KR20080038047A

KR20080038047A - 세포핵에서 세포질로의 ｇｓｋ３ 이동을 억제하는 방법 및물질

Info

Publication number: KR20080038047A
Application number: KR1020070108063A
Authority: KR
Inventors: 김정문; 김정국; 김태한; 이종석; 육종인
Original assignee: 김정문; 김정국; 이종석; 김태한
Priority date: 2006-10-27
Filing date: 2007-10-26
Publication date: 2008-05-02
Also published as: WO2008051048A2

Abstract

본 발명은 세포핵에서 세포질로의 GSK3 이동을 억제하는 방법 및 물질에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, (i) 글리코겐 신타아제 카이네이즈 3(glycogen synthase kinase 3, GSK3)과 결합하는 GBD(GSK3 binding domain) 또는 (ⅱ) Axin과 결합하는 ABD(Axin binding domain)을 포함하는 세포핵에서 세포질로의 GSK3 이동을 저해하는 폴리펩티드 및 Axin과의 결합을 통해 GSK3이 세포핵 밖으로 유출되어 세포핵 내에서 GSK3의 농도가 저하되는 것을 억제하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 세포핵 내부의 GSK3 농도를 억제하거나 증가시키는 것이 가능하므로, 핵 내부의 GSK3 농도 감소로 인해 발생하는 다양한 질환을 치료하는데 유용하다.

GSK3, PTD, Axin, HA2, nuclear export, 폴리펩티드

Description

세포핵에서 세포질로의 ＧＳＫ３ 이동을 억제하는 방법 및 물질{Method and Materials for Inhibiting a Nuclear Export of GSK3}

글리코겐 신타아제 카이네이즈-3(glycogen synthase kinase-3, GSK3)은 세린/트레오닌 카이네이즈(serine/threonine kinase)로서, 약 47kD의 분자량을 가지며, 50여개의 단백질을 인산화시킨다. GSK3은 두 개의 아이소폼(isoform), 즉 GSK3α 및 GSK3β가 있으며, 이들 유전자는 매우 유사하고 기능도 매우 유사한 것으로 알려져 있다 (Double B.W. & Woodgett. J. R., J. Cell Sci ., 116:1175, 2003).

GSK3은 (1) 개체 발생, (2) 암 발생 및 진행 과정, (3) 류마티스 관절염(rheumatic arthritis)과 같은 면역 및 만성 염증성 질환의 발병 과정에서 수많은 단백질, 특히 β-카테닌(β-catenin) 또는 Snail과 같은 단백질의 인산화를 조절하는 기능을 수행한다. 즉, Wnt signaling과 같은 신호체계의 이상은 GSK3에 의한 β-catenin 및 Snail과 같은 암 발생 및 전이 활성 인자의 인산화를 억제하여 반감기를 증가시킴으로써 다양한 질병의 발생과 진행을 촉진한다.

따라서, GSK3의 세포 내 또는 핵 내부의 활성을 촉진하는 물질은 Wnt signaling에 의한 질병 발생 및 진행을 억제하는데 도움이 될 수 있을 것이다. 특히, GSK3의 활성을 증가시킨다면 Wnt signaling 등에 의한 핵 내부의 GSK3 억제를 경감시킬 수 있고, Wnt signaling에 의해 발생하는 많은 질환의 발병 및 진행을 효과적으로 억제할 수 있을 것이다.

그러나, GSK3에 의한 기질 단백질의 정확한 인산화 조절 과정은 거의 알려져 있지 않고, 핵 내부의 GSK3 활성을 억제하여 발생하는 질환에 대한 치료물질도 거의 알려져 있지 않다. 이는 Wnt signaling에 의한 GSK3에 이르는 기전들이 명확히 밝혀지지 않은 것에 기인한다. 본 발명에서는 이러한 질병들과 직접적으로 관련이 있는 Wnt signaling pathway에 있어서 Axin에 의한 GSK3의 nuclear export function(GSK3α 및 GSK3β를 핵에서 세포질로 이동시키는 기능)이라는 기전을 명확히 밝힘으로써, 실질적으로 세포핵 내의 GSK3 농도나 활성 저하를 억제하거나 유지 및 증가시키는 방법을 처음으로 명확하게 제시하였다. 또한, 이로 인해 GSK3의 nuclear export와 관련된 질병을 치료할 수 있는 방법과 치료물질을 제공할 수 있 는 구체적인 방안을 제시할 수 있게 되었다.

본 발명에서 규명한 중요한 메카니즘은 GSK3과 결합하여 GSK3의 nuclear export function을 하는 GSK3의 조절인자는 Wnt signaling pathway 상의 Axin이라는 점이다. Axin 유전자는 Axin1 및 Axin2(conductin)의 두 개의 아이소폼(isoform)을 가지고 있다. 상기 Axin1 및 Axin2 유전자는 서로 다른 전사 조절 과정을 통해 단백질 인산화를 조절하는 것으로 알려져 있다. Axin 유전자는 GSK3에 의한 β-catenin의 인산화를 촉진하여 반감기를 감소시킴으로써 Wnt signaling의 음성 조절자(negative regulator)로서의 역할을 한다 (미국특허 2001/0052137A1).

그 외에 GSK3과 결합하여 GSK3의 nuclear export function을 하는 FRAT-1 및 FRAT-2 유전자가 있다. 그러나, FRAT는 β-catenin의 인산화를 촉진한다고 알려진 Axin과는 달리 GSK3 억제 인자임이 밝혀졌고 (Ciani, L. et al ., J. Cell Biol ., 164:243, 2004; Yost, C. et al ., Cell, 93:1031, 1998), 아울러 GSK3과는 binding point 및 결합 형태가 다르다. 특히, Wnt와 전혀 관련이 없다고 할 수는 없으나, Axin-1이나 Axin-2 유전자 중 하나를 knock-out하면 정상적인 발생이 이루어지지 않지만(Chia, IV & Costatini, F., Mol . Cell Biol ., 25:4371, 2005), FRAT-1, -2, -3을 모두 knock-out시켜도 정상적인 발생이 가능하다는 점에서(van Amerongen, R. et al ., Genes De ., 19:425, 2005) FRAT 유전자가 Wnt 신호 전달에서 어떤 역할을 하는지 아직 명확하지 않다.

Axin 유전자는 GSK3α 및 GSK3β를 핵에서 세포질로 이동시키는 기능(nuclear export function)에 의해 핵 내부에 존재하는 GSK3의 농도를 낮추고, 결과적으로 Snail과 같은 핵 전사 조절 단백질의 인산화를 억제한다. 특히, Wnt signaling은 β-catenin을 경유하여 Axin2의 전사 및 활성을 증가시키고, 결과적으로 Axin2에 의한 GSK3의 nuclear export function에 의하여 핵 내부의 GSK3 농도를 감소시킨다. 즉, Wnt signaling에 의한 β-catenin의 활성화는 이차적으로 GSK3의 nuclear export function 기능을 가지는 Axin2를 활성화시켜 핵 내부의 GSK3 농도를 낮추고, 이를 통해 핵에 존재하는 다양한 조절 인자의 인산화를 억제한다.

따라서, 본 발명에서 새롭게 규명한 Axin에 의한 GSK3의 nuclear export function을 바탕으로, Axin의 활성화에 기여하는 β-catenin의 활성을 억제시키거나, β-catenin의 활성에 직접적으로 관여하는 Wnt/β-catenin pathway 상의 Wnt 신호전달을 억제시킬 경우, 궁극적으로 세포핵 내의 GSK3이 세포질로 이동하는 막을 수 있고, 이를 통해 Wnt signaling에 의해 발생 또는 진행되는 다양한 질환의 예방 및 치료에 적용할 수 있을 것이다.

지금까지 GSK3 활성을 억제하는 약물에 대한 개발이 많이 이루어져 왔으나, GSK3 활성을 증가시켜 Wnt signaling에 의한 질환의 발병 및 진행을 억제하는 개념과 물질은 알려져 있지 않은 실정이다. 본 발명에서는 새롭게 규명한 Axin에 의한 GSK3의 nuclear export function을 근거로 Wnt signaling에 의한 질환의 발병 및 진행을 억제하는 구체적인 방법과 물질을 제시하고 있다. 즉, β-catenin을 경유하여 발생하는 수많은 질환이 Wnt signaling pathway 상의 Axin에 의한 핵 내부의 GSK3 농도 조절 이상에 기인한 것이므로, β-catenin과 Axin의 nuclear export function을 표적으로 하여 핵 내부의 GSK3 농도 저하를 억제시킨다면, 암 발생 및 전이, 다양한 만성 면역질환을 치료하는 새로운 개념의 방법 및 물질의 개발이 가능하다.

Axin에 의한 GSK3의 nuclear export function이 수행되기 위해서는 Axin과 GSK3간의 긴밀한 구조 접촉이 필수적이다. 이미 밝혀진 Axin-GSK3 결합 구조에 따르면 Axin1의 아미노산 383~401 또는 Axin2 365~385 부위가 α-helix를 이루고, 그 가운데의 hydrophobic residues들이 GSK3β의 helix(아미노산 262~273) 및 extended loop(아미노산 285~299)으로 형성된 홈(groove)에 결합하게 된다.

한편, 단백질을 세포 내로 효과적으로 전달할 수 있는 단백질 형질도입 도메인(protein transduction domain, PTD; Joliot, A. et al ., Nature Cell Biol., 6:198, 2004; 미국특허 2006/0222657A1)이 알려져 있다. 또한, 마크로피노좀(macropinosome) 또는 엔도좀(endosome)에 의한 생물학적 활성 감소를 회피할 수 있는 인플루엔자 막 융합 단백질(influenza membrane fusion protein)인 헤마글루티닌2(haemagglutinin2, HA2 domain; Skehel, J.J. et al., Biochem . Society Med., 10:310, 2004; Jehangir, S.W. et al ., Nature Medicine, 10:310, 2004; Loredana Vaccaro et al ., Biophysical J., 88:25, 2005)가 발견되기도 하였다. 이러한 기술을 이용하여 생물학적 활성을 기대할 수 있는 다양한 펩티드에 대한 세포 내 전달이 다각적으로 시도되고 있다. 그러나, 이는 펩티드의 세포 내 전달 가능성을 입증한 초기 단계로서 그 가능성은 확인되고 있을 뿐, 실제 이를 이용하여 질병을 치료하는 방법이나 물질을 제시하는 것은 거의 없는 실정이다. 그 이유는 인체 내의 여러 가지 질병에 관여하는 물질들이 어떻게 상호작용하여 질병에 이르는지 예측하기 어려울 뿐만 아니라, 수많은 예외적인 상황을 정확하게 제어하면서 실험을 통해 입증하는 것이 지극히 난해하고 창의적인 통찰력을 필요로 하는 작업이기 때문이라 할 것이다.

본 발명에서는 Wnt signaling pathway 상의 Axin에 의한 GSK3 nuclear export function과 이것이 질병의 원인임을 처음으로 밝혀냈고, 이를 바탕으로 상기 선행 기술들을 유기적으로 결합하여 구체적으로 질병을 치료하는 전혀 새로운 방법과 이에 유용한 물질을 제시한다.

이에, 본 발명자들은 핵 내부의 GSK3 농도 감소로 인해 발생하는 질환을 치료하기 위한 방법과 물질을 개발하고자 예의 노력한 결과, 글리코겐 신타아제 카이네이즈 3(glycogen synthase kinase 3, GSK3)과 결합하는 GBD(GSK3 binding domain) 또는 Axin과 결합하는 ABD(Axin binding domain) 및 세포막 수용체의 도움 없이 세포막을 투과할 수 있게 하는 PTD를 포함하는 폴리펩티드가 핵 내부의 GSK3 농도 감소에 의해 발생되는 다양한 질환을 치료하는데 유용하다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 주된 목적은 Axin과의 결합에 의해 세포핵에서 세포질로의 GSK3 이동을 억제하는 폴리펩티드를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩티드 제조용 재조합벡터, 상기 재조합벡터로 형질전환된 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 Axin과의 결합에 의한 GSK3의 이동을 억제하는 폴리펩티드의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩티드를 유효성분으로 함유하는 암 세포의 성장 및 전이 억제용 약학 조성물 및 면역 질환 치료용 약학 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 Axin과의 결합을 통해 GSK3이 세포핵 밖으로 이동하여 세포핵 내에서 GSK3의 농도가 저하되는 것을 억제하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 세포막 수용체 없이 세포막을 투과할 수 있게 하는 PTD(protein transduction domain); 및 (b) 글리코겐 신타아제 카이네이즈 3(glycogen synthase kinase 3, GSK3)과 결합하여 핵 내부의 GSK3이 세포질로 이동하는 것을 억제하는 GBD(GSK3 binding domain)를 포함하는, 세포핵에 서 세포질로의 GSK3 이동을 억제하는 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 세포막 수용체 없이 세포막을 투과할 수 있게 하는 PTD(protein transduction domain); 및 (b) Axin과 결합하여 핵 내부의 GSK3이 세포질로 이동하는 것을 억제하는 ABD(Axin binding domain)를 포함하는, 세포핵에서 세포질로의 GSK3 이동을 억제하는 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 또한, 세포막 수용체 없이 세포막을 투과할 수 있게 하는 PTD(protein transduction domain)를 코딩하는 염기서열 및 글리코겐 신타아제 카이네이즈 3(glycogen synthase kinase 3, GSK3)과 결합하여 Axin에 의한 핵 내부의 GSK3가 세포질로 이동하는 것을 억제하는 GBD(GSK3 binding domain)를 코딩하는 염기서열을 함유하는 재조합벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 세포막 수용체 없이 세포막을 투과할 수 있게 하는 PTD(protein transduction domain)를 코딩하는 염기서열 및 Axin과 결합하여 핵 내부의 GSK3이 세포질로 이동하는 것을 억제하는 ABD(Axin binding domain)를 코딩하는 염기서열을 함유하는 재조합벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합벡터로 형질전환된 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 세포핵에서 세포질로의 GSK3 이동을 저해하는 폴리펩티드의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 폴리펩티드를 유효성분으로 함유하는 암 세포의 성장 및 전이 억제용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 폴리펩티드를 유효성분으로 함유하는 면역 질환 치료 용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 폴리펩티드가 nano 물질이나 Quantum dot(Q-dot)에 결합되어 있는, 세포핵 내 GSK3 농도 감소에 의해 발생되는 질병을 치료하기 위한 제제를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 치료용 유전자와 그 전달체를 함유하는 유전자 치료제를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 폴리펩티드가 nano 물질이나 Quantum dot(Q-dot)에 결합되어 있는, GSK3 감소에 의해 발생되는 질병을 진단하기 위한 진단제를 제공한다.

본 발명은 또한, (a) Axin이 결합하는 GSK3 부위의 봉쇄; (b) GSK3이 결합하는 Axin 부위의 봉쇄; (c) Axin의 활성화 억제; 및 (d) 세포핵 내 GSK3의 발현 증가로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 수단을 이용하는 것을 특징으로 하는, Axin과의 결합을 통해 GSK3이 세포핵 밖으로 이동하여 세포핵 내에서 GSK3의 농도가 저하되는 것을 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명은 핵 내부의 GSK3 농도 감소로 인해 발생하는 질환의 발생 및 진행 억제용 세포 투과성 폴리펩티드를 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 폴리펩티드는 생체 내로 투여되어 Axin에 의한 GSK3의 nuclear export function을 억제하고, 핵 내부의 GSK3 농도를 증가시킴으로써 핵 내부의 GSK3 농도가 낮아져서 발생 하는 다양한 질환의 발생 및 진행을 억제하는데 유용하다.

본 발명에서는 일련의 신호전달 체계, 즉, Wnt 신호 전달, β-catenin 활성화, Axin2 유전자 발현 증가로 이어지는 메카니즘을 규명하였다. 상기 메카니즘에 의해 세포 핵 내부의 GSK3이 nuclear export function에 의거 세포질로 이동하여 결국 세포 핵 내부의 GSK3 감소를 유도한다는 신호전달 체계의 세포학적 기전을 처음으로 규명하였다. 이를 근거로 GSK3의 농도 감소에 의해 유발되는 다양한 질환의 치료를 위한 기본 개념을 착안하게 되었다. 따라서, 본 발명은 Axin과 경쟁적으로 GSK3과 결합하여 핵 내부의 GSK3이 nuclear export function에 의해 세포질로 이동하는 것을 억제하는 방법 및 물질에 관한 것이다. 즉, Axin2와 같은 기능을 하는 폴리펩티드와 GSK3에 결합하되 GSK3의 기능에는 영향이 없거나 적은, GSK3의 nuclear export function을 효과적으로 억제할 수 있는 방법 및 물질에 관한 것이다.

본 발명자들은 아래의 설명에서 많은 선행논문을 활용하여 본 발명의 이론을 논리적으로 설명하고 있다. 그러나, 이러한 논리의 전개가 수없이 많은 선행논문들 중에서 (선행논문 중에는 서로 논리적으로 상반되는 결과를 나타내는 논문도 많고, 이 경우 더 많은 연구나 실험 등을 통해 합치되는 논문과 이론을 선택하고 찾아가는 과정을 거치게 됨) 상당한 창의력과 연구과정을 통해 선택하여 이루어진 것으로, 비록 선행논문에 있는 결과의 연결이기는 하나 그 자체로 대단히 의미있는 과 정을 거친 것이라 할 수 있다.

Axin과 GSK3의 결합부위가 구조적으로 밝혀진 바 있으나(Dajani et al ., EMBO J., 22:494, 2003), Axin에 의한 GSK3의 nuclear export function은 전혀 알려져 있지 않다. 지금까지 GSK3과 결합하는 부위로 알려져 있는 Axin1의 아미노산 383~401 부위가 GSK3β의 helix(아미노산 262~273) 및 extended loop(아미노산 285~299)로 형성된 홈(groove)에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 특히, 페닐알라닌388(Phe388), 루신392(Leu392), 루신396(Leu396), 발린399(Val399)의 잔기로 구성된 hydrophobic ridge가 GSK3β와의 결합에 결정적인 역할을 한다. Axin1과 Axin2는 매우 유사한 구조를 가지고 있으며, 핵 내부의 GSK3을 세포질로 이동시키는 기능도 유사하다. 나아가 발생과정에서 Axin1과 Axin2를 치환하여도 정상적인 발생이 진행되는 것으로 보아 Axin1과 Axin2는 동일한 기능, 즉 매우 유사한 구조를 가지고 있는 것으로 추정된다 (Chia, I.V. & Costantini, F., Mol . Cell Biol ., 25:4371, 2005).

본 발명 과정에서는 수많은 시행착오 끝에 세포에서 Axin1이나 Axin2 발현을 유도하면 세포 핵 내부의 GSK3 발현이 급격히 감소하고 결과적으로 GSK3에 의해 인산화되어 분해되는 Snail 단백질의 발현이 강력하게 증가하는 것을 확인하였다.

한편, FRAT 유전자는 3개의 isoform, 즉 FRAT-1, -2, -3을 가지며, 이들 유전자도 세포핵의 GSK3을 세포질로 이동시키는 nuclear export function을 가지는 것으로 알려져 있다 (Franca-Koh, J. et al ., J. Biol . Chem ., 277:43844, 2002). 결합 구조상 약간의 유사성이 있을 수는 있으나, FRAT는 Axin과 그 구조가 다른 뿐 만 아니라, binding point 및 결합의 형태가 다르다. 특히 FRAT는 Wnt와 전혀 관련이 없다고 할 수는 없으나, Axin과는 달리 FRAT-1, -2, -3을 모두 knock-out 시켜도 정상적인 발생과정이 진행된다는 점에서 Wnt signaling pathway의 component인 Axin과는 상당한 차이가 있다. (Dajani et al ., EMBO J., 22:494, 2003; van Amerongen et al ., Genes Dev ., 19:425, 2005).

본 발명은 기존의 인산화 효소를 억제하고자하는 다양한 화합물 개발과는 근본적으로 다른 개념을 갖는다. 즉, 지금까지 인산화 효소를 억제하는 화합물은 ATP(Adenosin triphosphate)가 결합하는 kinase domain에 특이적으로 결합하는 약물의 개발이 대부분이었다. 그러나, 본 발명에 기술된 폴리펩티드는 kinase domain을 억제하는 것이 아니라, 오히려 Axin에 의한 GSK3의 nuclear export function을 억제함으로써 세포 핵 내부의 GSK3 kinase 활성도를 높인다는 점에서 기존의 인산화 효소 억제와는 근본적으로 개념이 다르다.

본 발명은 일 관점에서, 세포막 수용체의 도움 없이 세포막을 투과할 수 있게 하는 PTD(protein transduction domain); GSK3(glycogen synthase kinase 3)과 결합하여 Axin 등에 의한 GSK3의 이동(핵으로부터 세포질로의 이동) 기능을 억제하는 GBD(GSK3 binding domain); 마크로피노좀(macropinosome) 또는 엔도좀(endosome)에 의한 생물학적 활성감소를 회피할 수 있는 HA2 도메인(HD); 및 폴리펩티드가 핵 내부로 쉽게 이동하여 Axin에 의한 GSK3 nuclear function을 효과적으로 억제할 수 있는 nuclear localization signal을 함유하는, GSK3의 이동을 억제하는 세포 투과성 폴리펩티드 및 이와 유사한 기능을 가지는 화합물에 관한 것이 다.

본 발명에 있어서, 상기 폴리펩티드는 (c) 마크로피노좀(macropinosome) 또는 엔도좀(endosome)에 의한 생물학적 활성감소를 회피할 수 있는 HA2 도메인(HD)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있고, 세포핵 내의 GSK3이 세포질로 이동되는 것을 억제하는 NLS(nuclear localization signal)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 PTD는 TAT인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 GBD는 GSK3와 액신(axin)의 결합을 저해하는, 액신(axin) 유래 GSK3 결합 도메인인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 GBD는 서열번호 1~서열번호 7로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 폴리펩티드의 바람직한 구현예는, 도 1의 A에 나타난 바와 같이, PTD로 세포 투과성 TAT(cell permeable tat), macropinosome rescue를 위한 HA2(HA2 endosomal rescue signal) 및 hAxin2-GSK3 결합을 저해하는 GSK3 결합 도메인(hAxin2의 370~390 아미노산 서열)으로 구성된다. 핵 내부의 GSK3 농도를 증가시키기 위하여 상기 세포 투과성 폴리펩티드를 사용하는 것이 바람직하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 예컨대, Axin과 경쟁적으로 GSK3에 결합하여 Axin-GSK3 결합을 억제하고, 궁극적으로 세포핵의 GSK3 발현과 농도를 증가시킬 수 있는 화합물도 사용될 수 있다. 아울러 실시예 10에서 기술한 발현벡터를 아데노바이러스(adenovirus), 레트로바이러스(retrovirus)와 같은 바이러스 발현으로 치환하여 유전자 치료로 응용할 수도 있다.

본 발명에서는 상기 PTD로 TAT(RKKRRQRRR)를 사용하였으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 에컨대, TAT(transactivator of transcription) 대신에 AntHD(초파리homeoprotein atennapedia transcription protein), VP22(virus protein22) 펩티드 및 mph-1-btm(마우스 전사 억제 인자-1-biomolecule transduction mortif), Penetratin, Buforin II, Transportan, Ku70, Prion, pVEC, Pep-1, PTD-5, KALA (Joliot, A. et al., Nature Cell Biol., 6:198, 2004; Kabouridis, P.S., Trends Biotechnol ., 21:498, 2003) 등을 사용할 수도 있다.

본 발명에서는 세포 투과성 폴리펩티드가 세포막을 투과하여 엔도좀(endosome) 또는 마크로피노좀(macropinosome) 내부에 제한되어 있을 때, 이를 극복하기 위해 인플루엔자 바이러스 기원의 HA2 펩티드(Jehangir, S.W. et al., Nature Med., 10:310, 2004)를 사용하였으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 예컨대, 세포 투과성 펩티드가 지질 이중층(lipid bilayer)에 밀봉되어 있는 것을 회피할 수 있는 클로로퀸(cloroquine) 또는 수크로오스(sucrose)와 같은 약물이나 펩티드를 사용할 수도 있다.

인플루엔자의 헤마글루티닌(HA)는 바이러스 외피(viral envelope)의 성분인 글리코프로테인(glycoprotein)의 일종으로, 표적 세포에 바이러스가 부착하도록 하거나, 표적 세포막과 바이러스 외피 막(viral envelope membrane)이 융합하도록 매개하는 역할을 한다. 일반적인 바이러스 감염의 경우, 세포 표면에 부착된 바이러스는 엔도좀으로 들어가서 상대적으로 낮은 pH에 노출된다. 상기와 같은 pH의 변화는 HA의 아미노 말단이 많이 노출되는 형태적인 변화뿐 아니라, 바이러스 외피와 엔도좀 막 사이의 융합을 일으킨다.

HA는 HA1과 HA2의 2개의 폴리펩티드 단편으로 구성되어 있는데, HA1 단편은 시알릭산-결합 부위를 형성하여 숙주세포 표면에 부착하도록 매개하는 역할을 한다. HA2 단편은 막-스패닝 고정체(membrane-spanning anchor)를 형성하고, 상기 아미노-말단 부위가 융합 반응 메카니즘에서 작용하게 된다.

헤마글루티닌2(haemagglutinin2, HA2 domain)는 하나 이상의 T-헬퍼 세포 인지 부위를 가지지만, B-세포 인지부위는 가지지 않는다. 따라서, HA2 도메인에 결합된 항원에 대하여 T-의존성 면역학적 반응을 유발시키나, 그 자체에 대해서는 항체 반응을 유도하지 않는다. HA2 소단위는 바이러스의 지질 외막을 통해 일반적으로 연장된 카르복시 말단 근처의 소수성 아미노산 서열을 포함하기 때문에, 리포좀의 지질 이중층과의 결합을 촉진시켜 세포 내로 단백질을 효과적으로 전달할 수 있는 헬퍼펩티드로 적당하다. 또한, HA2와 PTD를 동시에 이용할 경우, 엔도좀(endosome)으로부터 세포질(cytoplasm), 핵(nucleus) 또는 다른 세포 내 기관으로 폴리펩티드, 단백질 등의 이종 분자(heterologous molecules)를 분비하는 기능이 향상되어 세포 내로의 투과를 촉진하는 것으로 알려져 있다 (미국특허 2006/0222657A1).

HA2와 유사한 기능을 하는 펩티드로는 인플루엔자 바이러스 유래 diINF-7 도메인, B형 간염바이러스(Hepatitis B virus, HBV) 유래TLM(translocation motif), 사람 유두종 바이러스(Human Papilloma Virus, HPV) 유래 L2 domain, 항생물질로 개발된 Histatin 5 도메인, 합성 펩티드인 dhvar4 도메인 및 dhvar5 도메인 등이 알려져 있다 (Stoeckl, L. et al ., Proc . Natl . Acad . Sci ., 103:6730 2006; Kamper, N., J. Virol ., 80:759, 2006; Mastrobattista, E. et al ., J. Biol . Chem ., 277:27135, 2002; den Hertog, A.L. et al ., Biochem . J., 379:665, 2004). 이들은 세포 내로 투입된 바이러스나 펩티드가 지질막에 둘러 싸여 있는 것을 뚫고 나와 세포질로 유리되도록 하는 기능(endosomal escape, endosomal rescue)을 한다.

본 발명에서는 상기 GBD로 Axin2 유래 펩티드인 서열번호 1의 hAxin2를 사용하였으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 예컨대, 서열번호 2~서열번호 7과 같이 다른 동물유래 펩티드도 사용할 수 있으며, GSK3과 결합하여 nuclear export function을 제한할 수 있다면 모두 사용이 가능하다. 상기 서열번호 1~서열번호 7의 펩티드는 Axin과 경쟁적으로 GSK3에 결합함으로써 GSK3의 nuclear export function을 억제한다.

아울러, 본 발명에 따른 폴리펩티드에 펩티드 합성시 핵 내부로 운반하는 아미노산 서열(nuclear localization signal, NLS)을 포함하도록 하면 Axin에 의한 GSK3의 nuclear export function을 더욱 효과적으로 억제할 수 있다. 대표적인 NLS로는 Simian Virus-40(SV-40)의 large T-antien에서 유래된 PKKKRKV(서열번호 8)가 있으나, 다양한 바이러스와 수많은 단백질에 존재하는 NLS 및 그 조합을 사용할 수 있다. 이러한 핵 내부로 이동시키는 NLS(nuclear localization signal)을 포함할 경우 약리적인 효과가 증진될 수 있다. 본 발명과 같이 세포 핵 내부의 GSK3 농도를 증가시키기 위해서는 NLS에 의해 그 효과가 증폭될 수 있으며 그 예는, 도 27에 나타난 바와 같이, NLS이 폴리펩타이드를 핵 내부로 강력하게 이동시키고 그 효과를 증폭한다는 것을 알 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 세포막 수용체의 도움 없이 세포막을 투과할 수 있게 하는 PTD(protein transduction domain); Axin과 결합하여 Axin 등에 의한 GSK3의 이동(핵으로부터 세포질로의 이동) 기능을 억제하는 ABD(Axin binding domain); 마크로피노좀(macropinosome) 또는 엔도좀(endosome)에 의한 생물학적 활성감소를 회피할 수 있는 HA2 도메인(HD); 및 폴리 펩티드가 세포질 내 혹은 핵 내부로 쉽게 이동하여 Axin에 의한 GSK3 nuclear function을 효과적으로 억제할 수 있는 nuclear localization signal을 함유하는, GSK3의 이동을 억제하는 세포 투과성 폴리펩티드 및 이들과 유사한 기능을 가지는 화합물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 ABD는 GSK3와 액신(axin)의 결합을 저해하는, GSK3 유래 Axin 결합 도메인인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서는 상기 ABD로 GSK3 유래 펩티드를 서열번호 9 또는 서열번호 10의 프라이머를 사용하여 클로닝하여 사용하였으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

서열번호 9 (GFP-ABL-F): 5'-atg gac gag ctg tac aag ggt acctta cta gga caa cca ata

서열번호 10 (GFP-ABL-R): 5'-tat tgg ttg tcc tag taa ggt acc ctt gta cag ctc gtc cat

예컨대, Axin2와 결합하여 GSK3의 nuclear export function을 제한할 수 있는 것이라면 제한 없이 사용이 가능하다. 상기 서열번호 8 또는 서열번호 9의 프라 이머를 이용하여 클로닝된 펩티드는 GSK3과 경쟁적으로 Axin에 결합함으로써 GSK3의 nuclear export function을 억제한다.

Wnt 신호전달에 의해 E-cadherin의 발현이 감소하고, β-catenin 및 Snail의 발현이 증가하며, 암 세포의 침윤성 성장 및 전이가 발생한다 (Yook, J.I. et al ., J. Biol. Chem ., 280:11740, 2005). β-catenin에 의한 Snail 인산화 조절과정을 모식화하면 도 2와 같다. 간략하게 설명하자면, β-catenin에 의해 Axin의 발현이 증가되고, Axin은 핵 내부의 GSK3과 결합하여 GSK3을 세포질로 이동시킨다. 이로 인해 Snail 발현이 증가하고 암 세포의 전이가 발생하게 된다. Wnt 신호전달에 의한 핵 내부의 GSK3 농도 조절 과정을 모식화하면 도 3과 같다. 따라서, Axin의 GSK3과의 결합 부위와 동일하거나 유사한 구조를 가지는 폴리펩티드 또는 화합물을 이용할 경우, Axin 등에 의한 GSK3의 nuclear export function을 억제함으로써 Wnt 신호전달 및 β-catenin 활성화에 의해 발생하는 다양한 질환의 발생 및 진행을 억제할 수 있다. 도 4는 Axin과 GSK3의 결합구조를 나타낸 것으로, Axin 유래 펩티드 단편(hAxin2의 370~390 아미노산 서열)에 의해 Axin이 GSK3과 결합하는 것을 알 수 있다 (Dajani et al ., EMBO J., 22:494, 2003). 이때 Axin 및 FRAT 단백질은 α-helix 구조를 가지고, 그 중간의 hydrophobic residue가 GSK3의 groove 구조에 결합하게 된다. 따라서, 이와 경쟁적으로 결합할 수 있는 폴리펩티드는 Axin이나 FRAT에 의한 GSK3의 nuclear export function을 억제할 수 있다. 또한, FRAT 유전자들도 Axin과 매우 유사한 구조를 이용하여 GSK3과 결합하는바, 이들로부터 유래한 폴리펩티드, 또는 유사한 α-helix 및 hydrophobic residues를 가지고 있는 폴 리펩티드는 GSK3의 nuclear export function을 억제하여 핵 내부의 GSK3 농도 감소를 억제할 수 있다.

본 발명에서는 또한, 지금까지 암 발생 과정에서 가장 중요한 인자로 알려진 β-catenin(Giles, R.H. et al ., Biochim . Biophys . Acta, 1653:1, 2003)의 새로운 기능과 조절 기전을 제시함으로써, β-catenin이 암 발생뿐만 아니라 암세포의 침윤성 성장과 전이를 유도하는 역할을 한다는 것을 제시한다. 일반적으로 사람에서 발생하는 암의 90% 이상에서 Wnt 신호전달체계의 유전적 돌연변이나 다른 이상이 관찰되어, 암 발생에 있어 Wnt 신호전달 체계가 가장 중요한 것으로 생각되나, Wnt 신호 전달에 대한 구체적인 조절 기전은 잘 알려져 있지 않다. 다만, Wnt 신호전달의 유전적 이상이 공통적으로 β-catenin 유전자를 활성화하고 이를 통해 암 발생과정이 진행된다는 것이다 (Reya, T. & Clevers, H., Nature, 434:843, 2005; Giles, R.H. et al ., Biochim . Biophys . Acta, 1653:1, 2003). 그러나, β-catenin 유전자의 활성화가 암 세포의 침윤성 성장이나 전이를 유도하는 개념과 세포학적 기전은 전혀 알려져 있지 않다. 본 발명에서는 β-catenin 유전자의 활성화가 Axin2 유전자 발현을 유도하고, Axin2 유전자는 세포핵에 존재하는 GSK3과 결합하여 GSK3의 nuclear export function을 수행하여 결국, 핵 내부의 GSK3 농도를 감소시킨다. 이로 인해, 결과적으로 GSK3에 의해 인산화 및 분해되는 Snail 유전자 발현이 증가하게 되는 것이다. 결국 Wnt 신호 전달에 의한 Snail 유전자의 발현 증가는 암세포의 침윤성 성장과 전이를 유도하고, 임상적으로는 지속적인 재발과 원격전이를 유발하게 된다 (Yook, J.I. et al ., J. Biol . Chem ., 280:11740, 2005).

지금까지의 대부분의 항암제나 β-catenin 표적 치료제는 암세포의 사멸(apoptosis)을 유도하는 물질로 개발되고 있다. 그러므로, 본 발명에서 제시하는 신호전달 기전은 지금까지 개발되었거나 향후 개발되는 β-catenin 표적 치료제의 새로운 치료 효과와 개념을 제시하는 것이다. β-catenin의 활성을 억제하는 방법으로는 β-catenin 전사복합체, 즉 LEF/TCF, CBP300등과 경쟁적으로 결합하여 β-catenin에 의한 전사조절을 억제하는 것이 많이 알려져 있다 (Poy, F. et al ., Nature Structural Biol ,, 8:1053, 2001; Clevers, H., Nature Rev . Drug Discov ., 5:997, 2006). 이 경우, 지금까지 개발된 약물의 대부분은 β-catenin을 표적화하여 세포의 apoptosis를 유도하는 효과를 기대하였다.

그러나, 본 발명에서는 이들 약물이 궁극적으로 Axin2 발현을 억제하여 세포 핵 내부의 GSK3 발현을 증가시키고 암 세포의 전이나 재발을 억제할 수 있는 가능성을 제시한다. 특히, 암 환자의 치료에 있어 기존의 β-catenin 표적 치료제나 본 발명에서 제시하는 복합체를 이용하여 지속적인 재발과 원격 전이를 억제하거나 조절한다면 암환자의 생존율과 생존기간을 최소 2배 이상 증가시킬 수 있을 것으로 판단되며, 나아가 기존 30년 이상 지속되었던 암 치료 개념을 획기적으로 바꿀 수 있을 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 세포핵에서 세포질로의 GSK3 이동을 억제하는 폴리펩티드를 유효성분으로 함유하는 암 세포의 성장 및 전이 억제용 약학 조성물 또는 면역 질환 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 폴리펩티드는 Wnt 신호 전달에 의해 촉진되는 암 세포의 전 이뿐만 아니라 류마티스성 관절염과 같은 자가면역, 퇴행성 질환의 발생과 진행을 억제하는데 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 폴리펩티드는 그 자체를 사용하거나 약제학적으로 허용가능한 산부가염 또는 금속 복합체, 예를 들어, 아연, 철 등과 같은 염의 형태로 사용할 수 있다. 보다 구체적으로, 산부가염은 염화수소, 브롬화수소, 황산염, 인산염, 말레산염, 아세트염, 시트로산염, 벤조산염, 숙신산염, 말린산염, 아스코로브산염 및 타르탈산염으로 구성된 군에서 선택된 것을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 폴리펩티드를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물은 통상적인 투여방법, 투여형태 및 치료목적에 따라 상기 유효성분을 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 매트릭스인 담체와 함께 혼합하여 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다. 또한, 다른 골 결함 치료에 유익한 다른 약재와 배합하여 사용할 수 있다. 이때, 목적하는 pH, 등장성, 안정성 등을 갖는 생리적으로 수용 가능한 단백질 조성물의 제법은 본 발명의 분야에서 따르는 통상적인 기술범위 내에 있는 것을 사용할 수 있다. 본 발명에서 상기 매트릭스는 생물접합성, 생물분해성, 기계적 특성, 미용적 외관 및 접촉 특성에 따라 황산칼슘, 트리칼슘포스페이브, 하드록시아파리트, 폴리락트산, 포릴무수물과 같은 생물 분해성 및 화학적 물질이나; 뼈 또는 피부 콜라겐, 기타 순수 단백질 또는 세포의 매트릭스 성분과 같은 생물 분해성 및 생물학적 물질; 소결된 히드록시아파티트, 바이오글래스, 알루미네이트 또는 기타 세라믹과 같은 비-생물 분해성 및 화학성 물질; 폴리락트산, 히드록시아파티트, 콜라겐 및 트리칼슘포스페이트와 같은 상술한 물질의 배합 물을 사용하는 것이 바람직하다. 하지만, 상기 담체로 본 발명이 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 부형제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 소르비톨, 만니톨, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 마그네슘 스타아레이트, 물, 메틸하이드록시벤조에이트(methylhydroxybenzoate), 프로필하이드록시벤조에이트(propylhydroxybenzoate), 탈크(talc), 광물유 등을 사용할 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 함유하는 약학 조성물은 치료 효과를 기대하는 부위에 주입하기 위해 점성형으로 주사되거나 캡술화하여 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여량은 사용되는 부형제나 매트릭스 등의 담체 종류, 환자의 치료 부위, 환자의 나이, 성별 및 다이어트, 감염의심도, 투여시간 및 기타 임상적 요인을 고려하여 조절될 수 있기 때문에 한정되지 않으나, 통상적으로 공지된 유효량은 체중을 고려하여 적정량을 연속적 또는 나누어 투여하고, 치료 효과를 관찰하며 추가 투여를 결정할 수 있다.

본 발명에 따른 폴리펩티드는 합성에 의해 간편하게 제작할 수 있으나, 상기 폴리펩티드를 구성하는 각각의 도메인을 코딩하는 염기서열을 포함하는 재조합벡터로 형질전환된 대장균이나 다른 종류의 박테리아, 효모 또는 곰팡이를 배양하여 제조할 수도 있다. 특히, 재조합 박테리아를 이용하여 운반체 단백질과 융합된 형태로 본 발명에 따른 폴리펩티드를 대량으로 제작하는 것이 가능하며, 합성된 폴리펩티드와 유사한 효과를 기대할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, GSK3 농도 감소로 인해 발생하는 질환의 발생 및 진행 억제용 세포 투과성 폴리펩티드 제조용 재조합벡터, 상기 재조합벡터로 형질전환된 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 GSK3 이동을 억제하는 폴리펩티드의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합벡터는 마크로피노좀(macropinosome) 또는 엔도좀(endosome)에 의한 생물학적 활성감소를 회피할 수 있는 HA2 도메인(HD) 또는 세포핵 내의 GSK3이 세포질로 이동되는 것을 억제하는 NLS(nuclear localization signal)을 코딩하는 염기서열을 코딩하는 염기서열을 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서는 도 1의 B와 같이, 폴리펩티드의 분리 정제 및 발현을 확인하기 위한 tag, hAxin2-GSK3 결합을 저해하는 GSK3 결합 도메인을 코딩하는 염기서열, 펩티드 합성시 핵 내부로 운반하는 아미노산 서열(nuclear localization signal, NLS)을 코딩하는 염기서열, macropinosome rescue를 위한 HA2를 코딩하는 염기서열 및 세포 내 투과성 PTD(protein transduction domain)를 코딩하는 염기서열을 pRSET 벡터에 삽입하여 재조합벡터를 제작한 후, 상기 재조합벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 배양하여 GSK3 농도 감소로 인해 발생하는 질환의 발생 및 진행 억제용 폴리펩티드를 제조하였다.

본 발명에서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있 다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 형질전환은 이미 잘 알려진 칼슘 클로라이드 방법이나 전기천공법(electroporation)(Neumann et al., EMBO J., 1:841, 1982) 을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다.

본 발명에 따른 유전자의 과발현을 위하여 사용되는 벡터는 당업계에 공지된 발현 벡터가 사용될 수 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 재조합벡터 내에 포함되게 된다. 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 재조합벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.

상술한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.

물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담 없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.

본 발명에 따른 폴리펩티드는 치료제로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 최근에 많이 개발되고 있는 다양한 nano 물질이나 Quantum dot(Q-dot)에 결합시켜 약물 검색 및 개발, 세포 내 유전자 조작, 환자 진단용 영상 촬영 등에 사용될 수 있다 (Kandere-Grzybowska, K. et al ., Nature Methods, 2:739, 2005; Gao, X. et al ., Nature Biotechnol ., 22:969, 2004; Xie, X.S. et al ., Science, 312:228, 2006; Rosi, N.M. et al ., Science, 312:1027, 2006; Giepmans, B.N.G. et al ., Science, 312:217, 2006; Won, J. et al ., Science, 309:121, 2005). 예를 들면, GSK3과 본 발명의 폴리펩타이드를 각기 다른 방출파장을 가지는 Q-dot으로 살아있는 세포에 레이블링하고 다양한 화합물 다양한 농도로 처리에 의한 두 가지의 Q-dot의 결합을 살아있는 세포(live cell imaging)에서 관찰하면 기존의 화학약제 스크링법에 비해 효율성과 특이성 및 신뢰성 대폭 증가시킬 수 있을 것이다.

본 발명에 따른 폴리펩티드를 nano 물질이나 Q-dot에 결합시켜 세포 내로 투여하면 암 세포의 침윤성 성장이나 전이를 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드가 nano 물질이나 Quantum dot(Q-dot)에 결합되어 있는, 세포핵 내 GSK3 농도 감소에 의해 발생되는 질병을 치료하기 위한 제제에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 치료용 유전자와 그 전달체를 함유하는 유전자 치료제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 상기 전달체는 레트로바이러스, 배큘로바이러스 등 유전자 전달체로 통상 사용되는 바이러스벡터를 사용할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 nano 물질이나 Quantum dot(Q-dot)에 결합시켜 세포 내로 투여할 경우, 세포의 동력학을 실시간 세포 영상으로 추적할 수 있어, 암세포 등과 정상세포를 구별할 수 있다. 따라서 본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드가 nano 물질이나 Quantum dot(Q-dot)에 결합되어 있는, GSK3 감소에 의해 발생되는 질병을 진단하기 위한 진단제에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 세포핵 내 GSK3 농도 감소에 의해 발생되는 질병은 암 또는 면역 질환인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서는 Wnt signaling pathway에서 Axin에 의한 GSK3의 nuclear export function(GSK3α 및 GSK3β를 핵에서 세포질로 이동시키는 기능)이라는 기전을 명확히 밝힘으로써, 실질적으로 세포핵 내의 GSK3 농도나 활성 저하를 억제하거나 유지 및 증가시키는 방법을 처음으로 제시하였다. 즉, Wnt signaling은 β-catenin을 경유하여 Axin2의 전사 및 활성을 증가시키고 결과적으로 Axin2에 의한 GSK3의 nuclear export function에 의하여 핵 내부의 GSK3 농도를 감소시킨다. Wnt signaling에 의한 β-catenin의 활성화는 이차적으로 GSK3의 nuclear export function 기능을 가지는 Axin2를 활성화시켜 핵 내부의 GSK3 농도를 낮추고, 이를 통해 핵에 존재하는 다양한 조절 인자의 인산화를 억제한다.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, (a) Axin이 결합하는 GSK3 부위를 봉쇄시키거나; (b) GSK3이 결합하는 Axin 부위를 봉쇄시키거나; (c) Axin의 활성화를 억제시키거나; 또는 (d) 세포핵 내 GSK3의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는, Axin과의 결합을 통해 GSK3이 세포핵 밖으로 이동하여 세포핵 내에서 GSK3의 농도가 저하되는 것을 억제하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 Axin이 결합하는 GSK3 부위의 봉쇄는 GSK3의 Axin 결합부위와 결합하는 화합물, 펩티드 또는 폴리펩티드를 이용하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 GSK3과 결합하는 Axin 부위의 봉쇄는 Axin의 GSK3 결합 부위와 GSK3과 결합하는 화합물, 펩티드 또는 폴리펩티드를 이용하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 본 발명에 따른 세포 투과성 폴리펩티드인 것이 바람직하다.

상기 Axin의 활성화 억제는 Wnt/β-catenin pathway 상의 Wnt 신호 전달을 억제하거나, β-catenin의 활성을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, Axin과의 결합을 통해 GSK3이 세포핵 밖으로 이동하여 세포핵 내에서 GSK3의 농도가 저하되는 것을 억제하는 데에는 본 발명에 따른 제제 및 유전자 치료제를 사용할 수도 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: Wnt 신호 전달에 의한 E- cadherin 의 발현 및 β- catenin 의 활성화

형광 나노비드로 레이블(label)되고 Mock 발현벡터가 도입된 MCF-7 세포(ATCC, American Type Culture Collection, HTB-22) (MCF-7/Mock) 및 Wnt-1 발현벡터가 도입된 MCF-7 세포(MCF-7/Wnt)를 4% 포름알데히드(formaldehyde)로 고정하고, 0.1% Triton-100에 침투시킨 후, anti-E-cadherin(Zymed Laboratories) 항체 및 anti-β-catenin(BD Bioscience) 항체로 염색한 다음, Alexa-Fluor-594가 레이블된 2차 항체로 염색하여 전자현미경으로 관찰하였다. Torto-3(Molecular Probes) 또는 DAPI(Molecular Probes)는 핵을 염색하는데 사용하였다. 그 결과, MCF-7/Wnt 세포에서 E-cadherin의 발현이 감소되었고, β-catenin은 활성화된 것을 확인할 수 있었다 (도 5).

실시예 2: Wnt 신호전달 및 Snail 유전자에 의한 E- cadherin 의 활성화 및 전이

상기 MCF-7/Mock 세포 및 MCF-7/Wnt 세포에서의 E-cadherin, β-catenin 및 Snail의 발현 여부를 웨스턴 블럿으로 확인하였다. 그 결과, MCF-7/Wnt 세포에서 E-cadherin의 발현은 감소하였으나, β-catenin 및 Snail의 발현은 증가하였다 (도 6의 A). 이는 Wnt 신호전달에 의해 E-cadherin의 발현이 감소한다는 것을 의미한다.

상기 MCF-7/Mock 세포 및 MCF-7/Wnt 세포에서 Snail 유전자를 short hairpin RNA(sh-RNA)로 knockdown(Snail-sh-RNA)시킨 후, E-cadherin 프로모터의 활성화 여부를 확인한 결과, E-cadherin 프로모터의 활성이 증가하였다 (도 6의 B). 이는 Snail 유전자에 의해 E-cadherin의 활성이 감소한다는 것을 의미한다.

MCF-7 세포를 fluoresbrite carboxylate nanospheres(Polysciences, Inc.)로 레이블하고, 11주된 chick embryo의 chick chorioallantoic membrane(CAM) 위에서 배양한 후, 고정된 CAM의 절삭면에서 전이(invasion) 여부를 형광현미경으로 관찰하였다. 그 결과, MCF-7/Mock 세포는 CAM 표면에 남아있고 전이가 나타나지 않았으나, MCF-7/Wnt 세포에서는 CAM 표면을 가로질러 전이가 일어났다. 또한, MCF-7/Wnt 세포의 경우, E-cadherin은 세포-세포의 경계에서 발현되었고, β-catenin은 핵 내로 이동한 것을 확인할 수 있었다 (도 6의 C). 이는 Wnt 신호전달은 Snail 유전자의 안정화 과정을 통해 암 세포의 전이를 억제하는 것을 의미한다.

상기 MCF-7/Wnt 세포에서 Snail 유전자를 short hairpin RNA로 넉다운시킨(Snail-sh-RNA) 경우 전이가 일어나지 않았다 (도 6의 D). 이는 Snail 유전자가 전이에 관여한다는 것을 나타내는 것이다.

실시예 3: β- catenin 에 의한 E- cadherin 의 활성화 및 전이

MCF-7 세포에 S33Y β-catenin 발현벡터(Yook et al ., Nature Cell Biol ., 8:1398, 2006)가 도입된 형질전환체(S33Y-β-catenin) 및 상기 MCF-7/Mock 세포에서 E-cadherin 프로모터의 활성화 여부를 확인하였다.

그 결과, S33Y-β-catenin 세포의 경우, 전이가 일어나고 MCF-7/Wnt 세포와 유사하게 E-cadherin 프로모터의 활성화가 감소하였다 (도 7의 A). 이는 β-catenin의 활성화만으로도 암 세포의 침윤성 성장 및 전이과정이 촉발될 수 있다는 것을 의미한다. 아울러, β-catenin을 표적으로 하는 약물이 암 세포의 사멸(apoptosis) 뿐만 아니라, 암세포의 전이를 억제하는 데에도 효과적이라는 것을 보여주는 것이다.

또한, MCF-7/Wnt 세포에 dominant-negative TCF(DN-TCF) 발현벡터를 도입하여 CAM(chick chorioallantoic membrane) 상에서 배양한 후, 전이 여부를 확인한 결과, 전이가 일어나지 않았다 (도 7의 B).

실시예 4: β- catenin 에 의한 Snail 유전자의 발현 및 E- cadherin 조절

Mock, Snail 및 S33Y의 Topflash 활성도를 측정한 결과, S33Y에서 가장 높은 활성도를 나타내었다 (도 8의 A). 이는 β-catenin의 활성화가 Snail 유전자의 반감기를 증가시켜 발현을 증가시킨다는 것을 의미한다.

상기 MCF-7 세포에 S33Y β-catenin 발현벡터가 도입된 형질전환체(MCF-7/S33Y)에서 Snail mRNA의 발현 여부를 RT-PCR로 확인한 결과, MCF-7/Mock 세포와 MCF-7/S33Y 세포에서 유사한 정도로 Snail mRNA가 발현된 것으로 나타났다. 이 결과로부터, β-catenin에 의해 Snail mRNA 발현이 유도되지는 않는다는 것을 알 수 있었다 (도 8의 B).

MCF-7 세포에 S33Y β-catenin-myc 발현벡터, Snail-flag 발현벡터 및/또는 DN-TCF-Flag 발현벡터를 코-트랜스펙션(co-transfection)하여 Snail 유전자의 발현 여부를 확인하였다. 그 결과, MCF-7 세포에 S33Y β-catenin-myc 발현벡터 및 Snail-flag 발현벡터가 도입된 형질전환체에서는 Snail 유전자의 발현이 증가한 반면, S33Y β-catenin-myc 발현벡터, Snail-flag 발현벡터 및 DN-TCF-Flag 발현벡터를 코-트랜스펙션시킨 경우에는 Snail 발현이 감소하였다 (도 8의 C). 이는 β-catenin-TCF 축이 Snail 유전자의 발현을 조절한다는 것을 의미한다.

MCF-7 세포에 S33Y β-catenin 발현벡터가 도입된 형질전환체(MCF-7/S33Y)에서 Snail mRNA의 발현 여부를 확인한 결과, MCF-7/S33Y 세포에서 Snail의 발현이 증가하였다 (도 8의 D). 이는 β-catenin이 Snail의 발현을 증가시킨다는 것을 의미한다.

상기 MCF-7/Mock 세포, MCF-7/S33Y 세포, MCF-7 세포에 S33Y β-catenin 및 epitope-tagged Snail을 코-트랜스펙션시킨 형질전환체(MCF-7/S33Y DN-TCF), MCF-7 세포에 S33Y β-catenin 및 Scr를 도입한 형질전환체(MCF-7/S33Y Scr) 및 MCF-7 세포에 S33Y β-catenin 및 small inhibitory RNA(siRNA)으로 넉다운(knockdown)시킨 Snail 유전자를 도입한 형질전환체(MCF-7/S33Y Snail siRNA)에서 E-cadherin의 활성도를 측정하였다.

그 결과, MCF-7/S33Y 세포 및 MCF-7/S33Y Scr 세포에서는 E-cadherin의 활성이 감소하였으나, MCF-7/S33Y DN-TCF 세포 및 MCF-7/S33Y Snail siRNA 세포에서는 활성이 다시 증가하였다 (도 9의 A). 이는 β-catenin의 활성화가 Snail 유전자를 경유하여 E-cadherin 발현을 감소시킨다는 것을 의미한다. 또한, 도 9의 B에 나타나 바와 같이, MCF-7/S33Y Scr 세포에서는 전이가 일어나는데 비해, MCF-7/S33Y Snail siRNA에서는 전이가 일어나지 않았다.

실시예 5: Axin2 에 의한 Snail 발현 및 전이

β-catenin의 활성화가 Axin2 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 MCF-7/S33Y 세포에서 Axin1 및 Axin2 mRNA의 발현 정도를 RT-PCR로 측정하였다. 그 결과, MCF-7/S33Y 세포에서 Axin1의 발현은 변화하지 않았으나, Axin2는 발현이 증가되었다 (도 10의 A). 이는 β-catenin이 Axin2의 발현을 증가시킨다는 것을 나타낸다.

또한, Axin2의 존재하에서 Snail의 발현 여부를 확인하였다. 그 결과, MCF-7/Mock 세포의 경우 Snail 및 Axin2가 발현되지 않았으나, MCF-7 세포에 Axin2 발현 벡터를 도입한 경우 Snail의 발현이 증가하였다 (도 10의 B).

Axin2의 존재하에서의 Snail의 반감기를 pulse-chase analysis로 측정하였다. MCF-7 세포를 1.0㎍ pCR3.1-Snail-FLAG 발현벡터 및 1.0㎍ mock 발현벡터 또는 1.0㎍ Axin2 발현벡터로 코-트랜스펙션한 후, 메티오닌/시스테인-프리 배지(Met/Cys-free medium)에서 20분 동안 50μCi/㎖ [³⁵S]Met/Cys(PerkinElmer Life Sciences)로 레이블한 다음, 세척하여 0, 2, 4, 8시간 동안 배양하였다. 세포 lysate를 anti-FLAG-M2-아가로오스 비드(Sigma)로 immunoprecipitation한 후, SDS-PAGE/autoradiography를 수행하였다. 그 결과, MCF-7/Snail/Mock 세포는 시간이 경과할수록 Snail의 반감기가 감소하였으나, MCF-7/Snail/Axin2 세포는 Snail의 반감기가 그대로 유지되었다. 이는 Axin2가 Snail의 반감기를 증가시킨다는 것을 의미한다 (도 10의 C).

MCF-7 세포에 Axin2 및 Scr을 코-트랜스펙션하거나, MCF-7 세포에 Axin2 및 Snail siRNA(small inhibitory RNA)를 코-트랜스펙션한 후, CAM 표면에서 배양하여 전이 여부를 확인하였다. 그 결과, 도 10의 D에 나타난 바와 같이, MCF-7/Axin2/Scr 세포에서는 전이가 일어나는데 비해, MCF-7/Axin2/Snail siRNA 세포에서는 전이가 일어나지 않았다. 이는 β-catenin의 활성화가 Axin2 발현을 증가시키고, Axin2는 Snail의 반감기를 증가시켜 안정화시키며, 침윤성 성장 및 전이를 촉발한다는 것을 의미한다. 즉, Axin2에 의해 β-catenin에 의한 Snail 인산화 억제 과정이 이루어진다는 것을 의미한다.

실시예 6: Axin2 에 의한 GSK3 β의 이동

Axin2에 의한 GSK3β의 이동 여부를 확인하기 위하여, MCF-7 세포에 HA-tagged GSK3β 및 mock 발현 벡터를 도입하거나, MCF-7 세포에 HA-tagged GSK3β 및 Flag-tagged Axin2를 도입한 후, GSK3β 위치를 확인하기 위한 항-HA 항체, Axin2의 위치를 확인하기 위한 항-Flag 항체 또는 핵을 확인하기 위한 Toto-3으로 염색하여 confocal laser microscopy로 관찰하였다. 그 결과, GSK3β는 mock 발현벡터가 도입된 형질전환체에서는 세포질 및 핵에 위치하였으나, Axin2가 도입된 형질전환체에서는 세포질에 위치하는 것을 확인할 수 있었다 (도 11의 A).

또한, 상기 형질전환체의 전체 세포 lysate 및 핵 추출물에서 GSK3β의 발현여부를 확인한 결과, 전체 세포 lysate에서는 GSK3β의 발현 정도가 동일하였으나, Axin2가 도입된 형질전환체에서는 핵 추출물에서 GSK3의 발현 정도가 감소하였고, Snail의 발현은 증가하였다 (도 11의 B). 이는 Axin2가 GSK3을 핵 밖으로 이동시켜, GSK3에 의한 Snail 인산화가 억제된다는 것을 보여준다.

MCF-7 세포를 wild-type, D9-GSK3β 및 Y216F-GSK3β와 Snail 발현벡터를 코-트랜스펙션한후, 전체 세포 lysate 및 핵 추출물에서 GSK3β의 발현 여부를 확인한 결과, wild-type, D9-GSK3β(△9) 및 Y216F-GSK3β는 전체 세포 lysate에서는 동일한 정도로 발현되었으나, Y216F-GSK3β는 핵 추출물에서는 발현이 감소하였다. 또한, 핵 추출물에서 wild-type 및 D9-GSK3β는 Snail의 발현 정도가 감소하였다 (도 11의 C). 이는 핵 내부의 GSK3의 농도가 Snail의 발현을 조절한다는 것을 보여준다.

실시예 7: GSK3 에 작용하는 Axin2 의 작용기작

도 12의 A는 사람, 쥐, 닭의 Axin2 유전자에 존재하는 chromosome maintenance region 1(CRM1) 핵 수용체-의존적 경로(nuclear receptor-dependent pathway)를 경유하여 nuclear trafficking을 조절하는 leucine-rich nuclear export signal(NES)를 나타낸 것이다. NES-1, NES-2 및 NES-3은 루신을 아르기닌으로 바꾸어 돌연변이를 일으킨 것이다.

Axin2가 도입된 형질전환체를 CRM1 억제제인 렙토마이신 B(leptomycin B, LMB)의 존재하에서 배양하여 Axin2 및 GSK3β(glycogen synthase kinase-3β)의 위치를 확인하였다. 그 결과, LMB를 처리하면 Axin2 및 GSK3β가 핵 안에 위치하였고, 핵 추출물에서의 발현이 증가하였다 (도 12의 B). 이는 Axin2에 존재하는 nuclear export signal(NES)이 핵 내부의 GSK3을 세포질로 이동시키는 역할을 한다는 것을 의미한다.

또한, MCF-7 세포에 mock 발현벡터를 도입하거나, Snail 발현벡터와 결합된 wild-type Axin2, NES-1, NES-2, NES-3 및 GSK3-binding domain-deleted(△GSK3) 발현벡터를 도입하여 GSK3β의 발현 여부 및 E-cadherin 프로모터의 활성도를 확인하였다. 그 결과, wild-type Axin2, NES-1, NES-2 및 NES-3 형질전환체의 경우 전체 세포 추출물에서는 동일한 정도로 발현되었으나, wild-type Axin2, NES-1 및 NES-2의 경우 핵 내의 GSK3β의 발현이 감소하였고, NES-3 및 △GSK3 형질전환체는 핵 내의 GSK3β의 발현이 정상 수준으로 유지되었으며, Snail의 발현은 감소하였다. E-cadherin 프로모터의 활성도의 경우, wild-type Axin2, NES-1, NES-2 및 NES-3 형질전환체에서 활성도가 감소하였다 (도 12의 C). 이는 Axin2가 핵 내부의 GSK3을 세포질로 이동시키고 Snail의 발현을 증가시켜 E-cadherin의 발현을 감소시킨다는 것을 나타낸다.

실시예 8: β- catenin 에 의한 Axin2 유전자 발현 유도와 핵 내부의 GSK3 및 Snail 조절 기작

MCF-7 세포에 S33Y β-catenin 및 Snail 발현벡터를 코-트랜스펙션한 후, Axin2 mRNA의 발현 정도를 RT-PCR로 확인하였고, 핵 내부의 GSK3 및 Snail의 양은 웨스턴 블럿으로 확인하였다.

그 결과, S33Y β-catenin에 의해 Axin2 mRNA는 증가하였고, 핵 내부의 GSK3는 감소하였으며, 핵 내부의 Snail의 양은 증가하였다 (도 13). 이는 β-catenin의 활성화는 Axin2 발현을 증가시키고, Axin2에 의한 GSK3의 nuclear export function에 의해 핵 내부의 GSK3 농도가 감소되어, 결국 Snail의 안정화 및 E-cadherin 발현 감소로 인한 암 세포의 침윤과 전이가 일어난 것으로 해석할 수 있다.

실시예 9: 사람 암 조직에서 Axin2 가 Snail 발현에 미치는 영향

사람의 정상 유방 조직 및 유방암 조직에서 Axin2 및 Snail의 발현을 면역염색법(immunohistochemistry)으로 관찰하였다. 일산 병원 병리학실에서 얻은 파라핀에 담궈진 유방암 조직 및 정상 유방 조직에서 파라핀을 제거한 후, 크실렌(xylene) 및 graded alcohol을 사용하여 수화한 다음, citrate 버 퍼(DakoCytomation, Denmark) 및 마이크로웨이브 히팅을 이용하여 항원 검출하고, 샘플을 3-아미노-9-에틸-카바졸 및 메틸 그린을 사용한 아비딘-바이오틴 복합체 퍼옥시데이즈 테크닉에 의한 자동 시스템(Techmate 500+, DakoCytomation)으로 염색하였다. 그 결과, 암의 진행 정도에 따라 Axin2 및 Snail의 발현이 증가하였다 (도 14).

유방암 조직의 혈관 내 침윤과 임파절로의 전이 조직에서 Axin2 mRNA 및 Snail 발현 여부를 관찰하였다. 그 결과, Axin2 및 Snail의 발현이 모두 증가된 것을 확인할 수 있었다 (도 15). 즉, Axin2 발현에 의한 Snail 발현 증가 현상이 세포학적으로만 중요한 것이 아니라, 실제 사람의 유방암에서도 중요한 것임을 보여주는 것이다.

또한, 사람의 자궁경부암 세포에 Axin2 및 GSK3을 코-트랜스펙션하여 세포질과 핵 내부에서의 Axin2 및 GSK3 발현 정도를 확인하였다. 그 결과, 사람의 자궁경부암 세포에 Axin2 발현을 유도하면 핵 내부의 GSK3 농도가 감소하고, Snail 발현이 증가하였다 (도 16).

사람의 자궁 경부 조직에서의 Wnt1 mRNA 및 Wnt3a mRNA의 발현 정도를 면역염색법으로 관찰하였다. 그 결과, 암 발생이 진행될수록 Wnt1 mRNA 및 Wnt3a mRNA의 발현이 증가하였다 (도 17 및 도 18).

자궁 경부 전암 병소 및 암 세포에서의 Axin2 mRNA의 발현 정도를 확인한 결과, Axin2 mRNA의 발현이 증가하였다 (도 19). 또한, 자궁 경부 암 발생 과정에서 Snail 발현이 증가된 것을 확인할 수 있었다 (도 20).

침윤-전이성 자궁 경부 암 세포주에 shSnail(small hairpin RNA interference Snail) 및 shAxin2(small hairpin RNA interference Axin2)를 도입한 형질전환체를 이용하여 Snail 및 Axin2 유전자를 knock-down시킨 경우, 암 세포의 침윤성 성장 및 전이과정이 완전히 차단되었다 (도 21).

또한 세포에서 Wnt1 또는 Wnt3a를 발현시킨 결과, 핵 내부의 GSK3α 및 GSK3β의 발현이 모두 감소되었다 (도 22). 이는 Wnt 신호전달에 의해 핵 내부의 GSK3의 발현이 감소된다는 것을 의미한다.

실시예 10: GSK3 과의 특이적인 결합을 통해 핵 내부의 GSK3 발현을 증가시키는 폴리펩티드 및 발현벡터의 제작과 응용

Axin에 의한 GSK3의 nuclear export function을 특이적이고 효과적으로 억제하기 위하여, GSK3에 결합할 수 있는 Axin2의 도메인을 이용하여 GFP-융합(green fluorescent protein-fusion) 발현벡터를 제작하였다 (도 23). 특히 핵 내부의 GSK3과 결합을 유도하기 위하여, PCR(polymerase chain reaction) 방법을 이용하여 SV40 large T-항원에서 기원한 nuclear localization signal(NLS: PKKRKV: 서열번호 8)을 3개 연결한 벡터도 따로 제작하였다. 이때 GFP는 pCMS-EGFP 발현벡터(Clontech, USA)를 이용하였고, 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머를 이용한 PCR을 통해 GFP-NLS 융합 벡터를 제작하였다. 즉, pCMS-GFP로부터 GFP를 클로닝하고 GFP의 C-terminal에 3개의 연속된 NLS를 PCR 증폭을 통해 제작하고, 사람세포 발현 벡터인 pcDNA4-myc-his(Invitrogen, USA)의 HindIII~XbaI 위치에 클로닝하였 다. 이 벡터뿐만 아니라 앞으로 기술되는 GFP 융합 벡터나 TAT-재조합 융합 단백질을 위한 벡터는 모두 여러 단계의 PCR을 이용하여 증폭하였다.

서열번호 11: 5'-ctt ttt ctt agg cac cgc cac ctt tct ctt ctt ttt cgg ggt acc ctt gta cag ctc gtc cat

서열번호 12: 5'-ggc tcc acc tct aga tgg gac ctt ccg ttt ctt ctt tgg ggc ggg aac ttt acg ctt ttt ctt agg cac cgc

GFP 또는 GFP-NLS 발현벡터에 GSK3 결합 부위의 Axin을 융합하기 위하여, 서열번호 13 내지 서열번호 16의 프라이머를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 수행하였다. 즉, 위에서 제작된 GFP 발현 벡터와 Axin2 발현 벡터의 GSK3 결합 도메인을 상기 프라이머로 각각 1차 증폭한 다음, 이들을 함께 2차 증폭하여 융합 단백질 벡터를 구성한 후 상기 벡터와 같은 부위에 클로닝하였다.

GFP-F (서열번호 13): 5'-gga ggc cta ggc ttt tgc

GFP-Axin-F (서열번호 14): 5'-atg gac gag ctg tac aag ggt acc gag atg acc ccc gtg gaa

GFP-Axin-R (서열번호 15): 5'-ttc cac ggg ggt cat ctc ggt acc ctt gta cag ctc gtc cat

GFP-R (서열번호 16): 5'-cct gcc gcc tct aga gcg gct ctc caa ctc cag

또한 α-helix 부위의 hydrophobic residue의 역할을 학인하기 위하여, 상기 residues를 hydrophilic residue인 아르기닌(Arg)으로 치환한 것을 대조군으로 제작하였다. 이때 사용한 프라이머는 아래와 같다.

GBD-arg-R1 (서열번호 17): 5'-ctt ttc ccg cct cga gat ccg ctc agc tgc acg ggt ggc ggg ttc cac

GBD-arg-R2 (서열번호 18): 5'-cctgcc gcc tct aga gcg gct ctc ccg ctc ccg ctt ccg ctt ttc ccg cct cga gat

아울러 Axin에 의한 GSK3의 nuclear export function에 있어 GSK3 결합 부위 전방에 존재하는 GSK3 인산화 부위의 역할을 규명하고, 이를 응용하기 위하여 GSK3 인산화 부위를 포함한 발현벡터를 제작하였다. 이의 대조군으로 인산화 부위를 알라닌(Ala)으로 치환한 벡터를 제작하였다. 즉, Axin2의 296, 300 및 304 위치의 세린(serine)을 알라닌으로 치환하고, 이 위치가 포함되도록 프라이머를 제작한 다음, PCR을 통해 증폭하였다. 이때 사용한 프라이머는 아래와 같다.

NLS-GBD-F (서열번호 19): 5'-aaa cgg aag gtc cca tct gag atg acc ccc gtg gaa

NLS-GBD-R (서열번호 20): 5'-ttc cac ggg ggt cat ctc aga tgg gac ctt ccg ttt

NLS-GBD-GP-F (서열번호 21): 5'-aaa cgg aag gtc cca tctaat cct tat cac ata ggt

NLS-GBD-GP-R (서열번호 22): 5'- acc tat gtg ata agg att aga tgg gac ctt ccg ttt

제작된 각각의 벡터는 293 세포주(ATCC, CRL-1573)에 Lifectamine 2000(Invitrogen, USA)을 이용하여 transfection하고, 전술한 방법에 따라 nuclear fraction에서 GSK3 농도 증가 효과 및 특이성을 검증하였다. 이들 중 Snail 발현 감소와 암세포의 침윤성 성장을 억제하는 효과가 입증된 도메인은 GSK3의 이동을 억제하는 폴리펩티드 제작이나, 유전자 치료용 발현벡터 제작에 유용하다. 상기 발현벡터 또는 그 단편을 레트로바이러스 등 통상의 유전자 전달체에 삽입하거나, 상기 폴리펩티드를 nano 물질이나 Quantum dot(Q-dot)에 결합시켜 세포 내로 투입할 경우, 세포 내 GSK3 농도 감소 또는 발현 감소로 인해 발생하는 질병을 치료하는 유전자 치료제로 이용할 수 있다.

실시예 11: GSK3 - Axin 결합 억제용 폴리펩티드의 제조

GSK3에 결합하는 Axin2 도메인을 이용하여 GSK3의 nuclear export function을 저해하고, 핵 내부의 GSK3 농도를 높이기 위한 세포 투과성 폴리펩티드를 제작하였다. 즉, 폴리펩티드의 분리정제 및 발현을 확인하기 위한 tag, hAxin2-GSK3 결합을 저해하는 GSK3 결합 도메인(서열번호 1, hAxin2의 370~390 아미노산 서열)을 코딩하는 염기서열, 펩티드 합성시 핵 내부로 운반하는 아미노산 서열(nuclear localization signal, NLS)을 코딩하는 염기서열, macropinosome rescue를 위한 HA2를 코딩하는 염기서열 및 세포 내 투과성 PTD(protein transduction domain)를 코딩하는 염기서열을 pRSET(Invitrogen) 벡터에 삽입하여 재조합벡터를 제작한 다음 (도 1의 B), 상기 재조합벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 배양하여 GSK3 농도 감소로 인해 발생하는 질환의 발생 및 진행 억제용 폴리펩티드를 제조하였다.

실시예 12: GSK3 도메인 유래 Axin 결합 폴리펩티드 및 발현벡터의 제조 및 응용

GSK3이 결합하는 Axin 부위도 GSK3 유래 폴리펩티드를 사용하면, Axin에 의한 GSK3 nuclear export function을 효과적으로 억제할 수 있다. 이를 검증하기 위해 Axin에 결합할 수 있는 GSK3 유래 펩티드를 코딩하는 염기서열을 함유하는 발현벡터를 제작하였다 (도 24). 즉, 실시예 10에서 기술한 방법과 유사하게 서열번호 23~서열번호 25의 프라이머를 이용하여 사람 GSK3 유래 도메인을 GFP와의 융합벡터 형태로 제작하였다.

GFP-ABL-F (서열번호 23): 5'-atg gac gag ctg tac aag ggt acctta cta gga caa cca ata

GFP-ABL-R (서열번호 24): 5'-tat tgg ttg tcc tag taa ggt acc ctt gta cag ctc gtc cat

ABL-R (서열번호 25): 5'-cct gcc gcc tct aga atc ctt agt cca agg atg

상기 제작된 발현벡터는 전술한 실시예의 방법을 통해 Axin에 의한 GSK3의 nuclear export function을 효과적으로 억제하는지 검증하였다. 이들 중 Snail 발현 감소와 암세포의 침윤성 성장을 억제하는 효과가 입증된 도메인은 GSK3의 이동을 억제하는 폴리펩티드 제작이나, 유전자 치료용 발현벡터 제작에 유용하다. 상기 발현벡터 또는 그 단편, 혹은 상기 폴리펩티드를 코딩하는 염기서열을 레트로바이러스 등 통상의 유전자 전달체에 삽입할 경우, 세포 내 GSK3 농도 감소 또는 발현 감소로 인해 발생하는 질병을 치료하는 유전자 치료제로 이용할 수 있다. 또한, 상기 폴리펩티드를 nano 물질이나 Quantum dot(Q-dot)에 결합시켜 세포 내로 투입할 경우, 세포 내 GSK3 농도 감소 또는 발현 감소로 인해 발생하는 질병을 치료하는 제제로 이용할 수 있다.

실시예 13: 핵 내부의 GSK3 발현을 증가시키기 위한 nano 물질 제작

GSK3 또는 Axin과 특이적으로 결합하여 Axin에 의한 GSK3의 nuclear export function을 효율적으로 억제할 수 있는 nanobead, 또는 nanocrystal을 제작하였다. 시판중인 nanocrystal(Q-dot corp. USA)에 도 25와 같은 방법으로, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 conjugation시키고 세포 내로 투입시켰다. 세포 내로 투입된 Q-dots은 세포에 존재하는 GSK3에 특이적으로 결합하게 되는데, 이를 실시간 세포 영상 시스템(Real time live cell imaging system, DeltaVision RT, USA)으로 추적하면 실시간 영상을 얻을 수 있다 (도 26). 그 결과, TAT와 융합된 Q-dot이 세포 내로 들어가 GSK3과 결합하는 것을 볼 수 있었으며, 실시간 Q-dot을 추적하면, 도 26에 나타난 바와 같이, GSK3에 결합한 Q-dot의 세포 내 이동을 실시간으로 관찰할 수 있다.

이러한 실시간 세포 영상 시스템을 이용할 경우 세포의 동력학을 실시간으로 추적할 수 있고 암세포 등과 정상세포를 구별할 수 있으므로, 본 발명에 따른 폴리펩티드가 결합되어 있는 nano 물질 또는 Quantum dot(Q-dot)은 암과 같은 GSK3 감소에 의해 발생되는 질병을 진단하기 위한 진단제로 유용하다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통 상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 GSK3에 결합하는 Axin2 도메인을 이용하여 GSK3의 nuclear export function을 저해하고, 핵 내부의 GSK3 농도를 높이기 위한 본 발명에 따른 세포 투과성 폴리펩티드의 모식도이다 (A: Axin-GSK3 결합을 억제하는 세포 투과성 폴리펩티드; B: 본 발명에 따른 폴리펩티드 제조용 재조합벡터).

도 2는 Wnt 신호전달에 의한 β-catenin의 활성화, Axin2 발현 증가 및 핵 내부의 GSK3 조절을 나타낸 모식도이다.

도 3은 Wnt 신호전달에 의한 핵 내부 GSK3의 농도 조절과정에 대한 모식도이다.

도 4는 Axin과 GSK3의 결합 구조에 대한 모식도이다.

도 5는 Wnt 신호전달에 의한 E-cadherin 및 β-catenin의 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

도 6은 Wnt 신호전달 및 Snail 유전자에 의한 E-cadherin의 활성 및 전이에 미치는 영향을 나타낸 것이다 (A: Wnt 신호전달에 의한 E-cadherin, β-catenin 및 Snail 유전자의 발현에 미치는 영향; B: Snail 유전자에 의한 E-cadherin 프로모터의 활성도에 미치는 영향; C: Wnt 신호전달에 의한 전이; 및 D: Snail 유전자의 전이에 미치는 영향).

도 7은 β-catenin에 의한 전이 및 E-cadherin 프로모터의 활성화에 미치는 영향을 나타낸 것이다 (A: β-catenin의 활성화만으로도 암세포의 침윤성 성장과 전이 과정이 촉발되고, E-cadherin 프로모터의 활성화가 감소한다는 것을 나타낸 것; B: MCF-7/Wnt 세포에 dominant-negative TCF(DN-TCF) 발현벡터를 도입한 경우, 전이가 일어나지 않는다는 것을 나타낸 것).

도 8은 β-catenin의 Snail 유전자 및 E-cadherin의 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다 (A: Mock, Snail 및 S33Y β-catenin이 도입된 형질전환체의 Topflash 활성도; B: β-catenin의 Snail 유전자 발현에 미치는 영향; C: β-catenin-TCF 축의 Snail 유전자 발현에 미치는 영향; 및 D: β-catenin의 Snail 유전자 발현에 미치는 영향).

도 9는 β-catenin의 E-cadherin 발현에 미치는 영향 및 Snail 유전자의 전이에 미치는 영향을 나타낸 것이다 (A: β-catenin의 활성화가 Snail 유전자를 경유하여 E-cadherin 발현을 감소시키는 것을 도시한 것; B: MCF-7/S33Y Snail siRNA세포에서는 전이가 일어나지 않는다는 것을 나타낸 것).

도 10은 Axin2의 Snail 발현 및 전이에 미치는 영향을 나타낸 것이다 (A: β-catenin의 Axin2 발현에 미치는 영향; B: Axin2의 Snail 발현에 미치는 영향; C: Axin2의 Snail의 반감기에 미치는 영향; 및 D: Axin2의 전이에 미치는 영향).

도 11은 Axin2의 GSK3β에 미치는 영향을 나타낸 것이다 (A: Axin2의 GSK3β의 위치에 미치는 영향; B: Axin2가 핵 내부의 GSK3β 발현을 감소시킨다는 것을 나타낸 것; C: GSK3β와 Snail 발현과의 관계).

도 12는 GSK3에 작용하는 Axin2의 작용기작을 나타낸 것이다 (A: Axin2 유전자에 존재하는 nuclear export signal(NES); B: NES가 핵 내부의 GSK3을 세포질로 이동시키는 기능을 한다는 것을 나타낸 것; C: Axin2의 GSK3 및 E-cadherin 프로모 터의 활성화에 미치는 영향).

도 13은 β-catenin의 활성화가 Axin2 발현을 유도하고, Axin2는 핵 내부의 GSK3을 핵 외부로 이동시켜 핵 내부의 Snail 발현이 증가한다는 것을 나타낸 것이다.

도 14는 사람의 유방암 조직에서 Axin2 mRNA 발현 및 Snail의 발현이 증가한 것을 나타낸 것이다.

도 15는 사람의 유방암 조직에서 림프 혈관 내부로 전이하는 암 세포와 림프절로 전이한 암 조직에서 Axin2 발현 및 Snail 발현이 증가한 것을 나타낸 것이다.

도 16은 사람의 자궁경부암 세포에서 Axin2 발현 증가가 핵 내부의 GSK3 농도를 낮추고, Snail 발현을 증가시키는 것을 나타낸 것이다.

도 17은 사람의 자궁 경부 정상, 전암 병소 및 침윤성 암에서 Wnt1 mRNA 발현이 증가한 것을 나타낸 것이다.

도 18은 사람의 자궁 경부 정상, 전암 병소 및 침윤성 암에서 Wnt3a mRNA 발현이 증가한 것을 나타낸 것이다.

도 19는 사람의 자궁 경부 정상, 전암 병소 및 침윤성 암에서 Axin2 mRNA 발현이 증가한 것을 나타낸 것이다.

도 20은 사람의 자궁 경부 정상, 전암 병소 및 침윤성 암에서 Snail 발현이 증가한 것을 나타낸 것이다.

도 21은 자궁경부암 세포에서 Axin2 유전자 및 Snail 유전자를 knock-down시킨 경우 암세포의 침윤성 성장 및 전이가 차단되는 것을 나타낸 것이다.

도 22는 Wnt1 또는 Wnt3a 발현을 유도하면 핵 내부의 GSK3α 및 GSK3β의 발현이 모두 감소한다는 것을 나타낸 것이다.

도 23은 Axin2 유래 GSK3 결합부위 폴리펩티드와 발현벡터 제작을 위한 모식도이다.

도 24는 GSK3 유래 Axin 결합부위 폴리펩티드와 발현벡터 제작을 위한 모식도이다.

도 25는 nanobeads를 이용한 세포 핵 내부의 GSK3 발현 증가를 검증하기 위한 모식도이다.

도 26은 nanobeads에 cell permeable peptide, HA2, GSK3 binding domain을 결합시킨 다음, 세포 내로 투여하여 수득한 실시간 세포 영상이다.

도 27은 GFP(green fluoresecent protein)에 nuclear localization signal을 결합한 폴리펩타이드가 핵 내부로 특이적인 이동을 한다는 것을 보여주는 것이다.

<110> KIM, JUNG MOON KIM, JUNG KOOK KIM, TAE HAN LEE, JONG SUCK <120> Method and Materials for Inhibiting a Nuclear Export of GSK3 <130> P06-B305 <150> KR10-2006-0105210 <151> 2006-10-27 <150> KR10-2007-0009678 <151> 2007-01-30 <160> 25 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 61 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Pro Arg Thr His Arg Leu Pro Lys Glu Met Thr Pro Val Glu Pro Ala 1 5 10 15 Thr Phe Ala Ala Glu Leu Ile Ser Arg Leu Glu Lys Leu Lys Leu Glu 20 25 30 Leu Glu Ser Arg His Ser Leu Glu Glu Arg Leu Gln Gln Ile Arg Glu 35 40 45 Asp Glu Glu Arg Glu Gly Ser Glu Leu Thr Leu Asn Ser 50 55 60 <210> 2 <211> 60 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Pro Arg Thr Tyr Arg Met Pro Lys Glu Ile Arg Val Glu Pro Gln Lys 1 5 10 15 Phe Ala Glu Glu Leu Ile His Arg Leu Glu Ala Val Gln Arg Thr Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Glu Lys Leu Glu Glu Arg Leu Lys Arg Val Arg Met Glu 35 40 45 Glu Glu Gly Glu Asp Gly Glu Met Pro Ser Gly Pro 50 55 60 <210> 3 <211> 61 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 3 Pro Arg Thr Tyr Arg Met Pro Lys Asp Ile His Val Glu Pro Glu Lys 1 5 10 15 Phe Ala Ala Glu Leu Ile Asn Arg Leu Glu Glu Val Gln Lys Glu Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Glu Lys Leu Glu Glu Arg Leu Lys Arg Val Arg Ala Glu 35 40 45 Glu Glu Gly Glu Asp Ala Asp Ile Ser Ser Gly Pro Ser 50 55 60 <210> 4 <211> 61 <212> PRT <213> Xenopus sp. <400> 4 Pro Arg Thr Tyr His Met Pro Lys Asp Ile His Val Asp Pro Glu Lys 1 5 10 15 Phe Ala Ala Glu Leu Ile Ser Arg Leu Glu Gly Val Leu Arg Glu Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Gln Lys Leu Glu Glu Arg Leu Lys Arg Val Arg Ala Glu 35 40 45 Glu Glu Gly Asp Asp Gly Asp Val Ser Ser Gly Pro Ser 50 55 60 <210> 5 <211> 61 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Pro Arg Thr His Arg Leu Pro Lys Glu Met Thr Pro Val Glu Pro Ala 1 5 10 15 Ala Phe Ala Ala Glu Leu Ile Ser Arg Leu Glu Lys Leu Lys Leu Glu 20 25 30 Leu Glu Ser Arg His Ser Leu Glu Glu Arg Leu Gln Gln Ile Arg Glu 35 40 45 Asp Glu Glu Lys Glu Gly Ser Glu Gln Ala Leu Ser Ser 50 55 60 <210> 6 <211> 61 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 6 Pro Arg Thr His Arg Leu Pro Lys Glu Met Thr Pro Val Glu Pro Ala 1 5 10 15 Ala Phe Ala Ala Glu Leu Ile Ser Arg Leu Glu Lys Leu Lys Gln Glu 20 25 30 Gln Glu Thr Met Asp Ser Leu Glu Glu Arg Leu Gln Gln Ile Lys Glu 35 40 45 Asp Glu Glu Lys Glu Gly Leu Glu Leu Pro Ala Ser Leu 50 55 60 <210> 7 <211> 61 <212> PRT <213> Xenopus sp. <400> 7 Pro Arg Thr Met Arg Pro Pro Ala Glu Met Met Pro Thr Ser Pro Ala 1 5 10 15 Glu Phe Ala Ala Lys Leu Thr Ile Ala Leu Glu Lys Val Lys Lys Gln 20 25 30 Arg Asp Ala Glu Glu Lys Leu Glu Glu Lys Leu Gln Arg Ile Lys Glu 35 40 45 Glu Glu Glu Ile Ala Asp Tyr Asp Ile Pro Ser Ser Ser 50 55 60 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Simian virus 40 <400> 8 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 <210> 9 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 atggacgagc tgtacaaggg taccttacta ggacaaccaa ta 42 <210> 10 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 tattggttgt cctagtaagg tacccttgta cagctcgtcc at 42 <210> 11 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ctttttctta ggcaccgcca cctttctctt ctttttcggg gtacccttgt acagctcgtc 60 cat 63 <210> 12 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ggctccacct ctagatggga ccttccgttt cttctttggg gcgggaactt tacgcttttt 60 cttaggcacc gc 72 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ggaggcctag gcttttgc 18 <210> 14 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 atggacgagc tgtacaaggg taccgagatg acccccgtgg aa 42 <210> 15 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ttccacgggg gtcatctcgg tacccttgta cagctcgtcc at 42 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 cctgccgcct ctagagcggc tctccaactc cag 33 <210> 17 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 cttttcccgc ctcgagatcc gctcagctgc acgggtggcg ggttccac 48 <210> 18 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 cctgccgcct ctagagcggc tctcccgctc ccgcttccgc ttttcccgcc tcgagat 57 <210> 19 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 aaacggaagg tcccatctga gatgaccccc gtggaa 36 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 ttccacgggg gtcatctcag atgggacctt ccgttt 36 <210> 21 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 aaacggaagg tcccatctaa tccttatcac ataggt 36 <210> 22 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 acctatgtga taaggattag atgggacctt ccgttt 36 <210> 23 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 atggacgagc tgtacaaggg taccttacta ggacaaccaa ta 42 <210> 24 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 tattggttgt cctagtaagg tacccttgta cagctcgtcc at 42 <210> 25 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 cctgccgcct ctagaatcct tagtccaagg atg 33

Claims

다음을 포함하는, 세포핵에서 세포질로의 GSK3 이동을 억제하는 폴리펩티드:

(a) 세포막 수용체 없이 세포막을 투과할 수 있게 하는 PTD (protein transduction domain); 및

(b) 글리코겐 신타아제 카이네이즈 3(glycogen synthase kinase 3, GSK3)과 결합하여 핵 내부의 GSK3이 세포질로 이동하는 것을 억제하는 GBD (GSK3 binding domain).
제1항에 있어서, (c) 마크로피노좀(macropinosome) 또는 엔도좀(endosome)에 의한 생물학적 활성감소를 회피할 수 있는 HA2 도메인(HD)을 추가로 포함하는 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 세포핵 내의 GSK3이 세포질로 이동되는 것을 억제하는 NLS(nuclear localization signal)를 추가로 포함하는 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 상기 PTD는 TAT인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 상기 GBD는 GSK3와 액신(axin)의 결합을 저해하는, 액신(axin) 유래 GSK3 결합 도메인인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 상기 GBD는 서열번호 1 내지 서열번호 7로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
세포막 수용체 없이 세포막을 투과할 수 있게 하는 PTD(protein transduction domain)를 코딩하는 염기서열 및 글리코겐 신타아제 카이네이즈 3(glycogen synthase kinase 3, GSK3)과 결합하여 Axin에 의한 핵 내부의 GSK3이 세포질로 이동하는 것을 억제하는 GBD(GSK3 binding domain)를 코딩하는 염기서열을 함유하는 재조합벡터.
제7항에 있어서, 마크로피노좀(macropinosome) 또는 엔도좀(endosome)에 의한 생물학적 활성감소를 회피할 수 있는 HA2 도메인(HD) 또는 세포핵 내의 GSK3이 세포질로 이동되는 것을 억제하는 NLS(nuclear localization signal)을 코딩하는 염기서열을 코딩하는 염기서열을 추가로 함유하는 재조합벡터.
제7항 또는 제8항의 재조합벡터로 형질전환된 재조합 미생물.
제9항의 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 세포핵에서 세포질로의 GSK3 이동을 저해하는 폴리펩티드의 제조방법.
다음을 포함하는, 세포핵에서 세포질로의 GSK3 이동을 억제하는 폴리펩티드:

(a) 세포막 수용체 없이 세포막을 투과할 수 있게 하는 PTD (protein transduction domain); 및

(b) Axin과 결합하여 핵 내부의 GSK3이 세포질로 이동하는 것을 억제하는 ABD (Axin binding domain).
제11항에 있어서, (c) 마크로피노좀(macropinosome) 또는 엔도좀(endosome)에 의한 생물학적 활성감소를 회피할 수 있는 HA2 도메인(HD)을 추가로 포함하는 폴리펩티드.
제11항에 있어서, 세포핵 내의 GSK3이 세포질로 이동되는 것을 억제하는 NLS(nuclear localization signal)를 추가로 포함하는 폴리펩티드.
제11항에 있어서, 상기 PTD는 TAT인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제11항에 있어서, 상기 ABD는 GSK3과 액신(axin)의 결합을 저해하는, GSK3 유래 Axin 결합 도메인인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
세포막 수용체 없이 세포막을 투과할 수 있게 하는 PTD(protein transduction domain)를 코딩하는 염기서열 및 Axin과 결합하여 핵 내부의 GSK3이 세포질로 이동하는 것을 억제하는 ABD(Axin binding domain)를 코딩하는 염기서열을 함유하는 재조합벡터.
제16항에 있어서, 마크로피노좀(macropinosome) 또는 엔도좀(endosome)에 의한 생물학적 활성감소를 회피할 수 있는 HA2 도메인(HD)을 코딩하는 염기서열 또는 세포핵 내의 GSK3이 세포질로 이동되는 것을 억제하는 NLS(nuclear localization signal)을 코딩하는 염기서열을 추가로 함유하는 재조합벡터.
제16항 또는 제17항의 재조합벡터로 형질전환된 재조합 미생물.
제18항의 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 세포핵에서 세포질로의 GSK3 이동을 저해하는 폴리펩티드의 제조방법.
제1항 내지 제3항 및 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 유효성분으로 함유하는 암 세포의 성장 및 전이 억제용 약학 조성물.
제1항 내지 제3항 및 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 유효성분으로 함유하는 면역 질환 치료용 약학 조성물.
제21항에 있어서, 상기 면역 질환은 관절염인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항 내지 제3항 및 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 폴리펩티드가 nano 물질이나 Quantum dot(Q-dot)에 결합되어 있는, 세포핵 내 GSK3 농도 감소에 의해 발생되는 질병 치료용 제제.
제23항에 있어서, 세포핵 내 GSK3 농도 감소에 의해 발생되는 질병은 암 또는 면역 질환인 것을 특징으로 하는 제제.
치료용 유전자와 그 전달체를 함유하는 유전자 치료제에 있어서, 상기 치료용 유전자는 제1항 내지 제3항 및 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 코딩하는 염기서열인 것을 특징으로 하는, 세포핵 내 GSK3 농도 감소에 의해 발생되는 질병 치료용 유전자 치료제.
제25항에 있어서, 상기 전달체는 바이러스벡터인 것을 특징으로 하는 유전자 치료제.
제26항에 있어서, 세포핵 내 GSK3 농도 감소에 의해 발생되는 질병은 암 또는 면역 질환인 것을 특징으로 하는 유전자 치료제.
제1항 내지 제3항 및 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 폴리펩티드가 nano 물질이나 Quantum dot(Q-dot)에 결합되어 있는, GSK3 감소에 의해 발생되는 질병을 진단하기 위한 진단제.
제28항에 있어서, 세포핵 내 GSK3 농도 감소에 의해 발생되는 질병은 암 또는 면역 질환인 것을 특징으로 하는 진단제.
Axin과의 결합을 통해 GSK3이 세포핵 밖으로 이동하여 세포핵 내에서 GSK3의 농도가 저하되는 것을 억제하는 방법에 있어서, 다음으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 수단을 이용하는 것을 특징으로 하는 방법:

(a) Axin이 결합하는 GSK3 부위의 봉쇄;

(b) GSK3이 결합하는 Axin 부위의 봉쇄;

(c) Axin의 활성화 억제; 및

(d) 세포핵 내 GSK3의 발현 증가.
제30항에 있어서, Axin이 결합하는 GSK3 부위의 봉쇄는 GSK3의 Axin 결합부위와 결합하는 화합물, 펩티드 또는 폴리펩티드를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제31항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
제30항에 있어서, GSK3과 결합하는 Axin 부위의 봉쇄는 Axin의 GSK3 결합부위와 GSK3과 결합하는 화합물, 펩티드 또는 폴리펩티드를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제33항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
제30항에 있어서, Axin의 활성화 억제는 Wnt/β-catenin pathway 상의 Wnt 의 신호전달을 억제하거나, β-catenin의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
제30항에 있어서, 제32항의 제제에 의한 것임을 특징으로 하는 방법.
제30항에 있어서, 제34항의 유전자 치료제에 의한 것임을 특징으로 하는 방법.