KR20080058714A - 사스 코로나 바이러스의 ｒｎａ 유사매듭구조에 결합하여 리보솜 틀 이동을 억제하는 호모피페라진계 화합물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사스 코로나 바이러스의 RNA 유사매듭구조에 결합하여 리보솜 틀 이동을 억제하는 호모피페라진계 화합물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 치료학적 유효량의 하기 화학식 1의 호모피페라진계 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 약제학적 담체 또는 부형제와 함께 포함하는 사스 코로나 바이러스에 특이적으로 존재하는 RNA 유사매듭구조에 결합하여 -1 틀이동에 의해 유도되는 단백질 생성을 저해하는 약제 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 화합물은 급성호흡기 증후군의 원인바이러스인 사스 코로나 바이러스에 특이적으로 존재하는 RNA 유사매듭구조에 결합하여 -1 틀이동에 의해 유도되는 단백질 생성을 저해함으로써 항바이러스제로서 잠재적 효능을 나타낸다.

Description

사스 코로나 바이러스의 ＲＮＡ 유사매듭구조에 결합하여 리보솜 틀 이동을 억제하는 호모피페라진계 화합물 {HOMOPIPERAZINE COMPOUND FOR INHIBITION OF RIBOSOMAL FRAMESHIFTING BY BONDING TO RNA PSEUDOKNOT STRUCTURE OF SARS CORONAVIRUS}

도 1은 SDS-불연속 전기영동법에 의한 본 발명의 -1 틀이동 영향력 분석결과를 나타낸 그림이다.

도 2는 이중발광단백질분석법에 의한 -1 틀이동의 여부와 그 활성도에 대한 분석결과를 나타낸 그래프이다.

도 3은 발명 화합물의 사스 바이러스의 RNA 유사매듭구조에 대한 특이성 실험에 의한 본 발명의 -1 틀이동 영향력 분석결과를 나타낸 그림이다.

도 4는 발명 화합물의 사스 바이러스의 RNA 유사매듭구조에 대한 특이성 실험에 의한 -1 틀이동의 여부와 그 활성도에 대한 분석결과를 나타낸 그래프이다.

도 5는 본 발명의 화합물(샘플 1)의 동물세포내의 -1 틀이동에 미치는 영향력 측정 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 항바이러스 치료 및 예방에 유용한 화합물과 이를 함유한 약제 조성물에 관한 것이다.

중증급성호흡기증후군(Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS, 사스)은 2002년 11월부터 중국 광동지역을 중심으로 발생하여 전 세계로 확산되고 있으며 발열과 기침, 호흡곤란, 비정형 폐렴 등 증상을 보이는 증후군이다. 아직까지는 치료법에 대한 충분한 정보가 없으며 일부 항균제나 항바이러스제와 함께 투여하여 치료를 하고 있으나 그 효과는 만족할 만하지 못하고 사망률이 높아지는 실정이다. 따라서 강력한 급성호흡기증후군의 치료제의 개발이 시급하다. 본 발명은 이와 같은 필요에 따라 이뤄진 것이다.

한편, 바이러스가 일으키는 질병의 치료를 위하여 개발되는 대부분의 항바이러스제는 바이러스의 생존에 중요한 단백질을 타겟으로 하여 개발되고 있다. 이러한 방식으로 개발된 약제의 경우 처음에는 반응을 보이다가 치료기간 중 약물에 대해 내성을 나타내는 문제가 발생한다. 이는 바이러스에서는 빠른 속도로 단백질 자체의 돌연변이가 일어나는 까닭으로 특정 바이러스의 단백질을 타겟으로 개발된 약제에 쉽게 내성을 가지게 되기 때문이다. 그러므로, 바이러스의 치료에 있어서는 약제에 대한 바이러스의 내성을 막는 것이 무엇보다도 중요하다. 따라서 단백질을 타겟으로 하는 대신 점돌연변이에 의한 내성 발현이 상대적으로 느리게 나타나는 RNA의 특정구조를 타겟으로 하는 약물을 개발하는 것이 이런 문제점을 해결하기 위한 방법의 하나로 생각되어지고 있다. 그러나, 사스 코로나 바이러스를 비롯한 다른 여러 바이러스에서도 단백질 생성의 중요 기작인 -1 틀이동의 중요 인자인 RNA 유사매듭구조를 타겟으로 하여 개발된 항바이러스제제로서 가능성을 갖는 화합물의 개발은 전무하다.

본 발명의 목적은 사스 코로나 바이러스에 존재하는 RNA 유사매듭 구조를 타겟으로 하여 종래의 항바이러스제가 갖는 한계를 염두에 두고 이루어진 것으로, 급성호흡기 증후군에 대해 생존억제의 우수한 활성을 보일 뿐만 아니라 약재에 대한 내성의 발생을 최소화한 항바이러스제로 유용한 화합물 또는 이를 함유한 약제 조성물을 제공하기 위한 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 (1)의 호모피페라진계 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 약제 조성물을 제공한다. 보다 구체적으로, 치료학적 유효량의 화학식 (1)의 호모피페라진계 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 사스 코로나 바이러스의 RNA유사매듭구조에 결합하여 리보솜 -1 틀이동을 억제하기 위한 약제 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

-1 틀이동(-1 frameshifting) 기작이란 하나의 mRNA에서 서로 다른 단백질들을 만들 수 있는 기작들 중 하나로 특정위치에서 정상적인 번역 틀 대신 -1 즉, 5' 방향으로 한 틀만큼 이동한 틀을 번역과정에 이용하여 두 가지 다른 단백질을 만드는 기작을 말한다. 사스바이러스는 숙주세포 내에서 RNA 유사매듭구조가 야기하는 -1 틀이동을 이용하여 자기 증식에 필요한 두 가지 이상의 단백질을 정확한 비율로 만들어 사용하기 때문에, -1 틀이동의 효율에 있어서 증가나 감소가 일어나게 되면 바이러스의 자기증식의 과정이 억제되거나 파괴되는 치명적인 결과를 야기한다.

RNA 유사매듭구조는 -1 틀이동의 효율에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 이들의 구조적 특성과 안정성이 -1 틀이동의 정확한 효율을 유지하게 하는데 매우 중요한 역할을 하고 있다. 본 발명자들은 상업적으로 이용가능한 수 십 만개의 화합물 데이터베이스를 이용하여, 사스바이러스의 RNA 유사매듭구조의 삼차원구조 모델을 타겟으로 컴퓨터를 이용한 가상검색을 수행함으로써 후보화합물군을 확보하고, 시험관내와 동물세포내에서의 -1 틀이동 효율분석 실험을 통해 기존의 신약 개발법과는 차별화된 표적선정과 방법을 통해서 바이러스의 생존에 반드시 필요한 단백질에 대해 생성단계에서부터 억제하여 합성을 하지 못하게 하는 저분자 물질인 하기 화학식 (1)의 화합물을 개발하였다.

상기 식에서,

R은 H, C₁∼C₆ 알킬, C₃∼C₁₀ 아릴 또는, 아릴의 탄소상에 N 또는 O가 개재된 헤테로아릴이며;

X 및 Y는 독립적으로 탄소 또는 질소이며;

Z는 산소, 황 또는 질소이며;

X, Y 및 Z는 할로겐, C₁∼C₆ 알킬로 치환되거나 비치환될 수 있다.

상기 화학식 1의 화합물들 중 특히 바람직한 화합물을 하기 표 1에 나타내었다.

본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 호모피페라진계 화합물 및 약학적으로 허용되는 그의 염 뿐만 아니라 그로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물 및 수화물을 모두 포함한다.

본 발명의 화학식 1의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산 (free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p -톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산 (maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산 (propionic acid), 젖산 (lactic acid), 글리콜산 (glycollic acid), 글루콘산 (gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산 (glutaric acid), 글루쿠론산 (glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르빈산, 카르본산, 바닐린산, 요오드산 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화학식 1의 화합물을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 동량의 화학식 1의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올 (예를들면, 글리콜 모노메틸 에테르)을 가열하고, 이어서 이 혼합물을 건조시키거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.

또한 화학식 1의 화합물을 가능한 유기 용매, 예를 들면 디에틸 에테르, 테 트라히드로푸란, 디클로로메탄, 아세토니트릴을 사용하여 용해시키고, 상기 열거한 여러 가지 무기산 및 유기산을 직접 혹은 유기 용매에 용해되어 있는 형태로 가하여 생성되는 염을 침전시키고 흡입 여과하여 제조할 수도 있다.

화학식 1의 화합물은 임상투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 화학식 1의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예 를 들면, 전분, 탄산칼슘 (Calcium carbonate), 자당 (Sucrose) 또는 유당 (Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유효성분의 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 물활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 성인에게 1일에 체중 1kg당 화학식 1의 화합물을 0.1∼500 mg의 양으로 1회 내지 수회 나누어 투여할 수 있으며 바람직하기로는 1∼20 mg이다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 본 발명의 화합물의 시험관내에서의 -1 틀이동 효율 분석법( in vitro -1 frameshifting assay)

상기 표 1에 기재된 샘플 1 내지 4의 화합물은 Tripos Discovery Research Center, Bude-Stratton Business Park, Bude, Cornwall EX23 8LY UK 회사로부터 상업적으로 입수하였다. 또한, 샘플 1의 화합물은 하기 세포-기재 실험(cell-based assay)를 위하여 (주) 리드제넥스 회사에 대량 합성을 의뢰하여 사용하였다.

TNT T7 -coupled transcription/translation system 을 사용하여 -1 틀이동에 의해 야기되는 단백질을 생성하였다. 사스 바이러스의 RNA 유사매듭구조가 삽입된 이중 형광 리포터 유전자가 포함된 플라스미드를 가지는 재조합 DNA를 만들어 실험을 실시하였다. 총 20 ㎕의 반응에 500ng 의 DNA, 16 ㎕의 토끼의 망상적혈구 분리 혼합물(reticulocyte lysate mixture) 그리고 메티오닌으로 표지된 10μCi/㎕ 의 농도를 갖은 ³⁵S 0.8 ㎕을 사용하였다. 여기에 DMSO에 녹인 2.5mM의 화합물(샘플 1)을 첨가한 후 30℃에서 약 2시간 동안 반응을 진행하였다. 생성된 단백질의 양은 SDS-불연속 전기영동법과 이중발광단백질 분석법으로(dual luciferase assay) 분석하였다.

결과분석 방법 1 : SDS-불연속 전기영동법 (SDS-discontinuous polyacrylamide gel electrophoresis; SDS-PAGE)

생성된 단백질 중 틀이동이 일어나지 않는 경우 생성된 단백질(Non-frameshifting protein)과 -1 틀이동에 의해 생성된 단백질(frameshifting protein)을 분리하기위해 12% stacking 젤과 5% running 젤에 전기영동 하여 PhosphoImager screen에 노출시켜서 BAS 기계로 방사능 사진을 찍어 얻은 결과를 정량하였다. -1 틀이동 효율의 계산은 반응에서 생성되는 단백질들이 가지고 있는 ³⁵S-메티오닌의 수를 고려하여 % = (I[FS]/26)/[(I[FS]/26)+(I[NFS])/9] x 100 의 식을 사용한다. 여기서 I[FS]는 -1 틀이동에 의해 생성된 단백질의 양을 나타내고, I[NFS]는 -1 틀이동이 일어나지 않고 생성된 단백질의 양을 의미한다. 앞서 언급한 화합물의 결과는 도 1과 같다.

본 발명의 -1 틀이동 영향력 분석결과, 발명 화합물과 다른 화합물들의 결과를 비교하면 발명화합물이 -1 틀이동에 의해 생성되는 단백질의 합성을 현저히 방해 한 것을 보여주었다. DMSO 는 발명화합물이 첨가되지 않은 상태이고 나머지는 발명 화합물의 존재하에서 (2.5mM) 수행되었다.

결과분석 방법 2 : 이중발광단백질분석법(Dual Luciferase assay)

-1 틀이동의 여부와 그 활성도를 리포터유전자의 생성량을 직접 측정하여 재확인하는 실험이다. In Vitro Transcription/Translation Coupled Assay에서 얻은 샘플을 약 1 ㎕를 취하여 반딧불이 발광단백질 (firefly luciferase)을 측정하기 위해 약 50 ㎕의 luciferase assay reagent II를 첨가하여 반딧불이 발광단백질양을 측정하였고 Stop & Glo regent를 50 ㎕ 첨가해 주어 두 번째로 레닐라속 발광단백질(renilla luciferase)을 TD-20/20 Luminometer를 사용하여 정량하였다. 결과는 도 2에 나타내었다.

분석결과 본 발명화합물이 -1 틀이동에 의해 생성되는 단백질의 합성을 현저히 방해한 결과를 보여주었다.DMSO 는 발명화합물이 첨가되지 않은 상태이고 나머지는 발명화합물의 존재하에서 (2.5mM) 수행되었다.

<실시예 2> 발명 화합물의 사스 바이러스의 RNA 유사매듭구조에 대한 특이성 실험

위에 언급한 동일한 방법으로 사스 바이러스의RNA 유사매듭구조와 전혀 유사성이 없는 다른 RNA 유사매듭구조와 함께 실험하여 그 결과를 비교 분석하였다.

본 발명의 -1 틀이동 영향력 분석결과는 하기와 같다.

결과분석 방법1.

분석결과는 도 3에 나타내었다. 분석결과 본 발명화합물이 다른 RNA 유사매듭구조 영향을 주지 않는 것을 확인하였다.

결과분석 방법2.

분석결과는 도 4에 나타내었다. 분석결과 본 발명화합물이 다른 RNA 유사매듭구조 영향을 주지 않는 것을 재확인하였다.

<실시예 3> 동물세포내에서의 -1 틀이동 분석

HEK 293 ( 인간신장세포)를 이용하여 실험하였다. 세포 배양으로는 페니실린과 스트렙토마이신을 첨가한 DMEM 용액을 10% FBS 로 보강한 배지를 사용하였으며, 37℃, 5% 이산화탄소, 95% 공기의 조건에서 배양하며,3-4일에 한번씩 계대유지하였다.

<실시예 4> 동물세포내에서 발명화합물의 -1 틀이동에 미치는 영향실험

세포를 24웰 플레이트에 분주하고, 세포가 바닥에 부착하도록 24시간동안 배양하였다. 세포가 바닥면에 부착된 후 사스바이러스의 RNA 유사매듭구조가 포함되어 있는 DNA를 삽입시켜 배양기에서 약 18시간을 배양한 후 발명화합물(샘플 1)을 웰 당 2㎕씩 첨가하여 배양기에서 18시간을 더 배양한다. 배양이 끝난 후 발명화합물이 -1 틀이동에 미치는 영향을 이중형광분석법으로 측정하였다.

측정 결과는 도 5에 나타내었다. 분석결과 본 발명화합물이 -1 틀이동에 의해 생성되는 단백질의 합성을 방해한 결과를 보여주었다. 0mM 는 발명화합물이 첨가되지 않은 상태이고 나머지는 발명화합물의 존재하에서 (0.02-2mM) 수행되었다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 화합물은 급성호흡기 증후군의 원인바이러스인 사스 코로나 바이러스에 특이적으로 존재하는 RNA 유사매듭구조에 결합하여 -1 틀이동에 의해 유도되는 단백질 생성을 저해함으로써 항바이러스제로서 잠재적 효능을 나타낸다.

Claims (6)

1. 치료학적 유효량의 하기 화학식 1의 호모피페라진계 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 약제학적 담체 또는 부형제와 함께 포함하는 사스 코로나 바이러스에 특이적으로 존재하는 RNA 유사매듭구조에 결합하여 -1 틀이동에 의해 유도되는 단백질 생성을 저해하기 위한 약제 조성물:

   화학식 1

   

   상기 식에서,

   R은 H, C₁∼C₆ 알킬, C₃∼C₁₀ 아릴 또는, 아릴의 탄소상에 N 또는 O가 개재된 헤테로아릴이며;

   X 및 Y는 독립적으로 탄소 또는 질소이며;

   Z는 산소, 황 또는 질소이며;

   X, Y 및 Z는 할로겐, C₁∼C₆ 알킬로 치환되거나 비치환될 수 있다.
2. 치료학적 유효량의 화학식 1의 호모피페라진계 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 약제학적 담체 또는 부형제와 함께 포함하는 항바이러스성 치료 또는 예방을 위한 약제 조성물.
3. 제 2항에 있어서, 바이러스가 사스 코로나 바이러스인 약제 조성물.
4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 화학식 (1)의 화합물이,

   2-((4-(2메틸-티아졸-4-일메틸)-[1,4]디아제펜-1-카르보닐)아미노)벤조산 에틸 에스테르;

   2-({4-[5-(3,5-다이메틸-이속사졸-4-일)-[1,2,4]옥사디아졸-3-일메틸]-[1,4]디아제판-1-카르보닐}-아미노)-벤조산 에틸 에스테르;

   2-({4-(5-메틸-이속사졸-3-일메틸)-[1,4]디아제판-1-카르보닐}-아미노)-벤조산 에틸 에스테르; 또는

   2-({4-(5-클로로-1,3-다이메틸-1H-피라졸-4-일메틸)[1,4]디아제판-1-카르보닐]-아미노}-벤조산 에틸 에스테르인 약제 조성물.
5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 경구 투여를 위한 제형인 약제 조성물.
6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 비경구 투여를 위한 제형인 약제 조성물.

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