KR20080057228A - 발색단 모이어티를 포함하는 산화된 인지질 및 항아테롬성활성을 가진 효소의 존재 결정을 위한 이의 용도 - Google Patents
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-
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Abstract
본 발명은 일반식 (I) 또는 (II) 중 하나로 표시되는 산화된 인지질에 관한 것이다.
상기 식에서,
A는 O, C, NH 또는 S이고;
B는 O, C, NH, 또는 S이고;
R2는 n이 3-7인, -CO-(CH2)n-CH3; -CO-(CH2)n-CHO; 및 -CO-(CH2)n-COOH로 이루어진 군으로부터 선택되며,
단, 일반식 (I)에서, R1은 n이 5-11인, -CH2-(CH2)n-X; 및 -CO-(CH2)n-X로 이루어진 군으로부터 선택되고, X는 발색단이고,
단, 일반식 (II)에서, R1은 n이 9-15인 -CH=CH-(CH2)n-CH3; n이 11-17인 -(CH2)n-CH3; 및 n이 10-16인 -CO-(CH2)n-CH3로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R3은 n이 0-5인 -CO-(CH2)n-X; 및 -SO2-(CH2)n-X로 이루어진 군으로부터 선택되고, X는 발색단이다.
Description
본 발명은 일반식 (I) 또는 (II) 중 하나로 표시되는 산화된 인지질에 관한 것이다.
LDL의 산화적 변형은 죽상경화증에 중요한 병리학적 요인으로 여겨지고 있다. 여러 실험실에서의 연구를 통해, mmLDL에 의해 촉발되는 생물학적 효과는 대게 인지질 산화 산물에 의한 것일 수 있다는 것이 밝혀졌다(Leitinger, N. et al. (1999) PNAS 96, 12010-12015; Watson, A. D. et al. (1995) J. Clin. Invest. 95, 774-782; Leitinger, N. et al. (1997) Adv. Exp. Med. Biol 433, 379-382; Loidl, A. et al. (2003) J. Biol. Chem. 278, 32921-32928). 죽상경화증의 반(plaque)에서의 이들의 농도 증가(Watson, A. D. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272, 13597-13607; Itabe, H. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 15274-15279) 및 병변이 있는 인간과 마우스에서의 산화된 인지질에 대한 항체 역가 상승(Horkko, S. et al. (1999) J. Clin. Invest. 103, 117-128; Palinski, W. et al. (1995) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 15, 1569-1576; Palinski, W. et al. (1996) J. Clin. Invest. 98, 800-814)은, 이들 분자의 병리학적 관련성에 대한 관심을 불러일으킨다.
급격히 증가하는 흥미는 동종의 산화된 인지질 시리즈들 중 2가지 대표적인 물질, 즉 1-팔미토일-2-글루타로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(PGPC) 및 1-팔미토일-2-(5-옥소발레로일)-sn-글리세로-3-포스포콜린(POVPC)에 집중되고 있다. 이들이, 혈관벽 세포에서 죽상경화증의 발병 뿐만 아니라 그외 만성적인 염증 질환에 기여할 수 있는 프로세스를 선택적으로 활성화시킨다는 발견에 의해, 중요성은 더욱 가중되고 있다. 이들 2가지 지질 모두 토끼의 죽상경화증 병변에서 3 내지 6배 농화되는 것으로 입증되었으며, 이는 PGPC 및 POVPC의 대동맥 습윤 중량 약 62 및 116 ng/mg에 각각 해당된다(Subbanagounder, G. et al. (2000) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 20, 2248-2254).
WO 01/75170에는, 죽상경화증에 대한 위험성을 평가하는 방법이 개시되어 있는데, HDL을 포함하는 생물학적 샘플을 산화된 인지질과 접촉시켜, 산화된 또는 산화되지 않은 인지질의 양 변화를 체크하는 방법으로, 산화된 인지질의 양의 무변화는 죽상경화증에 대한 위험을 나타낸다.
전술한 바와 같이, 산화된 인지질은 죽상경화증의 발병에 참여한다. 산화된 인지질은 또한 지단백질 및 항아테롬성 활성과 관련된 효소, 예컨대 포스포리파제 또는 PAF 아세틸하이드롤라제에 의해 가수분해로 절단되는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 목적은 샘플내 항아테롬성 효소의 활성에 대한 정보를 수집하는데 이용할 수 있는 화합물을 제공하는 것이다. 특히, 이들의 효소와의 상호작용으로, 샘플의 효소 활성에 대한 결론을 이끌어낼 수 있는, 검출가능한 산물이 나타나야 한다.
상기한 목적은 일반식 I 또는 II 중 하나로 표시되는 산화된 인지질에 의해 달성된다.
상기 식에서,
A는 O, C, NH 또는 S이고;
B는 O, C, NH, 또는 S이고;
R2는 n이 3-7인, -CO-(CH2)n-CH3; -CO-(CH2)n-CHO; 및 -CO-(CH2)n-COOH로 이루어진 군으로부터 선택되며,
단, 일반식 (I)에서, R1은 n이 5-11인, -CH2-(CH2)n-X; 및 -CO-(CH2)n-X로 이루어진 군으로부터 선택되고, X는 발색단이고,
단, 일반식 (II)에서, R1은 n이 9-15인 -CH=CH-(CH2)n-CH3; n이 11-17인 -(CH2)n-CH3; 및 n이 10-16인 -CO-(CH2)n-CH3로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R3은 n이 0-5인 -CO-(CH2)n-X; 및 -SO2-(CH2)n-X로 이루어진 군으로부터 선택되고, X는 발색단이다.
바람직한 예로, A 및/또는 B는 산소이다.
다른 바람직한 예로, 일반식 (I)에서, X는 피렌, 페릴렌 및 니트로벤즈아삭디아졸(nitrobenzaxadiazole)로 이루어진 군으로부터 선택되는 발색단이고, 바람직하기로는 피렌이다.
다른 바람직힌 예로, 일반식 (II)에서, X는 피렌, 페릴렌, 보로디아자인다센(borodiazaindacene)(BODIP Y™), 시아닌 염료 2, 시아닌 염료 3, 시아닌 염료 5 및 알렉사 염료(Alexa dye)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일반식 (I)에 따른 바람직한 산화된 인지질의 예는 하기 화합물이다:
1-(10-피렌데카노일)-2-글루타로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(PyrGPC)
1-(10-피렌데카노일)-2-(5-옥소발레로일)-sn-글리세포-3-포스포콜린(PyrOVPC)
일반식 II에 따른 산화된 인지질의 바람직한 예는 하기 화합물이다:
1-팔미토일-2-글루타로일-sn-글리세로-3-포스포-N-(3-[4,4-디플루오로-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센]-프로피오닐)-에탄올아민(BODIPY-PGPE)
1-팔미토일-2-글루타로일-sn-글리세로-3-포스포-N-(알렉사 플루오르 647-카르보닐)-에탄올아민(Alexa647-PGPE)
1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포-N-(3-[4,4-디플루오로-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센]-프로피오닐)-에탄올아민(BODIPY-POPE)
1-팔미토일-2-(5-옥소발레로일)-sn-글리세로-3-포스포-N-(3-[4,4-디플루오로-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센]-프로피오닐)-에탄올아민(BODPY-POVPE).
본 발명에 따른 형광 표지된 산화된 인지질을 항아테롬성 활성을 가진 효소에 대한 기질로서 사용할 수 있는 것으로 확인되었다. 청구한 화합물은 특히 혈액 샘플에서 이들 효소의 진단학적 측정에 유용하다. 조사중인 산화된 인지질과 효소 사이의 상호작용으로부터 발생되는 형광 표지된 절단 산물은 HPLC와 같은 크로마토그래피 분석에 의해 쉽고 민감하게 측정할 수 있으며, 따라서 샘플내에 존재하는 효소 활성에 대한 정보를 제공할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 항아테롬성 활성을 가진 효소, 바람직하기로는 포스포리파제 또는 PAF-아세틸하이드롤라제의 샘플내 존재를 결정함에 있어서의 본 발명에 따른 산화된 인지질의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 측면은 본 발명에 따른 산화된 인지질을 샘플에 첨가하는 단계 및 상기 샘플을 크로마토그래피 분석, 바람직하기로는 HPLC를 수행하는 단계를 포함하는, 샘플내 항아테롬성 활성을 가진 효소의 존재를 결정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 하기 실시예와 첨부된 도면을 들어 보다 상세히 설명될 것이다.
도 1A 및 B는 BODIPY-PGPE, BODIPY-POPE 및 BODPY-POVPE의 합성 단계를 개략화한 것이다.
도 2는 BODIPY-POVPE, BODIPY-PGPE 및 BODIPY-POPE의 질량 스펙트럼이다.
도 3은 PyrGPC 및 PyrOVPC의 합성 단계를 개략화한 것이다.
도 4는 PyrGPC 및 PyrOVPC의 질량 스펙트럼이다.
산화된 형광 인지질의 합성
1-
팔미토일
-2-
글루타로일
-
sn
-
글리세로
-3-
포스포
-N-(3-[4,4-
디플루오로
-4-보라-3a,4a-
디아자
-s-
인다센
]-
프로피오닐
)-에탄올아민(
BODIPY
-
PGPE
)
1. 1-팔미토일-2-글루타로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(PGPC)의 합성
PGPC(도 1A, 1)는, Watson et al. (J. Biol. Chem. 272, 13597-13607, 1997) 및 Subbanagounder et at.(Free Radic.Biol. Med. 28, 1751-1761, 2000)의 방법에 대한 변형된 방법에 따라 합성하였다. 무수 디클로로메탄 6 ㎖ 중의 건식 1-팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(62 ㎎, 125 μmol), 건식 글루타르 무수화물(70 ㎎, 613 μmol, 5 eq) 및 DMAP(p-(N,N'-디메틸아미노)피리딘, 75 ㎎, 614 μmol, 5 eq) 용액을, 35 ℃에서 마그네틱을 이용한 교반을 철야 수행하였다. 반응은 전개 시스템으로서 CHCl3/Me0H/25% NH3(65:35:5, v/v/v)을 이용한 TLC로 모니터링하고, MeOH 3 ㎖을 첨가하여 퀀칭하였다. 수득되는 혼합물은 MeOH/H2O(1:1, v/v) 1.8 ㎖로 한번 세정하였다. 유기상을 증발시킨 다음, 디에틸에테르 4 ㎖로 저 작(trituration)하여 과량의 DMAP를 제거하였다. 상층액을 제거하여, PGPC 32 ㎎을 수득하였다(2%, Rf= 0.05).
2. 1-팔미토일-2-글루타로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(PGPE)의 합성
PGPE(도 1A, 2)는, 톨루엔 1.4 ㎖ 및 0.5 M 에탄올아민이 함유된 0.5 M 소듐 아세테이트 완충액(pH 7.2) 4.3 ㎖ 에멀젼 중에, PLD(포스포리파제 D, 29 units)에 의한 PGPC(90 ㎎, 148 μmol)의 포스파티딜기의 전이 반응(transphosphatidylation)으로 수득하였다(도 1A, 단계 1). 2상 시스템(biphasic system)을 35 ℃에서 철야 교반하였다. 반응은 TLC로 모니터링하고, MeOH 4.3 ㎖을 첨가하여 퀀칭하였다. 산물은 CHCl3/Me0H(2:1, v/v) 43 ㎖로 추출하였다. 유기상은 MeOH/H2O(1:1, v/v) 11 ㎖로 2번 세정하여, 과량의 에탄올아민을 제거한 다음, 증발시키고, 조제용 TLC를 수행하였다. 산물을 긁어 내고, 실리카겔로부터 CHCl3/Me0H(1:4, v/v)을 이용하여 3번 용출시켰다. 모은 추출물을 증발시켜, 원하는 산물을 수득하였다(30.3 ㎎, 36%, Rf = 0.30).
3. 1-팔미토일-2-글루타로일-sn-글리세로-3-포스포-N-(3-[4,4-디플루오로-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센]-프로피오닐)-에탄올아민(BODIPY-PGPE)의 합성
마그네틱을 이용하여 교반한 CHCl3/Me0H(2:1, v/v) 중의 BODIPY-SE(4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-프로피온산 숙신이미딜 에스테르, 0.96 ㎎, 2.5 μmol) 용액에, PGPE(4.4 ㎎, 7.8 μmol, 3 eq)(도 1A, 2) 및 트 리에틸아민 p. a.(10 ㎕, 72 μmol, 30 eq)(도 1A, 단계 2)를 첨가하였다. 이후, 플라스크에 질소를 풍기한 다음, 광을 차단시켰고, 수득되는 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응의 진행은 TLC로 모니터링하였다. 질소 기류하에서 부피가 400 ㎕가 될 때까지, 조제용 TLC로 정제한 지질에서 용매를 제거하였다. UV 광 하에서 원하는 화합물을 확인한 다음 TLC를 벗겨낸 다음, CHCl3/Me0H(1:4, v/v)를 이용하여 실리카 겔로부터 용출시켰다. 회전식 증발에 의해 모은 추출물로부터 용매를 제거하여, BODIPY-PGPE를 수득하였다(1.77 ㎎, 85%, Rf= 0.28)(도 1A, 3).
1-
팔미토일
-2-
글루타로일
-
sn
-
글리세로
-3-
포스포
-N-(
알렉사647
-카르보닐)-에탄올아민(
Alexa647-PGPE)의
합성
Alexa647-PGPE는, 헤드 그룹에 BODIPY 대신 Alexa647을 포함하는 BODIPY-PGPE(도 1A, 3)에 대응된다. 이는, CHCl3/Me0H(2:1, v/v) 0.5 ㎖ 중의 Alexa647-SE(Alexa Fluor 647 카르복실산 숙신이미딜 에스테르, 0.5 ㎎, 0.4 μmol) 및 PGPE(0.68 ㎎, 1.2 μmol, 3 eq)(도 1A, 2)에, 트리에틸아민 p.a.(5 ㎕, 36 μmol, 90 eq)를 첨가한 다음, 실온에서 90분간 교반하여, 수득하였다. 이 반응 혼합물은 철저히 광 차단시켰다. 반응의 진행은 TLC(RP-18 F254s; Merck, Darmstadt, Germany)로 모니터링하였다. 산물은 전개 시스템으로서 H2O/EtOH/n-프로판올(20:57:23, v/v/v)을 이용한 조제용 TLC로 정제하고, 긁어낸 다음 CHCl3/Me0H(1:1, v/v)로 2번 및 MeOH로 1번 용출시켰다. 질소 기류하에 용매를 제 거하여, Alexa647-PGPE(0.26 μmol, 65%, Rf = 0.80)를 수득하였다.
1-
팔미토일
-2-(5-
옥소발레로일
)-
sn
-
글리세로
-3-
포스포
-N-(3-[4,4-
디플루오로
-4-보라-3a,4a-
디아자
-s-
인다센
]-
프로피오닐
)-
에탄올아민(BODPY-POVPE)의
합성
1. 1-팔미토일-2-(5-디메톡시펜타노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민의 합성
H2O/MeOH/THF(2:5:3, v/v/v) 5 ㎖ 중의 5,5-디메톡시펜타노산 메틸 에스테르(220 ㎎, 1.25 mmol)(도 1B, 4) 및 소듐 수산화물(250 ㎎, 6.25 mmol, 5 eq) 용액을 90분간 실온에서 교반하였다(도 1B, 단계 1). 0 ℃로 냉각한 후, 반응 혼합물에 6 ㎖의 1 N 및 적량의 0.1 M HCl을 첨가하여, pH 2.1로 산성화하고, 디클로로메탄(3 x 15 ㎖)으로 추출하였다. 모은 유기 추출물을 물(2 x 10 ㎖)로 세정하고, Na2SO4에서 건조하였다. 원하는 산물(Rf = 0.35)(도 1B, 5)이 함유된 10-15 ㎖을 제외한 용매를 감압하에 제거하고, 추가적인 정제없이 아실화 반응에 바로 사용하였다. 1-팔미토틸-sn-글리세로-3-포스포콜린(209 ㎎, 0.42 mmol)(도 1B, 6), DCC(N.N'-디사이클로헥실카르보디이미드, 270 ㎎, 1.3 mmol, 3 eq) 및 DMAP(160 ㎎, 1.3 mmol, 3 eq)을, 이 5,5-디메톡시펜타노산(도 1B, 단계 2) 용액에 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 질소하에서 철야 교반하였다. 반응은 TLC로 모니터링하였다. MeOH 6 ㎖을 첨가한 다음, 유기 용액을 MeOH/H2O(1:1, v/v)로 2번 세정하였다. 진공하에 용매를 제거하고, 벤젠/EtOH(3:2, v/v)를 첨가한 다음 물을 증발 시켰다. 오일성의 잔류물은 12 g의 실리카 겔상에서 용매로 CHCl3/Me0H/25% NH3(65:35:5, v/v/v)를 사용하는 플래쉬 크로마토그래피를 수행하여, 1-팔미토일-2-(5-디메톡시펜타노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린(245 ㎎, 91%, Rf = 0.14)(도 1B, 7)을 수득하였다. PGPC의 PGPE(도 1A, 단계 1과 비교)로의 변환에 대해 전술한 바와 같이, 콜린 지질의 포스파티딜 전이에 의해, 에탄올아민 유사체(도 1B, 8)를 수득하였다(수율: 6.2 ㎎, 66%, Rf = 0.24, 전개 용매로 CHCl3/MeOH/25% NH3, 65:35:5, v/v/v 이용)(도 1B, 단계 3).
2. 1-팔미토일-2-(5-옥소발레로일)-sn-글리세로-3-포스포-N-(3-[4,4-디플루오로-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센]-프로피오닐)-에탄올아민(BODIPY-POVPE)의 합성
CHCl3/MeOH(2:1, v/v) 1 ㎖ 중의 1-팔미토일-2-(5-디메톡시펜타노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(3.0 ㎎, 5.0 μmol)(도 1B, 8) 및 BODIPY-SE(1.95 ㎎, 5.0 μmol, 1 eq) 용액에, 트리에틸아민 p. a. (10 ㎕, 72 μmol, 14 eq)를 첨가하였다(도 1B, 단계 4). 반응 혼합물은 실온에서 80분간 교반하였다. 진공하에 용매를 제거하여, 추가적인 정제없이도 다음 반응에 사용할 수 있는 1-팔미토일-2-디메톡시펜타노일-sn-글리세로-3-포스포-N-(3-BODIPY-프로피오닐)-에탄올아민을 수득하였다(도 1B, 9). 400 ㎕의 THF/HCl(1 N)을 이용한 상기 안정적인 전구체(2.0 ㎎, 2.3 μmol)의 아세탈 절단에 의해 원하는 산물을 분리시켰다(도 1B, 단계 5). 단지 2분 후에, 반응 혼합물을 NaHCO3로 중화하고, 이후 1.2 ㎖의 CHCl3/MeOH(2:1, v/v)로 추출하였다. 유기상은 물 300 ㎕로 2번 세정하고, Na2SO4에서 건조한 다음, 감압하에 증발시켜, 1.65 ㎎의 BODIPY-POVPE(87%, Rf = 0.22, 전개 시스템으로 CHCl3/MeOH/H20, 15:5:0.1, v/v/v 이용)을 수득하였다(도 1B, 10).
1-
팔미토일
-2-
올레오일
-
sn
-
글리세로
-3-
포스포
-N-(3-[4,4-
디플루오로
-4-보라-3a,4a-
디아자
-s-
인다센
]-
프로피오닐
)-
에탄올아민(BODIPY-POPE)의
합성
BODIPY-SE(1.00 ㎎, 2.57 μmol), 트리에틸아민 p.a. (10 ㎕, 72 μmol, 28 eq) 및 POPE(1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 5.53 ㎎, 7.70 μmol, 3 eq)을 CHCl3/MeOH(2:1, v/v) 1 ㎖에 용해하였다. 이 혼합물을 60분간 실온에서 교반한 다음 용매를 질소 기류하에 제거하였다. 백색의 오일성 잔류물을 CHCl3/MeOH(2:1, v/v) 500 ㎕에 용해하였다. 조제용 TLC로 산물을 정제하였다. 산물을 포함하는 형광성 밴드를 플레이트에서 긁어 내고, CHCl3/MeOH(1:4, v/v)로 3번 용출시켰다. 모은 추출물을 증발시켜, 원하는 산물을 수득하였다(1.31 ㎎, 51%, Rf = 0.59).
1-(10-
피렌데카노일
)-2-
글루타로일
-
sn
-
글리세로
-3-
포스포콜린(PyrGPC)의
합성
0.1 M CaCl2를 포함하는 0.1 M Tris-HCl 완충액(pH 8) 3 ㎖ 및 디에틸에테 르(페록사이드-결핍) 3 ㎖의 혼합물 중의, 마그네틱을 이용하여 교반한 1,2-비스(10-피렌데카노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린(45 ㎎, 47 μmol)(도 3, 11) 에멀젼에, PLA2(Naja naja venom) 50 unit을 첨가하였다(도 3, 단계 1). 반응 혼합물을 35-40 ℃에서 철야 교반하였다. 디에틸에테르를 제거한 다음, CHCl3/Me0H(2:1, v/v)(3 x 5 ㎖)를 이용하여 수용액으로부터 산물을 추출하였다. 모은 유기 분획을 증발시키고, 잔류된 물은 고 진공하에 제거하여, 1-(10-피렌데카노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린(도 3, 12)와 유리 피렌데카노산 혼합물 50 ㎎을 수득하였다. 후자는 디에틸에테르를 이용한 저작에 의해 제거하였다. 진공하에 용매를 제거하여, 순수한 라이소포스포리피드(lysophospholipid) 25 ㎎을 수득하였다(88%, Rf = 0.12, CHCl3/MeOH/AcOH/H2O, 50:30:10:5, v/v/v/v을 전개 시스템으로 이용). 글루타르 무수화물(12 ㎎, 105 μmol, 11 eq) 및 무수 DMAP(4 ㎎, 33 μmol, 3 eq)을 무수 디클로로메탄 3 ㎖ 중의 라이소포스포리피드(6.0 ㎎, 9.8 μmol) 용액에 첨가하였다(도 3, 단계 2a). 반응물은 35-40 ℃에서 철야 교반하였다. 10 g의 실리카겔 상에서 CHCl3/Me0H(/H2O(65:25:4, v/v/v)을 이용한, 조산물의 플래쉬 크로마토그래피를 수행하여, PyrGPC(2.2 ㎎, 31%, Rf = 0.18, CHCl3/MeOH/AcOH/H2O, 50:30:10:5, v/v/v/v을 전개 시스템으로 이용)를 수득하였다(도 3, 14).
1-(10-
피렌데카노일
)-2-(5-
옥소발레로일
)-
sn
-
글리세로
-3-포스포콜린(
PyrOVPC
)의 합성
1-(10-피렌데카노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린(10 ㎎, 16 μmol)(도 3, 12)를 DCC(200 ㎎, 1.0 mmol, 59 eq) 및 DMAP(200 ㎎, 1.6 mmol, 100 eq)이 함유된 디클로로메탄 10 ㎖ 중의 5,5-디메톡시펜타노산(산 "5")을 이용하여 아실화하였다. 반응 혼합물은 실온에서 철야 교반하였다(도 3, 단계 2b). 반응의 진행은 MeOH 6 ㎖을 첨가하여 반응을 중지시키기 전까지 TLC로 모니터링하였다. 수득된 용액은 MeOH/H2O(1:1, v/v)로 2번 세정하고, 감압하에 용매를 제거하였다. 조산물은 조제용 TLC로 정제하고, 긁어 내어 CHCl3/MeOH(1:4, v/v) 4 ㎖로 5번 용출시켰다. 잔류 실리카 겔은 모은 유기 분획(5 ㎖로 농축)을 MeOH/H2O(1:1, v/v) 1 ㎖로 세정함으로써 제거하였다. 용매의 증발로, 1-(10-피렌데카노일)-2-(5-디메톡시펜타노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린(49%, Rf = 0.17)을 수득하였다(도 3, 15). 중간 산물 15(5.6 ㎎, 7.4 μmol)의 탈보호화는, THF/HCl(1 N)을 이용한 아세탈 절단에 의해 수행하고, 이후 NaHCO3로 중화한 다음, 산물을 CHCl3/MeOH(2:1, v/v)로 추출하였다. 유기상은 2번 세정하고, Na2SO4에서 건조한 다음 감압하에 증발시켜, PyrOVPC 1.1 ㎎을 수득하였다(21%, Rf = 0.05)(도 3, 단계 3).
질량 분광분석법
MALDI-TOF(Matrix assisted laser desorption/ionisation time-of-flight) 질량 스펙트럼은, 질소 레이저(λ = 337 nm, 5 Hz에서 작동) 및 시간차 포커싱 유닛(time-lag focusing unit)이 장착된 Micromass TofSpec2E에서 수행하였다. 역치 레이저 파워 보다 조금 높게 조사하여, 이온을 발생시켰다. 20 kV의 가속 전압으로 리플렉트론 모드(reflectron mode)에서 스펙트럼을 기록하였고, 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)들의 적정 혼합물로 외인적으로 보정하였다. 샘플은, 전형적으로, 기질(2,5-디하이드록시벤조산, c = 10 ㎎/㎖, CH3Cl/0.1% 트리플루오로아세트산(TFA), 70:30, v/v), 분석 물질(c = 0.01-1 ㎎/㎖, CHCl3/MeOH, 2:1, v/v) 및 NaTFA(c = 1 ㎎/㎖, CH3CN/H2O, 70:30, v/v)를 10:1:0.5(v/v/v) 비율로 혼합하여, 준비하였다. 이 혼합물에서 0.5 ㎕ 분획을 샘플 플레이트(스테인레스 스틸)에 두고, 공기 중에 건조시켰다. 50 - 100 회(shot)의 스펙트럼을 평균내어, 신호 대 노이즈 비를 개선시켰다. 본 실험에서 논의되는 모든 m/z 값은 모든 동위원소 분포에서 가장 강한 피크이다. BODIPY-POVPE, BODIPY-PGPE 및 BODIPY-POPE의 질량 스펙트럼은 도 2에 나타낸다. PyrGPC 및 PyrOVPC의 질량 스펙트럼은 도 4에 나타낸다.
Claims (15)
- 일반식 (I) 또는 (II) 중 하나로 표시되는 산화된 인지질:
상기 식에서,A는 O, C, NH 또는 S이고;B는 O, C, NH, 또는 S이고;R2는 n이 3-7인, -CO-(CH2)n-CH3; -CO-(CH2)n-CHO; 및 -CO-(CH2)n-COOH로 이루어진 군으로부터 선택되며,단, 일반식 (I)에서, R1은 n이 5-11인, -CH2-(CH2)n-X; 및 -CO-(CH2)n-X로 이루어진 군으로부터 선택되고, X는 발색단이고,단, 일반식 (II)에서, R1은 n이 9-15인 -CH=CH-(CH2)n-CH3; n이 11-17인 -(CH2)n-CH3; 및 n이 10-16인 -CO-(CH2)n-CH3로 이루어진 군으로부터 선택되고;R3은 n이 0-5인, -CO-(CH2)n-X; 및 -SO2-(CH2)n-X로 이루어진 군으로부터 선택되고, X는 발색단이다. - 제 1항에 있어서, A 및/또는 B는 산소인 것을 특징으로 하는 일반식 (I)로 표시되는 산화된 인지질.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, X는 피렌, 페릴렌 및 니트로벤즈아사디아졸로 이루어진 군으로부터 선택되는 발색단(fluorophore)이며, 바람직하기로는 피렌인 것을 특징으로 하는 일반식 (I)로 표시되는 산화된 인지질.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한항에 있어서, 1-(10-피렌데카노일)-2-글루타로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(PyrGPC)인 것을 특징으로 하는 일반식 (I)로 표시되는 산화된 인지질.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한항에 있어서, 1-(10-피렌데카노일)-2-(5-옥소발레로일)-sn-글리세포-3-포스포콜린(PyrOVPC)인 것을 특징으로 하는 일반식 (I)로 표시되는 산화된 인지질.
- 항아테롬성 활성(antiatherogenetic activity)을 가진 효소, 바람직하기로는 포스포리파제 또는 PAF-아세틸하이드롤라제의 존재를 결정하기 위한, 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한항에 따른 일반식 (I)로 표시되는 산화된 인지질의 용도.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한항에 따른 일반식 (I)로 표시되는 산화된 인지질을 샘플에 첨가하는 단계 및 상기 샘플을 크로마토그래피 분석, 바람직하기로는 HPLC를 수행하는 단계를 포함하는, 샘플내 항아테롬성 활성을 가진 효소의 존재를 결정하는 방법.
- 제 1항에 있어서, A 및/또는 B는 산소인 것을 특징으로 하는 일반식 (II)로 표시되는 산화된 인지질.
- 제 1항 또는 제 8항에 있어서, X는 피렌, 페릴렌, 보로디아자인다센(borodiazaindacene)(BODIP Y™), 시아닌 염료 2, 시아닌 염료 3, 시아닌 염료 5 및 알렉사 염료(Alexa dye)로 이루어진 군으로부터 선택되는 발색단인 것을 특징으로 하는 일반식 (II)로 표시되는 산화된 인지질.
- 제 1항, 8항 또는 9항 중 어느 한항에 있어서, 1-팔미토일-2-글루타로일-sn-글리세로-3-포스포-N-(3-[4,4-디플루오로-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센]-프로피오닐)-에탄올아민(BODIPY-PGPE)인 것을 특징으로 하는 일반식 (II)로 표시되는 산화된 인지질.
- 제 1항, 8항 또는 9항 중 어느 한항에 있어서, 1-팔미토일-2-글루타로일-sn-글리세로-3-포스포-N-(알렉사 플루오르 647-카르보닐)-에탄올아민(Alexa647-PGPE)인 것을 특징으로 하는 일반식 (II)로 표시되는 산화된 인지질.
- 제 1항, 8항 또는 9항 중 어느 한항에 있어서, 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포-N-(3-[4,4-디플루오로-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센]-프로피오닐)-에탄올아민(BODIPY-POPE)인 것을 특징으로 하는 일반식 (II)로 표시되는 산화된 인지질.
- 제 1항, 8항 또는 9항 중 어느 한항에 있어서, 1-팔미토일-2-(5-옥소발레로일)-sn-글리세로-3-포스포-N-(3-[4,4-디플루오로-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센]-프로피오닐)-에탄올아민(BODPY-POVPE)인 것을 특징으로 하는 일반식 (II)로 표시되는 산화된 인지질.
- 항아테롬성 활성을 가진 효소, 바람직하기로는 포스포리파제 또는 PAF-아세틸하이드롤라제의 존재를 결정하기 위한, 제 1항 또는 8항 내지 13항 중 어느 한항에 따른 일반식 (II)로 표시되는 산화된 인지질의 용도.
- 제 1항 또는 8항 내지 13항 중 어느 한항에 따른 일반식 (II)로 표시되는 산 화된 인지질을 샘플에 첨가하는 단계 및 상기 샘플을 크로마토그래피 분석, 바람직하기로는 HPLC를 수행하는 단계를 포함하는, 샘플내 항아테롬성 활성을 가진 효소의 존재를 결정하는 방법.
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