KR20080036590A - 줄기세포 구조 지지체로서의 탄소나노튜브 - Google Patents

Abstract

본 발명은 탄소나노튜브 (carbon nanotube)를 포함하는 세포무독성 줄기세포 이식용 구조 지지체 및, (

) 줄기세포 및 (

Description

줄기세포 구조 지지체로서의 탄소나노튜브{CARBON NANOTUBES SERVING AS STEM CELL SCAFFOLD}

본 발명은 줄기세포 이식용 구조 지지체 및 줄기세포 치료제 조성물에 관한 것이다.

뇌허혈, 파킨슨, 알츠하이머, 심근경색, 관상동맥 및 간 질환을 포함한 각종 질환의 치료에 있어서 요즘 가장 많은 관심을 받고 있는 것이 다분화능 줄기세포치료제이다.

한편, 이식된 줄기세포가 질환의 치료에 유효성을 갖기 위해서는 최소한 두 가지 요건을 충족시켜야 한다. 첫 번째 요건은 이식된 줄기세포가 원하는 세포로 분화 되는 것이다. 두 번째 요건은 치료를 위하여 제대로 분화된 줄기세포가 손상 받은 부위에서 그 기능을 충분히 수행할 수 있도록 피 이식조직과 네트워크를 이루는 것이다.

그러나 사실상 손상 받은 부위로의 직접적인 줄기세포 이식은 여러가지 요인에 의해 그곳에서 네트워크 (예컨대, 신경네트워크)를 이루지 못하고 씻겨진다. 또한 원하지 않는 부위로 이동하여 이종세포로 분화될 수도 있다.

따라서 현재 많은 연구진에 의해 생체 내 독성을 갖지 않는 줄기세포 치료제 의 구조적 지지체 개발에 대한 연구가 많이 이루어지고 있다. 그러나, 전혀 독성을 갖지 않는 구조물의 개발 그 자체도 어려울 뿐만 아니라, 지지 구조물을 각 질환 부위로 삽입하는데 있어서 각종 부작용이 많이 보고되고 있다. 따라서 줄기세포의 치료 효과를 높이기 위하여 임상적 적용이 용이하며 생체 독성을 전혀 갖지 않는 새로운 지지체의 개발에 대한 요구가 대두되고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로써 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 상술한 당업계의 요구를 해결하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 줄기세포의 구조 지지체로서 탄소나노튜브가 세포독성이 없고 이식된 줄기세포의 피이식조직에서의 네트워킹에 탁월한 효과를 발휘하고 인 비보에서 실제적으로 개선된 줄기세포 치료효과를 발휘한다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 세포무독성 줄기세포 이식용 구조 지지체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 개선된 치료 효능을 발휘하는 줄기세포 치료제 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 줄기세포를 이용한 세포치료방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 세포치료제 약물(medicament)을 제조하기 위한 탄소나노튜브의 용도를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 탄소나노튜브 (carbon nanotube)를 포함하는 세포무독성 줄기세포 이식용 구조 지지체(scaffold)를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 줄기세포; 및 (b) 세포무독성 줄기세포의 구조 지지체로서의 탄소나노튜브를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 치료제 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 줄기세포; 및 (b) 줄기세포의 세포무독성 구조 지지체로서의 탄소나노튜브를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 치료제 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 줄기세포를 이용한 세포치료방법을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 세포치료제 약물(medicament)을 제조하기 위한 (a) 줄기세포; 및 (b) 줄기세포의 세포무독성 구조 지지체로서의 탄소나노튜브를 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도(use)를 제공한다.

본 발명자들은 줄기세포 치료 기술 (stem cell therapy)의 큰 장애물인 피이식조직과 분화된 줄기세포의 네트워크 형성 문제를 극복하기 위하여, 줄기세포의 구조 지지체를 개발하고자 노력하였고, 그 결과 탄소나노튜브가 세포에 독성이 없고 이식된 줄기세포의 피이식조직에서의 네트워킹에 탁월한 효과를 발휘하고 인 비보에서 실제적으로 개선된 세포치료효과를 발휘한다는 것을 확인하였다.

본 발명에서 줄기세포 지지체로 이용되는 탄소나노튜브는 플러렌(fullerenes)의 한 형태로서, 플러렌은 탄소-케이쥐 (carbon-cage) 분자 집단을 의미한다. 이 플러렌은 원형 (버키볼) 또는 튜브 (나노튜브)와 같은 형태를 가질 수 있다.

본 명세서에서 용어 "탄소나노튜브 (carbon nantotube: CNT)"는 탄소-케이쥐 분자 집단을 의미하기 위하여 사용된 것으로서, 플러렌, 탄소버키볼 및 탄소나노튜브를 포괄하는 의미를 가지지만, 바람직하게는 튜브의 형태를 가지는 플러렌 즉 탄소나노튜브를 지시한다. 또한, 탄소나노튜브는 응집 (aggregation) 정도에 따라 탄소나노파이버 (carbon nanofiber)와 탄소나노입자 (carbon nanoparticles)로 표현될 수 있다. 한편, 탄소나노튜브는 밀폐된 원형 다중층 껍질, 다중벽 나노튜브 (multi-wall nanotobe) 또는 단일벽 나노튜브 (single-wall nanotube)로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 탄소나노튜브는 단일벽 나노튜브이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 탄소나노튜브는 관능기화(funtionalized) CNT 이다. CNT 에 결합되는 관능기는 예컨대, 티올기 및 카르복실기를 포함한다. 관능기화 CNT 는 CNT 분자 사이의 응집(aggregation)을 줄여준다. 본 발명에서 이용되는 탄소나노튜브의 탄소수는 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는 C₂₀-C₁₅₀ 이다. 본 발명에서 이용되는 탄소나노튜브는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 제조될 수 있다 (참조: 미국 특허 제 5,753,088 호,제 5,641,466 호, 제 5,292,813 호 및 제 5,558,903 호).

CNT 는 1991 년에 발견된 이후에 계속적으로 그 용도와 특징 기능에 대한 연구가 전세계적으로 계속 되고 있으며 그 이용도가 점차 높아져 가고 있는 미래 나노기술의 최첨단 소재라 할 수 있다. CNT 는 일반적으로 매우 강하며 유동적으로 전기전도체로서 작용할 수 있을 뿐만 아니라 수용성, 지용성의 특징을 모두 가지고 있으며 (Mattson MP, et al., J Mol Neurosci 14(3):175-82, 2000), 다른 여러 분자적 물질들의 이동 통로가 될 수 있다고 알려져 있다 (Nadine Wong Shi Kam et al, , JACS 126:6850-6851, 2004; Nadine Wong Shi Kam et al., JACS 127:6021-6026, 2005). 또한, 생체에서 약물송달 시스템으로서의 CNT 에 대한 연구도 있다 (Zhu Yinghuai, et al., JACS 127:9875-9880, 2005). 이런 특징들 때문에 CNT 가 관심을 받고 있지만 생체에 적용하고자 하는 노력은 사실상 많은 연구가 이루어지고 있지 않다.

본 발명은 종래의 CNT 물질을 줄기세포에 대한 구조적 지지체로서의 용도를 최초로 규명한 것이다.

CNT 를 포함하는 본 발명의 줄기세포 이식용 구조 지지체는, 생체 내 이식된 줄기세포 피이식조직에서 분화하여 주위의 세포들과 네트워킹을 이루는 데 있어서 매우 우수한 지지체 특성을 나타낸다. 하기의 실시예에서 입증한 바와 같이, 본 발명의 CNT 줄기세포 지지체는 세포에 대한 접착성이 우수하여 세포밀도를 향상시키며, 세포들 사이의 응집성 (adhesion)도 향상시키는 작용을 하며, 더욱이 세포에 독성이 없다. 이러한 CNT 의 특성은 이식된 줄기세포가 이식 부위에서 그 기능을 충분히 수행할 수 있도록 피이식조직과 네트워크를 이루는 데 기여를 하며, 이식 부위에서 씻겨지는 현상을 억제한다.

특히, CNT 를 포함하는 본 발명의 줄기세포 구조 지지체는 종래의 여러 가지 구조적 지지체와 다르게 탄소나노입자로서 주사로 줄기세포와 함께 쉽게 이식이 가능하며 세포의 전기 생리학적 작용을 실리콘처럼 방해하지 않으며 오히려 그 작용을 도와주는 작용을 할 수 있다는 점에서도 매우 유리한 효과를 발휘한다. 또한, 본 발명에 이용되는 CNT 는 염증 반응을 매우 줄여줄 수 있는 이점도 가지고 있다 (Shvedova AA, et al., Am. J Physiol Lung Cell Mol Physiol, in print, 2005).

한편, CNT 는 손쉽게 줄기세포 치료제와 혼합물을 형성시켜 주사로 원하는 위치에 주입하기 때문에 그만큼 수술에 의한 다른 부작용을 최소화 할 수 있는 장점을 가지고 있다. 또한, 주입된 CNT 는 그 자체로 시간이 지나면서 구조체를 형성하며 또한 이런 구조체는 세포간 네트워크를 형성하기 위하여 적절하고, CNT 의 전기 전도성 때문에 전기적 유도를 통해 적절히 원하는 곳으로 이동이 가능하며 조직이 망가진 곳에서 유동적으로 세포와 함께 지지체 역할을 충분히 수행할 수 있다.

본 발명이 적용되는 줄기세포는 제한이 없으며, 줄기세포의 특성, 즉 미분화, 무한정 증식 및 특정세포로의 분화능을 갖는 세포는 본 발명이 적용될 수 있는 세포이다. 본 발명이 적용되는 줄기세포는 크게 두 종류로 구별된다: 배아줄기세포 (ES) 및 배아생식세포 (EG)를 포함하는 전능성 줄기세포 (pluripotent stem cell)와 다능성 줄기세포 (multipotent stem cell). 배아줄기세포는 배반포의 내부세포괴 (ICM)로부터 유래되고, 배아생식세포는 5-10 주령의 생식융기 (gonadal ridge)의 원시생식세포로부터 유래된다. 한편, 다능성 줄기세포는 배아 조직, 태아조직 및 성체 조직에서 발견되며, 이는 성체줄기세포를 포함한다. 전능성 줄기세포는 인 비트로에서 무한정 증식되며, 3 종류의 모든 배아층 (외배엽, 중배엽과 내배엽)으로부터 유래되는 다양한 세포로 분화될 수 있는 능력을 갖는다. 한편, 다능성 줄기세포는 그가 유래된 특정 조직으로 분화될 수 있는 능력을 갖으며, 자가재생산 능력은 전형적으로 유기체의 라이프타임으로 제한된다. 다능성 줄기세포의 소스는 모든 조직 종류이고, 특히 골수, 혈액, 간, 피부, 장, 췌장, 뇌, 골격근 및 치수로부터 주로 분리된다.

본 발명이 적용되는 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포, 배아생식세포 및 배아종양세포를 포함하며, 바람직하게는 배아줄기세포 및 성체줄기세포이다.

본 발명의 치료제 조성물에서, 바람직하게는, 줄기세포 분화 유도제를 추가적으로 포함한다. 줄기세포 분화 유도제의 바람직한 예는 레티노산 (retinoic acid), 아스코브산 (ascorbic acid), 멜라토닌 (melatonine) 또는 여러 가지 성장인자 [예컨대, GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor), EGF (epidermal growth factor), NGF (nerve growth factor)]을 포함한다.

본 발명의 치료제 조성물에 의해 치료될 수 있는 질병 또는 질환은 줄기세포 치료 기술에 의해 치료될 수 있는 것으로 알려진 모든 질병 또는 질환을 포함한다. 바람직하게는 본 발명의 치료제 조성물은 신경 질환 (neuronal disease), 심근 경색, 척추 손상 및 퇴행성 관절염 치료에 이용된다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물에 포함되는 줄기세포는 신경줄기세포 (neural stem cell)이고 이 경우 치료제 조성물은 신경 질환 (neuronal disease) 치료용 조성물이 된다.

본 발명의 조성물이 신경 질환 치료용 조성물로 제조되는 경우, 이 조성물에의해 치료될 수 있는 질환은 신경세포의 손상에 의해 유발되는 모든 신경 질환을 포함한다. 바람직하게는, 상기 신경 질환은 신경 퇴행성 질환, 및 허혈 또는 재관류에 의한 질환으로 구성된 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 상기 신경 퇴행성 질환은 알쯔하이머병, 헌팅톤 질병, 파킨슨 질병 및 근위축성 측삭 경화증으로 구성된 군으로부터 선택되며, 가장 바람직하게는 파킨슨 질병이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 허혈 또는 재관류에 의한 질환은 허혈성 뇌졸중이다.

CNT 를 포함하는 본 발명의 줄기세포 구조 지지체는 종래의 여러가지 구조적 지지체와 다르게 탄소나노입자로서 주사로 줄기세포와 함께 쉽게 이식이 가능하다. 따라서, 본 발명의 치료제 조성물의 바람직한 구현예에 따르면, 탄소나노튜브는 탄소나노입자의 현탁액 형태로 존재한다.

본 발명의 조성물에서 CNT 의 함량은 0.002-10 mg/ml, 바람직하게는 0.01-1 mg/ml, 보다 바람직하게는 0.01-0.5 mg/ml, 가장 바람직하게는 0.01-0.3 mg/ml 이다.

본 발명의 치료제 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 치료제 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19^th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 치료제 조성물은 비경구로 투여할 수 있고, 국소 주입(local injection)이 가장 바람직한 투여방법이다.

본 발명의 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 조성물의 투여량은 바람직하게는 1 회 2 x 10⁵ - 2 x 10⁶ 세포이며, 통상적으로 1 회 또는 2 회 투여된다.

본 발명의 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태일 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 치료제 조성물은 줄기세포의 기능을 충분히 발휘할 수 있도록 세포간 네트워킹을 탁월하게 형성케 하여 실제적으로 질환 동물에서 개선된 치료 효능을 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

도 1 은 탄소나노튜브 (CNT)의 P19 EC 줄기세포에 대한 부착성을 보여주는 전자 현미경 사진이다.

도 2 는 세포 응집성에 대한 CNT 의 형향을 보여주는 그래프이다.

도 3a-도 3c 는 CNT 의 인 비트로 세포독성 유무를 확인한 실험 결과를 보여주는 그래프이다. 도 3a-도 3c는 각각 functionalized Multi-Walled CNT(f-MWCNT), functionalized Single-Walled CNT(f-SWCNT) 및 CNT fiber 에 대한 실험 결과이다.

도 3d 는 CNT 의 인 비트로 세포독성 유무를 PI 와 FDA 를 이용한 세포염색으로 분석한 결과 사진이다.

도 4 는 CNT 에 의한 염증 반응 유발 여부를 분석한 실험 결과를 보여준다.

도 5a 는 CNT 에 의한 활성기 산소 발생 여부를 분석한 DCF-DA 염색 결과 사진이다.

도 5b 는 CNT 에 의한 활성기 산소 발생 여부를 분석한 Fluoremeter 측정 결과이다.

도 6 은 CNT 의 인 비보 독성 유무를 확인한 실험 결과를 보여주는 그래프이다.

도 7 은 CNT 와 줄기세포 혼합 치료제의 파킨슨 질환 동물모델에서의 치료 효능을 보여주는 그래프이다.

도 8a 는 CNT 와 줄기세포 혼합 치료제의 뇌허혈 동물모델에서의 기억력 회복능을 보여주는 그래프이다.

도 8b 는 CNT 와 줄기세포 혼합 치료제의 뇌허혈 동물모델에서의 수동 회피 행동 실험 결과를 보여주는 그래프이다.

도 9 는 CNT 와 줄기세포 혼합 치료제의 알츠하이머 동물모델에서의 인지기능 개선 효능을 보여주는 그래프이다.

발명의 실시를 위한 형태

실험재료 및 실험방법

세포 배양

본 연구에서는 신경세포로 SK-NSH (ATCC)를 이용하였으며, DMEM (GIBCO)에 10％ 우태아혈청 (FBS, GIBCO)을 첨가하여 제조된 배지를 포함하는 세포 배양 접시에 배양하였다. 또한 줄기세포는 P19 EC (embryonal carcinoma) 세포 (Cell Bank, Korea)을 이용하였으며, α-MEM (GIBCO)에 7.5％ 소 혈청 (CS, GIBCO)와 2.5％ FBS (GIBCO)를 첨가하여 제조된 배지를 포함하는 세포 배양 접시에서 배양하였다. 또한 별아교세포(astrocyte) A172 (ATCC)를 이용하여 연구를 진행했다. 배지는 SKN-SH 와 동일하다. 상기 세포들을 이용하여 CNT 의 세포 독성과 세포 부착성 및 구조체 형성 가능성에 대한 연구를 진행하였다.

탄소나노튜브

3 종의 탄소나노튜브, functionalized Single-Walled CNT(f-SWCNT), functionalized Multi-Walled CNT(f-MWCNT) 및 CNT 나노파이버를 실험에 이용하였다. 이들 탄소나노튜브의 특성은 다음 표 1 과 같다. f-SWCNT 및 f-MWCNT 는 카르복실산으로 관능화(funtionalization)된 것이다.

[표 1]

CNT 의 세포 부착성과 구조체 형성 가능성 연구

배양된 각각의 세포에 단일벽 나노튜브 형태의 CNT(IL JIN, Korea)를 0.05 mg/ml 로 처리하여 37℃ 에서 5％ 항온기에서 48 시간 동안 배양한 후 각각 세포 부착성과 구조체 형성을 확인하였다. 세포의 부착성은 48 시간 후 전자 현미경 (JEM 200CS, JEOL, Japan)을 이용하여 부착 정도를 사진으로 확인하였다. 직접 부 착성과 구조체 형성에 CNT 의 효과를 수치화하기 위하여 본 연구에서는 CNT 처리 후 시간 별로 형태 변화를 각각 관찰하였으며, 이렇게 관찰된 세포의 비율을 동일하게 한 후 원심분리하여 세포의 CNT 부착성과 구조체 형성에 의한 비중 차이를 수치화 하였다. 이 수치는 원심분리 이후 상층 부위의 배양액에 1 ml 당 세포의 개수를 표로 나타내었다.

세포 생존율 측정

배양된 각각의 세포에 CNT 를 0.05 mg/ml 로 처리하여 37℃ 에서 5％ CO₂ 항온기에서 배양하였다. CNT 의 처리 후 12 시간에서 72 시간 후에 각 시간별로 10 ㎕의 alarmablue 용액(Serotec, UK)을 각 웰에 첨가한 후에 3 시간 동안 더 배양하였다. 세포의 사립체 기능 유무에 따라 환원이 된 alarmablue 를 ELISA 리더 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 이용하여 570 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도의 백그라운드는 600 nm 에서 측정하여 570 nm 의 측정치에서 빼주었다. 세포의 생존율은 다음과 같이 구한다: 세포의 생존율 = [(시료 카운트)-(블랭크 카운트)/(비처리 대조군 카운트)-(블랭크 카운트)] x 100 (Shimoke and Chiba, 2001).

Mac-1 면역세포화학염색

50％ 트립산을 이용해서 세포를 떼어내고 수집한 후 PBS로 세척하고, 이어 Poly-L-lysin 으로 1 시간 코팅한 슬라이드에서 7 일 동안 배양하였다. 이후 세포를 PBS 로 세척한 후 아세톤/메탄올(50％/50％) 혼합액으로 2 분간 고정하고 5 분 동안 건조시켰다. 세포를 PBS 로 3 회 수세 후, 세포 내에 존재하는 퍼옥시다아제의 효과를 차단하고 세포 투과성을 높이기 위해서 에탄올 내 3％ H₂O₂ 에 10 분간 처리하였다. 그런 다음, 세포를 10％ 비-면역 혈청(Zymed Co., USA)으로 30 분간 처리한 후 Mac-1 의 1 차 항체(Santacurz, USA)를 1:100 의 비율로 희석한 후 37℃ 배양기에서 2 시간 동안 반응 시켰다. 이후 세포를 PBS 로 수세한 후 2 차 항체(biotinylated anti-IgG, VECTA)를 37℃ 배양기에서 1 시간 동안 반응시켰다. 세포를 PBS 수세한 후 3 차 항체(streptavidin peroxidase conjugated, VECTA)로 37℃ 배양기에서 1 시간 동안 반응시킨 후 DAB 용액으로 발색 한 후 증류수를 흘려서 커버 글래스 뒷면을 닦고 헤마토자일린으로 10 초 정도 염색 후 다시 뒷면을 수세 후 마운트 과정을 거쳐 광학현미경으로 관찰하였다.

DCF-DA 염색

HCSS 완충액(20 mM HEPES, 2.3 mM CaCl₂ , 120mM NaCl, 10mM NaOH, 5 mM KCl, 1.6 mM MgCl₂ 및 15 mM 글루코오스)에 용해시킨 10 μM 의 DCFDA (6-carboxy-2',7'-dichloro-dihydrofluoresceine diacetate, dicarboxymethylester, Invitrogen)와 현탁보조제인 2％ Pluronic F-127 을 배양한 세포에 37℃에서 30 분간 처리하였다. 세포 내 자유라디칼에 의한 DCF 형광은 실온에서 수은 램프 형광 부속을 갖춘 Olympus IX70 도립 현미경 상에서 관찰하였고(Excitation=488 nm, Emission=510 nm) CCD 카메라로 화상을 포착한 후 NIH Image 1.65 프로그램을 이용하여 영상분석하거나, Flow cytometry(GENios, Tecan, NC, USA)를 이용하여 Excitation 파장 485 nm 와 Emission 파장 510 nm 에서 측정하였다.

동물 실험

여러 가지 퇴행성 질환 동물 모델

5 주령된 수컷 마우스와 래트(SAMTACO, Korea)를 이용하였다. 4 주령된 래트를 1 주 동안 적응시키고 뇌허혈 동물 모델을 만들었다. 뇌에 혈액을 공급하는 오른속목동맥에 나일론 실을 삽입하고 30 분 뒤에 나일론 실을 제거하여 혈액의 순환을 다시 재게 시켜주고 목을 봉합하였다. 1 주일 동안 이렇게 수술한 동물을 사육하다가 1 주일째부터 여러 가지 행동 결합과 관련된 실험을 진행하고 줄기세포 치료제 혹은 CNT 와 줄기세포의 혼합물을 18-게이지 바늘을 이용하여 주입하여 효과 연구를 진행하였다. 이 경우, 줄기세포만을 주입하는 경우에는 세포 현탁액 (40000 세포/㎕) 5 ㎕를 주입하고, CNT 와 줄기세포의 혼합물을 주입하는 경우에는 세포 현탁액 2 x 10⁵ 세포 및 CNT 0.02 mg/ml 의 혼합물 5 ㎕를 주입하였다.

알츠하이머성 동물 모델은 5 주령 마우스를 이용해서 제작하였다. 본 실험에서는 stereotaxic 시스템을 이용하여 원하는 부위에 아밀로이드 β 1-42 단백질 (Biosource CA USA)를 주입하여 알츠하이머 모델을 제작하였다. 본 연구에서는 아밀로이드 β 단백질을 뇌실 (intraventricular zone)에 주입하였다. 이곳은 좌우 연결되어 있는 뇌실로서 좌우반구 모두에서 아밀로이드 β 단백질의 영향을 받게 된다. 본 모델의 경우 충분히 영향을 갖게 하기 위해 1 주일 뒤에 다시 한번 같은 방법으로 아밀로이드 β 단백질을 주입해주고 다시 2 주 뒤부터 행동실험을 진행하 고 줄기세포 치료제 혹은 CNT 와 줄기세포 치료제를 주입하였다. 치료제 주입양은 상기한 바와 같다.

파킨슨 질환 동물 모델은 5 주령된 마우스의 흑질 (substantial nigra) 부위에 stereotaxic 시스템을 이용하여 6-OHDA (6-hydroxydopamine)를 주입하여 적절하게 선조체 (striatum)의 도파민성 신경세포를 선택적인 사멸을 유도하여 제작하였다. 본 모델의 경우는 2 주후에 동물 행동 실험을 진행하고 다시 3 일후부터 줄기세포 치료제 혹은 CNT 와 줄기세포의 혼합물을 각각 주입해주는 방법으로 효과를 확인하였다. 치료제 주입양은 상기한 바와 같다.

탄소 나노튜브의 주입

탄소 나노튜브의 동물에 주입은 동물에 CNT(f-SWCNT 또는 f-MWCNT)를 단독으로 주입할 때 0.2 mg/2 ml 의 농도로 주입하였으며, 세포와 함께 이식할 때는 이식 바로 전에 0.2mg/1 ml 와 200000 개/1 ml 의 농도로 혼합하여 이을 진행하였다. 이때 주입 1 시간 전에 CNT 를 충분히 ultrasonication 을 통해서 하나 하나의 CNT 로 떨어뜨리고 이용하였다.×

행동실험

8-방 미로 실험

8 개의 미로를 가진 투명한 아크릴 재질의 방사형 미로 (radial arm maze)를 사용하였다. 방사형 미로는 직경이 40 cm, 높이는 30 cm 이고, 한 변의 길이가 15 cm 인 8 각형의 중앙 플랫폼 (central platform)을 가지고 있으며, 이를 중심으로 길이가 70 cm 이고 넓이 9 cm, 높이 8 cm 의 공간을 지닌 8 개의 미로가 방사형으 로 뻗어 있는 형태로 제작하였다. 중앙 플랫폼과 미로사이에는 개폐 할 수 있는 문이 있으며 이 미로의 종착지점에는 보상을 제공하는 음식접시 (5 cm × 5 cm × 2.5 cm)를 움직이지 않도록 고정시켜 놓았다. 음식접시는 불투명하고 깊이가 있어 중앙 플랫폼에서는 보상으로 제공되는 물의 유무가 보이지 않도록 하였다. 방사미로의 주위에는 시각단서가 될만한 실험대, 창, 쓰레기통, 냉방기 등의 위치를 고정적으로 유지하였다. 실험자 또한 시각단서가 되므로 항상 일정한 위치에서 실험을 실시하였다.

줄기세포를 전혀 주사하지 않은 동물과 줄기세포 치료제만을 주사한 개체 그리고 줄기세포 치료제와 CNT 혼합물 주사한 개체를 가지고 방사미로학습을 실시하였다. 작업기억에 의한 학습은 방사미로의 모든 미로 (8 개)에 있는 물을 찾아먹는 시간과 시행마다의 오류 횟수로 측정을 하였고, 참조기억의 학습은 4 개의 미로에만 물을 놓아두고 학습을 시켜 미로의 물을 모두 찾아먹는 시간과 시행마다의 오류횟수로 측정하였다.

첫 실험 대상 쥐의 경우 실험 시작 30 시간 전부터 물을 박탈하여 갈증을 유발시켰으며 실험 첫 날에는 8 개의 미로로 통하는 통로를 차단한 채 동물을 중앙 플랫폼에 5 분간 넣어 두어 실험상황에 적응하도록 하였다. 다음날부터 학습을 시작하였으며, 실험시작 15 분 전에 사육실에서 행동관찰실로 옮겨 급박한 이동에 따르는 쥐의 제반 변화를 방지하였다. 매일 1 회 시행의 학습 후에는 쥐를 사육실로 되돌려 넣고 30 분간 물을 준 후 다음날 시행까지 물을 박탈하였다.

작업기억의 학습절차: 작업기억을 이용한 학습은 각 미로의 종착지점에 있는 8 개의 음식접시 모두에 0.1 ㎖의 물을 놓아두고 미로의 문이 닫힌 상태에서 흰쥐를 중앙 플랫폼에 위치시켜 약 1 분간 방사형 미로에 적응시킨 후 8 개의 미로의 문을 동시에 열어 흰쥐가 자유롭게 돌아다닐 수 있게 하였다. 쥐가 8 개의 미로를 1 번씩 방문하여 미로에서 물을 모두 섭취하였거나, 제한시간 5 분을 초과하면 한 시행을 종료하였다. 매 시행마다 물은 1 회에 한정하여 공급하였다. 물이 있는 미로에 들어가서도 물을 섭취하지 않았거나, 쥐가 한번 방문해서 물을 섭취한 미로를 2 회 이상 방문하면 오류를 범하는 것으로 간주하여 그 횟수를 기록하였고, 8 개의 미로를 모두 방문해서 물을 모두 섭취하기까지의 시간도 함께 기록하였다. 이때 오류율은 이미 방문한 미로에 다시 방문한 수와 물이 있는 미로에 들어가서도 물을 섭취하지 못한 횟수를 총 방문한 미로의 수로 나누어 백분율로 표시하였다.

이 과제에서는 제한시간 5 분 안에 각 미로를 1 회씩 방문하여 총 8 회의 방문만에 물을 모두 섭취하는 것이 가장 효율적인 수행이 된다. 오류율이 5％ 이하로 떨어지면 학습이 종료된 것으로 간주하고 실험을 종료하였다.

참조기억의 학습절차: 참조기억을 이용한 학습은 각 미로의 종착지점이 있는 8 개의 음식접시 중 특정 4 개의 음식접시에만 0.1 ㎖의 물을 놓아두고 미로의 문이 닫힌 상태에서 흰쥐를 중앙 플랫폼에 위치시켜 약 1 분간 방사형 미로에 적응시킨 후 8 개의 미로의 문을 동시에 열어 흰쥐가 자유롭게 돌아다닐 수 있게 하였다. 쥐가 물이 있는 특정 4 개의 미로를 방문하여 물을 모두 섭취하였거나, 제한시간 5 분을 초과하면 한 시행을 종료하였다. 매 시행마다 물은 1 회에 한정하여 공급하였고 물이 있는 미로에 들어가서도 물을 섭취하지 않았거나, 물이 없는 미로를 방문 하면 오류를 범하는 것으로 간주하여 그 횟수를 기록하였고, 물이 있는 4 개의 미로를 모두 방문해서 물을 모두 섭취하기까지의 시간도 함께 기록하였다. 오류율은 물이 있는 미로에 들어가서도 물을 섭취하지 못했거나, 물이 없는 미로를 방문한 수를 총 방문한 미로의 수로 나누어 백분율로 표시하였다.

이 과제에서는 제한시간 5 분 안에 물이 있는 4 개의 미로만을 1 회씩 방문하여 총 4 회의 방문만에 물을 모두 섭취하는 것이 가장 효율적인 수행이 된다. 오류율이 5％ 이하로 떨어지면 학습이 종료된 것으로 간주하고 실험을 종료하였다.

수미로(water maze) 실험

본 연구에서는 공간 지각 능력 및 기억 능력을 확인하기 위해서 Morris water maze 실험 방법 (Morris, R., Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J. Neurosci. Methods 11:47-60(1984))을 이용하여 학습 및 기억력 능력을 측정하였다. 각 실험군의 동물을 5 일 동안 수미로에서 플랫폼을 찾아갈 수 있도록 하루에 각각 4 방향에서 4 번씩 학습을 시켰다. 각 학습 사이의 간격은 적어도 25 분을 기준으로 한다. 5 일 동안 학습을 시킨 동물은 6 일째 되었을 때 플랫폼을 치우고 얼마나 플랫폼이 있는 곳을 찾아가는지 측정하여 수치화하였다.

수동 회피 실험 (passive avoidance)

자극에 의한 수동 회피실험을 통해 학습과 기억이 얼마나 빨리 진행되고 지속되는지 알아보았다. 본 연구에서는 각 동물을 이용하여 4 일 동안 소음과 빛으로부터 어둡고 조용한 곳으로 이동할 수 있도록 학습을 진행하였다. 본 학습에서는 20 초 이하로 각 자극을 피해 암 공간으로 이동하면 학습이 진행된 것으로 판단하였다. 또한 자극이 발생할 공간에서 180 초 동안 적응을 거치고 이후에 자극이 시작되며 자극이 없는 암 공간으로 이동할 수 있도록 문이 열리게 된다. 이때 자극은 고출력의 소음과 밝은 빛으로 정의하며 최대 90 초간 지속되도록 하였다. 그리고 자극이 없는 암 공간으로 이동하는 경우는 바로 문이 내려오며 모든 자극은 제거되고 이곳에서도 60 초간 본 학습 상황을 인지시키는 과정을 거치게 된다. 이렇게 4일 동안 지속적으로 학습을 시키고 5 일째 암 공간으로 동물이 이동하는 경우 0.1 mA 의 자극을 3 초간 동물에게 가하고 이제 암 공간으로 이동할 경우 전기적 자극이 존재한다는 것을 인지시킨다. 그리고 이런 shock 학습 이후 이틀 뒤에 다시 학습시키는 것과 동일한 상황에서 암 공간으로의 이동 시간을 측정한다. 이때 무자극 암 공간으로 이동하여도 전기적 자극은 없으며 이동 시간이 짧을수록 학습 및 기억에 손상이 있다고 판단하였다.

실험결과

인 비트로에서 CNT 의 세포와의 결합성과 세포의 응집성에 미치는 영향

우선 본 연구에서는 CNT 가 신경세포를 포함하는 여러 세포들과 결합할 수 있는지 확인해 보기 위하여, 시간 별로 각 세포에 CNT 를 처리하고 12 시간에서 72 시간까지 변화를 관찰하였다. 실제 줄기세포의 구조적 지지체로서 그 역할을 수행하기 위해서는 여러 세포들과 자유롭게 접합할 수 있어야 하며 이식된 줄기세포의 결집을 유도할 수 있어야 한다. 따라서 각 시간대에서 세포의 응집에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해서 세포의 응집력과 세포의 무게 변화 등을 확인하였다.

전자현미경 사진인 도 1 에서 확인할 수 있듯이, CNT 는 줄기세포인 P19 EC 세포에 부착성을 갖는다는 것을 알 수 있다. 또한, 신경세포인 SK-NSH 및 별아교세포에도 CNT 가 결합하는 것을 확인하였다.

도 1 에서 확인한 CNT 의 세포에 대한 결합성이 세포의 응집성(adhesion)에 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다. CNT 가 처리된 상황에서 여러 세포들의 응집성을 확인하기 위하여 세포 배양 접시에서 세포 밀도 (density)를 확인하였다. 도 2 에서 볼 수 있듯이, CNT 를 처리했을 때 모든 세포에서 응집성이 향상되는 것을 발견하였고, 특히 줄기세포와 신경세포에서 매우 크게 향상되는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 별아교세포의 경우 다른 세포들에 피해 응집성 정도가 크게 향상되지 않았다.

결론적으로, CNT 는 신경세포 및 줄기세포에 결합할 뿐만 아니라 각 세포의 응집성을 향상시킬 수 있다는 것을 알 수 있다.

탄소나노튜브에 의한 미세아교세포종의 세포 생존율에 미치는 영향 분석

쥐의 뇌세포 중 미세아교세포종인 BV-2 세포(ATCC, USA)에서 다양한 Carbon Nanotube(CNT)에 의한 독성 및 세포생존율에 미치는 영향을 살펴보기 위해서, CNT 를 처리하기 2 시간 전에 1％ FBS 를 포함하는 DMEM 배지에서 세포를 배양하였으며, CNT 에 의해 유발된 세포생존율 측정은 alamarBlue assay 로 측정하였다. 본 실험에 사용한 CNT 는 functionalized Single-Walled CNT(f-SWCNT), functionalized Multi-Walled CNT(f-MWCNT) 및 CNT fiber 등 세 종류를 이용하였고, 농도는 10, 100, 1000 및 1000 ug/ml 로 처리하여 12 시간 간격으로 48 시간까 지 관찰하였다. 이 때 시간 및 농도 의존적으로 세포생존율에 어떠한 변화를 유발하는지 확인하였다.

도 3a 에서 볼 수 있듯이, f-SWCNT 를 각각 10, 100, 1000 및 1000 ug/ml 로 처리하여 48 시간 까지 관찰한 결과, 농도와 시간 모든 요인에 있어 큰 차이 없이 세포 생존율에는 거의 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 또한 도 3b 및 도 3c 에서 볼 수 있듯이, f-MWCNT 및 CNT fiber 을 각각 사용하여 위에 상기한 농도와 시간에 따라 측정한 결과에서도 별다른 세포 생존율 변화가 나타나지 않았다. 또한 세포의 외형적 변화와 살아있는 세포와 죽은 세포를 직접적으로 보여준 실험으로서, PI 와 FDA 염색을 시행하여 세포 사멸 유무 정도를 확인하였다. 붉은 형광을 나타내는 PI 염색은 죽은 세포를, 녹색 형광을 나타내는 FDA 염색은 살아있는 세포를 나타낸다. 도 3d 은, 가장 높은 농도인 10000 ug/ml 의 f-SWCNT, f-MWCNT, CNT fiber 를 각각 처리한 후 48 시간 이후의 사진을 나타낸다. 도 3d 에서 볼 수 있듯이, 붉은 형광을 띠는 세포가 거의 나타나지 않음을 확인할 수 있었다. CNT 각각의 세 종류에서 모두 같은 양상을 나타내었으며, 이는 세 종류의 CNT 를 저농도에서 고농도까지 처리한 경우, 세포의 사멸 유발, 즉 세포 생존에 거의 향을 미치지 않음을 보여주는 결과라 하겠다.

이상의 결과를 종합하여 보면, f-SWCNT, f-MWCNT 및 CNT fiber 등은 10000 ug/ml 농도 이하의 경우, 세포 사멸이나 생존에 영향을 미치지 않아 미세아교세포에 독성이 없는 것으로 판단된다. 따라서 탄소나노튜브의 세포치료제의 스캐폴드로서의 안전성은 우수하다.

미세아교세포에서의 탄소나노튜브에 의한 염증 유발 유무 확인

쥐의 미세아교세포종인 BV-2 세포에서 functionalized Single-Walled CNT (f-SWCNT), functionalized Multi-Walled CNT (f-MWCNT) 및 CNT fiber 등 세 종류의 CNT 를 이용하여 100 ug/ml 로 처리하여 24 시간 후의 염증반응을 나타내는 미세아교세포의 활성화를 Mac-1 면역세포화학염색을 시행하여 관찰하였다. 도 4 에서 볼 수 있듯이, f-SWCNT, f-MWCNT 및 CNT fiber 100 ug/ml 을 처리한 결과, 대조군에 비해 유의 있는 변화를 관찰할 수 없었다. 따라서 CNT 에 의해서 염증 반응은 나타나지 않는 것으로 판단할 수 있다. 가장 우측의 사진은 1 ug/ml 의 LPS 를 처리한 것으로 positive control 로 사용한 것이다. 아래의 그래프는 본 Mac-1 면역세포화학염색을 정량화하여 나타낸 그래프로서, 동일한 결과를 나타낸다.

미세아교세포에서의 탄소나노튜브에 의한 활성기 산소 발생 유무 확인

산화적 스트레스의 주요인인 활성기 산소는 세포의 사멸, 생존, 분화 및 염증 반응 등 다양한 세포 신호 전달에 영향을 미친다. 그 중 자극이나 환경에 의해 발생한 산화적 스트레스는 염증 반응에서도 주요한 신호전달기전을 활성화시켜 하위 신호전달체계를 전달하는 것으로 알려져 있다. 따라서 탄소나노튜브에 의해 염증 반응과 관련하여 활성기 산소의 발생을 확인해보고자, 쥐의 미세아교세포종인 BV-2 세포에서 functionalized Single-Walled CNT (f-SWCNT), functionalized Multi-Walled CNT (f-MWCNT) 및 CNT fiber 등 세 종류의 CNT 를 이용하여 10, 100, 1000 및 10000 ug/ml 로 처리하여 1, 2 및 6 시간 까지 활성기 산소종이 얼마나 발생하였는지를 DCF-DA 염색을 시행하여 관찰하였다. 도 5a 에서 볼 수 있듯이, f- SWCNT, f-MWCNT 및 CNT fiber 를 농도별로 시간별로 처리한 결과 유의 있는 활성기 산소의 발생은 관찰되지 않았다. 이 결과는, Fluoremeter 를 이용한 정량화한 결과(도 5b)에서도 동일한 결과를 나타내었다. 따라서 CNT 자체에 의해서는 자체 독성 및 세포 생존에 영향을 주지 않으며, 염증 반응에 있어서도 어떠한 유발 자극이 되지 않을 뿐 아니라, 활성기 산소 발생에도 큰 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다.

따라서, CNT 는 줄기세포 이식용 스캐폴드로서 매우 안전성이 우수한 소재임을 알 수 있다.

CNT 주입에 의한 마우스 뇌에서의 인 비보 독성 유무

상기 실험 결과를 통하여 본 연구진은 CNT 만의 인 비트로 세포 독성은 없는 것으로 확인하였고, CNT 를 임상 적용하기 이전에 추가적으로 인 비보 독성을 조사하였다. CNT 의 인 비보 독성을 확인하기 위하여, 5 주령 쥐의 뇌의 가쪽뇌실부위에 CNT(f-SWCNT 또는 f-MWCNT)를 직접 주입하고 5 주 동안 수술한 쥐의 생존율을 확인하였다.

도 6 에서 볼 수 있듯이, CNT 주입은 쥐에 아무런 영향을 미치지 않았다. 또한, CNT 주입이 신경세포 사멸이나 세포 유실 (cell loss)과 같은 악영향을 나타내지 않는다는 것을 조직 염색을 통하여 확인하였다.

따라서 본 연구 결과를 바탕으로 CNT 는 인 비보 독성을 전혀 갖지 않으며, 뇌 기능 이상을 유발하지 않는다는 것을 알 수 있다. 이러한 비독성 결과를 기초로 하여, CNT 를 줄기세포와 함께 이식하여 치료효과를 확인하였다.

줄기세포 및 CNT 의 혼합물에 의한 파킨슨 질환 치료 효과

본 실험은 6-OHDA 에 의해 만들어진 파킨슨 마우스 모델을 이용하여 CNT(f-SWCNT 또는 f-MWCNT)와 줄기세포 혼합물의 파킨슨 질환 치료 효과를 확인하였다.

도 7 에서 확인할 수 있듯이, 줄기세포 단독 이식 치료 효과보다 CNT 와 줄기세포를 함께 이식해준 질환 동물에서 그 개선 효과가 더 뛰어난 것을 알 수 있다. 이러한 개선된 치료 효과는 CNT 가 줄기세포의 효과적인 신경 네트워크 형성에 큰 도움을 주기 때문인 것으로 판단된다.

뇌허혈 동물 모델에서 줄기세포와 CNT 의 상호작용에 의한 행동이상 치료 효과

뇌허혈 동물 모델에서 줄기세포의 치료효과를 향상시키는데 CNT 가 전임상적으로 효과가 있는 지 여부를 확인하였다.

도 8a 에서 확인할 수 있듯이, 뇌허혈 동물 모델에서 CNT 를 줄기세포와 함께 뇌 손상 부위에 주입하였을 때 줄기세포만을 주입한 것보다 행동 병증 치료 효과가 뛰어났으며 공간 지각력과 학습 및 기억력 회복 치료에 뛰어난 효과가 있었다. 도 8a 에서, 잠복 시간 (latency)이 길어질수록 기억력이 상승되었음을 의미한다.

한편, 도 8b 는 수동 회피 행동 실험을 이식 후 1 주마다 다른 개체군으로 수행하여 통계 처리한 결과이다. 본 결과에서 확인할 수 있는 것처럼, 뇌허혈 동물 모델에서 줄기세포만을 이식한 경우보다 CNT 를 이용한 줄기세포 이식의 경우 그 치료 효과가 더 빠르고 의미 있게 증가하는 것을 알 수 있다.

줄기세포만을 이식한 경우 적어도 4 주 이상이 되어야 인지 및 학습력 저하의 개선 효과가 나타났지만, CNT 를 이용한 이식의 경우 2 주만에 그 효과가 나타났다. 뿐만 아니라, CNT 는 줄기세포의 장기 생존을 도움으로써 지속적인 치료 효과를 보이는 것을 확인했다.

알츠하이머 질환에서 줄기세포와 CNT 를 이용한 행동 및 인지기능 개선 효과

알츠하이머 동물 모델을 이용하여 8 방 미로 테스트를 통해서 SAT (spatial alteration task)를 확인하였다. 도 9 에서 볼 수 있듯이, 줄기세포만을 주입했을 때보다 CNT 를 이용한 줄기세포 이식이 기억력 개선에 더 큰 효과가 있었다. 특히 이식 후 일주일 후부터 8 일 동안 기억력 테스트를 진행한 결과 CNT 와 줄기세포를 함께 이식한 경우 안정적이고 지속적으로 기억력이 향상되는 것을 확인할 수 있었으며, 이 결과는 줄기세포만을 이식한 것과는 현저한 차이를 나타내는 것이다.

이상에서 상세히 설명하였듯이, 본 발명은 신규한 세포무독성 줄기세포 이식용 구조 지지체를 제공한다. 또한, 본 발명은 개선된 치료 효능을 발휘하는 줄기세포 치료제 조성물을 제공한다. CNT 를 포함하는 본 발명의 줄기세포 이식용 구조 지지체는, 생체 내 이식된 줄기세포 피이식조직에서 분화하여 주위의 세포들과 네트워킹을 이루는 데 있어서 매우 우수한 지지체 특성을 나타내며, 결국 이러한 지지체를 포함하는 본 발명의 치료제 조성물은 실제적으로 질환 동물에서 개선된 줄기세포 치료 효능을 나타낸다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이 며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (22)

1. 탄소나노튜브(carbon nanotube)를 포함하는 세포무독성 줄기세포 이식용 구조 지지체.
2. (a) 줄기세포; 및 (b) 줄기세포의 세포무독성 구조 지지체로서의 탄소나노튜브를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 치료제 조성물.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 줄기세포는 신경줄기세포이고 상기 치료제 조성물은 신경 질환 (neuronal disease) 치료용 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 신경 질환은 신경 퇴행성 질환, 및 허혈 또는 재관류에 의한 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 신경 퇴행성 질환은 알쯔하이머병, 헌팅톤 질병, 파킨슨 질병 및 근위축성 측삭 경화증으로 구성된 군으로부터 선택되는 신경 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 제 5 항에 있어서, 상기 허혈 또는 재관류에 의한 질환은 허혈성 뇌졸중인 것을 특징으로 하는 조성물.
8. 제 2 항에 있어서, 상기 탄소나노튜브는 탄소나노입자의 현탁액 형태로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
9. (a) 줄기세포; 및 (b) 줄기세포의 세포무독성 구조 지지체로서의 탄소나노튜브를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 치료제 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 줄기세포를 이용한 세포치료방법.
10. 제 9 항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포인 것을 특징으로 하는 세포치료방법.
11. 제 10 항에 있어서, 상기 줄기세포는 신경줄기세포이고 상기 치료제 조성물은 신경 질환(neuronal disease) 치료용 조성물인 것을 특징으로 하는 세포치료방법.
12. 제 11 항에 있어서, 상기 신경 질환은 신경 퇴행성 질환, 및 허혈 또는 재관류에 의한 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포치료방 법.
13. 제 12 항에 있어서, 상기 신경 퇴행성 질환은 알쯔하이머병, 헌팅톤 질병, 파킨슨 질병 및 근위축성 측삭 경화증으로 구성된 군으로부터 선택되는 신경 질환인 것을 특징으로 하는 세포치료방법.
14. 제 12 항에 있어서, 상기 허혈 또는 재관류에 의한 질환은 허혈성 뇌졸중인 것을 특징으로 하는 세포치료방법.
15. 제 9 항에 있어서, 상기 탄소나노튜브는 탄소나노입자의 현탁액 형태로 존재하는 것을 특징으로 하는 세포치료방법.
16. 세포치료제 약물(medicament)을 제조하기 위한 (a) 줄기세포; 및 (b) 줄기세포의 세포무독성 구조 지지체로서의 탄소나노튜브를 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도(use).
17. 제 16 항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포인 것을 특징으로 하는 용도.
18. 제 17 항에 있어서, 상기 줄기세포는 신경줄기세포이고 상기 치료제 조성물 은 신경 질환(neuronal disease) 치료용 조성물인 것을 특징으로 하는 용도.
19. 제 18 항에 있어서, 상기 신경 질환은 신경 퇴행성 질환, 및 허혈 또는 재관류에 의한 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
20. 제 19 항에 있어서, 상기 신경 퇴행성 질환은 알쯔하이머병, 헌팅톤 질병, 파킨슨 질병 및 근위축성 측삭 경화증으로 구성된 군으로부터 선택되는 신경 질환인 것을 특징으로 하는 용도.
21. 제 19 항에 있어서, 상기 허혈 또는 재관류에 의한 질환은 허혈성 뇌졸중인 것을 특징으로 하는 용도.
22. 제 16 항에 있어서, 상기 탄소나노튜브는 탄소나노입자의 현탁액 형태로 존재하는 것을 특징으로 하는 용도.

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