KR20080039872A

KR20080039872A - Ｎ-아실계 아미노산 유도체, 이의 생산방법, 약리학적조성물 및 항알러지제, 소염제 및 저지질혈제 형태에서의용도

Info

Publication number: KR20080039872A
Application number: KR1020087001210A
Authority: KR
Inventors: 블라디미르 에브제니에비치 네볼씬; 타트야나 알렉산드로브나 크로모바; 갈리나 알렉산드로브나 젤투키나; 비올레타 레오니도브나 코바레바
Original assignee: 오트크라이토에 악치오네르노에 오브스체스트보 '오테체스트베니에 레카르스트바'; 블라디미르 에브제니에비치 네볼씬
Priority date: 2005-06-15
Filing date: 2006-06-15
Publication date: 2008-05-07
Also published as: EP1905763A1; EP1905763B1; JP2008543830A; RU2335495C2; EA013057B1; US20100267962A1; RU2005118635A; CN101243053B; JP5836995B2; US8318950B2; CN101243053A; EP1905763A4; US20080319040A1; CA2612324C; UA94586C2; US8940780B2; EA200800054A1; JP2013151551A; KR101402855B1; WO2006135280A1

Abstract

본 발명은 하기 화학식 I로 표시되는 N-아실 아미노산 유도체 및 이의 약학적 허용성 염; 이들을 제조하는 신규 방법; 항알러지, 항아나필락시스, 항염증 및 저지질혈제로서의 용도; 전술한 화합물을 유효량으로 함유하는 약학적 조성물; 알러지 및 염증 질환, 지질 대사 장애, 즉 기관지 천식, 알러지 비염, 화분증, 계절성 및 연중 비염, 알러지 폐렴, 아토피성 피부염, 건선, 두드러기, 곤충 쏘임 및 약제에 대한 알러지(아나필락시스 포함) 반응, 한랭 알러지, 알러지 결막염, 죽상동맥경화증, 비만, 허혈성 심질환 및 뇌질환, 심근 경색 및 발작을 치료하는 방법에 관한 것이다:

화학식 I

여기서, n은 2 또는 3이고;

R₁은

또는

이며;

R₂는 H, -CH₃, -C₂H₅이다.

N-아실 아미노산 유도체, 알러지, 염증. 고지질혈증

Description

Ｎ-아실계 아미노산 유도체, 이의 생산방법, 약리학적 조성물 및 항알러지제, 소염제 및 저지질혈제 형태에서의 용도{N-ACYLIC AMINOACID DERIVATIVES, METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF, PHARMACOLOGICAL COMPOSITION AND THE USE IN THE FORM OF ANTI-ALLERGIC, ANTI-INFLAMMATORY AND HYPOLIPIDEMIC AGENTS}

본 발명은 생물유기화학 분야에 관한 것으로서, N-아실계 아미노산 유도체 및 이의 약학적 허용성 염, 이 화합물들의 신규 합성방법은 물론 이들을 주성분으로 하는 약학적 조성물, 및 항알러지제, 소염제 및 저지질혈제로서의 의약에 사용되는 용도에 관한 것이다.

알러지 질환 및 지질 대사 장애는 나쁜 환경 상태, 영양물 구조 및 개체군의 생활 양식의 변화로 인해 현재 가장 널리 보급되어 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 이러한 병리 상태는 물론 알러지를 동반하는 염증 과정을 퇴치하기 위한 약물 개발의 문제는 아직 남아 있는 상태이다.

H1-히스타민 수용체 차단제는 항알러지 약물 중 가장 널리 보급된 그룹이다. 현재, 항히스타민 약물은 2 세대로 분류되어 있다[Mashkovsky M.D. Lekarstvennye sredstva (Medicaments)/ Moscow, the Novaya Volna publishers, 2005, p.285].

제1 세대의 항히스타민 약물은 혈액-뇌 장벽을 통과하며, 역진정 효과를 유 발하는 중추 신경계 세포의 H1 수용체 차단을 유도할 수 있다. 이 약물의 높은 혈중 농도는 고용량의 처방을 요하는 분명한 항히스타민 작용을 달성하는데 요구된다. 다소 빈번히 발생되는 반응급강현상, 협동 장애로 나타나는 CNS에 미치는 효과, 현기증, 무력감, 주위 집중력 저하는 이 약물의 좋지 않은 특징이다. 그럼에도 불구하고, 제1 세대의 항히스타민제는 특히 매우 급박한 치료 효과가 요구되는 상황, 예컨대 아나필락시스에서 여전히 사용되고 있다. 제1 세대 항히스타민 약물에는 디메드롤(디펜히드라민), 수프라스틴(클로로피라민), 타베질(클레마스틴) 및 펜카롤(키페나딘)이 있다.

제2 세대의 항히스타민 약물은 제1 세대 약물 고유의 부작용이 없기 때문에 알러지학적 진료 시에 많이 사용되고 있다. 특히, 제2 세대 약물은 혈액-뇌 장벽을 통과하지 않아서, 진정 효과 및 최면 효과를 나타내지 않는다. 이 약물은 빠르고 장기간 지속적인 항히스타민 작용을 특징으로 한다. 클라리틴(로라타딘), 지르텍(세티리스틴), 케스틴(에바스틴)이 이 제2 세대 항히스타민 약물에 속한다. 하지만, 임상 시험 수행 결과, 다른 약제와의 상호작용이나 P450 사이토크롬에 의해 유도된 대사 중단에 의해 유발되는 상기 약물의 부작용이 드러났다. 따라서,제2 세대 항히스타민제에서는 잠재적 진정 효과(세티리신, 로라타딘) 및 잠재적 심장독성 효과(테르페나딘, 애스테미솔(에바스틴))가 검출되었다.

기관지 천식 등의 몇몇 경우에는 강력한 항알러지 작용을 발휘하는 글루코코르티코이드가 사용된다. 하지만, 이 약물의 사용 시, 잇센코-쿠싱 증후군, 고혈압, 과칼륨혈증, 골다공증 등과 같은 전신 징후가 동반된다[Mashkovsky M.D. Lekarstvennye sredstva(Medicaments) Moscow, 1993, Vol.1, p.365].

알러지 반응 발달의 병리화학적 단계는 그 상당한 정도가 1차 알러지 표적 세포(호염기구 및 비만세포)의 활성화도에 의해 결정되는 것으로서, 알러지 질환의 발달에 특별한 역할을 한다. 이 단계의 중요한 특징은 자극(알러지 항원)의 효과 하에서 생물학적 활성 화합물, 무엇보다도 히스타민의 축적 및 방출 능력이다. IgE- 및/또는 IgG-매개의 항원에 대한 반응에서, 상기 세포들만이 즉시 알러지 임상 징후의 정도를 측정한다[Parker Ch.V./ Mediators: Release and Functions.// In: Immunology. Edited by W. Pole. Moscow, the Mir publishers. 1989. vol.3. pp.170-247; Chakravarty N.K.// In: The mast cell: Its role in health and disease, ed. J. Pepys. 1979. p.38-46].

기관지 천식과 기관지 경련 증상에 유용하며, 비만세포 탈과립 억제 능력 및 기관지 경련, 알러지 및 염증의 발달을 촉진하는 매개물질(브래디키닌, 히스타민)의 방출 방해 능력을 기반으로 하는 작용을 가진 일군의 약물도 있다(소듐 크로모글리케이트(크로모글릭산 이나트륨 염), 케토티펜, 옥사토마이드). 부작용으로서 점막 자극, 두통, 후두 부종, 기침, 질식이 관찰될 수 있다[Mashkovsky M.D. Lekarstvennye sredstva (Medicaments)/ Moscow, the Novaya Volna publishers, 2005, p.297].

전세계적으로 성인 사망률 원인 중 1위인 허혈성 심질환은 죽상동맥경화증의 가장 흔한 징후인 것으로 알려져 있다. "죽종형성성" 지단백으로 불리는 저밀도 지단백 콜레스테롤(LDLC) 및 초저밀도 지단백 콜레스테롤(VLDLC)을 비롯한 혈장 콜레 스테롤 수치 상승과 이와 동시에 "항죽종형성성" 지단백 함량의 감소로 나타나는 지질 대사 장애는 이 질환의 선도 장애 중 하나로서 인정되어 있다.

혈장 지질 함량과 비의 변화는 실질 기관의 막 구조에서 그 변경을 반영하는 것으로 밝혀졌다. 세포 막 조성, 예컨대 거대과립의 막 조성은 실험 동물에 제공되는 식이에 따라 직접적으로 달라진다[Wade A., Harred W.//Feder.Proct. 1976, vol.55, pp. 2475-2479]. 동물에게 콜레스테롤 투여는, 세포막에 콜레스테롤 축적을 유도하여 세포막의 유동성을 저하시키고, 결과적으로 효소들의 기능적 상태를 변경시킨다[Buters J.T.M., Zysset T., Reichen J.//Biochem. Pharmacol. 1993, vol. 46. Iss 6. pp. 983-991].

콜레스테롤과 트리글리세라이드의 혈액 수치를 저하시키는 저지혈증제는 지질 대사 장애와 관련 있는 질환의 치료 및 예방에 사용될 수 있다. 지질 대사 장애는 트리글리세라이드, 총 콜레스테롤, 저밀도 및 초저밀도 지단백 콜레스테롤(LDLC 및 VLDLC)의 수치 상승 및 죽상동맥경화증, 비만, 허혈성 심질환 및 뇌질환, 심근 경색, 발작과 질환에서 고밀도 지단백 콜레스테롤의 수치 저하를 특징으로 하며, 분명한 당뇨병과 혈전 형성의 위험 요인으로서 작용한다.

조코르(심바스타틴) 등과 같은 콜레스테롤 생합성 억제제인, 소위 스타틴의 임상 용도는 공지되어 있다. 주어진 그룹의 약물은 하루에 80mg 용량이 주로 총 콜레스테롤 수치 저하와 관련하여 충분히 효과적이지만, 이 약물은 생체이용율이 불량하고 신체에 이종성인 화학적 화합물이다. 더욱이, 이 약물의 사용은 간 기능의 변화 및 혈액 트란스아미나제 수치 상승 및 소화불량과 같은 부작용을 동반할 수 있다[Mashkovsky M.D. Medicaments./ Meditsina publishers. Moscow. 1993. vol.1. p.463].

따라서, 저농도에서 활성을 나타낼 수 있고 부작용이 없는 대체 작용 기전을 가진 새로운 효과적인 항알러지제 및 저지질혈제의 연구가 실제 절실히 요구된다. 이와 관련하여, 천연 기원의 물질의 잔기를 함유하는 화합물이 저독성과 낮은 부작용 발생율이 예상되는 바, 특별한 관심을 받고 있다.

국제 특허출원 공개번호 WO 99/01103에는 생체 아민의 N-아실 유도체, 예컨대 γ-글루타밀 히스타민 및 이의 가장 근접한 유사체인 글루타릴 히스타민의 항알러지 및 저지질혈 작용이 개시되어 있는데, 이 화합물들은 본 발명의 화합물과 구조 및 작용 면에서 가장 근접한 것이다. 논문[Krzhechkovskaya V.V., Zheltukhina G.A., Nebolsin V.E. et al. Study of anti-anaphylactic activity and mechanisms of action of ㅳ-L-glutamyl histamine. // Pathogenez (Pathogenesis). 2003. Vol.1 No 2, pp.60-64]에서는, γ-글루타밀 히스타민이 여러 동물 종과 투여 속도가 사용될 때 분명한 항 아나필락시스 활성이 있다는 것을 보여주었다. 수득된 결과는 γ-글루타밀 히스타민의 효과 하에, 동물의 비만 세포에서 히스타민 수치 및 이의 항원 자극 분비의 유의적인 저하가 일어난다는 것을 보여준다. 기관지 경련도의 대조군 대비 50% 이상의 감소가 항원 유도성 기관지 경련의 표시 정도에 미치는 글루타릴 히스타민 효과 검사에서 확인되었다. 즉각적인 효과는 50㎍/kg의 저 용량을 경구 및 기관내 경로로 투여할 때 분명하게 나타났다. 글루타릴 히스타민은 피동적 피부 아나필락시스의 징후를 저하시킬 수 있다. WO 99/01103에서 글루타릴 히 스타민은 50 내지 500㎍/kg의 용량으로 동물에게 투여 시, 지연 과민의 강도를 유의적으로 저하시키는 것으로 나타났다. 더욱이, 50 내지 500㎍/kg 용량에서 글루타릴 히스타민은 죽종형성성 부하량을 보유한 동물에 비해 총 콜레스테롤을 5 내지 7% 정도 저하시키는 약간의 항콜레스테롤혈증 활성을 보유했다.

글루타릴 히스타민의 단점은 가격이 비교적 비싸고 그 제조를 위한 원료 물질, 즉 히스타민의 생체이용율이 불량하다는 점이다. 더욱이, 이 물질은 앞에서 언급한 검사에서 효과가 불충분했다.

기술 수단의 축적을 확대하고 더욱 효과적이며 유용한 항알러지제, 항염증제 및 저지질혈제를 창안하기 위해, 본 발명자들은 국제출원 공개번호 WO 99/01103에 개시된 화학식 I로 표시되는 특정한 N-아실 아미노산 유도체를 밝힌 바 있지만, 글루타릴-L-히스티딘 메틸 에스테르(XII) 외에는 구체적으로 기술하거나 제조하거나 특성 분석된 것이 없다.

따라서, 본 발명의 화합물은 앞에서 지적한 국제출원의 화학식 I에 포함되는 것이다. 하지만, 지적한 공개 특허문헌에는 주어진 화합물의 특정 구조식이나 임의의 이화학적 특징이 제시된 바 없음은 물론 이의 제조방법도 개시된 바가 전혀 없다. 본 발명의 화합물은 유도성 세포 분화 활성을 있는, 국제출원 공개번호 WO 03/072124에 개시된 화합물의 일반 구조식에 속하는 것이다. 하지만, 제시된 공개문헌에는 그 합성 방법이나 임의의 이화학적 상수가 개시 및 제시된 바 없다.

화합물 중 하나인 글루타릴 히스타민은 펩타이드 Glt-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-poly-Lys이 합성에 사용되는 중간체로서 US 3,963,691에 개시된 His C-말단 메틸 에스테르[Glt-His(OMe)(XII)] 형태만을 언급하고 있다. 더욱이, 국제출원 공개번호 WO 99/01103에는 글루타릴-L-히스티딘 메틸 에스테르(XII)의 합성도 개시되고 이의 이화학적 특징도 제시되어 있다: ¹H-NMR, 질량분광분석, HPLC 데이터.

국제 출원 공개번호 WO 93/04690에는 숙시닐 히스티딘 화합물이 언급되고 있다. 이 공개문헌에 따르면, 유리 이미다졸 또는 숙시닐 히스티딘의 첨가가 카노신 및 디하이드록시아세톤 사이의 반응을 가속시킨다는 것을 보여준다. 하지만, 숙시닐 히스티딘의 합성 및 이의 이화학적 상수는 제시되어 있지 않다.

숙시닐 트립토판의 구조식은 US 출원 2005079515에 언급되어 있다. 하지만, 이 공개 문헌에는 숙시닐 트립토판의 합성이나 이화학적 상수에 대해서는 제시되어 있지 않다.

저널 ["Byuleten' experimental'noy biologii i meditsiny", 1998, vol.125, No 5, pp.544-547]에는 항허혈 작용 및 항저산소증 작용을 제공하고 급성 심근 허혈증의 혈류역학적 매개변수를 안정시키는, 항부정맥 및 항세동 활성이 있는 N-숙시닐-d,l-트립토판의 디포타슘 염이 개시되어 있다.

저널[Justus liebigs annalen der chemie, 1966, Band 691. P. 159-164]에는, 라세미체 숙시닐 트립토판이 개시되어 있다.

저널[Tetrahedron, 2005, v.61, No4, P.919-926]에는 숙시닐-L-트립토판 및 숙시닐-D-트립토판의 이화학적 특징이 제시되어 있다. 하지만, 이의 생물학적 활성 에 대한 임의의 정보는 부족한 상태이다.

논문[Joseph R.Votano et al. Inhibition of deoxyhemoglobin S polymerization by biaromatic peptides found to associate with the hemoglobin molecule at a preferred site, Biochemistry, 1977, v.16, No.25, pp.5484-5491]에는 숙시닐-L-트립토판이 언급되어 있고, 이 트립토판이 데옥시헤모글로빈에 결합하는 능력이 연구되어 있다.

논문[Dongmei H., Chao W., Ming Z., Shiqi P. Synthesis and analgesic activity of N,N'-dicarbonyltryptamines. Prep. Biochem. & Biotechnol., 2000, V.30(3), P.231-240]에는 디메틸아민 피리딘의 존재 하에 트립토판 메틸 에스테르와 숙신산 무수물로부터 시작되고 이어서 표적 산물을 크로마토그래피 정제하는, N^α-숙시닐-L-트립토판 메틸 에스테르(XI)의 합성에 대해 개시되어 있다. N^α-숙시닐-L-트립토판 메틸 에스테르는 이화학적 데이터, 즉 H-NMR-, IR-분광분석법, 질량분광분석법, 융점 및 원소분석 데이터를 통해 특성규명되어 있다.

글루테릴-L-트립토판 메틸 에스테르(XIII)는 논문[Raimondi S., Monti D., Pagnoni U.M., Riva S. Glutaryl acylases: One-reaction enzymes or versatile enantioselective biocatalysts? Adv. Synth. Catal. 2003. V.345(6-7). P.783-789]에 언급되어 있지만, 전형적인 합성 기술만이 제시되어 있고 이화학적 상수 중에서 ¹H-NMR만이 제시되고 있다. 이 화합물(XIII)은 글루타릴 아실라제의 기질로서 합성되었다.

N^α-글루타릴-L-히스타민의 제조는 국제출원 공개번호 WO 99/01103에 개시되어 있는데, 그 공정은 무수 N,N-디메틸 포름아미드의 매질 내에서 글루타르산 무수물을 이용한 생체 아민의 N-아실화이다. 더욱이, 간행물[Gershkovich A.A., Kibirev V.K.//Chemical synthesis of peptides./Kiev, Naukova Dumka publishers, 1992, p.360]에는, 수성-유기, 강알칼리성 매질에서 아미노산을 아실화하는 방법이 개시되어 있다.

간행물[Sorm F., Pravda Z. Proteins and amino acids. X. Synthesis of two peptide analogs.//Chemicke Listy pro Vedu a Prumysl. 1951. V.45. P.423-425]에는 약알칼리성 pH를 유지하기 위한 NaHCO₃의 존재 하에 티로신 에틸 에스테르 클로로하이드레이트와 글루타르산 무수물로부터 물과 에틸아세테이트 1:1 혼합물 중의 숙신닐 티로신 에틸 에스테르를 합성하는 방법이 개시되어 있다.

카르복시산 무수물을 이용한 유리 히스티딘 아실화에 대해서는 이 문헌에 개시되어 있지 않다.

본 발명의 목적은 저용량에서 항알러지 작용, 항염증 작용 및 저지질혈 작용을 나타내고 부작용이 없는 새로운 효과적인 N-아실 아미노산 유도체 및 이의 약학적 허용성 염, 이를 주성분으로 하는 약학적 조성물, 더욱 효과적인 항알러지제, 항염증제 및 저지질혈제로서의 용도, 뿐만 아니라 N-아실 아미노산 유도체의 신규 합성 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 고체 형태의 글루타르산 무수물 또는 숙신산 무수물을 무기 및 유기 염기의 부재 하에 아미노산 수용액에 첨가하여 목표 산물을 55 내지 60%의 충분히 높은 수율로 수득하는, 화학식 I 화합물의 간단하고 효과적인 합성 방법을 개발했다.

본 발명자들은 히스티딘 수용액 또는 트립토판 염과 아실화제가 과량으로 사용된 적당한 유기 용매 중의 아실화제 용액으로 이루어진 2상 시스템에서의 반응인, N-아실 히스티딘 및 트립토판 유도체를 비롯한 화학식 I 화합물의 1 이상의 합성 방법을 개발했다.

본 발명은 항알러지, 항염증 및 저지질혈 작용을 나타내는 하기 화학식 I로 표시되는 신규 N-아실 아미노산 유도체, 이의 약학적 허용성 염에 관한 것이다:

화학식 I

여기서, n은 2 또는 3이고;

R₁은

또는

이며;

R₂는 H, -CH₃, -C₂H₅이다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 a로 표시되는 아미노산 수용액에 고체 형태의 글루타르산 또는 숙신산 무수물을 첨가하고, 경우에 따라 목표 산물을 이의 염으로 변환시키는 것을 포함하는, 화학식 I로 표시되는 N-아실 아미노산 유도체의 제조방법에 관한 것이다:

화학식 a

여기서, R₁은

을 나타낸다.

또한, 본 발명은 수불혼화성 유기 용매 중에서 하기 화학식 a로 표시되는 아미노산 수용액과 글루타르산 무수물 또는 숙신산 무수물을 2상 시스템으로 반응시키고, 경우에 따라 목표 산물을 이의 염으로 변환시키는 것을 포함하는, N-아실 아미노산 유도체 및 이의 염의 제조방법에 관한 것이다:

화학식 a

여기서, R₁은

또는

을 나타낸다.

또한, 본 발명은 항알러지제, 항염증제 및 저지질혈제로서 화학식 I의 화합물 및 이의 약학적 허용성 염의 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적 허용성 염의 유효량과 필요한 경우 약학적 허용성 담체를 함유하는, 항알러지, 항아나필락시스, 항염증 및 저지질혈 작용을 나타내는 제제 및 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 1 이상의 목적은 화학식 I 화합물 또는 이의 약학적 허용성 염의 유효량을 검체에게 투여하는 것을 포함하는, 기관지 천식, 알러지 비염, 화분증, 계절성 비염, 연중 비염, 아토피 피부염, 건선, 두드러기, 곤충 쏘임 및 약제에 대한 알러지(예컨대, 아나필락시스) 반응, 한랭 알러지, 알러지 결막염, 만성 폐색성 폐 질환, 일명, 만성 폐색성 기관지염, 폐기종, 폐쇄성 기관지염, 점액성 점착증, 뿐만 아니라 지질 대사 장애와 관련된 질환, 즉 죽상동맥경화증, 비만, 허혈성 심질환 및 뇌질환, 심근 경색, 발작 등의 알러지 질환의 치료 방법이다.

화학식 I의 바람직한 화합물은 표 1에 제시했다.

표 1

화학식 I의 화합물의 합성은 2가지 방법으로 달성할 수 있다. 제1 방법은 하기 화학식으로 표시되는 아미노산 수용액에 고체 형태의 글루타르산 무수물 또는 숙신산 무수물을 서서히 첨가하고, 이어서 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여, 바람직하게는 반응 혼합물을 캣이오나이트 보유 컬럼을 통해 통과시켜 목표 산물을 분리한 후, 수용액으로부터 결정화하는 것으로 이루어진다.

(여기서, R₁은

을 나타낸다)

수득된 목표 산물의 결정은 적당한 용매, 바람직하게는 메탄올로 세척한다. 이 방법의 주요 장점은 알칼리 부재 하에 아미노산 수용액에서 이루어져, 가수분해로부터 일어나는 디카르복시산 무수물의 불활성화가 방지된다는 점이다. 더욱이, 그 아미노산 분자 중의 이미다졸 잔기는 아미노산의 아미노 기의 아실화 반응 중의 산성-염기성 자가촉매작용에 영향을 미칠 수 있다. 본 방법을 사용할 때 수득되는 다소 높은 수율(55 내지 60%)은 특히 과량으로 취해진 디카르복시산 무수물을 강력히 교반되는 반응물에 서서히 첨가함으로써 달성된다.

또한, 화학식 I의 화합물은 수불혼화성 용매 중의 글루타르산 무수물 또는 숙신산 무수물을 하기 화학식의 아미노산 수용액에 첨가하는 것을 포함하는 2상 시스템에서 대안적 방법을 이용하여 제조할 수 있다:

여기서, R₁은

또는

을 나타낸다.

이 방법은 과량의 아실화제를 사용하는 방법으로서, 아미노산의 α-아미노 기의 완전한 아실화 및 약 70% 수율의 목표 산물을 달성한다. 필요한 pH를 유지하기 위해, 무기 알칼리 대신에 무수물을 가수분해하지 않으며 또한 아실화의 촉매인 것으로 알려진 유기 염기 피리딘을 사용한다. 피리딘을 사용하면 반응 산물과 함께 수성 상에 남는 무기 염에 의한 최종 산물의 오염을 피할 수 있다. 이처럼 사용된 시도는 반응하지 않은 무수물과 각 아미노산으로부터 목표 산물을 간단하게 분리할 수 있게 하고, 간단한 결정화로 목표 산물을 분리할 수 있게 한다.

바람직한 수불혼화성 유기 용매는 부탄올, 에틸아세테이트 및 클로로포름이다.

표적 산물의 결정화에 유용한 바람직한 용매는 물-알콜 혼합물, 특히 물-에탄올이다.

본 발명의 아미노산 에스테르의 N-아실 유도체는 디카르복시산의 각각의 내부 무수물을 유기 또는 물-유기 매질 중에서 아미노 유리 히스티딘 또는 트립토판 에스테르에 작용시켜 제조할 수 있다. 수불혼화성 유기 용매, 부탄올, 에틸아세테이트 및 클로로포름을 이용하여 2상 시스템에서 화합물 VI-XIII을 제조하는 것이 바람직하다.

또한, 화학식 I의 화합물은 문헌에 널리 개시된 통상적인 공정을 이용하여, 예컨대 수산화나트륨, 수산화칼륨, 탄산마그네슘, 수산화리튬, 탄산칼슘과 반응시킴으로써 약학적 허용성 염 형태로 제조할 수도 있다.

화학식 I의 화합물은 항알러지, 항염증 및 저지질혈 활성이 있고, 따라서 알러지 질환, 아나필락시스 질환, 예컨대 염증 동반 질환, 및 지질 대사 장애의 치료에 사용할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 화합물은 다음과 같은 알러지 질환의 치료에 사용할 수 있다: 기관지 천식, 알러지 비염, 화분증, 계절성 비염, 연중 비염, 아토피 피부염, 건선, 두드러기, 곤충 쏘임 및 약제에 대한 알러지(예컨대, 아나필락시스) 반응, 한랭 알러지, 알러지 결막염, 만성 폐색성 폐 질환, 일명, 만성 폐색성 기관지염, 폐기종, 폐쇄성 기관지염, 점액성 점착증, 뿐만 아니라 지질 대사 장애와 관련된 질환, 예컨대 죽상동맥경화증, 비만, 허혈성 심질환 및 뇌질환, 심근 경색 및 발작.

본 발명의 화합물은 원하는 치료 결과를 제공하는 유효량으로 투여한다.

기관지 천식, 알러지 비염, 화분증, 계절성 비염, 연중 비염, 아토피 피부염, 건선, 두드러기, 곤충 쏘임 및 약제에 대한 알러지(예컨대, 아나필락시스) 반응, 한랭 알러지, 알러지 결막염, 만성 폐색성 폐 질환, 일명, 만성 폐색성 기관지염, 폐기종, 폐쇄성 기관지염, 점액성 점착증, 뿐만 아니라 지질 대사 장애와 관련된 질환, 즉 죽상동맥경화증, 비만, 허혈성 심질환 및 뇌질환, 심근 경색, 발작 등의 알러지 질환을 치료하기 위해, 화학식 I의 화합물은 비독성 약학적 허용성 담체를 함유하는 단위 투약량 형태로 경구, 국소, 비경구, 비측, 흡입에 의해 또는 직장을 통해 투여될 수 있다. 본 명세서에 사용된, "비경구 투여"란 용어는 피하, 정맥내, 근육내 또는 복강내 주사 또는 주입을 의미한다.

본 발명의 화합물은 1일 0.01 내지 10mg/kg(체중)의 용량, 바람직하게는 0.05 내지 5mg/kg의 용량으로 환자에게 1일 1회 이상 투여될 수 있다.

이와 동시에, 각 특정 환자에 대한 특별한 용량은 사용된 소정 화합물의 활성, 연령, 체중, 성별, 일반적인 건강 상태 및 환자의 영양 섭생, 약제의 투여 시간 및 경로, 신체로부터의 제거율, 사용된 약제들의 특정 조합 및 소정 개체에서 치료되어야 하는 질환의 병도를 비롯한 다양한 요인에 따라 달라질 것이라는 것을 유념해야 한다.

본 발명의 약학적 조성물은 화학식 I의 화합물을 원하는 결과를 달성하기에 효과적인 양으로 함유하며, 활성 성분으로서 본 발명의 화합물을 근육내, 정맥내, 경구, 설하, 흡입, 비강내 및 수막강내 투여에 적합한 담체 또는 부형제와 함께 함유하는 단위 투약량 형태(예컨대, 고형, 반고형 또는 액형)로 투여할 수 있다. 활성 성분은 용액제, 정제, 환약, 캡슐, 당제, 좌약, 유제, 현탁제, 연고, 젤 및 임의의 다른 투약 형태를 제조하는데 적합한, 종래 사용된 비독성 약학적 허용성 담체와 함께 조성물에 포함될 수 있다.

부형제로서, 여러 물질, 예컨대 글루코스, 락토스 또는 슈크로스와 같은 당류, 만니톨 또는 소르비톨, 셀룰로스 유도체 및/또는 칼슘포스페이트, 예컨대 트리칼슘포스페이트 또는 산성 칼슘포스페이트를 사용할 수 있고, 결합 성분으로서, 전분페이스트, 예컨대 옥수수, 밀, 쌀, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸트, 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 소듐 카르복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈과 같은 물질을 사용할 수 있다. 필요하다면, 붕해제, 예컨대 앞에서 언급한 전분 및 카르복시메틸 전분, 가교된 폴리비닐피롤리돈, 아가 또는 알긴산 또는 이의 염, 예컨대 알긴산나트륨을 사용할 수도 있다.

유동성 조절제 및 윤활제, 예컨대 실리카, 탈크, 스테아르산 및 이의 염, 예를 들어 스테아르산마그네슘 또는 스테아르산칼슘 및/또는 프로필렌글리콜과 같은 선택적 첨가제를 사용할 수도 있다.

코어는 일반적으로 위액의 작용에 내성적인 층으로 코팅한다. 이를 위해, 당류 농축액을 사용할 수 있으며, 이 용액은 경우에 따라 아라비아 검, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 이산화티탄, 및 적당한 유기 용매 또는 이의 혼합물을 포함할 수도 있다.

첨가제로서, 안정제, 증점제, 착색제 및 향미제도 사용할 수 있다.

연고 기제로서, 탄수화물 연고 기제, 예컨대 백색 및 황색 바셀린(Vaselinum album, Vaselinum flavum), 바셀린 오일(Oleum Vaselini), 백색 및 액체 연고(Unguentum album, Unguentum flavum)를 사용할 수 있으며, 더욱 치밀한 충만감을 위해, 경질 파라핀 및 왁스, 흡착 연고 기제, 예컨대 친수성 바셀린(Vaselinum hydrophylicum), 라놀린(Lanolinum), 콜드크림(Unguentum leniens), 물로 세척가능한 연고 기제, 예컨대 친수성 연고(Unguentum hydrophylum); 수용성 연고 기제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 연고(Unguentum Glycolis Polyaethyleni), 벤토나이트 기제 등을 사용할 수 있다.

젤용 기제로서, 메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스 나트륨염, 옥시프로필셀룰로스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 옥사이드 및 카르보폴을 사용할 수 있다.

좌약용 기제로서, 불수용성 기제, 예컨대 코코아버터; 수용성 또는 수혼화성 기제, 예컨대 젤라틴-글리세롤 또는 폴리에틸렌 옥사이드 및 혼합(비누-글리세롤)을 사용할 수 있다.

단위 투약 형태의 제조 시에, 담체와 함께 사용되는 활성 성분의 함량은 치료를 받는 수용체, 약제의 특정 투여 경로에 따라 달라질 수 있다.

즉, 주사용 용액 형태로 본 발명의 화합물을 사용할 때, 활성 성분의 함량은 0.01 내지 5%이다. 희석제로는, 0.9% 염화나트륨 용액, 증류수, 주사용 노보카인 용액, 링거액, 포도당액 및 용해를 위한 특수 첨가제를 사용할 수 있다. 본 발명의 화합물을 정제 및 좌약의 형태로 체내에 투여할 때에는 그 함량은 단위 투약 형태당 5.0 내지 500.0mg 범위이다.

본 발명의 투약 형태는 표준 기술, 예컨대 혼합, 과립화, 당제 제조, 용해 및 동결건조 공정 등에 따라 제조한다.

특히, 본 발명의 화합물은 비교용으로 사용된 공지의 약물보다 2 내지 3배 낮은 용량에서 사실상 유사한 효능의 생물학적 활성을 나타내며, 어떠한 부작용도 검출되지 않았고, 그 사용 시의 금기사항도 발견되지 않았다. 이와 동시에, 본 발명에 따라 화합물의 독성 검사 시, 3,000mg/kg의 경구 용량에서도 실험 동물의 사망을 기록되지 않았다.

본 발명에 따른 화합물, 이의 제법 및 약리학적 활성 연구에 대한 상세한 설명은 이하 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니라 본 발명의 바람직한 구체예를 설명하고자 한 실시예를 통해 제시된다.

도 1은 지방 주입량과 화합물 IV의 다른 용량(50 내지 1,500㎍/kg)에 의해 나타난 혈청 총 콜레스테롤 수치의 변화. 가는 수직선은 평균값의 표준 편차를 나타낸다.

화학식 I의 N-아실 유도체의 합성예

제조한 화합물의 특성은 메탄올(1), 클로로포름-메탄올-암모니아(4:3:1)(2)의 시스템에서 평판 "Kieselgel 60 F₂₅₄" "Merck"(독일)을 이용한 TLC법으로 검사했다.

크로마토그램은 클로로톨리딘 시약, 닌하이드린, 요오드로 발색시키고 자외선 하에서 발광시켜 확인했다.

광회전각은 편광기 "Perkin Elmer 341"(스웨덴)로 측정했다.

¹H-NMR은 "AMX-400 Bruker"(독일) 장치를 이용하여 기록했다.

융점은 "Boetius"(독일) 장치를 이용하여 측정했다.

분석용 HPLC는 "System Gold"("Beckman", 미국) 장치를 이용하여 다음과 같이 수행했다: 용출 속도 0.25ml/min; 다음과 같은 조건 하에 214nm에서 검출: 컬럼 Ultrasphere ODS "Beckman" 2x250mm, 5㎛, 0.1% TFA로 용출, 용출 속도 0.25ml/min(1): 용출 속도 1ml/min, 다음과 같은 조건 하에 220nm에서 검출; 컬럼 Luna-5 "Phenomenex", C₁₈, 250x4.6mm, 0.05M 인산염 완충액(pH 3.0) 중의 25% 아세토니트릴로 용출(2).

실시예 1

N ^α - 글루타릴 -L-히스티딘(IV)

기술 A

히스티딘 103.4g(0.67mmol)을 물 400ml에 용해시킨 용액에 글루타르산 무수물 83.7g(0.73mol)을 첨가했다. 이 현탁액을 1시간 동안 교반하고, 형성된 용액을 부피가 150ml가 되도록 비등가열하고, 냉장고에 넣어 16시간 동안 방치했다. 침전물을 여과하여 에탄올 150ml로 세척하고 건조했다. 정제는 H⁺ 형태의 수지 Purolight를 이용한 이온 교환 크로마토그래피에서 용출제로서 물을 이용하여 수행했다. 목표 산물을 함유하는 분획을 합하여, 침전이 시작될 때까지 비등가열하고, 4℃에서 16시간 동안 방치했다. 침전물을 여과한 후, 메탄올 200ml로 세척하고, 일정한 중량이 될 때까지 건조했다. 수율 98.8g(55%). R_f 0.55 (1), 0.37 (2). T_m.p.=222-224℃. [α]_D ²⁰+15.95°(C 0.53, 물). [M+H]⁺ 270.1. ¹H-NMR 스펙트럼(D₂O), δ, m.d.: 1.60-1.80 (m, 2H, β-CH₂-Glt), 2.10-2.25 (m, 4H, α,γ-CH₂-Glt), 2.90-3.25 (m, 2H, β-CH₂-His), 4.40-4.50 (m, 1H, α-CH-His), 7.15 (s, 1H, CH-4-Im), 8.50 (s, 1H, CH-2-Im). 실측치, %: C 49.18; H 5.91; N 15.42. C₁₁H₁₅N₃O₅. 이론치, %: C 49.07; H 5.62; N 15.61.

기술 B

히스티딘 0.3g(1.93mmol)을 강력한 교반 하에 물 5ml에 용해시킨 현탁액에, 에틸아세테이트 2.5ml에 용해한 글루타르산 무수물 0.44g(3.86mmol)을 첨가했다. 이 현탁액을 2시간 동안 교반하고, 피리딘으로 pH를 7로 조정한 뒤, 다시 1시간 동안 교반했다. 에틸아세테이트 층과 수성 층을 분리했다. 수성 층은 에스테르로 2회 세척하고, 에스테르 층은 제거했다. 물은 진공 제거하고, 침전물은 최소량의 물에 용해한 뒤, 백색 침전물이 침강되기 시작하기 전에 에탄올을 첨가하고 20시간 동안 +4℃에서 방치했다. 침전물을 여과하고, 진공하에 건조했다. 수율 0.36g(70%). R_f 0.56 (1), 0.35 (2). T_m _.p.=219-221℃. [α]_D ²⁰= +15.71°(C 0.56, 물). [M+H]⁺ 270.1. ¹H-NMR 스펙트럼(D₂O), δ, m.d.: 1.40-1.55 (m, 2H, β-CH₂-Glt), 1.90-2.0 (m, 4H, α,γ-CH₂-Glt), 2.7-3.0 (m, 2H, β-CH₂-His), 4.20-4.30 (m, 1H, α-CH-His), 6.95 (s, 1H, 4-CH-Im), 8.30 (s, 1H, 2-CH-Im). 조건 (1) 하에서의 HPLC : 각 피크, 체류 시간 14.55 min. 실측치, %: C 49.07; H 5.65; N 15.65. C₁₁H₁₅N₃O₅. 이론치, %: C 49.07; H 5.62; N 15.61.

실시예 2

N ^α - 숙시닐 -L-히스티딘(V)

합성은 화합물 IV에서 제시한 기술 A에 따라 수행했다.

수율 0.08g(57%).

R_f 0.44 (1), 0.25 (2).

T_m _.p.=179-181℃.

[α]_D ²⁰= +30.71°(C 0.56, 물).

[M]⁺ 255.2.

¹H-NMR 스펙트럼(D₂O), δ, m.d.: 2.15-2.30 (m, 4H, (CH₂)₂-Suc), 2.75-2.95 (m, 2H, β-CH₂-His), 4.25 (br.s, 1H, α-CH-His), 6.95 (s, 1H, 4-CH-Jm), 8.25 (s, 1H, 2-CH-Jm).

실측치, %: C 47.09; H 5.04; N 16.40. C₁₀H₁₃N₃O₅. 이론치, %: C 47.06; H 5.13; N 16.46

합성은 화합물 IV에서 수행된 기술 B에 따라 수행했다.

수율 0.101g(67%).

R_f 0.45 (1), 0.27 (2).

T_m _.p.=178-180℃.

[α]_D ²⁰= +30.8°(C 0.57, 물).

조건 (1) 하에서의 HPLC - 각 피크, 체류 시간 7.54min.

실측치 %: C 47.15; H 5.2; N 16.50. C₁₀H₁₃N₃O₅.

이론치 %: C 47.06; H 5.13; N 16.46.

실시예 3

N ^α - 글루타릴 트립토판(III)

트립토판 1.0g(4.9mmol)을 물 7ml에 현탁시킨 현탁액에 1N NaOH 용액(4.9mmol)을 적가했다. 준비된 용액에, 에틸아세테이트 3ml 중의 글루타릭 알데하이드 0.56g(4.9mmol) 용액을 첨가했다. 반응 혼합물을 암실의 아르곤 하에서 실온에서 3시간 동안 교반하고, +4℃에서 16시간 동안 방치했다. 반응 혼합물로부터 진공 하에 용매를 제거했다. 수득되는 오일상 잔류물을 교반 중인 물 30ml에 용해하고, 0℃까지 냉각한 다음, 1N HCl을 첨가하여 pH를 4까지 조정했다. 산물을 에틸아세테이트(3x25ml)로 추출했다. 합한 에틸아세테이트 추출물을 0℃까지 냉각하고, 물로 세척하여(4x25ml) pH를 7로 조정하고, 5% HCl(5ml)로 세척한 뒤, 물로 세척하여(4x25ml) pH를 7.0으로 조정한 다음, 무수 Na₂SO₄ 상에서 1시간 동안 건조했다. Na₂SO₄ 잔류물을 여과하고, 에틸아세테이트로 세척한 뒤, 용매를 진공 제거했다. 회색빛 고체 침전물을 수득되었고 진공 건조했다.

수율 1.0g(70%)

R_f 0.54(1).

T_m _.p. = 150-152℃.

[α]_D ²⁰= +8.20°(C 0.5, 메탄올).

¹H-NMR 스펙트럼(CD₃OD), δ, m.d.: 1.75-1.84 (m, 2H, β-CH₂-Glt), 2.15-2.30 (m, 4H, α,γ-CH₂-Glt), 3.30-3.40 (m, 2H, β-CH₂-Trp), 3.80-3.90 (m, 1H, α-CH-Trp), 6.97(t, J=7Hz, 1H, CH-6-Ind), 7.06 (t, J=7 Hz, 1H, CH-7-Ind), 7.15 (d, J=7 Hz, 1H, CH-2-Ind), 7.33 (d, J=7 Hz, 1H, CH-5-Ind), 7.55 (d, J=7 Hz, 1H, CH-8-Ind).

조건 (2) 하에서의 HPLC - 각 피크, 체류 시간 6.77min.

실측치, %: C 60.07; H 5.65; N 8.75. C₁₆H₁₈N₂O₅

이론치, %: C 60.37; H 5.7; N 8.8.

실시예 4

N ^α - 숙시닐 -L-트립토판(II)

합성은 화합물 III에 제시된 기술에 따라 수행했다.

수율 100.5mg(67%)

R_f 0.63(1).

[α]_D ²⁰= +21.05°(C 0.6, 물).

¹H-NMR 스펙트럼(DMSO-d₆), δ, m.d.: 2.33-2.41 (d, 4H, α,β-CH₂-Suc), 2.93-3.01 (d, 1H, β-CH₂-Trp), 3.10-3.16 (m, 1H, β-CH₂-Trp), 4.39-4.47 (m, 1H, α-CH-Trp), 6.93-7.06 (m, 2H, CH-6,7-Ind), 7.11 (d, J=2.2 Hz, 1H, CH-2-Ind), 7.30-7.32 (m, 1H, CH-5-Ind), 7.44-7.47 (m, 1H, CH-8-Ind). [M]⁺ 304.3.

조건 (2) 하에서의 HPLC - 각 피크, 체류 시간 6.35min.

실측치, %: C 59.07; H 5.65; N 9.35. C₁₅H₁₆N₂O₅

이론치, %: C 59.21; H 5.3; N 9.21.

실시예 5

N ^α - 글루타릴 -L-히스티딘 모노소듐 염(IV)

N^α-글루타릴-L-히스티딘 1.0g(3.7mmol)을 물 15ml에 용해한 용액에, 물 20ml 중의 0.15g(3.7mmol) NaOH 용액을 교반 중에 첨가하고 +5℃까지 냉각했다. 이 용액을 30분 동안 교반하고, 용매를 진공 제거했다. 오일상 잔류물에 벤젠을 분할 첨가하고, 용매를 진공 제거했다. 고체 잔류물을 과립상 알칼리 상에서 건조했다.

수율 1.07g(99.7%)

T_m _.p. = 208-210℃.

[α]_D ²⁰= +16.27°(C 0.58, 물).

실측치, %: C 45.25; H 5.51; N 14.52. C₁₁H₁₅N₃O₅Na.

이론치, %: C 45.21; H 5.17; N 14.38.

실시예 6

N ^α - 숙시닐 -L-히스티딘 모노소듐 염(V)

합성은 N^α-글루타릴-L-히스티딘 모노소듐 염(IV)(실시예 5)에 제시된 기술에 따라 수행했다.

수율 1.06g(97.0%)

[α]_D ²⁰= +40.21°(C 0.48, 물).

실측치, %: C 43.25; H 4.51; N 15.52. C₁₀H₁₃N₃O₅Na

이론치, %: C 43.17; H 4.71; N 15.10.

실시예 7

N ^α - 숙시닐 -L-트립토판 모노소듐 염(II)

수율 0.21g(98.0%)

T_m _.p. = 147-150℃

[α]_D ²⁰= +22.02°(C 0.39, 물).

실측치, %: C 55.25; H 4.51; N 8.32. C₁₅H₁₆N₂O₅Na.

이론치, %: C 55.05; H 4.93; N 8.56.

실시예 8

N ^α - 글루타릴 -L-트립토판 모노소듐 염(III)

수율 0.11g(99.0%)

T_m _.p. = 128-130℃

[α]_D ²⁰= +22.06°(C 0.34, 메탄올).

실측치, %: C 56.15; H 5.21; N 8.22. C₁₆H₁₈N₂O₅Na.

이론치, %: C 56.30; H 5.32; N 8.21.

조건 (2) 하에서의 HPLC - 각 피크. 체류 시간 6.96min.

실시예 9

N ^α - 글루타릴 -L-히스티딘 디소듐 염(IV)

N^α-글루타릴-L-히스티딘 1.0g(3.7mmol)을 물 15ml에 용해한 용액에, 물 15ml 중의 0.3g(7.44mmol) NaOH 용액을 교반 중에 첨가하고 +5℃까지 냉각했다. 이 용액을 30분 동안 교반하고, 용매를 진공 제거했다. 오일상 잔류물에 벤젠을 분할 첨가하고, 용매를 진공 제거했다. 고체 잔류물을 과립상 알칼리 상에서 건조했다.

수율 1.15g(99.0%)

[α]_D ²⁰= +11.92°(C 0.57, 물).

실측치, %: C 41.25; H 4.51; N 13.52. C₁₁H₁₅N₃O₅Na₂.

이론치, %: C 41.91; H 4.80; N 13.3.

실시예 10

N ^α - 숙시닐 -L-히스티딘 디소듐 염(V)

합성은 N^α-글루타릴-L-히스티딘 디소듐 염(IV)(실시예 9)에 제시된 기술에 따라 수행했다.

수율 1.16g(99.0%)

T_m _.p. = 124-128℃.

[α]_D ²⁰= +20.06°(C 0.67, 물).

실측치, %: C 39.55; H 4.31; N 13.52. C₁₀H₁₃N₃O₅Na₂.

이론치, %: C 39.88; H 4.35; N 13.95.

실시예 11

N ^α - 숙시닐 -L-트립토판 디소듐 염(II)

수율 0.56g(97.7%)

실측치, %: C 51.35; H 4.31; N 8.22. C₁₅H₁₆N₂O₅Na₂.

이론치, %: C 51.43; H 4.60; N 8.0.

실시예 12

N ^α - 글루타릴 -L-트립토판 디소듐 염(III)

수율 0.56g(98.5%)

실측치, %: C 52.55; H 4.71; N 7.52. C₁₆H₁₈N₂O₅Na₂.

이론치, %: C 52.75; H 4.98; N 7.69.

실시예 13

N ^α - 숙시닐 -L-히스티딘 메틸 에스테르

히스티딘 메틸 에스테르 1.0g(4.13mmol)을 N,N-디메틸포름아미드 5ml와 물 5ml에 용해한 용액에, 2.5ml 에틸아세테이트 중의 0.41g 숙신산 무수물 (4.13mmol) 용액을 강력한 교반 하에 첨가했다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반했다. 에틸아세테이트와 수 층을 분리했다. 수 층은 에스테르로 2회 세척하고, 에스테르 층은 제거했다. 물을 진공 제거하고, 잔류물을 10ml 헥산으로 분말화했다. 잔류물을 여과하고 진공 건조했다.

수율 0.70g(67%)

R_f 0.38(1).

T_m _.p. = 171-173℃.

¹H-NMR 스펙트럼 (DMSO-d₆), δ, m.d.: 2.26-2.37 (m, 4H, ㅱ,ㅲ-CH₂-Suc), 2.70 (s, 3H, -O-CH₃), 2.76-2.87 (m, 2H, ㅲ-CH₂-His), 4.33-4.45 (m, 1H, ㅱ-CH₂-His), 6.78 (s, 1H, 4-CH-Im), 7.93 (s, 1H, 2-CH-Im), 8.25 (d, J=7Hz, NH-아미드).

[α]_D ²⁰= +11.92°(C 0.57, 물).

또한, 유사한 전형적인 기술에 따라서, 표 2에 제시한 화학식 I의 신규 화합물도 제조했다.

표 2

화학식 I의 화합물의 구조 및 특성

생물학적 활성 검사

실시예 14

즉시형 알러지 반응에 미치는 화학식 I 화합물의 효과(면역화된 기니아 피그의 오브알부민( OA ) 유도 혈액 호염기구 탈과립화의 시험관내 검사)

기니아 피그 혈액 유래의 백혈구는 프리멜법(Freemel's method)[Immunologicheskiye Metody under edition of G. Frimel/Moscow., "Meditsina" publishers, 1987, p.222 in the inventors modification]에 따라 분리했다.

이 검사를 위해 600 내지 800g의 기니아 피그 암컷과 수컷을 사용했다. 동물들은 앤더슨[Anderson P. Antigen-induced bronchial anaphylaxis in actively sensitized guinea-pigs.//Allergy. 1980. Vol. 35. P.6371]에 따라 동물 1마리당 오브알부민 10㎍과 수산화알루미늄 100mg의 혼합물을 이용하여 1회 면역화시켰다.

에스테르 마취 하에, 혈액 15ml를 기니아 피그 심장으로부터 채혈했다. EDTA 및 구염산염 함유 침전 액체를 이용한 세포의 2중 침전법을 이용하여 백혈구 현탁액 중의 호염기구를 분리했다.

혈액을 9:1 비율의 5% EDTA·Na₂ 2H₂O("Sigma) 용액과 혼합하고, 30분 후 약한 원심분리로 처리했다(80g에서 12분간). 상청액을 모아 다시 500g에서 15분간 원심분리했다.

남은 세포에, 구연산염 함유 침전 액체(3)를 3:10의 비율로 첨가했다(30분 동안 37℃에 항온 유지시켰다). 백혈구가 농축된 상청액 분획을 100g에서 7분 동안 원심분리했다. 백혈구 침전물에 0.85% NaCl 용액을 첨가하고 세포 농도를 30 x 10³/㎕로 조정했다.

시험관내 호염기구 탈과립화 검사 프로토콜[Spravochnil po klinicheskim laboratornym metodam issledovaniya (A reference book on clinical-laboratory examination methods)/Edited by E.A.Cost/Moscow, "Meditsina" publishers, 1975, p. 130].

검사를 위해, 원심분리 튜브(각 시료당 튜브 3개)에 300㎕ 세포 현탁액을 주입한 후, 검사 화합물의 염 용액(또는 자발적 및 최대 탈과립화 비교용의 염 용액)을 첨가하고 37℃에서 15분 동안 예비항온배양한 다음, 각 튜브에 1% OA 용액 300㎕를 첨가하고(자발적 탈과립화 비교군에는 동량의 염 용액을 첨가했다), 한번 더 37℃에서 10분 동안 예비항온배양했다. 기능적 백혈구의 농도는 10⁴/㎕ 였다. 각 튜브로부터 시료(100㎕)를 채취하여 다른 튜브에 담아 총 호염기구 탈과립화를 평가하고, 남은 세포에 냉각된 염 용액을 첨가하여(각 튜브에 5ml) 탈과립화 반응을 정지시킨 다음, 튜브를 100g에서 7분 동안 원심분리하고, 침전물로부터 검경용 제조물을 준비했다. 제조물은 고정시키고 세더 등의 방법[Seder R.A. et al. Mouse splenic and bone marrow cell populations that express high affinity Fc receptors and produce interleukin-4 are highly enriched in basophils.// Proc.Natl.Acad.USA, 1991, V.88, P.2835-2839]에 따라 염색했다.

특정 호염기구 과립화를 검출하기 위해, 0.5% 알시안 블루(미쵸묻 (pH 1.0) 염료를 사용하고, 핵은 다시 사프라닌(1% 아세트산 중의 0.1% 용액)으로 염색했다. 제조물을 사용하여 완전 탈과립화 억제율을 평가했다.

완전 탈과립화 억제율(DI)(%)은 다음과 같은 식에 따라 계산했다:

DI = [ ( 최대값 - 실험값) / ( 최대값 - 자발적 값) ] x 100(%)

여기서, 최대값은 최대 탈과립화(OA)에서 탈과립화된 호염기구의 백분율(%)

자발적 값은 자발적 탈과립화(대조군)에서 탈과립화된 호염기구의 백분율(%)

실험값은 검사된 화합물에 노출된 후에 탈과립화된 호염기구의 백분율(%).

총 호염기구 탈과립화 평가

호염기구 탈과립화 검사 후 선발한 시료(각각 100㎕)를 염료(0.5% 알시안 블루, pH 1.0)와 1:1의 비율로 튜브에 주입했다. 염색은 실온에서 50분 이상 수행했다. 염색된 호염기구는 훅스-로센탈(Fooks-Rosenthal) 챔버에서 계산했다. 총 호염기구 탈과립화(ICD)의 억제는 다음 식에 따라 계산했다:

ICD(%) = 1-[(Mm(c)-Mm(exper.)]/[Mm(c)-Mm(OA)] x 100

여기서, Mm(c)는 자발적 호염기구 탈과립화 검사에서의 평균 호염기구 수(3 시료의 평균값);

M±m(OA)는 최대 항원 유도 호염기구 탈과립화 검사에서 평균 호염기구 수(3 시료의 평균값);

M±m(exper.)는 검사된 화합물과 항온배양한 후 호염기구 탈과립화 검사에서 평균 호염기구 수(3 시료의 평균값)이다.

표 3

화학식 I 화합물에 의해 나타나는 기니아 피그 혈액의 OA 유도 호염기구 탈과립화의 시험관내 억제율

표 3의 데이터는 글루타릴 히스타민과 비교했을 때, 화합물(IV)가 면역화된 기니아 피그에서 수집된 혈액 호염기구의 완전 OA 유도 탈과립화 검사(칼슘 무함유 매질에서 시험관내 아나필락시스 반응)에서 사실상 100% 탈과립화 억제율을 나타내듯이 현저한 항 아나필락시스 작용을 발휘한다는 것을 보여준다. 또한, 화합물 IV의 유의적인 항 아나필락시스 효과는 탈과립화된 세포 수의 감소를 통해 명백했고, 특히 10^-5M 농도에서 현저했다(탈과립화된 세포의 부재).

실시예 15

생체내 전신 아나필락시스에 미치는 화학식 I 화합물의 효과 연구

항원으로서 에어로졸 오브알부민에 노출시켜 능동적으로 감작시킨 의식이 있는 기니아 피그의 기관지 경련 모델을 사용했다[Kovaleva V.L. "Metodicheskiye ukazaniya po izucheniyu bronkholiticheskikh I protivovospalitel'nykh sredstv.// Rukovodstvo po experimental'nomy (doklinicheskomu) izucheniyu novykh pharmacologicheskikh veshchestv, Moscow. 2000. pp.242-250].

기니아 피그를 앤더슨법[Anderson P. Antigen-induced bronchial anaphylaxis in actively sensitized guinea-pigs.//Allergy. 1980. Vol. 35. P. 6371]에 따라 오브알부민으로 감작시키고, 감작 후 1 내지 2개월이 지나서, 알부민 추가접종 용량(일반 식염수 1ml 중에 3mg/kg)을 에어로졸 투여하여 기관지 경련을 유도했다.

검사 그룹의 경우, 프로브를 이용하여 검사 화합물을 10㎍/kg, 50㎍/kg 및 150㎍/kg의 용량으로 기니아 피그에게 3일 동안 투여했다. 다른 실험 그룹의 경우에는 검사 화합물을 50㎍/kg(1ml 일반 식염수 중에)의 용량으로 3일 동안 1일 1회씩 비측으로 투여했다(분무기를 이용하여). 대조군에게는 일반 식염수를 투여했다. 물질을 마지막으로 투여하고 1시간 후, 오브알부민을 분무기를 이용하여 흡입 투여한 뒤, 동물들의 기관지 경련 반응의 강도와 지속기간(초)을 평가했다.

표 4

화합물 IV를 50㎍/kg 용량으로 흡입 투여한 기니아 피그의 전신 아나필락시스 반응의 억제

그룹	급성기의 지속기간, 초	아급성기의 지속기간, 초
대조군 1(일반 식염수)	180±6	650±34
화합물 IV, 50㎍/kg	0	400±25

표 5

화합물 IV를 10㎍/kg 및 150㎍/kg 용량으로 위내 투여한 기니아 피그의 전신 아나필락시스 반응의 억제

그룹	급성기의 지속기간, 초	아급성기의 지속기간, 초
대조군 2(일반 식염수)	296.7±104.6	628.3±80.6
화합물 IV, 10㎍/kg	68.0±54.7^*	428.0±75.0
화합물 IV, 150㎍/kg	72.0±42.1^*	337.0±78.5^*
^*- P<0.001

표 4와 표 5에 제시된 실험 결과는 10㎍/kg 및 150㎍/kg의 용량으로 위내 투여된 화합물 IV 및 50㎍/kg의 용량으로 흡입 투여된 화합물 IV가 항 아나필락시스 활성을 나타낸다는 것을 보여준다. 50㎍/kg 용량으로 흡입 투여된 물질은 동물의 사망 원인인 질식을 유도하는 기관지수축 반응의 급성기 발달을 차단했다. 화합물 IV를 10 및 150㎍/kg 용량으로 위내 투여한 경우에는 항원 유도된 기관지 경련에 대한 유의적인 방어 효과가 검출되었다.

즉, 화합물 IV는 생체내 전신 아나필락시스 반응에 대해 유의적인 방어 효과를 나타낸다.

실시예 16

기니아 피그의 알러지 비염 모델에서 화학식 I 화합물의 항알러지 반응

기니아 피그의 알러지 비염 모델을 사용했다.

기니아 피그는 1.5 내지 2개월 동안 특정 계획에 따라 면역시켰다(Hutson P.A., Church M.K. et al. 1988): 동물의 1차 면역은 오브알부민을 10mg/kg의 용량으로 7일 간격(2회)으로 복강내 투여하여 실시하고, 그 다음 오브알부민 용액을 파리(Pari) 분무기를 이용하여 0.1%에서부터 1%에 이르는 증가 농도를 흡입 사이에 4일 간격을 두고 기니아 피그에게 흡입시켰다. 마지막 오브알부민 용량은 마이크로피펫을 이용하여 비강으로 투여했다. 마지막 오브알부민 투여 24시간 후 비내 세척 물을 수집하고(특수 튜브 시스템을 통해), 비측 점막의 변화를 조직학적 방법과 세포학적 방법의 복합 방법을 이용하여 평가했다. 검사 화합물(0.1% 용액)은 6일 동안 분무 장치를 이용하여 흡입 형태로 매일 투여했고; 투여 6일째, 항원(OA) 투여를 수행했다. 비내 세척물은 항원투여 24시간 후에 수득했다.

표 6

비내 세척물에서 세포증대증(1㎕ 중에 세포의 절대 수)에 미치는 화합물 IV의 효과

그룹	순수 대조군	모델+항원투여 (비염)	화합물 IV (0.1% 용액)
N	6	7	7
세포증대증	18.0±2.10	67.2±6.47^**	43.7±6.65°^*
^* - 순수 대조군과의 차이; °- 모델과의 차이 (° - P<0.05; ^* - P<0.01; ^** - P<0.001)

표 7

기니아 피그의 비내 세척물의 시토그램 매개변수(%)에 미치는 화합물 IV의 효과

아집단 그룹	순수 대조군 n=6	모델(비염) n=7	화합물 IV (0.1% 용액), n=7
대식세포	21.8±1.64	12.7^*±1.57	14.6^*±1.27
림프구	4.7±0.88	6.1±1.42	5.7±1.54
호중구	0.3±0.21	3.3^*±0.80	7.8^**°±1.35
호산구	7.0±2.45	47.9^***±5.37	6.9^ooo±1.32
시험관내 조직배양 상피세포	66.2±3.09	27.1±5.01	63.6^ooo±3.02
^* - 순수 대조군과의 차이; °- 모델과의 차이 (° - P<0.05; ^,^oo - P<0.01; ^*,^ooo - P<0.001)

표 8

기니아 피그의 비내 세척물(1㎕) 중 세포 아집단의 절대 수에 미치는 화합물 IV의 효과

아집단 그룹	순수 대조군 n=6	모델(비염) n=7	화합물 IV (0.1% 용액), n=7
대식세포	6.2±1.29	7.9±1.88	6.1±0.75
림프구	0.9±0.24	4.1^*±1.16	3.2^*±52
호중구	0.03±0.021	2.1±0.67	3.1±1.02
호산구	1.2±0.46	26.5^***±4.47	3.2^oo±0.97
시험관내 조직배양 상피세포	11.8±1.4	11.3±2.10	26.3^**oo±4.31
^* - 순수 대조군과의 차이; °- 모델과의 차이 (° - P<0.05; ^,^oo - P<0.01; ^*,^ooo - P<0.001)

표 5 내지 7의 결과는 알러지 비염 모델화 조건 하에서 화합물 IV가 호산구 염증을 유의적으로 억제한다는 것을 보여준다. 이것은 호산구의 정상적인 절대 수와 상대적 수까지의 저하 및 비내 세척물에서 세포증대증의 유의적인 저하를 통해 입증된다.

실시예 17

기니아 피그의 알러지 폐렴 모델에서 화학식 I 화합물의 항알러지 활성

기니아 피그의 알러지 폐렴 모델을 사용했다. 동물의 면역화는 실시예 7에 기술된 것과 유사하게 실시했다.

마지막 오브알부민 투여 24시간 후, 기관지-폐포 세척물을 수집하고(기관내 삽입된 캐뉼라를 통해), 기관지 점막의 변화를 조직학적 및 세포학적 방법의 복합 방법을 이용하여 평가했다.

검사 화합물(0.1% 용액)은 6일 동안 분무 장치를 이용하여 흡입 형태로 매일 투여하고; 투여 6일 째, 항원(OA) 투여를 수행했다.

표 9

기관지-폐포 세척물에서 세포증대증(1㎕ 중에 세포의 절대 수)에 미치는 화합물 IV의 효과

그룹	순수 대조군	모델+항원투여 (비염)	화합물 IV (0.1% 용액)
N	6	5	7
세포증대증	726.8±82.4	1849.4±287.3^*	1331.3±277.4
^* P<0.01 - 순수 대조군과의 차이

표 10

기니아 피그의 기관지-폐포비내 세척물(1㎕)의 세포 아집단의 절대 수에 미치는 화합물 IV의 효과

아집단 그룹	순수 대조군	모델	화합물 IV (0.1% 용액)
대식세포	502.6±60.31 (n=6)	680.3±105.0 (n=5)	640.1±57.98 (n=6)
림프구	101.4±24.3 (n=6)	328.3^**±49.18 (n=5)	233.0^*±45.77 (n=7)
호중구	0 (n=6)	56.8±17.08 (n=5)	16.9°±4.22 (n=7)
호산구	37.0±9.04 (n=5)	773.0^**±171.7 (n=5)	487.4^**±98.70 (n=6)
시험관내 조직배양 상피세포	16.9±6.09 (n=6)	0 (n=5)	2.48^*±1.84 (n=7)
^* - 순수 대조군과의 차이; °- 모델과의 차이 (^,° - P<0.05; ^* - P<0.01)

표 9와 10의 데이터는 알러지 폐렴 모델의 조건 하에서 화합물 IV가 염증 과정을 유의적으로 억제하며, 이것은 세포증대증의 저하, 주 염증 세포인 호산구 수 치 저하, 호중구 수치의 급감 및 림프구 수의 감소에 의해 입증된다는 것을 보여준다.

실시예 18

세파덱스에 의해 래트에 유도된 폐렴 모델에 미치는 화학식 I 화합물의 항염증

작용 연구

세파덱스에 의해 유도된(6일) 래트 폐렴 모델

본 검사에는 270 내지 300g 중량의 수컷 비스타 래트를 사용했다.

폐의 염증은 세파덱스 A-25(입자 크기가 20 내지 80㎛인 친수성 분말)를 흡입기 "Cyclohaler"(Scientific-Research Institute for Pulmonology of the RF)의 실험실 유사 장치인 용량투여 장치를 이용하여 5mg/kg의 용량으로 1회 흡입시켜 유도했다.

세파덱스 및 약리학적 물질을 투여하는 흡입 기술

세파덱스 A-25는 체중 1kg당 5mg의 용량으로 무수 분말을 흡입 투여하기 위한 오리지널 투여 장치를 이용하여 에스테르 마취하에 래트에게 투여했다. 세파덱스 A-25 투여 후, 비스타 래트는 마취로부터 빠르게 회복했고, 그 행동과 호흡 특성에 특별한 이상은 감지되지 않았다. 무수 분말 형태의 약리 물질은 세파덱스 투여 1시간 후에 500㎍/kg의 용량으로 흡입 투여했고, 그 후 5일 동안 매일 1회씩 동일한 오전 시간에 연속 투여했다. 대조군으로는 2 그룹, 즉 순수 동물 그룹과 세파덱스를 흡입으로 1회 투여한 그룹을 사용했다.

폐렴 발달에 미치는 약리 물질의 치료 작용의 결과는 에어로졸 세파덱스 투 여 6일 후 형태학적 및 형태측정 매개변수(부피 밀도 및 폐포염)를 이용하여 평가했다.

연구에 사용된 방법

조직학적 방법

폐의 조직학적 검사는 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하여 실시했다.

형태측정 방법

4 내지 5㎛ 두께의 조직학적 폐 절편을 준비하여 호중구 수를 계산하고, 폐포염 및 폐기종의 부피 밀도를 아브탠딜로브 메시[Avtandilov's mesh; Avtandilov G.G., Vvedeniye v kolichestvennuyu pathologicheskuyu morphologiyu.// Moscow. "Meditsina" publishers. 1980. p. 203]를 이용하여 평가했다. 폐 림프양 조직의 형태측정 검사도 실시했다. 이를 위해, 폐의 마이크로 제조물을 비에넨스탁 등[Bienenstock J., Johnson N., Perey D.Y.E. Bronchial lymphoid tissue 1. Morphologic characteristics//Lab. Invest. 1973. v.28 p.693-698]의 방법에 따라 고정시켰다. 기관과 함께 폐를 흉강으로부터 떼어내고, 마이크로 제조물을 2% 아세트산 수용액에 담아 두었다. 18 내지 24시간 후, 기관, 주기관지 및 소엽성 기관지를 절개하고, 기관지에 결합된 림프구양 조직의 부피 밀도의 형태측정 평가를 확대경(배율 7배) 하에서 점계산법을 이용하여 수행했다.

세포학적 방법

기관지-폐포 세척물은 헥세날 마취 하의 래트와 기니아 피그에서 10ml 일반 식염수로 기관을 통해 폐를 2회 세척하여 수득했다. 세포의 생육성은 트립판 블루 검사로 측정했다. 1ml 중에 세포의 절대 수(세포증대증)는 고예브 챔버(Goryaev's chamber)를 이용하여 기관지-폐포 세척액(BAW)에서 측정했다. BAW액 침전물의 스미어(smear)는 200g로 10분 동안 원심분리하여 수득하고, 로마노브스키-김자에 따라 염색한 후, 폐내 시토그램을 계산했다(백분율)[Avtsyn A.P., Lukomskij G.I., Romanova L.K. et al. Endopul'monal'naya cytogramma.// Sov. Med. 1982. No 7. pp.8-14].

연구 결과는 변량 통계법과 스투던트 t-검정을 이용하여 처리했다.

표 11

세파덱스 A-25에 에어로졸 노출 및 약리학적 제제 처리후 비스타 래트의 기관지-폐포 세척물 세포증대증 매개변수(M±m)

세포증대증

1㎕ BAW내 세포의 절대 수

기준	순수 대조군 n=5	세파덱스(모델) n=6	화합물 IV n=6
세포증대증	160.4±20.65	259.2^*±32.42	178.6^*±20.4
P		0.05	0.05
주: ^* - 순수 대조군과의 차이

표 12

세포증대증

1㎕ BAW내 세포의 절대 수

아집단	순수 대조군	모델(세파덱스)	화합물 IV
N	4	5	6
대식세포	124.8±16.35	226.1^*±30.83	152.4±18.5
림프구	15.5±4.27	28.2±6.01	22.0^*±3.5
호중구	0	20.4^*±6.38	5.1^*±0.6
주: ^* - 순수 대조군과의 차이(P<0.05)

폐 조직 검사

화합물 IV는 특별한 항 염증 작용을 유도했다: 동물 모델 그룹에 비해 폐포염의 유병율은 유의적으로 저하되었다; 폐기종은 사실상 검출되지 않았다; 폐포간 중격의 호중구에 의한 침윤은 감지되지 않았다. BAW 내의 세포증대증 수치 및 호중구 수 면에서, 염증 진행은 세파덱스를 5일 동안 투여한 동물보다 훨씬 덜 뚜렷했다.

따라서, 사용된 모든 실험 모델은 시험관내 검사에서 뿐만 아니라 생체내 알러지 및 염증 병리학 모델에서 명백한 화학식 I 화합물의 유의적인 항 알러지, 항 아나필락시스 및 항 염증 활성을 암시한다.

실시예 19

래트의 고콜레스테롤혈증 모델에서 화학식 I 화합물의 저지질혈 작용 연구

본 연구는 200±20g 중량의 비스타 래트 수컷을 이용하여 실시했다. 고지질혈증은 콜레스테롤 주입물인 오일상 콜레스테롤 현탁액을 경구 투여하여 유도했다:

올리브유(Acorsa, 스페인) - 동물 체중 기준 5ml/kg;

콜레스테롤(Sigma, 미국) - 1g/kg 체중;

소듐 콜레이트(Sigma, 미국) - 100mg/kg 체중.

참조 제제로서, 머크 샵 앤 돈 사 제품인 스타틴류 "Mevacor"(로바스타틴) 그룹 중의 제제를 40mg/kg의 용량으로 사용했다. 콜레스테롤 현탁액은 10일 동안 아침에 매일 투여했다. 검사 화합물(500㎍/kg 용량) 및 참조 제제(40mg/kg 용량)를 콜레스테롤 현탁액과 함께 10일 동안 동물에게 투여했다. 모든 동물에게는 표준 브리켓형 마초를 공급했다.

동물은 다음과 같은 그룹으로 나뉘었다:

"대조군" - 순수 동물(n=6);

"콜레스테롤" - 콜레스테롤 주입량을 경구 투여한 래트(n=10);

"로바스타틴" - 콜레스테롤 주입량과 로바스타틴을 경구 투여한 래트(n=10);

"화합물 IV" - 콜레스테롤 주입량과 검사 화합물 IV를 경구 투여한 래트(n=10);

혈액은 실험 5일, 8일 및 10일째에 채취했다.

검사 물질의 저지질혈 작용 데이터의 통계 처리는 "콜레스테롤" 그룹에 대해 수행했다(표 13).

표 13

콜레스테롤 주입과 동시에 올리브유, 콜레스테롤 및 화합물 IV를 10일 동안 경구 투여한 래트의 혈청 및 간에 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 수치

500㎍/kg 용량의 화합물 IV의 투여는 혈청의 총 콜레스테롤을 19.5%, 간 콜레스테롤을 22.7%, LDL 콜레스테롤을 29.8%, 간 트리글리세라이드를 19% 정도 유의적으로 저하시켰다. 화합물 글루타릴 히스타민은 총 콜레스테롤 수치를 9% 정도만 저하시켜 국제출원 공개번호 WO99/01103에서 제시된 LDL 및 VLDL(저밀도 지단백 및 초저밀도 지단백)에 대해서만 효과를 발휘했고, 유사한 생물학적 실험에서 화합물 IV보다 덜 효능적인 것으로 드러났다.

다른 본 발명의 화합물에 대한 연구 결과는 이하에 제시한다.

실험 그룹에는 다음과 같은 것이 있다:

1) "콜레스테롤" - 10일 동안 오일상 콜레스테롤 현탁액을 경구 투여한 래 트;

2) "화합물 IV" - 오일상 콜레스테롤 현탁액 및 검사 화합물 IV를 경구 투여한 래트;

3) "화합물 IV - 1Na" - 오일상 콜레스테롤 현탁액과 검사 화합물 IV의 모노소듐 염을 경구 투여한 래트;

4) "화합물 V - 2Na" - 오일상 콜레스테롤 현탁액과 검사 화합물 IV의 디소듐 염을 경구 투여한 래트;

5) "화합물 V - 1Na" - 오일상 콜레스테롤 현탁액과 검사 화합물 V의 모노소듐 염을 경구 투여한 래트;

6) "화합물 III - 1Na" - 오일상 콜레스테롤 현탁액과 검사 화합물 III의 모노소듐 염을 경구 투여한 래트;

7) "화합물 II - 1Na" - 오일상 콜레스테롤 현탁액과 검사 화합물 II의 모노소듐 염을 경구 투여한 래트;

8) "Sim" - 오일상 콜레스테롤 현탁액과 심바스타틴을 경구 투여한 래트;

9) 대조군 - 검사 개시 전의 순수 래트.

검사 10일째에 동물을 단두 처리 후 혈액 시료를 채취했다. 단두 처리전에 동물을 12시간 동안 금식시켰다.

혈액 혈청의 총 콜레스테롤, 트리글리세라이드 및 고밀도 지단백 콜레스테롤(HDLC)을 측정했다. 저밀도 지단백 콜레스테롤 및 초저밀도 지단백 콜레스테롤은 총 콜레스테롤과 HDL 콜레스테롤 사이의 차이로 계산했다.

혈액 혈청 총 콜레스테롤 및 트리글리세라이드는 효소법으로 측정했다.

고밀도 지단백(α-LP) 중의 콜레스테롤 수치는 포스포텅스텐산 및 마그네슘 이온을 이용한 LDL 및 VLDL의 침전법을 통해 측정했다.

통계 처리

표에 제시된 데이터는 평균값 ± 표준오차로서 나타낸 것이다. "콜레스테롤"과 "제제" 그룹 간의 차이의 유효성은 2 표본 스투던트 t-검정으로 평가했다. 오차 확률(p)은 표의 그래프에 제시했다.

콜레스테롤 주입량이 투입된 래트의 혈액 혈청 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 수치에 미치는 화합물들의 효과에 관한 데이터는 표 14 내지 21에 제시했다.

표 14

실험적 고콜레스테롤혈증

래트에 오일상 콜레스테롤 현탁액을 10일 투여한 결과, 혈청 콜레스테롤 수 치는 2.3배 유의적으로 상승했고 트리글리세라이드 수치는 1.9배 상승했다. 유도된 고지질혈증의 발달의 경우에, 콜레스테롤은 15% 정도 감소했다. LDL+VLDL 콜레스테롤은 5배 상승이 관찰되었다. LDL + VLDL 트리글리세라이드는 2.3배 상승이 관찰되었다.

표 15

실험 5일째 래트의 혈액 혈청 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 수치(mg/100ml)

표 16

실험 8일째 래트의 혈액 혈청 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 수치(mg/100ml)

표 17

실험 10일째 래트의 혈액 혈청 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 수치(mg/100ml)

매개변수	그룹
매개변수	"콜레스테롤" (n=20)	"화합물 IV" (n=20)	"화합물 IV" 1Na" (n=20)	"화합물 IV" 2 Na" (n=19)	"Sim" (n=10)
총 콜레스테롤
혈청	135.7±10.9	95.2±5.4 p=0.003	97.4±7.1 p=0.006	97.9±3.9 p=0.003	93.9±10.2 p=0.01
HDL	32.5±1.1	36.5±0.9 p=0.093	37.7±1.0 p=0.02	40.0±1.9 p=0.002	32.7±1.2
LDL + VLDL	103.2±11.5	58.7±5.3 p=0.002	59.7±7.2 p=0.003	57.3±4.3 p=0.002	61.2±9.7 p=0.01

트리글리세라이드 혈청	156.6±11.4	143.3±8.9	132.5±8.4 p=0.096	127.3±6.2 p=0.03	142.0±5.4

표 18

"콜레스테롤" 그룹의 실험 동물에서 고콜레스테롤혈증 발생

오일상 콜레스테롤 현탁액을 래트에게 10일 투여한 결과, 혈청 총 콜레스테롤은 유의적인 1.7배 상승, 트리글리세라이드 수치는 1.6배 상승했다(표 18). HDL 콜레스테롤은 처음 66.7mg/100ml에서부터 고지질혈증의 유도 발생 시 48mg/100ml까지 28% 정도 감소했다. LDL + VLDL 콜레스테롤 수치는 22.5mg/100ml에서부터 99mg/100ml까지 4.4배 상승되는 것으로 관찰되었다.

표 19

표 20

표 21

동물에게 화합물 III의 모노소듐 염을 투여한 결과, 총 콜레스테롤(CH)은 29%, VLDL+LDL 분획의 콜레스테롤은 40% 정도 크게 감소했지만, 혈청 항죽종형성형 HDL의 CH 및 총 트리글리세라이드 수치는 변하지 않았다.

수득된 결과는, 모노소듐 염 및 디소듐 염이 혈청 총 콜레스테롤 및 LDL+VLDL 콜레스테롤과 다른 지질 대사의 매개변수에 대한 작용 동역학이 화합물 IV보다 우수하다는 것을 암시한다. 실험 10일경, 상기 언급한 매개변수들의 유의적인 비슷한 저하는 앞에서 언급한 모든 화합물 및 참조 제제 "Zokor"(심바스타틴)의 효과 하에서 나타난 반면, 화합물 IV의 염은 더 이른 실험 초기(5일 및 8일경)에 작용을 개시했다. 화합물 IV의 두 소듐 염은 모두 실험 5일경에 이미 HDL을 상승시킨 반면, 화합물 IV는 8일경에야 이 매개변수의 수치를 상승시켰다. 참조 제제인 심바스타틴은 HDL 콜레스테롤에 영향을 미치지 않았다. 더욱이, 화합물 IV의 디소듐 염은 실험 5일과 10일째에 혈청의 총 트리글리세라이드 수치를 저하시켰다.

화합물 V 모노소듐 염의 뚜렷한 특징은 혈청의 총 트리글리세라이드 수치를 저하시키는 능력인 반면, 총 콜레스테롤과 VLDP 콜레스테롤 수치의 저하 및 HLD 수치의 상승은 화합물 III 및 화합물 IV 모노소듐 염의 경우보다 낮았다.

즉, 국제출원 공개번호 WO 99/01103에 개시된 화합물 및 본 발명에서 제안한 화합물들의 활성과 비교했을 때, 화합물 II, III, IV 및 V의 염은 혈청 트리글리세라이드, LDL 콜레스테롤 수치를 비롯한 총 콜레스테롤 수치의 저하 및 HLD 콜레스테롤 상승 능력을 포함하여 향상된 저지질혈 활성을 보유한다.

실시예 19

기니아 피그의 "내인성" 고콜레스테롤혈증 모델에 대한 화학식 I 화합물의

저지질혈 효과 연구

본 연구는 304±25g 중량의 수컷 기니아 피그(Aguti line)를 이용하여 수행했다. 실험은 31일 동안 지속했다. 대조군에는 6마리의 기니아 피그(순수 동물)을 사용했다. 연구 화합물은 실험 1일부터 투여했다(지방 주입량을 투여한 1일부터).

실험 그룹의 동물에게 연구 화합물과 지방 주입량을 31일 동안 경구 투약했다. 아래에 제시한 용량의 연구 화합물은 수용액 형태(동물당 0.5ml)로 투여했고; 지방 주입량(돼지 지방과 예열된 옥수수유 4:1 부피비의 혼합물)을 5ml/kg(체중)의 속도로 연구 물질의 투여 0.5시간 후에 투여했다.

실험 그룹:

1) "대조군" - 순수 동물;

2) "지방" - 지방 주입량만 공급한 동물;

3) "화합물 IV" - 지방 주입량 + 화합물 IV 500㎍/kg(체중)을 공급한 동물;

4) "화합물 V" - 지방 주입량 + 화합물 V 500㎍/kg(체중)을 공급한 동물.

지방 주입량과 연구 화합물을 공급받은 기니아 피그의 혈액 혈청 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 수치에 대한 데이터는 표 22 내지 표 25에 제시했다.

표 22

지방 주입량과 연구 화합물을 공급한 기니아 피그의 혈액 혈청 총 콜레스테롤 수치

통계 처리는 일요인 변량 분석을 이용하여 수행했다.

표 23

지방 주입량과 연구 화합물을 공급한 기니아 피그의 혈액 혈청 총 트리글리세라이드 수치

표 24

지방 주입량과 연구 화합물을 공급한 기니아 피그의 31일째 혈액 혈청의 지단백 분획 중의 총 콜레스테롤 수치

표 25

지방 주입량과 연구 화합물을 공급한 기니아 피그의 31일째 혈액 혈청의 지단백 분획 중의 총 트리글리세라이드 수치

연구된 화합물 IV 및 V는 단지 실험 31일경에 총 콜레스테롤 수치를 각각 33.9% 및 37.8% 정도 유의적으로 저하시켰다. 이와 동시에, LDL 콜레스테롤도 37.7% 및 38% 정도 유의적으로 저하시켰다.

본 발명의 화합물, 구체적으로 화합물 IV의 장점은 치료 효과의 광대함을 제공하는 광범위한 작용 용량이다. 즉, 예를 들어, 화합물 IV는 30배 차이가 나는 50 내지 1,500㎍/kg 용량 간격에서 20일 동안 총 콜레스테롤 수치 저하에 사실상 유사한 효과를 나타냈다.

따라서, 화학식 I에 해당하는 본 발명의 화합물은 혈액 혈청과 간에서 지질 대사 매개변수를 상당히 개선시킴으로써 유의적인 저지질혈 활성을 나타낸다.

실시예 20

카라기난 래트 앞발 부종 모델에 대한 화학식 I 화합물의 항염증 작용 연구

본 실험은 250g 중량의 무작위교배계 백색 수컷 래트를 이용하여 수행했다. 실험마다 동물의 총 수는 12마리였다.

윈터 등[Winter et al. Studies of the mediators of the acute inflammatory response induced in rats in different sites by carrageenan and turpentine.//J.Phamacol. 1971. V.104. P.15-29]의 방법에 따른 카라기난 유도 부종 모델을 사용했다. 1% 카라기난 용액(SERVA) 0.1ml를 래트의 오른쪽 앞발 발바닥에 주사했다. 이 동물을 각 챔버에 방치했다. 검사 물질을 함유하는 젤(1%)을 앞발에 3회 투여했다: 카라기난 투여 직후, 투여 후 1시간 및 2시간째. 카라기난 투여 4시간 후, 앞발 체적을 체적변동기록기(Ugo Basile)로 측정했다. 젤의 치료 효과는 주어진 동물의 초기 왼쪽 앞발 및 대조군(무처리군)의 래트 앞발 반응과 비교하여 염증 반응의 억제율로 평가했다. 백분율로 나타낸 염증 반응 억제율은 다음 식에 따라 계산했다:

체적 증가 = 차이 x 100 / 왼쪽 앞발 체적

억제율 = 100 - [체적 증가 _(실험) x 100 / 체적 증가 _(대조군) ]

1% 젤 형태의 검사 화합물 VI 및 XIII은 부종 억제율이 각각 44% 및 40%였고, 참조 제제인 디클로페낙(1% 젤)은 부종을 62% 억제했다.

투약 형태 예

실시예 21

A. 정제

정제는 이하에 제시한 성분을 이용하여 제조했다:

화학식 I에 해당하는 화합물 또는 이의 약학적 허용성 염	1-150mg
감자 전분	20-50mg
마그네슘 스테아레이트	3mg
아에로실	1mg
락토스	300mg 이하

성분들을 혼합하고, 각각 300mg 중량의 정제로 압착했다.

B. 좌약

좌약 조성물의 예:

화학식 I에 해당하는 화합물 또는 이의 약학적 허용성 염	1-100mg
코코아 버터	좌약을 제조하는데 필요한 양

필요하다면, 직장용, 질용 및 요도용 좌약을 각각의 부형제를 이용하여 제조할 수도 있다.

C. 연고

연고 조성물의 예:

화학식 I에 해당하는 화합물 또는 이의 약학적 허용성 염	1-500mg
바셀린	10g

연고는 일반적으로 공지의 기술에 따라 제조했다.

D. 젤

젤 조성물의 예;

화학식 I에 해당하는 화합물 또는 이의 약학적 허용성 염	1-500mg
카르보폴	200mg
벤질 알콜	20mg
에틸 알콜	300mg
물	10g 이하

E. 흡입용 무수 분말

분말 조성물의 예:

화학식 I에 해당하는 화합물 또는 이의 약학적 허용성 염	20-200mg
락토스	1g 이하

분말은 특수 장치(용기) 또는 젤라틴 캡슐에 충진했다.

F. 비측 스프레이

스프레이 조성물의 예:

화학식 I에 해당하는 화합물 또는 이의 약학적 허용성 염	1.5-150mg
정제수	15ml 이하

G. 점안제

점안제 조성물의 예:

화학식 I에 해당하는 화합물 또는 이의 약학적 허용성 염	0.5-50mg
보존제	10mg
정제수	5ml 이하

H. 주사용 용액제

주사용 용액제 조성물의 예:

화학식 I에 해당하는 화합물 또는 이의 약학적 허용성 염	0.2-20mg
주사용수	2mg

Claims

하기 화학식 I로 표시되는 N-아실 아미노산 유도체 및 이의 약학적 허용성 염:

화학식 I

여기서, n은 2 또는 3이고;

R₁은
또는
이며;

R₂는 H, -CH₃, -C₂H₅이며, 단 화학식 I의 화합물은 숙시닐-L-트립토판, 숙시닐-D-트립토판 및 숙시닐-D,L-트립토판, 및 이의 디포타슘 염, N^α-숙시닐-L-트립토판 메틸 에스테르, N^α-글루타릴-L-히스티딘 메틸 에스테르, N^α-글루타릴-L-트립토판 메틸 에스테르는 아니다.
제1항에 있어서, 약학적 허용성 염은 모노소듐 염 또는 디소듐 염인 것인 화합물.
하기 화학식 a의 아미노산 또는 이의 염의 수용액에 고체로서 글루타르산 무수물 또는 숙신산 무수물을 첨가하는 단계, 및 경우에 따라 목표 산물을 이의 염으로 변환시키는 단계를 포함하여, 하기 화학식 I로 표시되는 N-아실 아미노산 유도체 또는 이의 약학적 허용성 염의 제조방법:

화학식 I

화학식 a

상기 식들에서, n은 2 또는 3이고;

R₁은
이며;

R₂는 H이다.
수불혼화성(water immiscible) 유기 용매 중에서 하기 화학식 a로 표시되는 아미노산 또는 이의 염, 또는 하기 화학식 b로 표시되는 아미노산 또는 이의 염의 수성 용액 또는 수성-유기 용액과 글루타르산 무수물 또는 숙신산 무수물을 2상 시스템으로 반응시키는 단계, 및 경우에 따라 목표 산물을 이의 염으로 변환시키는 단계를 포함하여, 하기 화학식 I로 표시되는 N-아실 아미노산 유도체 또는 이의 염을 제조하는 방법:

화학식 I

화학식 a

화학식 b

상기 식들에서, n은 2 또는 3이고;

R₁은
또는
이며;

R₂는 -CH₃ 또는 -C₂H₅이다.
유효량의 하기 화학식 I의 N-아실 아미노산 유도체 또는 이의 약학적 허용성 염과 약학적 허용성 첨가제를 함유하고, 항알러지, 항아나필락시스, 항염증 및 저지질혈 활성이 있는 약학적 조성물:

화학식 I

여기서, n은 2 또는 3이고;

R₁은
또는
이며;

R₂는 H, -CH₃, -C₂H₅이다.
항알러지, 항아나필락시스, 항염증 및 저지질혈 활성이 있는 약제의 제조에 사용되는 하기 화학식 I의 N-아실 아미노산 유도체 또는 이의 약학적 허용성 염의 용도:

화학식 I

여기서, n은 2 또는 3이고;

R₁은
또는
이며;

R₂는 H, -CH₃, -C₂H₅이다.
제6항에 있어서, 항원 의존적 히스타민 분비 및 호염기구 탈과립화를 저하시키고, 호산구, 호중구 및 림프구의 수치를 조절하기 위한 약제의 제조에 사용되는 N-아실 아미노산 유도체의 용도.
제6항에 있어서, 기관지 천식, 알러지 비염, 화분증, 계절성 비염, 연중 비염, 알러지 폐렴, 아토피 피부염, 건선, 두드러기, 곤충 쏘임 및 약제에 대한 알러지(예컨대, 아나필락시스) 반응, 한랭 알러지, 알러지 결막염의 증후군을 완화시키는 약제의 제조에 사용되는 N-아실 아미노산 유도체의 용도.
죽상동맥경화증, 비만, 허혈성 심질환 및 뇌질환, 심근 경색 및 발작의 증후군을 완화시키는 약제의 제조에 사용되는 하기 화학식 I의 N-아실 아미노산 유도체 또는 이의 약학적 허용성 염의 용도:

화학식 I

여기서, n은 2 또는 3이고;

R₁은
또는
이며;

R₂는 H, -CH₃, -C₂H₅이며, 단 상기 화학식 I의 화합물은 숙시닐-D,L-트립토판의 디포타슘 염은 아니다.
하기 화학식 I의 N-아실 아미노산 유도체 또는 이의 약학적 허용성 염을 함유하고 항알러지, 항아나필락시스, 항염증 및 저지질혈 활성이 있는 약제:

화학식 I

여기서, n은 2 또는 3이고;

R₁은
또는
이며;

R₂는 H, -CH₃, -C₂H₅이다.
유효량의 하기 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적 허용성 염을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하여, 염증, 고지질혈증, 고콜레스테롤혈증을 동반하는 질환을 비롯한 알러지, 아나필락시스 질환을 치료하는 방법:

화학식 I

여기서, n은 2 또는 3이고;

R₁은
또는
이며;

R₂는 H, -CH₃, -C₂H₅이다.
제11항에 있어서, 기관지 천식, 알러지 비염, 화분증, 계절성 비염, 연중 비염, 알러지 폐렴, 아토피 피부염, 건선, 두드러기, 곤충 쏘임 및 약제에 대한 알러지(예컨대, 아나필락시스) 반응, 한랭 알러지, 알러지 결막염을 치료하는 방법.
유효량의 하기 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적 허용성 염을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하여, 죽상동맥경화증, 비만, 허혈성 심질환 및 뇌질환, 심근 경색, 발작을 치료하는 방법:

화학식 I

여기서, n은 2 또는 3이고;

R₁은
또는
이며;

R₂는 H, -CH₃, -C₂H₅이며, 단 상기 화학식 I의 화합물은 숙시닐-D,L-트립토판의 디포타슘 염은 아니다.