KR20040105704A

KR20040105704A - 내피 세포 부착 및 분화를 촉진하는 코팅을 갖는 의료 장치

Info

Publication number: KR20040105704A
Application number: KR10-2004-7011431A
Authority: KR
Inventors: 마이클 제이 비 쿠트릭; 로버트 존 쥬니어 코톤; 스티븐 엠 로우랜드; 마이클 에이 쿨리스체프스키
Original assignee: 오르버스 메디칼 테크놀로지즈 인코포레이티드
Priority date: 2002-02-06
Filing date: 2003-02-06
Publication date: 2004-12-16
Also published as: EP1471853B1; WO2003065881A2; AU2003219718A8; CN100455275C; CN101502674A; EP1471853A2; CN1627924A; AU2003219718A1; CA2472031A1; CA2472031C; EP1471853A4; WO2003065881A3; IL162803A; JP2005523050A; IL162803A0

Abstract

원시 세포 표면 항원을 인식, 이에 결합 및/또는 이와 상호작용하여 장치의 표면에 이 세포를 고정하는 항체, 항체 단편 또는 소형 분자를 포함하는 생체적합성 매트릭스로 코팅된, 스텐트, 스텐트 이식편, 합성 혈관 이식편, 심장 밸브와 같은 의료 장치를 제조하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 장치 상의 코팅은 또한, 원시 내피 세포를 촉진하여, 결합된 세포가 장치 표면 상에서 성숙한 기능성 내피 세포로 부착, 성장 및 분화되는 것을 가속화하여 내막 과형성을 막기 위한 화합물 또는 성장 인자를 포함할 수 있다. 이러한 의료 장치의 제조 방법, 조성물 및 재발협착증, 아테롬성 동맥경화증 또는 다른 종류의 혈관 폐색과 같은 혈관 질환을 갖는 포유 동물의 치료 방법이 개시된다.

Description

내피 세포 부착 및 분화를 촉진하는 코팅을 갖는 의료 장치{MEDICAL DEVICE WITH COATING THAT PROMOTES ENDOTHELIAL CELL ADHERENCE AND DIFFERENTIATION}

아테롬성 동맥경화증은 전세계적으로 사망 및 장애의 주요 원인 중 하나이다. 아테롬성 동맥경화증은 지방 플라크가 동맥의 내강 표면에 침착된다. 이 지방 플라크의 침착으로 인해 동맥의 단면적이 좁아지게 된다. 궁극적으로, 이러한 침착은 병소 원위로의 혈류를 차단하여, 동맥이 공급하는 조직에 허혈 손상을 일으킨다.

관상동맥은 심장에 혈액을 공급한다. 관상동맥 아테롬성 동맥경화 질환(CAD)은 미국에서 가장 일반적이고, 심각하고, 만성이고, 생명을 위협하는 질병으로, 천백만명 이상에게 영향을 주고 있다. 관상 아테롬성동맥경화증의 사회 경제적인 비용은 대부분의 다른 질환의 비용을 크게 초과한다. 관상동맥 내강이 좁아지면 심장 근육이 파괴되어, 일차적으로 앙기나, 이어서 심근경색 및 최종적으로 사망에 이르게 된다. 미국에서는 매년 백오십만명 이상에게서 심근경색이 발생한다. 이들 환자 중 육십만명(즉 40%)이 급성 심근 경색을 겪고, 이들 환자중 삼십만명 이상이 병원에 도착하기 전에 사망한다(Harrison's Principles of Internal Medicine, 14^thEdition, 1998).

CAD는 경피적인 내강을 가로지르는(translumenal) 관상 벌룬 혈관성형술(PTCA)(coronary balloon angioplasty)을 사용하여 치료할 수 있다. 미국에서는 매년 400,000 번 이상 PTCA 법을 실시한다. PTCA에서, 벌룬 카테터는 말초 동맥에 삽입되어, 차단된 관상 동맥 속으로 동맥계를 빠져나간다. 이어서 이 벌룬은 팽창되고, 동맥은 늘어나고, 막고있던 지방 플라크가 납작해져, 환부 동맥에 혈액의 단면 흐름이 증가한다. 그러나. 이 치료법으로는 일반적으로 환부 관상 동맥이 영구적으로 개방되지 않는다. PTCA로 치료받은 환자의 50%나 되는 많은 환자는 관상 동맥이 다시 좁아진 것을 치료하기 위하여 6개월 내에 반복적인 절차가 필요하다. 의학적으로, PTCA 치료 후에 동맥이 이와 같이 다시 좁아지는 것을 재발협착증이라고 한다. 심각하게, 재발협착증으로 혈관이 반동하여 수축하게 된다. 이어서, 혈관이 반동하여 수축한 후에, PTCA로부터의 혈관 손상으로 인해 내측 평활근 세포가 증식된다. 부분적으로, 평활근 세포의 증식은 트롬복산 A₂, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 및 섬유아세포 성장 인자(FGF)를 포함하는 손상된 영역으로부터의 다양한 염증성 인자가 방출됨으로써 매개된다. 재발협착증의 문제를 해결하기 위하여, 다양한 약리학적 약제를 사용하거나, 스텐트로 동맥의 개방을 기계적으로 유지하여 환자를 치료하는 것을 포함하는 많은 다른 기술이 사용되었다(Harrison's Principles of Internal Medicine, 14^thEdition, 1998).

재발협착증을 해결하기 위하여 사용된 다양한 방법 중에서, 스텐트가 가장 효과적인 것으로 판명되었다. 스텐트는 정상 혈관 내강을 만들기 위해 질환이 있는 혈관 분절에 위치하는 금속 골격이다. 환부 동맥 분절에 스텐트를 위치시키면 동맥이 반동하여 패쇄되는 것을 막는다. 스텐트는 또한 동맥의 내측 층(medial layer)을 따르는 동맥의 국부적 절개를 막을 수 있다. PTCA 만을 사용한 경우보다 큰 내강을 유지함으로써, 스텐트는 재발협착증을 30%만큼이나 크게 감소시킨다. 이와 같은 성공에도 불구하고, 스텐트는 재발협착증을 완전히 막지 못한다.(Suryapranata et al. 1998. Randomized comparison of coronary stenting with balloon angioplasty in selected patients with acute myocardial infarction.Circulation97:2502-2502)

에이오토일리악(aortoiliac), 서혜부 아래쪽(infrainguinal), 원위 심재성대퇴골(distal profunda femoris), 원위 슬와, 경골, 쇄골밑 및 장간막(mesenteric) 동맥을 포함하는, 관상 동맥 이외의 혈관에서 동맥이 좁아질 수 있다. 말초 동맥 아테롬성 동맥경화 질환(PAD)의 유병력(prevalence)은 환부의 특정한 해부학상 부위 및 폐색의 진단에 사용되는 기준에 따라 결정된다. 일반적으로, 내과의사는 PAD가 존재하는지를 확인하기 위하여 간헐성 파행 시험을 사용해왔다. 그러나, 이 측정법으로는 집단 내 실제 질환 발병율이 크게 과소평가될 수 있다. PAD의 비율은 연령에 따라 다양하게 나타나며, 노인에게서 PAD의 발병율이 증가한다. NHDS(National Hospital Discharge Survey)로부터의 데이터에 따르면, 매년 남성 55,000명 및 여성 44,000명이 일차적으로 만성 PAD로 진단받았고, 남성 60,000명 및 여성 50,000명이 일차적으로 급성 PAD로 진단받은 것으로 나타났다. 급성 PAD의 91%는 곤경에 처한 정도가 낮았다. PAD 환자의 코모르비드(comorbid) CAD 유병력이 50%를 초과할 수 있다. 또한, PAD 환자 가운데 뇌혈관 질환의 유병력이 증가된다.

PAD는 경피적인 내강을 가로지르는 벌룬 형관성형술(PTA)을 사용하여 치료할 수 있다. PTA와 함께 스텐트를 사용하면 재발협착증의 발병율이 감소한다. 그러나, 스텐트와 같은 의료 장치를 사용하여 얻어진 수술 후의 결과는 표준 수술 혈관이식 방법, 즉 정맥 또는 인공삽입(prosthetic) 바이패스 물질을 사용하여 얻어진 결과와 대등하지 않다. (Principles of Surgery, Schwartz et al. eds., Chapter 20,Arterial Disease, 7th Edition, McGraw-Hill Health Professions Division, New York 1999).

PAD는, 동맥의 차단된 부분을 이식편을 사용하여 우회하는 바이패스 방법을 사용하여 치료하는 것이 바람직하다. (Principles of Surgery, Schwartz et al. eds., Chapter 20,Arterial Disease, 7th Edition, McGraw-Hill Health Professions Division, New York 1999). 이식편은 복제 정맥과 같은 자가조직(autologous) 정맥 분절 또는 폴리에스테르, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 또는 팽창된 폴리테트라플루오로에틸렌(ePTFE), 또는 다른 중합체 물질로 만들어진 것과 같은 합성 이식편으로 구성될 수 있다. 수술 후 개방율은 바이패스 이식편의 내강 크기, 이식편에 사용된 합성 물질의 종류 및 유출(outflow) 부위를 포함하는 다수의 상이한 인자에 따라 결정된다. 그러나, 바이패스 이식편을 사용한다 하더라도 과도한 내막 과형성 및 혈전증이 큰 문제점으로 남는다. 예를 들어, ePTFE 바이패스 이식편을 사용한 3년 시점에 서혜부 아래쪽 바이패스 방법의 개방은, 대퇴부-슬와 바이패스에 대해 54% 및 대퇴부-경골 바이패스에 대해 단지 12%이다.

결과적으로, CAD 및 PAD의 질병률 및 사망률을 더 감소시키기 위하여, 스텐트, 합성 바이패스 이식편 및 다른 장기간에 걸친 혈액 접촉 표면 및/또는 장치의 성능을 개선해야 할 큰 필요성이 있다.

스텐트에 대하여, 혈전증 및 재발협착증을 감소시키기 위하여 다양한 항-혈전증 약제 또는 항-재발협착증 약제를 사용하여 스텐트를 코팅하는 접근법이 있었다. 예를 들어, 스텐트를 방사성 물질로 함침시키면 근육섬유아세포의 이동 및 증식이 저해되어 재발협착증이 저해되는 것으로 나타난다. (미국 특허 제 5,059,166호, 5,199,939호 및 5,302,168호). 치료된 혈관을 방사선조사하면 환자에게 심각한 가장자리 재발협착증 문제가 발생할 수 있다. 또한, 방사선조사는 환부 혈관을 균일하게 치료할 수 없다.

선택적으로, 스텐트는 또한 헤파린, 포스포릴콜린, 라파마이신, 및 탁솔과 같은 화학제로 코팅되었으며, 이들은 모두 혈전증 및/또는 재발협착증을 감소시키는 것으로 보인다. 헤파린 및 포스포릴콜린은 동물 모델에서 단기간에 혈전증을 크게 감소시키는 것으로 보이지만, 이들 약제를 사용한 치료는 재발협착증의 예방에 대해 장기간의 효과를 갖지 않는 것으로 보인다. 또한, 헤파린은 혈소판 감소증을 유도하여 졸중과 같은 심각한 혈전색전증 합병증을 일으킬 수 있다. 따라서, 이와 관련하여 실제로 재발협착증을 치료하기 위하여 충분한 치료적 유효량의 헤파린 또는 포스포릴콜린을 스텐트에 로딩하는 것은 쉽지 않다.

수술후 재발협착증 및 혈전증을 감소시키기 위하여 다양한 방법으로 합성 이식편을 처리하였다. (Bos et al. 1998. Small-Diameter Vascular Graft Prostheses: Current StatusArchives Physio. Biochem.106:100-115). 예를 들어, 망상(meshed) 폴리카르보네이트 우레탄과 같은 폴리우레탄 조성물이 ePTFE 이식편에 비해 재발협착증을 감소시키는 것으로 보고되었다. 이식편의 표면은 또한 폴리테레프탈레이트 이식편을 불소화하기 위하여 무선주파수 글로우(glow) 방전으로 변형되었다. 합성 이식편은 또한 콜라겐과 같은 생체분자로 함침되었다. 그러나, 이들 접근법 중 어느것도 장기간에 걸쳐 혈전증 또는 재발협착증의 발병율을 크게 감소시키지 못하였다.

내피 세포(EC) 층은 정상적인 혈관벽의 중요한 성분으로, 혈관벽의 주변 분자 및 혈류 간의 계면을 제공한다. 내피 세포는 또한 혈관형성을 포함하는 생리학적 사건, 염증 및 혈전증의 예방과 관련이 있다(Rodgers GM. FASEB J 1988;2:116-123). 맥관구조를 구성하는 내피 세포 외에, ECs 및 내피 원시 세포(EPCs)가 말초 혈액에서 생후에(postnatally) 순환하는 것으로 최근 연구를 통해 밝혀졌다(Asahara T, et al. Science 1997;275:964-7; Yin AH, et al. Blood 1997;90:5002-5012; Shi Q, et al. Blood 1998;92:362-367; Gehling UM, et al. Blood 2000; 95:3106-3112; Lin Y, et al. J Clin Invest 2000;105:71-77). EPCs는 외상성 및 허혈성 손상 부위를 포함하는 손상된 내피 라이닝(lining)과 함께 순환계의 영역으로 이동하는 것으로 생각된다(Takahashi T, et al. Nat Med 1999;5:434-438). 정상 성인에서, 말초 혈액의 EPCs 농도는 3-10 세포/mm³이다(Takahashi T, et al. Nat Med 1999;5:434-438; Kalka C, et al. Ann Thorac Surg. 2000;70:829-834). 현재, 손상에 대한 혈관 반응의 각 양상은 내피에 의해 (조절되지 않는다면) 영향을 받는다는 것이 명백하다. 손상되고 스텐트된 혈관의 분절 상에 기능성 내피층이 신속하게 복구되면, 순환하는 사이토카인에 대한 장벽이 제공되고, 혈전의 역효과가 예방됨으로써, 그리고 밑에 놓인(underlying) 평활근 세포층을 부동태화하는(passivate) 물질을 생산하는 내피 세포의 능력에 의해, 이와 같은 잠재적으로 심각한 합병증의 예방에 도움이 될 수 있을 것으로 생각된다(Van Belle et al. 1997. Stent Endothelializaiton.Circulation95:438-448; Bos et al. 1998. Small-Diameter Vascular Graft Prostheses: Current StatusArchives Physio.Biochem.106:100-115).

내피 세포는, 스텐트의 이식 후 혈관 내피 성장 인자(VEGF)인 내피 세포 미토젠의 국부 전달에 의해 스텐트의 표면 상에서 성장하도록 촉진되었다(Van Belle et al. 1997. Stent Endothelialization.Circulation95:438-448). 손상 부위에 식염수 중의 재조합 단백질 성장 인자인 VEGF를 적용하면 바람직한 효과가 유도되며, VEGF는 채널 벌룬 카테터를 사용한 스텐트 이식 후에 손상 부위에 전달된다. 이 기술은, 단일 투여량 전달의 효율이 낮고 일정하지 않은 결과를 나타내는 것으로 증명되었으므로 바람직하지 않다. 따라서, 이 방법은 매번 정확하게 재현될 수 없다.

합성 이식편에 내피 세포가 또한 접종(seeding)되었으나, 내피 접종의 임상 결과는 일반적으로 열등하였다, 즉 수술후 개방율이 낮았으며(Lio et al. 1998. New concepts and Materials in Microvascular Grafting: Prosthetic Graft Endothelial Cell Seeding and Gene Therapy.Microsurgery18:263-256), 세포가 이식편에 적절히 부착되지 않았고 및/또는 생체 외 조작으로 이들의 EC 기능이 손실되었다는 사실이 큰 원인인 것으로 생각된다.

그러므로, 내피 세포 성장 인자 및 원 위치의 환경적인 조건은, 혈관 손상 부위에서의 내피 세포의 부착, 성장 및 분화를 조절하기에 필수적이다. 따라서, 표적 혈관 분절 또는 이식된 내강 상에 융합성 EC 단층이 형성되도록 이식된 장치의 표면 상에서 기능성 내피의 형성을 촉진 및 가속화하는, 스텐트 및 합성 이식편을 포함하는 의료 장치를 코팅하고, 후기-내막 과형성(neo-intimal hyperplasia)을 저해하기 위한 신규한 방법 및 조성물을 개발할 필요성이 있다. 이러한 형태의 코팅은 재발협착증을 저해할 뿐 아니라, 장치의 이식에 따른 혈전색전증 합병증도 저해할 것이다. 이러한 개선을 제공하는 방법 및 조성물은, 이전의 기술의 단점을 제거하고, CAD 및 PAD와 관련있는 질병률 및 사망률에 대해 상당히 긍정적인 효과를 갖는다.

본 출원은 2002년 2월 6일자로 출원된 미국 가특허출원 제 60/354,680호에 대한 우선권을 주장한다.

본 발명은 신체 내 혈관 또는 속이 비어 있는 장기에 이식되는 의료 장치의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 코팅된 스텐트, 스텐트 이식편(grafts), 합성 혈관 이식편, 심장 밸브, 카테터 및 혈관 인공삽입(vascular prosthetic filters) 필터와 같은 의료 장치의 인공적인 내강내 혈액 접촉 표면에 관한 것이다. 이식된 의료 장치 상의 코팅은, 원시 내피 세포(progenitor endothelial cells)가 이식된 장치의 표면 상에 부착, 성장 및 분화되어 기능성 내피를 형성하도록 촉진하고, 이를 통해 이식 부위에서의 혈관 또는 장기의 내막 과형성을 저해한다.

도 1a는 가교결합 분자에 의해 매트릭스에 공유 결합된 항체의 개략도이다. 도 1b는 매트릭스를 고정하는 C₆₀O 분자의 다이아그램을 나타낸다. 도 1c는 본 발명의 매트릭스로 코팅된 스텐트의 개략도를 나타낸다.

도 2a는 강화 배지에 의해 분리된 세포를 포함하는 피브로넥틴-코팅된 슬라이드에 부착된 원시 내피 세포의 위상차 현미경사진이다. 도 2b는 항-CD34 항체코팅된 자석 비드에 의해 분리된 세포를 포함하는 피브로넥틴-코팅된 슬라이드에 부착된 원시 내피 세포의 위상차 현미경사진이다. 도 2d 및 2f는 7일동안 배양되고 Pl 핵 염료로 염색된 원시 내피 세포의 현미경사진이다. 이들 도면에서 알 수 있는 바와 같이, 세포는, Tie-2(도 2e 및 2g) 및 VEGFR-2(도 2c) 항체 반응성에 대해 항체 형광으로 나타나는 성숙한 내피 세포 표지를 발현한다.

도 3a 및 3b는 내피 질소 산화물 신태타제, eNOS 및 글리세르알데하이드 포스페이트 디하이드로게나제, GAPDH에 대한 반정량 RT-PCR의, 에티듐 브로마이드로 염색된 2% 아가로스겔의 사진이다. 피브로넥틴-코팅된 슬라이드 상에서 배양한 3일 후(도 3b) 및 7일(도 3a) 후, 원시 내피 세포는 eNOS mRNA를 발현하기 시작한다.

도 4a-4e는, HUVEC 세포와 함께 배양되고 프로피듐 이오다이드로 염색된, CMDx 및 항-CD34 항체(도 4a); 젤라틴 및 항-CD34 항체(도 4b); 노출(bare) 스테인리스강 디스크(도 4c); CMDx 코팅 및 젤라틴 코팅된 스테인리스강 디스크에 부착되어 있는 HUVECs의 현미경사진이다.

도 5a-5c는 항체가 없는 CMDx로 코팅된 대조구의 현미경사진이다. 도 5d-5f는 이의 표면에 결합된 항체가 없는 젤라틴으로 코팅되어 있는 대조 스테인리스강 디스크의 현미경사진이다.

도 6a-6c는 이의 표면에 결합된 항-CD34 항체를 갖는 CMDx 매트릭스로 코팅되어 있는 스테인리스강 디스크의 현미경사진이다. 도 6d-6f는 이의 표면에 결합된 항체를 갖는 젤라틴 매트릭스로 코팅되어 있는 스테인리스강 디스크의 현미경사진이다.

도 7은 24시간동안 원시 세포와 함께 배양된, 이의 표면에 결합된 항체를 갖는 CMDx 매트릭스로 코팅된 스테인리스강 디스크의 현미경사진이다.

도 8a 및 8b는 7일동안 원시 세포와 함께 배양되고 항-KDR 항체와 함께 발달된, 이의 표면에 결합된 항-CD34 항체를 포함하는 CMDx 매트릭스로 코팅된 스테인리스강 디스크의 현미경사진이다.

도 9a 및 9b는 7일동안 원시 세포와 함께 배양되고 항-Tie-2 항체와 함께 발달된, 이의 표면에 결합된 항-CD34 항체를 포함하는 CMDx 매트릭스로 코팅된 스테인리스강 디스크의 현미경사진이다.

도 10a-10c는 성숙한 내피 세포를 보여주는 내피 성장 배지에서 3주동안 원시 세포와 함께 배양된 스테인리스강 CMDx 코팅 디스크의 위상차 현미경사진이다.

도 11은 원시 세포와 결합하는 본 발명의 기능성 풀러렌 코팅된 스텐트 표면의 개략도이다.

도 12a-12d는, 프로피듐 브로마이드로 염색된 항-CD34 항체 및 항-VEGFR-2 항체가 있거나 없는, 풀러렌-코팅된 시료의 현미경사진이다.

도 13a-13d는 노출 스테인리스강 스텐트(도 13a 및 13c) 및 풀러렌-코팅된 시료(도 13b 및 13d)가 4주동안 이식된 관상 동맥 외식편(explants)을 각각 저배율 및 고배율로 찍은 현미경사진이다.

도 14a-14g는 1 및 48시간에서의 주사 전자 현미경사진이다. 이식 1시간 후의 덱스트란-코팅된(도 14a) 및 덱스트란/항-CD34 항체-코팅된(도 14b) 스텐트의외식편. 도 14c 및 14d는 대조구 시료의 외식편을 도시하고, 도 14e-g는 이식 48시간 후의 덱스트란/항-CD34 항체-코팅된 스텐트이다. 도 14h-14m은 4주동안 이식되었던 웅성 요크셔 돼지로부터의 외식편의 관상 동맥 단면의 조직학적 현미경사진이다: 비코팅(노출 스테인리스강)(14h 및 14i), 덱스트란-코팅된 대조구(14j 및14k), 및 덱스트란/항-CD34 항체-코팅(14l 및 14m).

도 15a, 15b 및 15c는 각각, 길이 18mm인, 이의 표면 상에 항체가 없는 덱스트란-혈장-코팅된 스텐트 및 덱스트란-혈장-코팅/항-CD34 항체-코팅된 스텐트의 48시간 외식편 부분의 공초점 현미경사진이다.

도 16a 및 16b는 프로피듐 이오다이드 및 항-렉틴/FITC-접합된 시료의 현미경사진이다.

본 발명의 목적은, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화증, 혈전증, 혈관 폐색 등을 포함하는 혈관 질환을 치료하기 위한, 스텐트, 스텐트 이식편, 심장 밸브, 카테터, 혈관 인공삽입 필터, 인공 심장, 외부 및 내부 좌심실 보조 장치(LVADs), 및 합성 혈관 이식편와 같은 코팅된 의료 장치를 제공하는 것이다. 일실시형태에서, 본 의료 장치 상의 코팅은, 포획된 원시 내피 세포의 의료 장치 표면 상의 부착, 성장 및 분화를 조절하여 기능성 내피의 형성을 유도함으로써 내막 과형성을 저해하고 재발협착증을 예방하고, 이를 통해 혈관 질환을 갖는 치료 환자의 예후를 개선하기 위하여, 생체적합성 매트릭스, 일종 이상의 항체 또는 항체 단편, 또는 항체 및 단편의 조합물, 및 성장 인자와 같은 하나 이상의 화합물을 포함하여 이루어진다.

일실시형태에서, 생체적합성 매트릭스는 치료적 유효량의 일종 이상의 항체, 항체 단편, 또는 항체 및 항체 단편의 조합물을 부착시키기 위한 외면을 포함하여 이루어진다. 이 항체 또는 항체 단편은 원시 내피 세포의 세포막 또는 표면 상에 있는 항원을 인식하고 이에 결합하여 이 세포를 매트릭스 표면에 고정시킨다. 또한, 코팅은 고정된 원시 내피 세포를 자극하여, 의료 장치 표면 상의 성숙한 기능성 내피의 형성을 가속화하는 치료적 유효량의 하나 이상의 화합물을 포함하여 이루어진다.

본 발명의 의료 장치는, 내강을 포함하는 신체 일부 또는 장기에 이식하기 위해 사용되는 임의의 장치가 될 수 있으며, 스텐트, 스텐트 이식편, 합성 혈관 이식편, 심장 밸브, 카테터, 혈관 인공삽입 필터, 페이스메이커, 페이스메이커 리드(pacemaker lead), 세동제거기(defibrilator), 개방 난원공(patent foramen ovale)(PFO) 격벽 폐쇄 장치, 혈관 클립, 혈관 동맥류 폐색기(vascular aneurysm occluder), 혈액투석 이식편, 혈액투석 카테터, 방실계의 션트(shunt), 대동맥 동맥류 이식편 장치 또는 성분, 정맥 밸브, 봉합재(suture), 혈관 문합 클립, 내재성 정맥 또는 동맥 카테터, 혈관 시스(vascular sheath) 및 약물 전달 포트가 될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 의료 장치는 장치에 따라 많은 물질로 만들 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 스텐트는 스테인리스강, 니티놀(Nitinol)(NiTi), 또는 크롬 합금으로 만들 수 있다. 합성 혈관 이식편은 가교결합된 PVA 하이드로겔, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 팽창된 폴리테트라플루오로에틸렌(ePTFE), 다공성 고밀도 폴리에틸렌(HDPE), 폴리우레탄, 및 폴리에틸렌 테레프탈레이트로 만들 수 있다.

본 장치의 코팅을 형성하는 생체적합성 매트릭스는, 폴리우레탄, 분절화된 폴리우레탄-우레아/헤파린, 폴리-L-락트산, 셀룰로오스 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 아세테이트, 덱스트란 및 젤라틴과 같은 합성 물질, 콜라겐, 엘라스틴, 라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴 등의 기저막 성분; 헤파린, 피브린, 셀룰로오스, 및 비정질 탄소와 같은 자연-발생 물질 또는 풀러렌을 포함하여 이루어진다.

본 발명의 일실시형태에서, 의료 장치는 풀러렌을 포함하는 생체적합성 매트릭스를 포함하여 이루어진다. 이 실시형태에서, 풀러렌은 탄소수 약 C₂₀내지 약 C₁₅₀의 범위가 될 수 있으며, 더 상세하게는 C₆₀또는 C₇₀이다. 본 발명의 풀러렌은 의료 장치의 표면 상에 나노튜브로서 배열될 수도 있다.

의료 장치의 코팅에 제공하기 위한 항체는 일종 이상의 항체 또는 항체 단편을 포함하여 이루어진다. 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메라 항체 또는 인간화된 항체가 될 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 원시 내피(성숙한 기능성 내피 세포가 될 수 있는 내피 세포, 원시 또는 줄기 세포) 세포 표면 항원을 인식하고 결합하며, 의료 장치 표면 상으로의 세포의 부착을 조절한다. 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 매트릭스의 표면에 공유 또는 비공유 부착되거나, 의료 장치를 코팅하는 매트릭스의 최외층에 링커 분자에 의해 공유 속박될 수 있다. 본 발명의 이러한 관점에서, 예를 들어 모노클로날 항체는 Fab 또는 F(ab')₂단편을 더 포함하여 이루어질 수 있다. 본 발명의 항체 단편은, 항체로서 표적 항원을 인식 및 결합하는 특성을 갖는 대형 및 소형 분자와 같은 임의의 단편 크기를 포함한다.

본 발명의 항체 또는 항체 단편은 치료되는 포유 동물에 대한 특이성을 갖는 항원을 인식하여 결합하며, 이의 특이성은 세포 혈통에 따라 결정되지 않는다. 일 실시형태에서, 항체 또는 단편은 CD133, CD34, CDw90, CD117, HLA-DR, VEGFR-1,VEGFR-2, Muc-18(CD146), CD130, 줄기 세포 항원(Sca-1), 줄기 세포 인자 1(SCF/c-Kit 리간드), Tie-2 및 HAD-DR과 같은 인간 원시 내피 세포 표면 항원에 대해 특이적이다.

다른 실시형태에서, 의료 장치의 코팅은 상기된 바와 같은 한 층 이상의 생체적합성 매트릭스를 포함하여 이루어지며, 이 메트릭스는 자연 또는 합성 유래인, 치료적 유효량의 일종 이상의 소형 분자를 부착시키기 위한 외면을 포함한다. 소형 분자는 원시 내피 세포 표면 상의 항원을 인식하고 상호작용하여, 원시 내피 세포를 장치의 표면 상에 고정함으로써 내피를 형성한다. 소형 분자는 지방산, 단백질, 핵산, 사카라이드 등의 세포 성분과 같은 다수의 공급원으로부터 유래할 수 있으며, 항체와 동일한 결과 또는 효과로 원시 내피 세포의 표면 상에 있는 항원과 상호작용할 수 있다. 본 발명의 이러한 관점에서, 의료 장치 상의 코팅은, 항체 또는 항체 단편을 포함하는 코팅과 관련하여, 본 명세서에 기재된 성장 인자와 같은 화합물을 더 포함하여 이루어질 수 있다.

본 발명의 코팅의 화합물은, 원시 세포의 성숙한 기능성 내피 세포로의 성장 및 분화를 자극 또는 가속화하는 임의의 화합물을 포함하여 이루어진다. 예를 들어, 본 발명에 사용되는 화합물은, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 염기성 섬유아세포 성장인자, 혈소판-유도된 성장인자, 형질전환 성장인자 베타 1, 산성 섬유아세포 성장인자, 오스테오넥틴, 안지오포이에틴 1(Ang-1), 안지오포이에틴 2(Ang-2), 인슐린-유사 성장 인자, 과립구-마크로파지 콜로니-자극 인자, 혈소판-유래 성장인자 AA, 혈소판-유래 성장인자 BB, 혈소판-유래 성장인자 AB 및 내피 PAS 단백질 1과같은 성장인자이다.

본 발명은 또한 본 발명의 코팅된 의료 장치를 사용한 아테롬성 동맥경화증, 재발협착증, 혈전증, 동맥류 및 혈관 폐색과 같은 혈관 질환의 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 이러한 실시형태에서, 이 방법은 혈관 항상성을 확립하고 이를 통해 과도한 내막 과형성을 예방하기 위해 스텐트 또는 합성 혈관 이식편, 심장 밸브, 복부 대동맥 동맥류 장치 및 이의 성분과 같은 의료 장치 인서트를 혈관벽에 유지시키거나 끼워넣는 만큼, 종래 기술에 따른 방법을 개선한다. 본 아테롬성 동맥경화증의 치료 방법에서, 동맥은 대퇴부 동맥과 같은 말초 동맥 또는 관상 동맥일 수 있다. 본 발명의 기술 및 의료 장치를 사용하여 정맥을 치료할 수도 있다.

본 발명은 또한 치유 반응을 유도하기 위하여 설계된 방법을 제공한다. 일실시형태에서, 이식된 혈관(vessel)의 표적 병소에 이식된 장치의 내강 표면에 융합성 내피 층의 형성을 신속하게 유도하기 위한 방법이 제공되며, 내피 세포는 질소 산화물 신태타제 및 다른 항-염증성 및 염증-조절 인자를 발현한다. 본 발명은 또한, 종래 기술의 장치보다 생체적합성이 증가되고, 의료 장치의 이식 부위에서의 내부 내강 표면을 따르는 평활근 세포 이동, 평활근 세포 분화 및 콜라겐 침착을 감소시키거나 저해함으로써 조직-계의 과도한 내막 과형성 및 재발협착증을 감소시키거나 저해하는 의료 장치를 제공한다.

본 발명의 실시형태에서, 의료장치를 코팅하는 방법은, 폴리우레탄, 분절화된 폴리우레탄-우레아/헤파린, 폴리-L-락트산, 셀룰로오스 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 아세테이트, 덱스트란, 젤라틴, 콜라겐, 엘라스틴,라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 헤파린, 피브린, 셀룰로오스 및 탄소 및 풀러렌으로 구성되는 그룹에서 선택되는 하나 이상의 성분을 포함하여 이루어지는 한 층 이상의 생체적합성 매트릭스 층을 의료 장치 표면에 적용하는 단계, 및

생체적합성 매트릭스에 동시 또는 순차적으로, 치료적 유효량의 한 종 이상의 항체, 항체 단편 또는 이의 조합물, 및 내피 세포성장 및 분화를 자극하는 하나 이상의 화합물을 적용하는 단계를 포함하여 이루어진다.

본 발명은 또한, 포유 동물의 혈관 또는 관상 장기에 의료 장치를 이식하는 것을 포함하여 이루어지는 포유 동물의 혈관 질환의 치료 방법을 제공하며, 상기 의료 장치는 (a) 생체적합성 매트릭스, (b) 치료적 유효량의 한종 이상의 항체, 항체 단편 또는 이의 조합물, 및 (c) 하나 이상의 화합물로 코팅되어 있고; 상기 항체 또는 항체 단편은 원시 내피 세포 표면 상의 항원을 인식 및 결합하여 원시 내피 세포를 매트릭스 표면 상에 고정시키고, 상기 화합물은 고정된 원시 내피 세포를 자극하여 의료 장치의 표면 상에 내피를 형성하기 위한 것임을 특징으로 한다.

본 발명은 또한, 포유 동물의 혈관 또는 관상 장기에 의료 장치를 이식하는 것을 포함하여 이루어지는 포유 동물의 내막 과형성증의 저해 방법을 제공하며, 상기 의료 장치는 (a) 한층 이상의 생체적합성 매트릭스, (b) 치료적 유효량의 한종 이상의 항체, 항체 단편 또는 이의 조합물, 및 (c) 하나 이상의 화합물로 코팅되어 있고; 상기 항체 또는 항체 단편은 원시 내피 세포 표면 상의 항원을 인식 및 결합하여 원시 내피 세포를 매트릭스 표면 상에 고정시키고, 상기 하나 이상의 화합물은 고정된 원시 내피 세포를 자극하여 의료 장치의 표면 상에 내피를 형성하기 위한 것임을 특징으로 한다.

본 발명은 코팅된, 스텐트와 같은 이식가능한 의료 장치, 의료 장치의 코팅 방법 및 조성물, 및 코팅된 의료 장치를 사용한 혈관 질환의 치료 방법을 제공한다. 도 1a-1c는 본 발명의 의료 장치의 표면 코팅물의 개략도를 나타낸다. 이 의료 장치 상의 코팅물은, 내피 세포의 융합성 층의 형성을 촉진하여 과도한 내막 과형성을 저해함으로써 재발협착증 및 혈전증을 막기 위한 생체적합성 매트릭스를 포함하여 이루어진다. 일실시형태에서, 매트릭스는, 의료장치에 대한 내피, 원시 또는 줄기 세포의 부착을 촉진하는 치료적 유효량의 한 종 이상의 항체, 및 내피 세포 성장 및 분화를 자극하는 성장 인자와 같은 하나 이상의 화합물을 포함하는 합성 또는 자연-발생 물질을 포함하여 이루어진다. 장치를 이식하면, 장치의 표면에 부착되는 세포는, 의료 장치의 내강 표면 상에서 성숙한 융합성 기능성 내피층으로 형질전환된다. 의료장치 상에 융합성 내피세포층이 존재하면 이식 부위에 재발협착증 및 혈전증의 발생이 감소된다.

본 명세서에서, "의료 장치"는 의학적 이상(medical condition)을 예방 또는 치료하기 위하여 일시적 또는 영구적으로 포유 동물에 도입되는 장치를 의미한다. 이러한 장치에는 피하, 경피 또는 외과적으로 도입되어 동맥, 정맥, 심실 및 심방과 같은 장기, 장기의 조직 또는 내강 내에 남겨지는 임의의 것들이 포함된다. 의료 장치에는, 스텐트, 스텐트 이식편, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 팽창된 폴리테트라플루오로에틸렌(ePTFE)으로 도포된 것과 같은 도포 스텐트, 또는 합성 혈관 이식편, 인공 심장 밸브, 인공 심장 및 혈관 혈행(vascular circulation)에 인공삽입 장기를 연결하는 고정물(fixtures), 정맥 밸브, 복부 대동맥 동맥류(AAA) 이식편, 하방 정맥 대정맥 필터(inferior venal caval filters), 영구 약물 주입 카테터, 색전 코일(embolic coils), 혈관 전색에 사용되는 색전 물질(예를 들어, 가교-결합된 PVA 하이드로겔), 혈관 봉합재, 혈관 문합 고정물, 트란스마이오카디얼(transmyocardial) 혈관 이식 스텐트 및/또는 다른 도관(conduits)이 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 의료장치를 코팅하면 의료 장치의 표면 상에 있는 융합성 내피 세포층의 발달이 자극되어, 재발협착증이 예방되고, 의료 장치의 이식으로 인한 국부적인 만성 염증 반응 및 다른 혈전색전증 합병증이 조절된다.

의료 장치를 코팅하는 매트릭스는, 폴리비닐 알콜(PVA), 폴리우레탄, 폴리-L-락트산, 셀룰로오스 에스테르 또는 폴리에틸렌 글리콜로 만든 하이드로겔 등의 중합체 겔 포말과 같은 합성 물질로 구성될 수 있다. 일실시형태에서, 매트릭스 제조용 합성 물질은 덱스트란 화합물과 같은 매우 친수성인 화합물을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 매트릭스는 콜라겐, 피브린, 엘라스틴 또는 비정질 탄소와 같은 자연 발생 물질로 구성된다. 매트릭스는, 합성 또는 자연 발생 물질로 구성되는 제 1층 및 항체로 구성되는 제 2층을 갖는 수개의 층을 포함할 수 있다. 층은 순차적으로 배열되어, 제 1층은 스텐트 또는 합성 이식편 표면과 직접적으로 접촉하고, 제 2층은 한쪽 표면이 제 1층과 접촉하고 반대쪽 표면이 혈관 내강과 접촉할 수 있다.

매트릭스는 또한, 내피 세포 증식 및 분화를 자극하는 하나 이상의 성장 인자, 사이토카인 등을 포함하여 이루어진다. 예를 들어, 혈관 내피 세포 성장 인자(VEGF) 및 이소형(isoforms), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 혈소판-유도된 성장 인자(PIGF), 형질전환 성장 인자 베타 1(TGF.b1), 산성 섬유아세포 성장 인자(aFGF), 오스테오넥틴, 안지오포이에틴 1, 안지오포이에틴 2, 인슐린-유사 성장 인자(ILGF), 혈소판-유래 성장 인자 AA(PDGF-AA), 혈소판-유래 성장 인자 BB(PDGF-BB), 혈소판-유래 성장 인자 AB(PDGF-AB), 과립구-마크로파지 콜로니-자극 인자(GM-CSF) 등, 또는 이의 기능성 단편을 본 발명에 사용할 수 있다.

다른 실시형태에서, 매트릭스는 탄소수 약 C₂₀내지 약 C₁₅₀범위인 풀러렌을 포함하여 이루어질 수 있다. 풀러렌은 또한 분자 또는 단백질을 포함하는 나노튜브로 배열될 수 있다. 풀러렌 매트릭스는 또한 스테인리스강, PTFE 또는 ePTFE 의료 장치의 표면에 적용될 수 있으며, 이어서 이 층은 기능화되고, 이의 표면 상에 항체 및 성장 인자가 코팅된다. 선택적으로, PTFE 또는 ePTFE가 예를 들어 스테인리스강 의료 장치 상에 먼저 층을 이룬 후 풀러렌이 제 2층을 이룰 수 있으며, 이어서 항체 및 성장 인자가 첨가된다.

매트릭스는 의료 장치에 비공유 또는 공유 부착될 수 있다. 항체 및 성장 인자는 헤테로- 또는 호모 이기능성 가교결합제를 사용하여 매트릭스에 공유 부착될 수 있다. 성장 인자는 항체와 함께 또는 항체 결합 후에 표준 기술을 사용하여 매트릭스에 첨가될 수 있다.

본 명세서에서, "항체"라는 용어는 일종의 모노클로날, 폴리클로날, 인간화 또는 키메라 항체 또는 이의 조합물을 의미하며, 이 모노클로날, 폴리클로날, 인간화 또는 키메라 항체는 한 항원 또는 이 항원의 기능성 등가물에 결합한다. 항체 단편이라는 용어는 Fab, F(ab')₂와 같은 임의의 항체 단편을 포함하며, 항체와 동일한 결과 또는 효과를 갖는 임의의 크기, 즉 대형 또는 소형 분자가 될 수 있다. (항체는 항체 몰당 6.022×10²³분자인 다수의 개별 항체 분자를 포함한다).

본 발명의 한 관점에서, 본 발명의 스텐트 또는 합성 이식편은, 순환하는 원시 내피 세포의 의료 장치에 대한 부착을 조절하는 항체를 포함하는 생체적합성 매트릭스로 코팅된다. 본 발명의 항체는 순환 혈액 중의 원시 내피 세포 표면 항원을 인식 및 결합하여, 이 세포를 장치 표면 상에 고정시킨다. 일실시형태에서, 항체는 원시 내피 세포 표면 항원, 또는 혈관 내피 성장 인자 수용체-1, -2 및 -3(VEGFR-1, VEGFR-2 및 VEGFR 수용체계 이소형), Tie-1, Tie2, CD34, Thy-1, Thy-2, Muc-18(CD146), CD30, 줄기 세포 항원-1(Sca-1), 줄기 세포 인자(SCF 또는 c-Kit 리간드), CD133 항원, VE-카드헤린(VE-cadherin), P1H12, TEK, CD31, Ang-1, Ang-2와 같은 원시 또는 줄기 세포 표면 항원, 또는 원시 내피 세포의 표면상에서 발현되는 항원과 반응하는(인식 및 결합) 모노클로날 항체를 포함하여 이루어진다. 일실시형태에서, 하나의 항원과 반응하는 단일종의 항체를 사용할 수 있다. 선택적으로, 상이한 원시 내피 세포 표면 항원에 대한 다수의 상이한 항체를 함께 혼합하여 매트릭스에 첨가할 수 있다. 다른 실시형태에서, 모노클로날 항체의 칵테일을 사용하여 특이적 세포 표면 항원을 표적화함으로써 내피 형성 속도를 증가시킨다. 본 발명의 이러한 관점에서, 예를 들어 항-CD34 및 항-CD133을 조합 사용하여 스텐트 상의 매트릭스 표면에 첨가한다.

본 명세서에서, "치료적 유효량의 항체"는 내피, 원시 또는 줄기 세포의 의료 장치에 대한 부착을 촉진하는 항체의 양을 의미한다. 본 발명을 실시하기 위하여 필요한 항체의 양은 사용되는 항체의 성질에 따라 다르다. 예를 들어, 사용되는 항체의 양은 항체 및 이것이 반응하는 항원간의 결합 상수에 따라 결정된다. 특정 항원과 함께 사용하는 항체의 치료적 유효량을 결정하는 방법은 당업자에게 주지되어 있다.

본 명세서에서, "화합물"이라는 용어는, 질소 산화물 신태타제와 같은 분자를 발현하는, 성숙한 기능성 내피 세포로의 원시 내피 세포의 성장 및 분화를 자극하는, 안지오포이에틴계 및 VEGF계에 속하는 것 등의 성장 인자 및 비타민 A 및 C 등의 비타민과 같은 임의의 물질을 의미한다.

본 명세서에서, "성장 인자"라는 용어는, 내피, 줄기 또는 원시 세포가 성숙한 기능성 내피 세포로 성장 및 분화하도록 자극하는 펩티드, 단백질, 당단백질, 지단백질, 또는 이의 단편 또는 변형물, 또는 합성 분자를 의미한다. 성숙한 내피 세포는 질소 산화물 신태타제를 발현함으로써, 조직에 질소 산화물을 방출시킨다. 하기 표 1은 의료 장치를 코팅하기 위해 사용가능한 성장 인자 중 일부를 나타낸다.

본 명세서에서, "VEGF"라는 용어는, 이소형(isoform)이 이의 숫자 또는 알파벳 약자로 구체적으로 확인되지 않는다면, 상기 표 1에 기재된 혈관 내피 성장 인자의 임의의 이소형을 의미한다.

본 명세서에서, "치료적 유효량의 성장 인자"라는 용어는, 내피, 원시 또는 줄기 세포가 성장 및 분화하도록 자극하거나 유도함으로써 의료 장치의 내강 표면 상에 성숙한 기능성 내피 세포의 융합성 층을 형성하는 성장인자의 양을 의미한다. 본 발명을 실시하기 위해 필요한 성장 인자의 양은 사용되는 성장 인자의 성질, 및 성장인자 및 이의 수용체 간의 결합 동역학에 따라 달라진다. 예를 들어, 100㎍의 VEGF는 의료 장치 상의 내피 세포의 부착을 자극하여 내피의 융합성 층을 형성하는 것으로 나타났다. 내피 세포의 세포 성장 및 분화를 자극하기 위하여 사용하는 성장인자의 치료적 유효량을 결정하는 방법은 당업자에게 주지되어 있다.

본 명세서에서, "내막 과형성"은 혈관벽에 평활근 세포 증식 및 매트릭스 침착이 증가된 바람직하지 못한 상태이다. 본 명세서에서 "재발협착증"은 혈관 내강이 다시 좁아지는 것을 의미한다. 혈관은 재발협착증 때문에 막힐 수 있다. PTCA 또는 PTA 후에, 내막에 정상적으로 존재하지 않는 중간 및 외막으로부터의 평활근 세포가 증식하여 내막으로 이동하고, 단백질을 분비하여, 내막 내에 평활근 세포 및 매트릭스 단백질의 축적물이 형성된다. 이러한 축적물로 인해, 동맥의 내강이 좁아지고, 좁아진 부분의 말단으로 혈류가 감소한다. 본 명세서에서, "재발협착증의 저해"는 단백질 분비의 예방을 통해 재발협착증 및 이로부터 발생하는 합병증의 예방을 수반하는 평활근 세포의 이동 및 증식의 저해를 의미한다.

본 발명의 의료 장치, 방법 및 조성물을 사용하여 치료할 수 있는 대상은, 포유 동물, 즉 보다 구체적으로는, 인간, 개, 고양이, 돼지, 설치류 또는 원숭이가 있다.

본 발명의 방법은 생체 내 또는 시험관 내에서 실시할 수 있다.

"원시 내피 세포"라는 용어는, 골수, 혈액 또는 국부 조직에서 유래한, 원시 또는 줄기 세포로부터 성숙한 기능성 내피 세포까지 임의의 발달 단계에 있는 비-악성 내피 세포를 의미한다.

코팅된 의료 장치를 생체 내에서 연구 또는 사용하기 위하여, 완전히 분화된 내피 세포를 동맥 또는 인간 배꼽 정맥과 같은 정맥으로부터 분리할 수 있으며, 원시 내피 세포는 말초 혈액 또는 골수로부터 분리한다. 내피 세포는, 항체, 성장 인자 또는 내피 세포에 부착되는 다른 약제를 포함하는 매트릭스로 코팅된 의료 장치와 함께 내피 세포를 배양함으로써 의료 장치에 결합된다. 다른 실시형태에서, 내피 세포는 형질전환된 내피 세포가 될 수 있다. 트랜스펙션된 내피 세포는, 혈전형성, 재발협착증, 또는 임의의 다른 치료적 한계를 저해하는 성장 인자 또는 단백질을 발현하는 벡터를 포함한다.

본 발명의 혈관 질환의 치료 방법은 임의의 동맥 또는 정맥에 실시할 수 있다. 관상, 서혜부 아래쪽, 에이오토일리악, 쇄골밑, 장간막 및 신장 동맥을 포함하는 임의의 동맥의 아테롬성 동맥경화증이 본 발명의 범위에 포함된다. 해부 동맥류로 인한 것과 같은 다른 종류의 혈관 폐색도 본 발명에 포함된다.

혈관 질환을 갖는 포유 동물의 치료 방법은, 예를 들어 혈관성형 수술동안코팅된 스텐트의 경우에, 환자의 장기 또는 혈관 속에 코팅된 의료 장치를 이식하는 단계를 포함하여 이루어진다. 원 위치에서 일단, 코팅 상에 존재하는 항체가 원시 세포 표면 상에 있는 항원을 인식 및 결합함으로써, 원시 내피 세포는 코팅된 스텐트의 표면 상에 포획된다. 일단 원시 세포가 매트릭스에 부착되면, 코팅 상의 성장 인자는, 스텐트의 내강 표면상에 융합성 성숙한 기능성 내피를 성장 및 분화 및 형성시키기 위하여 새롭게 결합된 원시 내피 세포를 촉진한다. 선택적으로, 의료 장치의 이식 전에, 의료장치는 환자의 혈액, 골수 또는 혈관으로부터 분리된 원시, 줄기 세포 또는 성숙한 내피 세포를 사용하여 시험관 내에서 내피 세포로 코팅된다. 어느 경우든, 의료 장치의 내강 표면 상에 내피 세포가 존재하면 과도한 내막 과형성 및 혈전증이 저해 또는 예방된다.

내피 세포

본 명세서에 참조 병합된 문헌(Jaffe, et al.,J. Clin. Invest.,52:2745-2757, 1973)의 방법에 따라 탯줄로부터 인간 배꼽 정맥 내피 세포(HUVEC)를 얻어 실험에 사용하였다. 요약하면, 콜라게나제로 처리하여 혈관벽으로부터 세포를 벗겨내고, 젤라틴-코팅된 조직 배양 플라스크에서 10% 저농도 내독소 우태아 혈청, 90ug/㎖ 보존제-무첨가 돼지 헤파린, 20ug/㎖ 내피 세포 성장 보충물(ECGS) 및 글루타민을 포함하는 M199 배지 중에 배양한다.

아사하라 등(Asahara et al.)(Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis,Science275:964-967, 1997, 본 명세서에 참조 병합됨)의 방법에 따라 원시 내피 세포(EPC)를 인간 말초 혈액으로부터 분리한다. CD34에 대한 항체로 코팅된 자석 비드를 분획화된 인간 말초 혈액을 사용하여 배양한다. 배양 후, 결합된 세포를 용리해내고, EBM-2 배양 배지에서 배양할 수 있다. (Clonetics, San Diego, CA). 선택적으로, 이들 세포를 분리하기 위하여 강화 배지 분리를 사용할 수 있다. 요약하면, 말초 정맥혈을 건강한 남성 지원자로부터 얻어 단핵 세포 단편을 밀도 구배 원심분리를 통해 분리하고, 이 세포를 5% 우태아 혈청, 인간 VEGF-A, 인간 섬유아세포 성장 인자-2, 인간 상피 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자-1, 및 아스코르브산이 보충된 EC 기본 배지-2(EBM-2)(Clonetics) 중에서 피브로넥틴 코팅된 배양 슬라이드(Becton Dickinson) 상에 도말한다. EPCs는 매 48시간마다 배양 배지를 교환하면서 7일간 성장시킨다. 세포는 CD45, CD34, CD31, VEGFR-2, Tie-2 및 E-셀렉틴에 대한 형광 항체에 의해 특성이 나타난다.

포유 동물 세포를, 통상적인 방법을 사용하여, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 또는 질소 산화물 신타제(NOS)와 같은 단백질을 암호화하는 임의의 클로닝된 유전자를 포함하는 발현 벡터를 사용하여 트랜스펙션한다. [예를 들어, 스트라타젠(Stratagene, San Diego, CA)에서 시판하고 있는 포유 동물 발현 벡터 및 트랜스펙션 키트]. 예를 들어, 정제된 소의 원시 내피 세포를 로젠가르트 등(Rosengart et al.)(Six-month assessment of a phase I trial of angiogenic gene therapy for the treatment of coronary artery disease using direct intramyocardial administration of an adenovirus vector expressing the VEGF121 cDNA.Ann. Surg.230(4):466-470(1999), 본 명세서에 참조 병합됨)의 방법에 따라 VEGF cDNA를 발현시키는 아데노바이러스 발현 벡터를 사용하여 혈관 내피 성장 인자(VEGF)로 트랜스펙션한다.

항체

본 발명의 방법에 유용한 모노클로날 항체는 코헬 및 밀스테인(Kohler and Milstein)(Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.Nature265:495-497, 1975, 본 명세서에 참조 병합됨)의 표준 기술에 따라 제조하거나, 상업적인 공급원으로부터 얻을 수 있다. 내피 세포를 면역원으로 사용하여 내피 세포 표면 항원에 대한 모노클로날 항체를 제조할 수 있다.

내피 세포에 대한 모노클로날 항체는 HUVEC 또는 정제된 원시 내피 세포를 마우스 또는 래트에 주입하여 제조한다. 충분한 시간 후에, 마우스를 치사시켜 비장 세포를 얻는다. 일반적으로 비-이온성 세제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜의 존재 하에 비장 세포를 골수종 세포 또는 림프종 세포와 융합시켜 비장 세포를 불멸화한다. 융합된 하이브리도마를 포함하는 얻어진 세포를 HAT-배지와 같은 선택성 배지 중에서 성장시키고, 생존한 세포를 제한 희석 조건을 사용하여 이러한 배지 내에서 성장시킨다. 세포는 예를 들어 미량역가 웰과 같은 적당한 용기 내에서 성장시키고, 상등액을 원하는 특이성, 즉 내피 세포 항원과의 반응성을 갖는 모노클로날 항체에 대하여 선별한다.

세포를 받는 포유 동물 숙주의 복막강에 하이브리도마 세포를 주입한 후 복수를 회수하는 것과 같은 모노클로날 항체의 수율을 증진시키기 위한 다양한 기술이 있다. 복수에서 불충분한 양의 모노클로날 항체가 회수되는 경우에, 숙주의 혈액으로부터 항체를 회수한다. 다른 단백질로부터의 모노클로날 항체 및 다른 오염물이 없도록 모노클로날 항체를 분리 및 정제하기 위한 다양한 통상적인 방법이 있다.

본 발명의 범위에는 이들 모노클로날 항체의 Fab, F(ab')₂와 같은 항-내피 세포 모노클로날 항체의 유용한 결합 단편도 포함된다. 항체 단편은 통상적인 기술에 의해 얻어진다. 예를 들어, 유용한 결합 단편은 파파인 또는 펩신을 사용하여 항체를 펩티다제 소화함으로써 제조할 수 있다.

본 발명의 항체는 쥐 공급원으로부터의 IgG 클라스의 항체에 대한 것이다; 그러나, 이에 제한하고자 하는 것은 아니다. 상기 항체, 및 쥐 공급원, 인간을 포함하는 포유 동물 공급원 유래든지 또는 다른 공급원 유래든지 간에 상기 항체와 기능성 등가성을 갖는 항체와, 이러한 클라스 내의 이소형을 포함하는 IgM, IgA, IgE 등과 같은 다른 클라스가 본 발명의 범위에 포함된다. 항체의 경우, "기능성 등가성"이라는 용어는, 두개의 다른 항체가 각각 항원 상의 동일한 항원 부위에 결합한다는 것, 다시 말해 항체가 동일한 항원에 결합하기 위해 경쟁한다는 것을 의미한다. 항원은 동일하거나 상이한 분자 상에 있을 수 있다.

일실시형태에서, 내피 세포 표면 항원 CD34와 반응하는 모노클로날 항체가 사용된다. 고체 지지체에 부착된 항-CD34 모노클로날 항체는 인간 말초 혈액으로부터의 원시 내피 세포를 포획하는 것으로 보였다. 포획 후, 이들 원시 세포는 내피 세포로 분화 가능하다. (Asahara et al. 1997. Isolation of putativeprogenitor endothelial cells for angiogenesis.Science275:964-967). CD34에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는 ATTC(American Type Tissue Collection)(Rockville, MD)로부터 얻을 수 있다. 다른 실시형태에서, VEGFR-1 및 VEGFR-2, CD133 또는 Tie-2와 같은 내피 세포 표면 항원과 반응성인 모노클로날 항체가 사용된다.

의료 장치 이식물의 수혜자와 동일한 종으로부터 분리된 내피 세포에 대해 반응성인 폴리클로날 항체도 사용될 수 있다.

스텐트

본 명세서에서 "스텐트"라는 용어는 혈관의 내강에 삽입 또는 이식되는 경우에 혈관의 단면 내강을 팽창시키는 임의의 의료 장치를 의미한다. "스텐트"라는 용어에는, 본 발명의 방법으로 코팅된 시판 스테인리스강 스텐트; PTFE 또는 ePTFE로 도포된 것과 같은 도포 스텐트가 포함된다. 일실시형태에서, 관상 동맥 폐색을 치료하거나, 비장, 경동맥, 장골 및 슬와 혈관의 절개부 또는 동맥류를 밀봉하기 위하여 경피 전달된 스텐트가 포함된다. 다른 실시형태에서, 스텐트가 정맥 혈관에 전달된다. 스텐트는, 항체 및 성장 인자와 같은 화합물을 포함하여 이루어지는 매트릭스가 상부에 적용되어 있는 중합성 또는 금속성 구조적 요소로 구성될 수 있거나, 중합체와 혼합된 매트릭스 복합물이 될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 참조병합되어 있는 미국 특허 제 4,886,062호(Wiktor)에 개시된 것과 같은 변형가능한 금속 와이어 스텐트를 사용할 수 있다. 본 명세서에 참조 병합되어 있는 공개된 국제 특허 출원 WO91/12779호 "Intraluminal Drug Eluting Prosthesis"에 개시된 것과 같은 탄성 중합체 물질의 자가-팽창 스텐트를 사용할 수도 있다. 스테인리스강, 중합체, 니켈-티탄, 탄탈, 금, 백금-이리듐 또는 엘길로이(Elgiloy) 및 MP35N 및 다른 철 함유 물질을 사용하여 스텐트를 제조할 수도 있다. 스텐트는, 카테터로부터 스텐트가 방출되는 처리 부위에 카테터 상에서 신체 내강을 통하여 전달되어, 혈관의 내강벽과 직접 접촉하도록 팽창된다. 다른 실시형태에서, 스텐트는 생분해성 스텐트를 포함하여 이루어진다(H. Tamai, pp 297 in Handbook of Coronary Stents. 3rd Edition, Eds. PW Serruys and MJB Kutryk, Martin Dunitz(2000)). 본 발명의 항체, 성장 인자 및 매트릭스와 함께 (탄성 금속 스텐트 디자인과 같은) 다른 자가-팽창 스텐트 설계를 사용할 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.

합성 이식편

"합성 이식편"라는 용어는 생체적합성의 특성을 갖는 임의의 인공 삽입물을 의미한다. 일실시형태에서, 합성 이식편은 폴리에틸렌 테레프탈레이트(Dacron, PET) 또는 폴리테트라플루오로에틸렌(Teflon, ePTFE)으로 만들어질 수 있다. 다른 실시형태에서, 합성 이식편은 폴리우레탄, 가교-결합된 PVA 하이드로겔, 및/또는 하이드로겔의 생체적합성 포말로 구성된다. 제 3 실시형태에서, 합성 이식편은 망상 폴리카르보네이트 우레탄의 내층 및 망상 폴리에틸렌 테레프탈레이트의 외층으로 구성된다. 본 발명의 항체, 성장 인자 및 매트릭스와 함께 임의의 생체적합성 합성 이식편을 사용할 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. (Bos et al. 1998. Small-Diameter Vascular Prostheses: Current Status.Archives PhysioBiochem.106:100-115, 본 명세서에 참조병합됨). 합성 이식편은, 말단에서 말단까지, 말단에서 측면까지, 측면에서 측면까지 또는 내강을 가로질러, 혈관 문합에, 또는 예를 들어 복부 대동맥 동맥류 장치와 같은 질환을 갖는 혈관 분절의 바이패스를 위해 사용할 수 있다.

매트릭스

(A)합성 물질-스텐트 또는 합성 이식편을 코팅하기 위하여 사용되는 매트릭스는, 폴리우레탄, 분절화된 폴리우레탄-우레아/헤파린, 폴리-L-락트산, 셀룰로오스 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 가교-결합된 PVA 하이드로겔, 하이드로겔의 생체적합성 포말, 또는 카르복시메틸 덱스트란 등의 친수성 덱스트란과 같은 합성 물질로부터 선택될 수 있다.

(B)자연 발생 물질-매트릭스는 콜라겐, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 엘라스틴, 라미닌, 헤파린, 피브린, 셀룰로오스 또는 탄소와 같은 자연 발생 물질로부터 선택될 수 있다. 매트릭스의 일차적 요건은, 이것이 스텐트 또는 합성 이식편의 노출면 상에서 파열되지 않고 남아있도록 충분한 탄성 및 가요성을 갖는 것이다.

(C)풀러렌-매트릭스는 또한 풀러렌("풀러렌"이라는 용어는 다수의 풀러렌 분자를 포함한다)을 포함하여 이루어진다. 풀러렌은 탄소-케이지 분자이다. 풀러렌 종의 탄소 (C) 분자수는 약 C₂₀내지 약 C₁₅₀으로 다양하다. 풀러렌은 당업자에게 주지된 방법으로 원소 탄소 또는 탄소-함유 종의 고온 반응; 예를 들어 탄소의 레이저 기화, 전기 아크에서의 탄소 가열, 또는 그을음 불꽃(sooting flames)에서의탄화수소의 연소를 통해 제조된다. [미국 특허 제 5,292,813호(Patel et al.), 본 명세서에 참조 병합됨; 미국 특허 제 5,558,903호(Bhushan et al.), 본 명세서에 참조 병합됨]. 각 경우에, 탄소질 침착 또는 그을음이 생긴다. 톨루엔과 같은 적당한 용매로 추출함으로써 이 그을음으로부터 다양한 풀러렌이 얻어진다. 풀러렌은 공지된 방법, 특히 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 분리된다. 풀러렌은 합성하거나 다이나믹 엔터프라이즈사(Dynamic Enterprises, Ltd., Berkshire, England or Southern Chemical Group, LLC, Tucker, Georgia, or Bucky USA, Houston Texas)로부터 구매할 수 있다.

풀러렌은 미국 특허 제 5,558,903호에 개시된 승화(sublimation), 레이저 기화, 스퍼터링, 이온빔, 스프레이 코팅, 딥 코팅(dip-coating), 롤-온(roll-on) 또는 브러시 코팅을 포함하는 다양한 다른 방법으로 또는 스텐트 표면의 유도체화에 의해 표면 상에 침착될 수 있다.

풀러렌의 중요한 특징은 "활성화된 탄소(activated carbon)"를 형성하는 이들의 능력이다. 풀러렌의 전자 구조는, 다수의 결합 전자가 분자의 표면 주위에 공존하는 중첩 π-오비탈계이다. (Chemical and Engineering News, Apr. 8, 1991, page 59, 본 명세서에 참조 병합됨). 활성화된 탄소의 형태로서, 풀러렌은 상호작용이 약한 실질적인 반데르발스 힘을 보인다. 풀러렌 표면의 흡착성으로 인해 특정 세포막과 상호작용하도록 할 목적으로 추가적인 변형이 쉽다. 예를 들어, 특정 세포 종의 세포막 또는 세포막의 특정 성분(예를 들어 렉틴 또는 항체)에 선택적으로 결합하는 화학적 특징을 갖는 특정 분자를 풀러렌 표면에 흡착시킬 수 있다. 풀러렌 표면에 대한 상이한 분자의 부착을 조작하여, 다양한 세포 종[예를 들어, 원시 내피 세포, 내피 세포, 섬유아세포, 일차 외식편 또는 T-세포 부차집단(subpopulations)]에 선택적으로 결합하는 표면을 만들 수 있다. 미국 특허 제 5,310,669호(Richmond et al.), 본 명세서에 참조 병합됨; 문헌(Stephen R. Wilson, Biologicla Aspects of Fullerenes,Fullerenes, Fullerenes:Chemistry Physics and Technology,Kadish et al. eds., John Wiley & Sons, NY2000), 본 명세서에 참조 병합됨.

풀러렌은 다른 원자 또는 분자를 넣은 나노튜브를 형성할 수도 있다. [Liu et al. Science 280:1253-1256(1998), 본 명세서에 참조 병합됨]. 탄소 나노 튜브의 합성 및 제조는 이 기술분야에 주지되어 있다. [미국 특허 제 5,753,088호(Olk et al.) 및 미국 특허 제 5,641,466호(Ebbsen et al.), 본 명세서에 참조 병합됨]. 단백질과 같은 분자를 탄소 나노튜브에 넣을 수도 있다. 예를 들어, 나노튜브의 말단을 절단한 후 Zn₂Cd₂-메탈로티오네인(Zn₂Cd₂-metallothionein), 시토크롬 C 및 C3, 및 베타-락타마제와 같은 효소로 나노튜브를 충전할 수 있다. [Davis et al.Inorganica Chim. Acta272:261(1998); Cook et al. Full Sci. Tech. 5(4):695(1997), 본 명세서에 참조 병합됨].

3차원 풀러렌 구조를 사용할 수도 있다. 본 명세서에 참조 병합된 미국 특허 제 5,338,571호(Mirkin et al.)에, (i) 풀러렌을 화학적으로 변형시켜 결합-형성 종을 제공하고; (ii) 기재 표면을 화학적으로 처리하여, 용액 중의 풀러렌의 결합-형성 종과 공유 결합하기에 효과적인 결합-형성 종을 제공하고; 및 (iii) 변형된 풀러렌의 용액을 처리된 기재 표면과 접촉시켜, 처리된 기재 표면에 공유 결합된 풀러렌 층을 형성함으로써 기재 표면 상에 형성되는 3차원의 다층 풀러렌 구조가 개시되어 있다.

(D)의료 장치에 대한 매트릭스의 적용

매트릭스는 스텐트 또는 합성 이식편의 표면에 단단히 부착되어야 한다. 바람직하게는, 매트릭스를 연속적인 박층으로 적용하여 이를 수행한다. 선택적으로, 항체 및 성장 인자를 혈관 내강과 직접 접촉하는 외층의 표면에만 적용한다. 상이한 종류의 매트릭스를 연속층으로 연속적으로 적용할 수 있다. 스텐트에 매트릭스를 적용한 후, 매트릭스 상에 항체를 공유 또는 비공유 코팅할 수 있다.

스텐트와 같은 의료 장치를 코팅하기 위하여, 스텐트를 적당한 점도의 매트릭스 액상 용액에 담그거나 이를 분무한다. 각 층을 적용한 후, 다음 층의 적용 전에 스텐트를 건조시킨다. 일실시형태에서, 얇은 페인트형 매트릭스 코팅은 전체 두께가 100 미크론을 초과하지 않는다.

일실시형태에서, 스텐트 표면을 먼저 기능화한 후에 매트릭스층을 첨가한다. 그리고나서, 항체 및 성장 인자를 매트릭스 표면에 결합시킨다. 본 발명의 이러한 관점에서, 스텐트 표면 기술로 화학적 작용기를 만든다. 이어서, 아민과 같은 화학적 기를 사용하여, 항체 및 성장 인자에 대한 지지체 역할을 하는 매트릭스 중간층을 고정한다.

다른 실시형태에서, 무균 조건 하에서 클로르포름 3 밀리리터(㎖) 중에 폴리-D, L-락티드[뵈링거 사제(Boehringer Inc. Lngelheim, Germany)의 R203로 이용가능]와 같은 약물 담체 480 밀리그람(mg)을 용해시켜 적당한 매트릭스 코팅 용액을 제조한다. 그러나, 원칙적으로, 그것이 적용 후 의료 장치 상에 자가-부착성 라커- 또는 페인트-유사 코팅으로 비교적 빠르게 건조된다면, 혈액- 및 조직-적합성(생체 적합성)이고 용해, 분산 또는 유화될 수 있는 임의의 생분해성(또는 비-생분해성) 매트릭스를 매트릭스로 사용할 수 있다.

예를 들어, 스텐트를 피브린으로 코팅하는 것이 당업자에게 주지되어 있다. 본 명세서에 참조 병합되어 있는 미국 특허 제 4,548,736호(Muller et al.)에서는, 피브리노겐을 트롬빈과 접촉시켜 피브린을 응고시킨다. 바람직하게는, 본 발명의 피브린-함유 스텐트 중의 피브린은, 이식된 장치의 기계적 특성 및 생체안정성(biostability)을 개선하기 위하여, 본 명세서에 참조 병합되어 있는 미국 특허 제 3,523,807호(Gerendas)에 기재된 바와 같거나, 본 명세서에 참조 병합되어 있는 공개 유럽 특허 출원 제 0366564호에 기재된 바와 같이, 응고동안에 존재하는 인자 XIII 및 칼슘을 갖는다. 바람직하게는, 본 발명에서 피브린을 만들기 위하여 사용되는 피브리노겐 및 트롬빈은, 예를 들어 인간 항-소(human anti-cow)와 같은 임의의 종간 면역 반응을 피하기 위하여, 스텐트가 이식될 예정인 종과 동일한 동물 또는 인간 종으로부터 유래한다. 피브린 생성물은, 조합된 피브리노겐 및 트롬빈을 막으로 주조한 후, 반투과성 막을 통해 삼투적으로 막으로부터 수분을 제거함으로써 미세한 피브린 막의 형태로 될 수 있다. 유럽 특허 출원 제 0366564호에서는, (바람직하게는, 높은 다공성 또는 트롬빈 또는 피브리노겐에 대한 높은 친화도를갖는) 기재를 피브리노겐 용액 및 트롬빈 용액과 접촉시킨다. 의료 장치의 표면 상에 피브리노겐이 중합하여 형성된 피브린층이 얻어진다. 이러한 방법으로 적용된 피브린의 다층은 임의의 원하는 두께를 갖는 피브린층을 제공할 수 있다. 선택적으로, 피브린을 먼저 응고시킨 후, 물과 혼합되어 가열 몰드에서 원하는 형태로 스탬핑되는 분말로 그라인딩한다(미국 특허 제 3,523,807호). 피브린을 글루타르알데하이드 또는 포름알데하이드와 같은 고정제와 접촉시켜 성형된 피브린에 안정성을 또한 증가시킬 수 있다. 피브린을 만들고 형성시키기 위하여 당업자에게 공지된 이들 및 다른 방법을 본 발명에 사용할 수 있다.

합성 이식편을 콜라겐으로 코팅하는 경우, 콜라겐을 제조하고 이를 합성 이식편 장치 상에 형성하는 방법이, 본 명세서에 참조 병합되어 있는 미국 특허 제 5,851,230호(Weadock et al.)에 나타난 바와 같이 주지되어 있다. 이 특허에는 합성 이식편을 콜라겐으로 코팅하는 방법이 기재되어 있다. 콜라겐을 다공성 이식편 기재에 부착시키는 방법은 일반적으로, 콜라겐 분산물을 기재에 적용하여 이를 건조시키고, 이 처리를 반복하는 것을 포함한다. 콜라겐 분산물은 일반적으로, 산성 pH(2 내지 4 범위의 pH)에서 불용성 콜라겐(약 1-2 중량%)을 분산물 중에 혼합하여 만든다. 분산물은 일반적으로 주사기를 통해 이식편의 내강 속에 주입하고 손으로 마사지하여, 전체 내부 표면적을 콜라겐 슬러리로 도포한다. 과도한 콜라겐 슬러리는 이식편의 개방 말단 중 하나를 통해 제거한다. 코팅 및 건조 단계를 수회 반복하여 충분히 처리한다.

또다른 실시형태에서, 스텐트 또는 합성 이식편을 비정질 탄소로 코팅한다.본 명세서에 참조 병합되어 있는 미국 특허 제 5,198,263호에는, 불소화되거나 또는 다른 할로겐화된 가스의 존재 하에서 비정질 탄소 막을 고속, 저온 침착시키는 방법이 기재되어 있다. 본 발명의 방법에 따른 침착은, 주변 실온을 포함하는 100℃ 이하에서 무선주파수, 플라즈마-보조, 화학-증착 공정을 사용하여 실시할 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하여 만든 비정질 탄소 막은, 예를 들어 유리, 금속, 반도체 및 플라스틱을 포함하는 많은 종류의 기재에 잘 부착된다.

미국 특허 5,292,813호에 기재된 바와 같이, 풀러렌-이식편, 아민-함유 중합체를 형성하기 위하여 아민-포함 중합체의 반응성 아미노기 부위에 풀러렌 잔기를 부착시킬 수 있다. 이와 같이 화학적으로 변형시키면 스텐트에 풀러렌을 직접 넣을 수 있다. 다른 실시형태에서, 풀러렌을 상기와 같은 스텐트 또는 합성 이식편의 표면 상에 침착시킬 수 있다. [WO 99/32184호(Leone et al.) 참조, 본 명세서에 참조병합됨]. 풀러렌(예를 들어 C₆₀)을 에폭사이드 결합을 통해 스테인리스강의 표면에 부착시킬 수 있다. (Yamago et al., Chemical Derivatization of Organofullerenes through Oxidation, Reduction and C-O and C-C Bond Forming Reactions,J. Org. Chem., 58 4796-4798(1998), 본 명세서에 참조 병합됨). 산소에는 공유 결합으로 부착된다. 결합을 위한 이러한 화합물 및 프로토콜은 BuckyUSA(BuckUSA, Houston, Texas)에서 시판중이다.

(E)메트릭스에 대한 항체 및 성장 인자의 첨가-원시 내피 세포의 부착을 촉진하는 항체, 및 세포 성장 및 분화를 촉진하기 위한 성장인자는 공유 또는 비공유적으로 매트릭스에 넣는다. 항체 및 성장 인자는, 항체 및 성장 인자를 매트릭스 코팅 용액과 혼합하여 매트릭스층에 넣은 후, 장치의 표면에 적용한다. 일반적으로, 항체 및 성장 인자를 장치의 내강 표면 상에 적용되는 매트릭스의 최외층 표면에 부착시켜, 항체 및 성장 인자가 순환하는 혈액과 접촉하는 표면 상에 돌출되도록 한다. 항체 및 성장인자는 표준 기술을 사용하여 표면 매트릭스에 적용한다.

일실시형태에서, 항체는 매트릭스를 포함하는 용액에 첨가한다. 예를 들어, 항-CD34 모노클로날 항체 상의 Fab 단편을 인간 피브리노겐을 500 내지 800mg/dl의 농도로 포함하는 용액과 함께 배양한다. 항-CD34 Fab 단편의 농도는 다양하며, 당업자는 과도한 실험을 하지 않고 최적 농도를 결정할 수 있을 것으로 생각된다. 스텐트는 Fab/피브린 혼합물에 첨가되며, 농축 트롬빈(1000U/㎖ 이상의 농도)을 첨가함으로써 피브린이 활성화된다. 매트릭스에 직접 넣어진 Fab 단편을 포함하는, 얻어진 중합 피브린 혼합물을, 스텐트 또는 합성 이식편의 표면 상에서 박막(100㎛)으로 가압한다. 사실상 임의의 종류의 항체 또는 항체 단편을, 스텐트 또는 합성 이식편의 코팅 전에 이러한 방법으로 매트릭스 용액 중에 넣을 수 있다.

예를 들어, 다른 실시형태에서는, 항체 단편 및 성장 인자가 있거나 없는 항체 전체를 매트릭스에 공유 결합시킨다. 일실시형태에서, 항체 및 성장인자(들)를 헤테로- 또는 호모이기능성 링커 분자를 사용하여 매트릭스에 공유 속박시킨다. 본 명세서에서 "속박(tethered)"이라는 용어는 링커 분자에 의해 항체가 매트릭스에 공유 결합되는 것을 의미한다. 본 발명과 관련하여 링커 분자는 일반적으로, 링커 분자를 스텐트에 부착시킨 후 이를 매트릭스에 공유 결합시키는 것을 포함하여 사용한다. 매트릭스에 공유 결합시킨 후, 링커 분자를 사용하여 일종 이상의 항체를 공유 결합시킬 수 있다. 도 1a는 가교-결합 분자를 통한 결합을 도시한다. 내피 세포(1.01)는 세포 표면 항원(1.02)을 통해 항체(1.03)에 결합한다. 항체는 가교결합 분자(1.04)를 통해 매트릭스(1.05, 1.06)에 속박된다. 매트릭스(1.05-1.06)는 스텐트(1.07)에 부착된다. 링커 분자는 매트릭스에 직접(즉, 카르복실기를 통해) 또는 에스테르화, 아미드화 및 아실화와 같은 주지된 커플링 화학을 통해 결합될 수 있다. 링커 분자는, 아미드 결합의 직접적인 형성을 통해 매트릭스에 커플링되는 디- 또는 트리-아민 기능성 화합물이 될 수 있으며, 항체와의 반응을 위해 이용가능한 아민-작용기를 제공한다. 예를 들어, 링커 분자는 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리알릴아민(PALLA) 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)와 같은 폴리아민 기능성 중합체가 될 수 있다. 예를 들어 mPEG-숙신이미딜 프로피네이트 또는 mPEG-N-하이드록시숙신이미드와 같은 다양한 PEG 유도체가 공유 커플링을 위한 프로토콜과 함께 세어워터사(Shearwater Corporation, Birmingham, Alabama)에서 시판되고 있다. (또한, Weiner et al., Influence of a poly-ethyleneglycol spacer on antigen capture by immobilized antibodies.J. Biochem. Biophys. Methods45:211-219(2000) 참조, 본 명세서에 참조 병합됨). 특정 커플링제의 선택은 사용되는 항체의 종류에 따라 결정되고, 이러한 선택은 과도한 실험 없이 가능한 것으로 생각될 것이다. 이들 중합체의 혼합물을 사용할 수도 있다. 이들 분자는, 하나 이상의 항체를 표면-고정하기 위하여 사용할 수 있는 다수의 부속 아민-작용기를 포함한다.

스텐트의 표면에 직접 침착된 C₆₀풀러렌층에 항체가 부착될 수 있다. 가교결합제가 풀러렌에 공유 부착될 수 있다. 이어서, 항체가 가교결합제에 부착되고, 이는 차례로 스텐트에 부착된다. 도 1b는 C₆₀에 의한 결합을 도시한다. 내피 세포(2.01)는 세포 표면 항원(2.02)을 통해 항체(2.03)에 결합되고, 이는 차례로 매트릭스(2.04)에 공유 또는 비공유 결합된다. 매트릭스(2.04)는 C₆₀(2.05)를 통해 스텐트(2.06)에 공유 결합된다.

본 발명의 소형 분자는, 항체, 성장 인자 또는 이의 단편 대신에 사용할 수 있는 합성 또는 자연 발생 분자 또는 펩티드를 포함한다. 예를 들어, 렉틴은 자연발생되는 비-면역 유래의 당-결합 펩티드이다. 내피 세포 특이성 렉틴 항원(Ulex Europaeus Uea 1)(Schatz et al. 2000 Human Endometrial Endothelial Cells: Isolation, Characterization, and Inflammatory-Mediated Expression of Tissue Factor and Type 1 Plasminogen Activiator Inhibitor.Biol Reprod62:691-697)은 원시 내피 세포의 세포 표면에 선택적으로 결합할 수 있다.

합성 "소형 분자"는 다양한 세포 표면 수용체를 표적화하기 위해 만들어졌다. 이들 분자는 선택적으로 특정 수용체(들)에 결합하고, 원시 내피 세포와 같은 특정 세포 종류를 표적화할 수 있다. VEGF와 같은 내피 세포 표면 표지를 인식하기 위하여 소형 분자를 합성할 수 있다. SU11248(Sugen Inc.)(Mendel et al. 2003 In vivo antitumor activity of SU11248, a novel tyrosine kinase inhibitor targeting vascular endothelial growth factor and platelet-derived growthfactor receptors: determination of a pharmacokinetic/pharmacodynamic relationship.Clin Cancer Res.Jan;9(1):327-37), PTK787/ZK222584(Drevs J. et al. 2003. Receptor tyrosine kinases: the main targets for new anticancer therapy.Curr Drug Targets.Feb;4(2):113-21) 및 SU6668(Laird, AD et al. 2002 SU6668 inhibits Flk-1/KDR and PDGFRbeta in vivo, resulting in rapid apoptosis of tumor vasculature and tumor regression in mice. FASEB J. May;16(7):681-90)은 VEGFR-2와 결합하는 소형 분자이다.

내피 세포 표면을 표적화하는 합성 소형 분자의 다른 아집단은 알파(v)베타(3) 인테그린 저해제이다. SM256 및 SD983(Kerr JS. et al. 1999 Novel small molecule alpha v integrin antagonists: comparative anti-cancer efficacy with known angiogenesis inhibitors. Anticancer Res Mar-Apr; 19(2A):959-68)은 모두 내피 세포의 표면에 존재하는 알파(v)베타(3)을 표적화하여 결합하는 합성 분자이다.

본 발명은 이하의 실험에 대한 상세한 설명 부분에서 설명한다. 이하의 이러한 부분은 본 발명의 이해를 위한 것으로, 이에 제한되지 않으며, 이하의 특허청구범위에 기재된 본 발명을 어떤 방식으로 제한하고자 하는 것이 아니다.

실시예 1

내피 원시 세포 표현형 확인(Phenotyping)

내피 원시 세포(EPC)를 최근 알려진 바에 따라 CD34+ 자석 비드 분리(Dynal Biotech) 또는 강화 배지 분리(enriched medium isolation)를 통해서 분리하였다. (Asahara T, Murohara T, Sullivan A, et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science 1997; 275:964-7). 간략하게, 말초정맥 혈액을 건강한 남성 지원자로부터 얻어, 밀도 구배 원심분리로 모노클로날 세포 분획을 분리하고, 이 세포를 5% 우태아 혈청, 인간 VEGF-A, 인간 섬유아세포 성장 인자-2, 인간 상피 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자-1 및 아스코르브산이 보충된 EC 기본 배지-2(EBM-2)(Clonetics) 중에서 인간 피브로넥틴 코팅 배양 슬라이드 상에 도말하였다. EPCs는 배양 배지를 교환하면서 매 48시간마다 7일까지 성장시켰다. 이 실험의 수득물은 도 2a 및 2b에 도시한다. 도 2a 및 2b는, 항-CD34 분리된 세포가 축-형(spindle-like)에 가깝다는 것을 보여주며, 이는 세포가 내피 세포로 분화되고 있다는 것을 나타낸다.

EC 표현형을 면역조직화학으로 결정하였다. 요약하면, EPC를 포스페이트 완충 식염수(PBS)(Sigma) 중의 2% 파라포름알데하이드(PFA)(Sigma)에서 10분동안 고정시키고, PBS로 3회 세척하고, 다양한 EC 특이성 표지; 래빗 항-인간 VEGFR-2(Alpha Diagnostics Intl. Inc.), 마우스 항-인간 Tie-2(Clone Ab33, Upstate Biotechnology), 마우스 항-인간 CD34(Becton Dickinson), EC-렉틴(Ulex Europaeus Uea 1(Sigma) 및 마우스 항-인간 인자 8(Sigma)를 사용하여 염색하였다. 세포를 플루오레스세인 이소티오시아네이트-접합된(FITC) 이차 항체에 노출시켜 항체의 존재를 확인하였다. 프로피듐 요오드(PI)를 핵 표지로 사용하였다. 이들 실험결과는 도 2c-2g에 도시한다. 도 2c는, VEGFR-2가 배양액에서 24시간 후에 발현되어, 이 세포가 확실히 내피 세포라는 것을 보여준다. 도 2d 및 2f는 배양 7일후의 결합 세포의 핵 염색을 보여주고, 도 2e 및 2g는 항-Tie-2 항체로 염색된 동일 분야의 세포를 보여준다.

EC 기능을 보증하는 내피 질소 산화물 신타제(eNOS)를 발현하는 EPCs 능력을, eNOS mRNA에 대한 역 트랜스크립타제-폴리머라제 사슬 반응(rt-PCR)으로 확인하였다. EPCs를 EBM-2 배지에서 7일까지 성장시킨 후, GenElute 포유 동물 전체 RNA 키트(Sigma)를 사용하여 전체 RNA를 분리하고, 260nm에서의 흡광도로 정량화하였다. 전체 RNA를 무작위 프라이머 1㎍를 갖는 옴니스크립트(Omniscript) RT 키트(Qiagen)를 사용하여 20㎕ 부피로 역전사하였다. 각각의 RT 생성물에 대하여, 최종 반응 부피의 분취량(2-10㎕)을 eNOS(299 bp 생성물, 센스 5'-TTCCGGGGATTCTGGCAGGAG-3', 안티센스 5'-GCCATGGYAACATCGCCGCAG-3') 또는 GAPDH(343 bp 생성물, 센스 5'-CTCTAAGGCTGTGGGCAAGGTCAT-3', 안티센스 5'-GAGATCCACCACCCTGTTGCTGTA-3') 특이성 프라이머 및 Taq 폴리머라제(Pharmacia Biotech Amersham)를 사용하여 두 병행 PCR 반응으로 증폭하였다. PCR 주기는 다음과 같았다: 94℃로 5분, 65℃로 45초, 72℃로 30초(eNOS에 대해 35 주기 및 GAPDH에 대해 25 주기). rtPCR 생성물을 2% 아가로즈 겔 전기영동으로 분석하고, 에티듐 브로마이드를 사용하여 가시화하고, 밀도측정으로 정량화하였다. 이 실험의 결과를 도 3a 및 도 3b에 도시한다. 도 3a 및 3b에서 보여지는 바와 같이, 세포를 산소의 존재 또는 부재 하에 배양물 중에서 3일동안 배지 배양한 후, 질소 산화물 신태타제(eNOS)가 발현된다. 배양물 중에서 7일 후에 eNOS mRNA 발현이 계속 존재한다. eNOS mRNA가 존재한다는 것은, 세포가 3일 시점까지 성숙한 내피 세포로 분화되고, 완전히 분화된 내피 세포처럼 기능하기 시작했다는 것을 나타낸다.

실시예 2

항-CD34 코팅 스테인리스강 디스크에 의한 내피 세포의 포획:

인간 배꼽 정맥 내피 세포(HUVEC)(American Type Culture Collection)를 실험 기간동안 내피 세포 성장 배지 중에 성장시킨다. 세포를 CMDX, 및 이의 표면 상에 결합된 항체가 있거나 없는 젤라틴 코팅된 시료 또는 노출 스테인리스강(SST) 시료와 함께 배양한다. 배양 후, 성장 배지를 제거하고 시료를 PBS로 2회 세척한다. 세포를 2% 파라포름알데하이드(PFA) 중에 10분동안 고정하고, PBS 중에서 각 회당 10분간 3회 세척하여, 고정제가 모두 제거되도록 한다. 각 시료를 차단(blocking) 용액과 함께 30분간 실온에서 배양하여 모든 비-특이성 결합을 차단한다. 시료를 PBS로 1회 세척하고, VEGFR-2 항체 1:100 희석물에 노출시켜 밤새 배양한다. 이어서, 시료를 PBS로 3회 세척하여 모든 일차 항체가 제거되도록 한다. 차단 용액 중의 FITC-접합된 이차 항체를 1:100 희석하여 각 개별 시료에 첨가하고, 실온에서 45분동안 벨리 댄서 장치(Belly Dancer apparatus) 상에서 배양한다. 배양 후, 시료를 PBS 중에 3회, 0.1% Tween 20을 포함하는 PBS 를 사용하여 1회, 이어서 PBS 중에 다시 세척한다. 시료에 프로피듐 요오드(PI)를 넣고, 공초점 현미경을 사용하여 가시화한다.

도 4a-4e는 CMDX 및 항-CD34 항체 코팅 SST 시료(도 4a), 젤라틴 및 항-CD34 항체 코팅 SST 시료(도 4b), 노출 SST(도 4c), CMDX 코팅 및 항체 무첨가 SST 시료(도 4d) 및 젤라틴-코팅 및 항체 무첨가 SST 시료(도 4e)의 현미경사진이다. 도면은, 항체가 코팅된 시료만이 PI 염색으로 보여지는 것과 같이 시료의 표면에 부착된 세포를 다수 포함한다는 것을 보여준다. 노출 SST 대조 디스크에는, 이의 표면에 부착된 세포가 거의 보이지 않는다.

도 5a-5c는, 이의 표면에 결합된 항체가 없는 CMDX-코팅된 대조 시료의 현미경사진이다. 도 5a에는 시료의 표면에 부착된 PI 염색으로 보여지는 것과 같이 세포가 아주 적다. 도 5b는, 부착 세포가, 이들이 내피 세포라는 것을 나타내는 VEGFR-2 양성임을 보여주고, 도 5c는 염색된 핵과 VEGFR-2 양성 녹색 형광을 조합하여 보여준다. 도 5d-f는 이의 표면 상에 항체가 없는 젤라틴 코팅된 대조 시료의 현미경사진이다. 도 5d는, PI 염색이 시료에 존재하지 않고 시료에 의해 방사된 녹색 형광이 없으므로(도 5e 및 5f 참조) 세포가 존재하지 않는다는 것을 보여준다.

도 6a-6c는 이의 표면에 결합된 항-CD34 항체를 갖는 CMDX 코팅된 SST 시료의 현미경 사진이다. 도면은, 시료가, 핵 융합성 단층(도 6a)을 이루고, 녹색 형광으로 보여지는 바와 같이 VEGFR-2 양성(도 6b 및 6c)인 다수의 부착 세포를 포함한다는 것을 보여준다. 유사하게, 도 6d-6f는 이의 표면에 결합된 항-CD34 항체를 갖는 젤라틴-코팅된 시료의 현미경사진이다. 이들 도면은 또한, 다수의 적색-염색된 핵 및 VEGFR-2/FITC 항체로부터의 녹색 형광(도 6e 및 6f)으로 보여지는 바와 같이 HUVECs가 시료 표면에 부착되었다는 것을 보여준다.

실시예 3

원시 내피 세포의 VEGFR-2 및 Tie-2 염색:

실시예 1에 기재된 바와 같이 인간 혈액으로부터 원시 세포를 분리하고, 성장 배지에서 24시간, 7일 및 3주동안 시험관 내 배양한다. 배양 후, 성장 배지를제거하고, 시료를 PBS로 2회 세척한다. 세포를 2% 파라포름알데하이드(PFA) 중에 10분동안 고정하고, PBS 중에서 각 회당 10분간 3회 세척하여, 고정제가 모두 제거되도록 한다. 각 시료를 440㎕의 염소(VEGFR-2에 대해) 또는 말(Tie-2에 대해) 차단 용액과 함께 30분간 실온에서 배양하여 모든 비-특이적 결합을 차단한다. 시료를 PBS로 1회 세척하고, VEGFR-2 또는 Tie-2 항체를 차단액으로 1:100 희석하여 첨가하고, 시료를 밤새 배양한다. 이어서, 시료를 PBS로 3회 세척하여 모든 일차 항체가 세척되도록 한다. 말 또는 염소 차단 용액 중의 FITC-접합된 이차 항체(200㎕)를 1:100 희석하여 각 개별 시료에 첨가하고, 실온에서 45분동안 벨리 댄서 장치 상에서 배양한다. 배양 후, 시료를 PBS 중에 3회, 0.1% Tween 20을 포함하는 PBS 를 사용하여 1회, 이어서 PBS 중에 다시 세척한다. 시료에 프로피듐 요오드(PI)를 넣고, 공초점 현미경을 사용하여 가시화한다.

도 7은, 세포와 함께 24시간동안 배양된, 이의 표면 상에 CD34 항체를 포함하는 CMDX-코팅된 시료의 현미경 사진으로, 시료의 표면 상에 존재하는 적색-염색된 핵에 의해 증명되는 바와 같이, 원시 세포가 시료의 표면 상에 포획되었다는 것을 보여준다. 도면은 또한, 세포의 약 75%가 VEGFR-2 양성이며 둥근 형태라는 것을 보여준다.

도 8a 및 8b는 7일동안 세포와 함께 배양된 시료로부터 얻은 것이다. 도 8a에서, 적색-염색된 핵으로 보여지는 바와 같이 시료상에 세포가 존재하며, 이는 VEGRF-2 양성(도 8b, 100%)이고, 축 형의 세포로 보여지는 바와 같이 내피 구조에 가깝다. 도 9a 및 9b는 이의 표면 상에 CD34 항체를 포함하는 CMDX-코팅된 시료의현미경 사진으로, 이는 세포와 함께 7일동안 배양되었고, 배양 후 시료가 Tie-2 항체에 노출되었다. 도 9a에서, 적색-염색된 핵으로 보여지는 바와 같이, 시료의 표면에 다수의 세포가 부착되어 있다. 시료에 부착된 세포는 또한 세포로부터 방사된 녹색 형광(도 9b)으로 보여지는 바와 같이 Tie-2 양성(100%)이다. 요약하면, 시료와 함께 세포를 배양한 7일 후, 시료의 표면에 다수의 세포가 부착되어 있고, 부착된 세포의 표면 상에 VEGRF-2 및 Tie-2 수용체가 존재하는 것에 의해 보여지는 바와 같이, CD 34 항체-코팅된 시료는 이의 표면 상에 내피 세포를 포획할 수 있다. 또한, 7일 시점에 시료 표면 상에 내피 세포가 100% 존재한다는 것은, 비-내피 세포가 분리되었을 수 있거나, 또는 모든 부착 세포가 7일 시점까지 내피 세포 표지를 발현하기 시작했음을 나타낸다.

도 10a-10c는 내피 세포 성장 배지에서 3주동안 성장된 원시 내피 세포의 위상차 현미경 사진이다. 도 10a는, 화살표가 혈관의 내강을 나타내는 2차원 튜브-형 구조(화살표)에 의해 보여지는 바와 같이, 세포가 성숙한 내피 세포로 분화되었다는 것을 증명한다. 도 10b는 다층(즉 다른 층의 위에 한 층)으로의 세포의 3차원 성장(build-up)이 일어난다는 것을 보여주며, 이는 장기간동안 성장된 내피 세포가 다른 층의 위에 한 층의 층을 형성하기 시작한다는 보고내용을 확인시켜 준다. 도 10c는 도말 3주 후에 배양물 중에 성장하는 원시 세포를 보여주며, 이 도면은 이의 표면 상에 존재하는 CD34/FITC 항체의 녹색 형광에 의해 증명되는 바와 같이, 세포가 내피 세포라는 것을 확인시켜 준다.

상기 데이터는, 인간 혈액으로부터 분리된 백혈구가 CD34 양성 원시 세포를가지며, 이들 세포가 성숙한 내피 세포로 발달할 수 있고, 내피 세포 표면 항원(VEGFR-1 및 Tie-2)을 쉽게 발현한다는 것을 증명한다. 이 데이터는 또한, 원시 또는 줄기 세포 표면 항원에 대한 항체가, 본 발명의 코팅된 의료 장치 표면 상에 이들 세포를 포획하기 위하여 사용될 수 있다는 것을 보여준다.

실시예 4

코팅된 풀러렌 및 항-CD34 항체 및/또는 내피 세포 성장 인자(Ang-2, VEGF) 스테인리스강으로 코팅된 풀러렌

스테인리스강 스텐트 및 디스크를 다음의 방법을 사용하여 항체 및/또는 성장 인자(즉, VEGF 또는 Ang-2)를 부착시키기 위한 기능성 풀러렌층으로 유도체화한다:

1단계로, SST 스텐트 또는 디스크의 표면을 임의의 부동태화 오염물의 표면을 또한 세정하는 0.5M HCL로 활성화한다. 금속 시료를 활성화 조로부터 옮겨, 증류수로 헹구고, 메탄올로 건조시키고, 75℃에서 오븐 건조한다. 이어서, 스텐트를 풀러렌 산화물(C₆₀-O)을 포함하는 톨루엔 유도체 용액 중에 24시간동안 침지시킨다. 풀러렌 산화물을 스텐트 상에서 발견된 Fe-O, Cr-O 및 Ni-O를 통해 스텐트에 결합시킨다. 스텐트를 유도체화 조로부터 옮기고, 톨루엔으로 세정하고, 임의의 물리흡착된(physisorbed) C₆₀을 제거하기 위해 새 톨루엔을 사용하여 16시간동안 속슬렛 추출기(Soxhlet Extractor)에 위치시킨다. 스텐트를 제거하고 105℃에서 밤새 오븐-건조한다. 이 반응을 통해 단층 풀러렌을 갖는, 완전히 유도체화된 스텐트 또는 디스크를 얻는다.

2단계로, 세바신산을 티오닐 클로라이드 또는 설퍼 옥시클로라이드(SOCl₂)와 반응시켜 세바코실 클로라이드를 형성함으로써, 용액 중에 디-알데하이드 분자를 형성한다. 얻어진 세바코실 클로라이드를 LiA[t-OButyl]₃H 및 디글림과 반응시켜 1,10-데칸디올을 다음과 같이 얻는다:

3단계로, N-메틸 피롤리딘 유도체를 (1단계로부터의) 스텐트 또는 디스크의 표면 상에 형성시킨다. 등몰량의 풀러렌 및 N-메틸글리신을 질소 하에 환류 톨루엔 용액 중에서 48시간동안 2단계 반응의 1,10-데칸디올 생성물과 반응시켜 N-메틸 피롤리딘-유도체화된 톨루엔-스테인리스강 스텐트 또는 디스크를 얻음으로써, 다음과 같이 풀러렌 분자를 더 유도체화한다.

유도체화된 스테인리스강 스텐트 또는 디스크를 세척하여 임의의 화학적 잔류물을 제거하고, 표준 방법으로 항체 및/또는 (VEGF 또는 Ang-2)를 결합시키기 위해 사용한다. 원시 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 인간 혈액으로부터 분리하고, 항-CD34 항체 코팅된 풀러렌 디스크에 노출시킨다. 배양 후, 성장 배지를 제거하고, 시료를 PBS로 2회 세척한다. 세포를 2% 파라포름알데하이드(PFA) 중에 10분동안 고정하고, 각 회당 10분씩 3회 PBS 중에 세척하여 고정제가 모두 제거되도록 한다. 각 시료를 차단 용액을 사용하여 30분간 실온에서 배양하여, 모든 비-특이성 결합을 차단한다. 시료를 PBS로 1회 세척하고, VEGFR-2 항체의 1:100 희석물에 노출하고 밤새 배양한다. 이어서, 시료를 PBS로 3회 세척하여 일차 항체가 모두 제거되도록 한다. 차단용액 중의 FITC-접합된 2차 항체를 1:100 희석하여 각 개별 시료에 첨가하고, 45분동안 실온에서 밸리 댄서 장치 상에 배양한다. 배양 후, 시료를 PBS 중에 3회, 0.1% Tween 20을 포함하는 PBS 중에 1회, 이어서 PBS 중에 다시 세척한다. 시료에 프로피듐 요오드(PI)를 넣고 공초점 현미경을 사용하여 가시화한다. 도 11은 원시 세포와 결합한, 본 발명의 기능성 풀러렌 코팅된 스텐트 표면의 개략도를 도시한다. 도 12a-12b는 각각 PI로 염색된 항체(도 12a) 및 염색된 항-VEGFR-2/FITC-접합된 항체가 없는 풀러렌-코팅된 대조 시료의 현미경사진이다. 도 12c 및 12d는 풀러렌/항-CD34 항체 코팅으로 코팅된 시료의 현미경 사진이다. 도면에서 보여지는 바와 같이, 항-CD34 항체 코팅된 시료는 VEGFR-2 양성인 표면에 부착된 세포를 더 많이 포함한다.

항체가 있거나 없는 풀러렌-코팅된 시료를 실시예 5에 기재된 바와 같이 요크셔 돼지에 이식한다. 스텐트는 조직학을 위해 외식하고, 스텐트된 분절은 10% 완충 포르말린을 사용하여 30초동안 씻어낸 후, 10% 완충 포르말린을 사용하여 처리시까지 고정한다. 각 스텐트로부터 다섯 부분을 절단한다; 스텐트 근위 1mm, 스텐트의 근위 말단으로부터 1mm, 스텐트 중심, 스텐트의 원위 가장자리로부터 1mm 및 스텐트 원위 1mm. 헤마톡실린 & 에오신(Eosin)(HE) 및 엘라스틴 트리크롬으로 부분들을 염색한다. 도 13a-13d는 4주간 외식된 스텐트의 관상 동맥 외식편 단면의 현미경 사진이다. 데이터는, 풀러렌 코팅된(도 13b 및 13d) 스텐트가 대조구(노출 스텐트, 13a 및 13c) 상의 스텐트 부위에서 과도한 내막 과형성을 저해한다는 것을 보여준다.

실시예 5

돼지 벌룬 손상 연구 :체중 25 내지 30kg의 젊은 요크셔 돼지로 항체-도포된 스텐트의 이식을 실시한다. 문헌("Guide for the Care and Use of Laboratory Animals") (NIH publication No. 80-23, revised 1985) 대로 돼지를 관리한다. 밤새 절식 후, 돼지를 케타민 하이드로클로라이드(20mg/kg)로 안정시킨다. 티오펜탈(12mg/kg)으로 마취를 유도한 후, 돼지에 관을 삽입하고 산소 및 질소 산화물의 혼합물(1:2[vol/vol])을 투여하는 환기장치(ventilator)에 연결한다. 0.5-2.5 vol% 이소플루란으로 마취를 유지한다. 프로카인 페니실린-G 및 벤자틴 페니실린-G(스트렙토마이신)의 혼합물 1,000mg을 근육내 주입하여 항생물질 예방을 제공한다.

살균 조건 하에서, 좌측 경동맥을 동맥 절개하고, 8F-유도자 시스(8F-introducer sheath)를 좌측 경동맥에 위치시킨다. 모든 돼지에게 체중 1 kg당100IU의 헤파린을 투여한다. 추가적인 2,500IU의 헤파린 환괴를, 활성화된 응고 시간을 300초 이상으로 유지하기 위한 방법을 통해 주기적으로 투여한다. 6F 가이딩(guiding) 카테터를 경동맥 시스를 통해 도입하고, 관상동맥의 소공(ostia)을 통과시킨다. 200㎍의 내부 관상 니트로 글리세린(intra coronary nitroglycerin)을 투여한 후 혈관조영법을 실시하고, 정량 관상 혈관조영법 시스템을 사용하여 이미지를 분석한다. 3F-색전적출 카테터를 관상 동맥의 근위 부분에 삽입하고, 스텐트 이식을 위해 선택된 분절 원위에 통과시키고, 내피를 노출시킨다. 항-CD34 항체를 넣은 코팅된 R 스텐트를 가이딩 카테터를 통해 삽입하고, 관상 동맥의 노출 분절에 배치한다. 노출 스테인리스강 스텐트 또는 항체가 없는 매트릭스로 코팅된 스텐트를 대조구로 사용한다. 스텐트를, 좌측 전방 하향(Left Anterior Descending)(LAD) 관상 동맥 또는 우측 관상 동맥(RCA) 또는 궁상만곡(circumflex) 관상 동맥(Cx)에, 동맥에 대한 스텐트 할당량 1.1로 이식한다. 스텐트의 사이징(sizing) 및 배치를 혈관조영법으로 평가하고, 유도자 시스를 제거하고, 피부를 두 층으로 폐쇄한다. 돼지를 실험 기간동안 300mg의 ASA 상에 위치시킨다.

스텐트를 이식한 1, 3, 7, 14 및 28일 후에 돼지를 치사시킨다. 돼지를 우선 안정시키고, 상기된 바와 같이 마취한다. 스텐트된 관상동맥을, 스텐트의 근위 및 원위의 비-스텐트된 혈관 1cm와 함께 외식한다. 스텐트된 동맥을, 조직학, 면역조직화학 또는 주사 전자 현미경 검사의 세가지 방법으로 처리한다.

면역조직화학에 대해서는, 절개된 스텐트를 10% 포르말린을 사용하여 30초동안 천천히 씻어내리고, 처리시까지 10% 포르말린/PBS 용액에 위치시킨다. 면역조직화학용 스텐트는 PBS 중의 2% 파라포름알데하이드(PFA)를 사용하여 30초동안 씻어내린 후, 2% PFA 용액 중에 15분간 위치시키고, 세척하고, 래빗 항-인간 BEGFR-2 또는 마우스 항-인간 Tie-2 항체를 사용한 면역조직화학을 수행할 때까지 PBS 중에 저장한다.

10% 완충 포르말린으로 30초동안 씻어내린 후 0.1M 나트륨 카코딜레이트 완충물 중의 2.5% 글루타르알데하이드를 포함하는 2% PFA를 사용하여 밤새 고정함으로써 SEM을 위한 스텐트를 제조한다. 이어서, 시료를 카코딜레이트 완충물을 사용하여 3회 세척하고, 세척하기 위해 밤새 방치한다. 0.1M 카코딜레이트 완충물 중의 1% 오스뮴 테트록사이드(Sigma)를 사용하여 후-고정을 완료한 후, 에탄올(30% 에탄올, 50%, 70%, 85%, 95%, 100%, 100%)을 사용한 탈수하고, 이어서 CO₂를 사용하여 임계점 건조를 실시한다. 건조 후, 시료를 골드 스퍼터링하고(gold sputtered), SEM 하에 가시화한다.(Reduction in thrombotic events with heparin-coated Palmaz-Schatz stents in normal porcine coronary arteries,Circulation93:423-430, 본 명세서에 참조 병합됨).

조직학을 위해, 스텐트된 분절을 10% 완충 포르말린을 사용하여 30초동안 씻어내린 후, 처리시까지 10% 완충 포르말린으로 고정한다. 각 스텐트로부터 다섯 부분을 절단한다; 스텐트 근위 1mm, 스텐트의 근위 말단으로부터 1mm, 스텐트 중심, 스텐트의 원위 가장자리로부터 1mm 및 스텐트 원위 1mm. 헤마톡실린 & 에오신(HE) 및 엘라스틴 트리크롬으로 부분들을 염색한다.

도 14a-14g는, 주사 전자 현미경 하에서 관찰된, 이식 1시간(도 14a 및 14b) 및 48시간(도 14c-14g) 후의 외식편을 도시한다. 현미경 사진은, 48시간에 고배율(400×)에서의 축-형 세포 형태에 의해 알 수 있는 바와 같이, 덱스트란/항-CD34 항체-코팅된 스텐트(14b, 14e-g)는 덱스트란 코팅된 대조구(14a, 14c 및 14d)와 비교할 때 포획 원시 내피 세포를 갖는다는 것을 명백하게 보여준다.

돼지 관상 동맥으로부터의 외식편의 단면은 또한, 덱스트란-항-CD34 항체-코팅된(14l, 14m) 것은 대조구(노출 스테인리스강 14h 및 14i; 덱스트란-코팅된 14j 및 14k)에 비해 내막 과형성(동맥 평활근층의 두께)을 현저하게 저해하였다는 것을 보여주었다. 풀러렌-코팅된 스텐트 이식편은 또한 도 13b-13d에 보여지는 바와 같이 노출 대조 스테인리스강 스텐트보다 내막 과형성을 보다 잘 저해한다.

도 15a 및 15b는 각각, 표면 상에 항체가 없는 덱스트란-혈장 코팅된 스텐트, 및 길이 18mm의 덱스트란-혈장 코팅된 항-CD34 항체-스텐트의 48시간 외식편의 공초점 현미경 사진을 도시한다. 스텐트는 젊은 웅성 요크셔 돼지의 관상 동맥에 이식되었다. 외식편은 면역조직화학적으로 처리되어 VEGFR-2에 대해 염색된 후, FITC-접합된 이차 항체 처리되고, 공초점 현미경을 사용하여 연구되었다. 도 15b 및 15c는, 항체가 없는 스텐트(도 15a) 상에서는 내피가 완전히 결핍되는 것과 비교하여, 부분의 녹색 형광에 의해 증명되는 바와 같이, 항체 염색 스텐트가 내피 세포로 도포된다는 것을 보여준다.

실시예 6

스텐트에 적용된, 고정된 항체 매트릭스로의 내피 성장 인자의 투입:

이후에, 순환 내피 원시 세포의 부착, 및 혈액과 접촉하는 경우에 이의 기능성 내피로의 성숙을 촉진하기 위하여, 내피 원시 세포 세포 표면 항원에 대한 항체를, 내피 성장 인자가 흡수되는 혈관내 스텐트에 적용되어 있는 생체적합성 매트릭스에 고정하는 단계를 다음에 설명한다.

매트릭스 침착: 스텐트 표면 상에 아민 기능성을 도입하기 위하여, 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 스테인리스강 스텐트를 혈장 침착물로 처리한다. 수용성 카르보디이미드 결합 화학으로 알려진 표준 방법을 사용하여, 혈장 침착된 층 상의 아민기가 혈장층 및 기능성 CDMX 간에 아미드 결합을 형성하는 수성 조건 하에서, CMDX 카르복실기를 활성화시킴으로써, 카르복시 기능성 덱스트란(CMDX) 층은 스텐트 상에 침착된 아민 기능성 층에 결합될 것이다.

항체 고정: 내피 원시 세포 세포 표면 항원에 대한 항체, 즉, 쥐의 모노클로날 항-인간 CD34는, 완충 산성 용액 중에서 수성 수용성 카르보디이미드 화학으로 배양함으로써 CDMX 코팅된 스텐트와 공유 결합될 것이다.

성장 인자의 흡수: 스텐트에 적용된 CDMX 매트릭스에 모노클로날 항-인간CD34를 고정한 후, 성장 인자가 CMDX 매트릭스에 흡수되는 적당한 농도의, 예를 들어 안지오포이에틴-2와 같은 내피 성장 인자 수용액 중에서 장치를 배양한다. 처리된 장치는 생리학적 완충 식염수 용액 중에 헹구고, 나트륨 아지드 보존액 중에 저장한다.

표준 혈관조영법 기술을 사용하면, 돼지의 관상 동맥 중에 이식 및 인간 혈액에 노출시에 상기 장치는, 순환 내피 원시 세포의 처리된 스텐트 표면 위로의 흡수 및 부착을 개선하고, 이의 기능성 내피로의 성숙을 가속화한다. 기능성 내피가 신속하게 확립되면, 장치 혈전형성성이 감소되고 내막 과형성 정도가 조절될 것으로 기대된다.

실시예 7

스텐트 상의 내피 성장 인자 및 항체의 고정:

순환 내피 원시 세포의 부착 및 혈액과 접촉하는 경우에 이의 기능성 내피로의 성숙을 증진시키기 위하여, 내피 원시 세포 세포 표면 항원에 대한 항체 및 내피 성장 인자를, 혈관내 스텐트에 적용된 생체적합성 매트릭스에 고정하는 단계를 이하에 기재한다.

매트릭스 침착: 매트릭스 침착: 스텐트 표면 상에 아민 기능성을 도입하기 위하여, 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 스테인리스강 스텐트를 혈장 침착물로 처리한다. 수용성 카르보디이미드 커플링 화학으로 알려진 표준 방법을 사용하여, 혈장 침착된 층 상의 아민기가 혈장층 및 기능성 CDMX 간에 아미드 결합을 형성하는 수성 조건 하에서, CMDX 카르복실기를 활성화시킴으로써, 카르복시 기능성 덱스트란(CMDX) 층은 스텐트 상에 침착된 아민 기능성 층에 결합된다.

항체 및 성장 인자 고정: 내피 원시 세포 세포 표면 항원에 대한 항체, 즉, 쥐의 모노클로날 항-인간 CD34, 및 예를 들어 안지오포이에틴-2와 같은 내피 성장 인자는, 산성 조건 하에서 수성 수용성 카르보디이미드 용액 중에 등몰 농도로 배양함으로써 CDMX 코팅된 스텐트와 공유 결합된다. 처리된 장치를 생리학적 완충 식염수 용액으로 헹구고, 나트륨 아지드 보존액 중에 저장한다.

실시예 8

스텐트의 소형 분자 기능화:

원시 내피 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 분리하였다. 세포를 피브로넥틴-코팅된 슬라이드에 도말하고, EBM-2 배양 배지에서 7일동안 성장시켰다. 세포를 고정하고, 프로피듐 요오드(PI) 및 FITC-접합된 내피 세포 특이성 렉틴을 사용하여 염색하였다. (Ulex Europaeus Uea 1) 이 실험 결과를 도 16a 및 16b에 도시한다. 도면은, 원시 내피 세포가 피브로넥틴-코팅된 슬라이드에 결합되고, 세포가 이의 표면 상에 렉틴에 대한 리간드를 발현한다는 것을 보여준다.

Claims

(a) 코팅, (b) 치료적 유효량의 한 종 이상의 항체, 항체 단편 또는 이의 조합물, 및 (c) 하나 이상의 화합물을 포함하여 이루어지고;

상기 코팅은 한층 이상의 생체적합성 매트릭스를 포함하여 이루어지고;

상기 한종 이상의 항체 또는 항체 단편은 원시 내피 세포 표면 상의 항원에 대한 것이고;

상기 하나 이상의 화합물은 원시 내피 세포를 자극하여 의료 장치의 표면 상에 내피를 형성하는 것을 특징으로 하는 의료 장치.
제 1항에 있어서,

상기 의료 장치는 스텐트, 스텐트 이식편, 합성 혈관 이식편, 심장 밸브, 카테터, 혈관 인공삽입 필터, 페이스메이커, 페이스메이커 리드, 세동제거기, 개방 난원공 격벽 폐쇄 장치, 혈관 클립, 혈관 동맥류 폐색기(vascular aneurysm occluder), 혈액투석 이식편, 혈액투석 카테터, 방실계의 션트, 대동맥 동맥류 이식편 장치, 정맥 밸브, 봉합재, 혈관 문합 클립, 내재성 정맥 카테터, 내재성 동맥 카테터, 혈관 시스 및 약물 전달 포트로 구성되는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 의료 장치.
제 2항에 있어서,

상기 의료 장치는 스텐트인 것을 특징으로 하는 의료 장치.
제 3항에 있어서,

상기 스텐트는 스테인리스강, NiTi, MP35N 및 크롬 합금으로 구성되는 그룹에서 선택되는 물질을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 의료 장치.
제 2항 또는 제 3항에 있어서,

가교결합된 PVA 하이드로겔, ePTFE, PTFE, 다공성 HDPE, 폴리우레탄, 및 폴리에틸렌 테레프탈레이트로 구성되는 그룹에서 선택되는 피복물(jacket), 덮개(covering) 또는 캡슐화물(encapsulation)을 더 포함하여 이루어지는 스텐트.
제 2항에 있어서,

상기 합성 혈관 이식편은 가교결합된 폴리비닐 알콜, ePTFE, PTFE, 다공성 HDPE, 폴리우레탄, 및 폴리에틸렌 테레프탈레이트로 구성되는 그룹에서 선택되는 물질을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 의료 장치.
제 1항에 있어서,

상기 생체적합성 매트릭스는, 폴리우레탄, 분절화된 폴리우레탄-우레아/헤파린, 폴리-L-락트산, 셀룰로오스 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 아세테이트, 덱스트란 및 젤라틴으로 구성되는 그룹에서 선택되는 합성 물질을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 의료 장치.
제 1항에 있어서,

상기 생체적합성 매트릭스는, 콜라겐, 엘라스틴, 라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 헤파린, 피브린, 셀룰로오스 및 비정질 탄소로 구성되는 그룹에서 선택되는 자연-발생 물질을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 의료 장치.
제 1항에 있어서,

상기 생체적합성 매트릭스는 탄소수 약 C₂₀내지 약 C₁₅₀범위의 풀러렌을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 의료 장치.
제 9항에 있어서,

상기 풀러렌은 C₆₀또는 C₇₀인 것을 특징으로 하는 의료 장치.
제 1항에 있어서,

상기 하나 이상의 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메라 항체 및 인간화된 항체로 구성되는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 의료 장치.
제 1항에 있어서,

상기 하나 이상의 항체 또는 항체 단편은 의료 장치의 생체적합성 매트릭스 코팅의 최외층에 공유 또는 비공유 부착되거나, 또는 링커 분자에 의해 공유 속박되는 것을 특징으로 하는 의료 장치.
제 1항에 있어서,

상기 하나 이상의 항체 또는 항체 단편은 인간 원시 내피 세포에 특이적인 것을 특징으로 하는 의료 장치.
제 1항에 있어서,

상기 하나 이상의 항체 또는 단편은 CD133, CD34, CDw90, CD117, HLA-DR, VEGFR-1, VEGFR-2, Muc-18(CD146), CD130, 줄기 세포 항원(Sca-1), 줄기 세포 인자 1(SCF/c-Kit 리간드), Tie-2 및 HAD-DR로 구성되는 그룹에서 선택되는 원시 내피 세포 표면 항원에 대한 것임을 특징으로 하는 의료 장치.
제 1항 또는 제 11항에 있어서,

상기 하나 이상의 항체가 Fab 또는 F(ab')₂단편을 포함하여 이루어지는 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 의료 장치.
제 1항에 있어서,

상기 항체 단편이 합성 또는 자연 유래의 소형 분자를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 의료 장치.
제 1항에 있어서,

상기 하나 이상의 화합물은, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 섬유아세포 성장인자(FGF)-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF9, 염기성 섬유아세포 성장 인자, 혈소판-유도된 성장인자, 형질전환 성장인자 베타 1, 산성 섬유아세포 성장인자, 오스테오넥틴, 안지오포이에틴 1, 안지오포이에틴 2, 인슐린-유사 성장 인자, 과립구-마크로파지 콜로니-자극 인자, 혈소판-유래 성장인자 AA, 혈소판-유래 성장인자 BB, 혈소판-유래 성장인자 AB, 내피 PAS 단백질 1, 트롬보스폰딘, 프롤리페린, 에프린-A1(Ephrin-A1), E-셀렉틴, 렙틴, 헤파린, 인터류킨 8, 티록신, 및 스핑고신 1-포스페이트로 구성되는 그룹에서 선택되는 성장 인자인 것을 특징으로 하는 의료 장치.
제 17항에 있어서,

상기 성장 인자가 VEGF계 또는 안지오포이에틴계에 속하는 것을 특징으로 하는 의료 장치.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 생체적합성 매트릭스가 덱스트란을 포함하여 이루어지고, 상기 한종 이상의 항체가 CD34 세포 표면 항원에 결합하는 모노클로날 항체이고, 상기 하나 이상의 화합물이 VEGF 또는 Ang-2인 것을 특징으로 하는 의료 장치.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 생체적합성 매트릭스가 덱스트란을 포함하여 이루어지고, 상기 한종 이상의 항체가 CD133 세포 표면 항원에 결합하는 모노클로날 항체이고, 상기 하나 이상의 화합물이 VEGF 또는 Ang-2인 것을 특징으로 하는 의료 장치.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 생체적합성 매트릭스가 젤라틴을 포함하여 이루어지고, 상기 한종 이상의 항체가 CD34 또는 CD133 세포 표면 항원에 결합하는 모노클로날 항체이고, 상기 하나 이상의 성장 인자가 VEGF 또는 Ang-2인 것을 특징으로 하는 의료 장치.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 생체적합성 매트릭스가 젤라틴 또는 덱스트란을 포함하여 이루어지고, 상기 한종 이상의 항체가 Tie-2 세포 표면 항원에 결합하는 모노클로날 항체이고, 상기 하나 이상의 성장 인자가 VEGF 또는 Ang-2인 것을 특징으로 하는 의료 장치.
제 1항에 있어서,

상기 생체적합성 매트릭스가 풀러렌을 포함하여 이루어지고, 상기 한종 이상의 항체가 Tie-2 세포 표면 항원에 결합하는 모노클로날 항체이고, 상기 하나 이상의 성장 인자가 VEGF 또는 Ang-2인 것을 특징으로 하는 의료 장치.
제 15항에 있어서,

상기 한종 이상의 항체가 링커 분자에 의해 의료 장치를 코팅하는 생체적합성 매트릭스의 최외층의 표면에 공유 속박되는 것을 특징으로 하는 의료 장치.
제 1항에 있어서,

상기 원시 내피 세포는 인간 세포인 것을 특징으로 하는 의료 장치.
제 14항 또는 제 18항에 있어서,

상기 한 종 이상의 항체가 Fab 또는 F(ab')₂단편을 포함하여 이루어지는 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 의료 장치.
(a) 생체적합성 매트릭스, (b) 치료적 유효량의 한종 이상의 항체, 항체 단편 또는 이의 조합물, 및 (c) 원시 내피 세포를 자극하여 의료 장치의 표면 상에 내피를 형성하기 위한 치료적 유효량의 하나 이상의 화합물을 포함하여 이루어지는, 의료 장치의 코팅용 조성물.
제 27항에 있어서,

상기 의료 장치는 스텐트, 스텐트 이식편, 합성 혈관 이식편, 심장 밸브, 카테터, 혈관 인공삽입 필터, 페이스메이커, 페이스메이커 리드, 세동제거기, PFO 격벽 폐쇄 장치, 혈관 클립, 혈관 동맥류 폐색기, 혈액투석 이식편, 혈액투석 카테터, 방실계의 션트, 대동맥 동맥류 이식편 장치, 정맥 밸브, 봉합재, 혈관 문합 클립, 내재성 정맥 카테터, 내재성 동맥 카테터, 혈관 시스 및 약물 전달 포트로 구성되는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 27항에 있어서,

상기 생체적합성 매트릭스는, 폴리우레탄, 분절화된 폴리우레탄-우레아/헤파린, 폴리-L-락트산, 셀룰로오스 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 아세테이트, 덱스트란 및 젤라틴으로 구성되는 그룹에서 선택되는 합성 물질을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 27항에 있어서,

상기 생체적합성 매트릭스는, 콜라겐, 엘라스틴, 라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 헤파린, 피브린, 셀룰로오스, 및 비정질 탄소로 구성되는 그룹에서 선택되는 자연-발생 물질을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 27항에 있어서,

상기 생체적합성 매트릭스는 약 C₂₀내지 약 C₁₅₀범위의 풀러렌을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 27항에 있어서,

상기 하나 이상의 항체 또는 항체 단편은 CD133, CD34, CDw90, CD117, HLA-DR, VEGFR-1, VEGFR-2, Muc-18(CD146), CD130, 줄기 세포 항원(Sca-1), 줄기 세포 인자 1(SCF/c-Kit 리간드), Tie-2 및 HAD-DR로 구성되는 그룹에서 선택되는 원시 내피 세포 표면 항원을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 27항에 있어서,

상기 하나 이상의 항체는 폴리클로날, 키메라, 인간화 및 모노클로날 항체로 구성되는 그룹에서 선택되고, 상기 모노클로날 항체는 Fab 또는 F(ab')₂단편을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 27항에 있어서,

상기 하나 이상의 화합물은, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 섬유아세포 성장인자(FGF)-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF9, 염기성 섬유아세포 성장 인자, 혈소판-유도된 성장인자, 형질전환 성장인자 베타 1, 산성 섬유아세포 성장인자, 오스테오넥틴, 안지오포이에틴 1, 안지오포이에틴 2, 인슐린-유사 성장 인자,과립구-마크로파지 콜로니-자극 인자, 혈소판-유래 성장인자 AA, 혈소판-유래 성장인자 BB, 혈소판-유래 성장인자 AB, 내피 PAS 단백질 1, 트롬보스폰딘, 프롤리페린, 에프린-A1(Ephrin-A1), E-셀렉틴, 렙틴, 헤파린, 인터류킨 8, 티록신, 및 스핑고신 1-포스페이트로 구성되는 그룹에서 선택되는 성장 인자인 것을 특징으로 하는 조성물.
a. 폴리우레탄, 분절화된 폴리우레탄-우레아/헤파린, 폴리-L-락트산, 셀룰로오스 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 아세테이트, 덱스트란, 젤라틴, 콜라겐, 엘라스틴,라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 헤파린, 피브린, 셀룰로오스 및 탄소 및 풀러렌으로 구성되는 그룹에서 선택되는 하나 이상의 성분을 포함하여 이루어지는 한층 이상의 생체적합성 매트릭스를 의료 장치의 표면에 적용하는 단계, 및

b. 생체적합성 매트릭스에 동시 또는 순차적으로, 치료적 유효량의 한 종 이상의 항체, 항체 단편 또는 이의 조합물, 및 내피 세포 성장 및 분화를 자극하는 하나 이상의 화합물을 적용하는 단계를 포함하여 이루어지는 의료 장치의 코팅 방법.
제 35항에 있어서,

상기 의료 장치는 스텐트, 스텐트 이식편, 합성 혈관 이식편, 심장 밸브, 카테터, 혈관 인공삽입 필터, 페이스메이커, 페이스메이커 리드, 세동제거기, 개방 난원공 격벽 폐쇄 장치, 혈관 클립, 혈관 동맥류 폐색기, 혈액투석 이식편, 혈액투석 카테터, 방실계의 션트, 대동맥 동맥류 이식편 장치, 정맥 밸브, 봉합재, 혈관 문합 클립, 내재성 정맥 카테터, 내재성 동맥 카테터, 혈관 시스 및 약물 전달 포트를 포함하여 이루어지는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 35항에 있어서,

상기 하나 이상의 항체가 의료 장치를 코팅하는 생체적합성 매트릭스 상에 공유 또는 비공유 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 35항에 있어서,

상기 풀러렌이 C₆₀또는 C₇₀인 것을 특징으로 하는 방법.
제 35항에 있어서,

상기 하나 이상의 항체 또는 항체 단편은 CD133, CD34, CDw90, CD117, HLA-DR, VEGFR-1, VEGFR-2, Muc-18(CD146), CD130, 줄기 세포 항원(Sca-1), 줄기 세포 인자 1(SCF/c-Kit 리간드), Tie-2 및 HAD-DR로 구성되는 그룹에서 선택되는 원시 내피 세포 표면 항원에 대한 것임을 특징으로 하는 방법.
제 39항에 있어서,

상기 하나 이상의 항체가 모노클로날 항체이고, 항체의 대형 또는 소형 분자를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 35항에 있어서,

상기 하나 이상의 화합물은, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 섬유아세포 성장인자(FGF)-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF9, 염기성 섬유아세포 성장 인자, 혈소판-유도된 성장인자, 형질전환 성장인자 베타 1, 산성 섬유아세포 성장인자, 오스테오넥틴, 안지오포이에틴 1, 안지오포이에틴 2, 인슐린-유사 성장 인자, 과립구-마크로파지 콜로니-자극 인자, 혈소판-유래 성장인자 AA, 혈소판-유래 성장인자 BB, 혈소판-유래 성장인자 AB, 내피 PAS 단백질 1, 트롬보스폰딘, 프롤리페린, 에프린-A1(Ephrin-A1), E-셀렉틴, 렙틴, 헤파린, 인터류킨 8, 티록신, 및 스핑고신 1-포스페이트로 구성되는 그룹에서 선택되는 성장 인자인 것을 특징으로 하는 방법.
포유 동물의 혈관 또는 관상 장기에 의료 장치를 이식하는 것을 포함하여 이루어지고,

상기 의료장치는 (a) 생체적합성 매트릭스, (b) 치료적 유효량의 한종 이상의 항체, 항체 단편 또는 이의 조합물, 및 (c) 하나 이상의 화합물로 코팅되어 있고; 상기 항체 또는 항체 단편은 원시 내피 세포 표면 상의 항원을 인식 및 결합하여 원시 내피 세포를 매트릭스의 표면 상에 고정시키고, 상기 화합물은 고정된 원시 내피 세포를 자극하여 의료 장치의 표면 상에 내피를 형성하기 위한 것임을 특징으로 하는, 포유 동물의 혈관 질환의 치료 방법.
제 42항에 있어서,

상기 의료 장치는 스텐트, 스텐트 이식편, 합성 혈관 이식편, 심장 밸브, 카테터, 혈관 인공삽입 필터, 페이스메이커, 페이스메이커 리드, 세동제거기, 개방 난원공 격벽 폐쇄 장치, 혈관 클립, 혈관 동맥류 폐색기, 혈액투석 이식편, 혈액투석 카테터, 방실계의 션트, 대동맥 동맥류 이식편 장치, 정맥 밸브, 봉합재, 혈관 문합 클립, 내재성 정맥 카테터, 내재성 동맥 카테터, 혈관 시스 및 약물 전달 포트를 포함하여 이루어지는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 42항에 있어서,

상기 생체적합성 매트릭스는, 폴리우레탄, 분절화된 폴리우레탄-우레아/헤파린, 폴리-L-락트산, 셀룰로오스 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 아세테이트, 덱스트란, 젤라틴, 콜라겐, 엘라스틴,라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 헤파린, 피브린, 셀룰로오스, 비정질 탄소 및 풀러렌으로 구성되는 그룹에서 선택되는 하나 이상의 성분을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 44항에 있어서,

상기 풀러렌이 C₆₀또는 C₇₀인 것을 특징으로 하는 방법.
제 44항에 있어서,

상기 하나 이상의 항체 또는 항체 단편은 CD133, CD34, CDw90, CD117, HLA-DR, VEGFR-1, VEGFR-2, Muc-18(CD146), CD130, 줄기 세포 항원(Sca-1), 줄기 세포 인자 1(SCF/c-Kit 리간드), Tie-2 및 HAD-DR로 구성되는 그룹에서 선택된 원시 내피 세포 표면 항원에 대한 것임을 특징으로 하는 방법.
제 46항에 있어서,

상기 하나 이상의 항체는 모노클로날, 폴리클로날, 키메라 및 인간화 항체로 구성되는 그룹에서 선택되고, 상기 모노클로날 항체는 항체의 대형 또는 소형 분자를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 44항에 있어서,

상기 하나 이상의 화합물은, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 섬유아세포 성장인자(FGF)-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF9, 염기성 섬유아세포 성장 인자, 혈소판-유도된 성장인자, 형질전환 성장인자 베타 1, 산성 섬유아세포 성장인자, 오스테오넥틴, 안지오포이에틴 1, 안지오포이에틴 2, 인슐린-유사 성장 인자, 과립구-마크로파지 콜로니-자극 인자, 혈소판-유래 성장인자 AA, 혈소판-유래 성장인자 BB, 혈소판-유래 성장인자 AB, 내피 PAS 단백질 1, 트롬보스폰딘, 프롤리페린, 에프린-A1, E-셀렉틴, 렙틴, 헤파린, 인터류킨 8, 티록신, 및 스핑고신 1-포스페이트로 구성되는 그룹에서 선택되는 성장 인자인 것을 특징으로 하는 방법.
제 44항에 있어서,

상기 혈관 질환은 아테롬성 동맥경화증, 재발협착증, 혈전증, 혈관 및 관상 장기의 폐색으로 구성되는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 생체적합성 매트릭스는 C₆₀또는 C₇₀풀러렌을 포함하여 이루어지고, 상기 하나 이상의 항체 또는 항체 단편은 원시 세포 표면 항원 CD34 또는 CD133을 인식 및 결합하고, 상기 화합물은 VEGF 또는 Ang-2인 것을 특징으로 하는 의료 장치.
제 9항 또는 제 58항에 있어서,

상기 풀러렌은 나노튜브로서 배열되는 것을 특징으로 하는 의료 장치.
포유 동물의 혈관 또는 관상 장기에 의료 장치를 이식하는 것을 포함하여 이루어지고,

상기 의료 장치는 (a) 한층 이상의 생체적합성 매트릭스, (b) 치료적 유효량의 한종 이상의 항체, 항체 단편 또는 이의 조합물, 및 (c) 하나 이상의 화합물로코팅되어 있고; 상기 항체 또는 항체 단편은 원시 내피 세포 표면 상의 항원을 인식 및 결합하여 원시 내피 세포를 매트릭스 표면 상에 고정시키고, 상기 하나 이상의 화합물은 고정된 원시 내피 세포를 자극하여 의료 장치의 표면 상에 내피를 형성하기 위한 것임을 특징으로 하는, 포유 동물의 내막 과형성의 저해 방법.
제 52항에 있어서,

상기 의료 장치는 스텐트, 스텐트 이식편, 합성 혈관 이식편, 심장 밸브, 카테터, 혈관 인공삽입 필터, 페이스메이커, 페이스메이커 리드, 세동제거기, 개방 난원공 격벽 폐쇄 장치, 혈관 클립, 혈관 동맥류 폐색기, 혈액투석 이식편, 혈액투석 카테터, 방실계의 션트, 대동맥 동맥류 이식편 장치, 정맥 밸브, 봉합재, 혈관 문합 클립, 내재성 정맥 카테터, 내재성 동맥 카테터, 혈관 시스 및 약물 전달 포트를 포함하여 이루어지는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 52항에 있어서,

상기 생체적합성 매트릭스는, 폴리우레탄, 분절화된 폴리우레탄-우레아/헤파린, 폴리-L-락트산, 셀룰로오스 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 아세테이트, 덱스트란, 젤라틴, 콜라겐, 엘라스틴,라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 헤파린, 피브린, 셀룰로오스, 비정질 탄소 및 풀러렌으로 구성되는 그룹에서 선택되는 하나 이상의 성분을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 54항에 있어서,

상기 풀러렌이 C₆₀또는 C₇₀인 것을 특징으로 하는 방법.
제 52항에 있어서,

상기 하나 이상의 항체 또는 항체 단편은 CD133, CD34, CDw90, CD117, HLA-DR, VEGFR-1, VEGFR-2, Muc-18(CD146), CD130, 줄기 세포 항원(Sca-1), 줄기 세포 인자 1(SCF/c-Kit 리간드), Tie-2 및 HAD-DR로 구성되는 그룹에서 선택된 원시 내피 세포 표면 항원에 대한 것임을 특징으로 하는 방법.
제 52항에 있어서,

상기 하나 이상의 항체 단편은 모노클로날, 폴리클로날, 키메라 및 인간화 항체로 구성되는 그룹에서 선택되고, 항체의 대형 또는 소형 분자를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 52항에 있어서,

상기 하나 이상의 화합물은, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 섬유아세포 성장인자(FGF)-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF9, 염기성 섬유아세포 성장 인자, 혈소판-유도된 성장인자, 형질전환 성장인자 베타 1, 산성 섬유아세포 성장인자, 오스테오넥틴, 안지오포이에틴 1, 안지오포이에틴 2, 인슐린-유사 성장 인자,과립구-마크로파지 콜로니-자극 인자, 혈소판-유래 성장인자 AA, 혈소판-유래 성장인자 BB, 혈소판-유래 성장인자 AB, 내피 PAS 단백질 1, 트롬보스폰딘, 프롤리페린, 에프린-A1, E-셀렉틴, 렙틴, 헤파린, 인터류킨 8, 티록신, 및 스핑고신 1-포스페이트로 구성되는 그룹에서 선택되는 성장 인자인 것을 특징으로 하는 방법.
코팅 및 치료적 유효량의 한종 이상의 소형 분자를 포함하여 이루어지고,

상기 코팅은 한층 이상의 생체적합성 매트릭스를 포함하여 이루어지고, 상기 소형 분자는 원시 내피 세포 표면 상의 항원과 상호작용하여 장치의 표면 상의 원시 내피 세포를 고정하는 것을 특징으로 하는 의료 장치.
제 59항에 있어서,

상기 의료 장치는 스텐트, 스텐트 이식편, 합성 혈관 이식편, 심장 밸브, 카테터, 혈관 인공삽입 필터, 페이스메이커, 페이스메이커 리드, 세동제거기, 개방 난원공 격벽 폐쇄 장치, 혈관 클립, 혈관 동맥류 폐색기, 혈액투석 이식편, 혈액투석 카테터, 방실계의 션트, 대동맥 동맥류 이식편 장치, 정맥 밸브, 봉합재, 혈관 문합 클립, 내재성 정맥 카테터, 내재성 동맥 카테터, 혈관 시스 및 약물 전달 포트를 포함하여 이루어지는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 의료 장치.
제 59항에 있어서,

상기 생체적합성 매트릭스는, 폴리우레탄, 분절화된 폴리우레탄-우레아/헤파린, 폴리-L-락트산, 셀룰로오스 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 아세테이트, 덱스트란 및 젤라틴으로 구성되는 그룹에서 선택되는 합성 물질을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 의료 장치.
제 59항에 있어서,

상기 생체적합성 매트릭스는 콜라겐, 엘라스틴,라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 헤파린, 피브린, 셀룰로오스 및 비정질 탄소로 구성되는 그룹에서 선택되는 자연 발생 물질을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 의료 장치.
제 59항에 있어서,

상기 생체적합성 매트릭스가 탄소수 약 C₂₀내지 약 C₁₅₀범위의 풀러렌을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 의료 장치.
제 63항에 있어서,

상기 풀러렌이 C₆₀또는 C₇₀인 것을 특징으로 하는 의료 장치.
제 59항에 있어서,

상기 소형 분자는 자연 발생 펩티드, 합성 펩티드, 글리코펩티드, 리포펩티드, 지질, 당류, 유기 분자, 무기 분자 및 핵산으로 구성되는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 의료 장치.
제 59항에 있어서,

상기 소형 분자는 매트릭스의 표면에 공유 또는 비공유 부착되거나, 의료 장치를 코팅하는 매트릭스의 최외층에 링커 분자에 의해 공유 부착되는 것을 특징으로 하는 의료 장치.
제 70항에 있어서,

상기 소형 분자는 인간 원시 내피 세포에 특이적인 것을 특징으로 하는 의료 장치.
제 59항에 있어서,

상기 소형 분자는 CD133, CD34, CDw90, CD117, HLA-DR, VEGFR-1, VEGFR-2, Muc-18(CD146), CD130, 줄기 세포 항원(Sca-1), 줄기 세포 인자 1(SCF/c-Kit 리간드), Tie-2 및 HAD-DR로 구성되는 그룹에서 선택되는 원시 내피 세포 표면 항원에 대한 리간드인 것을 특징으로 하는 의료 장치.
제 59항에 있어서,

혈관 내피 성장 인자(VEGF), 섬유아세포 성장인자(FGF)-3, FGF-4, FGF-5,FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF9, 염기성 섬유아세포 성장 인자, 혈소판-유도된 성장인자, 형질전환 성장인자 베타 1, 산성 섬유아세포 성장인자, 오스테오넥틴, 안지오포이에틴 1, 안지오포이에틴 2, 인슐린-유사 성장 인자, 과립구-마크로파지 콜로니-자극 인자, 혈소판-유래 성장인자 AA, 혈소판-유래 성장 인자 BB, 혈소판-유래 성장인자 AB, 내피 PAS 단백질 1, 트롬보스폰딘, 프롤리페린, 에프린-A1, E-셀렉틴, 렙틴, 헤파린, 인터류킨 8, 티록신, 및 스핑고신 1-포스페이트로 구성되는 그룹에서 선택되는 성장 인자를 더 포함하여 이루어지는 의료 장치.
이러한 치료가 필요한 포유 동물의 혈관 또는 관상 장기에 제 59항 또는 제 69항의 의료 장치를 이식하는 것을 포함하여 이루어지는 포유 동물의 혈관 질환의 치료 방법.
이러한 치료가 필요한 포유 동물의 혈관 또는 관상 장기에 제 59항 또는 제 69항의 의료 장치를 이식하는 것을 포함하여 이루어지는 포유 동물의 내막 과형성의 저해 방법.