CN110105348A

CN110105348A - 新型迈克尔受体类肠病毒71型抑制剂的制备及用途

Info

Publication number: CN110105348A
Application number: CN201910174469.XA
Authority: CN
Inventors: 尚鲁庆; 马玉莹; 何帅; 尚成友
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2019-03-08
Filing date: 2019-03-08
Publication date: 2019-08-09

Abstract

本发明涉及一类新型迈克尔受体类病毒71（EV71）3C蛋白酶抑制剂，其结构通式（M）中的各变量在说明书中定义，这些化合物有效地抑制或阻断了肠病毒71的复制。本发明涉及含有结构通式（M）的化合物、其各种光学异构体、药物活性的代谢物、可药用盐、溶剂化物以及前药在制备治疗手足口病毒感染疾病抗病毒药物的发现和应用。本发明还涉及制备结构通式（M）化合物的中间体和合成方法。

Description

新型迈克尔受体类肠病毒71型抑制剂的制备及用途

技术领域

本发明是关于治疗肠病毒71（EV71）感染的通式（M）化合物、药物组合物，以及这类化合物的合成方法、制剂方法和用于这些合成中的化合物。具体地，本发明提供一类新型迈克尔受体类化合物，含有这类化合物的药物组合物及这类化合物治疗EV71感染的方法。

背景技术

手足口病（Hand-Foot-Mouth disease, HFMD）是一种由肠道病毒引起的常见传染性疾病，在过去的十几年内，全球大部分国家和地区先后有手足口病的疫情爆发，造成了上千例的婴幼儿死亡病例，给患儿家庭带来了巨大的经济和精神损害。并且近年来随着人员流动、病毒变异等多种因素的影响在中国，日本，马来西亚和新加坡等西太平洋呈现逐年上升的趋势。该疾病主要通过粪-口途径和呼吸道进行传播，传染性强、极易导致流行或爆发。手足口病多发于5岁以下的儿童，大多数患者症状轻微，其临床症状以发热和手、足、口腔等部位的皮疹等为主，少数患者伴随有严重的中枢神经系统并发症引起脑炎、肺水肿、弛缓性麻痹、心肌炎等症状，病情进展快，容易引发死亡。

目前已有超过100种血清型肠道病毒被确认，引发手足口病的肠道病毒有20多种，肠道病毒71型以及柯萨奇病毒A组的16、4、5、9、10型，B组的2、5型均为手足口病较常见的病毒，其中最常见的是肠道病毒71型（EV 71）和柯萨奇病毒A16型（Cox A16）。病毒学和流行病学的研究证实，人肠道病毒71型（Enterovirus 71, EV71）是近引发手足口病的主要病原体，同时还能引起无菌性脑膜炎(aseptic meningitis) 、脑干脑炎( brain stemencephalitis)和脊髓灰质炎样的麻痹(poliomyelitis like paralysis) 等多种与神经系统相关的严重并发症。EV71近年来已经引起多次流行，研究发现EV71的基因型在流行中不断变化，某些位点的基因突变引起EV71的致病性的改变，因此EV71的防治面临着相当大的压力。我国在手足口病预防方面已取得了重要进展，2015年，中国食品药品监督管理局批准了两种肠病毒71型灭活疫苗生产上市。但是目前并没有有效的临床使用的抗病毒治疗药物。

EV71于1969年Schmit等人首次从患有中枢神经系统疾病的患者粪便中分离得到，1974年确认其与手足口病的发生有关。EV71属于小RNA病毒科肠病毒属，病毒颗粒为典型的正二十面体结构。其基因组序列为一条约由7400 个核苷酸组成的单股正链RNA，包含开放阅读区(open-reading frame, ORF)和非编码区两部分。在开放阅读区两侧分别为5’和3’两个非编码区。开放阅读区翻译表达出一个2193个氨基酸构成的前体多聚蛋白(polyprotein)，在受感染的细胞内，该多聚蛋白进而被病毒自身的蛋白酶水解成为P1 、P2、P3三个前体蛋白。经过细胞和病毒的蛋白酶进一步的剪切，Pl前体蛋白被加工成四个病毒的衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4，负责病毒颗粒的装配和稳定；P2前体蛋白则进一步成熟为非结构蛋白（non-structural protein, nsp）2A(特异性蛋白酶)、2B和2C；P3 前体蛋白则用以形成非结构蛋白3A、3B（VPg，5’末端结合蛋白)、3C (特异性蛋白酶)和3D(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)。

在七个非结构蛋白中，3C蛋白酶是EV71病毒复制过程的关键蛋白，除去VP1与2A位置以及3C与3D位置的裂解是由2A蛋白催化完成外，多聚蛋白其它裂解过程主要通过3C蛋白酶或其前体蛋白3CD催化完成。此外还可扰乱病毒多项正常生理活动，譬如通过分解CstF-64因子来干扰宿主细胞RNA的聚腺苷酸化过程等等。由于其在病毒复制过程中的重要作用，因而一旦这个蛋白的功能丧失，则病毒进一步的转录和复制将无法正常继续进行。因此可被特异性识别的选择性小分子抑制3C蛋白酶的作用是治疗EV71病毒感染的有效手段，3C蛋白酶成为治疗手足口病的重要药物靶点。分别于2011年和2013年报道的3C蛋白酶的晶体结构3OSY和4GHQ显示EV71 3C蛋白酶具有和其它小核糖核酸病毒3C蛋白酶相似的糜蛋白折叠结构。定点突变实验证明其活性中心是Cys147，His40，Glu71组成的催化三联体。2013年报道的EV71 3C蛋白酶与rupintrivir的共晶结构为3C蛋白酶抑制剂的设计研究提供了重要的信息。2015年本课题组成功解析得到EV71 3C蛋白酶和氰醇类抑制剂(1R,2S,2’S,5S)-9的共晶结构，为进一步优化提供了基础。令人遗憾的是，由于体外血浆及肝微粒体中的不稳定性，以及氰醇基团存在的潜在毒性问题限制了此类抑制剂的进一步发展。

本发明基于EV71 3C蛋白酶的晶体结构特征，通过结合活性区域的结合位点，设计一系列新型迈尔尔受体类的3C蛋白酶抑制剂。本发明的第一个优点是其提供的迈克尔受体类抑制剂，可有效抑制EV71 3C蛋白酶并且在细胞培养中显示了非常好的抑制EV71病毒的活性。本发明的第二个优点是提供的迈克尔受体类抑制剂，由于形成共价抑制的特征，延长了抑制剂的作用时间，同时可逆的内在属性，避免了体内的非特异性反应。本发明的第三个优点，本发明的第三个优点是可以用于制备治疗半胱氨酸蛋白酶诱发疾病药物，如手足口病、普通感冒、小儿麻痹症等。

本发明的目标是发现一类抗肠病毒71型高效的小分子化合物，并提供用于所述蛋白酶抑制剂化合物合成的中间体和这些合成的合成方法。

发明内容

本发明针对EV71病毒3C蛋白酶抑制剂的现有技术的不足，提供一种含通式（M）类EV71病毒3C蛋白酶抑制剂,本发明另一个目的是要提供所描述蛋白酶抑制剂化合物中间体的合成和用于这些合成的合成方法。

本发明涉及通式（M）的迈克尔受体类化合物和/或药学上可接受的盐和/或水合物制备治疗肠病毒71（EV71）感染疾病药物的应用。这些化合物作为其药学上可接受的盐和/或水合物，或者作为药物组合物成分（无论其是否与其他治疗手足口病的抗病毒剂，抗感染药，免疫调节剂或抗生素同时给药）而用于抑制EV71病毒的3C蛋白酶，或者预防/治疗一项或多项EV71病毒感染症状。

更具体的说，本发明涉及通通式（M）化合物和/或药学上可接受的盐和/或水合物制备治疗肠病毒71（EV71）感染疾病药物的应用：

（M）

R₁表示:-H，C1-12烷基，C2-12烯基，C2-12炔基，C3-8环烷基，芳基，杂芳基，芳基C1-8烷基，杂芳基C1-9烷基，芳基C2-6烯基，杂芳基C2-6烯基，芳基C2-6炔基，杂芳基C2-6炔基，-O-烷基，-O-环烷基，-O-杂烷基，-O-杂环烷基，-O-杂环基，-O-链烯基，-O-环烯基，-O-杂烯基，-O-杂环烯基，-O-链炔基，-O-环炔基，-O-杂炔基，-O-环杂炔基，-O-芳基，-O-芳烷基，-O-杂芳基，-O-杂芳烷基，-S-烷基，-S-环烷基，-S-杂烷基，-S-杂环烷基，-S-杂环基，-S-链烯基，-S-环烯基，-S-杂烯基，-S-杂环烯基，-S-链炔基，-S-环炔基，-S-杂炔基，-S-环杂炔基，-S-芳基，-S-芳烷基，-S-杂芳基，-S-杂芳烷基，-N-烷基，-N-环烷基，-N-杂烷基，-N-杂环烷基，-N-杂环基，-N-链烯基，-N-环烯基，-N-杂烯基，-N-杂环烯基，-N-链炔基，-N-环炔基，-N-杂炔基，-N-环杂炔基，-N-芳基，-N-芳烷基，-N-杂芳基，-N-杂芳烷基；或任选可被1到4个取代基所取代，所述1到4个取代基选自卤素，-OH，-SH，-NO₂，-CN，卤C1-8烷基，C1-8烷氧基，C1-6烷基羰基，C1-6烷硫基，C1-8烷氧羰基，-CF₃；

R₂表示:烷基，环烷基，杂烷基，杂环烷基，杂环基，链烯基，环烯基，杂烯基，杂环烯基，链炔基，环炔基，杂炔基，环杂炔基，芳基，杂芳基，芳基C1-8烷基，杂芳基C1-9烷基，芳基C2-6烯基，杂芳基C2-6烯基，芳基C2-6炔基，杂芳基C2-6炔基。以上所述芳基是苯基或萘基，杂芳基是通过环碳原子或氮原子连接的具有1, 2或3个选自N, O, S的杂原子的五元或六元芳环，且杂环基是通过环碳原子或氮原子连接的具有1, 2，3或4个选自N, O, S的杂原子的饱和或不饱和的非芳香性环，其中芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，烷基，环烷氧基，烷氧基任选可被1到4个取代基所取代，所述1到4个取代基选自卤素，-OH，-SH，-NO₂，-CN，苯基，卤C1-8烷基，C1-8烷氧基，C1-6烷基羰基，C1-6烷硫基，C1-8烷氧羰基，-CF₃。以上所述环烷基，环烷氧基，芳基，杂芳基或杂环基上的两个相邻取代基任选地一起形成0-3个含有O, N, S的杂原子的3-6元环。

X表示-H，烷基，卤素，-CN,酯键，酰胺键，羰基，芳基，杂芳基。

Y表示-H，烷基，卤素，-CN,酯键，酰胺键，羰基，芳基，杂芳基。

以上所述芳基是苯基或萘基，杂芳基是通过环碳原子或氮原子连接的具有1, 2或3个选自N, O, S的杂原子的五元或六元芳环，且杂环基是通过环碳原子或氮原子连接的具有1, 2，3或4个选自N, O, S的杂原子的饱和或不饱和的非芳香性环，其中芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，烷基，环烷氧基，烷氧基任选可被1到4个取代基所取代，所述1到4个取代基选自卤素，-OH，-SH，-NO₂，-CN，卤C1-8烷基，C1-8烷氧基，C1-6烷基羰基，C1-6烷硫基，C1-8烷氧羰基，三氟甲基。以上所述环烷基，环烷氧基，芳基，杂芳基或杂环基上的两个相邻取代基任选地一起形成0-3个含有O, N, S的杂原子的三-六元环。

本发明范围内包括的药物组合物，包含抗EV71病毒有效量的通式（M）化合物或其治疗上可接受的盐，并混有在药学上可接受的药物载体或助剂。

本发明的一个重要方面，涉及在哺乳动物中，通过对该哺乳动物给予有效抗EV71病毒的含量的式M化合物，或其在治疗上可接受的盐或酯，或上述组合物，以治疗肠病毒71（EV71）感染疾病药物的方法。

本发明的另一个重要方面，涉及通过使病毒暴露在抑制EV71病毒的通式（M）化合物，或其在治疗上可接受的盐或酯，如上述的组合物之下，寻找治疗手足口病的有效药物。

其他的方面涉及的药物组合物，可另外包括其他抗EV71制剂，还可包括EV71病毒的其他靶标的抑制剂，如3D蛋白酶抑制剂和VP1蛋白抑制剂。

优选实施方案的详述

定义：

当用于本文中，除非另行提及，均适用下列的定义：

在述及各实例时，(R)或(S)用于指明不对称中心的绝对构型，这指明是用于整个化合物的说明而不是单独取代基的说明。

本文所使用的“P1, P2, P3”标识，意指从肽类似物的C-端开始，并朝向N-端延伸的氨基酸的残基的位置，即P1代表从C端开始的第一个位置，P2为从C端开始的第二个位置（参见Berger A.&Schechter I., Transactions of the Royal Society London seriesB257, 249-264(1970)）。

本文所用的“卤素”一词是指卤素取代基，即选自碘，溴，氯或氟。

本文所用的“芳基”一词，意指含有6个碳原子的芳香族单环系统，或含有10个原子的芳香族双环系统，例如苯基和萘基-环系统。

本文所用的“杂芳基”一词，单独使用或与另一取代基组合使用时，意指通过环碳原子或氮原子连接的具有1, 2或3个选自N, O, S的杂原子的五元，六元或七元不饱和的杂环，移除氢而衍生的单价取代基。适当的杂环实例如：噻吩，呋喃，吡咯，咪唑，吡唑，噻唑，噁唑，异噁唑，1, 2, 3-三唑，1, 2-噻二唑，吡啶，吡嗪，嘧啶，1, 2, 4-三嗪，苯并噁唑，苯并噻唑，喹啉。

本文所用的“低碳烷基，低碳烯基，低碳炔基”一词，单独使用或与另一取代基组合使用时，是指包含1到6个碳原子的非环形的、直链或支链烷基，烯基或炔基取代基。

本文所用的“药学可接受的酯”一词，单独使用或与另一取代基组合使用时，其中该分子的任何羧基官能基或羟基官能基，优选的是羧基或羟基终端，被烷氧羰基官能团或酯键置换：

其中R，R’部分是选自低碳烷基（如甲基、乙基、丙基、丁基、己基）；烷氧烷基（如甲氧乙基）；烷氧酰基（如乙酰氧基甲基）；芳烷基（如苄基）；芳氧烷基（如苯氧乙基）；芳基（如苯基）。可视需要被卤素，C1-4烷基或C1-4烷氧基取代。其他适当的前药酯，将其列入本文中以作参考。这类在药学上可接受的酯，通常在哺乳动物体内，被水解转化为化合物通式（M）的酸形式。

关于上述的酯类，除非另行指定，任何存在的烷基部分均有利地含有1至6个碳原子。任何存在于该酯类中的芳基部分，均有利地包括苯基基团。

本文中“药物上可接受的盐”一词是指通通式（M）化合物的盐，其在正常医学治疗中，适用于人及动物的组织接触而无毒性，无刺激性，无过敏反应等。一般是水溶性或油溶性，或是易分散的，并在其使用上是有效的。此词包括药物上可接受的酸加成盐和药物上可接受的碱加成盐。

“药物上可接受的酸加成盐”一词是指保持生物活性及游离态碱的性质，并且是非生物上或其他方面不需要的，其与无机酸如硫酸，硝酸，磷酸，盐酸，氢溴酸，氨基磺酸等，及有机酸如醋酸，三氟醋酸，三氯醋酸，肉桂酸，柠檬酸，马来酸，己二酸，藻酸，抗坏血酸，天冬氨酸，苯甲酸，苯磺酸，乙醇酸，苹果酸，乳酸，丙二酸，草酸，烟酸，丁二酸，水杨酸，硬脂酸，酒石酸，对氨基苯磺酸，三甲基苯磺酸，对甲基苯磺酸，扁桃酸，果胶酯酸，苦味酸，丙酸等所形成的盐。

“药物上可接受的碱加成盐”一词是指保持生物活性及游离态酸的性质，并且是非生物上或其他方面不需要的，其是与无机碱如氨或铵或金属阳离子如，钠，镁，铜，锌，钙，钾，铝等的氢氧化物或碳酸盐所形成的盐，特别优选的是铵，钾，钠，钙，镁盐。由药物上可接受的有机的非毒性的碱衍生的盐包括伯胺，仲胺及叔胺，季铵化合物，经取代的胺，包括天然的经取代的胺，环胺以及碱离子交换树脂，如甲基胺，二甲基胺，三甲基胺，乙基胺，二乙基胺，三乙基胺，三丙基胺，异丙基胺，三丁基胺，乙醇胺，二乙醇胺，二环己基胺，赖氨酸，精氨酸，组氨酸，咖啡因，胆碱，甜菜碱，亚乙基二胺，葡糖胺，甲基葡糖胺，可可碱，哌嗪，哌啶，嘌呤，四甲基铵化合物，四乙基铵化合物，吡啶，N,N二甲基苯胺，N-甲基哌啶，N-甲基吗啉，N,N-二苄基苯乙胺等所形成的盐。特别优选的有机非毒碱是异丙基胺，二乙基胺，乙醇胺，三甲基胺，二环己基胺，胆碱，咖啡因。

本发明的迈克尔受体类化合物可以游离形式或以盐形式存在。本领域技术人员已知许多化合物类型的药学上可接受的盐及其制备方法。药学上可接受的盐包括常规的无毒性的盐，包括这样的化合物碱与无机或有机酸形成的季铵盐。

本发明的化合物可形成水合物或溶剂合物。本领域技术人员已知将化合物与水一起冻干时所形成的水合物或在溶液中与合适的有机溶剂浓缩时形成溶剂合物的方法。

本发明包含含有治疗量本发明化合物的药物，和一种或多种药学上可接受载体和/或赋形剂的药物组合物。载体包括如盐水，缓冲盐水，葡萄糖，水，甘油，乙醇和它们的结合物。载体或赋形剂还可以包括本领域已知的时间延迟材料，如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，还可包括蜡，乙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，异丁烯酸甲酯等等。如果需要，该组合物还可以包含较小量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。该组合物可以是液体，悬浮液，乳剂，片剂，丸剂，胶囊，持续释放制剂或粉末。该组合物可以用传统的黏合剂和载体如三酸甘油酯配制成栓剂。口服制剂可以包括标准载体如药物品级的甘露糖醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素和碳酸镁等等。视需要制剂而定，配制可以设计混合，制粒和压缩或溶解成分。在另一个途径中，该组合物可以配制成纳米颗粒。

本发明的药物组合物可以以各式各样的药物形式给药。使用的药物载体可以为固体或者液体。

如果使用固体载体，制剂可以为片剂，被放入硬胶囊中的粉末或小药丸形式或锭剂或糖锭形式。固体载体的量在很大程度上变化，但是优选从约25mg到约1.0g。典型的固体载体包括乳糖，石膏粉，蔗糖，滑石，凝胶，琼脂，果胶，阿拉伯胶，硬脂酸镁，硬脂酸等等。固体载体可以包括一种或多种可能同时作为增香剂，润滑剂，增溶剂，悬浮剂，填料，助流剂，压缩助剂，粘合剂或片剂-崩解剂的物质；它还可以是包封材料。在粉末中，载体为精细粉碎的固体，它与精细粉碎的活性成分的混合。在片剂中活性成分与具有必要的压缩性质的载体以合适的比例混合，以需要的形状和大小压缩。粉末和片剂优选包含至多99％活性成分。

如果使用液体载体，制剂可以为糖浆，乳剂，软胶囊，在安瓿或小瓶或非水的液体悬浮液中的无菌注射溶液或悬浮液。典型的液体载体包括糖浆，花生油，橄榄油，水，等等。液体载体用于制备溶液，悬浮液，乳剂，糖浆，酊剂和密封的组合物。活性成分可以溶解或悬浮于药学上可接受的液体载体如水，有机溶剂，二者的混合物或药学上可接受的油类或脂肪。液体载体可以包含其他合适的药物添加剂如增溶剂，乳化剂，缓冲剂，防腐剂，增甜剂，增香剂，悬浮剂，增稠剂，颜料，粘度调节剂，稳定形成渗透压-调节剂。用于口服和肠胃外给药的液体载体的合适的例子包括水(部分地包含如同上述的添加剂，例如纤维素衍生物，优选羧甲基纤维素钠盐溶液)，醇(包括一元醇和多元醇，例如乙二醇)和它们的衍生物，和油类(例如分馏椰子油和花生油)。用于肠胃外给药的载体还可以为油脂如油酸乙酯和异丙基肉豆蔻酸盐。无菌的液体载体用于肠胃外给药的无菌的液态组合物。用于加压组合物的液体载体可以为卤代烃或其他药学上可接受的推进剂。无菌溶液或悬浮溶液液体药物组合物可以用来，例如，静脉内，肌内，腹膜内或皮下注射。可根据本领域的已知技术，使用适当的分散剂或湿润剂（如吐温80）和悬浮剂来调配该悬浮液。注射时可单次推入或逐渐注入30分钟的经脉内灌注。该化合物还可以以液体或者固体组合物的形式口服给药。本文中所用的肠胃外一词，包括皮下、皮内、肌肉内、静脉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内和病灶内注射或输液技术。

为了获得稳定的水溶性的剂型，可以将化合物或其药学上可接受的盐溶于有机或无机酸的水溶液，0.3M琥珀酸或柠檬酸溶液。选择性地，酸性的衍生物可以溶于合适的碱性溶液。如果得不到可溶形式，可将化合物溶于合适的共溶剂或它们的结合。这样的合适的共溶剂的例子包括，但是不局限于，浓度范围从0-60％总体积的乙醇，丙二醇，聚乙二醇300，聚山梨酸酯80，甘油，聚氧乙烯脂肪酸酯，脂肪醇或甘油羟脂肪酸酯等等。

本发明的药物组合物可口服、非经肠胃或通过植入的储存器给药，口服给药或通过注射给药时优选的。各种释放系统是已知的并且可以用于化合物或其他各种制剂的给药，这些制剂包括片剂，胶囊，可注射的溶液，脂质体中的胶囊，微粒，微胶囊，等等。引入的方法包括但是不局限于皮肤的，皮内，肌内，腹膜内的，静脉内的，皮下的，鼻腔内的，肺的，硬膜外的，眼睛的和(通常优选的)口服途径。化合物可以通过任何方便的或者其它适当的途径给药，例如通过注入或快速浓注，通过上皮的或粘膜线路(例如，口腔粘膜，直肠和肠粘膜，等等)吸收或通过负载药物的支架以及可以于其他生物活性剂一起给药。可以全身或局部给药。用于鼻，支气管或肺疾病的治疗或预防时，优选的给药途径为口服，鼻给药或支气管烟雾剂或喷雾器。

可供上文提及的调配物和组合物使用的其他适当的赋形剂或载体，可在标准药理学教科书中找到，例如在“Remington’s Pharmaceutical Sciences”，第19版中。为了预防和治疗EV71病毒引起的手足口病，在单一治疗中，在本文中所描述的3C蛋白酶抑制剂化合物，在约0.01到约100mg/kg体重每天之间的剂量范围是有用的，优选的是0.5到75mg/kg体重每天之间。通常，本发明的药物组合物将每天给药约1到5次，或另外一连续的输液。这类药物可用作慢性或急性的治疗。可与载体物质混合，产生单一剂量形式的活性成分的含量，可根据待处理的宿主和给药的特定模式而改变。代表性的制剂将含有约5%到约95%活性成分（重量/重量）。优选的是，这类制剂含有约20%到约80%的活性化合物。

熟悉本领域这将理解可能需要比上文提及的更高或更低的剂量。对特定患者的特定剂量和处理方式应该按照各种因素而定，包括所使用的特定化合物的活性，患者的年龄、体重、性别、一般的健康状态、饮食、给药的时间、代谢率、药物的组合，以及感染的严重性和过程、患者对感染的倾向，还有处理医师的判断。一般而言，以实质上低于该化合物的最佳剂量的小剂量开始治疗。随后通过少量的增加而增加剂量，直到在该情况下达到最佳的效果为止。一般而言，要求以通常足以产生有效的抗病毒结果，但不引起任何有害或不利的副作用的浓度含量来投予该化合物。

当本发明的组合物包括通式（M）化合物与一种或多种另外的治疗或预防剂组合时，该化合物与另外的制剂的存在量应该以约10到100%之间的剂量含量提供，更优选的是约10至80%的剂量，通常以单次治疗法给予。

当这些化合物或其在药学上可接受的盐类与在药学上可接受的载体一起调配时，将所得的组合物在活体内给予哺乳动物，如人类，以便治疗或预防EV71病毒感染。也可使用本发明化合物与下列制剂混合，来完成这类治疗，包括但不局限于：免疫调节剂，如α，β，γ干扰素及其他抗病毒制剂，如阿昔洛韦，更昔洛韦；其他的EV71 3C蛋白酶抑制剂；对在EV71生命循环中其他靶标的抑制剂，如3D蛋白酶，VP1蛋白；或其组合物。可将另外的制剂与本发明化合物混合，以产生单一的剂量形式。另外，也可将这类另外的制剂可分别投予哺乳动物，成为多个剂量形式的一部分。因此，本发明其他的具体方案提供一种在哺乳动物中，通过给予通式（M）化合物，其中取代基如同上文定义，来抑制EV71病毒的方法。

在优选的具体方案中，这些方法在哺乳动物中有用于降低EV71复制能力。如果药物组合物仅包括作为活性成分的本发明化合物，这类方法可另外包括对该哺乳动物给予选自免疫调节剂，抗病毒剂，其他EV71病毒3C蛋白酶抑制剂，或对在EV71生命循环中的其他靶标，如3D蛋白酶抑制剂和VP1蛋白抑制剂。可在给予本发明组合物之前、同时或之后，将这类另外的制剂给予哺乳动物。

工艺流程

本发明通式（M）化合物可以用本发明方法有效地制备，包括采用下述一般合成方法。这些合成方法中的R₁,R₂,X，Y定义如上。

工艺流程I：

以P1位内酰胺环为己内酰胺为例，中间体1-4经流程I的路线合成得到，在该流程中，以谷氨酸1-1为原料，首先将羧基进行甲酯化保护，随后将其氨基进行官能团保护得到其中间体1-2，然后用用LiHMDS（或其他强碱性试剂）将化合物1-2脱质子化，引入氰乙基基团得到中间体1-3。然后将中间体1-3的氰基还原，进而发生分子内酰胺化反应，分子内成环得到关键中间体1-4。

步骤I-1：化合物1-2的制备

在0°C条件下，将乙酰氯（1.5 equiv）缓慢滴加入甲醇中，搅拌5分钟，然后加入谷氨酸（1.0 equiv），继续搅拌并加热至回流，保持回流温度反应2小时。停止反应，减压蒸馏除去溶剂。将得到的油状物溶于THF中，在0°C条件下滴加TEA保持0°C搅拌5分钟，继续滴加溶于THF中的二碳酸二叔丁酯（1.2 equiv），搅拌至室温反应2.5小时。反应结束后，减压除去溶剂，残留物用水（200.0 mL）溶解后，加柠檬酸溶液酸化至PH = 4，加DCM (2×100.0 mL)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水洗涤后有机相用无水硫酸钠干燥，然后浓缩，得到的粗产物经快速色谱柱纯化，得到目标化合物1-2。

步骤I-2：化合物1-3的制备

将双（三甲基硅基）氨基锂（1.0 M的THF溶液，2.2 equiv）加到-78°C的1-2（1.0 equiv）的无水THF（200.0 mL）溶液中，并将所得溶液在此温度搅拌30分钟。然后缓慢滴加溴丙腈（1.5 equiv），将反应混合物在-78°C下继续搅拌2小时。待反应结束后，加入冰醋酸（5.0mL）淬灭反应，搅拌至室温。减压除去溶剂，残留物用水（100.0 mL）溶解后，以DCM萃取(100.0 mL×3)，合并有机相,用饱和食盐水洗涤，并将有机相用无水硫酸钠干燥，然后浓缩，得到的粗产物经快速色谱柱纯化，得到目标化合物1-3。

步骤I-3: 化合物1-4的制备

在1-3（1.0 equiv）的甲醇溶液中加入六水合氯化钴（1.0 equiv），然后在0°C条件下向所得到的粉红色溶液中分次加入硼氢化钠（10 equiv），室温搅拌18小时。TLC监测反应，待反应完毕后，加入饱和氯化铵水溶液（30.0 mL）淬灭反应，搅拌10分钟。抽滤除去固体杂质，减压除去易挥发溶剂，残留液体用DCM（100.0 mL×3）萃取后，加水(2×50.0 mL)洗涤有机相。合并的有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤蒸除溶剂，得到的粗产物经快速色谱柱纯化，最终得到关键中间体1-4。

工艺流程II：

结构单元2-4通过流程II合成得到，其中R₁, R₂表示的基团上文已经描述。以化合物2-1为原料，首先进行烯丙基酯化保护得到化合物2-2，再与不同的有机酸或者酰氯2-3进行缩合得到中间体2-4。

步骤II-1：化合物2-2的制备

2-1（1.0 equiv）溶于烯丙醇200 mL中，0 ℃下，缓慢慢滴加二氯亚砜（2.0 equiv）。滴加完毕后，继续在0 ℃下搅拌20 min。这时反应加热回流3-4 h，后冷却至室温。减压蒸发除去丙烯醇，溶于少量甲醇，乙醚重结晶，得到固体2-2直接用于下一步。

步骤II-2：化合物2-4的制备

2-2（1.0 equiv）溶于适量干燥的DCM中，0℃下TEA调pH = 7.0, 依此加入EDCI, HOBT,以及有机酸2-3,加入TEA（3.0 equiv）。0℃下搅拌30 min,升至室温搅拌6-8 h。或者2-2（1.0 equiv）溶于适量干燥的DCM中，0℃下TEA调pH = 7.0,依此加入酰氯2-3(1.5 equiv)和TEA (3.0 equiv)，0℃下搅拌30 min,升至室温搅拌1-2 h。反应完毕依此用水，饱和柠檬酸，饱和NaHCO₃，饱和氯化钠洗涤有机相。合并的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤减压蒸除溶剂，得到的粗产物经快速色谱柱纯化，得到化合物2-4。

工艺流程III：

本流程中结构单元1-4脱去氨基保护基，2-4脱去羧基保护基在酰胺缩合剂的作用下进行缩合得到化合物3-3。

步骤III-1：化合物3-1的制备

1-4（1.0 equiv）溶于干燥的DCM中, 0 ℃下缓慢滴加TFA（10 equiv）,在此温度下搅拌30 min,室温搅拌2-4 h。待反应完毕，减压蒸馏除去DCM及TFA，不经纯化直接用于下一步。

步骤III-2：化合物3-2的制备

2-4（1.0 equiv）溶于干燥的THF中，0 ℃下加入N-甲基苯胺（4.0 equiv）和Pd[(P(Ph)₃]₄（0.05 equiv）,在0 ℃下搅拌0.5-1 h。待反应完毕，减压蒸馏除去THF，粗品经快速色谱柱纯化，得到化合物3-2。

步骤III-3：化合物3-3的制备

3-1 (1.0 equiv)溶于干燥的DCM中，0 ℃下TEA调pH = 7.0,依此加入EDCI（1.5equiv）, HOBT（1.5 equiv）, 3-2（1.2 equiv）, 升至室温下搅拌6-8 h。反应完毕依此用水，饱和柠檬酸，饱和NaHCO₃，饱和氯化钠洗涤有机相。合并的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤减压蒸除溶剂，得到的粗产物经快速色谱柱纯化，得到化合物3-3。

工艺流程IV：

本流程是进行化合物3-1的结构衍生化，通过一系列的反应得到醛类衍生物4-2。

步骤IV-1：化合物4-1的制备

向化合物3-1（1.0 equiv.）的甲醇溶液（10.0 mL）中分次加入硼氢化钠（10.0equiv.），室温搅拌2小时。加入饱和氯化铵水溶液（5.0 mL）淬灭反应，减压除去甲醇。用DCM（3×50.0 ml）和水萃取，除去水溶性的杂质，合并的有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，然后浓缩，得到的粗产物经快速色谱柱纯化，得到目标化合物4-1。

步骤IV-2：化合物4-2的制备

向4-1（1.0 equiv.）的无水DCM（10.0 mL）溶液中加入DMP（1.2 equiv.），搅拌2小时。加入饱和碳酸氢钠（2.0 mL）淬灭反应，同时加入硫代硫酸钠（2.0 equiv.），搅拌至有机相澄清。用DCM（3×50.0 mL）萃取，合并的有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，粗产物经快速色谱柱纯化，得到目标化合物4-2。

工艺流程Ⅴ：

本流程通过Horner–Wadsworth–Emmons反应或者Knoevenagel缩合反应得到本发明通通式（M）化合物5-1。

4-2（1.0 equiv）溶于适量的乙腈中，依此加入相应的HWE-reagent（2.0 equiv），LiCl（1.2 equiv）, DBU（1.5 equiv）,室温下搅拌2-4 h。待反应完毕，饱和NH₄Cl淬灭，减压蒸馏除去溶剂，DCM（3×50.0 mL）萃取，合并的有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，粗产物经快速色谱柱纯化，得到目标化合物5-1。

或者通过Knoevenagel 缩合反应，4-2（1.0 equiv）溶于适量干燥的DCM，相应的活泼亚甲基化合物（1.2 equiv）和哌啶（0.2 equiv）相继加入。室温搅拌2-8 h，待反应完毕，依此用水，饱和柠檬酸，饱和碳酸氢钠，饱和氯化钠饱洗涤有机相。合并的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤减压蒸除溶剂，得到的粗产物经快速色谱柱纯化，得到化合物5-1。

实例

通过下列不受限制的实例，更详细地说明本发明，但本发明不局限于以下实例。下列实例中以摄氏度数提供温度。除非另行陈述，溶液百分比表示重量对体积的关系，且溶液比例表示体积对体积的关系。实例中化合物的结构用以下一种或多种方法确定：核磁共振谱仪，高分辨质谱分析，薄层色谱。

核磁共振谱（¹H NMR和¹³C NMR）是用Bruker 400谱仪在400 MHz场强下测定的。化学位移用相对于内标四甲基甲硅烷标准下移多少百万分之一（ppm，δ）表示。¹H-NMR中峰的多重性表示如下：s=单峰；d=双重峰；t=三重峰；m=多重峰。偶合常数用赫兹表示。溶剂峰参考内部的氘代试剂。所用的商品化试剂都是分别从它们各自的供应商那里得到，若有需处理的条件，文中另有说明。四氢呋喃（THF）是在使用前经钠-二苯甲酮体系蒸馏而得；二氯甲烷（DCM）是在使用前从氢化钙蒸馏而得。

本文用到下列缩写：Me：甲基；MeOH：甲醇；Boc：叔-丁氧羰基；TEA：三乙胺；EtOAc：乙酸乙酯；DMP：Dess-martin试剂； DBU：1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯PE；石油醚；Et₂O：乙醚；TFA：三氟乙酸；EDCI：1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐）；HOBT：1-羟基苯并三氮唑水合物。另外，“L”代表天然存在的氨基酸。FBS: 胎牛血清；PBS溶液: 磷酸缓冲液；PBST：磷酸缓冲液加上Tween-20；ESMS：电喷雾质谱分析；MS：质谱分析；HPLC：高效液相色谱法。

本发明实施方案的实例如下所述：

实施实例1：化合物1-2的制备

在0 °C条件下，将乙酰氯（5 mL）缓慢滴加入甲醇（100 mL）中，搅拌5分钟，然后加入谷氨酸（10 g，67.9 mmol），继续搅拌并加热至回流，保持回流温度反应2小时。待反应完全，减压蒸馏除去溶剂，用乙醚重结晶。将得到的油状物溶于THF（150 mL）中，在0 °C条件下滴加TEA（28.5 mL，203.7 mmol），保持0 °C搅拌5分钟，继续滴加溶于THF（30 mL）中的二碳酸二叔丁酯（17.8 g，81.5 mmol），升至室温搅拌2.5小时。反应结束后，减压蒸馏除去溶剂，残留物中加入水（200 mL），用DCM（2×200 mL）从水相中萃取，合并的有机相用无水硫酸钠干燥，然后浓缩，得到的粗产物经快速色谱柱纯化（PE:EA=5:1），得到化合物1-2为无色油状液体（17.7 g，产率95.2%）。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 4.22 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 3.64(s, 3H), 3.57 (s, 3H), 2.41 – 2.22 (m, 2H), 2.08 (td, J = 13.1, 7.0 Hz, 1H),1.86 (td, J = 14.7, 8.1 Hz, 1H), 1.33 (s, 9H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ:173.00, 172.55, 155.30, 79.68, 52.77, 52.18, 51.56, 29.94, 28.05, 27.49. ESI-MS (m/z): 298.1 (M+Na)⁺。

实施实例2：化合物 1-3的制备

在 -78 °C,氮气保护的条件下，将双（三甲基硅基）氨基锂（78.5 mL, 1.0 M的THF溶液，78.5 mmol）缓慢滴加到1-2（10 g，36.4 mmol）的无水THF（200 mL）溶液中，在此温度下搅拌 30 分钟。然后保持温度不变，缓慢滴加溴丙腈（3.4 mL），将反应混合物在 -78°C 的条件下继续搅拌 2 小时。待反应完毕后，加入冰醋酸（5 mL）淬灭反应，搅拌至室温。减压蒸馏除去溶剂，然后加入水（200 mL），用 DCM（2×200 mL）萃取水相，合并的有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，粗产物经快速色谱柱纯化（PE:EA=2:1），得到1-3为淡黄色油状液体（7.1 g，产率59.5%）。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 4.39 – 4.22 (m, 1H), 3.67 (s,3H), 3.64 (s, 3H), 2.62 – 2.50 (m, 1H), 2.33 (dd, J = 12.7, 7.3 Hz, 2H), 1.96(m, 4H), 1.37 (s, 9H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ: 174.35, 172.30, 155.35,118.70, 80.13, 52.45, 52.09, 51.54, 40.78, 34.23, 28.20, 27.27, 15.05. ESI-MS(m/z): 329.2 (M+H)⁺。

实施实例3：化合物1-4的制备

向1-3（5 g，15.9 mmol）的甲醇（80 mL）溶液中加入氯化钴水合物（4 g，14.6 mmol），然后在0 °C条件下多次缓慢加入硼氢化钠（6 g，157.9 mmol），室温搅拌18小时。加入饱和氯化铵水溶液（30 mL）淬灭反应，搅拌10分钟。抽滤除去固体杂质，减压蒸除易挥发溶剂。用DCM（3×100 mL）从水相中萃取，合并的有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，粗产物经快速色谱柱（EA）纯化,得到白色泡沫状1-4（2.9 g，产率60.7%）。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃-d) δ6.87 (s, 1H), 5.73 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.23 (ddd, J = 11.8, 8.5, 3.7 Hz,1H), 3.65 (s, 3H), 3.33 – 3.14 (m, 2H), 2.37 – 2.13 (m, 2H), 2.13 – 1.99 (m,1H), 1.88 – 1.72 (m, 2H), 1.72 – 1.58 (m, 1H), 1.50 (ddd, J = 13.8, 10.5, 3.0Hz, 1H), 1.36 (s, 9H). ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃-d) δ 174.7, 173.2, 155.9, 79.3,52.0, 51.6, 41.9, 37.7, 33.8, 28.1, 26.3, 21.3. ESI-MS (m/z): 323.2 (M + Na)⁺。

ESI-MS (m/z): 323.2 (M + Na)⁺。

实施实例4：化合物2-2的制备

在0 °C条件下，4-F-L-苯丙氨酸（10 g，54.6 mmol）溶于烯丙醇（200 mL）中，缓慢滴加氯化亚砜（8.0 mL, 110 mmol）。在0 °C下搅拌0.5 h后，回流fanying4 h。待反应完毕，降至室温，减压蒸馏除去溶剂，残渣溶于少量甲醇，加入大量乙醚重结晶，得到2-2为淡黄色固体（12 g,产率98%）。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ 8.91 (s, 2H), 7.33 (dd, J = 8.3,5.5 Hz, 2H), 7.16 (t, J = 8.7 Hz, 2H), 5.82 (ddt, J = 16.3, 10.8, 5.5 Hz,1H), 5.43 – 5.12 (m, 2H), 4.60 (d, J = 5.5 Hz, 2H), 4.27 (t, J = 6.6 Hz, 1H),3.28 (dd, J = 14.1, 5.5 Hz, 1H), 3.14 (dd, J = 14.0, 7.8 Hz, 1H); ¹³C NMR (101MHz, DMSO-d ₆) δ 169.0, 161.9 (d, J = 242.8 Hz), 132.0, 131.9, 131.9, 131.4(d, J = 2.8 Hz), 119.1, 115.8, 115.6, 66.3, 53.7, 35.4. ESI-MS (m/z): 224.1(M + H)⁺。

实施实例5：化合物2-4的制备

在0 °C下，2-3（6.9 g, 54.0 mmol）溶于干燥的DCM（300 mL）, 逐滴加入草酰氯（7.0mL, 81.0 mmol）。随后，加入催化当量的DMF，搅拌20分钟，升至室温搅拌2 h。待反应完全，减压浓缩除去溶剂，所得酰氯不经纯化直接用于下一步。化合物2-2溶于干燥的DCM中，0 °C下TEA调pH = 7.0，逐滴加入上述制备的酰氯，搅拌10分钟后，逐滴加入TEA（23.0 mL, 162mmol）。升至室温，搅拌2 h。待反应完全，依此用水，饱和柠檬酸，饱和NaHCO₃，饱和氯化钠洗涤有机相。合并的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤减压蒸除溶剂，得到的粗产物经快速色谱柱纯化（PE:EA = 5:1），得到化合物2-4为黄色油状物（14 g, 产率80%）。¹H NMR (400 MHz,MeOH-d ₄) δ 7.35 – 7.18 (m, 2H), 6.97 (t, J = 8.7 Hz, 2H), 6.40 (d, J = 1.1Hz, 1H), 5.99 – 5.79 (m, 1H), 5.29 (dq, J = 17.1, 1.5 Hz, 1H), 5.23 – 5.12(m, 1H), 4.96 (dd, J = 8.8, 5.5 Hz, 1H), 4.63 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 3.30 (dd,J = 14.0, 5.6 Hz, 1H), 3.16 (dd, J = 14.0, 8.9 Hz, 1H), 2.42 – 2.33 (m, 3H).¹³C NMR (101 MHz, MeOH-d ₄) δ 171.7, 170.7, 161.9 (d, J = 243.8 Hz), 159.7,158.2, 132.6 (d, J = 3.1 Hz), 131.7, 130.9, 130.8, 117.7, 115.0, 114.8,100.9, 65.8, 53.9, 36.0, 10.9. ESI-MS (m/z): 333.1 (M + H)⁺。

实施实例6：化合物 3-2的制备

在0 °C条件下, 2-4（14.0 g, 42.1 mmol）溶于THF中，加入N-甲基苯胺（13.7 mL, 126mmol）和Pd(PPh₃)₄（2.43 g, 2.11 mmol）。升至室温，搅拌0.5 h。减压蒸馏除去溶剂，粗品经快速色谱柱纯化（MeOH:DCM = 1:30），得到化合物3-2为白色固体（9 g, 产率75%）。¹H NMR(400 MHz, MeOH-d ₄) δ 7.37 – 7.16 (m, 2H), 7.09 – 6.87 (m, 2H), 6.41 (d, J =1.1 Hz, 1H), 4.85 (dd, J = 8.9, 4.9 Hz, 1H), 3.36 – 3.29 (m, 1H), 3.12 (dd, J= 14.0, 8.9 Hz, 1H), 2.46 (d, J = 0.9 Hz, 3H). ¹³C NMR (101 MHz, MeOH-d ₄) δ172.5, 171.7, 161.9 (d, J = 243.4 Hz), 159.8, 158.1, 132.9 (d, J = 3.0 Hz),130.7, 130.6, 114.8, 114.6, 100.5, 53.6, 35.9, 10.6. ESI-MS (m/z): 293.1 (M +H)⁺。

实施实例7：化合物3-3的制备

1-4（5.0 g，16.7 mmol）溶于干燥的DCM中,0 °C条件下，逐滴加入TFA（12.5 mL，167mmol）。升至室温，搅拌2 h。待反应完全，减压蒸馏除去溶剂，加入适量的干燥DCM，0 °C下，加入TEA调pH = 7.0, 依此加入3-2（4.9 g，16.7 mmol），EDCI（4.8 g，25.0 mmol）,HOBT（3.4 g，25.0 mmol）。搅拌0.5 h后，逐滴加入TEA（7.0 mL, 50.0 mmol）。升至室温，搅拌4h。待反应完全，依此用水，饱和柠檬酸，饱和NaHCO₃，饱和氯化钠洗涤有机相。合并的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤减压蒸除溶剂，得到的粗产物经快速色谱柱纯化（MeOH:DCM= 1:50），得到化合物3-3为白色泡沫状固体（6 g, 产率81%）。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃-d) δ8.20 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.17 (t, J = 6.2 Hz, 2H),6.96 – 6.82 (m, 2H), 6.73 (s, 1H), 6.31 (s, 1H), 5.00 (q, J = 7.3 Hz, 1H),4.63 – 4.43 (m, 1H), 3.66 (d, J = 2.0 Hz, 3H), 3.32 –2.98 (m, 4H), 2.40 (s,3H), 2.38 – 2.17 (m, 2H), 2.06 – 2.01 (m, 1H), 1.83 (ddd, J = 13.7, 8.3, 4.1Hz, 2H), 1.76 – 1.58 (m, 1H), 1.58 – 1.41 (m, 1H). ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃-d)δ 174.7, 172.2, 171.1, 170.8, 161.8 (d, J = 244.6 Hz), 158.8, 158.3, 132.1(d, J = 3.0 Hz), 131.1, 131.0, 115.3, 115.0, 101.3, 54.1, 52.3, 50.7, 42.2,37.9, 37.9, 33.5, 26.5, 21.3, 12.2. ESI-MS (m/z): 475.2 (M + H)⁺。

实施实例8: 化合物4-1的制备

0 °C下，向化合物3-1（5.0 g，10.5 mmol）的甲醇溶液中，分次缓慢加入硼氢化钠（4.0g，105.4 mmol），随后升至室温，搅拌2 h。待反应结束，加入饱和氯化铵水溶液（5.0 mL）淬灭反应，减压除去甲醇。用DCM（3×50.0 ml）和水萃取，除去水溶性的杂质，合并的有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，然后浓缩，得到的粗产物经快速色谱柱纯化（MeOH:DCM = 1:30），得到目标化合物4-1（3.4 g, 产率72%）。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃-d) δ 7.90(d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.24 – 7.10 (m, 2H), 7.02 –6.86 (m, 2H), 6.42 (s, 1H), 6.34 (d, J = 1.0 Hz, 1H), 4.89 (dt, J = 8.6, 6.7Hz, 1H), 3.96 (ddd, J = 11.5, 7.6, 4.0 Hz, 1H), 3.46 (d, J = 4.3 Hz, 2H),3.33 – 3.18 (m, 2H), 3.11 (d, J = 6.7 Hz, 2H), 2.43 (s, 3H), 2.18 (dq, J =11.2, 6.0 Hz, 1H), 2.07 (ddd, J = 14.0, 11.1, 4.9 Hz, 1H), 2.01 – 1.94 (m,1H), 1.82 (dt, J = 13.7, 4.5 Hz, 1H), 1.73 – 1.61 (m, 1H), 1.58 – 1.50 (m,1H), 1.49 – 1.41 (m, 1H). ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃ -d) δ 175.7, 171.2, 170.9,161.9 (d, J = 244.8 Hz), 158.9, 158.3, 132.1 (d, J = 2.9 Hz), 131.0, 130.9,115.4, 115.2, 101.4, 65.6, 54.5, 50.2, 42.4, 38.2, 38.0, 32.6, 27.1, 21.5,12.3. ESI-MS (m/z): 469.2 (M + Na)⁺。

实施实例9: 化合物4-2的制备

向4-1（2 g，4.5 mmol）的无水 DCM（10 mL）溶液中加入DMP（2.3 g，5.4 mmol），搅拌2小时。加入饱和碳酸氢钠（2.0 mL）淬灭反应，同时加入硫代硫酸钠（1.4 g，9.0 mmol），搅拌至有机相澄清。加入DCM（3×50 mL）萃取，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到的粗产物经快速色谱柱（MeOH: DCM = 1:30）纯化，得到4-2为白色泡沫状固体（1.6 g，产率80%）¹H NMR (400 MHz, CDCl₃-d) δ 9.28 (s, 1H), 8.36 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 7.62(d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.19 (ddd, J = 8.5, 5.3, 2.7 Hz, 2H), 6.91 (dd, J =10.0, 7.2 Hz, 2H), 6.59 (s, 1H), 6.32 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 5.00 (q, J = 7.2Hz, 1H), 4.34 (ddd, J = 10.7, 6.9, 4.6 Hz, 1H), 3.17 (ddt, J = 29.0, 14.0,6.5 Hz, 4H), 2.41 (d, J = 2.7 Hz, 3H), 2.22 (dq, J = 12.6, 6.4 Hz, 1H), 2.09(ddd, J = 15.6, 9.4, 6.6 Hz, 1H), 2.03 – 1.89 (m, 1H), 1.87 – 1.72 (m, 2H),1.73 – 1.56 (m, 1H), 1.56 – 1.35 (m, 1H). ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃-d) δ 199.7,174.9, 171.2, 171.1, 161.9 (d, J = 245.2 Hz), 158.9, 158.3, 132.0 (d, J = 3.1Hz), 131.0, 130.9, 115.4, 115.2, 101.3, 57.1, 54.2, 42.2, 37.9, 37.3, 30.7,27.1, 21.2, 12.2. HRMS (ESMS): C₂₂H₂₆FN₄O₅ (M + H)⁺, calcd. 445.1882, found445.1879。

实施实例10：化合物1的制备

膦酰基乙酸甲酯二乙酯（57 mg，0.27 mmol）溶于干燥的THF（50 mL）中，氮气保护，-78℃下逐滴加入到NaHMDS（1.0 mmol in THF，0.27 mL），搅拌半个小时，4-2（100 mg，0.23mmol）溶于干燥的THF逐滴加入上述反应液中，搅拌2 h，待反应完毕，1.0 M HCl溶液淬灭反应。减压蒸馏除去溶剂，得到的残渣DCM溶解，依此用水，饱和柠檬酸，饱和NaHCO₃，饱和氯化钠洗涤有机相。合并的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤减压蒸除溶剂，得到的粗产物经快速色谱柱纯化（MeOH:DCM= 1:50），得到化合物1为白色泡沫状固体（90 mg, 产率80%）。¹H NMR(CDCl₃-d) δ 7.2 – 7.1 (m, 2H), 6.9 (t, J = 8.6 Hz, 2H), 6.7 (d, J = 5.7 Hz,1H), 6.3 (s, 1H), 5.6 (dd, J = 15.6, 1.5 Hz, 1H), 4.9 (hept, J = 7.3 Hz, 1H),4.5 (s, 1H), 3.7 (s, 3H), 3.2 (tq, J = 12.5, 7.2 Hz, 2H), 3.1 (s, 2H), 2.4(s, 3H), 2.2 (qd, J = 9.4, 7.9, 3.1 Hz, 1H), 2.1 (ddd, J = 14.1, 12.0, 4.4Hz, 1H), 2.0 (dt, J = 13.7, 5.0 Hz, 1H), 1.9 – 1.8 (m, 1H), 1.7 – 1.6 (m,1H), 1.5 (dddd, J = 23.7, 20.9, 9.1, 3.3 Hz, 2H).¹³C NMR (CDCl₃-d) δ175.0,171.2, 170.4, 166.7, 162.0 (d, J = 244.8 Hz), 158.9, 158.4, 147.6, 132.0 (d,J = 3.1 Hz), 131.1, 131.0, 120.7, 115.5, 115.3, 101.5, 54.6, 51.7, 48.4,42.3, 38.1, 38.0, 35.7, 26.8, 21.4, 12.3. HRMS (ESMS): C₂₅H₂₉FN₄NaO₆ (M + Na)⁺,calcd. 523.1963, found 523.1968.

实施实例11：化合物2的制备

合成步骤同化合物1。¹H NMR (CDCl₃-d) δ 7.2 (dd, J = 8.4, 5.5 Hz, 2H), 6.9(t, J = 8.7 Hz, 2H), 6.7 (dd, J = 15.6, 5.7 Hz, 1H), 6.3 (s, 1H), 5.7 (dd, J= 15.7, 1.4 Hz, 1H), 5.0 – 4.9 (m, 1H), 4.5 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 4.2 (q, J =7.1 Hz, 2H), 3.3 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 3.1 (d, J = 6.7 Hz, 2H), 2.4 (s, 3H),2.2 (q, J = 5.6 Hz, 1H), 2.1 – 2.1 (m, 1H), 2.0 (td, J = 10.7, 8.5, 5.0 Hz,1H), 1.8 (dt, J = 13.7, 4.1 Hz, 1H), 1.7 (dt, J = 13.6, 7.6 Hz, 1H), 1.5(tdd, J = 14.7, 5.7, 2.6 Hz, 2H), 1.3 – 1.3 (m, 3H). ¹³C NMR (CDCl₃-d) δ175.0, 171.3, 170.4, 166.3, 162.0 (d, J = 245.0 Hz), 158.9, 158.4, 147.2,132.0 (d, J = 3.0 Hz), 131.2, 131.1, 121.3, 115.6, 115.4, 101.5, 60.6, 54.6,48.9, 42.4, 38.4, 38.2, 35.7, 27.3, 21.6, 14.3, 12.4. HRMS (ESMS):C₂₆H₃₁FN₄NaO₆ (M + Na)⁺, calcd. 537.2120, found 537.2125.

实施实例12：化合物3的制备

4-2（100 mg, 0.23 mmol）溶于乙腈中，依此加入(2-(甲基氨基)-2-氧代乙基)磷酸二乙酯（56 mg, 0.27 mmol），LiCl（12 mg, 0.27 mmol），DBU（51 mg, 0.34 mmol），室温搅拌2h，待反应完毕，饱和氯化铵淬灭溶液，减压蒸馏溶剂，依此用水，饱和柠檬酸，饱和NaHCO₃，饱和氯化钠洗涤有机相。合并的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤减压蒸除溶剂，得到的粗产物经快速色谱柱纯化（MeOH:DCM= 1:50），得到化合物3为白色泡沫状固体（90 mg, 产率80%）。¹H NMR (CDCl₃-d) δ 7.2 – 7.1 (m, 2H), 6.9 (t, J = 8.6 Hz, 2H), 6.7 (dd, J= 15.7, 5.6 Hz, 1H), 6.3 (s, 1H), 5.7 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 4.9 (d, J = 7.8Hz, 1H), 4.5 (s, 1H), 3.7 (s, 3H), 3.2 (d, J = 11.4 Hz, 2H), 3.1 (d, J = 6.8Hz, 2H), 2.4 (s, 3H), 2.2 (s, 1H), 2.1 (s, 1H), 2.0 (d, J = 13.8 Hz, 1H), 1.8(d, J = 13.5 Hz, 1H), 1.7 – 1.6 (m, 1H), 1.5 (p, J = 11.0 Hz, 2H). ¹³C NMR(CDCl₃-d) δ 175.0, 171.3, 170.4, 166.8, 162.0 (d, J = 244.9 Hz), 158.9,158.4, 147.6, 132.0 (d, J = 3.0 Hz), 131.1, 131.0, 120.7, 115.6, 115.4,101.5, 54.6, 51.7, 48.6, 42.4, 38.2, 38.2, 35.7, 27.1, 21.5, 12.4. HRMS(ESMS): C₂₅H₃₀FN₅NaO₅ (M + Na)⁺, calcd. 522.2123, found 522.2125.

实施实例13：化合物4的制备

合成步骤同化合物3。¹H NMR (MeOH-d ₄) δ 7.4 – 7.2 (m, 2H), 7.1 – 6.9 (m,2H), 6.6 (dd, J = 15.5, 5.9 Hz, 1H), 6.4 (d, J = 1.1 Hz, 1H), 5.9 (dd, J =15.5, 1.4 Hz, 1H), 4.7 (dd, J = 8.4, 6.4 Hz, 1H), 4.6 (dddd, J = 10.2, 6.1,4.1, 2.1 Hz, 1H), 3.3 – 3.0 (m, 4H), 2.5 (d, J = 0.8 Hz, 3H), 2.4 (tdd, J =10.0, 6.1, 3.7 Hz, 1H), 2.1 (ddd, J = 14.0, 11.8, 4.0 Hz, 1H), 2.0 (dtd, J =12.7, 6.1, 3.1 Hz, 1H), 1.9 – 1.7 (m, 1H), 1.6 (dddd, J = 24.1, 14.1, 9.0,4.7 Hz, 2H), 1.5 (dtd, J = 13.4, 10.2, 3.3 Hz, 1H). ¹³C NMR (MeOH-d ₄) δ 175.4,171.6, 171.3, 168.8, 161.9 (d, J = 243.7 Hz), 159.9, 158.2, 143.7, 132.6 (d,J = 3.1 Hz), 130.9, 130.8, 122.8, 114.9, 114.7, 100.5, 55.1, 47.6, 41.5,37.3, 36.5, 35.3, 25.7, 20.7, 10.6. HRMS (ESMS): C₂₄H₂₈FN₅NaO₅ (M + Na)⁺,calcd. 508.1967, found 508.1970.

实施实例14：化合物5的制备

合成步骤同化合物3。¹H NMR (CDCl₃-d) δ 7.2 (dd, J = 8.3, 5.4 Hz, 2H), 7.0(t, J = 8.6 Hz, 2H), 6.4 (dd, J = 16.3, 5.4 Hz, 1H), 6.3 (s, 1H), 5.1 (d, J =16.3 Hz, 1H), 4.9 (q, J = 7.4 Hz, 1H), 4.4 (dq, J = 10.8, 5.0 Hz, 1H), 3.3(qt, J = 11.6, 4.6 Hz, 2H), 3.1 (qd, J = 13.7, 6.9 Hz, 2H), 2.4 (s, 3H), 2.2(dq, J = 11.6, 6.0 Hz, 1H), 2.1 – 1.9 (m, 2H), 1.8 (dq, J = 13.8, 4.5 Hz,1H), 1.8 – 1.6 (m, 1H), 1.5 (ddt, J = 13.6, 10.5, 3.4 Hz, 2H). ¹³C NMR (CDCl₃-d) δ 174.8, 171.5, 170.6, 162.1 (d, J = 245.9 Hz), 159.0, 158.3, 153.6, 131.9(d, J = 3.1 Hz), 131.2, 131.1, 117.0, 115.7, 115.5, 101.5, 100.2, 54.6, 49.4,42.3, 38.2, 38.0, 35.1, 27.2, 21.6, 12.4. HRMS (ESMS): C₂₄H₂₆FN₅NaO₄ (M + Na)⁺,calcd. 490.1861, found 490.1865.

实施实例15：化合物6的制备

合成步骤同化合物3。¹H NMR (CDCl₃-d) δ 7.1 (ddd, J = 13.3, 8.2, 5.4 Hz,2H), 6.9 (dt, J = 15.4, 8.5 Hz, 2H), 6.3 (d, J = 3.1 Hz, 1H), 5.8 – 5.5 (m,1H), 4.9 (dq, J = 22.6, 7.4 Hz, 1H), 4.7 – 4.5 (m, 1H), 3.2 (d, J = 10.4 Hz,2H), 3.1 (h, J = 7.2 Hz, 2H), 2.4 (d, J = 1.8 Hz, 3H), 2.2 (ddt, J = 16.5,12.4, 5.9 Hz, 2H), 2.0 (dt, J = 9.2, 4.7 Hz, 1H), 2.0 – 1.9 (m, 3H), 1.8 (dq,J = 9.2, 4.6 Hz, 1H), 1.7 – 1.6 (m, 1H), 1.4 (ddd, J = 13.6, 8.7, 3.1 Hz,1H), 1.3 (ddd, J = 14.1, 7.2, 3.8 Hz, 1H). ¹³C NMR (CDCl₃-d) δ 174.6, 171.3,170.3, 170.2, 163.1 (d, J = 244.6 Hz), 162.0 (d, J = 245.3 Hz), 158.9, 158.8,158.3, 158.3, 147.9, 146.8, 132.2 (d, J = 3.0 Hz), 131.9 (d, J = 3.0 Hz),131.1 (d, J = 8.1 Hz), 131.0 (d, J = 7.9 Hz), 120.0, 115.5, 115.3, 115.3,115.1, 110.8, 110.0, 101.3, 101.3, 54.3, 54.2, 49.0, 45.5, 42.3, 42.3, 38.3,38.1, 37.8, 35.7, 35.0, 27.1, 26.9, 21.5, 21.5, 20.1, 15.3, 12.3. HRMS(ESMS): C₂₅H₂₈FN₅NaO₄ (M + Na)⁺, calcd. 504.2018, found 504.2022.

实施实例16：化合物7的制备

合成步骤同化合物3。¹H NMR (CDCl₃-d) δ 7.1 (dd, J = 8.2, 5.3 Hz, 2H), 6.9(td, J = 8.9, 2.7 Hz, 2H), 6.4 (s, 1H), 6.3 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 4.9 (q, J =7.1 Hz, 1H), 4.7 – 4.5 (m, 1H), 3.8 (s, 3H), 3.3 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 3.1(qd, J = 13.7, 6.7 Hz, 2H), 2.5 (s, 3H), 2.2 (td, J = 9.8, 8.7, 4.4 Hz, 1H),2.1 – 2.0 (m, 1H), 2.0 – 1.9 (m, 3H), 1.9 – 1.8 (m, 1H), 1.8 – 1.6 (m, 1H),1.6 – 1.4 (m, 1H), 1.4 – 1.3 (m, 2H). ¹³C NMR (CDCl₃-d) δ 175.1, 171.1, 169.9,168.2, 161.9 (d, J = 244.9 Hz), 158.7, 158.4, 141.1, 131.9 (d, J = 3.0 Hz),131.1, 131.0, 128.5, 115.4, 115.2, 101.4, 54.4, 52.0, 47.0, 42.4, 38.4, 38.2,35.4, 27.7, 21.6, 12.7, 12.4. HRMS (ESMS): C₂₆H₃₁FN₄NaO₆ (M + Na)⁺, calcd.537.2120, found 537.2123.

实施实例17：化合物8的制备

合成步骤同化合物3。¹H NMR (CDCl₃-d) δ 7.1 (dd, J = 8.1, 5.4 Hz, 2H), 7.0 –6.8 (m, 2H), 6.3 (s, 1H), 5.4 (dd, J = 32.3, 8.6 Hz, 1H), 4.9 (q, J = 6.7,5.9 Hz, 1H), 4.8 – 4.6 (m, 1H), 3.3 (h, J = 12.2, 11.4 Hz, 2H), 3.1 (q, J =5.8 Hz, 2H), 2.4 (s, 3H), 2.2 (q, J = 11.7, 8.3 Hz, 2H), 2.0 (dq, J = 14.1,5.4, 4.9 Hz, 1H), 1.8 (d, J = 15.0 Hz, 1H), 1.7 (qd, J = 11.4, 6.0 Hz, 1H),1.4 (q, J = 11.2, 10.7 Hz, 2H). ¹³C NMR (CDCl₃-d) δ 174.6, 171.3, 170.4, 161.9(d, J = 245.5 Hz), 158.9, 158.2, 131.9 (d, J = 3.1 Hz), 131.8 (d, J = 248.2Hz), 131.0, 130.9, 127.1 (d, J = 10.7 Hz), 115.4, 115.2, 111.7 (d, J = 47.2Hz), 101.3, 54.2, 43.2, 42.2, 38.0, 37.9, 35.0, 26.8, 21.4, 12.3. HRMS(ESMS): C₂₄H₂₅F₂N₅NaO₄ (M + Na)⁺, calcd. 508.1767, found 508.1770.

实施实例28：化合物9的制备

合成步骤同化合物3。¹H NMR (CDCl₃-d) δ 7.1 (dt, J = 8.7, 5.2 Hz, 2H), 7.0(q, J = 7.9 Hz, 2H), 6.3 (s, 1H), 6.1 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 4.9 (q, J = 7.6Hz, 1H), 4.8 – 4.5 (m, 1H), 3.3 (d, J = 10.2 Hz, 2H), 3.1 (qd, J = 13.7, 6.7Hz, 2H), 2.4 (s, 3H), 2.3 – 2.1 (m, 2H), 2.0 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 1.9 (d, J= 13.8 Hz, 1H), 1.8 – 1.6 (m, 1H), 1.5 (dd, J = 25.0, 12.3 Hz, 2H). ¹³C NMR(CDCl₃-d) δ 174.7, 171.4, 170.6, 162.1 (d, J = 245.7 Hz), 158.9, 158.3,148.0, 132.0 (d, J = 3.2 Hz), 131.1, 131.1, 115.6, 115.4, 114.7, 104.4,101.4, 54.3, 47.3, 42.4, 38.3, 38.2, 33.8, 27.3, 21.6, 12.4. HRMS (ESMS):C₂₄H₂₅ClFN₅NaO₄ (M + Na)⁺, calcd. 524.1471, found 524.1475.

实施实例19：化合物10的制备

合成步骤同化合物3。¹H NMR (CDCl₃-d) δ 7.2 (dt, J = 8.4, 4.7 Hz, 2H), 7.0(td, J = 8.6, 2.7 Hz, 2H), 6.3 (s, 1H), 6.2 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 4.9 (q, J =7.4 Hz, 1H), 4.6 – 4.5 (m, 1H), 3.3 (s, 2H), 3.2 – 3.0 (m, 2H), 2.5 (s, 3H),2.2 – 2.0 (m, 3H), 1.9 (dt, J = 13.3, 4.3 Hz, 1H), 1.7 (dd, J = 15.1, 6.9 Hz,1H), 1.6 – 1.4 (m, 2H). ¹³C NMR (CDCl₃-d) δ 174.8, 171.2, 170.4, 161.9 (d, J =245.5 Hz), 158.9, 158.2, 152.4, 150.9, 131.9 (d, J = 3.3 Hz), 131.1, 131.0,115.5, 115.3, 113.6, 101.3, 88.3, 54.3, 50.7, 42.3, 38.3, 38.1, 34.8, 27.5,21.5, 12.3. HRMS (ESMS): C₂₄H₂₅BrFN₅NaO₄ (M + Na)⁺, calcd. 568.0966, found568.0970.

实施实例20：化合物11的制备

合成步骤同化合物3。¹H NMR (CDCl₃-d) δ 7.1 (dt, J = 9.5, 4.9 Hz, 2H), 6.9(t, J = 8.5 Hz, 2H), 6.6 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.3 (s, 1H), 4.9 (q, J = 7.5Hz, 1H), 4.7 (q, J = 8.8, 8.0 Hz, 1H), 3.8 (s, 3H), 3.3 (s, 2H), 3.1 (qd, J =13.5, 6.9 Hz, 2H), 2.4 (s, 3H), 2.2 (s, 1H), 2.1 (d, J = 13.5 Hz, 2H), 1.9 –1.8 (m, 1H), 1.7 (s, 1H), 1.6 – 1.4 (m, 2H). ¹³C NMR (CDCl₃-d) δ 174.9, 171.3,170.4, 162.6, 162.0 (d, J = 244.9 Hz), 158.9, 158.4, 142.6, 132.1 (d, J = 3.0Hz), 131.1, 131.1, 124.3, 115.5, 115.3, 101.4, 54.4, 53.3, 47.8, 42.4, 38.4,38.3, 34.1, 27.1, 21.5, 12.4. HRMS (ESMS): C₂₅H₂₈ClFN₄NaO₆ (M + Na)⁺, calcd.557.1574, found 557.1577.

实施实例21：化合物12的制备

合成步骤同化合物3。¹H NMR (CDCl₃-d) δ 7.2 (dd, J = 8.5, 5.5 Hz, 2H), 6.9(t, J = 8.6 Hz, 2H), 6.8 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 6.3 (s, 1H), 5.0 – 4.9 (m, 1H),4.7 (ddt, J = 12.5, 8.4, 4.7 Hz, 1H), 3.8 (s, 3H), 3.3 – 3.2 (m, 2H), 3.2 –3.0 (m, 2H), 2.4 (d, J = 0.9 Hz, 3H), 2.3 – 2.2 (m, 1H), 2.1 (ddd, J = 14.2,7.2, 4.8 Hz, 2H), 1.9 (dt, J = 8.8, 2.9 Hz, 1H), 1.8 – 1.7 (m, 1H), 1.6 – 1.5(m, 2H). ¹³C NMR (CDCl₃-d) δ 175.0, 171.3, 170.4, 162.5, 162.0 (d, J = 245.0Hz), 158.9, 158.4, 146.3, 132.1 (d, J = 3.1 Hz), 131.2, 131.1, 115.6, 115.6,115.3, 101.4, 54.4, 53.6, 50.5, 42.4, 38.4, 38.4, 33.8, 27.3, 21.6, 12.4.HRMS (ESMS): C₂₅H₂₈BrFN₄NaO₆ (M + Na)⁺, calcd. 601.1068, found 601.1070.

实施实例22：化合物13的制备

合成步骤同化合物3。¹H NMR (CDCl₃-d) δ 7.2 (ddd, J = 8.7, 5.4, 3.0 Hz, 2H),6.9 (t, J = 8.7 Hz, 2H), 6.7 (dd, J = 80.7, 8.0 Hz, 1H), 6.4 (d, J = 5.8 Hz,1H), 4.9 (dddd, J = 20.4, 14.9, 10.1, 5.5 Hz, 1H), 4.7 (d, J = 9.0 Hz, 1H),4.3 (pd, J = 7.2, 3.8 Hz, 2H), 3.4 – 3.2 (m, 2H), 3.1 (ddt, J = 33.9, 13.8,7.0 Hz, 2H), 2.4 (s, 3H), 2.2 (ddt, J = 28.9, 11.0, 6.3 Hz, 1H), 2.1 – 2.0(m, 2H), 1.9 – 1.8 (m, 1H), 1.7 – 1.7 (m, 1H), 1.7 – 1.4 (m, 2H), 1.3 (dt, J= 9.8, 7.1 Hz, 3H). ¹³C NMR (CDCl₃-d) δ 175.0, 171.2, 170.2, 162.0, 161.9 (d,J = 245.1 Hz), 158.8, 158.3, 142.0, 132.0 (d, J = 3.2 Hz), 131.1, 131.0,124.8, 115.5, 115.2, 101.3, 62.5, 54.3, 48.3, 42.3, 38.5, 38.2, 33.9, 27.5,21.5, 14.2, 12.3. HRMS (ESMS): C₂₆H₃₀ClFN₄NaO₆ (M + Na)⁺, calcd. 571.1730,found 571.1735.

实施实例23：化合物14的制备

合成步骤同化合物3。¹H NMR (CDCl₃-d) δ 7.1 (dd, J = 8.3, 5.4 Hz, 2H), 6.9(t, J = 8.4 Hz, 2H), 6.9 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.3 (s, 1H), 4.9 (q, J = 7.6Hz, 1H), 4.7 (dtd, J = 11.3, 7.5, 3.2 Hz, 1H), 4.3 (ddt, J = 10.8, 7.5, 3.5Hz, 2H), 3.3 (dq, J = 15.9, 11.0, 8.4 Hz, 2H), 3.1 (h, J = 7.2 Hz, 2H), 2.4(s, 3H), 2.3 – 2.1 (m, 1H), 2.1 (qd, J = 11.3, 9.1, 4.2 Hz, 2H), 1.8 (dq, J =14.0, 5.2, 4.8 Hz, 1H), 1.7 (s, 1H), 1.6 – 1.4 (m, 2H), 1.3 (q, J = 7.0, 5.4Hz, 3H). ¹³C NMR (CDCl₃-d) δ 174.9, 171.1, 170.3, 161.9, 161.9 (d, J = 245.0Hz), 158.8, 158.3, 145.6, 132.0 (d, J = 3.2 Hz), 131.0, 131.0, 116.1, 115.4,115.2, 101.3, 62.7, 54.3, 50.2, 42.3, 38.3, 38.1, 33.9, 26.9, 21.4, 14.2,12.3. HRMS (ESMS): C₂₆H₃₀BrFN₄NaO₆ (M + Na)⁺, calcd. 615.1225, found 615.1230.

实施实例24：化合物15的制备

4-2（100 mg，0.23 mmol）溶于干燥的DCM中，加入氰乙酸甲酯（27 mg，0.27 mmol），加入催化量的哌啶。室温下搅拌2 h，待反应完毕，依此用水，饱和柠檬酸，饱和NaHCO₃，饱和氯化钠洗涤有机相。合并的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤减压蒸除溶剂，得到的粗产物经快速色谱柱纯化（MeOH:DCM= 1:70），得到化合物15为白色泡沫状固体（65 mg, 产率55%）。¹HNMR (CDCl₃-d) δ 7.1 (t, J = 8.2 Hz, 3H), 6.9 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 6.3 (s,1H), 4.9 (q, J = 7.4 Hz, 1H), 4.7 (s, 1H), 3.9 (s, 3H), 3.3 – 3.2 (m, 2H),3.1 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.4 (s, 3H), 2.3 – 2.2 (m, 1H), 2.2 – 2.1 (m, 1H),2.1 (d, J = 13.7 Hz, 1H), 1.9 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 1.8 – 1.6 (m, 1H), 1.6 –1.4 (m, 2H). ¹³C NMR (CDCl₃-d) δ 174.7, 171.3, 170.7, 162.8, 161.9 (d, J =244.4 Hz), 161.3, 158.9, 158.2, 131.9 (d, J = 3.1 Hz), 131.0, 130.9, 115.5,115.3, 112.9, 108.9, 101.3, 54.2, 53.3, 49.4, 42.3, 38.3, 38.1, 34.6, 27.2,21.4, 12.3. HRMS (ESMS): C₂₆H₂₈FN₅NaO₆ (M + Na)⁺, calcd. 548.1916, found548.1920。

实施实例25：化合物16的制备

合成步骤同化合物15。¹H NMR (CDCl₃-d) δ 7.2 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.2 (dd, J= 8.3, 5.3 Hz, 2H), 7.0 (t, J = 8.6 Hz, 3H), 6.4 (s, 1H), 5.0 – 4.9 (m, 1H),4.8 (tdt, J = 9.2, 6.1, 3.7 Hz, 1H), 4.3 (ttd, J = 17.2, 9.4, 8.6, 5.1 Hz,2H), 3.4 – 3.2 (m, 2H), 3.1 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 2.5 (s, 3H), 2.4 (dq, J =11.1, 6.1 Hz, 1H), 2.3 – 2.2 (m, 1H), 2.1 (td, J = 8.3, 7.9, 4.0 Hz, 1H), 2.0– 1.8 (m, 1H), 1.8 – 1.6 (m, 1H), 1.6 – 1.4 (m, 2H), 1.4 (t, J = 7.1 Hz, 3H).¹³C NMR (CDCl₃-d) δ 174.7, 171.3, 170.7, 162.4, 162.0 (d, J = 244.9 Hz),160.9, 158.9, 158.3, 132.1 (d, J = 2.4 Hz), 131.1, 131.0, 115.6, 115.3,113.0, 109.4, 101.4, 62.8, 54.3, 49.5, 42.3, 38.4, 38.1, 34.7, 27.3, 21.6,14.1, 12.4. HRMS (ESMS): C₂₇H₃₀FN₅NaO₆ (M + Na)⁺, calcd. 562.2072, found562.2077.

实施实例26：化合物17的制备

合成步骤同化合物15。¹H NMR (CDCl₃-d) δ 7.2 (q, J = 7.9, 6.3 Hz, 2H), 6.9(q, J = 8.5 Hz, 2H), 6.5 – 6.2 (m, 2H), 4.9 (q, J = 7.8, 7.3 Hz, 1H), 4.8 –4.6 (m, 1H), 4.3 – 4.0 (m, 2H), 3.3 (d, J = 12.3 Hz, 2H), 3.1 (pd, J = 15.7,12.8, 7.0 Hz, 2H), 2.4 (s, 3H), 2.2 (dq, J = 11.1, 5.7 Hz, 1H), 2.2 – 1.9 (m,2H), 1.9 (d, J = 14.8 Hz, 1H), 1.8 – 1.6 (m, 3H), 1.6 – 1.3 (m, 2H), 1.0 (t,J = 7.2 Hz, 3H). ¹³C NMR (CDCl₃-d) δ 174.9, 171.3, 170.7, 162.4, 162.1 (d, J =244.9 Hz), 161.0, 159.0, 158.4, 132.0 (d, J = 3.1 Hz), 131.1, 131.1, 115.7,115.5, 113.1, 109.5, 101.4, 68.3, 54.3, 50.0, 42.4, 38.8, 38.2, 34.7, 27.8,22.0, 21.7, 12.4, 10.4. HRMS (ESMS): C₂₈H₃₂FN₅NaO₆ (M + Na)⁺, calcd. 576.2229,found 576.2232.

实施实例27：化合物18的制备

合成步骤同化合物15。¹H NMR (CDCl₃-d) δ 7.4 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 7.2 (dd, J= 8.7, 6.2 Hz, 2H), 7.1 – 6.9 (m, 2H), 6.4 (s, 1H), 5.2 – 5.0 (m, 1H), 4.9(dt, J = 8.8, 6.6 Hz, 1H), 4.7 (ddt, J = 12.5, 8.7, 4.3 Hz, 1H), 3.4 – 3.2(m, 2H), 3.1 (qd, J = 13.7, 5.6 Hz, 2H), 2.5 (s, 3H), 2.2 (dq, J = 10.9, 5.8Hz, 1H), 2.1 (dddd, J = 23.6, 13.6, 10.3, 5.4 Hz, 1H), 1.9 (q, J = 7.8, 5.7Hz, 2H), 1.7 (tdd, J = 18.5, 8.9, 5.3 Hz, 1H), 1.6 – 1.4 (m, 2H), 1.3 (dt, J= 9.2, 4.5 Hz, 6H). ¹³C NMR (CDCl₃-d) δ 174.9, 171.2, 170.6, 162.0, 162.0 (d,J = 245.2 Hz), 160.3, 158.8, 158.3, 131.9 (d, J = 3.3 Hz), 131.0, 131.0,115.6, 115.3, 113.0, 109.9, 101.3, 70.8, 54.2, 50.1, 42.3, 38.8, 38.0, 34.6,27.8, 21.7, 21.6, 12.3. HRMS (ESMS): C₂₈H₃₂FN₅NaO₆ (M + Na)⁺, calcd. 576.2229,found 576.2234.

实施实例28：化合物19的制备

合成步骤同化合物15。¹H NMR (CDCl₃-d) δ 7.2 – 7.0 (m, 3H), 6.9 (t, J = 8.5Hz, 2H), 6.3 (s, 1H), 4.9 (p, J = 7.4 Hz, 1H), 4.7 (ddt, J = 15.8, 8.4, 3.6Hz, 1H), 3.3 – 3.2 (m, 2H), 3.1 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 2.4 (s, 3H), 2.2 (dt, J= 17.2, 5.5 Hz, 1H), 2.2 – 2.1 (m, 1H), 2.0 (dd, J = 12.3, 6.1 Hz, 1H), 1.9 –1.8 (m, 1H), 1.7 (dt, J = 12.4, 5.6 Hz, 2H), 1.5 (s, 9H), 1.5 – 1.4 (m, 1H).¹³C NMR (CDCl₃-d) δ 174.7, 171.3, 170.7, 161.9 (d, J = 245.2 Hz), 161.2,159.6, 158.9, 158.3, 132.0 (d, J = 3.1 Hz), 131.1, 131.0, 115.6, 115.3,113.3, 110.9, 101.4, 84.0, 54.2, 49.3, 42.3, 38.3, 38.2, 34.7, 27.9, 27.2,21.5, 12.4. HRMS (ESMS): C₂₉H₃₄FN₅NaO₆ (M + Na)⁺, calcd. 590.2385, found590.2390.

实施实例29：化合物20的制备

合成步骤同化合物15。¹H NMR (CDCl₃-d) δ 7.2 (q, J = 6.1 Hz, 2H), 6.9 (q, J= 8.4, 6.6 Hz, 2H), 6.4 (m, 2H), 4.9 (p, J = 7.3 Hz, 2H), 3.3 (d, J = 8.5 Hz,2H), 3.2 – 3.0 (m, 2H), 2.4 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 2.3 (dt, J = 11.5, 5.4 Hz,1H), 2.1 (ddd, J = 13.7, 8.7, 4.6 Hz, 1H), 2.0 – 1.8 (m, 3H), 1.8 – 1.6 (m,1H), 1.6 – 1.5 (m, 1H).¹³C NMR (CDCl₃-d) δ 174.4, 171.2, 170.2, 162.3, 161.5(d, J = 254.0 Hz), 161.3, 159.3, 158.3, 132.0 (d, J = 3.1 Hz), 131.0, 130.9,115.6, 115.4, 113.1, 109.1, 101.3, 54.1, 48.5, 42.4, 37.9, 37.4, 33.6, 26.5,21.8, 12.4. HRMS (ESMS): C₂₅H₂₆FN₅NaO₆ (M + Na)⁺, calcd. 534.1759, found534.1760.

实施实例30：化合物21的制备

合成步骤同化合物15。¹H NMR (CDCl₃-d) δ 7.2 (ddd, J = 31.4, 8.4, 5.5 Hz,2H), 7.0 (dd, J = 9.9, 7.5 Hz, 2H), 6.4 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 6.3 (s, 1H), 5.4(d, J = 9.4 Hz, 1H), 5.0 (q, J = 7.2 Hz, 1H), 4.3 – 3.5 (m, 6H), 3.3 – 3.2(m, 2H), 3.2 – 3.1 (m, 2H), 2.6 (dd, J = 14.4, 5.7 Hz, 1H), 2.5 (s, 3H), 2.3(dd, J = 10.8, 5.6 Hz, 1H), 2.1 (s, 1H), 1.8 (td, J = 10.8, 10.0, 4.2 Hz,2H), 1.7 – 1.6 (m, 1H), 1.6 – 1.4 (m, 1H). ¹³C NMR (CDCl₃-d) δ 174.6, 171.2,170.2, 168.6, 168.3, 161.9 (d, J = 245.0 Hz), 159.1, 158.3, 150.1, 135.4,132.0 (d, J = 3.1 Hz), 131.1, 131.0, 115.6, 115.4, 114.3, 101.4, 54.6, 52.8,51.3, 42.5, 39.8, 37.7, 37.7, 26.4, 21.5, 12.4. HRMS (ESMS): C₂₇H₃₁FN₄NaO₈ (M +Na)⁺, calcd. 581.2018, found 581.2020.

实施实例31：化合物22的制备

合成步骤同化合物15。¹H NMR (CDCl₃-d) ¹H NMR (CDCl₃-d) δ 7.2 – 7.1 (m, 2H),7.0 (ddt, J = 8.8, 6.2, 3.5 Hz, 2H), 6.4 (td, J = 8.5, 7.7, 3.8 Hz, 2H), 4.9(s, 1H), 4.7 (s, 1H), 3.9 – 3.7 (m, 3H), 3.3 – 3.2 (m, 2H), 3.1 (dtt, J =34.3, 13.7, 6.9 Hz, 2H), 2.5 (d, J = 15.1 Hz, 3H), 2.4 – 2.1 (m, 3H), 2.0 (d,J = 12.1 Hz, 2H), 1.8 (d, J = 16.2 Hz, 2H), 1.8 – 1.6 (m, 1H), 1.6 – 1.4 (m,2H). ¹³C NMR (CDCl₃-d) δ 195.3, 175.0, 171.1, 170.3, 166.0, 161.9 (d, J =245.0 Hz), 158.7, 158.3, 148.6, 135.3, 132.0 (d, J = 3.1 Hz), 131.1, 131.0,115.4, 115.2, 101.3, 68.0, 54.2, 52.4, 48.0, 42.3, 38.5, 38.1, 35.0, 27.6,21.5, 12.3. HRMS (ESMS): C₂₇H₃₁FN₄NaO₇ (M + Na)⁺, calcd. 565.2069, found565.2072.

实施实例32：化合物23的制备

合成步骤同化合物15。¹H NMR (CDCl₃-d) δ 7.2 (dd, J = 8.4, 5.4 Hz, 2H), 7.0– 6.9 (m, 2H), 6.4 (s, 1H), 6.1 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 5.0 – 4.9 (m, 1H), 4.4 –4.2 (m, 1H), 3.3 (dd, J = 10.7, 4.5 Hz, 2H), 3.1 (qd, J = 13.7, 6.3 Hz, 2H),2.4 (d, J = 2.9 Hz, 6H), 2.3 (s, 3H), 2.1 (dt, J = 11.6, 6.1 Hz, 1H), 2.1 –2.0 (m, 1H), 2.0 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 1.9 (dt, J = 13.5, 4.4 Hz, 1H), 1.7(dd, J = 15.2, 8.7 Hz, 1H), 1.6 – 1.5 (m, 2H). ¹³C NMR (CDCl₃-d) δ 203.8,197.4, 175.5, 171.3, 170.6, 162.0 (d, J = 245.7 Hz), 159.0, 158.4, 145.8,144.1, 132.1 (d, J = 3.3 Hz), 131.2, 131.1, 115.5, 115.3, 101.4, 54.1, 48.7,42.4, 38.8, 38.0, 35.1, 31.4, 27.8, 26.2, 21.6, 12.4. HRMS (ESMS):C₂₇H₃₁FN₄NaO₆ (M + Na)⁺, calcd. 549.2120, found 549.2125.

实施实例33：化合物24的制备

合成步骤同化合物15。¹H NMR (CDCl₃-d) δ 7.2 – 7.1 (m, 2H), 7.0 – 6.9 (m,2H), 6.8 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.3 (s, 1H), 5.0 – 4.9 (m, 1H), 4.8 (dtd, J =11.9, 9.2, 8.3, 4.0 Hz, 1H), 3.3 – 3.2 (m, 2H), 3.2 – 3.1 (m, 5H), 2.4 (d, J= 2.4 Hz, 3H), 2.2 (dd, J = 9.2, 4.5 Hz, 1H), 2.2 – 2.1 (m, 1H), 2.1 – 2.0(m, 1H), 1.8 (dd, J = 11.5, 6.1 Hz, 1H), 1.7 – 1.6 (m, 1H), 1.5 (d, J = 9.3Hz, 11H). ¹³C NMR (CDCl₃-d) δ 174.6, 171.2, 170.5, 164.8, 161.9 (d, J = 245.1Hz), 158.8, 158.3, 157.3, 152.2, 132.0 (d, J = 2.7 Hz), 131.1, 131.0, 115.5,115.3, 114.7, 113.4, 101.3, 85.2, 54.3, 48.9, 42.2, 38.2, 38.1, 34.8, 32.7,27.8, 26.9, 21.4, 12.3. HRMS (ESMS): C₃₁H₃₇FN₆NaO₇ (M + Na)⁺, calcd. 674.2600,found 674.2605.

实施实例34：化合物25的制备

24（100 mg, 0.16 mmol）溶于干燥的DCM（5 mL）中。0℃下，逐滴加入三氟乙酸（1.0mL），室温下搅拌2.0h。待反应完毕，减压蒸馏除去溶剂，残渣溶于DCM中，调pH = 7.0，依此用水，饱和柠檬酸，饱和NaHCO₃，饱和氯化钠洗涤有机相。合并的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤减压蒸除溶剂，得到的粗产物经快速色谱柱纯化（MeOH:DCM= 1:50），得到化合物25为白色泡沫状固体（30 mg, 产率35%）。¹H NMR (CDCl₃-d) δ 7.3 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.2– 7.1 (m, 2H), 7.0 – 6.9 (m, 2H), 6.4 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 5.0 – 4.8 (m, 1H),4.8 – 4.7 (m, 1H), 3.3 (q, J = 5.7, 4.9 Hz, 2H), 3.1 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 2.9(d, J = 4.8 Hz, 3H), 2.4 (s, 3H), 2.3 (dq, J = 11.7, 6.5, 5.9 Hz, 1H), 2.2(ddd, J = 14.1, 11.6, 5.4 Hz, 1H), 2.0 (s, 1H), 1.9 (ddd, J = 14.2, 8.1, 4.2Hz, 1H), 1.8 – 1.7 (m, 1H), 1.6 – 1.6 (m, 1H), 1.5 (dq, J = 14.2, 5.2, 4.2Hz, 1H). ¹³C NMR (CDCl₃-d) δ 174.9, 171.3, 170.7, 162.0 (d, J = 245.1 Hz),159.8, 159.0, 158.4, 158.2, 132.1 (d, J = 3.2 Hz), 131.1, 131.0, 115.6,115.4, 114.6, 110.5, 101.5, 54.5, 49.4, 42.4, 38.4, 37.9, 35.0, 27.4, 27.2,21.6, 12.4. HRMS (ESMS): C₂₆H₂₉FN₆NaO₅ (M + Na)⁺, calcd. 547.2076, found547.2078.

实施实例35：化合物26的制备

合成步骤同化合物15。¹H NMR (CDCl₃-d) δ 7.2 – 7.1 (m, 2H), 7.0 – 6.9 (m,2H), 6.8 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.3 (s, 1H), 5.0 – 4.8 (m, 1H), 4.8 (s, 1H),3.8 – 3.7 (m, 2H), 3.3 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 3.1 (dd, J = 19.0, 6.4 Hz, 2H),2.4 (d, J = 2.5 Hz, 3H), 2.2 (dt, J = 12.7, 4.4 Hz, 1H), 2.2 – 2.1 (m, 1H),2.1 – 2.0 (m, 1H), 1.9 – 1.8 (m, 1H), 1.7 (s, 1H), 1.6 – 1.5 (m, 11H), 1.2 –1.1 (m, 3H). ¹³C NMR (CDCl₃-d) δ 174.7, 171.2, 170.5, 164.5, 162.0 (d, J =244.9 Hz), 158.9, 158.4, 157.2, 152.1, 132.1 (d, J = 3.3 Hz), 131.2, 131.1,115.6, 115.4, 115.0, 113.5, 101.4, 84.9, 54.4, 49.0, 42.3, 41.4, 38.3, 38.2,34.9, 28.0, 27.1, 21.5, 13.9, 12.4. HRMS (ESMS): C₃₂H₃₉FN₆NaO₇ (M + Na)⁺,calcd. 661.2756, found 661.2760.

实施实例36：化合物27的制备

合成步骤同化合物25。¹H NMR (CDCl₃-d) δ 7.2 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.2 (ddd,J = 13.7, 9.7, 5.3 Hz, 2H), 7.0 (td, J = 8.5, 6.3 Hz, 2H), 6.4 (s, 1H), 4.9(dq, J = 15.1, 7.4 Hz, 1H), 4.8 – 4.6 (m, 1H), 3.5 – 3.1 (m, 6H), 2.5 (s,3H), 2.2 (s, 2H), 2.0 (s, 1H), 1.9 (dd, J = 17.1, 7.5 Hz, 1H), 1.8 – 1.7 (m,1H), 1.7 – 1.4 (m, 2H), 1.2 (td, J = 7.2, 2.1 Hz, 3H). ¹³C NMR (CDCl₃-d) δ174.8, 171.2, 170.6, 161.9 (d, J = 245.1 Hz), 160.2, 158.8, 158.3, 158.2,132.0 (d, J = 3.0 Hz), 131.0, 130.9, 115.5, 115.3, 114.5, 110.6, 101.4, 54.4,49.4, 42.4, 42.3, 38.3, 37.9, 35.4, 27.4, 21.5, 14.5, 12.3. HRMS (ESMS):C₂₇H₃₁FN₆NaO₅ (M + Na)⁺, calcd. 561.2232, found 561.2234.

实施实例37：化合物28的制备

合成步骤同化合物15。¹H NMR (CDCl₃-d) δ 7.2 – 7.1 (m, 2H), 7.0 – 6.9 (m,2H), 6.8 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.3 (s, 1H), 4.9 (tt, J = 15.1, 6.9 Hz, 1H),4.8 – 4.6 (m, 1H), 3.7 – 3.6 (m, 2H), 3.3 – 3.2 (m, 2H), 3.2 – 3.0 (m, 2H),2.4 (s, 3H), 2.3 – 2.2 (m, 1H), 2.2 – 2.1 (m, 1H), 2.1 (s, 1H), 1.9 (d, J =14.7 Hz, 1H), 1.6 – 1.4 (m, 14H), 0.9 – 0.9 (m, 3H). ¹³C NMR (CDCl₃-d) δ174.8, 171.2, 170.5, 164.6, 162.0 (d, J = 244.6 Hz), 158.9, 158.4, 157.2,152.4, 132.1 (d, J = 3.4 Hz), 131.2, 131.1, 115.6, 115.4, 115.0, 113.5,101.4, 84.9, 54.4, 49.0, 47.8, 42.3, 38.3, 38.2, 34.9, 27.9, 27.1, 22.0,21.5, 12.4, 11.3. HRMS (ESMS): C₃₃H₄₁FN₆NaO₇ (M + Na)⁺, calcd. 675.2913, found675.2915.

实施实例38：化合物29的制备

合成步骤同化合物25。¹H NMR (CDCl₃-d) δ 7.4 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.2 – 7.1(m, 2H), 6.9 (dtd, J = 8.6, 6.2, 3.1 Hz, 2H), 6.3 (s, 0H), 5.0 – 4.7 (m, 1H),3.3 – 3.1 (m, 6H), 2.4 (s, 2H), 2.2 (ddd, J = 15.7, 11.3, 5.5 Hz, 1H), 2.0(ddd, J = 14.4, 8.2, 4.3 Hz, 1H), 1.9 – 1.8 (m, 2H), 1.7 – 1.5 (m, 5H), 1.0 –0.9 (m, 2H). ¹³C NMR (CDCl₃-d) δ 174.4, 171.2, 170.2, 161.9 (d, J = 244.7 Hz),159.3, 159.0, 158.3, 158.0, 132.2 (d, J = 3.1 Hz), 130.9, 130.9, 115.5,115.3, 101.4, 54.2, 48.4, 42.4, 42.2, 37.8, 37.4, 34.0, 26.6, 22.5, 21.8,12.3, 11.3. HRMS (ESMS): C₂₈H₃₃FN₆NaO₅ (M + Na)⁺, calcd. 575.2389, found575.2394.

实施实例39：化合物30的制备

合成步骤同化合物15。¹H NMR (CDCl₃-d) δ 7.2 – 7.1 (m, 2H), 6.9 (t, J = 8.5Hz, 2H), 6.5 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 6.4 (s, 1H), 4.9 (p, J = 6.9 Hz, 1H), 4.6(ddt, J = 12.9, 8.9, 4.0 Hz, 1H), 3.3 – 3.2 (m, 2H), 3.1 (d, J = 6.3 Hz, 2H),3.1 (s, 3H), 3.0 (d, J = 7.4 Hz, 3H), 2.4 (s, 3H), 2.2 (dt, J = 12.9, 6.5 Hz,1H), 2.2 – 2.1 (m, 1H), 2.0 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 1.9 – 1.8 (m, 1H), 1.7 –1.6 (m, 1H), 1.5 (t, J = 12.2 Hz, 2H). ¹³C NMR (CDCl₃-d) δ 175.1, 171.3,170.6, 162.5, 162.0 (d, J = 245.2 Hz), 158.9, 158.3, 156.0, 132.0 (d, J = 3.1Hz), 131.1, 131.0, 115.5, 115.3, 113.6, 112.4, 101.4, 54.1, 50.2, 42.4, 38.9,38.7, 37.9, 36.0, 34.7, 27.8, 21.5, 12.4. HRMS (ESMS): C₂₇H₃₁FN₆NaO₅ (M + Na)⁺,calcd. 561.2232, found 561.2235.

实施实例40：化合物31的制备

合成步骤同化合物3。¹H NMR (CDCl₃-d) δ 7.2 – 7.1 (m, 2H), 7.0 (d, J = 8.5Hz, 1H), 7.0 – 6.9 (m, 2H), 6.4 (s, 1H), 5.0 – 4.8 (m, 1H), 4.8 – 4.5 (m,1H), 3.3 (dq, J = 14.6, 9.6, 7.5 Hz, 2H), 3.1 (qt, J = 13.9, 6.2 Hz, 2H), 2.5– 2.4 (m, 6H), 2.3 (dt, J = 10.7, 4.4 Hz, 1H), 2.1 – 2.0 (m, 2H), 1.9 (qd, J= 8.9, 4.7 Hz, 1H), 1.7 – 1.7 (m, 1H), 1.5 (ddt, J = 29.9, 14.3, 3.7 Hz, 2H).¹³C NMR (CDCl₃-d)δ 190.4, 174.9, 171.4, 170.8, 162.0 (d, J = 245.3 Hz), 160.6,159.0, 158.3, 132.0 (d, J = 3.1 Hz), 131.1, 131.1, 116.4, 115.7, 115.4,114.3, 101.4, 54.3, 50.1, 42.4, 38.7, 38.0, 34.7, 27.7, 27.6, 21.6, 12.5.HRMS (ESMS): C₂₆H₂₈FN₅NaO₅ (M + Na)⁺, calcd. 532.1967, found 532.1970.

实施实例41：化合物32的制备

合成步骤同化合物3。¹H NMR (CDCl₃-d) δ 7.1 (ddd, J = 8.8, 5.4, 3.1 Hz, 2H),6.9 (td, J = 8.6, 3.1 Hz, 2H), 6.7 (dd, J = 10.6, 5.5 Hz, 1H), 6.4 – 6.3 (m,1H), 5.0 – 4.7 (m, 2H), 3.3 – 3.2 (m, 2H), 3.1 (dt, J = 16.9, 7.5 Hz, 2H),3.1 (d, J = 2.5 Hz, 3H), 2.4 (s, 3H), 2.4 – 2.2 (m, 3H), 2.2 – 2.0 (m, 1H),1.9 – 1.8 (m, 1H), 1.8 – 1.6 (m, 1H), 1.5 (td, J = 12.6, 3.4 Hz, 1H). ¹³C NMR(CDCl₃-d) δ 175.9, 171.3, 170.0, 162.0 (d, J = 244.9 Hz), 159.0, 158.2,144.4, 131.6 (d, J = 3.0 Hz), 131.0, 130.9, 115.6, 115.4, 114.1, 101.4, 96.8,55.8, 55.3, 42.3, 40.6, 37.8, 37.4, 31.7, 27.9, 21.9, 12.3. HRMS (ESMS):C₂₅H₂₈FN₅NaO₆S (M + Na)⁺, calcd. 568.1637, found 568.1640.

实施实例42：化合物33的制备

合成步骤同化合物3。¹H NMR (CDCl₃-d) δ 7.2 (ddd, J = 8.5, 5.5, 2.9 Hz, 2H),7.0 (dt, J = 12.0, 8.4 Hz, 2H), 6.8 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.3 (s, 1H), 4.9 –4.8 (m, 1H), 4.7 – 4.6 (m, 1H), 3.3 (tq, J = 12.3, 7.4, 5.3 Hz, 2H), 3.2 –3.0 (m, 2H), 2.5 (s, 3H), 2.3 – 2.1 (m, 2H), 2.1 – 2.0 (m, 1H), 1.9 (dt, J =13.6, 5.0 Hz, 1H), 1.8 – 1.6 (m, 1H), 1.5 (dddd, J = 25.3, 17.2, 13.3, 7.4Hz, 2H). ¹³C NMR (CDCl₃-d) δ 174.5, 171.4, 171.1, 168.0, 161.9 (d, J = 245.7Hz), 159.0, 158.1, 131.9 (d, J = 3.1 Hz), 131.0, 131.0, 115.5, 115.3, 111.7,110.1, 101.3, 89.6, 54.2, 49.9, 42.2, 38.2, 37.7, 34.1, 27.3, 21.4, 12.3.HRMS (ESMS): C₂₅H₂₅FN₆NaO₄ (M + Na)⁺, calcd. 515.1814, found 515.1818.

实施实例43：化合物34的制备

合成步骤同化合物3。¹H NMR (CDCl₃-d) δ 7.5 – 7.4 (m, 2H), 7.4 – 7.3 (m,3H), 7.1 (dd, J = 8.4, 5.4 Hz, 2H), 6.8 (td, J = 8.6, 1.8 Hz, 2H), 6.3 (s,1H), 6.2 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 5.0 – 4.9 (m, 1H), 4.9 (dddd, J = 12.5, 10.2,6.1, 3.7 Hz, 1H), 3.3 (dq, J = 8.1, 4.7, 3.7 Hz, 2H), 3.1 (qd, J = 13.6, 6.9Hz, 2H), 2.4 (s, 3H), 2.3 – 2.2 (m, 2H), 2.1 (ddt, J = 11.6, 6.1, 2.8 Hz,1H), 1.9 (dt, J = 13.1, 4.2 Hz, 1H), 1.7 (dddd, J = 19.2, 14.2, 8.8, 3.1 Hz,1H), 1.6 (dq, J = 10.5, 4.6, 3.2 Hz, 2H). ¹³C NMR (CDCl₃-d) δ 175.0, 171.3,170.4, 161.9 (d, J = 245.1 Hz), 158.9, 158.4, 146.1, 132.4, 132.1 (d, J = 3.1Hz), 131.2, 131.1, 129.5, 129.1, 125.9, 116.0, 115.8, 115.4, 115.2, 101.4,54.2, 49.7, 42.4, 38.3, 35.7, 27.0, 21.6, 12.4. HRMS (ESMS): C₃₀H₃₀FN₅NaO₄ (M +Na)⁺, calcd. 566.2174, found 566.2178.

实施实例44：化合物35的制备

合成步骤同化合物3。¹H NMR (CDCl₃-d) δ 8.2 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.7 (d, J =8.8 Hz, 2H), 7.2 – 7.1 (m, 2H), 6.9 (t, J = 8.5 Hz, 2H), 6.3 (d, J = 4.5 Hz,2H), 5.0 (td, J = 8.3, 7.6, 5.1 Hz, 1H), 4.9 (dt, J = 8.7, 6.7 Hz, 1H), 3.3(dt, J = 7.5, 3.4 Hz, 2H), 3.1 (d, J = 6.7 Hz, 2H), 2.4 (s, 3H), 2.4 – 2.3(m, 1H), 2.2 (ddd, J = 13.3, 8.6, 4.2 Hz, 1H), 1.9 (tdd, J = 16.4, 8.7, 4.7Hz, 2H), 1.8 – 1.5 (m, 3H). ¹³C NMR (CDCl₃-d) δ 174.7, 171.5, 170.1, 162.0 (d,J = 245.3 Hz), 159.3, 158.3, 149.9, 148.2, 138.5, 132.1 (d, J = 3.1 Hz),131.1, 131.0, 126.9, 124.3, 115.6, 115.4, 115.1, 114.6, 101.4, 54.3, 49.5,42.5, 38.1, 37.6, 34.5, 26.8, 21.9, 12.4. HRMS (ESMS): C₃₀H₂₉FN₆NaO₆ (M + Na)⁺,calcd. 611.2025, found 611.2030.

实施实例45：化合物36的制备

合成步骤同化合物3。¹H NMR (CDCl₃-d) δ 8.6 (dd, J = 9.7, 5.5 Hz, 1H), 7.7(td, J = 7.8, 1.8 Hz, 1H), 7.5 (dd, J = 11.9, 8.2 Hz, 2H), 7.3 – 7.2 (m, 1H),7.2 – 7.0 (m, 3H), 6.8 (t, J = 8.4 Hz, 1H), 6.3 (s, 1H), 4.9 (q, J = 7.3 Hz,1H), 4.9 – 4.7 (m, 1H), 3.2 (dt, J = 15.8, 7.6 Hz, 2H), 3.1 – 2.9 (m, 2H),2.4 (s, 3H), 2.2 (td, J = 11.2, 6.4 Hz, 2H), 2.1 – 2.0 (m, 1H), 1.8 (dt, J =13.6, 4.2 Hz, 1H), 1.7 – 1.6 (m, 1H), 1.6 – 1.4 (m, 2H). ¹³C NMR (CDCl₃-d)174.9, 171.2, 170.4, 161.9 (d, J = 245.0 Hz), 158.9, 158.4, 150.1, 149.8,137.4, 132.0 (d, J = 2.9 Hz), 131.2, 131.1, 124.0, 121.2, 115.5, 115.5,115.3, 101.4, 54.3, 49.7, 42.4, 38.4, 38.3, 35.5, 27.2, 21.6, 12.4. HRMS(ESMS): C₂₉H₂₉FN₆NaO₄ (M + Na)⁺, calcd. 567.2127, found 567.2130.

实施实例46：化合物37的制备

合成步骤同化合物3。¹H NMR (CDCl₃-d) δ 7.5 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 7.4 – 7.3(m, 1H), 7.1 (t, J = 5.6 Hz, 3H), 6.8 (t, J = 8.5 Hz, 2H), 6.3 (s, 1H), 6.1(d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.0 (q, J = 7.4 Hz, 1H), 4.8 (dp, J = 12.5, 5.1, 4.3 Hz,1H), 3.3 (dd, J = 9.9, 4.9 Hz, 2H), 3.1 (qd, J = 13.7, 6.9 Hz, 2H), 2.4 (s,3H), 2.2 (tt, J = 17.6, 8.8 Hz, 2H), 2.1 – 2.0 (m, 1H), 1.9 (dq, J = 13.4,5.2, 4.3 Hz, 1H), 1.8 – 1.7 (m, 1H), 1.6 (ddt, J = 14.4, 10.5, 5.3 Hz, 2H).¹³C NMR (CDCl₃-d) δ 174.9, 171.2, 170.2, 161.8 (d, J = 245.1 Hz), 158.8,158.3, 146.5, 144.0, 134.5, 132.1 (d, J = 3.1 Hz), 131.1, 131.0, 127.4,124.0, 115.7, 115.3, 115.1, 111.2, 101.3, 54.2, 49.4, 42.3, 38.3, 38.2, 35.7,27.0, 21.5, 12.3. HRMS (ESMS): C₂₈H₂₈FN₅NaO₄S (M + Na)⁺, calcd. 572.1738, found572.1743.

实施实例47：化合物38的制备

合成步骤同化合物3。δ 7.5 – 7.4 (m, 1H), 7.3 – 7.3 (m, 1H), 7.2 – 7.1 (m,3H), 6.9 (t, J = 8.5 Hz, 2H), 6.5 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.4 (s, 1H), 4.9 (p, J= 7.7 Hz, 1H), 4.7 (q, J = 7.9, 6.5 Hz, 1H), 3.3 (ddt, J = 15.7, 11.3, 5.1Hz, 2H), 3.1 (q, J = 10.1, 7.8 Hz, 2H), 2.4 (s, 3H), 2.3 (td, J = 21.5, 18.9,11.0 Hz, 2H), 2.0 – 1.9 (m, 1H), 1.9 (q, J = 8.8, 5.4 Hz, 1H), 1.8 – 1.6 (m,1H), 1.6 – 1.5 (m, 2H). ¹³C NMR (CDCl₃-d) δ 175.0, 171.4, 170.4, 161.9 (d, J =244.6 Hz), 158.9, 158.3, 144.7, 134.7, 132.3 (d, J = 2.8 Hz), 131.2, 131.1,127.3, 124.2, 124.0, 115.9, 115.5, 115.3, 111.1, 101.4, 54.5, 49.8, 42.5,38.6, 38.1, 35.9, 27.3, 21.5, 12.4. HRMS (ESMS): C₂₈H₂₈FN₅NaO₄S (M + Na)⁺,calcd. 572.1738, found 572.1740.

实施实例48：化合物39的制备

合成步骤同化合物3。¹H NMR (CDCl₃-d) δ 8.0 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.9 – 7.8(m, 3H), 7.5 (ddt, J = 8.5, 6.0, 3.1 Hz, 3H), 7.1 (dd, J = 8.5, 5.4 Hz, 2H),6.8 (td, J = 8.7, 2.2 Hz, 2H), 6.4 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.3 (s, 1H), 5.0 (q,J = 7.4 Hz, 1H), 4.9 (qd, J = 8.6, 7.1, 3.1 Hz, 1H), 3.3 (dp, J = 11.4, 3.7,3.1 Hz, 2H), 3.1 (qd, J = 13.7, 6.9 Hz, 2H), 2.4 (d, J = 3.5 Hz, 3H), 2.3(ddt, J = 17.3, 11.6, 5.4 Hz, 2H), 2.2 – 2.1 (m, 1H), 1.9 (tt, J = 7.4, 3.8Hz, 1H), 1.7 – 1.5 (m, 3H). ¹³C NMR (CDCl₃-d) δ 175.0, 171.3, 170.4, 161.8 (d,J = 245.0 Hz), 158.9, 158.4, 146.1, 133.6, 133.2, 132.2 (d, J = 2.9 Hz),131.2, 131.1, 129.6, 128.9, 128.5, 127.8, 127.2, 127.0, 126.2, 122.3, 116.1,115.9, 115.4, 115.2, 101.4, 54.3, 49.8, 42.4, 38.3, 38.3, 35.8, 27.0, 21.6,12.4. HRMS (ESMS): C₃₄H₃₂FN₅NaO₄ (M + Na)⁺, calcd. 616.2331, found 616.2334.

实施实例49：化合物40的制备

合成步骤同化合物3。¹H NMR (CDCl₃-d) ¹H NMR (CDCl₃-d) δ 7.7 (d, J = 8.3 Hz,2H), 7.6 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.2 (dd, J = 8.5, 5.4 Hz, 2H), 6.9 (t, J = 8.6Hz, 2H), 6.4 (s, 2H), 5.0 – 4.9 (m, 1H), 4.9 – 4.7 (m, 1H), 3.3 (dd, J =10.8, 4.1 Hz, 2H), 3.2 – 3.1 (m, 2H), 2.4 (d, J = 1.4 Hz, 3H), 2.3 (dq, J =13.1, 5.6 Hz, 1H), 2.1 (s, 2H), 1.9 – 1.8 (m, 1H), 1.7 (dd, J = 14.5, 7.2 Hz,1H), 1.6 (ddd, J = 14.1, 5.6, 2.8 Hz, 2H). ¹³C NMR (CDCl₃-d) δ 175.0, 171.2,170.4, 161.8 (d, J = 245.3 Hz), 158.9, 158.3, 148.6, 135.8, 132.0 (d, J = 3.2Hz), 131.4 (d, J = 32.9 Hz), 131.1, 131.0, 129.2, 126.2, 126.0, 126.0, 123.7(q, J = 272.2 Hz), 115.6, 115.4, 115.2, 114.9, 101.3, 54.2, 50.3, 42.3, 38.5,37.9, 35.4, 27.4, 21.5, 12.3. HRMS (ESMS): C₃₁H₂₉F₄N₅NaO₄ (M + Na)⁺, calcd.634.2048, found 634.2050.

实施实例50：抑制剂对体外EV71 3C蛋白酶抑制活性（K_i）的测定

EV71 3C蛋白酶自主表达纯化，活性经实验鉴定。所用的荧光底物基于荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）技术设计合成：NMA-IEALFQGPPK(DNP)FR。所用的缓冲液为50 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，1 mM乙二胺四乙酸二钠盐，pH =7.0。小分子抑制剂设置八个终浓度，以1.5倍稀释。同时设阴性对照和阳性对照。100 µL反应体系包括：80 µL Buffer，10 µL EV71 3C蛋白，5 µL荧光底物，5 µL不同浓度的抑制剂。30°C下，通过酶标仪检测荧光强度，所得数据利用软件GraphPad Prism 7.0处理得到抑制剂的K_i*。

实施实例51：抑制剂体外抗病毒活性（EC₅₀）的测试

用来定量检测化合物抑制效果的病毒为带萤火虫荧光素酶Luciferase报告基因的EV71 病毒，简称为EV71-FY-Luc 病毒。所用细胞为人横纹肌肉瘤细胞（rhabdomyosarcomacell, RD cell）。实验所用培养基为：90% DMEM（Dulbecco's modified eagle medium）培养基+10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）+ 1%青霉素和链霉素（Penicillin-Streptomycin, PS）。RD细胞接种于96孔板中，于37 °C 5% CO₂孵育24小时，抑制剂分别稀释成200 µM、66.67 µM、22.22 µM、7.40 µM、2.46 µM、0.82 µM、0.28 µM、0.092 µM和0.03 µM的工作液，将细胞上清液吸走，加入50 µL抑制剂工作液到上述96孔板中，相同条件下继续孵育，同时设置病毒和细胞对照组。孵育4 h后，加入50 µL的EV71-FY-Luc，继续孵育24小时。吸走上清，用Bright-Glo™ Luciferase Assay System试剂（Promega）进行检测，每孔加入100 µL稀释后的底物，室温避光孵育5分钟，充分裂解细胞，酶标仪读数，所得数据利用软件GraphPad Prism 7.0处理得到抑制剂的EC₅₀。

实施实例52：抑制剂体外细胞毒性(CC₅₀)测试方法

RD细胞接种在96孔板中，于37 °C 5% CO₂孵育箱里孵育24小时。待测抑制剂分别稀释成100 µM、33.33 µM、11.11 µM、3.70 µM、1.23 µM、0.41 µM、0.14 µM、0.046 µM和0.015 µM的工作液。将96孔板中的细胞上清吸走，每孔加入100 µL不同浓度的抑制剂工作液，每个浓度重复3次，同时设置细胞对照组，37 °C 5% CO₂培养24 小时。用WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（Roche）检测抑制剂的细胞毒性，每孔加入10 µL WST-1进行活细胞染色，1小时后在酶标仪490 nM下读取荧光值，数据用GraphPad Prism 7.0进行分析。

Claims

1.一种新型的肠病毒71（EV71）3C蛋白酶抑制剂，具有结构通式M的化合物或其各种光学异构体、药物活性的代谢物、可药用盐、溶剂化物或其前药：

（M）

R₂表示:烷基，环烷基，杂烷基，杂环烷基，杂环基，链烯基，环烯基，杂烯基，杂环烯基，链炔基，环炔基，杂炔基，环杂炔基，芳基，杂芳基，芳基C1-8烷基，杂芳基C1-9烷基，芳基C2-6烯基，杂芳基C2-6烯基，芳基C2-6炔基，杂芳基C2-6炔基。以上所述芳基是苯基或萘基，杂芳基是通过环碳原子或氮原子连接的具有1, 2或3个选自N, O, S的杂原子的五元或六元芳环，且杂环基是通过环碳原子或氮原子连接的具有1, 2，3或4个选自N, O, S的杂原子的饱和或不饱和的非芳香性环，其中芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，烷基，环烷氧基，烷氧基任选可被1到4个取代基所取代，所述1到4个取代基选自卤素，-OH，-SH，-NO₂，-CN，苯基，卤C1-8烷基，C1-8烷氧基，C1-6烷基羰基，C1-6烷硫基，C1-8烷氧羰基，-CF₃。以上所述环烷基，环烷氧基，芳基，杂芳基或杂环基上的两个相邻取代基任选地一起形成0-3个含有O, N, S的杂原子的3-6元环：

X表示:-H，烷基，卤素，-CN,酯键，酰胺键，羰基，芳基，杂芳基；

Y表示:-H，烷基，卤素，-CN,酯键，酰胺键，羰基，芳基，杂芳基；

2.根据权利要求1所述的化合物在制备治疗肠病毒71（EV71）感染疾病药物的应用，其中所述的化合物包括以下实例但不局限于此。

3.如权利要求1所述的化合物、药物活性的代谢物、可药用盐、溶剂化物、前药或其光学异构体，双键*所示立体化学异构可以是E或Z。

4.根据权利要求1所述的化合物在制备治疗肠病毒感染疾病药物的应用，其中所述的肠病毒包括以下实例但不局限于此：脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒A、柯萨奇病毒B、肠病毒71（EV71）、埃可病毒。

5.根据权利要求1所述的化合物在制备治疗冠状病毒感染疾病药物的应用，其中所述的冠状病毒包括以下实例但不局限于此：SARS病毒、中东呼吸综合症冠状病毒（MERS-CoV）。

6.根据权利要求1所述的化合物在制备治疗半胱氨酸蛋白酶诱发疾病药物的应用，其中所述的疾病包括以下实例但不局限于此：手足口病、小儿麻痹症、普通感冒。

7.一种药物组合物，其包括有效量的权利要求1-6中任何一项所述的化合物及其在药物上可接受的盐，在制备治疗肠病毒71（EV71）感染疾病抗病毒药物的应用。

8.按照权利要求7的药物组合物，其用于制造供治疗哺乳动物的EV71病毒感染的药品。