KR20080061610A - ＰＰＡＲγ의 활성을 항진시키는 화합물, 그의 제조방법,및 이를 함유한 약제학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 퍼옥시좀 증식자-활성화 수용체 감마(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma; PPARγ)의 활성을 항진시키는 하기 화학식 1의 신규 화합물, 그의 제조방법, 및 이를 약리학적 유효량으로 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
Figure 112006097708719-PAT00001
상기 식에서, A, D, Q, X 및 Y는 명세서에 정의된 바와 같다.

Description

ＰＰＡＲγ의 활성을 항진시키는 화합물, 그의 제조방법, 및 이를 함유한 약제학적 조성물 {Compounds as agonist for PPARγ, method for the preparation thereof, and pharmaceutical composition comprising the same}
도 1은 실험예 2의 (1)에 기술된 벡터 pZeo-GAL의 작제 과정을 도시한 것이고;
도 2는 실험예 2의 (2)에 기술된 벡터 pZeo-GAL-PPARγLBD의 작제 과정을 도시한 것이며;
도 3은 실험예 2의 (3)에 기술된 벡터 pZeo-GAL-PPARγLBD-Y473A 의 작제 과정을 도시한 것이고;
도 4는 실험예 5에 기술된 방법에 따라 3T3-L1 세포에서의 aP2 유전자 발현 정도를 보여주는 그래프이며;
도 5는 실험예 6에 기술된 방법에 따라 3T3-L1 세포에서의 지질 축적을 분석한 결과 그래프이다.
본 발명은 퍼옥시좀 증식자-활성화 수용체 감마(Peroxisome proliferator- activated receptor gamma; PPARγ)의 활성을 항진시키는 신규 화합물, 그의 제조방법, 및 이를 약리학적 유효량으로 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
당뇨병은 전세계적으로 많은 사람들의 건강에 악영향을 끼치고 있으며, 아울러 여러가지 합병증을 유발시키고 있다. 당뇨병 중 제2형 당뇨병은 전체 당뇨병 환자의 90% 이상을 차지하고 있다. 당뇨병의 대표적인 합병증으로는, 고지혈증, 비만, 고혈압, 망막증, 신부전증 등이 있다 (참조: Paul Zimmer, et al., Nature, 2001, 414, 782). 당뇨병에 대한 기존의 치료제로는 설포닐유레아(췌장세포에서 인슐린 분비 촉진), 바이구아나이드(간에서의 포도당 생산 억제), α-글루코시다제 억제제(장에서의 포도당 흡수억제) 등이 주로 사용되고 있다. 최근에는, PPARγ 항진제인 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones; 인슐린 감수성 증가) 등이 당뇨병 치료제로서 사용되고 있다. 하지만, 이런 약제들은 각각의 기작에 기인한 부작용을 보이고 있으며, 부적절한 혈당조절에 기인한 저혈당, 체중증가 등이 대표적인 부작용이라 할 수 있다(David E. Moller, Nature, 2001, 414, 821). 따라서, 체중증가와 같은 부작용이 적고, 당뇨병의 합병증인 고지혈증을 치료할 수 있는 새로운 당뇨병 치료제에 대한 개발의 필요성이 절실히 요구되고 있다.
최근, PPARγ 항진제들이 인슐린 감수성을 증가시킬 뿐만 아니라, 포도당 및 인슐린의 양을 감소시킨다는 것이 동물실험을 통해 밝혀져, 당뇨병과 일부 합병증에 대한 치료제로서의 가능성을 제시한 바 있다(참조: Ricote M., Nature 1998, 391, 79-82). 또한, PPARα를 활성화시키는 파이브레이트가, 혈중 트리글리세라이드(TG)를 20-50% 감소시키고, LDLc를 10-15% 감소시키며, HDLc를 10-15% 증가시키 는 약제로서 사용되고 있으며, 이러한 효과는 PPARα를 활성화시킴에 따라 발휘되는 것이라는 사실이 여러 실험을 통해 보고되고 있다(참조: Isseman, I., et al, Nature 1990, 347, 645-650; Linton, M. F., Curr. Atheroscler. Rep. 2000, 2, 29-35). 즉, PPARα의 활성화는 지방산을 분해하는 효소의 전사를 활성화하며, 간에서 지방산의 de novo 합성을 감소시켜 TG 및 VLDL의 생산 및 방출을 감소시킨다는 보고들이 이를 뒷받침해 주고 있다.
또한, 인간 PPARγ와 PPARα의 항진제들이 여러가지 동맥경화 동물 모델에서 효과를 보임으로써, 이러한 항진제들이 동맥경화 치료제로서 사용될 가능성도 제시되고 있으며(참조: Li, A.C., et al, J. Clin, Invest. 2000, 106 523, Collins, A., Arterioscler., Thromb., Vasc. Biol. 2002, 21, 365-367, Bernadette P. Neve, et al. Biochemical Pharmacology 2000, 60, 1245), PPARγ 항진제들이 염증을 유발하는 인자들을 억제한다는 사실이 보고됨에 따라 이들의 염증 치료제로서의 가능성 또한 제시되고 있다(Ricoti M., et al., Nature 1998, 391, 79).
따라서, PPARγ와 PPARα를 모두 활성화시키는 화합물은 당뇨병과 당뇨병으로 인한 고지혈증을 치료하는데 사용될 수 있다는 가능성이 제시되었고(참조: Auwerx, J., Insulin Resistance, Metabolic Disease Diabetic Complications 1999, 167-172), 여러 연구자들은 최근에 PPARγ와 PPARα를 동시에 활성화시키는 화합물이 포도당 및 지질을 개선한다는 사실을 동물실험에서 확인하였다(참조: Koji Murakami, et al, Diabetes, 1998, 47, 1841, Dawn A. Brooks, et al., J. Med. Chem. 2001, 44, 2061).
이와 같이 다양한 분야의 우수한 약리학적 효과로 인해 많은 제약회사들이 PPARγ와 PPARα를 모두 활성화시키는 화합물을 개발하려고 노력하고 있으며, 그 결과 tesaglitazar(AZ-242)과 muraglitazar(BMS-298585)가 2004년 현재 임상 3상을 진행하고 있다(Brad R. Henke, J. Med. Chem. 2004, 47, 4118~4127). 특히 tesaglitazar는 동물 실험(ob/ob 쥐)에서 고혈당증, 과인슐린증 및 고중성지방혈증을 현저히 향상시키는 우수한 효과를 보인 바 있다(B. Bjung et al., J. Lipid Res. 2002, 43, 1855~1863).
우수한 효과와 더불어 나타나는 부작용으로는 체중증가와 부종을 들 수 있다. 특히 PPARγ 항진제인 rosiglitazone과 pioglitazone에서 뚜렷한 부작용을 볼 수 있는데, 대부분의 환자에서 체중증가(3~5kg)가 나타나고 일부 환자에서는 부종을 동반하는 경우도 있다(S. Mudaliar et al, Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes 2002, 9, 285~302). 부종이 야기되면 심장에 부담을 줄 수 있기 때문에 향후 PPARγ와 PPARα를 모두 활성화시키는 항진제을 개발함에 있어서 이러한 부작용이 없는 화합물을 개발하는 것이 관건이다. 체중증가는 주로 PPAR 항진제의 작용에 의해 생체대사조절물질의 분비가 왕성한 피하지방이 증가하는 것에 기인한다. 이는 복부지방의 감소와 병행하기는 하나, 당뇨병의 치료를 위해 일반적으로 체중감소를 지향하고 있으므로, 체중증가를 야기하지 않는 물질의 개발이 요구되고 있다. 이와 관련하여, 체중증가 없이 PPARγ와 PPARα를 모두 활성화시키는 항진제를 발표한 예가 있다(R. K. Virkramadithyan et al., Obesity Res. 2003, 11,292~303).
체중증가나 부종등과 같은 PPARγ 항진제의 부작용을 줄이면서 인슐린 저항 성을 향상시킬 수 있는 방법으로 PPARγ 부분적 항진제(partial agonist)의 개념이 도입되었다(SM Rangwala and MA Lazar, Sci STKE, 2002(121), 121-122). 이들은 SERM(Selective Estrogen Receptor Modulator)처럼 PPARγ의 프로모터와 조직에 따라 선택적으로 작용하여 인슐린 저항성을 개선하면서도 지방세포의 분화관련 유전자의 발현 등은 선택적으로 억제한다(JP Berger et al., Mol Endo., 2003, 17(4), 662-676). 그 결과, 동물실험에서 인슐린 저항성을 개선시키면서도 체중증가를 상당부분 억제시킨다는 실험결과가 발표되었다(Misra P et al., J Pharmacol Exp Ther., 2003, 306(2), 763-771), (Rocchi S et al., Mol Cell, 2001, 8, 737-747), (Liu LS et al., 1998, Endocrinology, 139(11), 4531-4539). 따라서 체중증가와 부종등 부작용이 많은 PPARγ 완전 항진제(full agonist)보다는 PPARγ 부분적 항진제가 오히려 좋은 치료제가 될 수 있을 것으로 기대된다.
PPARγ의 부분적 항진제는 완전 항진제와는 다른 방식으로 PPARγ에 결합한다고 알려져 있다. PPARγ 완전 항진제인 TZD 계열과 카르복실산 화합물 계열의 X-ray 결정구조에 의하면 PPARγ 완전 항진제의 산기(acidic moiety)는 His449, Tyr473, His323, Ser289, 그리고 Gln286 등의 아미노산과 수소결합을 하고 있다. 이중 Tyr473 은 카르복실 말단의 AF-2 도메인에 위치하고 있으며 Tyr473 과의 수소 결합은 co-activator의 동원(co-activator recruitment)과 DNA 결합구조를 이루는데 매우 중요하다(Tontonoz et al., Genes Dev., 1994, 8, 1224-1234), (Kubota N et al., Mol Cell., 1999, 4, 597-609), (Cronet P et al., Structure, 2001, 9, 699-706). 반면에 PPARγ의 부분적 항진제의 일종인 GW0072의 경우에는 특이한 결 합형태를 보여준다. GW0072는 다른 PPARγ 완전 항진제처럼 카르복실산 계열의 화합물이지만 AF-2 도메인과 결합을 하지 않고 따라서 Tyr473 과의 수소 결합도 하지 않는다(Yoshioka T., J Med Chem., 1989, 32, 421-428). 이러한 결합방식의 차이는 PPARγ 완전 항진제와 부분적 항진제를 구별짓는 매우 중요한 성질이 된다.
체중 증가와 부종 등의 부작용 외에도 PPARγ 항진제는 골다공증을 유발할 가능성이 있다. 뼈를 생성하는 골아세포(osteoblast)와 지방세포 (adipocyte)는 분화과정 중 골수의 중간엽세포(mesenchymal cells)로부터 유래한다. 중간엽세포로부터 골아세포의 분화는 Runx2/Cbfal나 Dlx5 같은 전사 요소들에 의해 조절되는 반면 중간엽세포로부터 지방세포로의 분화는 PPARγ에 의해 조절된다(Komori T et al., Cell, 1997, 89(5), 755-764), (Acampora T et al., Development, 1999, 126(17): 3795-809), (Lecka-Czernik B, J Cell Biochem., 1999, 74, 357-371). 골아세포에 PPARγ 항진제인 rosiglitazone 을 처리하면 PPARγ의 활성화와 함께 골아세포는 지방세포로 분화되며 동시에 골아세포의 표현형을 비가역적으로 억제한다. 이러한 현상은 PPARγ가 Runx2/Cbfa1 이나 osteopontin, alkaline phosphatase, 그리고 osteocalcin과 같은 골아세포 특유 요소의 활성을 억제함으로서 생기는 것이라 생각된다(Lecka-Czernik B, J Cell Biochem., 1999, 74, 357-371).
본 발명의 목적은 인간 PPARγ를 매우 우수한 효능으로 활성화시키는 화학식 1의 신규 화합물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 목적은 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 활성성분으로서 화학식 1의 화합물을 약리학적 유효량으로 포함함을 특징으로 하는 PPARγ 항진제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 화학식 1의 화합물을 활성성분으로 사용하여 당뇨병, 당뇨병 관련 합병증, 염증, 골다공증 등과 같은 PPARγ 관련 질병을 치료 및 예방하는 방법을 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물, 그의 약제학적으로 허용되는 염, 및 이성질체를 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112006097708719-PAT00002
상기 식에서
A 는 하기 그룹으로부터 선택되고:
(ⅰ) 할로겐에 의해 치환되거나 비치환된 선형, 가지형 또는 환형 C1~C6 알킬
(ⅱ)
Figure 112006097708719-PAT00003
(ⅲ)
Figure 112006097708719-PAT00004
(ⅳ)
Figure 112006097708719-PAT00005
(ⅴ)
Figure 112006097708719-PAT00006
여기서
R1은 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 할로겐에 의해 치환되거나 비치환된 선형 또는 가지형 C1~C4 알킬, 또는 할로겐에 의해 치환되거나 비치환된 선형 또는 가지형 C1~C4 알콕시를 나타내며,
R2는 할로겐에 의해 치환되거나 비치환된 선형 또는 가지형 C1~C4 알킬을 나타내고,
n은 0 또는 1이며,
X는 할로겐에 의해 치환되거나 비치환된 선형 또는 가지형 C1~C5 알킬을 나타내고,
Y는 할로겐에 의해 치환되거나 비치환된 선형 또는 가지형 C1~C5 알콕시를 나타내며,
Q는 수소, 할로겐, 또는 할로겐에 의해 치환되거나 비치환된 선형 또는 가지형 C1~C4 알킬을 나타내고,
D는 하기 그룹으로부터 선택되며:
(ⅰ)
Figure 112006097708719-PAT00007
(ⅱ)
Figure 112006097708719-PAT00008
여기서
n은 0 또는 1이고,
E는 수소, 할로겐, 할로겐에 의해 치환되거나 비치환된 선형, 가지형 또는 환형 C1~C6 알킬, 또는 할로겐에 의해 치환되거나 비치환된 선형, 가지형 또는 환형 C1~C6 알콕시를 나타내며,
G는 수소를 나타낸다.
이하에서 별도의 설명이 없는 한, 치료제의 활성성분에는 화학식 1의 화합물, 약제학적으로 허용되는 그의 염, 및 이성질체가 모두 포함되며, 이들은 모두 본 발명의 범주에 포함되는 것으로 해석되어야 한다. 설명의 편의를 위하여, 본 명세서에서는 이들을 화학식 1의 화합물로 간단히 표현한다.
본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물은 기존에 알려져 있는 PPARγ 항진제와는 전혀 상이한 구조를 가진다. 또한, 이하의 실험예에서도 볼 수 있는 바와 같이, 인간 PPARγ에 대해 우수한 항진효과를 발휘함으로써 당뇨병, 당뇨병 관련 합병증, 골다공증 및 염증의 예방 및 치료 효과를 나타낸다.
본 발명에 따른 화합물을 정의하는데 사용된 용어를 이하 간략히 설명한다.
본 명세서에서 용어 “알킬” 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, t-부틸, 펜틸, 헥실, 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실 등을 포함하는 의미로 사용된다.
용어 “약제학적으로 허용되는 염”과“이성질체”는 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 화합물의 제형을 의미한다. 약제학적으로 허용되는 염에는 약제학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 무독성 산부가염을 형성하는 산, 예를 들어, 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 등과 같은 무기산, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리실산 등과 같은 유기 카본산, 메탄설폰산, 에탄술폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산 등과 같은 설폰산 등에 의해 형성된 산부가염이 포함된다. 예를 들어, 약제학적으로 허용되는 카르복실산 염에는 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등에 의해 형성된 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속 염, 라이신, 아르지닌, 구아니딘 등의 아미노산 염, 디시클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(히드록시메틸)메틸아민, 디에탄올아민, 콜린 및 트리에틸아민 등과의 유기염 등이 포함된다. 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 통상적인 방법에 의해 그의 염으로 전환될 수 있다.
용어 “이성질체(isomer)”는 동일한 화학식 또는 분자식을 가지지만 광학적 또는 입체적으로 상이한 화합물 또는 그의 염을 의미한다. 본 발명에 따른 화합물은 옥심 구조를 가지고 있으므로 트랜스 및 시스 구조의 기하 이성질체가 존재할 수 있으며, 이들 모든 이성체 및 그의 혼합물이 본 발명의 범위에 포함된다.
기타 본 명세서에서 사용된 용어들은 본 발명이 속하는 분야에서 통상적으로 이해되는 의미로서 해석될 수 있다.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물 중 대표적인 화합물은 하기 그룹에서 선택된다:
(3-{[(2Z)-2-(1-벤질-1H-인돌-3-일)-2-(에톡시이미노)에틸]옥시} 페녹시)아세트산;
(3-{[(2Z)-2-(1-벤질-1H-인돌-3-일)-2-(에톡시이미노)에틸]옥시}-5-에톡시페닐)아세트산;
[3-({(2Z)-2-(에톡시이미노)-2-[1-(2-페닐에틸)-1H-인돌-3-일]에틸} 옥시)페닐]아세트산;
3-({(2Z)-2-(에톡시이미노)-2-[1-(2-페닐에틸)-1H-인돌-3-일]에틸} 옥시)벤조산;
(3-{[(2Z)-2-(에톡시이미노)-2-{1-[4-(트리플루오로메틸)벤질]-1H-인돌-3-일}에틸]옥시}페닐)아세트산;
(3-{[(2Z)-2-(에톡시이미노)-2-{1-[(5-메틸아이소옥사졸-3-일)메틸]-1H-인돌-3-일}에틸]옥시}페닐)아세트산;
(3-{[(2Z)-2-(1-벤질-5-메톡시-1H-인돌-3-일)-2-(에톡시이미노)에틸] 옥시}페닐)아세트산;
3-{[(2Z)-2-(1-벤질-1H-인돌-3-일)-2-(에톡시이미노)에틸]옥시} 벤조산;
3-{[(2Z)-2-(에톡시이미노)-2-(2-메틸-1-페닐-1H-인돌-3-일)에틸] 옥시}벤조산;
3-({(2Z)-2-(에톡시이미노)-2-[1-(4-플루오로벤질)-1H-인돌-3-일]-에틸}옥시)벤조산;
3-{[(2Z)-2-(1-벤질-1H-인돌-3-일)-2-(에톡시이미노)에틸]옥시}-5-아이소프로폭시벤조산;
(3-{[(2Z)-2-(1-벤질-1H-인돌-3-일)-2-(에톡시이미노)에틸]옥시} 페닐)아세트산;
(3-{[(2Z)-2-(1-벤질-1H-인돌-3-일)-2-(프로폭시이미노)에틸]옥시} 페닐)아세트산;
(3-{[(2Z)-2-[1-(3-클로로벤질)-1H-인돌-3-일]-2-(에톡시이미노) 에틸]옥시}페닐)아세트산;
(3-{[(2Z)-2-(에톡시이미노)-2-{1-[3-(트라이플루오로메틸)벤질]-1H-인돌-3- 일}에틸]옥시}페닐)아세트산;
3-{[(2Z)-2-(에톡시이미노)-2-(1-헥실-1H-인돌-3-일)-에틸]옥시} 벤조산;
(3-{[(2Z)-2-(에톡시이미노)-2-{1-[1-(2-(메틸설포닐에틸)-1H-인돌-3-일}에틸]옥시}페닐)아세트산; 및
(2-{[(2Z)-2-(1-벤질-1H-인돌-3-일)-2-(에톡시이미노)에틸]옥시} 페닐)아세트산.
본 발명은 또한 상기 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명이 속한 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자("당업자")라면 화학식 1의 구조를 바탕으로 본 명세서에 기재되거나 선행기술에 개시된 여러 합성법들을 임의로 조합하여 상기 화학식 1의 화합물을 제조할 수 있으며, 본 발명의 범위가 본 명세서에 개시된 방법만으로 한정되는 것은 아니다.
하나의 예시적인 방법으로서, 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 2의 화합물을 염기 존재하에 하기 화학식 3의 화합물과 축합 반응시킴을 특징으로 하여 제조할 수 있으며, 그 과정을 하기 반응식 1에 나타내었다.
Figure 112006097708719-PAT00009
Figure 112006097708719-PAT00010
Figure 112006097708719-PAT00011
상기 식에서,
A, D, Q, X 및 Y는 화학식 1에 대해 정의한 바와 같고,
L은 이탈기, 바람직하게는 Cl, Br, I 또는 메탄설포닐을 나타낸다.
상기 반응은 임의로 디메틸포름아마이드, 디메틸아세트아마이드, 아세토니트릴 등과 같은 유기용매에서 수행될 수 있으며, 경우에 따라서는 2 종류 이상의 유기용매 혼합물이 사용될 수도 있다. 반응에 사용되는 염기의 예로는 수소화나트륨, 포타시움 t-부톡사이드, 세슘카보네이트, 포타시움카보네이트, 소디움 카보네이트, 포타시움 비스(트리메틸실릴)아마이드 등을 들 수 있으며, 경우에 따라서는 2 종류 이상이 함께 사용될 수도 있다. 축합 반응이 완결된 후, 필요에 따라, 에스터 형태의 화합물을 가수분해하여 원하는 유리산 형태의 화합물을 얻을 수 있다.
화학식 1의 화합물은 또한, 하기 화학식 4의 화합물을 염기 존재하에 화학식 3의 화합물과 축합 반응시켜 하기 화학식 5의 화합물을 제조한 후, 화학식 5의 화 합물을 하기 화학식 6의 아민 또는 그의 하이드로클로라이드와 반응시켜 옥심구조를 형성함을 특징으로 하여 제조할 수 있다.
Figure 112006097708719-PAT00012
Figure 112006097708719-PAT00013
Figure 112006097708719-PAT00014
Figure 112006097708719-PAT00015
상기 식에서
A, D, Q, X, Y 및 L은 앞에서 정의한 바와 같다.
반응식 2의 축합 단계 a는 임의로 디메틸포름아마이드, 디메틸아세트아마이드, 아세토니트릴 등과 같은 유기용매에서 수행될 수 있으며, 경우에 따라서는 2 종류 이상의 유기용매 혼합물이 사용될 수도 있다. 반응에 사용되는 염기의 예로는 수소화나트륨, 포타시움 t-부톡사이드, 세슘카보네이트, 포타시움카보네이트, 소디움 카보네이트, 포타시움 비스(트리메틸실릴)아마이드 등을 들 수 있으며, 경우에 따라서는 2 종류 이상이 함께 사용될 수도 있다.
반응식 2의 옥심화 단계 b는 단계 a에서 얻어진 화학식 5의 화합물을 원하는 치환기 X를 가진 화학식 6의 옥심 화합물과 함께 메탄올, 에탄올, 프로판올과 같은 유기용매, 물, 또는 이들의 혼합물 중에서 반응시킴에 의해 수행될 수 있다. 반응 에 사용되는 염기의 예로는 수소화나트륨, 포타시움카보네이트, 소디움 카보네이트, 소디움 바이카보네이트 등을 들 수 있으며, 경우에 따라서는 2 종류 이상이 함께 사용될 수도 있다.
한편, 반응식 2의 방법에서 출발물질로 사용한 화학식 4의 화합물은 하기 반응식 3에 도시한 방법에 따라 제조할 수 있다.
Figure 112006097708719-PAT00016
상기 식에서
A, Y 및 Q는 앞에서 정의한 바와 같고,
L 및 L'는 각각 독립적으로 이탈기, 바람직하게는 Cl, Br, I 또는 메탄설포닐을 나타낸다.
반응식 3에서 출발물질로 사용한 화합물(7)은 상업적으로 얻을 수도 있고, 기존의 잘 알려진 Fischer indole 합성법(Tokmakov, G. P. et al. Tetrahedron, 1995, 51, 2091)을 이용하여 합성할 수도 있다. 화합물(7)과 화합물(8)을 반응시키는 단계 a의 축합반응은 임의로 디메틸포름아마이드, 디메틸아세트아마이드, 아세토나트릴, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄 등과 같은 유기용매 중에 반응물질을 녹인 후 예를 들어 수소화나트륨, 수산화나트륨, 포타시움 t-부톡사이드, 세슘카보네이트, 포타시움카보네이트, 소디움 카보네이트, 포타시움 비스(트리메틸실릴)아마이드 등과 같은 염기의 존재하에 가열하여 진행될 수 있으며, 반응 결과 화합물(9)가 제조된다.
단계 a에서 수득된 화합물(9)를 메틸렌클로라이드와 메탄올의 혼합용액 또는 클로로포름과 메탄올의 혼합용액에 녹이고 아세트산을 용액에 가한 다음 예를 들어 테트라부틸 암모늄 트리브로마이드나 브롬을 가하여 교반하면 L=Br인 화학식 4의 화합물이 얻어질 수 있다.
상기 화학식 2와 3의 화합물들 역시 당업자라면 그의 구조를 바탕으로, 본 발명의 범주 내에서, 다양한 방법에 의해 제조하는 것이 가능할 것이다. 예를 들어, 화학식 2의 화합물은 화학식 4의 화합물을 화학식 6의 화합물과 옥심화 반응시켜 얻을 수 있으며, 화학식 3의 화합물은 문헌(한국특허출원 제2005-0111079호)에 게시된 방법을 참고하여 용이하게 제조할 수 있다.
당업자라면 본 발명에 따른 화합물의 제조를 위한 구체적인 반응조건 등을 추후 설명하는 제조예와 실시예를 통해 확인할 수 있으므로 그에 대한 자세한 설명은 생략한다.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 하기 실험예의 결과로부터 입증되듯이 PPARγ에 대한 항진 활성을 나타내고 있고, 이에 따라 당뇨병, 당뇨병 관련 합병증, 염증, 골다공증 등과 같은 PPARγ 관련 질병의 치료 및 예방에 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 (a) 약리학적 유효량의 화학식 1의 화합물; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 함유함을 특징으로 하는 PPARγ 항진제 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 “약제학적 조성물(pharmaceutical composition)”은 본발명의 활성 화합물과 희석제 또는 담체와 같은 다른 화학 성분의 혼합물을 의미한다. 약제학적 조성물은 생물체 내로 화합물의 투여를 용이하게 한다. 화합물을 투여하는 다양한 기술들이 존재하며, 여기에는 경구, 주사, 에어로졸, 비경구, 및 국소 투여 등이 포함되지만, 이들만으로 한정되는 것은 아니다. 약제학적 조성물은 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 살리실산 등과 같은 산 화합물들을 반응시켜서 얻어질 수도 있다.
용어 “약리학적 유효량(therapeutically effective amount)”은 치료하고자 하는 질병에 의해 야기된 하나 이상의 증상을 어느 정도 경감시키거나, 예방을 요하는 질병의 임상학적 마커 또는 증상의 개시를 지연시키는데 유효한 활성성분의 양을 의미한다. 따라서, 약리학적 유효량은, (1) 질환의 진행 속도를 역전시키는 효과, (2) 질환의 그 이상의 진행을 어느 정도 금지시키는 효과, 및/또는 (3) 질환과 관련된 하나 또는 그 이상의 증상을 어느 정도 경감(바람직하게는, 제거)하는 효과를 가지는 양을 의미한다. 약리학적 유효량은 치료를 요하는 질병에 대한 공지된 생채내(in vivo) 및 생체외(in vitro) 모델 시스템에서 화합물을 실험함으로 써 경험적으로 결정될 수 있다.
용어 “담체(carrier)”는 세포 또는 조직내로 화합물이 부가되는 것을 용이하게 하는 화합물로 정의된다. 예를 들어, 디메틸 설폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직내로 많은 유기화합물의 투입을 용이하게 하는데 통상 사용되는 담체이다. 또한, 본 명세서에서 담체는 희석제 및 부형제의 개념을 포함하는 의미로 사용된다.
용어 “희석제(diluent)”는 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 완충액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 완충액은 포스페이트 완충된 식염수인데, 이는 인간 체액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 완충액의 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 완충액 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다.
본 발명에서 사용된 화합물은 인간 환자에게 그 자체로서, 또는 결합 요법에서와 같이 다른 활성 성분들과 함께 투여될 수 있으며, 이때 적당한 담체와 함께 혼합된 약제 조성물로서 투여될 수 있다. 화합물의 제형 및 투여에 관한 기술은 문헌(“Remington's Pharmaceutical Sciences,”Mack Publishing Co., Easton, PA, 18th edition, 1990)을 참조할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 사용하여, 예를 들어 혼합, 용해, 과립화, 당제-제조, 분말화, 에멀션화, 캡슐화, 트래핑화 또는 동결건조 과정들의 수단에 의해 공지 방식으로 제조될 수 있다.
적합한 제형은 선택된 투여 루트에 따라 결정된다. 예를 들어, 본 발명에서는 화학식 1의 화합물을 목적하는 바에 따라 주사용 제제 또는 경구용 제제 등으로 제형화시켜 사용할 수 있다.
주사용 제제에 있어서, 본 발명의 성분을 액상 용액, 바람직하게는 Hank 용액, Ringer 용액, 또는 생리 식염수 완충액과 같은 약리학적으로 적합한 완충액을 사용하여 제형화할 수 있다. 점막 투과 투여용으로는 통과할 배리어에 적합한 비침투성제가 제형에 사용된다. 그러한 비침투성제들은 당업계에 일반적으로 공지되어 있다.
경구용 제제는 활성 화합물을 당업계에 공지된 약제학적으로 허용되는 담체와 조합함으로써 용이하게 제조될 수 있다. 담체는 활성 화합물이 정제, 알약, 산제, 입제, 당제, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제형화될 수 있도록 작용한다. 경구용으로 바람직한 형태는 캅셀제, 정제, 환제, 산제 및 입제이며, 특히 캅셀제와 정제가 유용하다. 정제 및 환제는 장피제로 제조하는 것이 바람직하다. 경구용 제제를 제조함에 있어서, 본 발명에 따른 활성 화합물을 하나 이상의 부형제와 혼합하고, 경우에 따라 이러한 혼합물을 분쇄하고, 필요한 경우 적절한 보조제를 투여한 다음 과립의 혼합물로부터 정제 또는 담체 코어를 얻을 수 있다. 적절한 부형제로는 락토스, 수크로즈, 만니톨 또는 소르비톨과 같은 필러; 옥수수 녹말, 밀 녹말, 쌀 녹말, 감자 녹말, 젤라틴, 검, 트래거켄스, 메틸 셀룰로우즈, 히드록시프로필메틸-셀룰로우즈, 소듐 카르복시메틸 셀룰로우즈 또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)와 같은 셀룰로오즈계 물질을 들 수 있다. 필요한 경우, 가교 폴 리비닐 피롤리돈, 우뭇가사리, 알긴산, 알긴산 나트륨 또는 이들의 염과 같은 붕해제, 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제, 결합제 등의 담체가 첨가될 수도 있다.
경구에 사용될 수 있는 제약 준비물로는 젤라틴 및 글리콜 또는 소르비톨과 같은 가소제로 만들어진 부드러운 밀봉 캡슐 뿐만 아니라, 젤라틴으로 만들어져 밀어 고정하는 캡슐을 언급할 수 있다. 밀어 고정하는 캡슐은 락토오스와 같은 필러, 녹말과 같은 바인더, 및/또는 활석 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 활제와의 혼합물로서 활성 성분을 포함할 수 있다. 연질 캡슐에서, 활성 화합물은 지방산, 액체 파라핀, 액체 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 용제에 용해 또는 분산될 수 있으며, 안정화제가 포함될 수도 있다. 경구 투여를 위한 모든 조제들은 그러한 투여에 적합한 함량으로 되어 있어야 한다.
화합물은 주사, 예를 들어, 큰 환약 주사나 연속적인 주입에 의한 비경구 투입용으로 제형화될 수도 있다. 주사용 제형은, 예를 들어, 방부제를 부가한 앰플 또는 멀티-도스 용기에 의한 단위 용량 형태로 제공될 수 있다. 조성물은 유성 또는 액상 비히클상의 현탁액, 용액, 에멀션과 같은 형태를 취할 수 있으며, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형용 성분들을 포함할 수도 있다.
또한, 활성 성분은 사용전에 멸균 무 발열물질의 물과 같은 적절한 비히클과 혼합되기 위한 분말의 형태일 수도 있다.
본 발명의 화합물은, 예를 들어, 코코아 버터나 글리세라이드와 같은 통상적인 좌약 기재를 포함하고 있는 좌약 또는 정체 관장과 같은 직장 투여용 조성물로 제형화될 수도 있다.
본 발명에 따라 사용하기에 적합한 약제 조성물에는 활성 성분이 그의 의도된 목적을 달성하기에 유효한 량으로 함유된다. 구체적으로, 치료적 유효량은 치료될 객체의 생존을 연장하거나, 질환의 증상을 방지, 경감 또는 완화시키는데 유효한 화합물의 양을 의미한다. 치료적 유효량의 결정은, 특히, 여기에 제공된 상세한 개시 내용 측면에서, 당업자의 능력 범위내에 있다.
단위 용량 형태로 제형화하는 경우, 활성성분으로서 화학식 1의 화합물은 약 0.1 내지 1,000 mg의 단위 용량으로 함유되는 것이 바람직하다. 화학식 1의 화합물의 투여량은 환자의 체중, 나이 및 질병의 특수한 성질과 심각성과 같은 요인에 따라 의사의 처방에 따라 결정된다. 그러나, 성인 치료에 필요한 투여량은 투여의 빈도와 강도에 따라 하루에 약 1 내지 1000 mg 범위가 보통이다. 성인에게 근육내 또는 정맥내 투여시 일회 투여량으로 분리하여 하루에 보통 약 1 내지 500 mg의 전체 투여량이면 충분할 것이나, 일부 환자의 경우 더 높은 일일 투여량이 바람직할 수 있다.
본 발명은 또한 화학식 1의 화합물을 유효량 사용하여 인간 PPARγ 관련 질병을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. “인간 PPARγ 관련 질병”이란 인간 PPARγ를 활성화시킴으로써 치료 내지 예방될 수 있는 질병으로서, 예를 들어, 당뇨병, 당뇨병 관련 합병증, 골다공증, 염증 등을 들 수 있지만, 그것만으로 한정되는 것은 아니다. 상기 당뇨병 관련 합병증의 예로는, 고지혈증, 동맥경화, 비만, 고혈압, 망막증, 신부전증 등을 들 수 있다. 상기 “치료”란 발병 증상을 보이는 객체에 사용될 때 질병의 진행을 중단 또는 지연시키는 것을 의미하며, 상기 “예 방”이란 발병 증상을 보이지는 않지만 그러한 위험성이 높은 객체에 사용될 때 발병 징후를 중단 또는 지연시키는 것을 의미한다.
이하, 본 발명을 하기 제조예, 실시예 및 실험예를 참조하여 상세히 설명하지만, 본 발명의 범위가 그것에 의해 한정되는 것은 아니다. 제조예에는 최종 화합물을 만들기 위한 중간체의 합성방법에 관한 내용이 기재되어 있고, 실시예에는 제조예의 화합물을 사용한 최종 화합물의 합성방법에 관한 내용이 기재되어 있으며, 실험예에서는 최종 화합물의 약리학적 활성을 확인하고 있다.
제조예 1: 1-(1-벤질-1H-인돌-3-일)-2- 브로모에탄온
(1) 1-(1-벤질-1H-인돌-3-일) 에탄온
1-(1H-인돌-3-일)에탄온 800mg(5.03mmol)을 다이클로로메탄에 녹인 후 분쇄한 소듐하이드록사이드 220mg(5.53mmol)을 신속하게 넣어주었다. 벤질 브로마이드 0.9㎖(7.56mmol)를 넣고 환류하며 5시간 교반해 주었다. 반응 종결 후 용매를 제거하고 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 표제 화합물 1g을 80% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 8.40~8.38(1H, m), 7.76(1H, s), 7.34~7.26(6H, m), 7.16~7.14(2H, m), 5.35(2H, s), 2.52(3H, s)
Mass(ESI) 250(M++1)
(2) 1-(1-벤질-1H-인돌-3-일)-2- 브로모에탄온
1-(1-벤질-1H-인돌-3-일)에탄온 572mg(2.29mmol)과 테트라부틸암모늄트리브로마이드 1.11g(2.29mmol)을 클로로포름 10㎖/메탄올3㎖에 녹이고 상온에서 12시간 교반하였다. 반응 종결 후 용매를 제거하고 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 표제 화합물 458mg을 61% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 8.38~8.36(1H, m), 7.87(1H, s), 7.37~7.26(6H, m), 7.18~7.16(2H, m), 5.37(2H, s), 4.30(2H, s)
Mass(ESI) 328, 330(M++1)
제조예 2: 에틸 (3- 하이드록시페녹시 ) 아세테이트
레솔시놀 550mg(5.0mmol)을 아세토나이트릴 용매에 녹인 후 에틸 브로모아세테이트 0.28㎖(2.5mmol) 및 세슘카보네이트 1.63g(5.0mmol)을 넣어주고 환류하며 2시간 교반해주었다. 반응 종결 후 에틸아세테이트로 세척하고, 여과하고, 여액의 용매를 증발시킨 후 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 표제 화합물 285mg을 58% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 7.13(1H, t, J=8.0Hz), 6.47(1H, m), 6.45(1H, m), 6.43(1H, m), 4.96(1H, bs), 4.59(2H, s), 4.27(2H, q, J=7.4Hz), 1.29(3H, t, J=7.4Hz)
Mass(ESI) 197(M++1)
제조예 3: 에틸 {3-[2-(1-벤질-1H-인돌-3-일)-2- 옥소에톡시 ] 페녹시 }아세테이트
1-(1-벤질-1H-인돌-3-일)-2-브로모에탄온 30mg(0.091mmol), 에틸 (3-하이드록시페녹시)아세테이트 18mg(0.091mmol) 및 세슘카보네이트 45mg(0.137mmol)을 아세토나이트릴에 녹인 후 제조예 2의 방법을 이용하여 표제 화합물 39mg을 98% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 8.43~8.41(1H, m), 8.09(1H, s), 7.36~7.26(6H, m), 7.17~7.13(3H, m), 6.57~6.55(1H, m), 6.54~6.52(1H, m), 6.51~6.48(1H, m), 5.34(2H, s), 4.99(2H, s), 4.56(2H, s), 4.25(2H, q, J=7.4Hz), 1.28(3H, t, J=7.4Hz)
Mass(ESI) 444(M++1)
제조예 4: 에틸 (3-{[(2Z)-2-(1-벤질-1H-인돌-3-일)-2-( 에톡시이미노 )에틸]옥시} 페녹시 )아세테이트
에틸 {3-[2-(1-벤질-1H-인돌-3-일)-2-옥소에톡시]페녹시}아세테이트 39mg(0.088mmol)을 메탄올에 잘 녹인 후 에틸옥시아민 하이드로클로라이드 9mg(0.097mmol) 및 소듐아세테이트 16mg(0.194mmol)를 넣고 10시간 상온에서 교반한 후 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 표제 화합물 31mg을 72% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 8.32~8.29(1H, m), 7.63(1H, s), 7.29~7.24(3H, m), 7.24~7.21(1H, m), 7.20~7.17(2H, m), 7.13(1H, m), 7.08~7.05(2H, m), 6.59~6.56(1H, m), 6.55(1H, m), 6.48~6.45(1H, m), 5.29(2H, s), 5.23(2H, s), 4.54(2H, s), 4.35(2H, q, J=7.4Hz), 4.24(2H, q, J=7.4Hz), 1.43(3H, t, J=7.4Hz), 1.27(3H, t, J=7.4Hz)
Mass(ESI) 487(M++1)
실시예 1: (3-{[(2Z)-2-(1-벤질-1H-인돌-3-일)-2-( 에톡시이미노 )에틸] 옥시 }페녹시)아세트산
Figure 112006097708719-PAT00017
에틸 (3-{[(2Z)-2-(1-벤질-1H-인돌-3-일)-2-(에톡시이미노)에틸]옥시}페녹시)아세테이트 31mg(0.064mmol)를 테트라하이드로퓨란:메탄올:1N NaOH(1:1:1)에 녹인 후 5시간 교반하였다. 1N HCl로 pH 2가 될 때까지 산성화시킨 후 에틸아세테이트로 추출하였다. 무수 소듐설페이트로 건조시킨 후 여과하여 표제 화합물 25mg을 85% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 8.32~8.29(1H, m), 7.62(1H, s), 7.28~7.13(7H, m), 7.07~7.04(2H, m), 6.62~6.59(1H, m), 6.55(1H, t, J=2.4Hz), 6.49~6.46(1H, m), 5.28(2H, s), 5.24(2H, s), 4.59(2H, s), 4.36(2H, q, J=7.4Hz), 1.43(3H, t, J=7.4Hz)
Mass(ESI) 459(M++1)
제조예 5: 메틸 (3- 에톡시 -5- 하이드록시페닐 )아세테이트
메틸 (3,5-다이하이드록시페닐)아세테이트 1 g(5.49 mmol)를 N,N-다이메틸포름아마이드에 녹여준 후 포타슘카보네이트 1.14 g(8.23 mmol)과 브로모에탄 0.2 ml(2.75 mmol)를 넣고 80℃로 가열해주며 3시간 동안 교반시켜 주었다. 에틸아세테이트와 물을 이용하여 추출을 실시하고 유기층을 분리하여 무수 마그네슘설페이트로 건조하고 용매를 날린 후 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 표제 화합물 364 mg을 32% 수율로 얻었다.
NMR: 1H-NMR(CDCl3) δ 6.39(1H, s), 6.35(1H, s), 6.30(1H, m), 5.20(1H, bs), 3.98(2H, q, J=6.8Hz), 3.69(3H, s), 3.51(2H, s), 1.38(3H, t, J=6.8Hz)
Mass(ESI) 210(M++1)
실시예 2: (3-{[(2Z)-2-(1-벤질-1H-인돌-3-일)-2-( 에톡시이미노 )에틸] 옥시 }- 5-에 톡시페 닐)아세트산
Figure 112006097708719-PAT00018
1-(1-벤질-1H-인돌-3-일)-2-브로모에탄온 30mg(0.091mmol), 메틸 (3-에톡시-5-하이드록시페닐)아세테이트 19mg(0.091mmol) 및 세슘카보네이트 45mg(0.137mmol)을 아세토나이트릴에 녹인 후 제조예 3, 제조예 4 및 실시예 1의 방법을 순차적으로 이용하여 표제 화합물 27mg을 61% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 8.32~8.29(1H, m), 7.62(1H, s), 7.31~7.15(6H, m), 7.08~7.04(2H, m), 6.45~6.41(3H, m), 5.27(2H, s), 5.21(2H, s), 4.34(2H, q, J=7.4Hz), 3.94(2H, q, J=7.4Hz), 3.52(2H, s), 1.42(3H, t, J=7.4Hz), 1.35(3H, t, J=7.4Hz)
Mass(ESI) 503(M++1)
제조예 6: 2- 브로모 -1-[1-(2- 페닐에틸 )-1H-인돌-3-일] 에탄온
(1) 1-[1-(2- 페닐에틸 )-1H-인돌-3-일] 에탄온
1-(1H-인돌-3-일)에탄온 500mg(3.14mmol)을 1,2-다이클로로에탄에 녹인 후 분쇄한 소듐하이드록사이드 188mg(4.71mmol)을 신속하게 넣어주었다. (2-브로모에틸)벤젠 0.65㎖(4.71mmol)를 넣고 환류하며 5시간 교반해 주었다. 반응 종결 후 용매를 제거하고 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 표제 화합물 467mg을 56% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 8.40~8.37(1H, m), 7.41(1H, s), 7.38~7.35(1H, m), 7.33~7.23(5H, m), 7.04~7.02(2H, m), 4.38(2H, t, J=7.3Hz), 3.14(2H, t, J=7.3Hz), 2.41(3H, s)
Mass(ESI) 264(M++1)
(2) 2- 브로모 -1-[1-(2- 페닐에틸 )-1H-인돌-3-일] 에탄온
1-[1-(2-페닐에틸)-1H-인돌-3-일]에탄온 467mg(1.8mmol)과 테트라부틸암모늄트리브로마이드 1.06g(2.2mmol)을 클로로포름 10㎖/메탄올 3㎖에 녹인 후 제조예 1-(2)의 방법을 이용하여 표제 화합물 160mg을 27% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 8.37~8.35(1H, m), 7.48(1H, s), 7.40~7.37(1H, m), 7.35~7.32(2H, m), 7.29~7.23(3H, m), 7.02~6.99(2H, m), 4.41(2H, t, J=7.3Hz), 4.16(2H, s), 3.15(2H, t, J=7.3Hz)
Mass(ESI) 342, 344(M++1)
실시예 3: [3-({(2Z)-2-( 에톡시이미노 )-2-[1-(2- 페닐에틸 )-1H-인돌-3-일]에틸} 옥시 ) 페닐 ]아세트산
Figure 112006097708719-PAT00019
2-브로모-1-[1-(2-페닐에틸)-1H-인돌-3-일]에탄온 80mg(0.23mmol), 메틸 (3-하이드록시페닐)아세테이트 42mg(0.25mmol) 및 세슘카보네이트 114mg(0.35mmol)을 아세토나이트릴에 녹인 후 제조예 3, 제조예 4 및 실시예 1의 방법을 순차적으로 이용하여 표제 화합물 10mg을 9% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 8.29(1H, d, J=8.0Hz), 7.40(1H, s), 7.29~7.16(7H, m), 7.04(2H, d, J=7.3Hz), 6.88~6.85(3H, m), 5.17(2H, s), 4.35~4.29(4H, m), 3.59(2H, s), 3.06(2H, t, J=7.4Hz), 1.41(3H, t, J=7.4Hz)
Mass(ESI) 457(M++1)
실시예 4: 3-({(2Z)-2-( 에톡시이미노 )-2-[1-(2- 페닐에틸 )-1H-인돌-3-일]에틸} 옥시 )벤조산
Figure 112006097708719-PAT00020
2-브로모-1-[1-(2-페닐에틸)-1H-인돌-3-일]에탄온 80mg(0.23mmol), 메틸 3-하이드록시벤조에이트 38mg(0.25mmol) 및 세슘카보네이트 114mg(0.35mmol)을 아세토나이트릴에 녹인 후 제조예 3, 제조예 4 및 실시예 1의 방법을 순차적으로 이용하여 표제 화합물 36mg을 48% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 8.28~8.25(1H, m), 7.68~7.59(2H, m), 7.31~7.28(1H, m), 7.27~7.12(7H, m), 7.00(1H, m), 6.94(2H, m), 5.11(2H, s), 4.30~4.27(2H, m), 4.19(2H, m), 2.97(2H, m), 1.37~1.33(3H, m)
Mass(ESI) 443(M++1)
제조예 7: 2- 브로모 -1-{1-[4-( 트리플루오로메틸 )벤질]-1H-인돌-3-일} 에탄온
(1) 1-( 브로모메틸 )-4-( 트리플루오로메틸 )벤젠
[4-(트리플루오로메틸)페닐]메탄올 350mg(2.0mmol)을 다이클로로메탄에 녹인 후 포스포러스 트리브로마이드 0.1㎖(1.20mmol)를 넣고 1시간 교반해 주었다. 반응 종결 후 용매를 최대한 제거한 후 다이에틸이써와 물로 추출하였다. 분리한 유기층 을 무수 마그네슘설페이트를 사용하여 건조시키고 여과한 다음 용매를 제거하여 표제 화합물 450mg을 94% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 7.64~7.59(2H, dd, J=15.3Hz, 8.0Hz), 7.51~7.48(2H, t, J=8.0Hz), 5.14(1H, m), 4.49(1H, s)
Mass(ESI) 239, 241(M++1)
(2) 1-{1-[4-( 트리플루오로메틸 )벤질]-1H-인돌-3-일} 에탄온
1-(1H-인돌-3-일)에탄온 200mg(1.25mmol), 분쇄한 소듐하이드록사이드 75mg(1.88mmol) 및 1-(브로모메틸)-4-(트리플루오로메틸)벤젠 450mg(1.88mmol)를 제조예 1-(1)의 방법에 따라 반응시켜 표제 화합물 127mg을 32% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 8.42~8.40(1H, d, J=8.0Hz), 7.78(1H, s), 7.59(2H, d, J=8.0Hz), 7.33~7.22(5H, m), 5.43(2H, s), 2.54(3H, s)
Mass(ESI) 318(M++1)
(3) 2- 브로모 -1-{1-[4-( 트리플루오로메틸 )벤질]-1H-인돌-3-일} 에탄온
1-{1-[4-(트리플루오로메틸)벤질]-1H-인돌-3-일}에탄온 127mg(0.40mmol)과 테트라부틸암모늄트리브로마이드 231mg(0.48mmol)을 클로로포름 5㎖/메탄올 1.5㎖에 녹인 후 제조예 1-(2)의 방법을 이용하여 표제 화합물 80mg을 51% 수율로 얻었 다.
1H-NMR(CDCl3) δ 8.39~8.37(1H, d, J=8.0Hz), 7.90(1H, s), 7.59(2H, d, J=8.0Hz), 7.36~7.23(5H, m), 5.44(2H, s), 4.30(2H, s)
Mass(ESI) 396, 398(M++1)
실시예 5: (3-{[(2Z)-2-( 에톡시이미노 )-2-{1-[4-( 트리플루오로메틸 )벤질]-1H-인돌-3-일}에틸] 옥시 } 페닐 )아세트산
Figure 112006097708719-PAT00021
2-브로모-1-{1-[4-(트리플루오로메틸)벤질]-1H-인돌-3-일}에탄온 80mg(0.20mmol), 메틸 (3-하이드록시페닐)아세테이트 37mg(0.22mmol) 및 세슘카보네이트 98mg(0.30mmol)을 아세토나이트릴에 녹인 후 제조예 3, 제조예 4 및 실시예 1의 방법을 순차적으로 이용하여 표제 화합물 16mg을 16% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 8.32~8.30(1H, m), 7.58(1H, s), 7.45(2H, m), 7.20~7.15(2H, m), 7.13~7.08(2H, m), 7.04(2H, m), 6.82(1H, s), 6.78~6.77(2H, m), 5.22(2H, s), 5.19(2H, s), 4.33(2H, q, J=7.4Hz), 3.47(2H, s), 1.39(3H, t, J=7.4Hz)
Mass(ESI) 511(M++1)
제조예 8: 2- 브로모 -1-{1-[(5- 메틸아이소옥사졸 -3-일) 메틸 ]-1H-인돌-3-일} 에탄온
(1) 3-( 브로모메틸 )-5- 메틸아이소옥사졸
(5-메틸아이소옥사졸-3-일)메탄올 100mg(0.88mmol)과 포스포러스 트리브로마이드 82㎕(0.88mmol)를 제조예 7-(1)의 방법에 따라 반응시켜 표제 화합물 140mg을 90% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 6.07(1H, s), 4.36(2H, s), 2.41(3H, s)
Mass(ESI) 176, 178(M++1)
(2) 1-{1-[(5- 메틸아이소옥사졸 -3-일) 메틸 ]-1H-인돌-3-일} 에탄온
1-(1H-인돌-3-일)에탄온 140mg(0.88mmol), 분쇄한 소듐하이드록사이드 52mg(1.32mmol) 및 3-(브로모메틸)-5-메틸아이소옥사졸 155mg(0.88mmol)를 제조예 1-(1)의 방법에 따라 반응시켜 표제 화합물 58mg을 26% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 8.41~8.36(1H, m), 7.79(1H, s), 7.42~7.38(1H, m), 7.33~7.27(2H, m), 5.74(1H, s), 5.34(2H, s), 2.52(3H, s), 2.35(3H, s)
Mass(ESI) 255(M++1)
(3) 2- 브로모 -1-{1-[(5- 메틸아이소옥사졸 -3-일) 메틸 ]-1H-인돌-3-일} 에탄온
1-{1-[(5-메틸아이소옥사졸-3-일)메틸]-1H-인돌-3-일}에탄온 58mg(0.23mmol)과 테트라부틸암모늄트리브로마이드 135mg(0.28mmol)을 클로로포름 2㎖/메탄올 0.6㎖에 녹인 후 제조예 1-(2)의 방법을 이용하여 표제 화합물 28mg을 37% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 8.37~8.34(1H, m), 7.92(1H, s), 7.43~7.41(1H, m), 7.36~7.33(2H, m), 5.76(1H, s), 5.38(2H, s), 4.30(2H, s), 2.36(3H, s)
Mass(ESI) 333, 335(M++1)
실시예 6: (3-{[(2Z)-2-( 에톡시이미노 )-2-{1-[(5- 메틸아이소옥사졸 -3-일) 메틸 ]-1H-인돌-3-일}에틸] 옥시 } 페닐 )아세트산
Figure 112006097708719-PAT00022
2-브로모-1-{1-[(5-메틸아이소옥사졸-3-일)메틸]-1H-인돌-3-일}에탄온 28mg(0.084mmol), 메틸 (3-하이드록시페닐)아세테이트 14mg(0.084mmol) 및 세슘카보네이트 42mg(0.13mmol)을 아세토나이트릴에 녹인 후 제조예 3, 제조예 4 및 실시예 1의 방법을 순차적으로 이용하여 표제 화합물 10mg을 27% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 8.30~8.28(1H, m), 7.63(1H, s), 7.32~7.30(1H, m), 7.26~7.19(4H, m), 6.92(1H, s), 6.90~6.85(2H, m), 5.27(2H, s), 5.24(2H, s), 4.35(2H, q, J=7.4Hz), 3.59(2H, s), 2.27(3H, s), 1.41(3H, t, J=7.4Hz)
Mass(ESI) 448(M++1)
제조예 9: 1-(1-벤질-5- 메톡시 -1H-인돌-3-일)-2- 브로모에탄온
(1) 1-(1-벤질-5- 메톡시 -1H-인돌-3-일) 에탄온
1-(5-메톡시-1H-인돌-3-일)에탄온 148mg(0.78mmol), 분쇄한 소듐하이드록사이드 47mg(1.17mmol) 및 벤질 브로마이드 0.14㎖(1.17mmol)를 제조예 1-(1)의 방법에 따라 반응시켜 표제 화합물 175mg을 80% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 7.91(1H, d, J=2.5Hz), 7.70(1H, s), 7.36~7.29(3H, m), 7.16~7.13(3H, m), 6.88(1H, dd, J=8.6Hz, 2.5Hz), 5.32(2H, s), 3.89(3H, s), 2.49(3H, s)
Mass(ESI) 280(M++1)
(2) 1-(1-벤질-5- 메톡시 -1H-인돌-3-일)-2- 브로모에탄온
1-(1-벤질-5-메톡시-1H-인돌-3-일)에탄온 175mg(0.63mmol)과 테트라부틸암모늄트리브로마이드 366mg(0.76mmol)을 클로로포름 2㎖/메탄올 0.6㎖에 녹인 후 제조예 1-(2)의 방법을 이용하여 표제 화합물 70mg을 31% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 7.88(1H, d, J=2.5Hz), 7.51(1H, s), 7.36~7.26(3H, m), 7.17~7.14(3H, m), 6.91(1H, m), 5.30(2H, s), 4.27(2H, s), 3.89(3H, s)
Mass(ESI) 359(M++1)
실시예 7: (3-{[(2Z)-2-(1-벤질-5- 메톡시 -1H-인돌-3-일)-2-( 에톡시이미노 )에틸] 옥시 } 페닐 )아세트산
Figure 112006097708719-PAT00023
1-(1-벤질-5-메톡시-1H-인돌-3-일)-2-브로모에탄온 70mg(0.20mmol), 메틸 (3-하이드록시페닐)아세테이트 33mg(0.20mmol) 및 세슘카보네이트 98mg(0.30mmol)을 아세토나이트릴에 녹인 후 제조예 3, 제조예 4 및 실시예 1의 방법을 순차적으 로 이용하여 표제 화합물 5mg을 6% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 7.84(1H, d, J=2.5Hz), 7.61(1H, s), 7.28~7.24(4H, m), 7.20(1H, m), 7.09(1H, d, J=9.2Hz), 7.05~7.03(2H, m), 6.87~6.82(3H, m), 5.24(2H, s), 5.23(2H, s), 4.33(2H, q, J=7.4Hz), 3.85(3H, s), 3.58(2H, s), 1.43(3H, t, J=7.4Hz)
Mass(ESI) 473(M++1)
실시예 8: 3-{[(2Z)-2-(1-벤질-1H-인돌-3-일)-2-( 에톡시이미노 )에틸] 옥시 }벤조산
Figure 112006097708719-PAT00024
1-(1-벤질-1H-인돌-3-일)-2-브로모에탄온 60mg(0.18mmol)과 메틸 3-하이드록시벤조에이트 28mg(0.18mmol)로부터 제조예 3, 제조예 4 및 실시예 1의 방법을 순차적으로 이용하여 표제 화합물 10mg을 32% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 8.32~8.30(1H, m), 7.71~7.70(1H, m), 7.69~7.67(1H, m), 7.63(1H, s), 7.34~7.31(1H, m), 7.28~7.22(4H, m), 7.19~7.17(2H, m), 7.15~7.13(1H, m), 7.08~7.06(2H, m), 5.32(2H, s), 5.30(2H, s), 4.38(2H, q, J=7.4Hz), 1.45(3H, t, J=7.4Hz)
Mass(ESI) 429(M++1)
제조예 10: 1-[2- 메틸 -1- 페닐 -1H-인돌-3-일]-2- 브로모에탄온
(1) 1-[2- 메틸 -1- 페닐 -1H-인돌-3-일]- 에탄온
1,1-다이페닐하이드라진 하이드로클로라이드 1.1g(5.0mmol)과 아세토아세톤 0.50g(5.0mmol)을 아세트산 50㎖에 녹이고 12시간 환류 하에 교반하였다. 용매를 제거하고 메탄올/물(1/5)에서 재결정하여 하이드라존 중간체를 필터하여 얻었다. 중간체를 촉매량의 p-톨루엔설포닉산과 함께 톨루엔에서 환류 하에 12시간 교반하고 용매를 제거한 후 칼럼 크로마토그래피로 분리하여 표제화합물 0.30g을 24% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 8.06(1H, d, J=8.0Hz), 7.60~7.52(3H, m), 7.33~7.27(3H, m), 7.16(1H, t, J=7.4Hz), 7.02(1H, d, J=8.5Hz), 2.73(3H, s), 2.58(3H, s)
Mass(ESI) 250(M++1)
(2) 1-[2- 메틸 -1- 페닐 -1H-인돌-3-일]-2- 브로모에탄온
1-[2-메틸-1-페닐-1H-인돌-3-일]-에탄온 30mg(0.13mmol)을 제조예 1-(2)의 방법에 따라 반응시켜 표제 화합물 10mg을 24% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 7.97(1H, d, J=8.0Hz), 7.60~7.57(3H, m), 7.33~7.31(3H, m), 7.19(1H, t, J=7.4Hz), 7.03(1H, d, J=8.5Hz), 4.55(2H, s), 2.58(3H, s)
Mass(ESI) 329(M++1)
실시예 9: 3-{[(2Z)-2-( 에톡시이미노 )-2-(2- 메틸 -1- 페닐 -1H-인돌-3-일)에틸]옥시}벤조산
Figure 112006097708719-PAT00025
1-[1-페닐-1H-인돌-3-일]-2-브로모에탄온 10mg(0.030mmol)으로부터 제조예 3, 제조예 4 및 실시예 1의 방법을 순차적으로 이용하여 표제 화합물 8.0mg을 62% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 7.70(1H, d, J=7.9Hz), 7.65~7.62(1H, m), 7.52~7.49(3H, m), 7.46~7.43(1H, m), 7.30~7.26(2H, m), 7.20~7.17(1H, m), 7.12~7.10(1H, m), 7.10~7.06(1H, m), 7.02~6.98(2H, m), 5.35(2H, s), 4.38(2H, q, J=7.4Hz), 2.24(3H, s), 1.42(3H, t, J=7.4Hz)
Mass(ESI) 429(M++1)
제조예 11: 1-[1-(4- 플루오로벤질 )-1H-인돌-3-일]-2- 브로모에탄온
1-(1H-인돌-3-일)에탄온 160mg(1.0mmol)을 제조예 1의 방법에 따라 반응시켜 표제 화합물 80mg을 23% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 8.38~8.36(1H, m), 7.85(1H, s), 7.35~7.28(3H, m), 7.16~7.14(2H, m), 7.06~7.02(2H, m), 5.34(2H, s), 4.29(2H, s)
Mass(ESI) 347(M++1)
실시예 10: 3-({(2Z)-2-( 에톡시이미노 )-2-[1-(4- 플루오로벤질 )-1H-인돌-3-일]-에틸} 옥시 )벤조산
Figure 112006097708719-PAT00026
1-[1-(4-플루오로벤질)-1H-인돌-3-일]-2-브로모에탄온 80mg(0.23mmol)으로부터 제조예 3, 제조예 4 및 실시예 1의 방법을 순차적으로 이용하여 표제 화합물 36mg을 15% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 8.32~8.30(1H, m), 7.71~7.67(2H, m), 7.61(1H, s), 7.34~7.31(1H, m), 7.21~7.18(3H, m), 7.16~7.13(1H, m), 7.05~7.02(2H, m), 6.98~6.94(2H, m), 5.32(2H, s), 5.26(2H, s), 4.38(2H, q, J=7.4Hz), 1.45(3H, t, J=7.4Hz)
Mass(ESI) 447(M++1)
제조예 12: 메틸 3- 하이드록시 -5- 아이소프로폭시벤조에이트
메틸 3,5-다이하이드록시벤조에이트 0.63g(3.8mmol)을 테트라하이드로퓨란 10㎖에 녹인 후 소듐하이드라이드 0.15g(60%, 3.8mmol)을 상온에서 교반하면서 천천히 넣어주었다. 30 분후 이 용액에 아이소프로필브로마이드 0.35㎖(3.8mmol)을 적가한 후 60℃에서 5 시간 동안 교반하였다. 포화 암모늄클로라이드 수용액 20㎖를 부어주고 에틸아세테이트로 추출하고 무수 마그네슘설페이트로 건조시킨 후 여과하였다. 용매제거 후 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 표제 화합물 0.30g을 38% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 7.15~7.14(1H, m), 7.08(1H, brs), 6.59~6.58(1H, m), 5.24(1H, brs), 4.60~4.54(1H, m), 3.89(3H, s), 1.35(6H, d, J=7Hz)
Mass(ESI) 211(M++1)
실시예 11: 3-{[(2Z)-2-(1-벤질-1H-인돌-3-일)-2-( 에톡시이미노 )에틸] 옥시 }-5-아 이소프로폭시벤조 산
Figure 112006097708719-PAT00027
1-(1-벤질-1H-인돌-3-일)-2-브로모에탄온 33mg(0.10mmol)과 메틸 3-하이드록시-5-아이소프로폭시벤조에이트 21mg(0.10mmol)로 부터 제조예 3, 제조예 4 및 실시예 1의 방법을 순차적으로 이용하여 표제 화합물 16mg을 34% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 8.32~8.30(1H, m), 7.63(1H, s), 7.31~7.24(5H, m), 7.21~7.18(3H, m), 7.09~7.07(2H, m), 6.74~6.72(1H, m), 5.30(2H, s), 5.28(2H, s), 4.37(2H, q, J=7.4Hz), 1.45(3H, t, J=7.4Hz)
Mass(ESI) 489(M++1)
제조예 13: 메틸 {3-[2-(1-벤질-1H-인돌-3-일)-2- 옥소에톡시 ] 페닐 }아세테이트
1-(1-벤질-1H-인돌-3-일)-2-브로모에탄온 40mg(0.12mmol)과 메틸 3-하이드록시페닐 아세테이트 20mg(0.12mmol)로부터 제조예 3의 방법을 이용하여 표제 화합물 50mg을 99% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 8.44~8.42(1H, m), 8.13(1H, s), 7.34~7.30(5H, m), 7.28~7.26(1H, m), 7.23~7.21(1H, m), 7.14~7.12(2H, m), 6.89~6.81(3H, m), 5.34(2H, s), 5.00(2H, s), 3.64(3H, s), 3.57(2H, s)
Mass(ESI) 414(M++1)
실시예 12: (3-{[(2Z)-2-(1-벤질-1H-인돌-3-일)-2-( 에톡시이미노 )에틸] 옥시 }페닐)아세트산
Figure 112006097708719-PAT00028
메틸 {3-[2-(1-벤질-1H-인돌-3-일)-2-옥소에톡시]페닐}아세테이트 30mg(0.073mmol)로부터 제조예 4와 실시예 1의 방법을 순차적으로 이용하여 표제 화합물 19mg을 60% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 8.32~8.30(1H, m), 7.63(1H, s), 7.28~7.17(7H, m), 7.07~7.04(2H, m), 6.87~6.84(3H, m), 5.27(2H, s), 5.24(2H, s), 4.35(2H, q, J=7.4Hz), 3.57(2H, s), 1.42(3H, t, J=7.4Hz)
Mass(ESI) 443(M++1)
실시예 13: (3-{[(2Z)-2-(1-벤질-1H-인돌-3-일)-2-( 프로폭시이미노 )에틸] 옥시 } 페닐 )아세트산
Figure 112006097708719-PAT00029
메틸 {3-[2-(1-벤질-1H-인돌-3-일)-2-옥소에톡시]페닐}아세테이트 16mg(0.039mmol)와 프로필옥시아민 하이드로클로라이드 4.7mg(0.043mmol)로부터 제조예 4와 실시예 1의 방법을 순차적으로 이용하여 표제 화합물 12mg을 67% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 8.31~8.29(1H, m), 7.63(1H, s), 7.28~7.16(7H, m), 7.07~7.04(2H, m), 6.88~6.84(3H, m), 5.27(2H, s), 5.25(2H, s), 4.25(2H, q, J=7.4Hz), 3.58(2H, s), 1.86~1.81(2H, m), 1.03(3H, t, J=7.4Hz)
Mass(ESI) 457(M++1)
제조예 14: 1-[1-(3- 클로로벤질 )-1H-인돌-3-일]-2- 브로모에탄온
1-(1H-인돌-3-일)에탄온 320mg(2.0mmol)와 3-클로로벤질 브로마이드 0.63g(2.0mmol)로부터 제조예 1의 방법을 이용하여 표제 화합물 250mg을 34% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 8.38~8.37(1H, m), 7.88(1H, s), 7.55~7.27(5H, m), 7.17(1H, brs), 7.01~7.00(1H, m), 5.35(2H, s), 4.32(2H, s)
Mass(ESI) 363(M++1)
실시예 14: (3-{[(2Z)-2-[1-(3- 클로로벤질 )-1H-인돌-3-일]-2-( 에톡시이미노 )에틸] 옥시 } 페닐 )아세트산
Figure 112006097708719-PAT00030
1-[1-(4-클로로벤질)-1H-인돌-3-일]-2-브로모에탄온 30mg(0.083mmol)과 메틸 3-하이드록시페닐아세테이트 14mg(0.083mmol)로부터 제조예 3, 제조예 4 및 실시예 1의 방법을 순차적으로 이용하여 표제 화합물 6.0mg을 15% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 8.31~8.29(1H, m), 7.51(1H, s), 7.17~7.13(3H, m), 7.10~7.03(3H, m), 6.97(1H, s), 6.80~6.67(4H, m), 5.13(2H, s), 5.02(2H, s), 4.29(2H, q, J=7.4Hz), 3.39(2H, s), 1.36(3H, t, J=7.4Hz)
Mass(ESI) 478(M++1)
제조예 15: 1-{1-[3-( 트라이플루오로메틸 )벤질]-1H-인돌-3-일}-2- 브로모에탄온
1-(1H-인돌-3-일)에탄온 320mg(2.0mmol)와 3-(트라이플루오로메틸)벤질 브로마이드 0.72g(2.0mmol)로부터 제조예 1의 방법을 이용하여 표제 화합물 260mg을 33% 수율로 얻었다
1H-NMR(CDCl3) δ 8.39~8.37(1H, m), 7.90(1H, s), 7.60~7.58(1H, m), 7.50(1H, s), 7.47~7.44(1H, m), 7.36~7.33(1H, m), 7.32~7.24(3H, m), 5.44(2H, s), 4.31(2H, s)
Mass(ESI) 397(M++1)
실시예 15: (3-{[(2Z)-2-( 에톡시이미노 )-2-{1-[3-( 트라이플루오로메틸 )벤질]-1H-인돌-3-일}에틸] 옥시 } 페닐 )아세트산
Figure 112006097708719-PAT00031
1-{1-[3-(트라이플루오로메틸)벤질]-1H-인돌-3-일}-2-브로모에탄온 30mg(0.076mmol)과 메틸 3-하이드록시페닐아세테이트 13mg(0.076mmol)로부터 제조예 3, 제조예 4 및 실시예 1의 방법을 순차적으로 이용하여 표제 화합물 12mg을 31% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 8.33~8.31(1H, m), 7.62(1H, s), 7.52~7.50(1H, m), 7.45(1H, s), 7.36~7.32(1H, m), 7.21~7.17(4H, m), 7.11~7.09(1H, m), 6.87~6.84(3H, m), 5.31(2H, s), 5.24(2H, s), 4.36(2H, q, J=7.4Hz), 3.57(2H, s), 1.42(3H, t, J=7.4Hz)
Mass(ESI) 511(M++1)
제조예 16: 1-(1- 헥실 -1H-인돌-3-일)-2- 브로모에탄온
1-(1H-인돌-3-일)에탄온 320mg(2.0mmol)와 헥실브로마이드 0.33g(2.0mmol)로부터 제조예 1의 방법을 이용하여 표제 화합물 95mg을 15% 수율로 얻었다
1H-NMR(CDCl3) δ 8.36~8.34(1H, m), 7.85(1H, s), 7.38~7.36(1H, m), 7.34~7.31(2H, m), 4.31(2H, s), 4.17(2H, t, J=7.4Hz), 1.91~1.86(2H, m), 1.35~1.29(6H, m), 0.88(3H, t, J=6.7Hz)
Mass(ESI) 323(M++1)
실시예 16: 3-{[(2Z)-2-( 에톡시이미노 )-2-(1- 헥실 -1H-인돌-3-일)-에틸] 옥시 }벤조산
Figure 112006097708719-PAT00032
1-(1-헥실-1H-인돌-3-일)-2-브로모에탄온 20mg(0.062mmol)로부터 제조예 3, 제조예 4 및 실시예 1의 방법을 순차적으로 이용하여 표제 화합물 19mg을 74% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 8.30~8.28(1H, m), 7.77~7.76(1H, m), 7.70~7.68(1H, m), 7.59(1H, s), 7.36~7.32(1H, m), 7.31~7.29(1H, m), 7.25~7.21(2H, m), 7.19~7.16(1H, m), 5.33(2H, s), 4.38(2H, q, J=7.4Hz), 4.09(2H, t, J=7.4Hz), 1.81~1.79(2H, m), 1.42(3H, t, J=7.4Hz) 1.28~1.22(6H, m), 0.85(3H, t, J=6.7Hz)
Mass(ESI) 423(M++1)
제조예 17: 1-[1-(2- 메틸설포닐에틸 )-1H-인돌-3-일]-2- 브로모에탄온
(1) 1-[1-(2- 메틸싸이오에틸 )-1H-인돌-3-일] 에탄온
1-(1H-인돌-3-일)에탄온 320mg(2.0mmol)과 1-클로로-2-(메틸싸이오)에탄 220mg(2.0mmol)로부터 제조예 1-(1)의 방법을 이용하여 표제화합물 240mg을 50% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 8.39~8.37(1H, m), 7.81(1H, s), 7.37~7.34(1H, m), 7.32~7.29(3H, m), 4.37(2H, t, J=6.7Hz), 2.94(2H, t, J=6.7Hz), 2.54(3H, s), 2.01(3H, s)
Mass(ESI) 224(M++1)
(2) 1-[1-(2- 메틸설포닐에틸 )-1H-인돌-3-일] 에탄온
1-[1-(2- 메틸싸이오에틸 )-1H-인돌-3-일] 에탄온 240mg(1.0mmol)을 메탄올/물(1/1) 10㎖에 녹이고 옥손 1.8g(3.0mmol)을 넣어주고 12시간 교반한 다음 에틸아세테이트로 추출하였다. 무수 소듐설페이트로 건조시키고 여과하여 용매를 제거한 후 칼럼 크로마토그래피로 분리하여 표제 화합물 100mg을 38% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 8.42~8.40(1H, m), 7.84(1H, s), 7.37~7.32(3H, m), 4.74(2H, t, J=6.4Hz), 3.55(2H, t, J=6.4Hz), 2.59(3H, s), 2.54(3H, s)
Mass(ESI) 266(M++1)
(3) 1-[1-(2- 메틸설포닐에틸 )-1H-인돌-3-일]-2- 브로모에탄온
1-[1-(2-메틸설포닐에틸)-1H-인돌-3-일]에탄온 100mg(0.38mmol)로부터 제조예 1-(2)의 방법을 이용하여 표제화합물 40mg을 31% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 8.41~8.40(1H, m), 7.98(1H, s), 7.40~7.38(3H, m), 4.77(2H, t, J=6.4Hz), 4.30(2H, s), 3.56(2H, t, J=6.4Hz), 2.76(3H, s)
Mass(ESI) 345(M++1)
실시예 17: (3-{[(2Z)-2-( 에톡시이미노 )-2-{1-[1-(2-( 메틸설포닐에틸 )-1H-인돌-3-일}에틸] 옥시 } 페닐 )아세트산
Figure 112006097708719-PAT00033
1-[1-(2- 메틸설포닐에틸 )-1H-인돌-3-일]-2- 브로모에탄온 40mg(0.12mmol)과 메틸 3-하이드록시페닐아세테이트 14mg(0.12mmol)로부터 제조예 3, 제조예 4 및 실시예 1의 방법을 순차적으로 이용하여 표제 화합물 12mg을 23% 수율로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) δ 8.31~8.29(1H, m), 7.67(1H, s), 7.31~7.27(2H, m), 7.23~7.18(2H, m), 6.97(1H, S), 6.90~6.83(2H, m), 5.29(2H, s), 4.61(2H, t, J=6.7Hz), 4.36(2H, q, H=7.4Hz), 3.59(2H, s), 2.26(3H, s), 1.43(3H, t, J=7.4Hz)
Mass(ESI) 459(M++1)
실시예 18: (2-{[(2Z)-2-(1-벤질-1H-인돌-3-일)-2-( 에톡시이미노 )에틸] 옥시 }페닐)아세트산
Figure 112006097708719-PAT00034
1-(1-벤질-1H-인돌-3-일)-2-브로모에탄온 33mg(0.10mmol)과 메틸 2-하이드록시페닐아세테이트 17mg(0.10mmol)로부터 제조예 3, 제조예 4 및 실시예 1의 방법을 순차적으로 이용하여 표제 화합물 20mg을 45% 수율로 얻었다
1H-NMR(CDCl3) δ 8.31~8.29(1H, m), 7.62(1H, s), 7.29~7.26(2H, m), 7.23~7.20(4H, m), 7.17~7.09(3H, m), 7.00~6.98(1H, m), 6.96~6.89(1H, m), 5.26(2H, s), 5.21(2H, s), 4.35(2H, q, J=7.4Hz), 3.51(2H, s), 1.41(3H, t, J=7.4Hz)
Mass(ESI) 443(M++1)
실험예 1: GAL4 전사 인자 응답 서열하에 루시페라제 구조 유전자를 배치한 리포터 벡터의 구축
기본 단위(UAS)를 반복하여 8 회 갖고 있으며, 5’말단에 제한효소 MluI 부위와 3’말단에 제한효소 HindIII 부위를 갖는 GAL4 응답 서열: 5'-GTGCAGGTGCCAGAACATTT CTCTATCGAT AGG TA (CTCGGAGGACAGTACTCCG) TA (CTCGGAGGACAGTACTCCG) TA (CTCGGAGGACAGTACTCCG) TA (CTCGGAGGACAGTACTCCG) TA (CTCGGAGGACAGTACTCCG) (CTCGGAGGACAGTACTCCG) (CTCGGAGGACAGTACTCCG) (CTCGGAGGACAGTACTCCG) TA CCGTCGACTT TAGAGGGTAT AT-3'(괄호 안의 염기서열은 기본단위 UAS를 나타낸다)을 DNA 합성기로 합성하여 플라스미드 pGL3-Basic (Promega사, Cat. No. E1751) 다중 제한효소 인지 부위내의 MluI - HindIII 부위에 삽입하였다. 그 결과, 8×UAS에 이어서 루시페라제 구조 유전자를 배치한 pGL3-GAL4 벡터를 구축하였다.
실험예 2: GAL4 단백질과 PPAR 단백질내 리간드 결합 부위와의 융합 단백질을 발현하는 발현 벡터의 구축
Invitrogen사의 포유동물세포발현 벡터 pZeoSV (Cat. No. V85001)를 기본 벡 터로서 이용하여 구조 유전자로서 GAL4의 DNA 결합부위와 PPAR의 리간드 결합부위가 융합된 단백질이 SV40 프로모터 지배하에 발현되는 벡터를 구축하였다.
(1) GAL4 전사 인자의 DNA 결합부위를 암호화하는 cDNA의 증폭 및 발현 벡터로의 삽입.
효모의 기본 전사 인자 GAL4 단백질의 DNA 결합부위를 증폭하기 위하여 다음과 같은 시발체를 DNA 합성기를 이용하여 합성하였다: 시발체 GAL4-HIII(5'-GC AAGCTT GAAGCAAGCCTCCTGAAAG ATG AAG CTA CTG TCT TCT ATC GAA C-3')는 GAL4의 DNA 결합부위 아미노 말단측 1 번째에서부터 8 번째까지의 아미노산을 코드하는 유전자를 포함하고 동시에 제한효소 HindIII 인지부위를 포함한다. 시발체 GAL4-KI(5'-AA GGTACC GGT AAA TTC CGG CGA TAC AGT CAA CTG TCT TTG A-3')은 GAL4의 DNA 결합영역 카복시 말단측 141 번째에서부터 147 번째까지의 아미노산을 코드하는 유전자를 포함하고 동시에 제한효소 KpnI 인지부위를 포함한다. 반응튜브에 시발체 GAL4-HIII 2㎍과 시발체 GAL4-KI 2㎍을 넣은 다음, 주형으로 플라스미드 pGBT9(Clonetech사, Cat. No. K1605-A) 10ng, 10㎕의 10 배 중합완충용액(50 mM KCl, 100 mM Tris-HCl, pH 9.0, 1% Triton X-100, 2.5 mM MgCl2), 10㎕의 2 mM dNTP(각 2mM dGTP, 2mM dATP, 2mM dCTP 및 2mM dTTP), 2.5 단위체 Taq 중합효소와 증류수를 가하여 총 부피를 100㎕로 한 후 95℃에서 40 초(denaturation), 55℃에서 30 초(annealing), 72℃에서 1 분(polymerization)의 조건으로 25 회 PCR을 실 시하였다. 상기에서 얻은 PCR 산물을 2% 아가로오스겔에서 분리한 결과 약 488 염기쌍의 핵산이 증폭되었음을 확인하였고, 동일조건의 아가로오스겔로부터 분리 정제하였다. 상기에서 분리 정제한 핵산을 제한효소 HindIII와 KpnI으로 NEB 완충용액 2(50mM NaCl, 10mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 1mM 디티오트레이톨(dithiothreitol)(pH 7.9))의 조건에서 완전 절단한 후, 이들을 페놀/클로로포름으로 추출하여(이하, 이 단편을 ‘단편 GAL4-H/K’라 칭한다) 20㎕의 TE(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0) 용액에 용존하였다.
한편, 플라스미드 pZeoSV 2㎍을 제한효소 HindIII와 KpnI으로 NEB 완충용액 2의 조건하에서 완전 절단한 후, 1% 아가로오스겔로 약 3.5kb의 핵산 단편을 분리 정제하였다. 이하, 이 단편을 ‘단편 pZeoSV-H/K’라 칭한다.
접합반응 튜브에 상기에서 얻은 100ng의 ‘단편 GAL4-H/K’와 100ng의 ‘단편 pZeoSV-H/K’를 넣은 다음, 2㎕의 10 배 접합반응용액(50 mM Tris-HCl(pH 7.8), 10mM MgCl2, 10mM 디티오트레이톨, 1mM ATP, 25㎍/㎖ 소혈청 알부민)과 10 단위체의 T4 DNA 리가제를 넣고, 총 부피가 20㎖가 되도록 증류수를 가하여, 12 시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤 대장균 HB101(ATCC 33694)에 형질전환시켜, 단편 GAL4의 DNA 결합부위를 함유한 플라스미드 pZeo-GAL을 얻었다 (도 1 참조).
(2) 인간 PPAR γ 리간드 결합부위를 암호화하는 DNA 단편의 획득 및 GAL4 -인간 PPAR γ 키메라 수용체 단백질 발현 벡터의 구축
인간 PPARγ 유전자의 염기서열 정보(유전자 은행 번호, NM_015869)로부터 다음과 같은 시발체를 합성하였다. 시발체 GLBD-f (5'-GG GGTACC TCT CAT AAT GCC ATC AGG TTT GGG CGG ATG C -3')는 인간 PPARγ 유전자의 Ser176에서부터 Met185을 코드하는 유전자를 포함하고, 동시에 제한효소 KpnI 인식부위를 포함하고 있다. 시발체 GLBD-r(5'-CC ACGCGT CTA GTA CAA GTC CTT GTA GAT CTC C -3')은 인간 PPARγ 유전자의 Glu472에서부터 Tyr477를 코드하는 유전자와 478 번째 아미노산에서 해독이 종료되도록 종료코돈을 가지고 있으며, 동시에 제한효소 MluI 인식부위를 가지고 있다. 인체 간 cDNA 라이브러리로부터 단리한 인간 PPARγ 전체 길이 cDNA를 주형으로 하여, 인간 PPARγ 리간드 결합부위를 포함하는 Ser176에서부터 Tyr477를 암호화하는 DNA 단편을 상기에서 언급한 시발체를 사용하여 PCR로 증폭하였다. 상기에서 얻은 PCR 산물을 1% 아가로오스겔에서 분리한 결과 약 900 염기쌍의 핵산이 증폭되었음을 확인하였고, 동일조건의 아가로오스겔로부터 분리 정제하였다. 상기에서 분리 정제한 핵산을 제한효소 KpnI과 MluI으로 NEB 완충용액 2의 조건에서 완전 절단한 후, 이들을 페놀/클로로포름으로 추출하여(이하, 이 단편을 ‘단편 GLBD-K/M’라 칭한다) 20㎕의 TE 용액에 용존하였다.
한편, 상기에서 얻은 플라스미드 pZeo-GAL 2㎍을 제한효소 KpnI과 MluI으로 NEB 완충용액 2의 조건하에서 완전 절단한 후, 1% 아가로오스겔로 약 4.0kb의 핵산 단편을 분리 정제하였다. 이하, 이 단편을 ‘단편 pZeoGAL-K/M’라 칭한다.
접합반응 튜브에 상기에서 얻은 100ng의 ‘단편 GLBD-K/M’와 100ng의 ‘단 편 pZeoGAL-K/M’을 넣은 다음, 2㎕의 10 배 접합반응용액과 10 단위체의 T4 DNA 리가제를 넣고, 총 부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가하여, 12 시간 동안 접합반응을 시켰다. 반응이 끝난 뒤 대장균 HB101(ATCC 33694)에 형질전환시켜, 상기한 pZeoGAL의 GAL4 DNA 결합 부위를 암호화하는 DNA 하류에 인간 PPARγ 리간드 결합부위를 암호화하는 DNA 단편을 삽입한, 목적으로 하는 효과기 단백질의 발현 벡터를 얻었다(이하, 이 벡터를 'pZeo-GAL-PPARγLBD'라 표기한다) (도 2 참조).
(3) 인간 PPAR γ 리간드 결합부위를 암호화하는 DNA 단편의 획득 및 GAL4 -인간 PPAR γ 키메라 수용체 단백질 발현 벡터의 구축
인간 PPARγ 유전자의 염기서열 정보(유전자 은행 번호, NM_015869)로부터 다음과 같은 시발체를 합성하였다. 시발체 GLBD-f (5'-GG GGTACC TCT CAT AAT GCC ATC AGG TTT GGG CGG ATG C -3')는 인간 PPARγ 유전자의 Ser176에서부터 Met185을 코드하는 유전자를 포함하고, 동시에 제한효소 KpnI 인식부위를 포함하고 있다. 시발체 ohG-Y2A-r (5'-ACGCGT CTA GTA CAA GTC CTT GGC GAT CTC CTG-3')은 인간 PPARγ 유전자의 Glu470에서부터 Tyr477을 코드하는 서열에서 Tyr473을 코드하는 부분을 Ala로 바꾼 유전자와 478 번째 아미노산에서 해독이 종료되도록 종료코돈을 가지고 있으며, 동시에 제한효소 MluI 인식부위를 가지고 있다.
인체 간 cDNA 라이브러리로부터 단리한 인간 PPARγ 전체 길이 cDNA를 주형으로 하여, 인간 PPARγ 리간드 결합부위를 포함하는 Ser176에서부터 Tyr477를 암호화 하는 DNA 단편을 상기에서 언급한 시발체를 사용하여 PCR로 증폭하였다. 상기에서 얻은 PCR 산물을 1% 아가로오스겔에서 분리한 결과 약 900 염기쌍의 핵산이 증폭되었음을 확인하였고, 동일조건의 아가로오스겔로부터 분리 정제하였다. 상기에서 분리 정제한 핵산을 제한효소 KpnI과 MluI으로 NEB 완충용액 2의 조건에서 완전 절단한 후, 이들을 페놀/클로로포름으로 추출하여(이하, 이 단편을 ‘단편 GLBD-Y473A-K/M’라 칭한다) 20㎕의 TE 용액에 용존하였다.
한편, 상기에서 얻은 플라스미드 pZeo-GAL 2㎍을 제한효소 KpnI과 MluI으로 NEB 완충용액 2의 조건하에서 완전 절단한 후, 1% 아가로오스겔로 약 4.0kb의 핵산 단편을 분리 정제하였다. 이하, 이 단편을 ‘단편 pZeoGAL-K/M’라 칭한다.
접합반응 튜브에 상기에서 얻은 100ng의 ‘단편 GLBD-Y473A-K/M’와 100ng의 ‘단편 pZeoGAL-K/M’을 넣은 다음, 2㎕의 10 배 접합반응용액과 10 단위체의 T4 DNA 리가제를 넣고, 총 부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가하여, 12 시간 동안 접합반응을 시켰다. 반응이 끝난 뒤 대장균 HB101(ATCC 33694)에 형질전환시켜, 상기한 pZeoGAL의 GAL4 DNA 결합 부위를 암호화하는 DNA 하류에 인간 PPARγ 리간드 결합부위를 암호화하는 DNA 단편을 삽입한, 목적으로 하는 효과기 단백질의 발현 벡터를 얻었다(이하, 이 벡터를 ‘pZeo-GAL-PPARγLBD-Y473A’라 표기한다) (도 3 참조).
실험예 3: 형질전환
10% 태 송아지 혈청(FBS)으로 보충된 DMEMTM 배지(Life Technologies Inc.) 중의 인간 간세포 HepG2(한국세포주은행)를 24-웰 플레이트에서 1 웰 당 6.0×104 개의 세포밀도로 뿌려, 5% 탄산가스 존재하에 37℃에서 24 시간 배양하였다. 배양 후에 배양액을 1 웰 당 200㎕의 OptiMEMTM 배지(Life Technologies Inc.)로 치환하여 형질전환에 사용하였다. DNA 양은 1 웰 당 480ng의 pGL3-GAL4, 48ng의 pZeo-GAL-PPARγLBD 또는 pZeo-GAL-PPARγLBD-Y473A, 및 128ng의 pCH110 (Amersham, Cat. No. 27-4508-01)을 사용하였다. DNA를 29㎕의 OptiMEMTM 배지에 용해한 다음, 1㎕의 PLUS reagent (Invitrogen)를 가하여 교반하고 15 분간 실온에서 정치하였다. DNA와 PLUS reagent와의 혼합액에, 29㎕의 OptiMEMTM 배지로 희석한 1㎕의 LIPOFECTAMINE (Invitrogen)을 첨가하여 교반하고 15 분간 실온에서 정치하였다. 이상의 방법에 의해 조제한 DNA와 LIPOFECTAMINE과의 복합체를 포함하는 용액을 24웰 플레이트에서 배양하고 있는 HepG2 세포에 적하하여 완만하게 교반한 후에, 5% 탄산가스 존재하에 37℃에서 3 시간 배양하였다. 배양 후 1 웰당 260㎕의 20% 태 송아지 혈청(FBS)으로 보충된 DMEMTM 배지를 첨가하여, 5% 탄산가스 존재하에 37℃에서 24 시간 배양한 후, 분석에 사용하였다.
실험예 4: 인간 PPAR γ 에 대한 항진활성 측정
(1) 루시페라제 ( Luciferase ) 발현도 측정
실험예 3에서 형질전환된 세포로부터 배양 배지를 제거하고, 실시예 1 내지 18의 화합물을 DMSO에 용해하여, 5% 태 송아지 혈청(FBS)으로 보충된 DMEMTM 배지에 첨가하고, 각 웰에 넣어준 뒤, 5% 탄산가스 존재하에 37℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 24 시간 배양 후, 배양 배지를 제거하고 세포를 PBS(Life Technologies Inc.)로 2 회 세척하였다. 각 웰 당 100㎕의 PLBTM 용해 완충액(Promega Corporation)을 첨가하고, 상온에서 20 분간 완만하게 교반하였다. 각 웰에서 20㎕의 세포 용해액을 각각 취하여, 96-웰 발광측정기(Luminometer)용 세포 배양 판(Costar)으로 옮긴 후, 루시페라제의 활성을 공급자의 권장에 따라 Luciferase Assay SystemTM 키트(Promega Corporation)를 통해 측정하였다
(2) 베타갈락토시다아제(β- galactosidase ) 활성 측정
상기 세포 용해액 20㎕ 씩을 96-웰 분석용판 (Falcon, Cat.No. 353911)으로 옮긴 후, 각 웰에 100㎕ 씩의 ONPG (O-nitrophenyl β-galacti-pyranoside) 용액을 첨가하고, 37℃ 배양기에서 2 시간 동안 정치하였다. 이후, 각 웰에 50㎕ 씩의 1 M 탄산나트륨(Na2CO3) 용액을 첨가하고 415 nm에서 흡광도를 측정하였다.
(3) 리간드의 활성능
상기 방법으로 측정한 베타갈락토시다아제 활성으로 세포용해액에서의 형질전환 효율을 보정하여 루시페라제의 상대적 활성을 측정함으로써 각 화합물의 활성을 비교하였다. 실험결과는 화합물없이 5% DMSO만 첨가한 대조군 값을 기준으로 대조군에 대한 증가배수로 표시하였다. 이를 바탕으로 하여, 하기 표 1에는 실시예 1 내지 18의 화합물의 억제 효능 EC50 이 기재되어 있다. EC50(Effective concentration fifty)은 약물의 최대효과를 기준으로 할 때 50%의 효과를 보이는 농도를 나타낸다.
[표 1]
Figure 112006097708719-PAT00035
실험예 5: 생쥐 세포에서 maP2 유전자 발현을 통한 PPAR γ에 대한 항진활성 측정
합성된 화합물을 생쥐의 지방전구 세포(3T3-L1; The Global Bioresource Center)에 처리하여 PPARγ의 목표유전자인 maP2의 메신저 RNA 발현량을 조절하는 정도를 알아보는 실험을 하였다. 10% 소 혈청(BS)으로 보충된 DMEMTM 배지(Life Technologies Inc.) 중의 생쥐 지방 전구 세포를 70% 정도의 포화도로 12웰 플레이트에 옮긴 다음 100%로 자라도록 하루동안 관찰한 후에 다시 48시간 동안 배양하였다. 그 후 기존의 배양액을 제거하고 50μM IBMX(3-Isobutyl-1-methylxanthine), 250nM 덱사메타손(Dexamethasone), 10㎍/㎖ 인슐린과 화합물을 같이 처리한 5% 태 송아지 혈청(FBS)으로 보충된 DMEMTM 배지에서 72시간 배양하였다. 배양 후, 배양 배지를 제거하고 세포를 PBS(Life Technologies Inc.)로 씻어준 후 다음과 같이 RNA를 뽑았다.
12웰 하나에 167㎕의 트리졸(Trizol)을 처리하고 상온에서 5분간 반응하여 세포를 깬다음 34㎕의 클로로포름을 넣고 심하게 교반하였다. 4℃에서 13200rpm으로 15분간 원심분리하여 층분리를 한 다음 상층액의 용액을 70㎕ 취하여 새로운 용기에 옮겼다. 이소프로판올 50㎕를 넣고 10분간 상온에 두었다. 상온에서 13200rpm으로 10분간 원심분리하여 RNA를 가라 앉히고 70% 에탄올로 1회 세척하였다. 5분간 상온에서 말린 다음 RNase가 없는 증류수로 녹였다.
이렇게 뽑혀진 RNA를 가지고 공급자(Qiagen kit-204443)의 권장에 따라 Rotorgene3000(Corbett Research)을 이용하여 quantitive RT-PCR(정량적 실시간 DNA 중합효소 연쇄반응) 방법을 수행하여 발현된 목표유전자의 양을 측정하고, 이를 도 4에 나타내었다.
실험예 6: 생쥐 지방세포주에서 PPAR γ 에 의한 지질 축적의 측정
시중에 발매된 PPARγ를 타겟으로 하는 당뇨 치료제는 높은 효율로 혈당을 저하시키지만 체중 증가와 부종을 발생시키는 등의 심각한 부작용을 일으키고 있다. 이때 체중의 증가는 지방세포의 분열 및 분화와 관련되어 있다. 지방세포의 분열 및 분화를 In vitro에서 측정할 수 있는 모델 세포로서 생쥐의 전구 지방세포주인 3T3-L1이 사용된다. 3T3-L1은 PPARγ의 활동이 활발할 때 세포 내부에 TG(트리글리세리드)라는 지질을 축적하게 된다. 따라서 PPARγ의 작용제(agonist)로서 합성된 화합물이 3T3-L1의 지질 축적에 기여하는 정도를 측정한다면 그 화합물이 치료제로 쓰였을 때 체중증가 부작용의 정도를 간접적으로 예측할 수 있을 것이다. 이를 근거로 지질축적분석(Lipid Accumulation Assay) 시스템을 구축하였다.
1) 생쥐의 전구 지방세포주(3 T3 - L1 )의 분열
첫째날, 3T3-L1 세포를 10%의 소혈청(Bovine Serum)이 들어있는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Life Technologies Inc.)에 1x106/㎖ 의 농도로 희석하여 24 웰 플레이트에 400㎕씩 분주하였다. 4x105 의 세포는 24 웰 플레이트에서 70%의 포화도를 가지는 농도이며 100%의 포화도를 가질 때까지 37℃ 배양기에서 48시간동안 배양하였다.
2) 생쥐의 전구 지방세포주(3 T3 - L1 )의 분화
셋째 날, 활성탄으로 정화한 5% 소 태아 혈청(Fetal Bovine Serum)과 혼합된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Life Technologies Inc.)에 최종 농도로서 3T3-L1의 분화 유도제인 IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine) 0.5 mM, DEX(dexamethasone) 0.25 μM, 인슐린 10㎍/㎖와 PPARγ의 작용제(agonist)의 대조 화합물과 후보 화합물을 혼합하였다. 24 웰 플레이트에서 100% 포화도로 분열한 3T3-L1의 배양배지를 제거하고 PBS(Life Technologies Inc.)로 세척하였다. 상기 혼합배지를 3T3-L1이 배양된 24 웰 플레이트에 400㎕씩 분주하고 37℃ 배양기에서 72시간 동안 배양하였다. 72시간 후 3T3-L1의 배양 배지를 제거하고 소 태아 혈청(Fetal Bovine Serum) 400㎕을 넣어준 후 다시 72시간 동안 배양하였다.
3) 지질 축적 분석(Lipid Accumulation Assay)
72시간 후, 현미경으로 충분한 지질의 축적 여부를 확인한 후 소 태아 혈청(Fetal Bovine Serum)을 제거하고 여기에 세포내의 지질만을 염색하여 특정 파장의 빛을 내는 Adipored Reagent(Cambrex)와 PBS의 혼합물을 1 ㎖/웰로 분주하여 20분간 염색하였다. 염색여부를 현미경으로 확인한 후 Victor3 (fluorimeter)에서 485nm의 파장을 주어 535nm 파장의 양을 감지하였다. 이때 535nm 파장의 에너지가 높을수록 세포내에 많은 지질이 축적된 것으로 볼 수 있으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 PPARγ에 대해 우수한 항진효과를 발휘한다. 따라서, 본 발명에 따른 화합물은 당뇨병, 당뇨병 관련 합병증, 염증, 골다공증 등과 같이 인간 PPARγ 관련 질병의 치료 및 예방을 위한 약제로서 사용될 수 있다.
본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.

Claims (7)

  1. 하기 화학식 1의 화합물, 그의 약제학적으로 허용되는 염, 또는 이성질체:
    [화학식 1]
    Figure 112006097708719-PAT00036
    상기 식에서
    A 는 하기 그룹으로부터 선택되고:
    (ⅰ) 할로겐에 의해 치환되거나 비치환된 선형, 가지형 또는 환형 C1~C6 알킬
    (ⅱ)
    Figure 112006097708719-PAT00037
    (ⅲ)
    Figure 112006097708719-PAT00038
    (ⅳ)
    Figure 112006097708719-PAT00039
    (ⅴ)
    Figure 112006097708719-PAT00040
    여기서
    R1은 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 할로겐에 의해 치환되거나 비치환된 선형 또는 가지형 C1~C4 알킬, 또는 할로겐에 의해 치환되거나 비치환된 선형 또는 가지형 C1~C4 알콕시를 나타내며,
    R2는 할로겐에 의해 치환되거나 비치환된 선형 또는 가지형 C1~C4 알킬을 나타내고,
    n은 0 또는 1이며,
    X는 할로겐에 의해 치환되거나 비치환된 선형 또는 가지형 C1~C5 알킬을 나타내고,
    Y는 할로겐에 의해 치환되거나 비치환된 선형 또는 가지형 C1~C5 알콕시를 나타내며,
    Q는 수소, 할로겐, 또는 할로겐에 의해 치환되거나 비치환된 선형 또는 가지형 C1~C4 알킬을 나타내고,
    D는 하기 그룹으로부터 선택되며:
    (ⅰ)
    Figure 112006097708719-PAT00041
    (ⅱ)
    Figure 112006097708719-PAT00042
    여기서
    n은 0 또는 1이고,
    E는 수소, 할로겐, 할로겐에 의해 치환되거나 비치환된 선형, 가지형 또는 환형 C1~C6 알킬, 또는 할로겐에 의해 치환되거나 비치환된 선형, 가지형 또는 환형 C1~C6 알콕시를 나타내며,
    G는 수소를 나타낸다.
  2. 제1항에 있어서,
    (3-{[(2Z)-2-(1-벤질-1H-인돌-3-일)-2-(에톡시이미노)에틸]옥시}-5-에톡시페닐)아세트산;
    3-({(2Z)-2-(에톡시이미노)-2-[1-(2-페닐에틸)-1H-인돌-3-일]에틸}옥시)벤조산;
    (3-{[(2Z)-2-(에톡시이미노)-2-{1-[4-(트리플루오로메틸)벤질]-1H-인돌-3-일}에틸]옥시}페닐)아세트산;
    (3-{[(2Z)-2-(1-벤질-1H-인돌-3-일)-2-(프로폭시이미노)에틸]옥시}페닐)아세트산;
    3-{[(2Z)-2-(에톡시이미노)-2-(1-헥실-1H-인돌-3-일)-에틸]옥시}벤조산; 및
    (2-{[(2Z)-2-(1-벤질-1H-인돌-3-일)-2-(에톡시이미노)에틸]옥시}페닐)아세트산으로 구성된 그룹으로부터 선택된 화합물.
  3. 하기 화학식 2의 화합물을 염기 존재하에 하기 화학식 3의 화합물과 축합 반응시킴을 특징으로 하여 제1항에 따른 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법:
    [화학식 2]
    Figure 112006097708719-PAT00043
    [화학식 3]
    Figure 112006097708719-PAT00044
    상기 식에서,
    A, D, Q, X 및 Y는 제1항에 정의된 바와 같고,
    L은 이탈기를 나타낸다.
  4. 하기 화학식 4의 화합물을 염기 존재하에 화학식 3의 화합물과 축합 반응시켜 하기 화학식 5의 화합물을 제조한 후, 화학식 5의 화합물을 하기 화학식 6의 아 민 또는 그의 하이드로클로라이드와 반응시켜 옥심구조를 형성함을 특징으로 하여 제1항에 따른 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법:
    [화학식 4]
    Figure 112006097708719-PAT00045
    [화학식 3]
    Figure 112006097708719-PAT00046
    [화학식 5]
    Figure 112006097708719-PAT00047
    [화학식 6]
    Figure 112006097708719-PAT00048
    상기 식에서
    A, D, Q, X, Y 및 L은 제3항에 정의된 바와 같다.
  5. 약리학적 유효량의 제1항에 따른 화학식 1의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유함을 특징으로 하는 PPARγ 항진제 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 당뇨병, 당뇨병 관련 합병증, 염증 또는 골다공증의 치료 및 예방용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 당뇨병 관련 합병증이 고지혈증, 동맥경화, 비만, 고혈압, 망막증 또는 신부전증인 조성물.
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