하여 융합 단백질 중간에 T7 프로모터가 더해진 2개의 융합 단백질을 엔코딩하는 DNA 단편을 제작하였다. DNA 컨스트럭트를 pACYCDuet-1 벡터(Novagen) 내의 제한효소 부위 NcoI과 AvrII 사이에 삽입시켰는데, 상기 제한효소 부위들은 첫번째 T7 프로모터 뒤 및 T7 종결자 지역 앞에 위치한다(도 17). 따라서, 두 융합체가 동일 몰당량으로 발현되는 것을 보장하기 위하여 2개의 단백질 키메라를 한 pACYCDuet-1 플라스미드에서 발현시켰다. 클로닝을 위해 대장균 종 XLlO-GoId Kan^r(Tet^r Δ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endAl supE44 thi-1 recAl gyrA96 relAl lac Hte[F' proAB ladIqZΔM15 Tn1O(Tet^r) Tn5 (Kan^r) Amy)(Stratagene)를 사용하였다. 모든 컨스트럭트들을 시퀀싱으로 확인하였다.

앱타머 클로닝. 2개의 RNA 앱타머를 엔코딩하는, DNA 서열을 디자인하였는데, 한 앱타머는 λN 펩티드에 결합하고 나머지 한 앱타머는 HTLV-I Rex 펩티드에 결합한다. 앱타머들은 10개의 티민으로 분리되어지며 말단부에 XbaI과 AvrII의 제한효소 부위가 부가되었다. 상응하는 DNA 주형을 맞춤 합성하고, PCR로 증폭시켰으며, T7 프로모터 조절하의 pETDuet-1 벡터(Novagen) 내의 XbaI과 AvrII 제한효소 부위 사이에 삽입시켰다. pETDuet-1과 pACYCDuet-1 벡터는 동시-발현시에 양립가 능하다. 음성 대조군으로서, 2개의 동일한 RNA 앱타머 서열을 엔코딩하는 DNA 서열을 유사하게 합성하였다. 이의 클로닝을 위해 대장균 종 XLlO-Gold를 사용하였다. 모든 컨스트럭트들을 시퀀싱으로 확인하였다.

성장 조건 및 유도. BL21(DE)3 세포들을 pMB33(키메라 단백질을 발현함)과 pMB23(표적 RNA를 발현함)로 동시-형질전환시켰다. EGFP 보완 복합체의 단백질과 RNA 성분을 엔코딩하는 2개의 플라스미드들을 대장균 BL21(DE) 3(B F^- dcm ompT hsdS(r_B ^- m_B ^-) gal λ(DE3))(Stratagene) 내에서 동시발현시켰다. 음성 대조군으로써, 2개의 동일한 앱타머를 포함하는 플라스미드로 세포를 형질전환시켰다. 또 다른 음성 대조군으로써, 앱타머 삽입물을 포함하지 아니하는 pETDuet-1 플라스미드로 세포를 형질전환시켰다. 형질전환된 세포의 단일 콜로니를 제일 처음 37℃에서 3-4시간 동안 항생제가 보충된 LB 배지에서 배양하였다. 37℃에서의 인큐베이션 후, 유도물질 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG; 1 mM, 또는 2성분 앱타머-펩티드 상호작용을 위한 0.01 mM)를 포함하는 신선한 배지로 배양물을 300배 희석시키고, 실온에서 밤새 배양하였다. 배양물의 광학 밀도는, 실험 당시, 0.4 내지 0.6(OD₆₀₀ = 0.4 내지 0.6) 사이였다. 단백질을 BL21(DE3)pLys 컴피턴트 세포(Stratagene, CA) 내에서 발현시켰다. 0.35 mM IPTG로 유도를 수행하였으며 세포가 37℃에서 4시간 동안 성장되도록 하였다. 세포를 수확하였으며, 세척하였고, 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 25% 수크로오스, 1 mM EDTA, 10 mM DTT 및 0.1% 소디움 아지드를 포함하는 완충액 중에서 초음파처리(sonication)(3회, 각각 30초)로 분해하였다. 봉입체(Inclusion bodies)를 상기한 동일 완충액으로 1회 및 50 mM Tris-HCl(pH 8.5), 100 mM NaCl, 0.5% 트리톤XlOO, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.1% 소디움 아지드를 포함하는 완충액으로 3회 세척하였으며 그 후 8 M 우레아, 25 mM MES(pH 8.5), 10 mM EDTA 및 0.1 mM DTT를 포함하는 완충액 중에 용해시켰다. 단백질을 적가 희석(droplet dilution)에 의해 우레아를 포함하지 않는 상기 동일 완충액 중에서 리폴딩시키고 완충액(50 mM 트리스-HCl(pH 8.5), 0.15 M NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% 트리톤 X-100, 1 mM PMSF)으로 평형화된 키틴 친화력 크로마토그래피 레진(New England Biolabs, MA)에 적용하였다. 컬럼을 상기 동일 완충액으로 충분히 세척하였다. 그 후 컬럼을 50 mM 트리스-HCl(pH 7.0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 트리톤 X-100 0.1%, 1 mM PMSF를 포함하는 완충액 중에서 평형화시키고 인테인 절단이 일어나도록 하기 위해 40℃에서 24-48시간 동안 두었다. 용리물을 수집하고 단백질 농도 및 순도를 SDS-PAGE 및 쿠마시 플러스 단백질 염색(Coomasie Plus Protein staining)(Pierce, IL)으로 분석하였다(도 15와 16 참조). 다음 한가지 경우를 제외하고 동일한 방법으로 모든 단백질을 정제하였다: 키틴 크로마토그래피 단계에서의 EGFP 알파-소단위체의 동정의 경우, 트리스-HCl 완충액을 PBS 완충액으로 대체하였다.

몇몇 실시예(실시예 1과 2)에서, 단백질을 우레아를 포함하지 않는 상기 동일 완충액 중에서 적가 희석으로 재폴딩시키고 완충액(50 mM 트리스-HCl(pH 8.5), 0.15 M NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% 트리톤 X-100, 1 mM PMSF)으로 평형화된 키틴 친화 력 크로마토그래피 레진(New England Biolabs, MA)에 적용하였다. 컬럼을 상기 동일 완충액으로 충분히 세척하였다. 그 후 컬럼을 50 mM 트리스-HCl(pH 7.0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 트리톤 X-100 0.1%, 1 mM PMSF를 포함하는 완충액 중에서 평형화시키고 인테인 절단이 일어나도록 하기 위해 40℃에서 24-48시간 동안 두었다. 용리물을 수집하고 단백질 농도 및 순도를 SDS-PAGE 및 쿠마시 플러스 단백질 염색(Coomasie Plus Protein staining)(Pierce, IL)으로 분석하였다(도 15와 16 참조). 다음 한가지 경우를 제외하고 동일한 방법으로 모든 단백질을 정제하였다: 키틴 크로마토그래피 단계에서의 EGFP 알파-소단위체의 동정의 경우, 트리스-HCl 완충액을 PBS 완충액으로 대체하였다. 이러한 실시예들에서, 5' 및 3' 말단에 SH기를 지니는 2개의 20-nt 길이의 상보적인 올리고뉴클레오티드들을 IDT DNA 테크놀로지즈로부터 구매하였다. 10 mM DTT를 포함하는 완충액과 함께 인큐베이션함으로써 상기 올리고뉴클레오티드들은 이들의 캡이 탈보호되었고, G25 컬럼을 통한 겔 여과에 의해 제염(desalt)되었으며, 촉매, 3 mM 황산구리 및 9 mM 1,10-페난쓰로린(phenanthroline)의 존재하에 암실에서 370℃, 30분간 동일몰당량의 단백질 단편과 커플링되었다(Lee et al., 1994). 커플링 효율은 거의 100%에 달하였다(도 29 참조). EGFP의 두 절반과 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는 커플링된 키메라를 투석 튜브 내에서 동일 몰당량으로 혼합하고 50 mM 트리스-HCl(pH 8.5), 0.5 M NaCl, 5 mM MgC1₂ 및 20 μM PEG(6000 MW)를 포함하는 완충액으로 투석시켰다. 히타치 형광 분광광도계 F-2500을 사용하여 4시간 이내에 형광 스펙트럼을 촬 영하였다(도 30).

세포는 적절한 항생제(클로람페니콜 및/또는 스트렙토마이신)를 포함하는 LB 배지에서 배양될 것이고 발색 기질 니트로세핀(nitrocefin)의 존재하에 0.2 mM IPTG로 유도될 것이다. 음성 대조군은 앱타머 서열, 붕괴된 앱타머 서열 및 앱타머에 대한 결합을 위해 필요한 성분들 중 어느 한 성분이 없는 단백질 융합체를 발현시키지 않을 것이다. 무세포 상청액의 490 nm에서의 흡광도는 나노드롭(NanoDrop) ND-1000 분광광도계를 사용하여 측정될 것이다.

유세포 분석기. 형광 측정은 488-nm 아르곤 여기 레이저와 515-545 nm 방출 필터(FLl)를 구비한 벡톤-디킨슨 팩스칼리버((Becton-Dickinson FACSCalibur) 유세포 분석기를 사용하여 획득되었다. 분석하기 전에 세포를 1X PBS로 1회 세척하였다. 100,000개의 세포가 수집될 때까지 형광을 측정하였다.

형광 현미경, 이미지화 및 데이터 분석. 배양물 내의 박테리아 세포를 커버 슬립과 1X PBS 중의 0.8% 아가로스의 얇은 슬립(slip) 사이에 고정시켰다. 실온에서 에피형광 시스템 X-Cite 120이 장착된 니콘(Nikon) 이클립스(Eclipse) 80i 역전 현미경으로 현미경촬영(microscopy)을 수행하였다. 이미지를 아이피랩 소프트웨서 버전 3.7(IPLab v.3.7 Software)(Scanalytics, Inc)에 의해 조절되는 10Ox 배율 대물렌즈(magnification objective)를 구비한 디지털 B&W 카메라(12 비트; 20 mHz)를 사용하여 노출 시간 150-300 ms로 촬영하였다. ND4 필터를 사용하여 세포의 광손상(photodamage)을 줄였다. 이미지제이 1.36비 소프트웨어ImageJ 1.36B software)(Wayne Rasband, NIH)를 사용하여 화상처리를 실시하였다. 현미경 촬영 을 통해 획득된 형광 이미지를 이미지제이(ImageJ)를 통해 JEPG 형식으로 읽어 들이고 8비트 형식으로 전환시켰다. 한계 레벨(Threshold level)을 각 이미지에 대해 수동으로 조정하였다. 상한 한계를 최대 관찰 값으로 자동으로 설정하였고 보다 낮은 한계를 경험적으로 설정하여 백그라운드 내에 물체로 식별된 픽셀이 없게 하였다. 총 세포 형광을 획득하기 위해, 옵션 '입자 분석(Analyze Particles)'을 선택하였다. 결과물은 식별된 물체에 대한 평균, 중간, 및 최대 그레이스케일의 픽셀 지역을 포함하였다. (픽셀의) 지역을 기준으로 평균에서 최소(그레이스케일/픽셀)를 뺀 결과를 통합하여 세포의 총 형광을 얻었다. 이 계산 방법은 백그라운드를 제(subtraction)하였다. 단일 세포에서의 총 형광 변화의 동역학을 유사한 방법으로 계산하였는데, 이번에는 관심있는 세포에 직사각형 세그먼트 툴을 적용하였다. 세포를 따라 분포하는 형광을 정량하기 위하여, 박테리아 세포의 장축을 따라서 형광 프로파일을 측정하였고 마이크로소프트 엑셀로 피크 표면 값을 계산하였다. 각각의 세포에 대해 3 내지 4회 측정하였으며, 그 결과를 평균하였다. 각각의 세포 주위의 백그라운드 형광을 유사하게 정량하였으며 세포 형광 프로파일로부터 제하였다.

형광 측정 및 세포 이미지화: 총 세포 형광은 벡톤-디킨슨 형광 활성 세포 분류기(488 nm 여기 아르곤 레이저를 구비한, FACSCalibur)로 측정될 것이고 엑셀 소프트웨어들 사용하여 분석될 것이다. 세포 이미지화는 형광과 미분 간섭 효과(DIC) 사이의 자동 스위칭이 가능한 공초점 현미경 시스템을 사용하여 수행될 것이다. 확대 견본 이미지(xl50)는 냉각된, 저속-스캔(slow-scan) CCD 이미지화 장 치(C4880; Hamamatsu Photonics, Bridgewater, NJ)로 직접적으로 전송될 것이다. 컴퓨터로 통제되는(MetaMorph 2.5 소프트웨어; Universal Imaging Corp., West Chester, PA) 현미경은 1-㎛ 축 스텝(axial steps)에서 형광 이미지와 중심 형광 이미지에 상응하는 단일 DIC 이미지를 촬영하는 획득 프로토콜을 실행하도록 설정될 것이다. EGFP 모티터링을 위하여, 488 nm 여기선(excitation line)을 갖는 아르곤 레이저가 사용될 것이며, 방출 창은 500-540 nm 사이로 설정될 것이다. 몇몇 시점의 합성 이미지를 생성하기 위하여, 본 발명자들은 메타몰프(Metamorph) 소프트웨어 패키지(Universal Imaging Corporation)의 3D 재구성 특성을 사용할 것이다. 매 1-2분마다, 또는 필요하다면 그 이하로, 이미지를 촬영하고 점 대 점으로(point-by-point) 형광 RNA 스팟을 추적함으로써 RNA 속도가 측정될 것이다.

실 경쟁 PCR 디자인, 증폭 및 신장. 세포 배양물로부터의 총 RNA 샘플을 총 부피 20 ㎕ 중의 0.5 ㎍의 랜덤 헥사뉴클레오티드 및 AMV 역전사효소(Promega)와 함께 42℃에서 1시간 동안 역전사시켰다. 프라이머와 경쟁자를 시쿠에놈 에세이 디자이너(Sequenom's Assay Designer) 소프트웨어를 사용하여 디자인하고 인테그레이티드 DNA 테크놀로지(Integrated DNA Technology)(Coralville, IA)로부터 획득하였다. cDNA의 증폭을 하기 조건과 더불어 5 ㎕ 중에 0.1U 핫스타(HotStar) Taq DNA 중합효소(Qiagen), 100 nM의 PCR 프라이머, 다양한 농도의 경쟁자, 2.75 mM의 MgCl₂, 및 200 μM dNTP를 사용하여 수행하였다: 95℃에서 15분간 가열 개시, 뒤이어 95℃에서 30초간, 56℃에서 1분간, 이후 72℃에서 1분간 45 주기, 72℃에서 7분 간 최종 유지. PCR 증폭 후, 산물을, 37℃에서 20분간, 증폭 사일크로부터 비사용된 dNTP를 불활성화시키는, 0.04U 새우 알카리성 인산화효소(shrimp alkaline phosphatase, SAP)(Sequenom)로 처리하고 난 다음, 뒤이어 85℃에서 5분간 열로 불활성화시켰다. 신장 사이클 동안, 최종 농도 1.2 μM의 신장 프라이머와 0.6U의 써모시쿼나아제(ThermoSequenase)(Sequenom)를 각 염기에 대하여 50 μM으로 각 반응에 특이적인 디데옥시뉴클레오티드와 데옥시뉴클레오티드를 포함하는 종결 혼합물과 함께 9 ㎕의 총 반응용액에 첨가하였다. 신장 조건은 다음 72사이클과 더불어 94℃에서 2시간 동안의 유지를 포함한다: 94℃에서 5초, 52℃에서 5초, 72℃에서 5초.

MALDI-TOF MS와 정량 분석. MALDI-TOF MS 분석에 앞서서, 스펙트로클린(SpectroCLEAN) 레진과 16 ㎕의 물을 사용하여 반응용액으로부터 염을 제거하였다. 매스어레이(MassARRAY) 시스템(Sequenom) 사용하여, 대략 10 nL의 최종 산물을 스펙트로포인트 나노디펜서(SpectroPOINT nanodispenser)(Sequenom)를 사용하는 384-플레이트 형식 MALDI-TOF MS 스펙트로칩(SpectroCHIP) 상에 분산시킴으로써, ASV 분석을 실행하였다. 디폴트 값으로 설정된 TITAN(Elvidge et al, 2005) 소프트웨어를 사용하여 질량분석 데이터를 분석하였다.

배지: 효모 야생형 세포는 YPD(2% 글루코오스, 1% 효모 추출물, 2% 펩톤) 중에서 배양될 것이다. 플라스미드로 형질전환된 세포는 트립토판, 우라실, 또는 류신이 결여된 선택 합성 드롭아웃 배지(0.67% 효모 질소 염기, 2% 글루코오스) 중에서 배양될 것이다. 이 연구에서 사용된 종은 YPH500(MATα ura3-52, lys2-801앰 버(amber), ade2-101오셔(ochre) trpl-Δ63, his3-Δ200, leu2-Δ1)(Johnsson &Varshavsky, 1994)의 유도체이다.

효모(진핵생물)에서의 컨주게이션된 검출-핵산 결합 단백질의 발현. 효모 내에서 키메라 단백질 EGFP(A)-eIF4A(Fl)와 EGFP(B)-eIF4A(F2)을 발현시키기 위해 사용된 플라스미드는 이들의 N-말단에서 HA 또는 myc 에피토프 태그에 융합된 단백질을 발현시키도록 변형된 발현 벡터 pDB20(Becker et al., 1991)의 유도체일 것이다. 상기 플라스미드는 강력한 ADHl 프로모터로부터의 구조 단백질 발현과 웨스턴 블랏에 의한 유전자 발현 분석을 가능하게 할 것이다. 플라스미드 pRS4Dl(Blake et al. 2003)는 유전자의 3' 말단(4번째 집-코드(zip-code) 뒤)에 위치하는 64 nt-길이 앱타머 태그와 함께 ASHl(EGFP 대신)의 전 메시지를 발현하도록 변형될 것이다. YPH500 종의 게놈 내로의 상기 플라스미드의 통합은 배양 배지에 갈락토오스와 안히드로테트라사이클린의 첨가 시에 태그된 ASH1 유전자의 조절된 발현을 가능하게 할 것이다. 그렇게 하여, 본 발명자들은 ASHl 3'-로컬라이제이션 서열(Bertrand et al., 1998; 및 Breach and Bloom, 2001)을 지니는 리포터 전사체와 반대로 ASHl 전체 메시지의 로컬라이제이션이 뒤따를 것이다. 이것은 본 발명자들에게 RNA 로컬라이제이션 기작에 대한 새로운 통찰력을 줄 수 있다.

효모 세포는 자이모라제(zymolase)로 처리되고 그 후 3 x 10⁵ 세포/ml의 농도로 1시간 동안 DMEM 중의 2 μM의 CCF2/AM 존재하에 인큐베이션될 것이다. 세포는 PBS 완충액으로 세척될 것이며 405 nm에서 여기, 및 440-450 nm에서 방출로 설 정된 필터를 구비한 니콘 이클립스 80i 형광 현미경을 사용하여 시각화될 것이다. 세포 형광은 또한 형광 활성 세포 분류기로 측정될 것이다(470 mn에서 여기를 갖는 레이저를 구비한, 팩스아리아(FACSaria), 벡톤-디킨슨).

시험관내 겔-이동도 분석. 시험관내 겔-이동도 분석을 수행하기 위해, 본 발명자들은 맞춤-합성된 펩티드와 표 1에 나열된 RNA 앱타머를 구입하였다. RNA를 제일 먼저 완충액(50 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 50 mM KCl) 중에서 95℃에서 3시간 동안 가열하여 변성시키고 그 후 실온까지 서서히 냉각시켜 RNA가 재생(renaturation)시켰다. 재생된 RNA와 펩티드를 일반적인 완충액(50 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 50 mM KCl) 중에서 30℃에서 15분간 혼합하였다. 펩티드-RNA 앱타머 복합체를 15% TBE 겔과 함께 겔 전기영동을 사용하여 분석하였다. RNA 앱타머와 펩티드-RNA 앱타머 복합체를 브롬화 에티듐(ethidium bromide)으로 염색하였다.

이상의 실시예들은 당업계의 통상의 기술자에게 본 발명을 어떻게 구현하며 사용하는지에 관한 완벽한 가르침과 설명을 제공하기 위해 제시된 것이며, 상기 실시예는 본 발명자들이 본 발명자들의 발명으로 간주하고자 하는 발명의 영역을 제한하고자 의도한 것은 아니며, 또한 상기 실시예는 본 발명에 의해 실시될 수 있는 유일한 실험과 실시예를 나타내기 위하여 의도된 것은 아니다. 본원의 가르침을 고려할 때, 수많은 변형과 변화가 본 발명이 의도하고자 한 영역으로부터 벗어나지 아니하면서 예시된 특정 구체예와 실시예에서 행해질 수 있다는 것은 당업계의 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다. 이와 같은 모든 변형은 첨부된 특허청구범위의 영역 내에 포함될 수 있도록 의도되어 있으며, 본 발명의 방법은 RNA의 생체내 가시화를 위한 수많은 시스템에 적용될 수 있다는 것이 이해된다.

참고문헌

본원에서 그리고 본 명세서 전반에 걸쳐 인용된 참고문헌은 참고문헌으로써 이의 전체내용이 본원에 통합된다.

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Claims (44)

1. 하기 단계와 수단을 포함하는 실시간 핵산 검출 방법:

   a. 핵산 결합 모티프에 컨주게이션된 제 1 폴리펩티드 단편과 핵산 결합 모티프에 컨주게이션된 하나 이상의 다른 폴리펩티드 단편들을 포함하는, 검출 컨스트럭트를 엔코딩하는 핵산 서열을 발현시키는 단계로서, 상기 두 폴리펩티드 단편들은 결합하여 활성화된 상태의 검출 단백질을 형성하며, 상기 두 단편들은 야생형 활성 단백질과 비교할 때 활성화되어 있으며 구조적으로 올바른 형태로 존재함을 특징으로 하는 단계;

   b. 관심있는 뉴클레오티드와 핵산 결합 서열을 포함하는, 리포터 컨스트럭트를 엔코딩하는 핵산 서열을 발현시키는 단계로서, 상기 핵산 결합 서열은 상기 검출 컨스트럭트 내의 2개 이상의 핵산 결합 모티프들에 의해 인지되며; 상기 핵산 결합 서열에 대한 상기 폴리펩티드 단편들 중의 2개 이상의 핵산 결합 모티프들의 결합은 활성화된 검출 단백질을 실시간으로 재구성함을 특징으로 하는 단계; 및

   c. 상기 재구성된 검출 단백질을 검출하기 위한 수단.
2. 제 1항에 있어서, 상기 검출이 시험관내 또는 생체내에서 일어남을 특징으로 하는 검출 방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 검출이 생체내에서 일어남을 특징으로 하는 검출 방 법.
4. 제 1항에 있어서, 상기 핵산이 RNA임을 특징으로 하는 검출 방법.
5. 제 1항에 있어서, 상기 핵산이 DNA임을 특징으로 하는 검출 방법.
6. 제 1항, 제 3항 또는 제 4항에 있어서, 상기 검출 단백질의 제 1 폴리펩티드 단편에 결합한 핵산 결합 모티프가 전장 길이 모티프의 일부이며, 모티프의 잔여 부분은 상기 검출 단백질의 하나 이상의 다른 폴리펩티드 단편과 결합함을 특징으로 하는 검출 방법.
7. 제 1항, 제 3항, 제 4항 또는 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 단백질의 제 1 폴리펩티드 단편과 결합한 핵산 결합 모티프는 상기 검출 단백질의 하나 이상의 폴리펩티드 단편과 결합한 핵산 결합 모티프와 독립적인 전장 길이 모티프임을 특징으로 하는 검출 방법.
8. 제 7항에 있어서, 상기 핵산 결합 모티프는 다중-도메인(multi-domain) 핵산 결합 분자의 도메인을 포함함을 특징으로 하는 검출 방법.
9. 제 1항, 제 3항 또는 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 단백질은 형광 단백질임을 특징으로 하는 검출 방법.
10. 제 9항에 있어서, 상기 형광 단백질은 녹색 형광 단백질(GFP); 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP); 녹색 형광 단백질 유사 단백질(GFP-like); 노란색 형광 단백질(YFP); 강화된 노란색 형광 단백질(EYFP); 파란색 형광 단백질(BFP); 강화된 파란색 형광 단백질(EBFP); 청록색 형광 단백질(CFP); 강화된 청록색 형광 단백질(ECFP); 적색 형광 단백질(dsRED); 및 이의 변형물(modifications)과 단편을 포함하는 군에서 선택됨을 특징으로 하는 검출 방법.
11. 제 10항에 있어서, 상기 형광 단백질은 EGFP임을 특징으로 하는 검출 방법.
12. 제 11항에 있어서, 추가로 EGFP의 제 1 및 제 2 단편 사이에 위치하는 절단 산물을 포함함을 특징으로 하는 검출 방법.
13. 제 11항에 있어서, 상기 EGFP의 제 1 단편이 아미노산 1 내지 대략 아미노산 158에 존재하며, 상기 EGFP의 제 2 단편이 대략 아미노산 159 내지 아미노산 239에 존재함을 특징으로 하는 검출 방법.
14. 제 1항에 있어서, 상기 검출 단백질이 효소임을 특징으로 하는 검출 방법.
15. 제 13항에 있어서, 상기 효소가 베타-갈락토시다아제, 베타락타메이즈, 베타-글루코시다제, 베타-글루쿠로니다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR)를 포함하는 군에서 선택됨을 특징으로 하는 검출 방법.
16. 제 14항에 있어서, 상기 효소가 베타락타메이즈임을 특징으로 하는 검출 방법.
17. 제 15항에 있어서, 상기 베타락타메이즈의 제 1 단편은 대략 아미노산 24 내지 아미노산 197이며, 상기 베타락타메이즈의 제 2 단편은 대략 아미노산 198 내지 아미노산 240임을 특징으로 하는 검출 방법.
18. 제 15항에 있어서, 상기 핵산 결합 모티프가 단백질임을 특징으로 하는 검출 방법.
19. 제 1항, 제 3항 또는 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 결합 모티프 단백질은 2 이상의 단편으로 분절되며, 한 단편은 상기 제 1 검출 폴리펩티드 단편에 컨주게이션되고, 잔여 단편(들)은 하나 이상의 상보적인 폴리펩티드 단편들에 컨주게이션되며, 상기 단편들은 (a) 활성화된 형태이고; (b) 단독으로 활성화되지 아니하며, 상기 리포터 컨스트럭트 내의 상기 핵산 결합 서열에 결합함으로써 실시간으로 활성 검출 단백질을 재구성하기 위해 보완함을 특징으로 하는 검출 방 법.
20. 제 1항, 제 3항 또는 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 결합 모티프는 MS2 피막 단백질이고 상기 핵산 결합 서열은 RNA 스템 루프이거나, 상기 핵산 결합 모티프는 TAR이고 상기 핵산 결합 서열은 Tat BIV-I 스템 루프이거나, 상기 핵산 결합 모티프는 G3/C3 스템 루프 중의 3개의 반복부분(repeat)이고 상기 핵산 결합 서열은 전사활성자이거나, 상기 핵산 결합 모티프는 eIF4A에 특이적인 앱타머이고 상기 핵산 결합 서열은 eIF4a이거나, 상기 핵산 결합 모티프는 리포터 컨스트럭트에 존재하는 핵산 결합 서열에 특이적인 앱타머이거나, 상기 리포터 컨스트럭트에 존재하는 핵산 결합 서열은 앱타머-태그(aptamer-tag)임을 특징으로 하는 검출 방법.
21. 제 1항, 제 3항 또는 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포터 단백질을 검출하기 위한 수단은 정량적 수단 또는 정성적 수단을 포함함을 특징으로 하는 검출 방법.
22. 제 1항에 있어서, 추가로 하기 단계를 포함하는 검출 방법:

    (a) 생물학적 샘플 내의 검출 단백질의 기준 시그널(baseline signal)을 검출하는 단계;

    (b) 보고된 컨스트럭트의 핵산 결합 서열과 검출 단백질의 폴리펩티드 단편 들에 컨주게이션된 핵산 결합 모티프들의 접촉에 있어서 변형이 일어나도록 분석 조건을 변화시키는 단계;

    (c) 상기 생물학적 샘플로부터 나온 검출 단백질의 활성에 있어서의 변화를 즉각적으로 검출하는 단계(여기서, 시그널의 변화가 관심있는 뉴클레오티드의 변화에 대한 지표가 된다).
23. 제 1항에 있어서, 상기 수단은 형광 현미경, 공초점 현미경, 전자 현미경, FACS(Fluorescence Activated Cell Sorter), 및 육안 검사(visual inspection)로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는 검출 방법.
24. 제 1항에 있어서, 상기 검출 컨스트럭트와 리포터 컨스트럭트는 상기 컨스트럭트들을 이용한 세포의 형질전환(transformation) 또는 트랜스펙션(transfection)에 의해 세포 내에서 발현됨을 특징으로 하는 검출 방법.
25. 제 1항에 있어서, 상기 검출 단백질은 검출 단백질을 엔코딩하는 두 핵산의 골격내 융합(in frame fusion)에 의해 핵산 결합 모티프에 컨주게이션되고 그에 따라 융합 생성물이 생산됨을 특징으로 하는 검출 방법.
26. 제 25항에 있어서, 상기 융합 생성물은 정제에 도움을 주는 프로테아제 부위 또는 태그를 포함함을 특징으로 하는 검출 방법.
27. 제 26항에 있어서, 상기 태그는 6-His 태그 또는 글루타치온-S-트랜스퍼라제 태그 또는 펩티드 에피토프임을 특징으로 하는 검출 방법.
28. 하기 중 어느 하나 이상을 엔코딩하는 DNA 서열을 포함하는 플라스미드:

    (i) 제 1항의 검출 컨스트럭트;

    (ii) 제 1항의 리포터 컨스트럭트; 또는

    (iii) 상기 (i)의 검출 컨스트럭트 및 상기 (ii)의 리포터 컨스트럭트 둘 모두.
29. 항체에 반응할 수 있도록 게놈 내에 통합된 제 28항의 DNA 서열 중 하나 이상을 지니는 유전자도입(transgenic) 개체.
30. 게놈 내에 충분히(competently) 통합된 하기 성분의 기능적 게놈 발현을 지니는 유전자도입 개체:

    a. 핵산 결합 모티프에 컨주게이션된 제 1 폴리펩티드 단편을 포함하는, 검출 컨스트럭트를 엔코딩하는 핵산 서열과 핵산 결합 모티프에 컨주게이션된 하나 이상의 다른 폴리펩티드 단편(여기서 2개의 폴리펩티드 단편들이 결합하여 활성화된 상태의 검출 단백질을 형성하며, 상기 2개의 단편들은, 야생형 활성 단백질과 비교할 때, 활성화되어 있으며 형태적으로 올바른 형태로 존재함); 및/또는

    b. 관심있는 뉴클레오티드와 핵산 결합 서열을 포함하는, 리포터 컨스트럭트를 엔코딩하는 핵산 서열(여기서, 상기 리포터 컨스트럭트는 검출 컨스트럭트 내의 2 이상의 핵산 결합 모티프들에 의해 인지되며; 상기 폴리펩티드 단편들의 2이상의 핵산 결합 모티프들의 상기 핵산 결합 서열에 대한 결합은 활성 검출 단백질을 실시간으로 재구성함).
31. 제 29항 또는 제 30항에 있어서, 상기 유전자도입 유기체가 생쥐, 제브라피쉬, 선충(C. elegans), 효모, 박테리아, 포유동물 세포, 1차 세포(primary cell), 및 2차 세포(secondary cell)로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는 개체.
32. 하기 단계를 포함하는, 개체 내의 질병 또는 장애를 검출하기 위한 방법:

    a. 개체로부터의 DNA 또는 RNA와 제 1항에 기재된 것과 같은 검출 컨스트럭트를 접촉시키는 단계로서, 핵산 결합 모티프가 특정 질병 또는 장애에 특이적임을 특징으로 하는 단계; 및

    b. 검출 컨스트럭트의 시그널에서 변화를 검출하는 단계로서, 상기 검출 컨스트럭트로부터 나온 시그널의 변화에 대한 검출이 질병 또는 장애의 존재에 대한 지표가 됨을 특징으로 하는 단계.
33. 제 32항에 있어서, 상기 질병이 병원체임을 특징으로 하는 방법.
34. 제 33항에 있어서, 상기 병원체는 바이러스, 인플루엔자, 박테리아, 진균, 기생충, 및 효모를 포함하는 군에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
35. 제 32항에 있어서, 상기 DNA 또는 RNA는 질병에 대한 유전자적 소인(genetic disposition)임을 특징으로 하는 방법.
36. 제 1항 또는 제 3항에 있어서, 상기 검출 단백질 단편들은 재구성될 때 즉각적으로 활성화될 수 있게 디자인됨을 특징으로 하는 방법.
37. 제 1항에 있어서, 상기 검출 폴리펩티드 단백질 단편들은, 야생형 활성 단백질과 비교할 때, 활성이 있으며 구조적으로 올바른 형태임을 특징으로 하며, 상보적인 검출 폴리펩티드 단백질 단편들은 표적 핵산 존재시 상기 검출 단백질과 시그널 표현형을 실시간으로 재구성함을 특징으로 하는 방법.
38. 실시간 핵산 검출을 위한 검출 컨스트럭트 및 리포터 컨스트럭트를 엔코딩하는 핵산 세그먼트의 용도로서, 하기를 특징으로 하는 용도:

    (i) 상기 검출 컨스트럭트는, 야생형 활성 단백질과 비교할 때, 활성이 있으며 구조적으로 올바른 형태로 존재하며; 이들은 핵산 결합 모티프, 및 핵산 결합 모티프에 컨주게이션된 하나 이상의 다른 폴리펩티드 단편에 컨주게이션되며;

    (ii) 상기 리포터 컨스트럭트는 관심있는 뉴클레오티드와 핵산 결합 서열을 포함하며, 상기 핵산 결합 서열은 검출 컨스트럭트 내의 2 이상의 핵산 결합 모티프들에 의해 인지되며; 폴리펩티드 단편의 2 이상의 핵산 결합 모티프들의 핵산 결합 서열에 대한 결합은 실시간으로 활성 검출 단백질을 재구성한다.
39. 제 38항에 있어서, 상기 실시간으로 검출되는 핵산이 생체내에서(in vivo) 검출됨을 특징으로 하는 용도.
40. 하기 중 하나 이상을 엔코딩하는 DNA 서열을 포함한 플라스미드를 포함하는 키트:

    (i) 제 1항의 검출 컨스트럭트;

    (ii) 제 1항의 리포터 컨스트럭트; 또는

    (iii) 상기 (i)의 검출 컨스트럭트 및 상기 (ii)의 리포터 컨스트럭트 둘 모두.
41. 제 40항에 있어서, 상기 검출 컨스트럭트가 제 9항 또는 제 10항의 형광 단백질 또는 제 15항의 효소를 포함함을 특징으로 하는 키트.
42. 제 40항에 있어서, 상기 리포터 컨스트럭트가 제 20항의 앱타머를 포함함을 특징으로 하는 키트.
43. 제 1항에 있어서, 상기 검출이 섬유아세포, 뉴런, 난모세포, 종양세포, 바이러스에 의해 감염된 포유동물 세포, 상피 세포, 박테리아 세포 및 효모 세포로 구성된 군에서 선택된 세포 내에서 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
44. 제 43항에 있어서, 상기 세포가 유전자적으로 변형된 세포임을 특징으로 하는 방법.

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