KR20080056554A - Skin whitening composition containing ethyl acetate fraction of white ginseng with high whitening activity - Google Patents

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Abstract

A skin whitening composition comprising an ethyl acetate fraction of white ginseng is provided to show high whitening activity with less cytotoxicity and be safe to human skin. A skin whitening composition comprises an ethyl acetate fraction of white ginseng as an effective ingredient, wherein the fraction is prepared by a method comprising steps of: (a) after crushing white ginseng, extracting it with a mixture solvent of methanol and distilled water; (b) filtering the extract and concentrating the filtrate under reduced pressure; (c) dividing the concentrate into an ethyl acetate soluble fraction and a water soluble fraction; and (d) after isolating the ethyl acetate soluble fraction, concentrating it under reduced pressure. A skin whitening cosmetic composition comprises the skin whitening composition as an effective ingredient. Further, the skin whiten composition comprises a cinnamic acid as an effective component.

Description

미백활성이 우수한 백삼 에틸아세테이트 분획물을 함유하는 피부 미백용 조성물{Skin Whitening Composition Containing Ethyl Acetate Fraction of White Ginseng with High Whitening Activity}Skin Whitening Composition Containing Ethyl Acetate Fraction of White Ginseng with High Whitening Activity}

도 1은 인삼시료의 에틸 아세테이트 분획물 추출과정을 도시한 것이다. Figure 1 shows the extraction process of ethyl acetate fraction of ginseng samples.

도 2는 인삼시료들 및 인삼에 함유되어 있다고 알려져 있는 미백활성성분으로서, 퀘르세틴, 말톨, p-쿠마르산, 에스큘레틴 및 신남산의 TLC 크로마토 그램이다. 2 is a TLC chromatogram of quercetin, maltol, p-coumaric acid, esculletin and cinnamic acid as whitening active ingredients known to be contained in ginseng samples and ginseng.

도 3 a~ f는 인삼시료들의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다. Figures 3a to f show the HPLC chromatogram of ginseng samples.

도 4는 미백활성성분 및 인삼시료별로 티로시나아제 활성을 저해하는 효과를 확인한 결과 그래프이다. 4 is a graph showing the effect of inhibiting tyrosinase activity for each whitening active ingredient and ginseng samples.

도 5a 내지 5g는 시료가 포함되지 않은 용매만을 처리한 군의 세포생존율과 멜라닌의 함량을 100%로 세팅한 후, Melanoma B16 세포주에서 세포 생장율 및 멜라닌 생성량에 대한, 코지산, PTU, 신남산, p-쿠마르산, 에스큘레틴, 말톤 및 퀘르세틴 각 화합물의 효과를 나타낸 그래프이다. 5a to 5g shows the cell growth rate and the melanin content of the group treated with only the solvent containing no sample after 100%, for the cell growth rate and melanin production in the Melanoma B16 cell line, koji acid, PTU, cinnamic acid, It is a graph which shows the effect of each compound of p-coumaric acid, esculletin, maltone, and quercetin.

도 6a~e은 시료가 포함되지 않은 용매만을 처리한 군의 세포생존율과 멜라닌의 함량을 100%로 세팅한 후, Melanoma B16 세포에서 세포 생장율 및 멜라닌 생성 량에 대한 각 인삼 EA 분획물의 영향을 나타낸 그래프이다. 도 6a는 건조인삼 동체의 영향, 도 6b는 건조미삼의 영향, 도 6c는 건조 잎의 영향, 도 6d는 백삼의 영향, 도 6e는 홍삼의 영향을 나타낸 것이다. Figure 6a ~ e shows the effect of each ginseng EA fraction on the cell growth rate and melanin production in Melanoma B16 cells after setting the cell survival rate and melanin content of the group treated with only the solvent containing no sample to 100% It is a graph. 6a shows the effect of dried ginseng fuselage, FIG. 6b shows the effect of dried ginseng, FIG. 6c shows the effect of dried leaves, FIG. 6d shows the effect of white ginseng, and FIG. 6e shows the effect of red ginseng.

도 7은 코지산, 신남산 및 피부백삼 시료 농도 각각 1ppm, 10 ppm, 100ppm에서 3일간 처리해주었을 때의 Melanoma B16 세포주 사진을 도시한 것이다. Figure 7 shows a picture of Melanoma B16 cell line when treated for 3 days at 1ppm, 10ppm, 100ppm Kojisan, Cinnamic acid and skin white ginseng sample concentration, respectively.

도 8a에는 신남산, 퀘르세틴, p-쿠마르산, 코지산 각 화합물 10ppm에서의 UV흡수를, 도 8b에서는 인삼시료들의 UV 흡수를 나타내었다. FIG. 8a shows the UV absorption of 10 ppm each of cinnamic acid, quercetin, p-coumaric acid and kojic acid, and FIG. 8b shows UV absorption of ginseng samples.

도 9a 및 도 9b는 UV-B로 색소침착된 갈색 기니아피그 피부의 완전 농축된 피부백삼 에틸아세테이트 분획물 도포 후 색소침착변화를 나타낸 것으로 도 9a는 70% 에탄올 6주 도포후를, 도 9b는 피부백삼 시료가 함유된 70% 에탄올 6주 도포후 사진을 나타낸다. Figures 9a and 9b shows the change in pigmentation after application of the fully concentrated skin white ginseng ethyl acetate fraction of the brown guinea pig skin pigmented with UV-B, Figure 9a shows after 6 weeks of application of 70% ethanol, Figure 9b shows the skin The photograph is shown after 6 weeks of application of 70% ethanol containing white ginseng sample.

본 발명은 미백활성이 우수한 피부백삼 에틸아세테이트 분획물을 함유하는 피부 미백용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 신남산을 유효성분으로 하는 피부백삼 에틸아세테이트 분획물을 함유하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a skin whitening composition containing skin white ginseng ethyl acetate fraction having excellent whitening activity, and more particularly, to a composition for skin whitening containing skin white ginseng ethyl acetate fraction containing cinnamic acid as an active ingredient.

멜라닌은 자외선 등으로 인한 피부의 손상에 대항하여 생성되며 피부를 보호 하는 작용을 한다. 멜라닌의 생합성 과정은 티로시나아제(Tyrosinase)에 의한 티로신(Tyrosine)의 산화로 시작되어 DOPA와 DOPAchrome 등이 생성된 후 DHICA와 DHI를 거쳐 이루어지며 현재까지 DHI-유멜라닌(DHI-eumelanin), DHICA-유멜라닌(DHICA-eumelanin), 페오멜라닌(Pheomelanin) 등의 3종이 생성되는 것으로 알려져 있다. 피부의 흑화는 피부세포내에 존재하는 멜라닌 생성세포(멜라노사이트: melanocyte)에서 생성된 멜라닌이 각질형성세포(케라티노사이트: keratinocyte)로 전달되어 피부 표피층에 축적되어 일어나게 된다.Melanin is produced against the damage of the skin caused by UV rays and protects the skin. The biosynthesis process of melanin begins with the oxidation of tyrosine by tyrosinase, the production of DOPA and DOPAchrome, etc., followed by DHICA and DHI. It is known that three species such as eumelanin (DHICA-eumelanin) and pheomelanin (Pheomelanin) are produced. Blackening of the skin is caused by melanin produced in melanocytes (melanosite: melanocyte) present in the skin cells are delivered to keratinocytes (keratinocytes: keratinocyte) and accumulated in the skin epidermal layer.

Figure 112006093697688-PAT00001
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피부의 멜라닌 색소 과침착은 기미, 주근깨, 검은반점 등을 일으키는 요인이 되며 이러한 피부의 흑화를 예방 및 개선하기 위하여 코지산(Kojic acid), 알부틴(Arbutin), 비타민 C(Vitamin C) 유도체 등이 미백제로 개발되었으나 코지산의 경우는 In Vitro상의 티로시나아제 억제효과에 비해 세포상이나 In Vivo상의 멜라 닌 생성억제효과가 미비한 실정이며 또한 장기 사용시 간암을 유발할 수 있다는 보고가 최근에 되어졌다. 또한 알부틴은 하이드로퀴논(hydroquinone)계열이 갖는 세포독성의 문제점이 있으며 비타민 C 역시 화학적 안정성에 대한 문제가 있어 장기 보관이 어려운 문제점이 있다. 따라서 이에 대한 우수한 대체 미백제의 개발이 시급한 실정이다. Melanin overdeposition of the skin causes blemishes, freckles, and black spots, and Kojiic acid, arbutin, and vitamin C derivatives are used to prevent and improve blackening of the skin. Although it was developed as a whitening agent, it has recently been reported that kojic acid has less melanin inhibitory effect on cellular or In Vivo than on tyrosinase on In Vitro, and may cause liver cancer in long-term use. In addition, arbutin has a problem of cytotoxicity of the hydroquinone series, and vitamin C also has a problem of chemical stability, making it difficult to store for a long time. Therefore, it is urgent to develop an excellent alternative whitening agent for this.

미백활성물질의 부작용 등이 발표됨에 따라 그 대체 원료로 여러 천연물 추출물을 이용한 기능성 미백소재에 대한 연구 또한 활발히 진행되어 상백피나 천화분 추출물, 율피, 녹두 등이 미백원료로써 사용되고 있으나 그 효능이나 독성에 대한 확실한 검증이 충분치 못한 현실이다.As side effects of whitening active substances are announced, research on functional whitening materials using various natural product extracts has been actively conducted as alternative raw materials, but whitening skin, natural extract, yulpi, and green beans are used as whitening raw materials. Clear verification is not enough.

인삼 (人蔘, Panax ginseng C.A. Meyer)은 항암효과, 면역기능 강화효과, 노화방지효과, 항스트레스 효과, 항피로 효과 등이 보고되고 있으며 피부와 관련해서는 각질형성세포(케라티노사이트: keratinocyte)의 증식 등의 항노화 관련 연구가 되어 있으나 멜라닌생성세포(멜라노사이트: melanocyte)와 관련된 멜라닌 생성억제효과는 아직까지 보고되고 있지 않다. 그러나 문헌조사에 의하면 인삼에는 티로시아나제 활성 억제물질이 함유되어 있으며 그 예로는 주근에 함유되어 있는 에스큘레틴 (esculetin), 말톨(maltol), p-쿠마르산(p-coumaric acid) 등을, 지상부에는 캠프페롤(kaempferol), 리놀레산(linoleic acid) 등을 들 수 있다. Ginseng (人蔘, Panax ginseng CA Meyer) has been reported anti-cancer effect, immune function enhancement, anti-aging effect, anti-stress effect, anti-fatigue effect and related to the skin of keratinocytes (keratinocyte: keratinocyte) Anti-aging studies such as proliferation have been studied, but melanin production inhibitory effects on melanocytes (melanocytes) have not been reported. However, literature studies have found that ginseng contains tyrosinase inhibitors, such as esculetin, maltol, p-coumaric acid, etc. On the ground, camphorol (kaempferol), linoleic acid (linoleic acid) and the like.

Figure 112006093697688-PAT00002
Figure 112006093697688-PAT00002

에스큘레틴 (esculetin) p-쿠마르산 (p-coumaric acid)       Esculetin p-coumaric acid

Figure 112006093697688-PAT00003
Figure 112006093697688-PAT00003

퀘르세틴(quercetin) 말톨 (Maltol)          Quercetin Maltol

Figure 112006093697688-PAT00004
Figure 112006093697688-PAT00004

신남산(cinnamic acid)            Cinnamic acid

현재, 인삼 및 산삼배양근의 추출물을 함유한 몇몇 기능성 미용제품이 시판되어 있으나 실질적 효과 보다는 고려인삼의 상징적 이미지를 이용한 경향이 크며 그 임상적 미용 효과는 아직까지 확실히 검증되어 있지 않다. Currently, several functional beauty products containing extracts of ginseng and wild ginseng cultured root are commercially available, but the tendency to use the symbolic image of Korean ginseng is greater than the actual effect, and its clinical beauty effect has not been verified yet.

또한 인삼자체 추출물의 미백활성에 대한 보고는 특별히 없는데, 이는 인삼 총추출 물 상태로는 그 활성이 강하지 못한 이유 때문으로 보인다. 따라서 인삼의 적절한 가공을 통한 멜라닌 생성 억제활성이 높은 성분 및 분획물의 도출과 이의 개량을 통한 미백원료의 확보에 대한 필요성이 제기되었다. In addition, there is no report on the whitening activity of ginseng extract itself, which may be due to the fact that the activity was not strong in the ginseng extract. Therefore, there is a need for derivation of components and fractions with high melanin production inhibitory activity through proper processing of ginseng and for securing whitening raw materials through improvement thereof.

이에 본 발명자들은 인삼으로부터 미백활성이 높은 성분을 함유하는 분획물을 수득하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과 본 발명을 완성하기에 이르렀다. Accordingly, the present inventors have completed the present invention as a result of diligent effort to develop a method for obtaining a fraction containing a high whitening activity from ginseng.

결국 본 발명의 목적은 인삼으로부터 미백활성이 높은 성분을 함유하는 분획물을 수득하는 방법 및 그 분획물을 함유하는 피부 미백용 조성물을 제공하는데 있다. After all, an object of the present invention is to provide a method for obtaining a fraction containing a high whitening activity from ginseng and a composition for skin whitening containing the fraction.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 The present invention to achieve the above object

피부 백삼의 탄소수 1 내지 4의 저급 알킬 아세테이트 분획물, 에테르 분획물, 또는 탄소수 1 내지 4의 저급 에테르 분획물로 이루어진 군에서부터 선택된 적어도 하나 이상의 유기용매 분획물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물을 제공한다. 바람직하게는 에틸아세테이트 분획물, 에틸에테르 분획물 또는 에테르 분획물이 가능하며, 에텔아세테이트 분획물이 가장 바람직하다.Provided is a composition for skin whitening containing at least one organic solvent fraction selected from the group consisting of lower alkyl acetate fractions having 1 to 4 carbon atoms, ether fractions or lower ether fractions having 1 to 4 carbon atoms as an active ingredient. Preferably ethyl acetate fraction, ethyl ether fraction or ether fraction is possible, with the ether acetate fraction being most preferred.

백삼은 보통 수삼의 겉껍질을 제거하고 건조하여 제조하나 피부백삼은 수삼의 겉껍질을 제거하지 않고 건조한 것을 말한다. White ginseng is usually prepared by removing the outer skin of ginseng and drying, but skin white ginseng is dry without removing the outer skin of ginseng.

본 발명에서 상기 피부 백삼의 유기용매 분획물은 피부 백삼의 추출물을 유기용매와 물 용매를 혼합한 후, 얻어진 유기 용매 가용성 분획물을 의미한다. In the present invention, the organic solvent fraction of skin white ginseng refers to an organic solvent soluble fraction obtained after mixing the extract of skin white ginseng with an organic solvent and a water solvent.

여기서 상기 추출물은 50~90 % 알콜/증류수 혼합용매로 추출한 추출물이 바람직하다. 상기 알콜은 탄소수 1~4의 저급 알콜이 바람직하다.Here, the extract is preferably an extract extracted with 50 ~ 90% alcohol / distilled water mixed solvent. The alcohol is preferably a lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms.

상기 추출물은 18~28℃의 온도에서 1~2 시간씩 2~5 반복하여 초음파 추출된 것이 바람직하다The extract is preferably ultrasonically extracted by repeating 2 to 5 for 1 to 2 hours at a temperature of 18 ~ 28 ℃.

상기 피부 백삼의 유기용매 분획물은 감압 농축후 동결 건조된 상태로 사용되는 것이 바람직하다. 감압농축 조건은 일반적으로 당해 기술분야에서 사용되는 조건이면 가능하며, 예를 들어 감압농축은 50℃이하에서 회전감압농축기를 이용하여 용매를 완전히 증발되도록 1시간 정도 농축시킬 수 있다. The organic solvent fraction of the skin white ginseng is preferably used in a freeze-dried state after concentration under reduced pressure. Decompression concentration conditions can be generally used as long as the conditions used in the art, for example, decompression concentration can be concentrated for about 1 hour so as to completely evaporate the solvent using a rotary decompression concentrator below 50 ℃.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 In order to achieve another object of the present invention

a) 피부 백삼 시료를 마쇄한 후 50~90% 알콜/증류수 혼합용매를 이용하여 추출하는 단계; b) 상기 추출물을 여과하고, 감압농축하는 단계; c) 상기 농축된 추출물을 에틸아세테이트 가용성 분획과 물 가용성 분획으로 나누는 단계; 및 d) 상기 에틸 아세테이트 가용성 분획을 분리하고 감압농축하여 피부 백삼의 에틸 아세테이트 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 따른 피부 백삼의 에틸아세테이트 분획물을 수득하는 방법에 도 1에 개략적으로 도시되어 있다. a) crushing the skin white ginseng sample and extracting it using a 50-90% alcohol / distilled water mixed solvent; b) filtering the extract and concentrating under reduced pressure; c) dividing the concentrated extract into an ethyl acetate soluble fraction and a water soluble fraction; And d) separating the ethyl acetate soluble fraction and concentrating under reduced pressure to obtain an ethyl acetate fraction of skin white ginseng. A method for obtaining an ethyl acetate fraction of skin white ginseng according to the present invention is schematically illustrated in FIG. 1.

상기 인삼시료 에틸아세테이트 분획물 분리 방법에서, a) 단계의 50~90% 알콜/증류수 혼합용매는 80% 메탄올/증류수 혼합용매를 사용하는 것이 바람직하고, 추출은 초음파 추출법을 이용하며 2~5회 반복 추출하는 것이 바람직하다.In the method for separating the ethyl acetate fraction of ginseng sample, the 50-90% alcohol / distilled water mixed solvent of step a) is preferably 80% methanol / distilled water mixed solvent, and the extraction is repeated 2-5 times using ultrasonic extraction. It is preferable to extract.

a) 단계에서 얻어진 인삼 추출시료는 와트만 (whatman) 거름종이를 이용하여 감압여과한 후 40oC에서 감압농축하여 용매를 완전히 제거한다. 제조된 인삼농축시료를 3차 증류수에 녹인 후 물 부피와 같은 양의 에틸아세테이트를 가하여 1~2분간 섞은 후 분별깔대기를 사용하여 에틸아세테이트 층을 분리하였다. 에틸아세테이트 층의 분리는 2~4회 반복하여 실시하는 것이 바람직하다. 얻어진 에틸아세테이트 층은 40℃에서 감압농축하여 에틸아세테이트를 완전히 제거하고 소량의 물에 녹인 후 동결건조하여 에틸아세테이트 분획물을 제조한다.The ginseng extract sample obtained in step a) was filtered under reduced pressure using whatman filter paper, and then concentrated under reduced pressure at 40 ° C to completely remove the solvent. After the prepared ginseng concentrate sample was dissolved in tertiary distilled water, ethyl acetate was added in the same amount as the water volume, mixed for 1 to 2 minutes, and the ethyl acetate layer was separated using a separatory funnel. Separation of the ethyl acetate layer is preferably repeated 2 to 4 times. The obtained ethyl acetate layer was concentrated under reduced pressure at 40 ° C. to completely remove the ethyl acetate, dissolved in a small amount of water, and lyophilized to prepare an ethyl acetate fraction.

본 발명의 상기 피부 미백용 조성물은 신남산을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다. The composition for skin whitening of the present invention may be characterized by containing cinnamic acid as an active ingredient.

본 발명은 또한 상기 피부 미백용 조성물을 함유하는 피부 미백 화장료 조성물을 제공한다 The present invention also provides a skin whitening cosmetic composition containing the composition for skin whitening.

본 발명에 따른 피부백삼의 EA(에틸 아세테이트) 분획물은 신남산을 유효성분으로서 다량 함유하므로, 뛰어난 티로시나아제 억제활성, 멜라닌 생성세포주에서의 멜라닌 억제활성, UV-방어효과, 기니아 피그 피부에서의 색소침착억제활성를 동시에 나타내어 우수한 미백원료로 사용이 가능하다. Since the EA (ethyl acetate) fraction of skin white ginseng according to the present invention contains a large amount of cinnamic acid as an active ingredient, it has excellent tyrosinase inhibitory activity, melanin inhibitory activity in melanogenesis cell line, UV-protective effect, and guinea pig skin. It can be used as an excellent whitening material because it shows pigmentation inhibitory activity at the same time.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.Through the following examples will be described the present invention in more detail. These examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.

실시예Example 1:  One:

1) 인삼시료의 준비1) Preparation of Ginseng Sample

충남금산의 인삼농장에서 2005 년 3월 하순경 채취한 수삼 5 kg을 수집하여 표피를 부분적으로 제거하고 증류수로 세척 후 동체, 미삼, 잎 부분으로 나누고 50℃에서 36 시간 열풍건조 하여 백삼시료를 제조하였다. 상기 제조된 인삼시료와의 비교실험을 위한 백삼은 2004 년도에 제조된 피부백삼을 구입 (서울 경동시장구입, 4년근, 1등급, 15뿌리, 충남금산군 제조, 농협중앙회인삼검사소검사필) 하여 사용하였다. 또한 홍삼은 2004 년도에 제조된 것으로 정관장에서 구입하여 사용하였다. 피부백삼은 수삼의 표피를 제거하지 않고 건조한 것을 말하며 피부백삼과 백삼의 성분 및 효능 차이점에 대한 연구는 아직 없으며 다만 피부백삼 제조용 수삼은 표면이 하얀 상등품을 쓴다는 것이 알려진 차이점이다. 백삼의 주요성분으로는 진세노사이드(ginsenoside) Rg1, Rb1 등 사포닌 계열이 알려져 있으며 그밖에 폴리아세틸렌(polyacetylene), 폴리페놀(polyphenol) 계열의 물질들을 함유하고 있다. 백삼의 주요효능으로는 항암효과, 혈액순환 촉진, 기억력 증진효과 등이 보고되어져 있다. Collected 5 kg of fresh ginseng from the ginseng farm in Chungnam Geumsan in late March 2005, partially removed the epidermis, washed it with distilled water, and divided it into the body, rice and leaf parts, and dried it in hot air at 50 ℃ for 36 hours to make white ginseng sample. It was. White ginseng for the comparative experiment with the prepared ginseng sample was used by purchasing skin white ginseng prepared in 2004 (purchased in Seoul Gyeongdong market, 4 years old, grade 1, 15 roots, Chungnam Geumsan-gun, Nonghyup Central Ginseng Inspection Office). . In addition, red ginseng was manufactured in 2004 and purchased from Jeonggwanjang. Skin white ginseng refers to dry ginseng without removing the epidermis of ginseng, and there is no research on the difference between the ingredients and efficacy of skin ginseng and white ginseng. Saponins such as ginsenosides Rg1 and Rb1 are known as main components of white ginseng, and they also contain polyacetylene and polyphenol-based substances. The main effects of white ginseng have been reported anti-cancer effect, blood circulation, memory enhancement effect.

하기 표 1은 상기 방법에 의해 수삼 5kg으로부터 얻은 건조인삼의 각 부위별 무게를 나타낸 것이다. Table 1 shows the weight for each part of the dried ginseng obtained from 5 kg of fresh ginseng by the above method.

동체(main roots)Main roots 미삼(root hairs)Root hairs 잎(leaves) Leaves 총량(total)Total 무게 (g)  Weight (g) 900.6900.6 180.1180.1 15.015.0 1090.71090.7

2): 인삼시료의 2): of ginseng sample 분획물Fraction 제조 Produce

시료의 추출은 상기 실시예 1-1)에서 얻은 건조인삼(이하 '건조인삼')의 동체, 미삼, 잎과 피부백삼 및 홍삼(이하 '인삼시료')을 각각 마쇄한 후 80% 메탄올/증류수 혼합용매를 사용하여 상온에서 1 시간 씩 3 회 반복하여 초음파 추출 하였다. 얻어진 추출액은 여과지로 여과하고 회전 감압 농축기를 이용하여 완전 농축시켜 추출물을 제조하였다. 이후 얻어진 추출물을 에틸 아세테이트(ethyl acetate: 이하 "EA") 가용성 분획과 물 가용성 분획으로 나누었다. 먼저 제조된 완전농축된 80% 메탄올/증류수 혼합용매 추출물을 500ml의 3차 증류수에 녹인 후 동량의 에틸아세테이트를 가하여 1~2분간 흔들고 분별깔대기에 방치한다. 에틸아세테이트층과 물층이 나누어지면 에틸아세테이트 층을 분리하고 이를 2~4회 반복 실시하여 에틸아세테이트 층을 수집한다. 수집된 에틸아세테이트 분획물은 감압농축하고 진공건조하여 용매인 에틸아세테이트를 제거하고 얻어진 잔사를 소량의 물에 녹인 후 동결건조하여 에틸아세테이트 분획시료제조를 완결한다. (도 1 참조)Extraction of the sample was performed after grinding the body, dried ginseng, leaves and skin white ginseng and red ginseng (hereinafter referred to as 'ginseng sample') of dried ginseng (hereinafter referred to as 'dry ginseng') obtained in Example 1-1). Ultrasonic extraction was carried out three times for 1 hour at room temperature using a mixed solvent. The obtained extract was filtered through filter paper and concentrated completely using a rotary vacuum concentrator to prepare an extract. The obtained extract was then divided into ethyl acetate (hereinafter referred to as "EA") soluble fraction and water soluble fraction. First, the prepared fully concentrated 80% methanol / distilled water mixed solvent extract was dissolved in 500 ml of tertiary distilled water, and then the same amount of ethyl acetate was added and shaken for 1 to 2 minutes and left in a separatory funnel. When the ethyl acetate layer and the water layer are divided, the ethyl acetate layer is separated and repeated 2-4 times to collect the ethyl acetate layer. The collected ethyl acetate fractions were concentrated under reduced pressure and dried in vacuo to remove ethyl acetate as a solvent, and the obtained residue was dissolved in a small amount of water and lyophilized to complete the preparation of the ethyl acetate fraction sample. (See Figure 1)

실험예Experimental Example 1: 인삼 시료의  1: ginseng sample 수율확인Yield Check 및 성분 확인 And ingredient identification

실시예 1에서 얻어진 추출물의 수율을 계산하였으며, 각각의 시료의 추출수율은 표 2와 같다. The yield of the extract obtained in Example 1 was calculated, the extraction yield of each sample is shown in Table 2.

시료sample 수율 (80% 메탄올 추출)Yield (80% methanol extraction) 수율 (EA 분획 추출)Yield (EA Fraction Extraction) 건조인삼의 동체 (Main roots of dried ginseng) Main roots of dried ginseng 26.1%26.1% 1.31%1.31% 건조인삼의 미삼 (Root hair of dried ginseng) Root hair of dried ginseng 42.7%42.7% 2.32%2.32% 건조인삼의 잎 (Leaves of dried ginseng)Leaves of dried ginseng 39.0%39.0% 3.82%3.82% 피부백삼 Skin white ginseng 26.5%26.5% 0.23%0.23% 홍삼 Red ginseng 31.2%31.2% 2.63%2.63%

각 수치는 건조 중량으로 %를 의미함.Each figure represents% by dry weight.

상기 표 2의 결과로서, 건조인삼의 잎의 분획물의 수율이 가장 높은 것으로 나타났다.As a result of Table 2, the yield of the leaves of dried ginseng was found to be the highest.

상기 EA 분획물과 물 분획물을 각각 TLC (전개용매: EA/Hexane=1/1, 3회 전개)로 확인하였다. 도 2a 및 도 2b는 각각 인삼에 함유되어 있다고 알려져 있는 미백활성성분으로서, 퀘르세틴, 말톨, p-쿠마르산, 에스큘레틴 및 신남산의 TLC 크로마토 그램과 상기 표 2의 인삼시료들의 TLC 크로마토그램을 나타낸 것이다. 도 2a에서 A: 퀘르세틴 B: 말톨 C: p-쿠마르산 D: 에스큘레틴 E: 신남산 F: 기준 혼합물 G: 건조 동체 (EA 분획) H: 건조 동체 (물 분획) I: 건조 미삼 (EA 분획) J: 건조 미삼 (물 분획) K: 건조 잎 (EA 분획) L: 건조 잎 (물 분획)이고, 도 2b에서 M: 건조 동체 (EA 분획) N: 건조 동체 (물 분획) O: 피부백삼 (EA 분획) P: 피부백삼 (물 분획) Q: 홍삼 (EA 분획) R: 홍삼(물 분획)이다. The EA fraction and the water fraction were identified by TLC (developing solvent: EA / Hexane = 1/1, 3 developments), respectively. 2A and 2B are whitening active ingredients known to be contained in ginseng, respectively, and show TLC chromatograms of quercetin, maltol, p-coumaric acid, esculletin and cinnamic acid and TLC chromatograms of ginseng samples of Table 2 above. It is shown. In FIG. 2A A: Quercetin B: Maltol C: p-coumaric acid D: Esculetin E: Cinnamic acid F: Reference mixture G: Dry body (EA fraction) H: Dry body (water fraction) I: Dry rice (EA Fraction) J: dry rice (water fraction) K: dry leaf (EA fraction) L: dry leaf (water fraction), in FIG. 2b M: dry fuselage (EA fraction) N: dry fuselage (water fraction) O: skin White ginseng (EA fraction) P: Skin white ginseng (water fraction) Q: Red ginseng (EA fraction) R: Red ginseng (water fraction).

도 2a를 통해 부위별로 볼 때 건조인삼 동체와 미삼은 비슷한 패턴을 보였으나 잎은 상이한 패턴을 보였고, 도 2b를 통해 인삼의 종류에 따라서는 건조인삼과 백삼이 비슷한 패턴을 보이면서 약간의 함량적 차이를 보이나, 홍삼은 건조인삼이나 백삼과 상이한 패턴을 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다. The dried ginseng fuselage and the ginseng showed similar patterns, but the leaves showed different patterns, and the dried ginseng and white ginseng showed similar patterns according to the types of ginseng. Although, red ginseng showed a different pattern from dried ginseng or white ginseng.

또한, 각 인삼시료들을 분획별로 보면, 각각 EA 가용성 분획에 미백활성성분이 전이되었고, 물 가용성 분획에는 미백활성성분이 거의 전이되지 않았다는 사실을 확인할 수 있었다. In addition, when the ginseng samples were fractionated, the whitening active ingredient was transferred to the EA soluble fraction, and the whitening active ingredient was hardly transferred to the water soluble fraction.

또한, 이것으로, 건조인삼 동체와 미삼, 피부백삼의 EA 가용성 분획물이 유사한 성분, 즉 미백활성 성분을 함유하고 있는 것을 알 수 있다.In addition, it can be seen that the EA-soluble fractions of dried ginseng fuselage, rice ginseng, and skin white ginseng contain similar ingredients, that is, whitening active ingredients.

Figure 112006093697688-PAT00005
Figure 112006093697688-PAT00005

실험예 2: 인삼 시료별 유효성분 함량 분석      Experimental Example 2: Analysis of the active ingredient content for each ginseng sample

상기 EA 분획에서 확인된 미백활성물질인 퀘르세틴, 말톨, 신남산, p-쿠마르산 및 에스큘레틴의 건조인삼 EA 분획물 중의 함량을 HPLC를 이용하여 정량하였다. The content of dry ginseng EA fractions of quercetin, maltol, cinnamic acid, p-coumaric acid and esculletin, the whitening active substance identified in the EA fraction, was quantified using HPLC.

시료액으로서 상기 인삼 EA 분획물은 완전 농축된 추출물을 10 mg/㎖로 메탄올에 녹인 후 0.45㎛ 시린지 필터(syringe filter) (Millipore)로 여과하여 제조하였고 이를 분석용 시료로 사용하였다. HPLC는 Jasco Co. (Japan)의 분석용 LC(liquid chromatography)를 사용하였다. 컬럼은 Bondpack C18 (4 um, 300 × 3.9 mm)을 사용하였고, 이동상은 2% 아세트산이 함유된 물과 0.5% 아세트산이 함유된 50% 아세토니트릴(acetonitrile) 을 구배를 주어 0.8 ㎖/min의 속도로 용출하였다. 컬럼의 온도는 40℃로 유지 하였으며 시료의 검출은 280 nm에서 측정하였다. 모든 시료는 3회 반복 실험하여 평균치를 산출하였고 표준물질과의 이중주입(co-injection)을 실시하여 피크(peak)의 일치를 확인하였다. As a sample solution, the Ginseng EA fraction was prepared by dissolving the fully concentrated extract in methanol at 10 mg / ml and filtering with a 0.45 μm syringe filter (Millipore), which was used as a sample for analysis. HPLC was performed by Jasco Co. Analytical LC (liquid chromatography) from (Japan) was used. The column used Bondpack C18 (4 um, 300 × 3.9 mm) and the mobile phase was gradientd at 0.8 mL / min by gradient of water with 2% acetic acid and 50% acetonitrile with 0.5% acetic acid. Eluted. The temperature of the column was maintained at 40 ℃ and the detection of the sample was measured at 280 nm. All samples were averaged by three replicates and co-injection with the standard was used to confirm peak agreement.

도 3 a~ f는 다양한 인삼시료의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다. 도 3a는 기준물질로서 말톨(Mal), 에스큘레틴(Esc), 쿠마르산(Cou), 신남산(Cin) 및 퀘르세틴(Que)의 피크를 확인한 것이고, 도 3b는 건조인삼 동체의 피크를 확인한 것이고, 도 3c는 건조 미삼의 피크를 확인한 것이고, 도 3d는 건조인삼 잎의 피크를 확인한 것이고, 도 3e는 피부백삼의 피크를 확인한 것이며, 도 3f는 홍삼의 피크를 확인한 것이다. 3 a to f show HPLC chromatograms of various ginseng samples. FIG. 3a shows the peaks of Maltol, Esculetin (Esc), Coumaric acid (Cou), Cinnamic acid (Cin) and Quercetin (Que) as reference materials, and FIG. 3b shows the peaks of dried ginseng bodies. 3c confirms the peak of dried ginseng, FIG. 3d confirms the peak of dried ginseng leaf, FIG. 3e confirms the peak of skin white ginseng, and FIG. 3f confirms the peak of red ginseng.

도 3에서 보면, 기준물질인 퀘르세틴, 말톨, 신남산, p-쿠마르산 및 에스큘레틴은 메탄올에 녹여 ODS-H80 역상 크로마토그래피를 통해, 앞서 서술한 바와 같은 방법에 기술된 조건으로 용출시켰을 때, 각각 9.2, 13.6, 19.7, 33.8, 34.9 분에서 검출되었다.Referring to FIG. 3, reference materials quercetin, maltol, cinnamic acid, p-coumaric acid, and esculinate are dissolved in methanol and eluted under conditions described in the method described above through ODS-H80 reverse phase chromatography. , At 9.2, 13.6, 19.7, 33.8, and 34.9 minutes, respectively.

건조인삼 EA 분획물의 부위별 미백활성 물질 함량은 표 3에, 건조인삼, 피부백삼 및 홍삼의 함량을 측정한 결과는 표 4에 나타내었다. The whitening active substance content of each part of the dried Ginseng EA fraction is shown in Table 3, and the results of measuring the contents of dried Ginseng, skin White Ginseng and Red Ginseng are shown in Table 4.

시료sample 에스큘레틴Esculetin p-쿠마르산 p -coumaric acid 신남산Sinnamsan 퀘르세틴Quercetin 말톨Maltol 동체 fuselage 0.10%0.10% 1.52%1.52% 0.10%0.10% 0.01이하0.01 or less 0.01이하0.01 or less 미삼Misam 0.09%0.09% 0.33%0.33% 0.05%0.05% 0.01이하0.01 or less 0.01이하0.01 or less  leaf 0.64%0.64% 0.26%0.26% 0.20%0.20% 0.16%0.16% 0.01이하0.01 or less

시료sample 에스큘레틴Esculetin p-쿠마르산 p -coumaric acid 신남산Sinnamsan 퀘르세틴Quercetin 말톨Maltol 건조인삼Dried ginseng 0.10%0.10% 1.52%1.52% 0.10%0.10% 0.01이하0.01 or less 0.01이하0.01 or less 피부백삼Skin white ginseng 0.01이하0.01 or less 0.19%0.19% 1.51%1.51% 0.24%0.24% 0.01이하0.01 or less 홍삼Red ginseng 0.96%0.96% 0.07%0.07% 0.06%0.06% 0.01이하0.01 or less 3.82%3.82%

표 3과 표 4에 나타난 바와 같이, 건조 인삼의 부위별로는 동체에서 p-쿠마르산이 1.52% 함유되어 있어, 미삼의 0.33%와 큰 차이를 보였고, 잎에는 에스큘레틴이 0.64%로 가장 많이 함유되어 있었다. 피부백삼에서는 신남산이 1.51% 함유되어 있고, p-쿠마르산은 건조인삼보다 적게 함유되어 있었다. 또한 홍삼은 홍삼의 특이 성분인 말톨을 다량 함유하고 있었으나 다른 성분은 상대적으로 적게 함유하고 있었다. As shown in Table 3 and Table 4, the parts of dried ginseng contained 1.52% of p-coumaric acid in the fuselage, showing a large difference from 0.33% of rice ginseng, and the highest content of esculletin was 0.64% in leaves. there was. Skin white ginseng contained 1.51% cinnamic acid and p-coumaric acid contained less than dry ginseng. In addition, red ginseng contained a large amount of maltol, a specific component of red ginseng, but relatively less other ingredients.

실시예 3: 미백 활성성분 및 인삼 시료별 미백 활성 확인Example 3: Confirming the whitening activity for each whitening active ingredient and ginseng sample

1) 미백 활성측정 방법1) How to measure whitening activity

가. 티로시나아제 활성억제도 측정방법end. How to measure tyrosinase activity inhibition

8.0 mM L-dopa (67 mM 인산염 버퍼 (PH 6.8) 에 녹임) 120 μl 와 메탄올 40 μl에 녹인 여러 농도의 검색시료를 96-웰(well) 마이크로플레이트에 넣고 티로시나아제 (125 U/ml) 40 μl를 가하였다. 37℃에서 20분간 인큐베이션한 후 생성된 도파크롬(dopachrome)의 양을 Elisa 리더를 사용하여 492 nm에서의 흡수도를 측정하였다.8.0 mM L-dopa (dissolved in 67 mM phosphate buffer (PH 6.8)) in a 96-well microplate with various concentrations of 120 μl dissolved in 40 μl methanol and tyrosinase (125 U / ml). 40 μl was added. After incubation at 37 ° C. for 20 minutes, the amount of dopachrome produced was measured at 492 nm using an Elisa reader.

나. 멜라닌 생성 세포주 시험I. Melanin-producing cell line test

멜라닌 생성 세포주는 10% FBS(Fetal Bovine Serum)가 함유된 RPMI1640 배지에서 배양시켰다. 100 π 컬쳐 디쉬(culture dish)에 약 5×105 개의 세포가 포함된 세포현탁액을 접종한 후 37℃, 5% CO2 조건에서 융합성(confluent)이 되게 자라게 되면 24 웰 플레이트에 105 cells/well의 농도로 다시 접종하고 24 시간 배양하였다. 웰 당 990 μl의 배지를 매일 갈아주면서 10 μl의 시료를 3 일간 처리(용매: 50% 프로필렌 글리콜(Propylene glycol, 30% EtOH, 20% H2O)한 후 1 일간 더 배양하였다.Melanogenic cell lines were cultured in RPMI1640 medium containing 10% FBS (Fetal Bovine Serum). After inoculating a cell suspension containing approximately 5 × 10 5 cells in a 100 π culture dish and growing confluent at 37 ° C. and 5% CO 2, 105 cells / well were placed on a 24-well plate. Inoculated again at concentration and incubated for 24 hours. 990 μl of medium per well was changed daily, and 10 μl of the sample was treated for 3 days (solvent: 50% propylene glycol (30% EtOH, 20% H 2 O), followed by further incubation for 1 day.

멜라닌 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 배지 제거 후 인산염완충식염수(saline, phosphate-buffered: PBS)로 세척하고 곧 1 N NaOH 1 ml를 가하여 멜라닌을 녹인 후 400 nm에서 UV 흡수도를 측정하였다.In order to determine the effect on melanin production, the medium was washed with phosphate-buffered saline (saline, phosphate-buffered: PBS) and immediately dissolved with 1 N NaOH 1 ml to measure melanin and UV absorbance was measured at 400 nm.

세포생존율에 미치는 영향을 측정하기 위하여 배지제거 후 PBS로 세척하고 크라스탈 바이올렛 (크리스탈 바이올렛 0.1%, 10% EtOH, 나머지 PBS)를 200 μl 첨가하였다. 5 분간 상온에서 인큐베이션한 후, 물로 2번 세척하였다. 여기에 EtOH 1 ml를 첨가하여 상온에서 10분간 쉐이킹(shaking)한 후 590 nm에서 UV 흡수도를 측정하였다.To determine the effect on cell viability, medium was removed, washed with PBS, and 200 μl of crystal violet (0.1% crystal violet, 10% EtOH, remaining PBS) was added. After incubation at room temperature for 5 minutes, it was washed twice with water. 1 ml of EtOH was added thereto and shaken at room temperature for 10 minutes, and then UV absorbance was measured at 590 nm.

2) 시료별 2) by sample 미백활성Whitening activity 확인 Confirm

가. end. 미백활성성분Whitening Active Ingredient 및 인삼시료별 티로시나아제 활성억제 확인 Inhibition of Tyrosinase Activity by Ginseng and Ginseng Samples

멜라닌 생성 초기과정에 주요한 역할을 하는 효소인 티로시나아제 활성에 미치는 영향을 상기 1)에 서술한 방법을 이용하여 각 시료별로 측정한 결과는 도 4와 같다. As a result of measuring the effects on the tyrosinase activity, an enzyme that plays a major role in the initial melanogenesis process by each sample using the method described in 1) is shown in FIG.

미백활성 물질 중에서는 에스큘레틴이 200 ppm에서 46.8%의 가장 우수한 티로시나아제 활성억제를 보였고, 퀘르세틴과 신남산 역시 같은 농도에서 각각 36.7%, 34.5%의 저해도를 나타내었다. 인삼시료 EA 분획물은 건조동체와 피부백삼에서 200 ppm 농도 일 때 각각 12.3% 와 13.7% 의 저해활성을 보였다. 이는 에스큘레틴 등 단일활성 물질에 비해 동일 농도에서 비교적 낮은 활성이나 여러 가지 성분이 섞여있는 추출물임을 감안 할 때 유의한 저해활성을 나타냈다고 볼 수 있다. 도 4에서는 건조잎이, 특히 20ppm일 때 피부백삼보다 티로시나아제 저해활성이 약간 좋게 나왔으나 이후 UV-차단효과나 멜라닌 생성세포에서의 활성은 피부백삼이 월등히 우수한 결과를 나타내어 피부백삼이 우수하다는 것을 알 수 있다.Among the whitening substances, esculletin showed the best inhibitory activity of tyrosinase at 4 ppm at 200 ppm, and quercetin and cinnamic acid showed 36.7% and 34.5% inhibition at the same concentration, respectively. EA fraction of ginseng samples showed inhibitory activity of 12.3% and 13.7% at 200 ppm concentration in dry body and skin white ginseng, respectively. This can be said to have a significant inhibitory activity considering the relatively low activity at the same concentration compared to a single active substance such as esculletin, but the extract is a mixture of several components. In Figure 4, when the dried leaves, especially 20ppm, the tyrosinase inhibitory activity was slightly better than the skin white ginseng, but the UV-blocking effect or activity in the melanin-producing cells showed that the skin white ginseng showed excellent results, which was excellent in skin white ginseng. It can be seen that.

나. 멜라닌 생성세포에서의 멜라닌 생성억제도 확인I. Inhibition of melanin production in melanocytes

미백활성분과 인삼시료들이 마우스 유래의 멜라닌 생성 세포인 Melanoma B16 세포주(한국세포주은행 구입)에서 세포의 생존율과 멜라닌 생성량에 미치는 영향을 측정하기 위해 10% FBS(fetal bovine serum) 과 1% 페니실린-스트렙토마이신, 200 nM의 PMA(Phorbol-12 myristate 13-acetate) 가 함유된 RPMI 1640 배지로 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하여 EtOH / H2O = 6 / 4 용액에 녹인 대조군의 시료를 1 ug/ml, 10 ug/ml, 100 ug/ml의 농도로 3 일간 처리하였다. To determine the effect of whitening actives and ginseng samples on cell viability and melanogenesis in Melanoma B16 cell line, a mouse-derived melanin-producing cell (Korea Cell Line Bank), 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin-strepto A control sample dissolved in EtOH / H 2 O = 6/4 solution incubated at 37 ° C and 5% CO 2 in RPMI 1640 medium containing mycin, 200 nM Phorbol-12 myristate 13-acetate (PMA) ug / ml, 10 ug / ml, 100 ug / ml were treated for 3 days.

도 5는 생존율과 멜라닌 운반체의 함량이 100%로 초기 세팅되었을 때의 melanoma B16 세포주의 세포 생장율 및 멜라닌 생성량에 대한 각 화합물의 영향을 나타낸 것으로, 대조물질로써 코지산, 양성 대조군으로서 PTU, 신남산, p-쿠마르산, 에스큘레틴, 말톨 및 퀘르세틴의 그래프를 각각 순서대로 도시한 것이다. Figure 5 shows the effect of each compound on the cell growth rate and melanin production of melanoma B16 cell line when the survival rate and the content of melanin carrier is initially set to 100%, koji acid as a control, PTU as a positive control, cinnamic acid Graphs of p-coumaric acid, esculletin, maltol and quercetin are shown in order, respectively.

도 5에 따르면 양성 대조군인 PTU(Phenyl thiourea)는 100 ug/ml에서 약 25%의 세포독성을 보였으나 멜라닌 생성률을 농도 의존적으로 각각 11.1%, 58.6%, 74.7% 감소 시켰다. 한편 대조물질로써 사용된 코지산(Kojic acid)은 고농도에서 세포독성을 나타냈으며 인삼에 함유된 성분 중에서는 신남산이 큰 세포독성 없이 10 ug/ml 농도에서 17%, 100 ug/ml 농도에서 29%의 멜라닌 생성량을 감소시켰고, 에스큘레틴은 100 ug/ml 농도에서 세포생존률 대비 멜라닌 감소효과를 보였으나 약간의 세포사멸을 일으켰다. 그 외 말톨, p-쿠마르산 및 퀘르세틴은 유의적인 효과를 나타내지 않았다. According to FIG. 5, PTU (Phenyl thiourea), a positive control, showed cytotoxicity of about 25% at 100 ug / ml, but decreased melanin production rates 11.1%, 58.6%, and 74.7%, respectively, in a concentration-dependent manner. Kojiic acid, used as a control, showed cytotoxicity at high concentrations. Among the components of ginseng, cinnamic acid was 17% at 10 ug / ml and 29 at 100 ug / ml without high cytotoxicity. The production of melanin was reduced in%, and esculletin showed melanin reduction compared to cell viability at a concentration of 100 ug / ml, but caused slight cell death. Other maltol, p-coumaric acid and quercetin showed no significant effect.

도 6은 생존율 및 멜라닌 운반체의 함량이 100%로 초기 세팅되었을 때의 melanoma B16 세포주의 세포 생장율 및 멜라닌 생성량에 대한 각 인삼 EA 분획별 영향을 나타낸 그래프이다. 도 6a는 건조인삼 동체의 영향, 도 6b는 건조미삼의 영향, 도 6c는 건조 잎의 영향, 도 6d는 백삼의 영향, 도 6e는 홍삼의 영향을 나타낸 것이다. Figure 6 is a graph showing the effect of each ginseng EA fraction on the cell growth rate and melanin production of melanoma B16 cell line when the survival rate and the content of melanin carrier is initially set to 100%. 6a shows the effect of dried ginseng fuselage, FIG. 6b shows the effect of dried ginseng, FIG. 6c shows the effect of dried leaves, FIG. 6d shows the effect of white ginseng, and FIG. 6e shows the effect of red ginseng.

인삼시료는 피부백삼 EA 분획물이 100 ug/ml 농도에서 세포생존률 대비 약 30%의 멜라닌 감소효과를 보였고, 잎의 EA 분획물이 100 ug/ml 농도에서 27%의 감소효과를 나타내었으나, 건조인삼 동체 EA 분획물 및 미삼 EA 분획물과 홍삼 EA 분획물은 높은 세포독성을 나타냈다. Ginseng samples showed melanin reduction of about 30% of melanin at 100 ug / ml at 100 ug / ml concentration and EA fraction of leaves at 27 ug / ml at 27 ug / ml. The EA fraction and the red ginseng EA fraction and the red ginseng EA fraction showed high cytotoxicity.

결과를 종합하여 볼 때 인삼시료 중 적은 독성과 가장 뛰어난 활성을 보인 피부백삼의 EA 분획물이 세포독성이 적으면서 멜라닌 감소효과가 우수하여 피부 미백 원료로 가장 적합하다고 할 수 있고, 상기 피부백삼의 EA 분획물은 실시예 2의 2)에서 신남산을 다량함유하고 있다고 확인하였으므로, 피부백삼의 멜라닌 억제활성에는 신남산이 주요한 역할을 한다고 판단할 수 있었다. In summary, the EA fraction of skin white ginseng showed the least toxicity and the most excellent activity among ginseng samples, and the cytotoxicity was low and the melanin reduction effect was excellent. Since the fraction was confirmed to contain a large amount of cinnamic acid in Example 2) 2, it could be determined that cinnamic acid plays a major role in the melanin inhibitory activity of skin white ginseng.

이를 토대로 코지산, 신남산 및 피부백삼 시료를 처리해주었을 때의 melnoma B16 세포주를 사진을 통해 확인하여 상기와 같은 판단의 근거를 찾을 수 있었다. Based on this, the melnoma B16 cell line when treated with kojic acid, cinnamic acid, and skin white ginseng samples was identified through photographs to find the basis for the above judgment.

도 7은 코지산, 신남산 및 피부백삼 시료 농도 각각 1ppm, 10 ppm, 100ppm에서 3일간 처리해주었을 때의 melanoma B16 세포 사진을 도시한 것이다. 도 7에 대한 데이터의 해석을 기재하여 주시기 바랍니다. - 활성비교를 위한 기준 미백활성물질인 코지산은 1ppm, 10ppm, 100ppm 처리군 모두에서 큰 세포사멸은 나타나지 않았으나 검은색으로 나타나는 멜라닌 생성량을 유의적으로 줄이지 못하였다. 반면 피부백삼 EA 및 cinnamic acid는 큰 세포사멸 없이 멜라닌 생성량을 농도의존적으로 감소시킴을 확인 할 수 있다. Figure 7 shows melanoma B16 cell photo when treated with kojisan, cinnamic acid and skin white ginseng sample concentration at 1ppm, 10ppm, 100ppm respectively for 3 days. Please describe the interpretation of the data for FIG. Kojic acid, the standardizing whitening activator for comparison of activity, did not show significant cell death in all 1ppm, 10ppm, and 100ppm treatment groups, but did not significantly reduce the amount of melanin produced in black. In contrast, skin white ginseng EA and cinnamic acid reduced melanin production in a concentration-dependent manner without significant cell death.

3) UV-A 와 UV-B 영역 자외선 차단효과 확인3) Check UV-A and UV-B area UV protection effect

자외선 영역 중 UV-A (350~370 nm) 는 파장이 길어 피부 진피층까지 침투 할 수 있으며 유리를 통과할 수 있는 자외선 영역으로 즉시형 색소침착을 일으킨다. 반면 UV-B(270-290 nm)은 UV-A에 비해 파장이 짧아 피부 깊숙이 침투하지 않지만 에너지가 높아 일광화상을 유발시키며 노출 후 72 시간 이후부터 색소침착이 나타나는 지연형 색소침착을 일으킨다. UV-A (350 ~ 370 nm) of the ultraviolet region has a long wavelength, can penetrate the dermal layer of the skin and cause immediate pigmentation in the ultraviolet region that can pass through the glass. UV-B (270-290 nm), on the other hand, has a shorter wavelength than UV-A, so it does not penetrate deep into the skin, but its high energy causes sunburn and delayed pigmentation, which occurs after 72 hours of exposure.

시료의 자외선 흡수도 측정은 메탄올에 검색시료를 10 ppm로 녹여 200 nm~600 nm에서 UV 흡수도를 측정하여 실시하였다.Ultraviolet absorbance measurement of the sample was carried out by measuring the UV absorbance at 200 nm ~ 600 nm by dissolving the test sample in 10 ppm in methanol.

도 8에는 UV-A 및 UV-B 영역에서 각 시료의 UV 흡수를 나타내었다. 200-500 nm 영역의 흡수도를 측정한 결과 100 ug/ml 의 농도의 피부백삼 EA 분획물이 UV-B 영역에서 특징적인 흡수를 나타냈으며 홍삼 EA 분획물은 UV-B 영역에서 약한 흡수를 보였으나 건조잎과 동체에서는 UV-B와 UV-A 영역에서 흡수를 나타내지 않았다. 인삼에 함유된 성분 중에서는 신남산이 UV-B 영역에서 가장 특징적인 흡수를 나타냈고 퀘르세틴은 UV-A 영역과 UV-B 영역에서 약간의 흡수도를 보였다. Figure 8 shows the UV absorption of each sample in the UV-A and UV-B region. The absorbance in the 200-500 nm region measured the absorption of 100 g / ml of skin white ginseng EA fraction in the UV-B region and the red ginseng EA fraction showed weak absorption in the UV-B region. Leaves and fuselage did not show absorption in the UV-B and UV-A regions. Among the components of ginseng, cinnamic acid showed the most characteristic absorption in the UV-B region, and quercetin showed some absorption in the UV-A and UV-B regions.

4) 브라운 4) brown 기니아Guinea 피그를Pig 이용한  Used 피부색소침착Skin Pigmentation 완화 효과 확인 Check for mitigation effect

500 g 내외의 브라운 기니아 피그(brown guinea pig) 암컷의 등 부분을 제모한 후 마취하고 500 mJ의 UV-B를 동일한 부위에 1주일에 한번씩 총 3회 조사하여 색소침착을 유도한 후, 색소침착부위에 각각의 실험시료용액을 1일 1회 6주간 도포하고 색소침착완화정도를 측정하였다. After shaving the back of 500 grams of brown guinea pig females, anesthetize and induce pigmentation by irradiating 500 mJ UV-B to the same site three times a week. Each test sample solution was applied to the site once a day for 6 weeks and the degree of pigmentation relaxation was measured.

도 9에는 UV-B로 색소침착된 갈색 기니아피그 피부의 색소침착변화를 나타내었다. 브라운 기니아 피그(Brown guinea pig)의 피부에 UV-B로 색소침착을 유발한 뒤 피부백삼 EA 분획물을 70% 에탄올에 녹여 6 주간 도포한 결과 70% 에탄올만을 도포한 부분에 비하여 색소침착을 유의적으로 완화시킴을 확인할 수 있었다. 9 shows the pigmentation change of the skin of the brown guinea pig pigmented with UV-B. Pigmentation was induced on the skin of Brown guinea pigs with UV-B, and the skin white ginseng EA fraction was dissolved in 70% ethanol and applied for 6 weeks. It was confirmed that the relaxation.

이하에서는 본 발명에서 가장 세포독성이 적으면서도 미백활성이 좋은 피부백삼 EA 분획물을 미백 조성물로 사용하여 제조할 수 있는 다양한 제형예를 제시한다. 그러나 본 발명의 범위가 하기 제형예에 한정되지 않음은 당업자에게 자명한 사항이라 할 것이다.Hereinafter, various formulations that can be prepared using the skin white ginseng EA fraction having the least cytotoxicity and good whitening activity in the present invention as a whitening composition. However, the scope of the present invention is not limited to the following formulation examples will be apparent to those skilled in the art.

제형예Formulation example

[제형예 1] 영양화장수(밀크로션) Formulation Example 1 Nutritious Longevity (Milk Lotion)

하기의 표와 같이 피부백삼 EA 분획물을 함유하는 미백 영양화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.A whitening nutrient lotion containing skin white ginseng EA fraction was prepared according to a conventional method as shown in the following table.

배합성분Ingredient 중량%weight% 피부백삼 EA 분획물Skin White Ginseng EA Fraction 2.02.0 스쿠알란Squalane 5.05.0 밀납Beeswax 4.04.0 폴리솔베이트 60Polysorbate 60 1.51.5 솔비탄세스퀴올레이트Sorbitan sesquioleate 1.51.5 유동파라핀Liquid paraffin 0.50.5 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드Caprylic / Capric Triglycerides 5.05.0 글리세린glycerin 3.03.0 부틸렌글리콜Butylene glycol 3.03.0 프로필렌글리콜Propylene glycol 3.03.0 카르복시비닐폴리머Carboxy Vinyl Polymer 0.10.1 트리에탄올아민Triethanolamine 0.20.2 방부제, 색소, 향료Preservative, coloring, flavoring 적량Quantity 정제수Purified water to 100to 100

[제형예 2] 유연화장수(스킨로션)Formulation Example 2 Softener (Skin Lotion)

하기의 표와 같이 피부백삼 EA 분획물을 함유하는 유연화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.A softening lotion containing skin white ginseng EA fraction was prepared according to a conventional method as shown in the following table.

배합성분Ingredient 중량%weight% 피부백삼 EA 분획물Skin White Ginseng EA Fraction 2.02.0 글리세린glycerin 3.03.0 부틸렌글리콜Butylene glycol 2.02.0 프로필렌글리콜Propylene glycol 2.02.0 카르복시비닐폴리머Carboxy Vinyl Polymer 0.10.1 PEG 12 노닐페닐에테르PEG 12 nonylphenyl ether 0.20.2 폴리솔베이트 80Polysorbate 80 0.40.4 에탄올ethanol 10.010.0 트리에탄올아민Triethanolamine 0.10.1 방부제, 색소, 향료Preservative, coloring, flavoring 적량Quantity 정제수Purified water to 100to 100

[[ 제형예Formulation example 3] 영양크림 3] Nutrition Cream

하기의 표와 같이 피부백삼 EA 분획물을 함유하는 영양크림을 통상의 방법에 따라 제조하였다.A nourishing cream containing skin white ginseng EA fraction was prepared according to a conventional method as shown in the following table.

배합성분Ingredient 중량%weight% 피부백삼 EA 분획물Skin White Ginseng EA Fraction 2.02.0 폴리솔베이트 60Polysorbate 60 1.51.5 솔비탄세스퀴올리에이트Solbitan Sesquioleate 0.50.5 PEG60 경화피마자유PEG60 Cured Castor Oil 2.02.0 유동파라핀Liquid paraffin 10.010.0 스쿠알란Squalane 5.05.0 카프릴릭/카프락트리글리세라이드Caprylic / Caprol Triglycerides 5.05.0 글리세린glycerin 5.05.0 부틸렌글리콜Butylene glycol 3.03.0 프로필렌글리콜Propylene glycol 3.03.0 트리에탄올아민Triethanolamine 0.20.2 방부제antiseptic 적량Quantity 색소Pigment 적량Quantity 향료Spices 적량Quantity 정제수Purified water to 100to 100

[[ 제형예Formulation example 4] 팩 4] pack

하기의 표와 같이 피부백삼 EA 분획물을 함유하는 팩을 통상의 방법에 따라 제조하였다.A pack containing the skin ginseng EA fraction was prepared according to a conventional method as shown in the following table.

배합성분Ingredient 중량%weight% 피부백삼 EA 분획물Skin White Ginseng EA Fraction 1.01.0 폴리비닐알콜Polyvinyl alcohol 13.013.0 소듐카르복시메틸셀룰로오스Sodium Carboxymethyl Cellulose 0.20.2 글리세린glycerin 5.05.0 알란토인Allantoin 0.10.1 에탄올ethanol 6.06.0 PEG 12 노닐페닐에테르PEG 12 nonylphenyl ether 0.30.3 폴리솔베이트 60Polysorbate 60 0.30.3 방부제, 색소, 향료Preservative, coloring, flavoring 적량Quantity 정제수Purified water to 100to 100

이상 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 피부백삼 에틸아세테이트 분획물을 함유하여 미백활성이 높으면서도 세포독성이 적은 미백용 조성물을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 피부백삼 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 하는 피부 미백용 화장료는 인체 피부에 대한 안전성을 갖는 동시에 우수한 미백 효과를 제공할 수 있으므로 피부 미백을 위한 기능성 화장료로서 사용될 수 있는 효과가 있다. As described in detail above, the present invention can provide a whitening composition containing skin white ginseng ethyl acetate fraction with high whitening activity and low cytotoxicity. In addition, the skin whitening cosmetics using the skin white ginseng ethyl acetate fraction according to the present invention as an active ingredient can be used as a functional cosmetic for skin whitening because it can provide safety and whitening effect on human skin. .

Claims (10)

피부 백삼의 에틸 아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.Skin whitening composition comprising the ethyl acetate fraction of skin white ginseng as an active ingredient. 제1항에 있어서, 상기 피부 백삼의 에틸 아세테이트 분획물이 피부 백삼의 추출물을 에틸 아세테이트와 물 용매를 혼합한 후, 얻어진 에틸 아세테이트 가용성 분획물인 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.The skin whitening composition according to claim 1, wherein the ethyl acetate fraction of skin white ginseng is an ethyl acetate soluble fraction obtained after mixing the extract of skin white ginseng with ethyl acetate and a water solvent. 제2항에 있어서, 상기 피부 백삼의 추출물이 50~90 % 알콜/증류수 혼합용매로 추출한 추출물인 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.The skin whitening composition according to claim 2, wherein the extract of skin white ginseng is an extract extracted with a 50-90% alcohol / distilled water mixed solvent. 제3항에 있어서, 상기 알콜이 메탄올인 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.The composition for skin whitening according to claim 3, wherein the alcohol is methanol. 제3항에 있어서, 상기 피부 백삼의 추출물이 18~28℃의 온도에서 1~2 시간씩 2~5 반복하여 초음파 추출된 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.The composition for skin whitening according to claim 3, wherein the extract of skin white ginseng is ultrasonically extracted by repeating 1 to 2 hours at a temperature of 18 to 28 ° C. for 2 to 5 hours. 제1항에 있어서, 상기 피부 백삼의 에틸 아세테이트 분획물이 감압 농축후 동결 건조된 상태로 사용되는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.The composition for skin whitening according to claim 1, wherein the ethyl acetate fraction of skin white ginseng is used in a freeze-dried state after concentration under reduced pressure. 제1항에 있어서, 상기 피부 백삼의 에틸 아세테이트 분획물이 The method of claim 1, wherein the ethyl acetate fraction of skin white ginseng a) 피부 백삼 시료를 마쇄한 후 메탄올/증류수 혼합용매를 이용하여 추출하는 단계;a) grinding the skin white ginseng sample and extracting the mixture using a methanol / distilled water mixed solvent; b) 상기 추출물을 여과하고, 감압농축하는 단계;b) filtering the extract and concentrating under reduced pressure; c) 상기 농축된 추출물을 에틸 아세테이트 가용성 분획과 물 가용성 분획으로 나누는 단계; 및 c) dividing the concentrated extract into an ethyl acetate soluble fraction and a water soluble fraction; And d) 상기 에틸 아세테이트 가용성 분획을 분리하고 감압농축하여 피부 백삼의 에틸 아세테이트 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물. d) separating the ethyl acetate soluble fraction and concentrating under reduced pressure to obtain an ethyl acetate fraction of skin white ginseng. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 신남산을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.The composition for skin whitening according to claim 1, wherein the composition contains cinnamic acid as an active ingredient. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 의한 피부 미백용 조성물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 미백 화장료 조성물.A skin whitening cosmetic composition comprising the composition for skin whitening according to any one of claims 1 to 8 as an active ingredient. a) 피부 백삼 시료를 마쇄한 후 메탄올/증류수 혼합용매를 이용하여 추출하는 단계;a) grinding the skin white ginseng sample and extracting the mixture using a methanol / distilled water mixed solvent; b) 상기 추출물을 여과하고, 감압농축하는 단계;b) filtering the extract and concentrating under reduced pressure; c) 상기 농축된 추출물을 에틸 아세테이트 가용성 분획과 물 가용성 분획으로 나누는 단계; 및 c) dividing the concentrated extract into an ethyl acetate soluble fraction and a water soluble fraction; And d) 상기 에틸 아세테이트 가용성 분획을 분리하고 감압농축하여 피부 백삼의 에틸 아세테이트 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 인삼 추출물의 제조방법. d) separating the ethyl acetate soluble fraction and concentrating under reduced pressure to obtain an ethyl acetate fraction of skin white ginseng.
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