KR101293249B1

KR101293249B1 - Ｃ형 간염 바이러스 헬리카제 및 ｒｎａ 복제효소의 활성을 동시에 저해하는 케르세틴 유도체

Info

Publication number: KR101293249B1
Application number: KR1020110014903A
Authority: KR
Inventors: 정유훈; 박혜리; 김동은
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2011-02-21
Filing date: 2011-02-21
Publication date: 2013-08-09
Also published as: KR20120095534A

Abstract

본 발명은 C형 간염 바이러스 헬리카제 및 RNA 복제효소를 동시에 저해함으로써 다중 HCV 표적효소저해 활성을 갖는 케르세틴 유도체 및 그 화합물의 C형 간염 치료제의 용도에 관한 것이다.

Description

Ｃ형 간염 바이러스 헬리카제 및 ＲＮＡ 복제효소의 활성을 동시에 저해하는 케르세틴 유도체{Quercetin derivatives inhibiting the activity of HCV helicase as well as RNA-dependent RNA polymerase at the same time}

본 발명은 케르세틴 유도체 및 그것의 C형 간염 바이러스 헬리카제 및 RNA 복제효소의 활성을 동시에 저해하는 특성 및 C형 간염 치료 및/또는 예방용 조성물에 대한 용도이다.

전세계적으로 약 1억7천만명의 C형 간염 환자가 분포되어 있으며, 매년 3-4백만명의 신규 감염 환자가 발생하고 있다. 감염된 환자들 중 약 80% 가량이 만성간염으로 발전하며 궁극적으로는 이들 중 상당수가 간경변(20%) 및 간암(5%)으로 발전할 가능성을 가지고 있다. C형 간염에 대한 백신은 아직까지 개발되지 않았으며, 또한 현재 사용되고 있는 유일한 치료법인 인터페론 -2a와 리바비린(ribavirin)의 복합처방은 여러 가지 부작용(감기증세, 발열, 피로, 간질환, 빈혈, 백혈구감소증, 탈모, 혈소판감소증 및 우울증)과 제한된 효능(전체 C형 간염의 60%를 차지하는 genotype 1에 대한 효능이 genotype 2 및 3에 대한 효능보다 현저히 떨어짐)으로 인해 그다지 큰 치료효과를 기대하기 어렵다(Fried, M. W.; Shiffman, M. L.; Reddy, K. R.; Smith, C.; Marinos, G.; Goncales, F. L., Jr.; Haussinger, D.; Diagom M.; Carosi, G.; Dhumeaux, D.; Craxi, A.; Lin, A.; Hoffman, J.; Yu, J. N. Engl . J. Med . 2002, 347, 975-982). 따라서, 새로운 C형 간염 치료제 개발에 대한 연구가 전세계적으로 매우 활발하게 진행중이다.

C형 바이러스성 간염은 만성화율이 대단히 높으며(70-80%), 일단 만성화되면 간경화, 간기능 상실, 간암으로 발전하여 높은 사망률을 보이는 특징을 가지고 있다(Ago, H.; Adachi, T.; Yoshida, A.; Yamamoto, M.; Habuka, N.; Yatsunami, K.; Miyano, M. Structure 1999, 7, 1417-1426). B형 간염은 백신과 치료제의 보급으로 그 비중이 점차 줄어들고 있지만 C형 간염의 경우 백신이나 적당한 치료제가 없으므로 상대적 비중이 커지고 있는 실정이다. C형 간염바이러스 감염자 수는 전 세계 인구의 2-3% 정도로(2억 7천만 ~ 3억) 추산되고 있으며, 우리나라에서는 인구의 1% 정도가 감염되어 있는 것으로 추산되어진다. 또한, 매년 100,000명중 13명의 비율로 신규 감염환자가 발생하고 매년 8,000-10,000명 정도가 C형 간염으로 사망하는 것으로 보고되고 있으며, 현재 만성화된 C형 간염보균자들이 긴 잠복기를 거친 후 증상이 악화되어 생명을 위협받게 되는 말기 간질환 혹은 간경화로 발전하게 되는 10-20년 후쯤에는 심각한 사회적 문제로 대두될 것으로 예상된다. 현재 이용되고 있는 유일한 항-HCV 치료법은 Pegylated interferon과 리바비린(ribavirin)의 combination therapy이나 낮은 반응률(HCV genotype 1 환자의 50%에서만 효과가 입증됨), 장기간 인터페론 치료시 심각한 독성, 내성의 발현, 투약 중단 후 빠른 재발 등의 심각한 문제(Manns, M. P.; Foster, G. R.; Rockstroh, J. K.; Zeuzem, S.; Zoulim, F.; Houghton, M. Nature Reviews Drug Discovery 2007, 6, 991-1000)가 있어 근원적인 치료법의 개발이 절실히 요구되어지고 있다.

HCV는 positive-sense RNA virus로서 증식과정에서 돌연변이율이 매우 높은데, nucleotide가 10⁴개 incorporation할 때마다 1개 정도의 error가 발생하여 하나의 HCV RNA로부터 증식한 1만개의 HCV 중 평균 1개의 nucleotide가 서로 다른 quasi-species를 형성하는 것으로 알려져 있다. 따라서 이론적으로, 바이러스가 한 round의 증식만 하여도 특정 바이러스 효소(protease나 polymerase)에 변형이 생긴 바이러스가 생겨날 수 있는데, 이러한 mutant 바이러스는 항바이러스제가 표적으로 하는 바이러스 특이적인 효소에 발생한 구조적인 변형으로 인해 기존의 항바이러스제에 약제내성을 보이게 된다. 돌연변이에 의한 약제내성의 발현은 C형 간염 뿐만 아니라 다른 대부분의 바이러스성 감염증 치료제 개발에 주요 걸림돌로 작용한다.

HCV를 포함하는 대부분의 바이러스는 높은 replication error와 proofreading activity의 부재로 인해 많은 quasi species가 존재하는데, wild type과 경쟁하여 바이러스 생환에 가장 적합한 species가 생존하는 이른바 replication fitness을 따른다. 일반적으로 항바이러스제 치료 개시 이전에는 wild type이 주종을 이루나 특정 표적효소 저해제 투여 이후에는 이 효소에 돌연변이를 갖고 있어 약물에 저항성을 갖는 변종이 우세하게 성장하게 되는데, 특정 효소에 돌연변이가 생긴 바이러스는 이 효소를 표적으로 하는 약물에 의한 저해작용을 받지 않게 되므로, 다른 표적 저해제 및 다른 mode of action을 가지는 약물과 혼합처방하는 combination therapy를 통해 치료효과를 도모하는 것이 현재 적용되는 일반적인 항바이러스 치료법이다. 그러나 AIDS 환자를 위한 HIV HAART에서 이미 경험한 바와 같이, combination therapy는 많은 약물의 복용에 의한 독성 및 다양한 부작용을 피할 수 없으며 환자순응도(patient compliance)가 매우 낮은 치료법이며 결과적으로 다양한 bioavailability, pharmacokinetics, 그리고 metabolism profile을 갖는 약물들을 혼합처방함으로써 발생하는 복잡한 ADMET의 문제와 drug-drug interaction (DDI)의 문제 역시 combination therapy의 피하기 힘든 치명적인 약점으로 작용한다.

전술한 바와 같이 돌연변이 바이러스는 생존에 필수적인 효소에 구조적 변형을 동반하므로 wild type에 비해 생존 능력이 떨어지나 항바이러스제 투여라는 특별한 상황하에서 생존하며 viral pathogenicity를 유지하므로 하나가 아닌 둘 이상의 바이러스 필수 효소에 동시에 돌연변이가 발생하는 경우 바이러스의 생존 능력 및 pathogenicity도 현저히 저하될 것임은 자명하다. 따라서 하나의 약물에 의해 둘 이상의 표적효소가 동시에 저해될 경우, 이 약물에 약제내성을 보이기 위해서는 두 효소에 모두 돌연변이가 발생해야 가능하며 이는 곧 현저히 약화된 viral pathogenicity를 의미하므로 그 자체로서 항바이러스 효과를 유발한다고 할 수 있으므로 다중표적효소 저해능을 갖는 항-HCV 화합물의 개발은 바이러스 선택성 및 안전성, 내성의 극복, combination therapy에의 응용 등 다양한 효과를 나타낼 수 있을 것으로 기대된다. 다중표적효소를 저해하는 단일 약물 [Multi-target-directed ligands (MTDLs)]의 개념은 약제내성에 효과적으로 대처하고 치료효과를 높이기 위해 항암제 개발 (Petrelli, A.; Giordano, S. From single- to multi-target ddrugs in cancer therapy: when aspecificity becomes an advantage Curr . Med . Chem . 2008, 15, 422-432)와 parasitic infection (Jenwitheesuk , E.; Samudrala, R. Identification of potential multitarget antimalarial drugs JAMA 2005, 294, 1490-1491; Biot, C.; Chibale, K. Novel approaches to antimalarial drug discovery Infectious Disorders - Drug Targets 2006, 6, 173-204) 분야에서 연구되기 시작한 신개념 약물이다.

본 발명자들은 HCV의 헬리카제와 RNA 복제효소가 nucleotide를 기질로 사용한다는 점에 착안하여 이 두가지 HCV 표적효소와 동시에 결합하여 효소활성을 저해할 수 있는 물질을 고안할 수 있을 것으로 기대하고 연구한 결과, HCV RNA 복제효소 저해제로 알려진 아릴디케토산 (aryl diketoacid, ADK) 유도체가 (Kim, J.; Kim, K. S.; Lee, H. S.; Park, K. S.; Park, S. Y.; Kang, S. Y.; Lee, S. J.; Park, H. S.; Kim, D. E.; Chong, Y. Effects of the aryl linker and the aromatic substituent on the anti-HCV activities of aryl diketoacid (ADK) analogues Bioorg . Med . Chem . Lett . 2008, 18, 4661-4665) 사스 코로나 바이러스 (SARS-CoV)의 헬리카제 활성 역시 효과적으로 저해함을 확인하였다 (Lee, C.; Lee, J. M.; Lee, N. R.; Jin, B. S.; Jang, K. J.; Kim, D. E.; Jeong, Y. J.; Chong, Y. Aryl diketoacids (ADK) selectively inhibit duplex DNA-unwinding activity of SARS coronavirus NTPase/helicase Bioorg . Med . Chem. Lett . 2009, 19, 1636-1638). 특히, SARS-CoV는 HCV와 같은 RNA 바이러스이므로 본 발명자들은 ADK가 HCV 헬리카제에 대한 저해제로도 작용할 수 있을 것으로 기대하였다.

그러나 다중표적효소 저해제로서의 가능성을 보인 ADK 유도체들은 화학적 불안정성, 혈장 단백질과의 비가역적인 공유결합 형성, 그리고 혈장 내에서의 불안정성 등의 문제점을 가지고 있어 약물로 개발하는데 문제가 있어 본 발명자들은 ADK의 모핵 구조를 ADK보다 더 안정하며 ADK의 bioisostere로 잘 알려져 있는 디히드록시크로몬 (dihydroxychromone, DHC) 구조로 바꾸고자 노력하였고 그 결과 [도 1]에 나타낸 케르세틴 유도체들에서 강력한 SARS-CoV 헬리카제 저해활성을 확인하였다 (Lee, C.; Lee, J. M.; Lee, N. -R.; Kim, D. -E.; Jeong, Y. -J.; Chong, Y. Investigation of the pharmacophore space of Severe Acute Respiratory Syndrome coronavirus (SARS-CoV) NTPase/helicase by dihydroxychromone derivatives Bioorg. Med . Chem . Lett . 2009, 19, 4538-4541).

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 C형 간염 바이러스의 생환주기에서 핵심적인 역할을 담당하는 HCV RNA 복제효소 및 HCV 헬리카제를 동시에 저해함으로써 궁극적으로는 다중표적 저해능을 갖는 새로운 C형 간염 치료제로 개발하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:

[화학식 1]

상기 화학식에서 R은 할로겐, CN, (C₁-C₄) 알킬, (C₁-C₄) 알콕시, NO₂로 구성된 군으로부터 선택된 치환기이고 오르소(ortho)-, 메타-, 또는 파라- 위치에 존재하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 "할로겐"은 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도인 것이 바람직하다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 "(C₁-C₄) 알킬"은 구체적으로는 약 4개 이하의 탄소 원자를 갖는 1가의 포화 지방족 히드로카르빌기를 나타낸다. 탄화수소 쇄는 직쇄 또는 분지쇄일 수 있다. 상기 알킬기의 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소-부틸, tert-부틸 등이 있고 본 발명에서 알킬은 메틸인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 "(C₁-C₄) 알콕시"는 -OR 기 (식 중, R은 알킬임)를 나타낸다. 특정 알콕시기의 예로는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, tert-부톡시, sec-부톡시 등이 있고, 본 발명에서는 메톡시인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 R은 클로로, 브로모, CN, 메틸, 메톡시, NO₂로 구성된 군으로부터 선택된 치환기이고 오르소(ortho)-, 메타-, 또는 파라- 위치에 존재하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 상기 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염은 C형 간염 감염의 예방 또는 치료효과를 가지는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

상기 화학식에서 R은 할로겐, CN, (C₁-C₄) 알킬, (C₁-C₄) 알콕시, NO₂로 구성된 군으로부터 선택된 치환기이고 오르소(ortho)-, 메타-, 또는 파라- 위치에 존재함.

본 발명의 상기 조성물은 C형 간염 감염의 예방 또는 치료효과를 가지는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 a)케르세틴을 피리딘에 녹인 용액에 아세트산 무수물을 가하여 2-(3,4-다이아세톡시페닐)-4-옥소-4H-크로멘-3,5,7-트리일트리아세테이트를 합성하는 단계;b)상기 2-(3,4-다이아세톡시페닐)-4-옥소-4H-크로멘-3,5,7-트리일트리아세테이트와 이미다졸을 N-메틸피페리딘(NMP)과 티오페놀의 혼합물에 녹인 용액에 가하여 4-(3,5-다이아세톡시-7-하이드록시-4-옥소-4H-크로멘-2-일)-1,2-페닐렌다이아세테이트를 합성하는 단계; 및 c)상기 4-(3,5-다이아세톡시-7-하이드록시-4-옥소-4H-크로멘-2-일)-1,2-페닐렌다이아세테이트와 탄산칼륨을 아세톤에 녹인 혼합물에 아릴메틸브로미드를 가하는 단계를 포함하는 하기 화학식 1의 화합물의 제조방법을 제공한다.

[화학식 1]

이하 본 발명을 설명한다.

ADK 유도체들은 HCV RNA 복제효소와 SARS-CoV 헬리카제를 동시에 저해하는 활성을 보임으로써 궁극적으로 HCV의 헬리카제와 RNA 복제효소를 동시에 저해하는 다중표적효소 저해제로 기대된다. 그러나 ADK 유도체들은 화학적/생물학적 불안정성으로 인해 약물로 개발되기 어려우므로, 본 발명자들은 ADK의 bioisostere이면서 ADK보다 안정한 디히드록시크로몬 (DHC) 유도체를 이용하여 다중 HCV 표적효소 저해능을 갖는 물질을 발굴하고자 예의 노력한 결과, 케르세틴 유도체 중 HCV RNA 복제효소와 HCV helicase 저해활성을 동시에 저해하는 다중표적효소 저해능을 갖는 물질들을 발굴하고 발명을 완성하였다.

본 발명에서 "약학적으로 허용가능한 염"은 본 발명 화합물의 생물학적 특성은 유지하면서도 독성을 나타내지 않거나 제약 용도로 부적절하지 않은 임의의 본 발명 화합물의 염을 나타낸다. 이러한 염은 당업계에 공지된 다양한 유기 및 무기 반대이온으로부터 유래될 수 있으며, 이들을 포함한다. 이러한 염으로는 (1) 유기 또는 무기산, 예컨대 염산,브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 술팜산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 트리클로로아세트산, 프로피온산,헥산산, 시클로펜틸프로피온산, 글리콜산, 글루타르산, 피루브산, 락트산, 말론산, 숙신산, 소르브산, 아스코르브산, 말산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-히드록시벤조일)벤조산, 피크르산,신남산, 만델산, 프탈산, 라우르산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 1,2-에탄-디술폰산, 2-히드록시에탄술폰산, 벤젠 술폰산, 4-클로로벤젠술폰산, 2-나프탈렌술폰산, 4-톨루엔술폰산, 캄포르산, 캄포르술폰산, 4메틸비시클로 [2.2.2]-옥트-2-엔-1-카르복실산, 글루코헵톤산, 3-페닐프로피온산, 트리메틸아세트산, tert-부틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 벤조산, 글루탐산, 히드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산, 시클로헥실술팜산, 퀸산,뮤콘산 등과 형성된 산 부가염; 또는 (2) 모 화합물에 존재하는 산성 양성자가 (a) 금속 이온 (예를 들면, 알칼리 금속 이온, 알칼리 토금속 이온 또는 알루미늄 이온), 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 수산화물 (예컨대,나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 알루미늄, 리튬, 아연 및 바륨 수산화물), 암모니아로 치환되거나, 또는 (b) 유기 염기, 예컨대 지방족, 지환족 또는 방향족 유기 아민, 예를 들면 암모니아, 메틸아민, 디메틸아민, 디에틸아민, 피콜린, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 에틸렌디아민, 리신, 아르기닌, 오르니틴, 콜린,N,N'-디벤질에틸렌-디아민, 클로로프로카인, 디에탄올아민, 프로카인, N-벤질페네틸아민, N-메틸글루카민 피페라진, 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄, 테트라메틸암모늄 히드록시드와 배위결합한 경우에 형성된 염 등이 있다.

또한, 염의 예로는 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄, 테트라알킬암모늄 염 등이 있으며, 화합물이 염기성 관능기를 함유하는 경우에는 비독성 유기산 또는 무기산과의 염, 예컨대 히드로할라이드 (예를 들면, 히드로클로라이드 또는 히드로브로마이드), 술페이트, 포스페이트, 술파메이트, 니트레이트, 아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 트리클로로아세테이트, 프로피오네이트, 헥사노에이트, 시클로펜틸프로피오네이트, 글리콜레이트,글루타레이트, 피루베이트, 락테이트,말로네이트, 숙시네이트, 소르베이트, 아스코르베이트, 말레이트, 말레에이트, 푸마레이트, 타르타레이트, 시트레이트, 벤조에이트, 3-(4-히드록시벤조일)벤조에이트, 피크레이트, 신나메이트, 만델레이트, 프탈레이트, 라우레이트,메탄술포네이트 메실레이트), 에탄술포네이트, 1,2-에탄-디술포네이트, 2-히드록시에탄술포네이트, 벤젠술포네이트(베실레이트), 4-클로로벤젠술포네이트, 2-나프탈렌술포네이트, 4-톨루엔술포네이트, 캄포레이트, 캄포르술포네이트, 4-메틸비시클로[2.2.2]-옥트-2-엔-1-카르복실레이트,글루코헵토네이트, 3-페닐프로피오네이트, 트리메틸아세테이트, tert-부틸아세테이트, 라우릴 술페이트, 글루코네이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 히드록시나프토에이트, 살리실레이트, 스테아레이트,시클로헥실술파메이트, 퀴네이트, 뮤코네이트 염 등이 있다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 하나 이상의 비대칭 중심을 가질 수 있으며, 따라서 이러한 화합물은 개별 (R)-거울상이성질체 또는 (S)-거울상이성질체, 또는 이들의 혼합물로 제조될 수 있다. 달리 지시되지 않는 한, 예를 들면 화학식 중 임의의 위치에서의 입체화학 명명법에 의한 본 명세서 및 특허청구범위의 특정 화합물에 대한 설명 또는 명칭은 개별 거울상이성질체 및 이들의 라세미체 혼합물 또는 기타 혼합물을 모두 포함하는 것으로 한다. 입체화학 결정 방법 및 입체이성질체 분리 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 염기로의 처리시 본원에 도시된 화합물의 입체이성질체를 제공한다.

사용된 용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에서 혼용가능하게 사용된다. 용어 "대상체(들)"은 동물, 예를 들어 비-영장류 (예를 들면, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트 및 마우스) 및 영장류 (예를 들면, 원숭이, 예를 들어 사이노몰구스 (cynomolgous) 원숭이, 침팬지 및 인간)를 비롯한 포유동물, 및 예를 들어, 인간을 나타낸다. 한 실시양태에서, 대상체는 C형 간염 감염에 대한 현행 처치법에 저항성이거나 반응하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 축산용 동물 (예를 들면, 말, 소, 돼지 등) 또는 애완용 동물 (예를 들면, 개 또는고양이)이다. 바람직한 실시양태에서, 대상체는 인간이다.

본원에 사용된 용어 "치료제(들) 또는 치료용 조성물"은 장애 또는 그의 1종 이상의 징후를 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있는 임의의 작용제(들)을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 용어 "치료제"는 본 발명의 화합물을 나타낸다. 다른 특정 실시양태에서, 용어 "치료제"는 본 발명의 화합물을 나타내지 않는다. 한 실시양태에서, 치료제는 장애 또는 그의 1종 이상의 징후를 치료 또는 예방하는 데 유용한 것으로 공지되어있거나, 상기 목적을 위해 사용되어 왔거나, 현재 사용되고 있는 작용제이다.

"치료 유효량"은 질환 치료를 위해 대상체에게 투여되었을 때 상기 질환 치료에 효과를 나타내기에 충분한 화합물, 복합체 또는 조성물의 양을 의미한다. "치료 유효량"은 특히 화합물, 질환 및 그의 중증도, 및 치료 대상의 연령, 체중 등에 따라 달라질 수 있다.

한 실시양태에서, 임의의 질환 또는 장애를 "치료하는" 것 또는 이들의 "치료"는 대상체에 존재하는 질환 또는 장애를 개선시키는 것을 나타낸다. 또다른 실시양태에서, "치료하는" 또는 "치료"는 하나 이상의 신체 파라미터를 개선시키는 것을 나타내며, 대상체는 이를 인식하지 못할 수도 있다. 또다른 실시양태에서, "치료하는"또는 "치료"는 질환 또는 장애를 신체적으로 조절하는 것 (예를 들면, 인식가능한 징후의 안정화) 또는 생리학적으로 조절하는 것 (예를 들면, 신체 파라미터의 안정화), 또는 이 둘 모두를 나타낸다. 또다른 실시양태에서, "치료하는" 또는 "치료"는 질환 또는 장애의 발병을 지연시키는 것을 나타낸다.

본원에 사용된 용어 "예방제(들)"은 장애 또는 그의 1종 이상의 징후를 예방하는 데 사용될 수 있는 임의의 작용제(들)을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 용어 "예방제"는 본 발명의 화합물을 나타낸다. 다른 특정 실시양태에서, 용어 "예방제"는 본 발명의 화합물은 나타내지 않는다. 예를 들어, 예방제는 장애의 발병, 발전, 진행 및/또는 심화를 예방 또는 지연시키는데 유용한 것으로 공지되어 있거나, 또는 상기 목적을 위해 사용되어 왔거나 현재 사용되고 있는 작용제이다.

본원에 사용된 용어 "예방하다", "예방하는" 및 "예방"은 요법제 (예를 들면, 예방제 또는 치료제) 또는 요법제의 조합물 (예를 들면, 예방제 또는 치료제의 조합물)을 투여하여 대상체에서 장애의 1종 이상의 징후가 재발,발병 또는 발전되는 것을 예방하는 것을 나타낸다.

본원에 사용된 어구 "예방 유효량"은 장애와 관련된 1종 이상의 징후의 발전, 재발 또는 발병을 예방하거나, 또는 또다른 요법제 (예를 들면, 또다른 예방제)의 예방 효과(들)을 증대 또는 개선시키기에 충분한 요법제 (예를들면, 예방제)의 양을 나타낸다.

본 발명의 방법에 사용되는 플라보놀 유도체는 바람직하게는 1종 이상의 화학식 I의 화합물, 적절한 경우에는 염 형태의 화합물을 단독으로 사용하거나, 또는 1종 이상의 적합한 제약상 허용되는 담체, 예컨대 희석제 또는 아주반트와, 또는 또다른 항-HCV 제제와 조합된 형태로 함유하는 제약 조성물을 사용함으로써 제공된다.

임상 실무에서, 본 발명의 유도체는 임의의 통상적인 경로, 특히 경구, 비경구, 직장 경로로 투여되거나, 또는 흡입 (예를 들면, 에어로졸 형태로)에 의해 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 플라보놀 유도체는 바람직하게는 경구 투여된다.

경구 투여용 고체 조성물로서, 정제, 환제, 경질 젤라틴 캡슐제, 분제 또는 과립제를 사용할 수 있다. 이들 조성물에서, 본 발명에 따른 화합물은 1종 이상의 불활성 희석제 또는 아주반트, 예컨대 수크로스, 락토스 또는 전분과 혼합된다.이들 조성물은 희석제 이외에도, 예를 들면 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트, 또는 제어 방출을 위한 코팅제와 같은 물질을 포함할 수 있다.

경구 투여용 액체 조성물로서, 불활성 희석제, 예컨대 물 또는 액체 파라핀을 함유하는 제약상 허용되는 용액제, 현탁액제, 에멀젼, 시럽 및 엘릭시르를 사용할 수 있다. 이들 조성물은 또한, 희석제 이외에도, 예를들면 습윤제, 감미제 또는 향미제와 같은 물질을 포함할 수 있다.

비경구 투여용 조성물은 에멀젼 또는 멸균 용액제일 수 있다. 용매 또는 비히클로서, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 특히, 올리브유 또는 주사용 유기 에스테르, 예를 들면 에틸 올레에이트를 사용할수 있다. 이들 조성물은 또한 아주반트, 특히 습윤제, 등장화제, 유화제, 분산제 및 안정화제를 함유할 수 있다. 멸균은 여러 방식으로 수행할 수 있는데, 예를 들면 박테리아용 필터를 사용하거나, 방사선을 조사하거나, 또는 가열함으로써 수행할 수 있다. 이들은 또한 사용할 때 멸균수 또는 임의의 다른 주사용 멸균 매질에 용해될 수 있는 멸균 고체 조성물의 형태로 제조될 수 있다.

직장 투여용 조성물은 좌제 또는 직장 투여용 캡슐제이며, 이들은 활성 성분 이외에 부형제, 예컨대 코코아 버터, 반합성 글리세리드 또는 폴리에틸렌 글리콜을 함유한다.

조성물은 또한 에어로졸일 수 있다. 액체 에어로졸 형태로 사용하는 경우,조성물은 안정한 멸균용액제이거나, 또는 사용할 때 비발열성 멸균수, 염수 또는 임의의 다른 제약상 허용되는 비히클에 용해되는 고체 조성물일 수 있다. 직접 흡입하기 위한 무수 에어로졸 형태로 사용하는 경우, 활성 성분은 미분되어 수용성 고체 희석제 또는 비히클, 예를 들면 덱스트란, 만니톨 또는 락토스와 함께혼합된다.

한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 제약 조성물 또는 단일 단위 투여 형태이다. 본 발명의 제약 조성물 및 단일 단위 투여 형태는 예방상 또는 치료 유효량의 1종 이상의 예방제 또는 치료제 (예를 들면, 본 발명의 화합물, 또는 다른 예방제 또는 치료제), 및 통상적으로 1종 이상의 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다.

특정 실시양태 및 문맥에서, 용어 "약학적으로 허용되는"은 동물, 보다 구체적으로는 인간에 사용될 수 있는 것으로 정부 또는 정부의 규제 기관에 의해 승인되었거나 또는 일반적으로 공인된 약전에 열거되어 있는 것을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 아주반트 (예를 들면, 프로인트(Freund) 아주반트 (완전 및 불완전 아주반트)), 부형제 또는 비히클을 나타낸다. 이러한 제약 담체는 멸균 액체, 예컨대 물, 및 석유, 동물 또는 식물 기원의 오일 또는 합성 오일을 비롯한 오일, 예를 들면 낙화생유, 대두유, 미네랄 오일, 참깨유 등일 수 있다. 물은 제약 조성물이 정맥내 투여되는 경우에 바람직한 담체이다.

염수 용액, 및 덱스트로스 및 글리세롤 수용액은 또한 액체 담체, 특히 주사용 용액으로 사용될 수 있다. 적합한 제약 담체의 예는 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin]에 기재되어 있다.

통상적인 제약 조성물 및 투여 형태는 1종 이상의 부형제를 포함한다. 적합한 부형제는 제약 분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 적합한 부형제의 비제한적 예로는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀,밀가루, 호분, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 탈지 분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등이 있다. 특정 부형제가 제약 조성물 또는 투여 형태에 혼입되는 것이 적합한지 여부는 투여 형태가 대상체에게 투여되는 방식 및 투여 형태에 포함된 특정 활성 성분 등을 비롯한 당업계에 공지된 다양한 요소에 좌우된다. 경우에 따라, 조성물 또는 단일 단위 투여 형태는 또한 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다.

본 발명은 또한 활성 성분을 포함하는 무수 제약 조성물 및 투여 형태를 포함한다. 예를 들면, 물 (예를 들면, 5)을 첨가하는 것은 시간에 경과함에 따라 제제의 특성 (예컨대,저장 수명 또는 안정성)을 결정하기 위한 모의 장기 보관 수단으로서 제약 업계에 널리 허용되어 있다. 예를들면, 문헌 [Jens T. Carstensen, Drug Stability: Principles Practice, 2d. Ed., Marcel Dekker, NY,NY, 1995, pp. 379 80]을 참조한다. 실제로, 물 및 열이 몇몇 화합물의 분해를 가속화시킨다. 따라서, 통상적으로 제제를 제조, 취급, 포장, 보관, 운송 및 사용하는 동안에는 수분 및/또는 습기가 발생하므로 물이 제제에 미치는 영향이 매우 중요할 수 있다.

본 발명의 무수 제약 조성물 및 투여 형태는 무수 또는 저수분 성분 및 낮은 수분 또는 낮은 습도 조건을 이용하여 제조할 수 있다. 제조, 포장 및/또는 보관 중에 수분 및/또는 습기와 실질적으로 접촉할 것이 예상된다면, 락토스, 및 1급 또는 2급 아민을 포함하는 1종 이상의 활성 성분을 포함하는 제약 조성물 및 투여형태는 무수물 형태인 것이 바람직하다.무수 제약 조성물은 그의 무수 특성이 유지되도록 제조하여 보관해야 한다. 따라서, 무수 조성물이 물에 노출되는 것을 방지하고 적합한 규격 키트에 포함될 수 있도록 공지된 물질을 사용하여 포장하는 것이 바람직하다. 적합한 포장의 예로는, 밀봉형 호일, 플라스틱, 단위 투여 용기 (예를 들면, 바이알), 블리스터 팩 및 스트립 팩이 있으나 이에 한정되지는 않는다.

본 발명은 또한 활성 성분의 분해 속도를 감소시키는 1종 이상의 화합물을 포함하는 제약 조성물 및 투여 형태를 포함한다. 이러한 화합물 (본원에서는 "안정화제"로 지칭함)로는 항산화제 (예컨대, 아스코르브산), pH 완충제 또는 염 완충제가 있으나 이에 한정되지는 않는다.

제약 조성물 및 단일 단위 투여 형태는 용액제, 현탁액제, 에멀젼, 정제, 환제, 캡슐제, 분제, 서방형 제제 등의 형태를 취할 수 있다. 경구 투여용 제제는 표준 담체, 예컨대 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등을 포함할 수 있다. 이러한 조성물 및 투여 형태는 예방상 또는 치료 유효량의 예방제 또는 치료제를 바람직하게는 정제된 형태로 적합한 양의 담체와 함께 함유하며, 대상체에 투여하기 적절한 형태로 제공될 것이다. 제제는 투여 방식에 적합해야 한다. 바람직한 실시양태에서, 제약 조성물 또는 단일 단위 투여 형태는 멸균 상태이며, 대상체, 바람직하게는 동물 대상체, 보다 바람직하게는 포유동물 대상체, 가장 바람직하게는 인간 대상체에게 투여하기 적합한 형태이다.

본 발명의 제약 조성물은 그의 의도된 투여 경로에 적합하도록 제제화된다. 투여 경로의 예로는 비경구 투여 경로, 예를 들면, 정맥내, 피내, 피하, 근육내, 피하, 경구, 구강, 설하, 흡입, 비강내, 경피, 국소, 경점막, 종양내, 활액내 및 직장 투여 경로가 있으나 이에 한정되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 조성물은 통상적인 절차에 따라 인간에게 정맥내, 피하, 근육내, 경구, 비강내 또는 국소 투여되도록 변형된 제약 조성물로 제제화된다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 통상적인 절차에 따라 인간에게 피하 투여되는 조성물로 제제화된다.

통상적으로, 정맥내 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액 중의 용액이다. 필요한 경우에, 조성물은 또한 가용화제 및 국부 마취제 (예컨대, 리그노카인)를 포함하여 주사 부위의 통증을 진정시킬 수 있다.

투여 형태의 예로는 정제; 캐플릿; 캡슐제, 예컨대 연질 탄성 젤라틴 캡슐제; 카세; 트로키; 로젠지; 분산액제; 좌제; 연고; 습포제 (찜질약);페이스트; 분제; 드레싱; 크림; 고약; 용액제; 패치; 에어로졸 (예를 들면, 비강 스프레이 또는 흡입기); 겔; 현탁액제 (예를 들면, 수성 또는 비수성 액체 현탁액제, 수중유 에멀젼, 또는 유중 수 액체 에멀젼), 용액제 및 엘릭시르를 포함하는 대상체에게 경구 또는 점막 투여하기 적합한 액체 투여 형태; 대상체에게 비경구 투여하기에 적합한 액체 투여 형태; 및 복원되었을 때 대상체에게 비경구 투여하기에 적합한

액체 투여 형태를 제공할 수 있는 멸균 고체 (예를 들면, 결정형 또는 무정형고체)가 있으나 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 조성물, 형태 및 투여 형태의 유형은 통상적으로 이들의 용도에 따라 달라질 것이다. 예를 들면, 바이러스 감염의 초기 치료에 사용되는 투여 형태는 1종 이상의 활성 성분을 바이러스 감염의 유지 요법에 사용되는 투여 형태에 포함된 양보다 더 많은 양으로 함유할 수 있다. 이와 유사하게, 비경구 투여 형태는 1종 이상의 활성 성분을 동일한 질환 또는 장애 치료에 사용되는 경구 투여 형태에 포함된 양보다 더 적은 양으로 함유할 수 있다. 상기 방식 및 본 발명에 포함되는 특정 투여 형태를 변형시키는 또 다른 방식은 당업자에게 이미 명백할 것이다. 예를 들면, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing, Easton PA (1990)]을 참조한다.

본 발명 조성물의 성분은 일반적으로, 예를 들면 활성제의 양을 표기한 앰풀 또는 샤세와 같은 밀봉된 용기 중 무수 동결건조된 분말 또는 수분 무함유 농축물로서, 단위 투여 형태 중에 별개로 또는 함께 혼합된 형태로 제공된다. 조성물을 주입에 의해 투여하는 경우, 이 조성물은 멸균된 제약 등급의 물 또는 염수를 함유하는 주입 용기에 분배될 수 있다. 조성물을 주사에 의해 투여하는 경우, 투여하기 전에 성분을 혼합할 수 있도록 주사용 멸균수 또는 염수 앰풀을 제공할 수 있다.

본 발명의 통상적인 투여 형태는 본 발명의 화합물, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 수화물을 약 0.1 mg 내지 약 1000 mg/일 범위의 양으로 포함하며, 이는 오전에 1일 1회 단일 투여하거나, 바람직하게는 하루동안 식사와 함께 분할 투여한다. 본 발명의 특정 투여 형태는 플라보놀 유도체 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4,0.5, 1.0, 2.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 20.0, 25.0, 50.0, 100, 200, 250, 500 또는 1000 mg을 갖는다.

경구 투여하기 적합한 본 발명의 제약 조성물은 별개의 투여 형태, 예컨대 정제 (예를 들면, 츄잉 정제), 캐플릿, 캡슐제 및 액체 (예를 들면, 향미 시럽) 등의 형태로 존재할 수 있다. 이러한 투여 형태는 미리 결정된 양의 활성 성분을 함유하며, 당업자에게 공지된 조제 방법에 의해 제조할 수 있다. 일반적으로, 문헌

[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing, Easton PA (1990)]을 참조한다. 특정 실시양태에서, 경구 투여 형태는 고체이며, 상기 단락에 상세하게 기재된 바와 같이 무수 성분을 사용하여 무수 조건하에 제조한다.

그러나, 본 발명의 범위는 무수 고체 경구 투여 형태 이외의 것까지 확장된다. 본 발명의 통상적인 경구 투여 형태는 활성 성분(들)을 통상적인 제약 합성 기술에 따라 1종 이상의 부형제와 친밀 혼합물로서 합하여 제조한다. 부형제는 투여하기 바람직한 제제의 형태에 따라 매우 다양한 형태를 취할 수 있다. 예를 들면, 경구 투여용 액체 또는 에어로졸 투여 형태에 사용하기 적합한 부형제로는 물, 글리콜,오일, 알코올, 향미제, 보존제 및 착색제가 있으나 이에 한정되지는 않는다. 고체 경구 투여 형태 (예를 들면,분제, 정제, 캡슐제 및 캐플릿)에 사용하기 적합한 부형제로는 전분, 당, 미정질 셀룰로스, 희석제, 과립화제,윤활제, 결합제 및 붕해제가 있으나 이에 한정되지는 않는다. 고체 부형제가 사용되는 경우에는 정제 및 캡슐제가 투여하기 쉽기 때문에 가장 유리한 경구 투여 단위 형태로 나타난다. 바람직한 경우, 정제는 표준 수성 또는 비수성 기술에 의해 코팅될 수 있다. 이러한 투여 형태는 임의의 조제 방법에 의해 제조될 수 있다.

일반적으로, 제약 조성물 및 투여 형태는 활성 성분을 액체 담체,미분된 고체 담체, 또는 이들 둘 모두와 균일하고 친밀하게 혼합한 후에, 필요한 경우에는 생성물을 원하는 형상으로 성형시켜 제조한다.예를 들면, 정제는 압축 또는 성형에 의해 제조할 수 있다. 압축된 정제는 임의로는 부형제와 혼합된 자유 유동 형태 (예컨대, 분말 또는 과립)의 활성 성분을 적합한 기계에서 압축시켜 제조할 수 있다. 성형된 정제는 불활성 액체 희석제로 적신 분말 화합물의 혼합물을 적합한 기계에서 성형하여 제조할 수 있다.

본 발명의 경구 투여 형태에 사용될 수 있는 부형제의 예로는 결합제, 충전제, 붕해제 및 윤활제가 있으나 이에 한정되지는 않는다. 제약 조성물 및 투여 형태에 사용하기 적합한 결합제로는 옥수수 전분, 감자 전분 또는 다른 전분,젤라틴, 천연 및 합성 검, 예컨대 아카시아 검, 나트륨 알기네이트, 알긴산, 다른 알기네이트, 분말 트래거캔스, 구아 검, 셀룰로스 및 그의 유도체 (예를 들면, 에틸 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 카르복시메틸 셀룰로스 칼슘, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스), 폴리비닐 피롤리돈, 메틸 셀룰로스, 전호화된 전분, 히드록시프로필 메틸 셀룰로스, (예를 들면, 번호 2208, 2906, 2910), 미정질 셀룰로스, 및 이들의 혼합물이 있으나 이에 한정되지는 않는다.

본원에 개시된 제약 조성물 및 투여 형태에 사용하기 적합한 충전제의 예로는 활석, 탄산칼슘 (예를 들면, 과립 또는 분말), 미정질 셀룰로스, 분말셀룰로스, 덱스트레이트, 카올린, 만니톨, 규산, 소르비톨, 전분, 전호화된 전분, 및 이들의 혼합물이 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 제약 조성물에 포함된 결합제 또는 충전재는 통상적으로 제약 조성물 또는 투여 형태의 약 50 내지 약 99 중량의 양으로 존재한다. 미정질 셀룰로스의 적합한 형태로는 아비셀(AVICEL) PH 101, 아비셀 PH 103, 아비셀 RC 581, 아비셀 PH 105로 시판되는 물질 (에프엠씨 코포레이션, 아메리칸 비스코스 디비젼, 아비셀 세일즈 (FMC Corporation, American Viscose Division, Avicel Sales; 미국 펜실베니아주 마쿠스 훅 소재)로부터 시판됨), 및 이들의 혼합물이 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 구체적인 결합제는 아비셀 RC 581로 시판되는 미정질 셀룰로스와 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스의 혼합물이다. 적합한 무수 또는 저수분 부형제 또는 첨가제로는 아비셀 PH 103(상표명) 및 전분 1500 LM이 있다.

본 발명의 조성물에 붕해제를 사용함으로써 수성 환경에 노출되었을 때 붕해되는 정제를 제공한다. 너무 많은 붕해제를 함유하는 정제는 보관시 붕해될 수 있으며, 너무 적은 붕해제를 함유하는 정제는 원하는 속도로 붕해되지 않거나 원하는 조건하에서 붕해되지 않을 수 있다. 따라서, 너무 많지도 너무 적지도 않아 활성 성분의 방출을 유해하게 변경시키지 않는 충분한 양의 붕해제를 사용하여 본 발명의 고체 경구 투여 형태를 형성해야 한다. 사용되는 붕해제의 양은 제제의 유형에 따라 달라지며, 당업자가 용이하게 결정할 수 있다. 통상적인 제약 조성물은 약 0.5 내지 약 15 중량%, 구체적으로는 약 1 내지 약 5 중량%의 붕해제를 포함한다. 본 발명의 제약 조성물 및 투여 형태에 사용될 수 있는 붕해제로는 한천, 알긴산, 탄산칼슘, 미정질 셀룰로스, 크로스카르멜로스 나트륨, 크로스포비돈, 폴라크릴린 칼륨, 나트륨 전분 글리콜레이트, 감자 또는 타피오카 전분, 전호화된 전분, 다른 전분, 점토, 다른 알긴, 다른 셀룰로스, 검, 및 이들의 혼합물이 있으나 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 제약 조성물 및 투여 형태에 사용될 수 있는 윤활제로는 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 미네랄 오일, 미네랄 경유, 글리세린, 소르비톨, 만니톨, 폴리에틸렌 글리콜, 다른 글리콜, 스테아르산, 나트륨 라우릴 술페이트, 활석, 수소화된 식물성 오일 (예를 들면, 낙화생유, 면실유, 해바라기씨유, 참깨유,올리브유, 옥수수 오일 및 대두유), 아연 스테아레이트, 에틸 올레에이트, 에틸 라우레에이트, 한천, 및 이들의 혼합물이 있으나 이에 한정되지는 않는다. 추가의 윤활제로는, 예를 들면 실로이드 실리카 겔 (AEROSIL 200, 더블유.알. 그레이스 코포레이션 (W.R. Grace Co.; 미국 매릴랜드주 발티모어 소재)에서 제조됨), 합성 실리카의 응고된 에어로졸 (데구사 코포레이션 (Degussa Co.; 미국 텍사스주 피아노 소재)에서 시판됨), CAB O SIL(발열성 이산화규소 제품, 캐봇 코포레이션 (Cabot Co.; 미국 메사추세츠주 보스톤 소재)에서 시판됨), 및 이들의 혼합물이 있다. 사용되는 경우, 윤활제는 통상적으로 이들이 혼입되는 제약 조성물 또는 투여 형태의 약 1 중량% 미만의 양으로 사용된다.

본 발명의 화합물은 예컨대 당업자에게 공지된 제어 방출 수단 또는 전달 장치로 투여할 수 있다. 이들의 예로는 미국 특허 제3,845,770호, 동 제3,916,899호, 동 제3,536,809호, 동 제3,598,123호, 동 제4,008,719호, 동 제5,674,533호, 동 제5,059,595호,동 제5,591,767호, 동 제5,120,548호, 동 제5,073,543호,동 제5,639,476호, 동 제5,354,556호 및 동 제5,733,566호 (이들 문헌은 각각 그 거명을 통해 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 것들이 있으나 이에 한정되지는 않는다. 이러한 투여 형태는, 예를 들면 다양한 비율에서 원하는 방출 프로파일을 제공하기 위해 히드로프로필메틸 셀룰로스, 다른 중합체 매트릭스, 겔, 투과가능한 막, 삼투 시스템, 다층 코팅, 미립자, 리포좀, 미소구, 또는 이들의 조합물을 이용하여, 1종 이상의 활성 성분을 지연 방출 또는 제어 방출시킬 때 사용할 수 있다. 본원에 기재된 것들을 비롯하여 당업자에게 공지된 적합한 제어 방출형 제제는 본 발명의 활성 성분과 함께 사용하기 위해 용이하게 선택할 수 있다. 따라서, 본 발명은 경구 투여에 적합한 단일 단위 투여 형태, 예컨대 제어 방출형으로 변형된 정제,캡슐제, 겔캡 및 캐플릿 등을 포함한다.

모든 제어 방출형 약품은 이들에 상응하는 비-제어 방출형 약품에 의해 달성되는 것보다 개선된 약물 요법을 제공하고자 하는 공통적인 목적을 갖는다. 이상적으로, 의학적 처치에 가장 알맞게 고안된 제어 방출형 제제의 사용은 최소량의 약물 물질을 사용하여 최소 시간 내에 증상을 치유 또는 제어함을 특징으로 한다. 제어 방출형 제제의 이점은 약물의 확장된 활성, 투여 횟수의 감소 및 대상체의 순응성 증가를 포함한다. 또한, 제어 방출형 제제를 사용하여 약물의 작용 개시 시간 또는 다른 특성, 예컨대 약물의 혈중 농도에 영향을 끼칠 수 있으며, 이에 따라 부작용 (역효과) 발생에도 영향을 끼칠 수 있다.

대부분의 제어 방출형 제제는 처음에는 원하는 치료 효과를 즉각적으로 나타내는 양의 약물 (활성 성분)을 방출하고, 연장된 기간에 걸쳐 상기 치료 또는 예방 효과 수준을 지속시키는 양의 약물을 단계적 및 지속적으로 방출하도록 고안되어 있다. 이와 같이 체내에서 일정한 약물 수준을 유지하기 위해, 약물은 대사되어 인체에서 분비되는 약물의 양을 대체하는 속도로 투여 형태로부터 방출되어야 한다. 활성 성분의 제어 방출은 pH, 온도,효소, 물, 또는 다른 생리학적 조건 또는 화합물 등을 비롯한 다양한 조건에 의해 자극될 수 있다.

특정 실시양태에서, 약물은 정맥내 주입, 이식가능한 삼투압 펌프, 경피 팻치, 리포좀, 또는 기타 투여 방식을 사용하여 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 펌프가 사용될 수 있다 (문헌 [Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987)]; [Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980)]; [Saudek et al., N. Engl. J. Med.321:574 (1989)] 참조). 다른 실시양태에서, 중합 물질이 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 제어 방출시스템이 대상체에서 당업자에 의해 결정된 적합한 부위에서 위치할 수 있으며, 즉, 이로써 전신 투여량의 일부 만이 필요하다 (예를 들어, 문헌 [Goodson, Medical Applications of Controlled Release, vol.2, pp. 115-138(1984)] 참조). 기타 제어 방출 시스템은 랑거 (Langer [Science 249:1527-1533 (1990)])에 의해 재검토되어 논의되었다. 활성 성분은 고체 내부 매트릭스, 예를 들어 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리부틸메타크릴레이트,가소화된 또는 비가소화된 폴리비닐클로라이드, 가소화된 나일론, 가소화된 폴리에틸렌테레프탈레이트, 천연 고무, 폴리이소프렌, 폴리이소부틸렌, 폴리부타디엔, 폴리에틸렌, 에틸렌-비닐아세테이트, 공중합체, 실리콘고무, 폴리디메틸실록산, 실리콘 카르보네이트 공중합체, 친수성 중합체, 예컨대 아크릴산 및 메타크릴산의 에스테르의 히드로겔, 콜라겐, 가교 폴리비닐알코올 및 부분적으로 가수분해된 가교 폴리비닐 아세테이트 중에 분산될 수 있으며, 이는 외부 중합체막, 예를 들어 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 에틸렌/프로필렌 공중합체, 에틸렌/에틸 아크릴레이트 공중합체, 에틸렌/비닐아세테이트 공중합체, 실리콘 고무, 폴리디메틸 실록산, 네오프렌 고무, 염화 폴리에틸렌, 폴리비닐클로라이드; 비닐 아세테이트, 비닐리덴 클로라이드, 에틸렌 및 프로필렌과의 비닐클로라이드 공중합체, 이오노머 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 부틸 고무 에피클로로히드린 고무, 에틸렌/비닐 알코올 공중합체, 에틸렌/비닐 아세테이트/비닐 알코올 삼중중합체, 및 에틸렌/비닐옥시에탄올 공중합체에 의해 둘러싸여 있고, 이는 체액에 불용성이다. 이어서, 활성 성분은 방출 속도 제어 단계에서 외부 중합체막을 통해 확산된다. 그러한 비경구 조성물에서 활성 성분의 비율은 그의 특정 성질 뿐만 아니라 대상체의 필요에 따라 매우 달라진다.

본 발명은 또한 비경구 투여 형태도 제공한다. 비경구 투여 형태는 피하, 정맥내 (볼루스 주사 포함), 근육내 및 동맥내 투여 경로 등을 비롯한 다양한 경로로 대상체에게 투여될수 있다. 이들 비경구 투여 경로는 통상적으로 오염 물질에 대한 대상체의 자연적 방어 경로를 피해가기 때문에, 비경구 투여 형태는 멸균 상태이거나 대상체에 투여하기 전에 멸균시킬 수 있는 것이 바람직하다. 비경구 투여 형태의 예로는 주사용 용액, 제약상 허용되는 주사용 비히클에 용해되거나 현탁시킬 수 있는 무수 제품, 주사용 현탁액, 및 에멀젼이 있으나 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 비경구 투여 형태를 제공하는 데 사용될 수 있는 적합한 비히클이 당업자에게 공지되어 있다. 이들 의 예로는 주사용수 (USP); 수성 비히클, 예컨대 나트륨 클로라이드 주사액, 링거 주사액, 덱스트로스 주사액,덱스트로스 및 나트륨 클로라이드 주사액 및 락테이트화된 링거 주사액 등; 수혼화성 비히클, 예컨대 에틸 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜 등; 및 비수성 비히클, 예컨대 옥수수유, 면실유, 낙화생유, 참깨유, 에틸 올레에이트, 이소프로필 미리스테이트 및 벤질 벤조에이트 등이 있으나 이에 한정되지는 않는다.또한, 본원에 개시된 1종 이상의 활성 성분의 용해도를 증가시키는 화합물도 본 발명의 비경구 투여 형태에 혼입될 수 있다.

본 발명은 또한 경피, 국소 및 점막 투여 형태를 제공한다. 본 발명의 경피, 국소 및 점막 투여 형태로는 안구용 용액, 스프레이, 에어로졸, 크림, 로션, 연고, 겔, 용액, 에멀젼, 현탁액 또는 당업자에 공지된 다른 형태가 있으나 이에 한정되지는 않는다. 예를 들면, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th, 18th and 20th eds., Mack Publishing, Easton PA (1980, 1990 2000)] 및 [Introduction to Pharmaceutical dose form, 4th ed., Lea Febiger, Philadelphia (1985)]을 참조한다.

구강내 점막 조직을 처치하기 적합한 투여 형태는 구강세정용 용액 또는 경구용 겔 제제로 제제화될 수 있다.또한, 경피 투여 형태는 "저장소형" 또는 "매트릭스형" 패치를 포함하며, 이들은 피부 또는 상처 부위에 특정 기간 동안 적용되어 원하는 양의 활성 성분을 침투시킬 수 있다.

본 발명에 포함되는 적합한 부형제 (예를 들면, 담체 및 희석제), 및 경피, 국소 및 점막 투여 형태를 제공하는데 사용될 수 있는 다른 물질은 제약 분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 이들은 주어진 제약 조성물 또는 투여 형태가 적용되는 특정 조직에 따라 달라진다. 이러한 사실을 고려하여, 통상적인 부형제로는 로션, 팅크,크림, 에멀젼, 겔 또는 연고를 형성하는 물, 아세톤, 에탄올, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 부탄 1,3 디올,이소프로필 미리스테이트, 이소프로필팔미테이트, 미네랄 오일, 및 이들의 혼합물 등이 있으며, 이들은 비독성이고 제약상 허용되는 것이다. 바람직한 경우, 보습제 또는 습윤제를 제약 조성물 및 투여 형태에 첨가할 수도 있다. 이러한 부가 성분의 예는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th, 18th and 20th eds.,Mack Publishing, Easton PA (1980, 1990 2000)]를 참조한다.

치료될 특정 조직에 따라, 추가의 성분을 본 발명의 활성 성분으로 처치하기 전에 사용하거나, 본 발명의 활성 성분과 함께 사용하거나, 또는 본 발명의 활성 성분으로 처치한 후에 사용할 수 있다. 예를 들면, 침투 증진제를 사용하여 조직에 활성 성분을 전달시키는 것을 보조할 수 있다. 적합한 침투 증진제로는 아세톤; 다양한 알코올, 예컨대 에탄올, 올레일 및 테트라히드로푸릴; 알킬 술폭시드, 예컨대 디메틸 술폭시드; 디메틸 아세트아미드; 디메틸 포름아미드; 폴리에틸렌 글리콜; 피롤리돈, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 콜리돈 (Kollidon) 등급(포비돈, 폴리비돈); 우레아; 및 다양한 수용성 또는 수불용성 당 에스테르, 예컨대 Tween 80 (폴리소르베이트80) 및 Span 60 (소르비탄 모노스테아레이트)이 있으나 이에 한정되지는 않는다.

또한, 제약 조성물 또는 투여 형태의 pH, 또는 제약 조성물 또는 투여 형태가 적용되는 조직의 pH를 조정하여 1 종 이상의 활성 성분의 전달을 개선시킬 수 있다. 이와 유사하게, 용매 담체의 극성, 그의 이온 강도 또는 긴장성을 조정하여 상기 전달을 개선시킬 수 있다. 화합물, 예컨대 스테아레이트를 제약 조성물 또는 투여 형태에 첨가하여 1종 이상의 활성 성분의 친수성 또는 친유성을 유리하게 변경시킴으로써 상기 전달을 개선시킬 수도 있다. 이와 관련하여, 스테아레이트는 제제화용 액체 비히클, 유화제 또는 계면활성제, 및 전달 증진제 또는 침투 증진제로서 작용할 수 있다. 활성 성분의 다른 염, 수화물 또는 용매화물을 사용하여 생성된 조성물의 특성을 더 조정할 수 있다.

인간을 치료하는 경우, 의사는 예방 또는 치유적 치료, 및 치료할 대상체의 연령, 체중, 감염 단계 및 이들에게 특이적인 다른 요소에 따라 가장 적절한 것으로 여겨지는 투여 용량을 결정할 것이다. 일반적으로, 성인의 경우, 투여량은 약 1 내지 약 1000 mg/일, 약 5 내지 약 250 mg/일, 또는 약 10 내지 50 mg/일이다. 특정 실시양태에서, 투여량은 성인 1인 당 약 5 내지 약 400 mg/일, 보다 바람직하게는 25 내지 200 mg/일이다. 약 50 내지 약 500 mg/일의 투여 속도도 또한 바람직하다.

추가 측면에서, 본 발명은 C형 간염 바이러스 감염의 치료 또는 예방이 필요한 대상체에게 C형 간염 바이러스에 대해 높은 치료 지수를 갖는 본 발명의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효량으로 투여하여 상기 대상체에서 C형 간염 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 치료 지수는 당업자에게 공지된 임의의 방법, 예컨대 하기 실시예에 기재한 방법에 따라 측정할 수 있다. 특정 실시양태에서, 치료 지수는 C형 간염 바이러스에 유효한 화합물의 농도에 대한, 독성을 나타내는 화합물의 농도의 비율이다. 독성은 세포독성(예를 들면, IC50 또는 IC90) 및 치사량 (예를 들면, LD50 또는 LD90)을 비롯한 당업자에게 공지된 임의의 기술로측정할 수 있다. 이와 마찬가지로, 유효 농도 (예를 들면, EC50 또는 EC90) 및 유효 투여량 (예를 들면, ED50 또는 ED90)을 비롯한 당업자에게 공지된 임의의 기술을 이용하여 유효 농도를 측정할 수 있다. 바람직하게는, 유사한 측정값을 비율로 비교한다 (예를 들면, IC50/EC50, IC90/EC90, LD50/ED50 또는 LD90/ED90). 특정 실시양태에서, 치료 지수는 2.0, 5.0, 10.0, 15.0, 20.0, 25.0, 50.0, 75.0, 100.0, 125.0, 150.0 또는 그 이상만큼 높을 수 있다.

장애 또는 그의 1종 이상의 징후를 예방, 치료, 관리 또는 개선시키는데 유효한 본 발명 화합물 또는 조성물의 양은 질환 또는 증상의 특성 및 중증도, 및 활성 성분이 투여되는 경로에 따라 달라질 것이다. 투여 횟수 및 투여량 또한 투여된 특정 요법제 (예를 들면, 치료제 또는 예방제), 장애, 질환 또는 증상의 중증도, 투여 경로뿐만 아니라 대상체의 연령, 체중, 반응 및 과거 병력에 의존하는 각 대상체에 대한 특이적 요소에 따라 달라질것이다. 유효 투여량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유래된 투여량-반응 곡선으로부터 외삽법에 의해 추정할 수 있다.

조성물 투여량의 예는, 대상체 또는 샘플 중량 1 kg 당 활성 화합물의 양 (mg 또는 ㎍)으로서, 예를 들면 약 10 ㎍/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 100 ㎍/kg 내지 약 25 mg/kg, 또는 약 100 ㎍/kg 내지 약 10 mg/kg을 포함한다.

본 발명의 조성물의 경우, 대상체에 투여된 투여량은 통상적으로 활성 화합물의 중량에 기초하여 대상체 체중 1kg 당 0.140 mg 내지 3 mg이다. 바람직하게는, 대상체에 투여된 투여량은 대상체 체중 1 kg 당 0.20 mg 내지 2.00 mg 또는 0.30 mg 내지 1.50 mg이다.

일반적으로, 본원에 기재된 증상에 대해 제안된 본 발명 조성물의 일일 투여량 범위는 약 0.1 내지 약 1000 mg/일이며, 이는 1일 1회 단일 투여되거나 또는 하루 동안 분할 투여된다. 한 실시양태에서, 상기 일일 투여량은 동등한 양으로 분할되어 매일 2회 투여된다. 일일 투여량 범위는, 구체적으로는 약 10 내지 약 200 mg/일, 보다 구체적으로는 약 10 내지 약 150 mg/일, 보다 더 구체적으로는 약 25 내지 약 100 mg/일이어야 한다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 몇몇 경우에는 활성 성분을 본원에 개시된 투여량 범위를 벗어난 투여량으로 사용할 필요가 있을 수 있다. 또한, 임상의 또는 치료 담당의는 대상체의 반응과 관련하여 요법을 언제 어떻게 중단,조정 또는 종결해야 할지 알고 있을 것임에 주목한다.

당업자에게 이미 공지된 바와 같이, 상이한 질환 및 증상에 대해 상이한 치료 유효량을 적용할 수 있다. 이와 유사하게, 상기 장애를 예방, 관리, 치료 또는 개선시키기에는 충분하지만 본 발명의 조성물과 관련된 부작용을 유발하기에는 불충분하거나 상기 부작용을 감소시키기에 충분한 양이 또한 상기 기재된 투여량 및 투여 횟수 계획에 포함된다. 또한, 대상체에게 본 발명의 조성물을 다중 투여량으로 투여하는 경우, 모든 투여량이 동일할 필요는 없다. 예를 들면, 대상체에 투여되는 투여량을 증가시켜 조성물의 예방 또는 치료 효과를 개선시킬 수 있으며, 이를 감소시켜 특정 대상체가 경험하는 1종 이상의 부작용을 감소시킬 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서는 C형 간염 바이러스 RNA 복제효소와 헬리카제 활성을 동시에 저해하는 다중표적효소 저해제를 개발하고자 하였다.

우선, 선행연구를 통하여 HCV RNA 복제효소와 헬리카제를 동시에 저해하는 활성이 있음을 확인한 ADK 유도체의 불안정성을 해결하기 위한 bioisostere로서 DHC 구조를 선정하였는데, DHC 구조 ([도 2]에서 점선 박스)는 대부분의natural flavonoid가 공유하는 scaffold로서 본 발명에서는 가장 대표적인 flavonoid인 케르세틴의 모핵 구조에 ADK 유도체에서 핵심적인 pharmacophore로 제시되었던 말단 아릴메틸기 (도 2에서 실선 박스)를 도입한 유도체 (화합물 2, [도 2])의 라이브러리를 구축하기로 결정하였다. 실제로 [도 2]의 ADK와 케르세틴 유도체의 포개진 그림은 ADK와 DHC pharmacophore가 잘 겹쳐짐을 보여주고 있다.

따라서 본 발명에서는, 케르세틴의 7번 수산화기에 아릴 링커와 거기에 연결된 혐수성 작용기를 적절히 도입함으로써 화학식 1로 대표될 수 있는 ADK의 유사체를 합성하였으며 [도 3], 이 화합물들의 HCV RNA 복제효소 저해능 및 HCV 헬리카제 저해능을 검증함으로써 [도 4] 다중 HCV 표적효소 저해제로서의 새로운 용도를 발견하고 발명을 완결하였다.

이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명에서는 적절한 치환기를 도입한 케르세틴 유도체들에 의한 HCV RNA 복제효소 및 HCV 헬리카제 활성 저해능을 검증하였고 이를 통하여 다중 HCV 표적효소 저해제로서 새로운 C형 간염의 치료제로 사용될 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

도 1은 케르세틴 유도체에 의해 공지된 SARS-CoV 헬리카제 저해활성을 설명한다.
도 2는 ADK와 케르세틴 유도체가 구조적으로 유사함을 겹친 그림으로 보여준다.
도 3은 화학식 1로 대표되는 화합물들의 합성과정을 설명한다.
도 4는 화학식 1로 대표되는 화합물들에 의한 HCV RNA 복제효소 저해능, HCV 헬리카제 저해능, 세포내 HCV 증식 억제 효능, 그리고 세포독성 등을 표로 나타내었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 아니하는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1:2-(3,4-Diacetoxyphenyl)-4-oxo-4 H -chromene-3,5,7-triyltriacetate ( 1 )의 합성:

케르세틴 (5 g, 16.5 mmol)을 무수 피리딘 (40 mL)에 녹인 용액에 아세트산 무수물 (12.5 ml, 135 mmol)을 가하고 80 ℃에서 4 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 상온으로 냉각시킨 후, 감압증류하여 얻어진 잔류물을 실리카겔 관 크로마토그래피 (헥산:아세톤:디클로로메탄=4:1:1)로 정제하여 화합물 1을 엷은 노란색 고체로 얻었다 (4.5 g, 8.8 mmol, 54% 수율): ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.72 (dd, J = 8.6, 2.0 Hz, 1H), 7.70 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 7.35 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.33 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 6.88 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 2.43 (s, 3H), 2.34 (s, 12H).

실시예 2:4-(3,5-Diacetoxy-7-hydroxy-4-oxo-4 H -chromen-2-yl)-1,2- phenylenediacetate ( 2 )의 합성:

위에서 얻은 화합물 1 (3 g, 5.9 mmol)과 이미다졸 (80 mg, 1.2 mmol)을 N-methylpiperidine (NMP, 30 ml)과 티오페놀 (0.5 ml, 4.7 mmol)의 혼합물에 녹인 용액에 0 ℃에서 서서히 가하고 상온에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 2N 염산 수용액으로 씻은 후, 유기층을 황산마그네슘으로 탈수하였다. 고체를 거른 후 여과액을 감압증류하여 얻어진 잔류물을 실리카겔 관 크로마토그래피 (헥산:아세톤:디클로로메탄=2:1:1)로 정제하여 화합물 2를 흰색 고체로 얻었다: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ 11.33 (s, 1H), 7.83-7.80 (m, 2H), 7.51 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.94 (s, 1H), 6.65 (s, 1H), 2.33 (s, 6H), 2.30 (s, 6H).

실시예 3:케르세틴 유도체 3 의 합성 ( General Procedure ):

위에서 얻은 화합물 2 (1 당량)와 탄산칼륨 (1.2 당량)을 아세톤에 녹인 혼합물에 아릴메틸브로미드 (1.2 당량)를 가하고, TLC로 반응의 진행 정도를 관찰하며 상온에서 교반하였다. 출발물질이 모두 사라지면 탄산칼륨 고체를 걸러내고 여과액을 감압증류하여 얻어진 잔류물을 포화 암모니아 메탄올 용액에 녹였다. 반응 혼합물을 0 ℃에서 1 시간 동안 교반한 후 감압증류하여 얻어진 잔류물을 실리카겔 관 크로마토그래피 (디클로로메탄:메탄올=20:1)로 정제하여 목적하는 화합물 3a-3aa를 얻었다. 각각의 유도체의 분광학적 data는 아래와 같다.

7-(Benzyloxy)-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5-dihydroxy-4H-chromen-4- one (3a). 노란색 고체 (43% 수율): ¹H NMR (500 MHz, CD₃COCD₃) δ 7.86 (s, 1H), 7.71 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.52 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.42 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.397.34 (m, 1H), 7.00 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 6.77 (s, 1H), 6.40 (s, 1H), 5.26 (s, 2H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d ₆) δ176.3, 164.2, 160.8, 156.3, 148.2, 147.7, 145.5, 143.9, 136.6, 136.4, 129.0, 128.3, 122.2, 116.0, 115.9, 115.6, 104.5, 98.4, 98.3, 93.2, 93.0, 70.3; LC/MS (ESI) m/z Calcd for C₂₂H₁₆O₇: 392.09, Found: 393.40 (M+H)⁺.

2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-7-(2-fluorobenzyloxy)-3,5-dihydroxy-4H-chromen-4-one (3b). 노란색 고체 (29% 수율): ¹H NMR (400 MHz, CD₃COCD₃) δ 7.87 (s, 1H), 7.73 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.63 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 7.46 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.297.20 (m, 2H), 7.00 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.83 (s, 1H), 6.42 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 5.33 (s, 2H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d ₆) δ176.3, 164.0, 162.1, 160.8, 159.6, 156.4, 148.3, 147.8, 145.5, 143.9, 136.5, 131.4, 124.9, 123.5, 123.3, 122.2, 120.2, 116.0, 104.6, 98.3, 93.0, 64.7; LC/MS (ESI) m/z Found: 411.30 (M+H)⁺; Calcd for C₂₂H₁₅FO₇: 410.08.

7-(2-Chlorobenzyloxy)-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5-dihydroxy-4H-chromen-4-one (3c). 흰색 고체 (22% 수율): ¹H NMR (500 MHz, CD₃COCD₃) δ 7.86 (s, 1H), 7.73 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.677.65 (m, 1H), 7.527.5 (m, 1H), 7.427.40 (m, 1H), 7.00 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.82 (s, 1H), 6.43 (s, 1H), 5.34 (s, 2H); ¹³C NMR (100MHz, DMSO-d ₆) δ 176.3, 164.0, 160.8, 156.4, 148.3, 147.8, 145.5, 136.5, 133.9, 133.3, 131.0, 130.8, 130.1, 129.7, 128.0, 127.7, 122.2, 120.6, 116.0, 104.7, 93.0, 68.0; LC/MS (ESI) m/z Found: 427.40 (M+H)⁺; Calcd for C₂₂H₁₅ClO₇: 426.05.

7-(2-Bromobenzyloxy)-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5-dihydroxy-4H-chromen-4-one (3d). 노란색 고체 (20% 수율): ¹H NMR(400 MHz, CD₃COCD₃) δ7.86 (s, 1H), 7.74-7.64 (m, 3H), 7.45 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.33 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.00 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.79 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 6.42 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 5.29 (s, 2H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d ₆) δ 176.3, 164.0, 160.8, 156.4, 148.3, 147.8, 145.5, 136.5, 135.4, 133.1, 131.0, 130.8, 128.4, 123.5, 122.2, 120.4, 115.9, 115.6, 104.7, 98.3, 93.0, 70.2; LC/MS (ESI) m/z Found: 471.80 (M+H)⁺; Calcd for C₂₂H₁₅BrO₇: 470.00.

2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3,5-dihydroxy-7-(2-iodobenzyloxy)-4H-chromen-4-one (3e). 노란색 고체 (18% 수율): ¹H NMR (400 MHz, CD₃COCD₃) δ 7.97 (dd, J = 7.9, 0.7 Hz, 1H), 7.86 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.73 (dd, J = 8.5, 1.3 Hz, 1H), 7.62 (dd, J = 7.6, 1.3 Hz, 1H), 7.49 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 7.16 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.81 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 6.43 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 5.24 (s, 2H); ¹³C NMR (125 MHz, DMSO-d ₆) δ 176.4, 164.2, 160.9, 156.5, 148.3, 147.9, 145.6, 139.8, 138.6, 136.6, 131.0, 130.7, 129.0, 122.3, 120.5, 116.1, 115.8, 104.8, 100.1, 98.4, 93.2, 74.5; LC/MS (ESI) m/z Found: 519.30 (M+H)⁺; Calcd for C₂₂H₁₅IO₇: 517.99.

2-((2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3,5-dihydroxy-4-oxo-4H-chromen-7-yloxy)methyl)benzonitrile (3f). 흰색 고체 (28% 수율): ¹H NMR (500 MHz, CD₃COCD₃) δ7.88 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 7.837.77 (m, 3H), 7.73 (d, J = 8.5 Hz,1H), 7.62 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 7.00 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.88 (s, 1H), 6.47 (s, 1H), 5.46 (s, 2H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d ₆) δ 176.3, 163.8, 160.8, 156.3, 148.3, 147.8, 145.5, 139.5, 136.5, 134.0, 129.8, 122.2, 120.4, 117.5, 116.0, 115.9, 111.8, 104.8, 98.3, 98.2, 93.2, 93.1, 68.6; LC/MS (ESI) m/z Found: 418.30 (M+H)⁺; Calcd for C₂₃H₁₅NO₇: 417.08.

2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3,5-dihydroxy-7-(2-nitrobenzyloxy)-4H-chromen-4-one (3g). 흰색 고체 (22% 수율): ¹H NMR (400 MHz, CD₃COCD₃) δ 8.20 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.917.80 (m, 3H), 7.71 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.66 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 6.99 (d, J = 8.39 Hz, 1H), 6.82 (s, 1H), 6.45 (s, 1H), 5.67 (s, 2H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d ₆) δ 176.3, 163.7, 160.9, 156.3, 148.3, 147.8, 147.7, 145.5, 136.5, 134.6, 132.1, 129.7, 129.5, 125.6, 125.1, 122.2, 115.9, 115.6, 104.8, 98.4, 93.2, 67.4; LC/MS (ESI) m/z Found: 438.40 (M+H)⁺; Calcd for C₂₂H₁₅NO₉: 437.36.

2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3,5-dihydroxy-7-(2-methylbenzyloxy)-4H-chromen-4-one (3h). 흰색 고체 (23% 수율): ¹H NMR (400 MHz, CD₃COCD₃) δ 7.86 (s, 1H), 7.72 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.47 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.287.23 (m, 3H), 7.00 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.82 (s, 1H), 6.42 (d, J = 0.7 Hz, 1H), 5.26 (s, 2H), 2.40 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d ₆) δ 176.3, 171.8, 164.4, 160.8, 156.4, 148.3, 147.7, 145.5, 137.2, 136.5, 134.5, 130.7, 130.5, 129.2, 128.9, 128.6, 122.2, 115.9, 104.5, 98.3, 93.1, 69.1, 19.0; LC/MS (ESI) m/z Found: 407.40 (M+H)⁺; Calcd for C₂₃H₁₈O₇:406.11.

2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-7-(3-fluorobenzyloxy)-3,5-dihydroxy-4H-chromen-4-one (3i). 흰색 고체 (31% 수율): ¹H NMR (500 MHz, CD₃COCD₃) δ 7.85 (s, 1H), 7.12 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.48 (q, J = 8.0 Hz, 1H), 7.37 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.14 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 7.00 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.81 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 6.44 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.32 (s, 2H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d ₆) δ 176.3, 164.0, 163.8, 161.4, 160.8, 156.3, 148.3, 147.8, 145.5, 139.5, 139.4, 136.5, 131.2, 124.2, 122.2, 120.5, 115.9, 114.8, 104.6, 98.4, 93.2, 69.4; LC/MS (ESI) m/z Found: 411.40 (M+H)⁺; Calcd for C₂₂H₁₅FO₇: 410.08.

7-(3-Chlorobenzyloxy)-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5-dihydroxy-4H-chromen-4-one (3j). 흰색 고체 (28% 수율): ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ 7.72 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 7.57 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 7.55 (s, 1H), 7.45 (m, 3H), 6.90 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.81 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.50 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.26 (s,2H); ¹³C NMR (100 MHz, CD₃COCD₃) δ 178.7, 165.1, 161.6, 157.4, 148.2, 147.3, 145.6, 139.7, 134.6, 130.9, 128.7, 128.1, 126.6, 123.4, 121.2, 115.9, 115.6, 104.9, 98.7, 98.6, 70.0; LC/MS (ESI) m/z Found: 427.10 (M+H)⁺; Calcd for C₂₂H₁₅ClO₇: 426.05.

7-(3-Bromobenzyloxy)-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5-dihydroxy-4H-chromen-4-one (3k). 흰색 고체 (25% 수율): ¹H NMR (400 MHz, CD₃COCD₃) δ 7.86 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.73 (s, 1H), 7.71 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.56-7.53 (m, 2H), 7.39 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 6.80 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 6.43 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.30 (s, 2H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d ₆) δ 176.3, 171.9, 164.0, 160.8, 156.3, 148.3, 147.8, 145.5, 139.4, 136.5, 131.5, 131.0, 127.3, 127.0, 122.3, 120.5, 120.2, 116.0, 104.6, 98.3, 93.2, 69.3; LC/MS (ESI) m/z Found: 471.20 (M+H)⁺; Calcd for C₂₂H₁₅BrO₇: 470.00.

2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3,5-dihydroxy-7-(3-iodobenzyloxy)-4H-chromen-4-one (3l). 흰색 고체 (13% 수율): ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ7.86 (s, 1H), 7.73 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 7.57 (dd, J = 8.5, 2.2 Hz, 1H), 7.52 (d, J = 10.2 Hz, 1H), 7.23 (t, J = 7.8 Hz,1H), 6.91 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.80 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 6.45 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 5.22 (s, 2H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d ₆) δ 176.8, 164.4, 161.3, 156.8, 148.7, 148.2, 145.9, 139.7, 137.6, 137.0, 136.9, 131.5, 127.9, 122.6, 120.8, 116.4, 116.1, 105.0, 98.8, 95.7, 93.6, 69.7; LC/MS (ESI) m/z Found: 519.40 (M+H)⁺; Calcd for C₂₂H₁₅IO₇: 517.99.

3-((2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3,5-dihydroxy-4-oxo-4H-chromen-7-yloxy)methyl)benzonitrile (3m). 흰색 고체 (29% 수율): ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ 7.96 (s, 1H), 7.84 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 7.75 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.65 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.56 (dd, J = 8.4, 2.0 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.82 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.47 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 5.31 (s, 2H); ¹³C NMR (100 MHz, CD₃COCD₃) δ 176.6, 165.2, 157.6, 148.3, 147.4, 145.7, 139.3, 137.0, 132.9, 132.6, 131.8, 130.7, 123.7, 121.5, 121.4, 119.1, 116.2, 115.8, 113.5, 105.1, 98.9, 93.7, 69.9; LC/MS (ESI) m/z Found: 418.20 (M+H)⁺; Calcd for C₂₃H₁₅NO₇: 417.08.

2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3,5-dihydroxy-7-(3-nitrobenzyloxy)-4H-chromen-4-one (3n). 흰색 고체 (30% 수율): ¹H NMR (500 MHz, CD₃COCD₃) δ8.41 (s, 1H), 8.25 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 8.00 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.86 (s, 1H), 7.76 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.72 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.00 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.86 (s, 1H), 6.48 (s, 1H), 5.48 (s, 2H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d ₆) δ 176.3, 171.9, 163.8, 160.9, 156.3, 148.3, 148.2, 147.8, 145.5, 138.9, 136.5, 134.5, 123.1, 122.8, 122.2, 120.5, 115.9, 104.7, 98.4, 98.3, 93.2, 68.9; LC/MS (ESI) m/z Found: 438.40 (M+H)⁺; Calcd for C₂₂H₁₅NO₉: 437.36.

2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3,5-dihydroxy-7-(3-methylbenzyloxy)-4H-chromen-4-one (3o). 흰색 고체 (22% 수율): ¹H NMR (500 MHz, CD₃COCD₃) δ 7.86 (s, 1H), 7.74 (s, 1H), 7.72 (dd, J = 8.5, 1.5 Hz, 1H), 7.31 (d, J = 5.0 Hz, 2H), 7.19 (t, J = 3.5 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.80 (d, J =2.0 Hz, 1H), 6.41 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.24 (s, 2H), 2.36 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO- d ₆ ) δ 176.3, 164.3, 160.8. 156.4, 148.2, 147.7, 145.5, 138.1, 136.5, 136.4, 128.9, 128.7, 125.3, 125.2, 122.2, 120.6, 120.2, 116.0, 104.5, 98.3, 93.1, 70.4, 21.5; LC/MS (ESI) m/z Found: 407.40 (M+H)⁺; Calcd for C₂₃H₁₈O₇: 406.11.

2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3,5-dihydroxy-7-(3-methoxybenzyloxy)-4H-chromen-4-one (3p). 흰색 고체 (22% 수율): ¹H NMR (500 MHz, CD₃COCD₃) δ 7.86 (s, 1H), 7.72 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.34 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.00 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.93 (d, J = 8.0 Hz), 6.80 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.42 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.26 (s, 2H), 3.82 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d ₆) δ 176.3, 164.2, 160.8, 159.8, 156.3, 148.2, 147.7, 145.5, 138.1, 136.4, 130.2, 129.9, 122.2, 120.5, 120.3, 116.0, 113.8, 113.6, 104.5, 98.4, 93.2, 70.1, 55.5; LC/MS (ESI) m/z Found: 423.30 (M+H)⁺; Calcd for C₂₃H₁₈O₇: 422.10.

2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3,5-dihydroxy-7-(3-(methylamino)benzyloxy)-4H-chromen-4-one (3q). 흰색 고체 (23% 수율): ¹H NMR (500 MHz, DMSO-d ₆) δ 7.72 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.59 (dd, J = 10.9, 2.2 Hz, 1H), 7.11 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.77 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 6.62 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 6.51 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.41 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 5.72 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 5.11 (s, 2H), 2.68 (d. J = 4.8 Hz, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d ₆) δ 147.0, 162.1, 158.5, 154.1, 148.2, 146.0, 145.4, 143.2, 134.8, 134.2, 127.1, 119.9, 118.1, 1137, 113.3, 112.9, 109.4, 108.9, 102.2, 96.1, 90.9, 68.6, 29.6; LC/MS (ESI) m/z Found: 422.20 (M+H)⁺; Calcd for C₂₃H₁₉NO₇: 421.12.

2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-7-(4-fluorobenzyloxy)-3,5-dihydroxy-4H-chromen-4-one (3r). 흰색 고체 (31% 수율): ¹H NMR (500 MHz, CD₃COCD₃) δ 7.86 (s, 1H), 7.72 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.59 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 7.20 (t, J = 8.5 Hz, 2H), 7.01 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.79 (s, 1H), 6.41 (s, 1H), 5.27 (s, 2H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d ₆) δ 176.4, 164.2, 161.4, 160.9, 156.5, 148.3, 147.8, 145.6, 136.5, 132.9, 130.7, 130.6, 122.3, 120.5, 116.0, 115.8, 104.6, 98.5, 93.2, 69.7 ; LC/MS (ESI) m/z Found: 411.30 (M+H)⁺; Calcd for C₂₂H₁₅FO₇: 410.08.

7-(4-Chlorobenzyloxy)-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5-dihydroxy-4H-chromen-4-one (3s). 흰색 고체 (25% 수율): ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ 7.72 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 7.56 (dd, J = 8.4, 1.9 Hz, 1H), 7.50 (m, 4H), 6.90 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.80 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.44 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 5.25 (s, 2H); ¹³C NMR (100 MHz, CD₃COCD₃) δ 177.1, 165.7, 162.1, 157.9, 148.9, 148.0, 146.3, 136.7, 134.7, 130.6, 129.8, 123.9, 121.8, 116.4, 116.1, 105.5, 100.6, 99.2, 94.0, 70.0; LC/MS (ESI) m/z Found: 427.20 (M+H)⁺; Calcd for C₂₂H₁₅ClO₇: 426.05.

7-(4-Bromobenzyloxy)-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5-dihydroxy-4H-chromen-4-one (3t). 흰색 고체 (22% 수율): ¹H NMR (400 MHz, CD₃COCD₃) δ 7.85 (s, 1H), 7.71 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.62 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.50 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.00 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.79 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 6.41 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 5.27 (s, 2H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d ₆) δ 174.4, 162.1, 159.0, 154.4, 146.3, 145.8, 143.6, 134.5, 134.2, 129.9, 128.4, 12.3, 119.7, 118.5, 114.0, 113.7, 102.7, 96.5, 91.3, 67.5; LC/MS (ESI) m/z Found: 471.30 (M+H)⁺; Calcd for C₂₂H₁₅BrO₇: 470.00.

2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3,5-dihydroxy-7-(4-iodobenzyloxy)-4H-chromen-4-one (3u). 흰색 고체 (20% 수율): ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ 7.79 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.73 (d, J = 2.0, 1H), 7.57 (dd, J = 8.5, 2.1 Hz, 1H), 7.29 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.90 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.78 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 5.21 (s, 2H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d ₆) δ 176.3, 164.0, 160.8, 156.3, 148.3, 147.7, 145.5, 137.7, 136.5, 136.4, 130.3, 122.2, 120.4, 115.9, 115.6, 104.6, 98.3, 94.6, 93.2, 69.6; LC/MS (ESI) m/z Found: 519.30 (M+H)⁺; Calcd for C₂₂H₁₅IO₇: 517.99.

4-((2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3,5-dihydroxy-4-oxo-4H-chromen-7-yloxy)methyl)benzonitrile (3v). 흰색 고체 (29% 수율): ¹H NMR (500 MHz, CD₃COCD₃) δ7.86 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 7.76 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.71 (d, J = 8.0 Hz,1H), 7.01 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.82 (s, 1H), 6.45 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 5.43 (s, 2H); ¹³C NMR (125 MHz, CD₃COCD₃) δ 176.4, 163.9, 161.0, 156.4, 148.4, 147.9, 145.6, 142.5, 136.6, 133.0, 128.6, 122.3, 120.5, 119.2, 116.0, 115.8, 111.2, 104.8, 98.5, 93.3, 69.4; LC/MS (ESI) m/z Found: 418.30 (M+H)⁺; Calcd for C₂₃H₁₅NO₇: 417.08.

2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3,5-dihydroxy-7-(4-nitrobenzyloxy)-4H-chromen-4-one (3w). 흰색 고체 (24% 수율): ¹H NMR (500 MHz, CD₃COCD₃) δ 8.31 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.83 (d, J = 8.5 Hz, 3H), 7.71 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.00 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.83 (s, 1H), 6.46 (s, 1H), 5.48 (s, 2H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d ₆) δ 174.5, 161.9, 159.0, 154.5, 146.5, 146.0, 145.7, 143.6, 142.6, 134.6, 126.8, 122.2, 120.3, 118.5, 114.1, 113.8, 102.9, 96.1, 91.4, 67.1; LC/MS (ESI) m/z Found: 438.40 (M+H)⁺; Calcd for C₂₂H₁₅NO₉: 437.36.

2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3,5-dihydroxy-7-(4-methoxybenzyloxy)-4H-chromen-4-one (3x). 흰색 고체 (19% 수율): ¹H NMR (500 MHz, CD₃COCD₃) δ 7.86 (s, 1H), 7.72 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.45 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.016.95 (m, 3H), 6.78 (d, J = 2.0 Hz), 6.39 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 5.19 (s, 2H), 3.82 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d ₆) δ 176.3, 164.3, 160.7, 156.4, 156.3, 147.7, 145.4, 136.4, 130.9, 129.3, 128.4, 122.3, 122.2, 121.2, 116.7, 115.1, 113.5, 110.0, 104.4, 56.2, 54.8; LC/MS (ESI) m/z Found: 423.30 (M+H)⁺; Calcd for C₂₃H₁₈O₇: 422.10.

2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3,5-dihydroxy-7-(4-methylbenzyloxy)-4H-chromen-4-one (3y). 흰색 고체 (21% 수율): ¹H NMR (500 MHz, CD₃COCD₃) δ 7.86 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.72 (dd, J = 8.5, 2.5 Hz, 1H), 7.41 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.24 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.01 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.79 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.41 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.23 (s, 2H), 2.35 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d ₆) δ 175.8, 163.8, 160.3, 155.9, 147.8, 147.2, 145.0, 137.3, 135.9, 1331, 129.0, 127.8, 121.7, 119.9, 115.5, 115.2, 104.0, 97.9, 92.7, 69.8, 20.7; LC/MS (ESI) m/z Found: 407.30 (M+H)⁺; Calcd for C₂₃H₁₈O₇: 406.11.

7-(4-tert-Butylbenzyloxy)-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5-dihydroxy-4H-chromen-4- one (3z). 흰색 고체 (21% 수율): ¹H NMR (400 MHz, CD₃COCD₃) δ 7.84 (s, 1H), 7.72 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.49-7.34 (m, 4H), 7.00 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.78 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 6.40 (J = 1.8 Hz, 1H), 5.23 (s, 2H), 1.33 (s, 9H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d ₆) δ 176.3, 164.3, 160.8, 156.4, 151.0, 148.3, 147.7, 145.5, 136.4, 133.5, 128.3, 128.0, 125.8, 125.5, 122.2, 116.0, 104.5, 98.4, 93.1, 70.2, 34.7, 31.5; LC/MS (ESI) m/z Found: 449.60 (M+H)⁺; Calcd for C₂₆H₂₄O₇: 448.15.

7-(2,4-Dichlorobenzyloxy)-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5-dihydroxy-4H-chromen-4- one (3 aa). 흰색 고체 (20% 수율): ¹H NMR (400 MHz, CD₃COCD₃) δ 7.86 (s, 1H), 7.74-7.68 (m, 2H), 7.60 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.47 (dd, J = 8.3, 2.0 Hz, 1H), 7.00 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.83 (s, 1H), 6.44 (s, 1H), 5.34 (s, 2H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d ₆) δ 176.4, 163.9, 160.9, 156.5, 148.4, 147.9, 145.6, 136.6, 134.4, 134.3, 133.2, 1321, 129.5, 128.1, 122.3, 120.5, 116.0, 115.8, 104.8, 98.4, 93.2, 67.5; LC/MS (ESI) m/z Found: 461.20 (M+H)⁺; Calcd for C₂₂H₁₄Cl₂O₇: 460.01.

실시예 4. 플라보놀 유도체에 의한 HCV RNA 중합효소 활성 저해능력의 검증:

상기 실시예 3에서 제조된 화합물들의 HCV 표적효소인 RNA 복제효소의 활성 억제 능력을 검증하기 위해, HCV의 RNA 복제효소를 암호화하고 있는 유전자 (HCV NS5B)의 소수성 잔기 21개가 제거된 유전자를 단백질발현 플라스미드에 끼워 넣은 후 대장균에서 재조합 단백질 (GST-NS5Bt21)을 과발현하여 정제한다. 복제효소가 RNA 주형을 인식하여 중합반응을 일으킬 수 있도록 RNA homopolymer인 poly A 주형 1mg/ml과 프라이머인 oligo dT (18 mer) 2mg/ml을 섞어주고 95℃에서 1분간 반응하고 실온에서 30분간 서서히 식히어 RNA와 primer의 annealing 중합체인 RNA주형을 형성한다. 생성된 주형을 포함하는 반응용액에 정제한 RNA 복제효소(9.8 mg)를 첨가하고, 10X reaction buffer (500mM Tris HCl, pH7.5/ 200mM MgCl₂) 3ml, DTT 용액 (10mM) 3ml, UTP (5mM) 3ml, 방사성 동위원소를 포함하는 알파-[³²P] UTP (25mCi) 3ml와 각 농도의 화합물을 첨가한 후 3차 증류수로 최종 부피 30ml로 맞춘다. 실온에서 2시간 반응 한 후 반응액 1ml를 Polyethyleneimine(PEI)-cellulose TLC plate에 점적하고, 전개용매(0.3M potassium phosphate, pH3.4)를 써서 전개한 후, 자가방사법을 이용하여 생성된 RNA의 존재여부와 정량을 수행하였다. 케르세틴 유도체 화합물이 포함되지 않은 RNA 중합효소 반응을 대조군으로 하여 케르세틴 유도체 화합물이 포함된 경우의 줄어든 RNA합성을 비교/정량하여 화합물의 효소활성 억제능을 산출하였다.

실시예 5. HCV NTPase / helicase 저해활성 검증 ( duplex DNA - unwinding 저해활성 검증):

HCV NTPase/helicase는 이중가닥 RNA 뿐만 아니라 이중가닥 DNA 역시 풀어주는 역할을 하는데, 대부분의 경우 연구의 용이성 때문에 이중가닥 DNA를 기질로 하여 helicase 활성 연구를 진행한다. 이중가닥 DNA 풀림 활성저해 연구를 위해 5을 가지는 partial duplex DNA를 준비한다. 이 실험은 기질인 이중가닥 DNA 각각의 끝에 형광을 내는 물질 (TAMRA; Ex=549nm/Em=578nm 와 Fluorescein; Ex=485nm/Em=535nm)을 붙이고 FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)의 원리에 의해 이들이 서로 가까이 있을 경우 TAMRA가 Fluorescein의 빛을 흡수하도록 설계되며 따라서 HCV NTPase/helicase에 의해 이중가닥 DNA가 풀려 각 가닥이 분리되어 있다면 Fluorescein이 빛을 발할 것이고, 풀리지 않아 TAMRA와 Fluorescein이 가까이 있다면 그 빛을 TAMRA가 흡수하여 다른 파장에서 빛이 관찰 되는 것을 이용한다. 실제로 helicase가 없을 경우 535 nm에서 흡수가 일어나지 않는 반면 helicase가 존재하는 경우 기질인 이중가닥 DNA가 풀리게 되어 535 nm에서 강하게 흡수가 나타나는 것을 확인할 수 있다. 위와 같이 이 실험에서는 FRET을 이용하여 Fluorescein이 내는 빛의 파장인 535nm를 측정함으로써 여러 구조집중 화합물들 존재하에서 HCV NTPase/helicase에 의해 이중가닥 DNA가 풀리는지 여부를 확인한다.

실시예 6: 세포내 HCV 증식 억제 효능 검증:

HCV의 subgenomic replicon RNA로 transfection 시킨 Huh7 세포주에서 항바이러스제에 의한 실제 HCV propagation 저해활성을 확인하는 실험이다. HCV는 virus 감염 세포 배양 시스템이 없기 때문에 바이러스의 생장에 필요한 subgenomic replicon을 간암세포주에 도입하여 바이러스가 감염된 상태와 유사하게 만들어 어세이를 수행한다. Replicon이 들어 있는 세포들은 항생제 내성 marker에 의하여 G418 항생제 존재 배지에서도 살아남을 수 있으므로 Replicon의 소실여부는 이러한 항생제 배지에서 살아남는 세포를 확인하고 정량함으로써 가능하다. 화합물에 의한 세포내 표적효소 활성저해에 의한 HCV relpicon의 propagation이 억제가 되면 Cell viability가 떨어지므로 Cell viability assay를 아래와 같이 수행하여 화합물의 효능을 확인한다. 우선, 96 웰 플레이트에 HCV replicon neo+/Huh 7 cell을 배양하고 배양액에는 G418 항생제를 포함시킨다. DMSO에 녹인 화합물들을 첨가하고 24시간 배양 한 후 Cell-TiterGlo reagent첨가하고 30분 후 Plate reader를 통하여 각 well의 발광 Luminescence를 측정한다. Cell-TiterGlo reagent는 생존하고 있는 세포에 존재하는 ATP와 정량적으로 반응하여 Luminescence를 발광하므로 luminescence의 정도가 Cell viability를 표현한다. 따라서 화합물에 의한 발광 Luminescence의 감소가 나타나는 부분이 효과적인 저해제라 판단한다.

실시예 7: 세포독성 검증:

HCV replicon을 포함하는 Huh-7 세포주를 5 x 10³/웰의 밀도로 G418 500 μg/mL가 포함된 완전 DMEM을 배지로 하여 조직 배양 white 96 웰 플레이트에 분주한다. Well plate를 37℃에서 5% CO₂ 존재하에 24 시간 동안 배양한 후, 배지를 새 것으로 교체하고 순차적으로 희석된 라이브러리 화합물의 DMSO 스톡 용액(100μM, 50 μM, 40 μM, 30 μM, 20 μM, 10 μM, 5 μM, 1 μM, 0.5 μM 및 0.1 μM)을 각 웰 마다 가한다. 3 일간 같은 조건 하에서 배양한 후, 세포생존도를 WST 분석법을 이용하여 측정한다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구 항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

하기 화학식 1의 화합물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 C형 간염 바이러스의 헬리케이즈(helicase)와 폴리머레이즈(polymerase)의 활성을 동시에 저해할 수 있는 C형 간염 감염의 예방 또는 치료효과를 가지는 제약 조성물.

[화학식 1]
상기 화학식에서 R은 4-Cl임
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