KR20080031997A - 단백질 키나제 억제제로서의 5-치환 티아졸-2-일 아미노화합물 및 조성물 - Google Patents

단백질 키나제 억제제로서의 5-치환 티아졸-2-일 아미노화합물 및 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 화학식 I의 5-치환 티아졸-2-일 아미노 화합물, 상기 화합물을 포함하는 제약 조성물 및 비정상적 또는 탈조절된 키나제 활성과 연관된 질환 또는 장애, 특히 Abl, Aurora-A, Bcr-Abl, Bmx, CDK1/cyclinB, CHK2, Fes, FGFR3, Flt3, GSK3β, JNK1α1, Lck, MKK4 및 TrkB 키나제의 비정상적 활성화를 수반하는 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 위한 상기 화합물의 사용 방법을 제공한다.
[화학식 I]
Figure 112008015051082-PCT00040
5-치환 티아졸-2-일 아미노 화합물, 키나제, 백혈병, 암, 심혈관 질환

Description

단백질 키나제 억제제로서의 5-치환 티아졸-2-일 아미노 화합물 및 조성물 {5-SUBSTITUTED THIAZOL-2-YL AMINO COMPOUNDS AND COMPOSITIONS AS PROTEIN KINASE INHIBITORS}
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2005년 8월 2일에 출원된 미국 가특허 출원 제60/704,976호에 대하여 우선권의 이익을 주장한다. 상기 출원의 모든 개시사항은 그 전체로 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다.
발명의 배경
본 발명은 신규 부류의 화합물, 상기 화합물을 포함하는 제약 조성물 및 비정상적 또는 탈조절된 키나제 활성과 연관된 질환 또는 장애, 특히 Abl, Aurora-A, Bcr-Abl, Bmx, CDK1/cyclinB, CHK2, Fes, FGFR3, Flt3, GSK3β, JNK1α1, Lck, MKK4 및 TrkB 키나제의 비정상적 활성화를 수반하는 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한 상기 화합물의 사용 방법을 제공한다.
단백질 키나제는 다양한 세포 과정의 조절 및 세포 기능에 대한 조절 유지에 중요한 역할을 하는 단백질의 광범위한 족을 나타낸다. 상기 키나제의 부분적이고 비제한적인 목록에는 수용체 티로신 키나제, 예컨대 혈소판-유래 성장 인자 수용체 키나제 (PDGF-R), 신경 성장 인자 수용체, trkB, Met, 및 섬유모세포 성장 인자 수용체, FGFR3; 비-수용체 티로신 키나제, 예컨대 Abl 및 융합 키나제 BCR-Abl, Lck, Csk, Fes, Bmx 및 c-src; 및 세린/트레오닌 키나제, 예컨대 b-RAF, c-RAF, sgk, MAP 키나제 (예를 들어, MKK4, MKK6 등) 및 SAPK2α, SAPK2β 및 SAPK3가 포함된다. 이상 키나제 활성은 양성 및 악성 증식성 장애뿐만 아니라 면역계 및 신경계의 부적절한 활성화에 기인한 질환을 비롯한 다수의 질환 상태에서 관찰되어 왔다.
본 발명의 신규 화합물은 1종 이상의 단백질 키나제의 활성을 억제하며, 따라서 키나제-연관 질환의 치료에 유용할 것으로 예상된다.
발명의 개요
제1 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 I의 화합물, 및 그의 N-옥시드 유도체, 프로드러그 유도체, 보호된 유도체, 개별 이성질체 및 이성질체 혼합물, 및 상기 화합물의 제약상 허용가능한 염 및 용매화물 (예를 들어 수화물)을 제공한다.
Figure 112008015051082-PCT00001
식 중,
n은 0, 1, 2 및 3으로부터 선택되고;
m은 0 및 1로부터 선택되고;
R1은 할로, 시아노, 히드록시, 니트로, C1 - 6알킬, C1 - 6알콕시, 할로-치환-C1 - 6알킬, 할로-치환-C1 - 6알콕시, -S(O)0-2R5, -NR5R5, -C(O)NR5R6, -C(O)NR5R6, -C(O)NR5XOR5, -C(O)NR5XNR5R5, -OR6, -C(O)OR5, -NR5C(O)R6로부터 선택되며; 여기서 각 R5는 수소 및 C1 - 6알킬로부터 독립적으로 선택되고; R6는 C6 - 10아릴-C0 - 4알킬, C1 - 10헤테로아릴-C0 - 4알킬, C3 - 12시클로알킬-C0 - 4알킬 및 C3 - 8헤테로시클로알킬-C0 - 4알킬로부터 선택되거나; 또는 n이 2인 경우에는, 인접한 두 R1 라디칼이, 그들 모두가 결합되어 있는 원자와 함께, 페닐을 형성하여서, 고리 A가 임의로 치환되는 나프틸이 되고 (예를 들어, 하기 표 1의 화합물 59);
R2는 수소 및 메틸이고;
R3는 할로이고;
R4는 수소, 할로겐 및 C1 - 6알킬로부터 선택되거나; 또는 R3 및 R4는, R3 및 R4가 결합되어 있는 원자와 함께, 페닐을 형성하며; 페닐 고리 A는 임의로 3개 이하의 =C- 기가 =N-으로 대체될 수 있다.
제2 측면에서, 본 발명은 화학식 I의 화합물 또는 그의 N-옥시드 유도체, 개별 이성질체 및 이성질체 혼합물, 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 1종 이상의 적합한 부형제와의 혼합물로 함유하는 제약 조성물을 제공한다.
제3 측면에서, 본 발명은 치료 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 N-옥 시드 유도체, 개별 이성질체 및 이성질체 혼합물, 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 키나제 활성, 특히 Abl, Aurora-A, Bcr-Abl, Bmx, CDK1/cyclinB, CHK2, Fes, FGFR3, Flt3, GSK3β, JNK1α1, Lck, MKK4 및/또는 TrkB 활성의 억제가 질환의 병리상태 및/또는 증상을 예방, 억제 또는 완화시킬 수 있는 동물에서의 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
제4 측면에서, 본 발명은 키나제 활성, 특히 Abl, Aurora-A, Bcr-Abl, Bmx, CDK1/cyclinB, CHK2, Fes, FGFR3, Flt3, GSK3β, JNK1α1, Lck, MKK4 및/또는 TrkB 활성이 질환의 병리상태 및/또는 증상의 원인이 되는 동물에서의 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 화학식 I의 화합물의 용도를 제공한다.
제5 측면에서, 본 발명은 화학식 I의 화합물 및 그의 N-옥시드 유도체, 프로드러그 유도체, 보호된 유도체, 개별 이성질체 및 이성질체 혼합물, 및 그의 제약상 허용가능한 염의 제조 방법을 제공한다.
정의
"알킬"은 하나의 기로서, 그리고 다른 기, 예를 들어 할로-치환-알킬 및 알콕시의 구조적 요소로서 직쇄 또는 분지쇄일 수 있다. C1 -4-알콕시에는 메톡시, 에톡시 등이 포함된다. 할로-치환 알킬에는 트리플루오로메틸, 펜타플루오로에틸 등이 포함된다.
"아릴"은 6 내지 10개의 고리 탄소 원자를 함유하는 모노시클릭 또는 융합된 비시클릭 방향족 고리단을 의미한다. 예를 들어, 아릴은 페닐 또는 나프틸, 바람직하게는 페닐일 수 있다. "아릴렌"은 아릴기로부터 유도된 2가 라디칼을 의미한다.
"헤테로아릴"은 상기 아릴에 대하여 정의된 바와 같되, 여기서 고리 구성원 중 하나 이상은 헤테로원자이다. 예를 들어 본 출원에서 사용되는 바와 같은 C1 - 10헤테로아릴에는 피리딜, 인돌릴, 인다졸릴, 퀴녹살리닐, 퀴놀리닐, 벤조푸라닐, 벤조피라닐, 벤조티오피라닐, 벤조[1,3]디옥솔, 이미다졸릴, 벤조-이미다졸릴, 피리미디닐, 푸라닐, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 피라졸릴, 티에닐 등이 포함된다.
"시클로알킬"은 지정된 개수의 고리 원자를 함유하는 포화 또는 부분적으로 불포화된, 모노시클릭, 융합된 비시클릭 또는 가교된 폴리시클릭 고리단을 의미한다. 예를 들어, C3 - 10시클로알킬에는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실 등이 포함된다.
"헤테로시클로알킬"은 본 출원에서 정의된 바와 같되, 단, 지정된 고리 탄소 중 하나 이상이 -O-, -N=, -NR-, -C(O)-, -S-, -S(O)- 또는 -S(O)2- (여기서 R은 수소, C1 - 4알킬 또는 질소 보호기임)로부터 선택되는 잔기로 대체되는 시클로알킬을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 화합물을 기술하기 위해서 본 출원에서 사용되는 바와 같은 C3 - 8헤테로시클로알킬에는 모르폴리노, 피롤리디닐, 피롤리디닐-2-온, 피페라지닐, 피페리디닐, 피페리디닐론, 1,4-디옥사-8-아자-스피로[4.5]데스-8-일 등이 포함된다.
"할로겐" (또는 할로)은 바람직하게는 클로로 또는 플루오로를 나타내지만, 브로모 또는 요오도일 수도 있다.
"키나제 패널"은 Abl(인간), Abl(T315I), JAK2, JAK3, ALK, JNK1α1, ALK4, KDR, Aurora-A, Lck, Blk, MAPK1, Bmx, MAPKAP-K2, BRK, MEK1, CaMKII(래트), Met, CDK1/cyclinB, p70S6K, CHK2, PAK2, CK1, PDGFRα, CK2, PDK1, c-kit, Pim-2, c-RAF, PKA(h), CSK, PKBα, cSrc, PKCα, DYRK2, Plk3, EGFR, ROCK-I, Fes, Ron, FGFR3, Ros, Flt3, SAPK2α, Fms, SGK, Fyn, SIK, GSK3β, Syk, IGF-1R, Tie-2, IKKβ, TrKB, IR, WNK3, IRAK4, ZAP-70, ITK, AMPK(래트), LIMK1, Rsk2, Axl, LKB1, SAPK2β, BrSK2, Lyn(h), SAPK3, BTK, MAPKAP-K3, SAPK4, CaMKIV, MARK1, Snk, CDK2/cyclinA, MINK, SRPK1, CDK3/cyclinE, MKK4(m), TAK1, CDK5/p25, MKK6(h), TBK1, CDK6/cyclinD3, MLCK, TrkA, CDK7/cyclinH/MAT1, MRCKβ, TSSK1, CHK1, MSK1, Yes, CK1d, MST2, ZIPK, c-Kit (D816V), MuSK, DAPK2, NEK2, DDR2, NEK6, DMPK, PAK4, DRAK1, PAR-1Bα, EphA1, PDGFRβ, EphA2, Pim-1, EphA5, PKBβ, EphB2, PKCβI, EphB4, PKCδ, FGFR1, PKCη, FGFR2, PKCθ, FGFR4, PKD2, Fgr, PKG1β, Flt1, PRK2, Hck, PYK2, HIPK2, Ret, IKKα, RIPK2, IRR, ROCK-II(인간), JNK2α2, Rse, JNK3, Rsk1(h), PI3 Kγ, PI3 Kδ 및 PI3-Kβ를 포함하는 키나제 목록이다. 본 발명의 화합물은 상기 키나제 패널 (야생형 및/또는 그의 돌연변이)에 대하여 스크리닝되고, 상기 패널 구성원 중 하나 이상의 활성을 억제한다.
"BCR-Abl의 돌연변이 형태"는 야생형 서열로부터의 단일 또는 복수의 아미노산 변이를 의미한다. BCR-ABL에서의 돌연변이는 단백질과 억제제 (예를 들어, 글리벡(Gleevec) 등) 사이의 중요한 접촉점을 분열시킴으로써, 더욱 빈번하게는, 비활성에서 활성 상태, 즉, BCR-ABL과 글리벡이 결합할 수 없는 구조로의 전환을 유도함으로써 작용한다. 임상 샘플의 분석으로부터, 내성 표현형과 관련하여 발견되는 돌연변이 레퍼토리는 천천히, 그러나 엄연히 시간이 흐르면서 증가해 왔다. 돌연변이는 4개의 주요 영역에 클러스터링하는 것으로 보인다. 돌연변이 제1 군 (G250E, Q252R, Y253F/H, E255K/V)은 ATP에 대한 인산염-결합 루프 (P-루프로도 알려짐)를 형성하는 아미노산을 포함한다. 제2 군 (V289A, F311L, T315I, F317L)은 글리벡 결합 부위에서 발견될 수 있으며, 수소 결합 또는 반데르발스 상호작용을 통해 억제제와 직접 상호작용한다. 돌연변이 제3 군 (M351T, E355G)은 촉매 도메인에 아주 근접하여 클러스터링한다. 돌연변이 제4 군 (H396R/P)은 그 구조가 키나제 활성화/불활성화를 조절하는 분자 스위치인 활성화 루프에 위치한다. CML 및 ALL 환자에서 탐지되는 글리벡 내성과 연관된 BCR-ABL 점 돌연변이로는 M224V, L248V, G250E, G250R, Q252R, Q252H, Y253H, Y253F, E255K, E255V, D276G, T277A, V289A, F311L, T315I, T315N, F317L, M343T, M315T, E355G, F359V, F359A, V379I, F382L, L387M, L387F, H396P, H396R, A397P, S417Y, E459K, 및 F486S (1문자 코드로 나타내는 아미노산 위치는 진뱅크(GenBank) 서열, 수탁 번호 AAB60394에서의 위치이며, ABL 타입 1a에 대응함; 문헌 [Martinelli et al., Haematologica/The Hematology Journal, 2005, April; 90-4])가 포함된다. 본 발명에 대하여 달리 명시하지 않는 한, Bcr-Abl은 상기 효소의 야생형 및 돌연변이 형태를 지칭한다.
"치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 질환 및/또는 그에 수반되는 증상을 완화 또는 경감시키는 방법을 가리킨다.
바람직한 실시양태의 기술
융합 단백질 BCR-Abl은 Abl 원-종양유전자와 Bcr 유전자를 융합시키는 상호전위의 결과이다. 이때 BCR-Abl은 분열촉진 활성의 증가를 통해서 B-세포를 형질전환시킬 수 있다. 상기의 증가는 아폽토시스에 대한 민감성을 감소시킬 뿐만 아니라 CML 전구세포의 유착 및 귀소를 변형시킨다. 본 발명은 키나제 관련 질환, 특히 Abl, Aurora-A, Bcr-Abl, Bmx, CDK1/cyclinB, CHK2, Fes, FGFR3, Flt3, GSK3β, JNK1α1, Lck, MKK4 및 TrkB 키나제 관련 질환의 치료를 위한 화합물, 조성물 및 방법을 제공한다. 예를 들어, 백혈병 및 BCR-Abl과 관련된 기타 증식 장애는 Bcr-Abl의 야생형 및 돌연변이 형태의 억제를 통해서 치료할 수 있다.
한 실시양태에서는, 화학식 I의 화합물과 관련하여, 고리 A는 페닐, 피리디닐 및 나프틸 (여기서 2개의 R1 라디칼이 조합되어 고리 A에 융합되는 페닐 고리를 형성함으로써 나프틸을 생성함)로부터 선택되고; m은 0이고; R3는 할로이며; R4는 수소이다.
또 다른 실시양태에서, R1은 메틸, 히드록시, 메톡시, 클로로, 플루오로, 브로모, 카르복시, 아미노, 시아노, 니트로, 메틸-술파닐, 트리플루오로메톡시, 트리플루오로메틸, 메틸-카르보닐, 에톡시-카르보닐, -C(O)NHR6, -C(O)NH(CH2)2OCH3, -C(O)NHCH(CH3)CH2OCH3, -C(O)N(CH3)(CH2)2OCH3, -C(O)NH(CH2)2OH, -C(O)NH(CH2)2N(CH3)2, -C(O)NH(CH2)2N(C2H5)2, -C(O)NHCH3, -NHC(O)R6, -NHC(O)CH3 및 -OR6로부터 선택되며; 여기서 R6는 페닐, 모르폴리노-에틸, 피리디닐 및 피롤리디닐-에틸로부터 선택된다.
본 발명의 바람직한 화합물은 (5-브로모-티아졸-2-일)-p-톨릴-아민; 4-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-페놀; (5-브로모-티아졸-2-일)-(4-메톡시-페닐)-아민; 4-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-벤조산; 4-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-N-(2-모르폴린-4-일-에틸)-벤즈아미드; 4-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-N-(2-메톡시-에틸)-벤즈아미드; (5-브로모-티아졸-2-일)-[4-(1-메틸아미노-비닐)-페닐]-아민; 3-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-벤조산; N-[4-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-페닐]-벤즈아미드; N-[4-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-페닐]-아세트아미드; 3-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-N-(2-메톡시-에틸)-벤즈아미드; 3-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-N-메틸-벤즈아미드; (5-브로모-티아졸-2-일)-[4-(피리딘-4-일옥시)-페닐]-아민; (5-브로모-티아졸-2-일)-(4-클로로-페닐)-아민; 벤조티아졸-2-일-(4-플루오로-페닐)-아민; 4-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-N-(2-히드록시-에틸)-벤즈아미드; 4-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-N-(2-디메틸아미노-에틸)-벤즈아미드; 4-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-N-(2-디에틸아미노-에틸)-벤즈아미드; N-(5-브로모-티아졸-2-일)-벤즈아미드; (5-브로모-티아졸-2-일)-(3-플루오로-페닐)-아민; (5-브로모-티아졸-2-일)-(3-트리플루오로메틸-페닐)-아민; (5-브로모-티아졸-2-일)-(3-메톡시-페닐)-아민; (5-브로모-티아졸-2-일)-m-톨릴-아민; (5-브로모-티아졸-2-일)-피리딘-2-일-아민; N-(5-브로모-티아졸-2-일)-벤젠-1,4-디아민; 1-[4-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-페닐]-에탄온; 4-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-벤조산 에틸 에스테르; (5-브로모-티아졸-2-일)-피리딘-4-일-아민; (5-브로모-티아졸-2-일)-피리딘-3-일-아민; N-(5-브로모-티아졸-2-일)-벤즈아미드; (5-브로모-티아졸-2-일)-(4-트리플루오로메틸-페닐)-아민; 3-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-벤조산 에틸 에스테르; (5-브로모-티아졸-2-일)-페닐-아민; (5-브로모-티아졸-2-일)-(2-메톡시-페닐)-아민; (5-브로모-티아졸-2-일)-(4-플루오로-페닐)-아민; (5-클로로-티아졸-2-일)-(4-플루오로-페닐)-아민; (4-플루오로-페닐)-(5-요오도-티아졸-2-일)-아민; 4-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-벤조니트릴; (5-브로모-티아졸-2-일)-o-톨릴-아민; (5-브로모-티아졸-2-일)-나프탈렌-1-일-아민; (5-브로모-티아졸-2-일)-(2-플루오로-페닐)-아민; 3-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-벤조니트릴; (5-브로모-티아졸-2-일)-(3-메틸술파닐-페닐)-아민; (4-브로모-페닐)-(5-브로모-티아졸-2-일)-아민; (5-브로모-티아졸-2-일)-(4-페녹시-페닐)-아민; (5-브로모-티아졸-2-일)-(4-니트로-페닐)-아민; 4-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-N-(2-피롤리딘-1-일-에틸)-벤즈아미드; 4-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-N-(2-메톡시-1-메틸-에틸)-벤즈아미드; 및 4-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-N-(2-메톡시-에틸)-N-메틸-벤즈아미드로부터 선택된다.
본 발명의 더욱 바람직한 화합물은 아래 실시예 및 표 1에서 상술한다.
약리 및 효용
본 발명의 화합물은 키나제 활성을 조절하며, 그로 인하여, 키나제가 질환의 병리상태 및/또는 증상의 원인이 되는 질환 또는 장애의 치료에 유용하다. 본원에 기재한 화합물 및 조성물에 의해서 억제되고, 본원에 기재한 방법이 유용한 키나제의 예로는 Abl, Aurora-A, Bcr-Abl (야생형 및 돌연변이 형태), Bmx, CDK1/cyclinB, CHK2, Fes, FGFR3, Flt3, GSK3β, JNK1α1, Lck, MKK4 및 TrkB이 포함되지만, 여기에 한정되지는 않는다.
아벨슨 티로신 키나제 (즉, Abl, c-Abl)는 세포 주기의 조절, 유전자독성 스트레스에 대한 세포 반응, 및 인테그린 신호전달을 통한 세포 환경에 관한 정보의 전달에 관여한다. 전체적으로, Abl 단백질은 다양한 세포외 및 세포내 출처로부터의 신호를 통합하고, 세포 주기 및 아폽토시스에 관한 결정에 영향을 미치는 세포 모듈로서의 복잡한 역할을 수행하는 것으로 보인다. 아벨슨 티로신 키나제는 아형 유도체, 예컨대 탈조절된 티로신 키나제 활성을 갖는 키메라 융합체 (종양단백질) BCR-Abl, 또는 v-Abl을 포함한다. BCR-Abl은 만성 골수성 백혈병 (CML)의 95％ 및 급성 림프성 백혈병의 10％의 발병에 있어서 결정적이다. STI-571 (글리벡)은 종양발생성 BCR-Abl 티로신 키나제의 억제제이고, 만성 골수성 백혈병 (CML)의 치료에 사용된다. 그러나, CML의 모구성 발증 단계에 있는 일부 환자는 BCR-Abl 키나제에서의 돌연변이 때문에 STI-571에 내성이 있다. 현재까지 22종이 넘는 돌연변이가 보고되었으며, 그 중 G250E, E255V, T315I, F317L 및 M351T가 가장 흔하다.
본 발명의 화합물은 abl 키나제, 특히 v-abl 키나제를 억제한다. 본 발명의 화합물은 또한 야생형 BCR-Abl 키나제 및 BCR-Abl 키나제의 돌연변이도 억제하고, 따라서 Bcr-abl-양성 암 및 종양 질환, 예컨대 백혈병 (주로, 특히 아폽토시스성 작용 기작이 발견되는 만성 골수성 백혈병 및 급성 림프모구성 백혈병)의 치료에 적합하며, 또한 백혈병 줄기 세포의 아군에 대한 효과뿐만 아니라, 상기 세포를 제거 (예를 들어, 골수 제거)한 후, 시험관 내에서 이들 세포를 정제하고, 이들 세포로부터 암세포를 제거한 뒤의 재이식 (예를 들어, 정제된 골수 세포의 재이식) 잠재성을 보여준다.
특정 단백질 키나제 족, 예컨대 Nima 관련 키나제 (Nek) 2, Polo-유사 키나제 (Plk) 1, 및 Aurora 키나제는 중심체 및 방추체의 기능 조절에 관여한다. Aurora 키나제는 세포 분할 이후에 비정상적 배수체 (ipl)를 나타내는 돌연변이에 대한 효모 스크린에서 최초로 발견되었다. 초파리에서, Aurora 키나제 돌연변이는 중심체 분리를 막아서 단극성 방추체를 생성하는 것으로 밝혀졌다. 포유류에서 기술된 Aurora 키나제 중 공지된 세 가지 동형(isoform)인 Aurora A, B 및 C가 있다. Aurora A 및 B는 어디에서나 발현되는 반면, Aurora C는 고환에서 주로 발현되는 것으로 밝혀져, 가능한 역할이 감수분열임을 시사한다. Aurora A는 말기 S 기 및 초기 G2 기부터 M 기까지 중심체 및 방추체 극에 위치한다. Aurora A는, Aurora A를 유사분열성 방추체에 표적화시키는 G2/M 전이에서 TPX2에 결합하며, 이것에 의해서 활성화된다. Aurora A는 중심체 성숙 및 방추체 구축 도중에 히스톤 H3를 세린 10에서 인산화시킬 수 있다. Aurora B는 유사분열 도중에 동원체로부터 방추체 중간대로 이동하는 염색체 일과성(passenger) 단백질이다. Aurora B는 말기 후기 동안에는 중심 방추체에 그리고 종기 및 세포질분열 도중에는 중간체에 위치한다. Aurora B는 염색체 응축 및 응집, 양극성 염색체 부착, 방추체 체크포인트 및 염색체 분리의 조절을 제공한다. Aurora C는, 그의 중요성에 대해서는 덜 알려져 있지만, Aurora B의 기능 중 일부를 보완할 수 있다.
Aurora A는 유방암 및 결장암에서 유전자적으로 증폭된다고 흔히 알려진 영역 (단백질 과다발현도 검출됨)에서 염색체 20q13에 위치하며, 불량한 예후와 연관된다. Aurora A와 B는 둘 다, 이후에 마우스에서 종양을 형성할 수 있는 세포주 (NIH3T3 또는 CHO)를 형질전환시키는 능력을 갖는다. 세포 주기 및 종양발생에서 Aurora 키나제의 역할은 그들을 소분자 요법의 개발에 있어서 잠재적인 목표로 만들었다. 예를 들어, Aurora-A 활성은 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, 위암, 신경아세포종, 난소암 및 췌장암에서 상승된다.
신경영양인자 수용체의 trk 족 (trkA, trkB, trkC)은 신경세포성 및 비-신경세포성 조직의 생존, 성장 및 분화를 촉진시킨다. TrkB 단백질은 소장 및 결장에서의 신경내분비형 세포에서, 췌장의 알파 세포에서, 림프절 및 비장의 단핵구 및 대식세포에서, 그리고 표피의 과립층에서 발현된다 (문헌 [Shibayama and Koizumi, 1996]). TrkB 단백질의 발현은 윌름즈(Wilms) 종양 및 신경모세포종의 비우호적인 진행과 연관되어 있다. TrkB는 또한 암성 전립선 세포에서는 발현되지만 정상 세포에서는 발현되지 않는다. trk 수용체의 신호전달 경로 하류는 Shc, 활성화된 Ras, ERK-1 및 ERK-2 유전자를 통한 MAPK 활성화의 캐스케이드, 및 PLC-감마1 전달 경로를 포함한다 (문헌 [Sugimoto et al., 2001]).
비-수용체 단백질-티로신 키나제인 Tec 족 키나제 Bmx는 포유류 상피 암세포의 증식을 제어한다.
섬유모세포 성장 인자 수용체 3은 골 성장에 대한 음성적 조절 효과 및 연골세포 증식의 억제를 발휘하는 것으로 밝혀졌다. 치사성 이형성증은 섬유모세포 성장 인자 수용체 3에서의 여러 돌연변이에 의해서 야기되며, 한 돌연변이인 TDII FGFR3는 전사 인자 Stat1을 활성화시켜서 세포-주기 억제제의 발현, 성장 저지 및 비정상적 골 발달을 야기하는 구성적 티로신 키나제 활성을 갖는다 (문헌 [Su et al., Nature, 1997, 386, 288-292]). FGFR3는 또한 다발성 골수종형 암에서 종종 발현된다. FGFR3 활성의 억제제는 류마티스 관절염 (RA), 콜라겐 II 관절염, 다발성 경화증 (MS), 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 건선, 유년기 발병형 당뇨병, 쇼그렌(Sjogren) 질환, 갑상샘 질환, 사코이드증, 자가면역성 포도막염, 염증성 장 질환 (크론(Crohn) 및 궤양성 대장염), 복강 질환 및 중증근무력증을 포함하지만 여기에 한정되지는 않는 T-세포 매개 염증성 또는 자가면역성 질환의 치료에 유용하다.
Lck는 T-세포 신호전달에서 일익을 담당한다. Lck 유전자가 결핍된 마우스는 가슴샘세포를 발생시키는 능력이 불량하다. T-세포 신호전달의 양성 활성화제로서의 Lck의 기능은 Lck 억제제가 류마티스 관절염과 같은 자가면역성 질환을 치료하는데 유용할 수 있음을 시사한다.
JNK는, 기타 MAPK와 함께, 암, 트롬빈-유발된 혈소판 응집, 면역결핍성 장애, 자가면역성 질환, 세포사, 알레르기, 골다공증 및 심장 질환에 대한 세포 반응을 매개하는 역할을 갖는데 연관되어 있다. JNK 경로의 활성화에 관련된 치료 표적에는 만성 골수성 백혈병 (CML), 류마티스 관절염, 천식, 골관절염, 허혈, 암 및 신경퇴행성 질환이 포함된다. 간 질환 또는 간 허혈 발작과 연관된 JNK 활성화의 중요성의 결과로서, 본 발명의 화합물은 또한 다양한 간 장애를 치료하는데 유용할 수 있다. 심혈관 질환, 예컨대 심근경색 또는 울혈성 심부전에서의 JNK의 역할은 또한, JNK가 다양한 형태의 심장 스트레스에 대한 비대 반응을 매개하는 것이 밝혀진 것으로 보고되었다. JNK 캐스케이드가 또한 IL-2 프로모터의 활성화를 비롯한 T-세포 활성화에서 일익을 담당한다는 것이 입증되었다. 따라서, JNK의 억제제는 병적 면역 반응을 변경시키는데 치료적 가치를 가질 수 있다. 다양한 암에서 JNK 활성화에 대한 역할이 또한 확립되었으며, 이는 암에서 JNK 억제제의 잠재적인 유용성을 시사한다. 예를 들어, 구성적으로 활성화된 JNK는 HTLV-1 매개 종양형성과 연관되어 있다 (문헌 [Oncogene 13:135-42 (1996)]). JNK는 카포시(Kaposi) 육종 (KS)에서 일익을 담당할 수 있다. KS 증식에 연루된 다른 시토킨, 예컨대 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), IL-6 및 TNFα의 기타 증식성 효과는 또한 JNK에 의해서 매개될 수 있다. 또한, p210 BCR-ABL 형질전환된 세포에서 c-jun 유전자의 조절은 JNK의 활성과 조화되며, 이는 만성 골수성 백혈병 (CML)에 대한 치료에서 JNK 억제제에 대한 역할을 시사한다 (문헌 [Blood 92:2450-60 (1998)]).
미토겐-활성화된 단백질 키나제 (MAPK)는 전사 인자, 번역 인자 및 다양한 세포외 신호에 반응하는 기타 표적 분자를 활성화시키는 보존된 신호 전달 경로의 일원이다. MAPK는 미토겐-활성화된 단백질 키나제 키나제 (MKK)에 의해서 서열 Thr-X-Tyr을 갖는 이중 인산화 모티프에서의 인산화에 의해서 활성화된다. 고등 진핵생물에서, MAPK 신호전달의 생리학적 역할은 증식, 종양형성, 발생 및 분화와 같은 세포 사건과 상호연관되어 있다. 따라서, 상기 경로를 통해서 (특히 MKK4 및 MKK6을 통해서) 신호 전달을 조절하는 능력은 MAPK 신호전달과 연관된 인간 질환, 예컨대 염증성 질환, 자가면역성 질환 및 암에 대한 치료 및 예방적 요법의 발달을 이끌어낼 수 있었다.
SAPK's ("jun N-말단 키나제" 또는 "JNK's"라고도 칭함)는 c-jun 전사 인자의 활성화 및 c-jun에 의해서 조절되는 유전자의 발현을 일으키는 신호 전달 경로에서의 전종단 단계를 나타내는 단백질 키나제 족이다. 특히, c-jun은 유전자독성 손상에 기인하여 손상된 DNA의 복구에 관계하는 단백질을 암호화하는 유전자의 전사와 관련된다. 세포에서 SAPK 활성을 억제하는 작용제는 DNA 복구를 막고, DNA 손상 유발에 의해서 작용하는 암 치유 양식에 대하여 세포를 감작화시킨다.
CHK2는 세린/트레오닌 단백질 키나제의 체크포인트 키나제 족의 일원이고, DNA 손상, 예컨대 환경상의 돌연변이원 및 내인성의 반응성 산소종에 의해 야기되는 손상의 감시에 사용되는 기작에 연관되어 있다. 그 결과, 상기는 암 치유에 있어서 종양 억제제 및 표적으로서 연루된다.
Fes는 다양한 시토킨 신호 전달 경로, 뿐만 아니라 골수 세포의 분화에 연관된 비-수용체 단백질 티로신 키나제이다. Fes는 또한 과립구 분화 수단의 주 구성요소이다.
Flt3 수용체 티로신 키나제 활성은 백혈병 및 골수이형성 증후군에 연관되어 있다. 대략 25％의 AML에서, 백혈병 세포는 세포 표면에서 자가-인산화된 (p) FLT3 티로신 키나제의 구성상 활성인 형태를 발현시킨다. p-FLT3의 활성은 백혈병 세포에 성장 및 생존 이득을 준다. 백혈병 세포가 p-FLT3 키나제 활성을 발현시키는 급성 백혈병 환자는 전체적인 임상적 결과가 불량하다. p-FLT3 키나제 활성의 억제는 백혈병 세포의 아폽토시스 (프로그램화된 세포사)를 유발한다.
상기에 따르면, 본 발명은 치료 유효량 (하기 "투여 및 제약 조성물" 참고)의 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 앞서 기재한 임의의 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 상기 질환 또는 장애의 예방 또는 치료 방법을 추가로 제공한다. 상기한 임의의 용도에 있어서, 필요한 투약량은 투여 방식, 치료할 특정 상태 및 원하는 효과에 따라 달라질 것이다.
투여 및 제약 조성물
일반적으로, 본 발명의 화합물은 당업계에 공지된 통상의 허용가능한 임의의 방식을 통해서, 단독으로 또는 1종 이상의 치료제와 함께 치료 유효량으로 투여될 것이다. 치료 유효량은 질환의 중증도, 대상체의 연령 및 상대적인 건강상태, 사용하는 화합물의 효능 및 기타 요소에 따라 광범위하게 바뀔 수 있다. 일반적으로, 약 0.03 내지 2.5 ㎎/체중 ㎏의 1일 투약량에서 전신적으로 만족스러운 결과가 수득되는 것으로 나타난다. 대형 포유류, 예를 들어 인간에서, 지시되는 1일 투약량은 약 0.5 ㎎ 내지 약 100 ㎎ 범위이며, 편의상, 예를 들어 1일 4회 이하의 분할 용량으로 또는 서방형으로 투여된다. 경구 투여에 적합한 단위 투약 형태는 약 1 내지 50 ㎎의 활성 성분을 포함한다.
본 발명의 화합물은 임의의 통상적인 경로, 특히 장관으로, 예를 들어 경구로, 예를 들어 정제 또는 캡슐제의 형태로, 또는 비경구로, 예를 들어 주사가능한 용액제 또는 현탁액제의 형태로, 국소적으로, 예를 들어 로션, 겔, 연고 또는 크림의 형태로, 또는 비강제 또는 좌제 형태로 제약 조성물로서 투여될 수 있다. 유리 형태 또는 제약상 허용가능한 염 형태의 본 발명의 화합물을 1종 이상의 제약상 허용가능한 담체 또는 희석제와 함께 포함하는 제약 조성물은 혼합, 과립화 또는 코팅법에 의하여 통상의 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 조성물은 활성 성분과 함께 a) 희석제, 예를 들어, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 소르비톨, 셀룰로스 및/또는 글리신; b) 윤활제, 예를 들어, 실리카, 탈크, 스테아르산, 그의 마그네슘 또는 칼슘 염 및/또는 폴리에틸렌글리콜; 정제에 있어서는 또한 c) 결합제, 예를 들어, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸트, 메틸셀룰로스, 소듐 카르복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈; 경우에 따라 d) 붕해제, 예를 들어, 전분, 아가, 알긴산 또는 그의 나트륨 염, 또는 발포성 혼합물; 및/또는 e) 흡수제, 착색제, 향료 및 감미료를 포함하는 정제 또는 젤라틴 캡슐제일 수 있다. 주사가능한 조성물은 등장성 수용액제 또는 수현탁액제일 수 있고, 좌제는 지방 에멀션 또는 현탁액제로부터 제조할 수 있다. 조성물은 멸균되고/되거나 보조제, 예컨대 보존제, 안정화제, 습윤화제 또는 유화제, 용액 촉진제, 삼투압 조절용 염 및/또는 완충제를 함유할 수 있다. 또한, 치료적 가치가 있는 기타 물질도 함유할 수 있다. 경피적 적용에 적합한 제형은 본 발명의 화합물의 유효량과 담체를 포함한다. 담체는 숙주의 피부를 통과하는데 도움이 되는 약리학적으로 허용가능한 흡수성 용매를 포함할 수 있다. 예를 들어, 경피적 장치는 지지재, 화합물을 임의로 담체와 함께 함유하는 저장고, 임의로 상기 화합물을 숙주의 피부에 조절된 소정의 속도로 장기간에 걸쳐 전달하기 위한 속도 조절 배리어, 및 피부에 장치를 고정하는 수단을 포함하는 붕대 형태이다. 매트릭스 경피 제형 또한 사용할 수 있다. 예를 들어 피부 및 안구에 대한 국소 적용에 적합한 제형은 바람직하게는 당업계에 주지된 수용액제, 연고, 크림 또는 겔이다. 상기의 것들은 가용화제, 안정화제, 삼투성 증강제, 완충제 및 보존제를 함유할 수 있다.
본 발명의 화합물은 치료 유효량으로 1종 이상의 치료제와 함께 투여될 수 있다 (제약 조합물). 예를 들어, 다른 면역조절성 또는 항-염증성 물질과의 경우, 예를 들어 시클로스포린, 라파마이신 또는 아스코마이신, 또는 그의 면역억제성 유사체, 예를 들어, 시클로스포린 A (CsA), 시클로스포린 G, FK-506, 라파마이신, 또는 그에 상응하는 화합물, 코르티코스테로이드, 시클로포스파미드, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 브레퀴나르, 레플루노미드, 미조리빈, 마이코페놀산, 마이코페놀레이트 모페틸, 15-데옥시스페르구알린, 면역억제성 항체, 특히 백혈구 수용체, 예를 들어, MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD25, CD28, B7, CD45, CD58 또는 그들의 리간드에 대한 모노클로날 항체, 또는 CTLA41g와 같은 기타 면역조절성 화합물과 함께 사용할 때 상승 효과가 발생할 수 있다. 본 발명의 화합물이 다른 요법과 함께 투여되는 경우, 병용-투여되는 화합물의 투약량은 이용하는 병용-약물의 유형, 이용하는 특정 약물, 치료할 상태 등에 따라 물론 달라질 것이다.
본 발명은 또한 제약 조합물, 예를 들어 a) 유리 형태 또는 제약상 허용가능한 염 형태의 본원에 개시한 바와 같은 본 발명의 화합물인 제1 작용제; 및 b) 1종 이상의 병용제를 포함하는 키트를 제공한다. 상기 키트는 투여를 위한 지침서를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "병용-투여" 또는 "조합 투여" 등의 용어는 단일 환자에 대한 선택한 치료제의 투여를 포괄함을 의미하며, 약제들이 반드시 동일한 투여 경로로 또는 동시에 투여될 필요는 없는 치료 처방을 포함하고자 한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "제약 조합물"이라는 용어는 하나를 초과하는 활성 성분을 혼합 또는 조합하여 생성된 산물을 의미하며, 활성 성분들의 고정적 및 비-고정적 조합물 양자 모두를 포함한다. "고정적 조합물"이라는 용어는 활성 성분, 예를 들어 화학식 I의 화합물 및 병용제가 양자 모두 단일체 또는 단일 투약 형태로 환자에게 동시에 투여됨을 의미한다. "비-고정적 조합물"은 활성 성분, 예를 들어 화학식 I의 화합물 및 병용제가 양자 모두 별개체로서, 일제히, 동시에 또는 특정의 시간 제한 없이 순차적으로 환자에게 투여됨을 의미하며, 여기서 상기의 투여는 환자의 체내에 치료적으로 유효한 수준의 2종의 화합물을 제공한다. 후자는 칵테일 요법, 예를 들어 3종 이상의 활성 성분의 투여에도 적용된다.
본 발명의 화합물의 제조 방법
본 발명은 또한 본 발명의 화합물의 제조 방법을 포함한다. 기재된 반응에서, 최종 생성물에 반응성 관능기, 예를 들어 히드록시, 아미노, 이미노, 티오 또는 카르복시기를 원할 경우, 그들의 원치않는 반응 참여를 피하기 위해서 그들을 보호하는 것이 필요할 수 있다. 통상의 보호기를 표준 실무에 따라 사용할 수 있으며, 예를 들어 문헌 [T. W. Greene and P. G. M. Wuts in "Protective Groups in Organic Chemistry", John Wiley and Sons, 1991]을 참고한다.
화학식 I의 화합물은 하기의 반응식 I에서와 같이 진행하여 제조할 수 있다.
Figure 112008015051082-PCT00002
식 중, n, m, R1, R2 및 R4는 발명의 개요에 정의된 바와 같다. R3는, 이 경우에는 Br이지만, 사용하는 반응물에 따라서 Cl 또는 I일 수 있다. 화학식 I의 화합물은 적합한 용매 (예를 들어, AcOH 등)의 존재 하에 화학식 2의 화합물 및 브롬을 반응시켜서 합성할 수 있다. 반응은 약 0℃ 내지 약 40℃의 온도 범위에서 진행되며, 완료되기까지는 약 10시간 정도가 소요될 수 있다.
화학식 I의 화합물의 합성의 상세한 예는 아래 실시예에서 찾을 수 있다.
본 발명 화합물의 추가적 제조 방법
본 발명의 화합물은 상기 화합물의 유리 염기 형태를 제약상 허용가능한 무기 또는 유기 산과 반응시켜, 제약상 허용가능한 산 부가염으로서 제조할 수 있다. 다르게는, 본 발명의 화합물의 제약상 허용가능한 염기 부가염은 상기 화합물의 유리 산 형태를 제약상 허용가능한 무기 또는 유기 염기와 반응시켜 제조할 수 있다.
다르게는, 본 발명의 화합물의 염 형태는 출발 물질 또는 중간체의 염을 사용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 화합물의 유리 산 또는 유리 염기 형태는 상응하는 염기 부가염 또는 산 부가염 형태로부터 각각 제조할 수 있다. 예를 들어, 산 부가염 형태의 본 발명의 화합물은 적합한 염기 (예를 들어, 수산화암모늄 용액, 수산화나트륨 등)로 처리하여 상응하는 유리 염기로 전환시킬 수 있다. 염기 부가염 형태의 본 발명의 화합물은 적합한 산 (예를 들어, 염산 등)으로 처리하여 상응하는 유리 산으로 전환시킬 수 있다.
비산화된 형태의 본 발명의 화합물은 0 내지 80℃에서 적합한 비활성 유기 용매 (예를 들어, 아세토니트릴, 에탄올, 수성 디옥산 등) 중에서 본 발명의 화합물의 N-옥시드로부터 환원제 (예를 들어, 황, 이산화황, 트리페닐 포스핀, 리튬 보로히드라이드, 소듐 보로히드라이드, 포스포러스 트리클로라이드, 트리브로마이드 등)로 처리하여 제조할 수 있다.
본 발명의 화합물의 프로드러그 유도체는 당업자에게 공지된 방법 (예를 들어, 추가의 상세사항은 문헌 [Saulnier et al., (1994), Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, Vol. 4, p. 1985] 참고)으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 적당한 프로드러그는 본 발명의 비-유도체화된 화합물을 적합한 카르바밀화제 (예를 들어, 1,1-아실옥시알킬카르바노클로리데이트, 파라-니트로페닐 카보네이트 등)와 반응시켜 제조할 수 있다.
본 발명의 화합물의 보호된 유도체는 당업자에게 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 보호기의 생성 및 그들의 제거에 적용가능한 기술에 대한 상세한 설명은 문 헌 [T. W. Greene, "Protecting Groups in Organic Chemistry", 3rd edition, John Wiley and Sons, Inc., 1999]에서 찾을 수 있다.
본 발명의 화합물은 편리하게는 본 발명의 진행 도중 용매화물 (예를 들어, 수화물)로서 제조 또는 형성될 수 있다. 본 발명의 화합물의 수화물은 편리하게는 디옥신, 테트라히드로푸란 또는 메탄올과 같은 유기 용매를 사용하여, 수성/유기 용매 혼합물로부터의 재결정화에 의하여 제조할 수 있다.
본 발명의 화합물은 상기 화합물의 라세미 혼합물을 광학 활성 분할제와 반응시켜 부분입체이성질체 화합물 쌍을 형성하고, 부분입체이성질체들을 분리하고, 광학적으로 순수한 거울상이성질체를 회수함으로써, 그들의 개별 입체이성질체로서 제조할 수 있다. 거울상이성질체의 분할은 본 발명의 화합물의 공유 부분입체이성질성 유도체를 사용하여 수행할 수 있지만, 분리가능한 복합체가 바람직하다 (예를 들어, 결정성 부분입체이성질성 염). 부분입체이성질체는 별개의 물성 (예를 들어, 융점, 비점, 용해도, 반응성 등)을 갖고, 이러한 차이점을 이용하여 쉽게 분리할 수 있다. 부분입체이성질체는 크로마토그래피에 의하여, 또는 바람직하게는 용해도 차이에 기초하는 분리/분할 기술에 의하여 분리될 수 있다. 이때 광학적으로 순수한 거울상이성질체는 라세미화를 일으키지 않는 임의의 실무적 방법에 의해서 분할제와 함께 회수된다. 화합물의 라세미 혼합물로부터의 그의 입체이성질체의 분할에 적용가능한 기술의 더욱 상세한 설명은 문헌 [Jean Jacques, Andre Collet, Samuel H. Wilen, "Enantiomers, Racemates and Resolutions", John Wiley And Sons, Inc., 1981]에서 찾을 수 있다.
요약하면, 화학식 I의 화합물은 하기의 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조할 수 있다.
(a) 반응식 I의 단계; 및
(b) 임의로 본 발명의 화합물을 제약상 허용가능한 염으로 전환시키는 단계;
(c) 임의로 본 발명의 화합물의 염 형태를 염이 아닌 형태로 전환시키는 단계;
(d) 임의로 본 발명의 화합물의 비산화된 형태를 제약상 허용가능한 N-옥시드로 전환시키는 단계;
(e) 임의로 본 발명의 화합물의 N-옥시드 형태를 그의 비산화된 형태로 전환시키는 단계;
(f) 임의로 본 발명의 화합물의 이성질체 혼합물로부터 개별 이성질체를 분할하는 단계;
(g) 임의로 본 발명의 비-유도체화된 화합물을 제약상 허용가능한 프로드러그 유도체로 전환시키는 단계; 및
(h) 임의로 본 발명의 화합물의 프로드러그 유도체를 비-유도체화된 형태로 전환시키는 단계.
출발 물질의 제법을 특별히 기재하지 않는 한, 상기 화합물은 공지되어 있거나, 당업계에 공지된 방법과 유사하게 또는 이후의 실시예에 개시된 바와 같이 제조할 수 있다.
당업자는 상기 변형이 본 발명의 화합물의 제조 방법에 대한 예일 뿐, 주지된 기타의 방법도 유사하게 사용할 수 있음을 인식하게 될 것이다.
본 발명은 본 발명에 따른 화학식 I의 화합물의 제법을 예시하는 하기 실시예로 추가로 예시되지만, 여기에 한정되지는 않는다.
달리 나타내지 않는다면, 물질들은 상업적 공급자로부터 얻고, 정제하지 않고 사용하였다. 감압 하에서의 용매의 제거는 진공 펌프 (~ 3 mmHg)에 부착된 부치(Buchi) 회전 증발기를 사용하는 증류를 가리킨다. 고체 또는 고비등성 오일로서 수득한 생성물은 진공 (~ 1 mmHg) 하에 건조시켰다.
역상 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)는 용리액으로서 물-아세토니트릴 (0.035％ TFA)을 사용하여, C18 칼럼 (페노메넥스(Phenomenex))을 갖춘 베리언(Varian) 크로마토그래피 시스템 (프로스타(ProStar) 모델 210)을 사용하여 수행하였다. 1H NMR 스펙트럼은 브루커(Bruker) XWIN-NMR (400 MHz 또는 600 MHz)로 기록하였다. 양자 공명은 테트라메틸실란 (TMS)으로부터 낮은쪽 장으로 백만분의 일 (ppm)로 기록하였다. 1H NMR 데이터는 다중도 (s 단일선, d 이중선, t 삼중선, q 사중선, quint 오중선, sept 7중선, dd 이중 이중선, dt 이중 삼중선, bs 폭넓은 단일선), 양자의 개수 및 커플링 상수 (Hertz)로서 기록하였다. DMSO-d 6 , CD3OD에서 수득한 스펙트럼에 있어서, 잔류 양자 (각각 2.50 및 3.31 ppm)를 표준으로서 사용하였다.
분석용 박층 크로마토그래피 (TLC)는 시판되는 실리카 플레이트 (머크(Merck) 60-F 254, 0.25 mm 두께)에서 수행하였고; 화합물을 UV 광 (254 nm)에 노출시켰다. 플래시 크로마토그래피는 실리카 겔 (머크 키젤겔(Merck Kieselgel) 60, 230-400 메쉬)을 사용하여 수행하였다.
애질런트(Agilent) 1100 시리즈 액체 크로마토그래프/질량 선택적 검출기 (LC/MSD)를 사용하여 반응의 진행을 모니터링하고, 254 nm, 220 nm 파장, 및 전기분무 이온화 (ESI) 양성 모드를 사용하여 생성물의 순도를 체크하였다. 질량 스펙트럼은 ESI 양성 모드로 수득하였다.
(5-브로모-티아졸-2-일)-아릴-아민은, 특별히 나타내지 않는 한, 아릴 티오우레아로부터 2단계로 합성하였다. 전형적인 절차는 아래에 예시한다. 에탄올 (3 ㎖) 중 아릴티오우레아 (1.67 mmol) 및 1,2-디클로로-1-에톡시-에탄 (0.286 g, 2.00 mmol)의 용액을 75℃에서 12시간 동안 밀봉된 바이알 내에서 교반하면서 가열하였다. 이어서, 진공에서 농축시켜 조질의 아릴티아졸-2-일-아민을 오일 또는 고체로서 얻었다. 조질의 아릴티아졸-2-일-아민을 추가로 정제하지 않고 다음 단계에 사용하였다. 에탄올로부터의 재결정화에 의해서 순수한 아릴티아졸-2-일 아민을 수득할 수 있었다. 아세트산 중 조질의 아릴티아졸-2-일-아민 (0.42 mmol)의 교반 용액에 아세트산 (0.42 mmol) 중 브롬을 첨가하였다. 반응물을 추가로 1시간 동안 실온에서 교반한 후, 용매를 진공에서 제거하였다. 생성된 잔류물을 HPLC (C18 칼 럼, TFA가 0.035％인 CH3CN/H2O로 용출됨)로 정제하여 (5-브로모-티아졸-2-일)-아릴-아민을 고체로서 얻었다.
실시예 1
(5- 클로로 -티아졸-2- 일 )-(4-플루오로-페닐)-아민
Figure 112008015051082-PCT00003
THF (5 ㎖) 중 (4-플루오로-페닐)-티아졸-2-일-아민 (60 ㎎, 0.31 mmol)의 용액에 N-클로로숙신이미드 (42 ㎎, 0.31 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 용매를 진공에서 제거하였다. 생성된 잔류물을 HPLC (C18 칼럼, TFA가 0.035％인 CH3CN/H2O로 용출됨)로 정제하여 표제 화합물을 회백색 고체로서 얻었다.
Figure 112008015051082-PCT00004
실시예 2
(4-플루오로-페닐)-(5-요오도-티아졸-2- 일 )-아민
Figure 112008015051082-PCT00005
THF (5 ㎖) 중 (4-플루오로-페닐)-티아졸-2-일-아민 (60 ㎎, 0.31 mmol)의 용액에 N-요오도숙신이미드 (70 ㎎, 0.31 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 용매를 진공에서 제거하였다. 생성된 잔류물을 HPLC (C18 칼럼, TFA가 0.035％인 CH3CN/H2O로 용출됨)로 정제하여 표제 화합물을 회백색 고체로서 얻었다.
Figure 112008015051082-PCT00006
실시예 3
(5-브로모-티아졸-2- 일 )-(4-플루오로-페닐)-메틸-아민
Figure 112008015051082-PCT00007
DMF (1 ㎖) 중 (4-플루오로-페닐)-티아졸-2-일-아민 (97 ㎎, 0.5 mmol)의 용액을 0℃로 냉각시키고, NaH (광유 중 60％ 분산액, 40 ㎎, 1.0 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 0℃에서 10분 동안 교반한 후, 요오도메탄 (142 ㎎, 1.0 mmol)을 첨가하였다. 실온에서 12시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 포화 수성 NH4Cl (10 ㎖)로 켄칭시키고, 에틸 아세테이트 (10 ㎖ × 2)로 추출하였다. 유기층을 합치고, 물 (10 ㎖) 및 포화 염수 (10 ㎖)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 진공에서 용매를 제거한 후, 생성된 (4-플루오로-페닐)-메틸-티아졸-2-일-아민을 표준 브롬화 절차에 적용하고 HPLC 정제한 후, 표제 화합물을 회백색 고체로서 얻었다.
Figure 112008015051082-PCT00008
실시예 4
N-(5- 브로모 -티아졸-2-일)-벤젠-1,4- 디아민
Figure 112008015051082-PCT00009
에탄올 (5 ㎖) 중 (4-니트로-페닐)-티아졸-2-일-아민 (60 ㎎, 0.2 mmol) 및 SnCl2ㆍH2O (185 ㎎, 0.8 mmol)의 용액을 75℃에서 4시간 동안 가열하였다. 용매를 진공에서 제거하고, 포화 수성 Na2CO3 (5 ㎖) 및 에틸 아세테이트 (5 ㎖)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 셀라이트를 통해서 여과하고, 에틸 아세테이트 층을 분리하고, 건조시키고 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 HPLC (C18 칼럼, TFA가 0.035％인 CH3CN/H2O로 용출됨)로 정제하여 표제 화합물을 고체로서 얻었다.
Figure 112008015051082-PCT00010
실시예 5
N-[4-(5-브로모-티아졸-2- 일아미노 )-페닐]-벤즈아미드
Figure 112008015051082-PCT00011
(4-니트로-페닐)-티아졸-2-일-아민 (200 ㎎)을 MeOH (30 ㎖)에 용해시키고, 50 psi에서 Pd/C (10％, 250 ㎎)의 존재 하에 12시간 동안 수소화시켰다. 촉매를 여과해내고, 용매를 제거하여 N-티아졸-2-일-벤젠-1,4-디아민 (0.16 g, 92％)을 얻었다. N-티아졸-2-일-벤젠-1,4-디아민 (30 ㎎, 0.16 mmol)을 CH2Cl2 (2 ㎖) 중 트리에틸아민 (32 ㎎, 0.31 mmol)의 존재 하에 2시간 동안 염화벤조일 (24 ㎎, 0.17 mmol)로 처리하였다. 반응물을 포화 수성 Na2CO3 (10 ㎖)로 켄칭시키고, 에틸 아세테이트 (10 ㎖ × 2)로 추출하였다. 에틸 아세테이트 층을 합치고, 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 진공에서 용매를 제거한 후, N-[4-(티아졸-2-일아미노)-페닐]-벤즈아미드를 수득하였다. 이어서, 조질의 티아졸을 표준 브롬화 절차에 적용하고 HPLC 정제한 후, 표제 화합물을 백색 고체로서 얻었다.
Figure 112008015051082-PCT00012
실시예 6
4-(5-브로모-티아졸-2- 일아미노 )-벤조산
Figure 112008015051082-PCT00013
디옥산-H2O (1:1, 20 ㎖) 중 4-(티아졸-2-일아미노)-벤조산 에틸 에스테르 (0.15 g, 0.60 mmol) 및 KOH (0.14 g, 2.4 mmol)의 용액을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 pH가 4-5 (pH 시험지로 모니터링함)가 될 때까지 염산으로 산성화시켰다. 생성된 침전물을 여과에 의해서 모아서 4-(티아졸-2-일아미노)-벤조산을 회백색 고체로서 얻었다. 4-(티아졸-2-일아미노)-벤조산을 표준 브롬화 절차에 적용하여 표제 화합물을 얻었다.
Figure 112008015051082-PCT00014
실시예 7
4-(5- 브로모 -티아졸-2- 일아미노 )-N-(2-모르폴린-4-일-에틸)- 벤즈아미드 TFA 염
Figure 112008015051082-PCT00015
DMF (2 ㎖) 중 4-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-벤조산 (24, 60 ㎎, 0.20 mmol), 2-모르폴린-4-일-에틸아민 (78 ㎎, 0.6 mmol), 및 N,N-디이소프로필에틸-아민 (77 ㎎, 0.6 mmol)의 용액에 HATU (91 ㎎, 0.24 mmol)를 첨가하였다. 생성된 용액을 1시간 동안 실온에서 교반하고, 용매를 진공에서 제거하였다. 잔류물을 HPLC (C18 칼럼, TFA가 0.035％인 CH3CN/H2O로 용출됨)로 정제하여 표제 화합물을 TFA 염으로서 얻었다.
Figure 112008015051082-PCT00016
실시예 8
N-(5-브로모-티아졸-2- 일 )-벤즈아미드
Figure 112008015051082-PCT00017
DMF (5 ㎖) 중 2-아미노티아졸 (0.10 g, 1.0 mmol), 벤조산 (0.15 g, 1.2 mmol), N,N-디이소프로필에틸아민 (0.39 g, 3.0 mmol)의 용액에 HATU (0.46 g, 1.2 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 용매를 진공에서 제거하였다. 포화 수성 NH4Cl (10 ㎖)을 첨가하고, 혼합물을 CH2Cl2 (10 ㎖)로 추출하였다. CH2Cl2 층을 포화 수성 NaHCO3로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 용매를 진공에서 제거하고, 생성된 조질의 물질을 칼럼 크로마토그래피 (실리카 겔, 헥산-에틸 아세테이트)로 정제하여 N-티아졸-2-일-벤즈아미드를 백색 고체로서 얻었다. N-티아졸-2-일-벤즈아미드를 표준 브롬화 절차에 적용하고 HPLC 정제한 후, 표제 화합물을 얻었다.
Figure 112008015051082-PCT00018
실시예 9
1-(5- 브로모 -티아졸-2-일)-3- 페닐-우레아
Figure 112008015051082-PCT00019
THF (10 ㎖) 중 2-아미노티아졸 (0.1 g, 1.0 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸 아민 (0.39 g, 3.0 mmol)의 용액에 페닐 이소시아네이트 (0.12 g, 1.0 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 포화 수성 NH4Cl (10 ㎖)을 첨가하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트 (10 ㎖ × 2)로 추출하였다. 에틸 아세테이트 층을 합치고, 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 용매를 진공에서 증발시켜 1-페닐-3-티아졸-2-일-우레아를 백색 고체로서 얻었다. 1-페닐-3-티아졸-2-일-우레아를 표준 브롬화 절차에 적용하고, HPLC 정제 후에 표제 화합물을 얻었다.
Figure 112008015051082-PCT00020
실시예 10
(5- 브로모 -티아졸-2-일)-피리딘-2-일-아민
Figure 112008015051082-PCT00021
톨루엔 (25 ㎖) 중 2-클로로피리딘 (0.34 g, 3.0 mmol), 2-아미노티아졸 (0.314 g, 3.1 mmol), Na2CO3 (0.76 g, 7.2 mmol), Pd2(dba)3 (0.275 g, 0.3 mmol) 및 XantPhos (0.52 g, 0.9 mmol), H2O (54 ㎎, 3.0 mmol)의 용액을 100℃에서 12시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 여과한 후, 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 칼럼 크로마토그래피 (실리카 겔, CH2Cl2:MeOH:NH3 (MeOH 중 7 N) = 20:1:1로 용출됨)로 정제하여 피리딘-2-일-티아졸-2-일-아민을 얻은 후, 이것을 표준 브롬화 절차에 적용하고 HPLC 정제한 후, 표제 화합물을 회백색 고체로서 얻었다.
Figure 112008015051082-PCT00022
실시예 11
(5-브로모-티아졸-2- 일 )-피리딘-3- 일 -아민
Figure 112008015051082-PCT00023
3-피리딜티오우레아 (0.153 g, 1.0 mmol) 및 클로로-아세트알데히드 수용액 (50％, 0.127 ㎖)을 에탄올 (30 ㎖)에 용해시키고, 16시간 동안 60℃에서 교반하였다. 용매를 진공에서 제거하고, 생성된 잔류물을 표준 브롬화 절차에 적용하였다. HPLC 정제한 후, 표제 화합물을 회백색 고체로서 수득하였다.
Figure 112008015051082-PCT00024
적당한 출발 물질을 사용하여, 상기 예에 기술한 절차를 반복함으로써, 표 1에서 확인되는 바와 같은 하기의 화학식 I의 화합물을 수득하였다.
Figure 112008015051082-PCT00025
Figure 112008015051082-PCT00026
Figure 112008015051082-PCT00027
Figure 112008015051082-PCT00028
Figure 112008015051082-PCT00029
Figure 112008015051082-PCT00030
Figure 112008015051082-PCT00031
Figure 112008015051082-PCT00032
Figure 112008015051082-PCT00033
Figure 112008015051082-PCT00034
실시예 61
4- 브로모 - 아미노티아졸의 제조
Figure 112008015051082-PCT00035
(4- 플루오로 - 페닐 )- 카르밤산 tert -부틸 에스테르
THF (30 ㎖) 중 4-플루오로-페닐아민 (1.11 g, 10 mmol)의 용액에 1 N NaOH 수용액 (30 ㎖)을 첨가하였다. 얼음조를 사용하여 0℃로 냉각시킨 후, (Boc)2O (2.8 g, 12.8 mmol)를 조금씩 첨가하였다. 상기 용액을 실온에서 16시간 동안 교반하고, EtOAc (30 ㎖ × 2)로 추출하였다. 유기층을 합치고, 1 N HCl에 이어서 포화 NaHCO3로 세척하였다. 용매를 진공에서 제거하고, 잔류물을 칼럼 크로마토그래피 (실리카 겔, 헥산-EtOAc)로 정제하였다. 원하는 생성물을 회백색 고체로서 수득하였다.
Figure 112008015051082-PCT00036
(4- 브로모 -티아졸-2-일)-(4- 플루오로 - 페닐 )- 카르밤산 tert -부틸 에스테르
피리딘 (4 ㎖) 중 (4-플루오로-페닐)-카르밤산 tert-부틸 에스테르 (260 ㎎, 1.23 mmol), 2,4-디브로모티아졸 (100 ㎎, 0.41 mmol), 구리 분말 (26 ㎎, 0.41 mmol), CuCl (41 ㎎, 0.41 mmol), 및 KOAc (40 ㎎, 0.41 mmol)의 혼합물을 100℃에서 2시간 동안 가열하였다. 냉각시킨 혼합물을 EtOAc (30 ㎖)로 희석시키고, H2O (30 ㎖)로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 HPLC (C18 칼럼, TFA가 0.035％인 CH3CN/H2O로 용출됨)로 정제하여 표제 화합물을 고체로서 얻었다.
Figure 112008015051082-PCT00037
(4-브로모-티아졸-2- 일 )-(4-플루오로-페닐)-아민
염화메틸렌 (5 ㎖) 중 (4-브로모-티아졸-2-일)-(4-플루오로-페닐)-카르밤산 tert-부틸 에스테르 (10 ㎎, 0.027 mmol)의 용액에 TFA (1 ㎖)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하고 농축시켰다. 잔류물을 HPLC (C18 칼럼, TFA가 0.035％인 CH3CN/H2O로 용출됨)로 정제하여 표제 화합물을 고체로서 얻었다.
Figure 112008015051082-PCT00038
검정
본 발명의 화합물을, Aurora 키나제를 선택적으로 억제하는 그들의 능력을 측정하기 위하여 검정하였다 또한, 상기 화합물을 Abl, Bcr-Abl, Bmx, CDK1/cyclinB, CHK2, Fes, FGFR3, Flt3, GSK3β, JNK1α1, Lck, MKK4 및 TrkB 키나제를 억제하는 그들의 능력을 측정하기 위하여 검정하였다.
Aurora 키나제
키나제 활성은 키나제 완충액 (50 mM OPS (pH 7.0), 10 mM MgCl2, 1 mM DTT) 중 1웰 당 0.1 ㎍의 키나제를 사용하여 384 웰 프록시플레이트(ProxiPlates)에서 수행하였다. 화합물들을, 1 μM ATP, 33Pγ-ATP를 함유하는 키나제 완충액 중 10 μM의 최종 농도로 각 웰에 옮겼다. IC50 측정에 대해서는, 10 μM ATP의 최종 농도를 사용하였다. 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시킨 후, 1 M ATP, 1 mM EDTA 및 50 ㎎/㎖ SPA 비드 (아머샴/파마시아/지이 헬스(Amersham/Pharmacia/GE health))로 반응을 종결시키고, 탑카운트(TopCount)로 계수하였다. 키나제 활성의 억제가 50％를 초과하는 화합물을 IC50을 측정하기 위해서 재시험하였다.
세포 검정: 히스톤 H3 ser 10 인산화: 12 웰 플레이트에 플레이팅한 5만개의 HeLa 세포를 100 ng/㎖ 노코다졸로 20시간 동안 처리한 후, 화합물과 함께 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 2배 샘플 완충액에서 용해시켰다. 1웰 당 세포의 1/3인 총 세포 추출물 샘플을 SDS-PAGE, 및 항 포스포 세린 10 히스톤 H3 (셀 시그널링(Cell Signaling))를 사용한 웨스턴 블로팅에 적용하여 인산화 상태를 측정하였다.
FACS 분석: HeLa를 다양한 기간 동안 화합물로 처리하였다. 세포를 트립신처리하고, PBS로 1회 세척하고, 20분 동안 -20℃에서 고정시켰다. 세포를 PBS, 1 mM EDTA, 100 ㎍/㎖ RNase에 재현탁시키고, 30분 동안 37℃에서 인큐베이션시킨 후, 10 ㎍/㎖ 최종 농도의 요오드화프로피듐 (PI)을 첨가하였다. 세포 주기 분포를 베크먼(Beckman) 팩스칼리버(FACScalibur)(상표명) (비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences))로 측정하고, 플로우조(FlowJo)(상표명) (트리스타(Treestar))로 분석하였다.
고속 처리 현미경검사법 (HTM): 다르게는, 세포 주기 분포를 다음과 같이 384-웰 플레이트를 영상화할 수 있는 공초점 현미경 시스템을 사용하여 정량화시켰다. 4천개의 HeLa 세포를 384 웰 플레이트의 각 웰에 플레이팅하고, 24시간 후에 다양한 농도의 화합물을 첨가하고, 플레이트를 4％ 파라포름알데히드로 고정시키고, DAPI로 염색하였다. 각 웰로부터의 영상은 자동으로 입수되었고, EIDAQ 100 고속 처리 현미경검사법(High Throughput Microscopy: HTM) (Q3DM/베크먼 코울터(Beckman Coulter))으로 분석하였다.
세포 증식 검정: 세포를 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 일련의 화합물 희석액에 적용하였다. 48시간 후에, 세포 생존율을 제조사의 프로토콜에 따라서 셀타이터96(CellTiter96)(등록상표) (프로메가(Promega))을 사용하여 측정하였다.
현미경검사법: Hela 세포를 덮개 유리에 플레이팅하고, 20시간 후에 각종 화합물로 처리하였다. 화합물 처리는 덮개 유리를 PBS로 2회 세척하고, 그들을 4％ 파라포름알데히드로 37℃에서 10분 동안 고정시킴으로써 종결시켰다. 덮개 유리를 PBS로 세척하고, 그 후에 최소 1시간 동안 블로킹 용액 (PBS 0.1％ 트리톤 X-100 및 5％ BSA) 중에 인큐베이션시켰다. 덮개 유리를 1시간 동안 블로킹 용액 (5％ BSA 함유) 중 1:300 항-포스포 세린 10 히스톤 H3로 염색한 후, 1시간 동안 블로킹 용액 중 1:1000 항 토끼 Cy3와 함께 인큐베이션시켰다. 일부 경우에는, 덮개 유리를 블로킹 용액 중 FITC 표지된 항-B-튜불린으로도 염색하였다.
세포성 BCR - Abl 의존성 증식의 억제 (고속 처리법)
사용한 뮤린(murine) 세포주는 BCR-Abl cDNA로 형질전환된 32D 조혈 전구 세포주이다 (32D-p210). 이 세포를 페니실린 50 ㎍/㎖, 스트렙토마이신 50 ㎍/㎖ 및 L-글루타민 200 mM로 보충한 RPMI/10％ 송아지 태아 혈청 (RPMI/FCS) 중에 유지하였다. 형질전환되지 않은 32D 세포는 IL3의 공급원으로서 15％의 WEHI 조건화 배지를 첨가하여 유사하게 유지하였다.
50 ㎕의 32D 또는 32D-p210 세포 현탁액을 그라이너(Greiner) 384 웰 마이크로플레이트 (블랙)에 1웰 당 5000개 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 50 nl의 시험 화합물 (DMSO 원액 중 1 mM)을 각 웰에 첨가하였다 (STI571은 양성 대조군으로서 포함됨). 세포를 72시간 동안 37℃, 5％ CO2에서 인큐베이션시켰다. 10 ㎕의 60％ 알라마르 블루(Alamar Blue) 용액 (텍 다이아그노스틱스(Tek diagnostics))을 각 웰에 첨가하고, 세포를 추가로 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 형광 강도 (530 ㎚에서 여기, 580 ㎚에서 방출)를 액퀘스트(Acquest)(상표명) 시스템 (몰리큘러 디바이시즈(Molecular Devices))을 사용하여 정량화하였다.
세포성 BCR - Abl 의존성 증식의 억제
32D-p210 세포를 96 웰 TC 플레이트에 1웰 당 15,000개 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 시험 화합물 (Cmax는 40 μM)의 2배 순차 희석액 50 ㎕를 각 웰에 첨가하였다 (STI571은 양성 대조군으로서 포함됨). 세포를 48시간 동안 37℃, 5％ CO2에서 인큐베이션시킨 후, MTT (프로메가) 15 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 세포를 추가로 5시간 동안 인큐베이션시켰다. 570 ㎚에서의 광학 밀도를 분광광도계로 정량화하고, 용량 반응 곡선으로부터, 50％ 억제에 필요한 화합물의 농도인 IC50 값을 결정하였다.
세포 주기 분포에 대한 효과
32D 및 32D-p210 세포를 6 웰 TC 플레이트에, 배지 5 ㎖ 중 1웰 당 2.5×106개 세포로 플레이팅하고, 1 또는 10 μM의 시험 화합물을 첨가하였다 (STI571은 대조군으로서 포함됨). 이어서 세포를 24 또는 48시간 동안 37℃, 5％ CO2에서 인큐베이션시켰다. 세포 현탁액 2 ㎖를 PBS로 세척하고, 70％ EtOH 중에서 1시간 동안 고정시키고, PBS/EDTA/RNase A로 30분 동안 처리하였다. 요오드화프로피듐 (Cf = 10 ㎍/㎖)을 첨가하고, 형광 강도를 팩스칼리버(상표명) 시스템 (비디 바이오사이언시즈)에서 유세포 분석법으로 정량화하였다. 본 발명의 시험 화합물은 32D-p210 세포에 대한 아폽토시스성 효과를 나타내는 것으로 입증되었으나, 32D 모세포에서는 아폽토시스를 유발하지 않았다.
세포성 BCR - Abl 자가인산화에 대한 효과
BCR-Abl 자가인산화를 c-abl 특이적 포획 항체 및 항포스포티로신 항체를 사용하여 포획 엘리자(Elisa)로 정량화하였다. 32D-p210 세포를 96 웰 TC 플레이트에 배지 50 ㎕ 중 1웰 당 2×105개 세포로 플레이팅하였다. 시험 화합물 (Cmax는 10 μM)의 2배 순차 희석액 50 ㎕를 각 웰에 첨가하였다 (STI571은 양성 대조군으로서 포함됨). 세포를 90분 동안 37℃, 5％ CO2에서 인큐베이션시켰다. 이어서 세포를 1시간 동안 얼음에서 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 함유하는 용해 완충액 (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM EGTA 및 1％ NP-40) 150 ㎕로 처리하였다. 세포 용해물 50 ㎕를, 항-abl 특이적 항체로 미리 코팅시키고 블로킹한 96 웰 광학플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 4시간 동안 4℃에서 인큐베이션시켰다. TBS-Tween 20 완충액으로 세척한 후, 알칼리-포스파타제 콘쥬게이션된 항-포스포티로신 항체 50 ㎕를 첨가하고, 플레이트를 밤새 4℃에서 추가로 인큐베이션시켰다. TBS-Tween 20 완충액으로 세척한 후, 발광성 기질 90 ㎕를 첨가하고, 발광을 액퀘스트(상표명) 시스템 (몰리큘러 디바이시즈)을 사용하여 정량화하였다. BCR-Abl 발현 세포의 증식을 억제하는 본 발명의 시험 화합물은 세포성 BCR-Abl 자가인산화를 용량-의존적 방식으로 억제하였다.
Bcr - abl 의 돌연변이 형태를 발현하는 세포의 증식에 대한 효과
본 발명의 화합물을 BCR-Abl의 야생형 또는 STI571에 대하여 내성이 부여되거나 민감성이 감소된 돌연변이 형태 (G250E, E255V, T315I, F317L, M351T)를 발현하는 Ba/F3 세포에 대한 그들의 항증식성 효과에 대하여 시험하였다. 돌연변이-BCR-Abl 발현 세포 및 형질전환되지 않은 세포에 대한 상기 화합물의 항증식성 효과를 (IL3 결핍 배지 중) 앞서 기재한 바와 같이 10, 3.3, 1.1 및 0.37 μM에서 시험하였다. 형질전환되지 않은 세포에 대하여 독성이 없는 화합물의 IC50 값을 앞서 기재한 바와 같이 수득한 용량 반응 곡선으로부터 결정하였다.
FGFR3 (효소 검정)
정제된 FGFR3 (업스테이트(Upstate))를 이용한 키나제 활성 검정을 키나제 완충액 (30 mM Tris-HCl (pH 7.5), 15 mM MgCl2, 4.5 mM MnCl2, 15 μM Na3V04 및 50 ㎍/㎖ BSA) 및 기질 (5 ㎍/㎖ 비오틴-폴리-EY(Glu, Tyr) (시아이에스-유에스, 인코퍼레이티드(CIS-US, Inc.)) 및 3 μM ATP) 중 효소 0.25 ㎍/㎖를 함유하는 최종 부피 10 ㎕ 중에서 실시하였다. 2종의 용액을 제조하였다. 키나제 완충액 중 FGFR3 효소를 함유하는 제1 용액 5 ㎕를 먼저 384-포맷 프록시플레이트(등록상표) (퍼킨-엘머(Perkin-Elmer))에 분배한 후, DMSO에 용해시킨 화합물 50 nL를 첨가하고, 이어서 키나제 완충액 중 기질 (폴리-EY) 및 ATP를 함유하는 제2 용액 5 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시키고, 30 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.5 M KF, 50 mM ETDA, 0.2 ㎎/㎖ BSA, 15 ㎍/㎖ 스트렙트아비딘-XL665 (시아이에스-유에스, 인코퍼레이티드) 및 150 ng/㎖ 크립테이트 콘쥬게이션된 항-포스포티로신 항체 (시아이에스-유에스, 인코퍼레이티드)를 함유하는 HTRF 검출 혼합물 10 ㎕를 첨가하여 중지시켰다. 실온에서 1시간 인큐베이션시켜 스트렙트아비딘-비오틴을 상호작용시킨 후, 애널리스트 지티(Analyst GT) (몰리큘러 디바이시즈 코퍼레이션(Molecular Devices Corp.))로 시분해 형광 신호를 판독하였다. 12가지 농도 (50 μM에서 0.28 nM까지의 1:3 희석)에서 각 화합물의 억제 백분율의 선형 회귀 분석에 의해서 IC50 값을 계산하였다. 상기 검정에서, 본 발명의 화합물의 IC50 값은 10 nM 내지 2 μM의 범위였다.
FGFR3 (세포 검정)
본 발명의 화합물을, FGFR3 세포 키나제 활성에 의존적인, 형질전환된 Ba/F3-TEL-FGFR3 세포 증식을 억제하는 그들의 능력에 대하여 시험하였다. Ba/F3-TEL-FGFR3를 배양 배지로서 10％ 소 태아 혈청을 보충한 RPMI 1640을 이용하여, 현탁액 중 1 ㎖ 당 800,000개 이하의 세포로 배양하였다. 세포를 384-웰 포맷 플레이트에 50 ㎕ 배양 배지 중 1웰 당 5000개 세포로 분배하였다. 본 발명의 화합물을 디메틸술폭시드 (DMSO)에 용해 및 희석시켰다. 12가지 1:3 순차 희석액을 DMSO 중에 제조하여 전형적으로 10 mM 내지 0.05 μM 범위의 농도 구배를 생성하였다. 세포에 희석 화합물 50 nL를 첨가하고, 세포 배양 인큐베이터에서 48시간 동안 인큐베이션시켰다. 증식하는 세포에 의해 생성되는 환원 환경을 모니터링하는데 사용할 수 있는 알라마르블루(등록상표) (트렉 다이아그노스틱 시스템즈(TREK Diagnostic Systems))를 세포에 최종 농도 10％로 첨가하였다. 37℃ 세포 배양 인큐베이터에서 추가로 4시간 인큐베이션시킨 후, 환원된 알라마르블루(등록상표) (530 ㎚에서 여기, 580 ㎚에서 방출)로부터의 형광 신호를 애널리스트 지티 (몰리큘러 디바이시즈 코퍼레이션)로 정량화하였다. 12가지 농도에서의 각 화합물의 억제 백분율의 선형 회귀 분석에 의해 IC50 값을 계산하였다.
FLT3 및 PDGFR β (세포 검정)
FLT3의 세포 활성에 대한 본 발명의 화합물의 효과를, Ba/F3-TEL-FGFR3 대신 Ba/F3-FLT3-ITD를 사용한 것을 제외하고는, FGFR3 세포 활성에 대하여 앞서 기재한 바와 동일한 방법을 사용하여 수행하였다.
업스테이트 키나제프로파일러 ( Upstate KinaseProfiler )(상표명) - 방사능-효소 필터 결합 검정
본 발명의 화합물을 키나제 패널의 개별 구성원을 억제하는 그들의 능력에 대하여 평가하였다. 다음의 일반적인 프로토콜에 따라, 최종 농도 10 μM에서 화합물을 이중으로 시험하였다. 키나제 완충액 조성 및 기질은 "업스테이트 키나제프로파일러(상표명)" 패널에 포함된 여러 키나제마다 다르다는 것을 주의한다. 키나제 완충액 (2.5 ㎕, 1O× - 필요한 경우 MnCl2 함유), 활성 키나제 (0.001-0.01 유닛; 2.5 ㎕), 키나제 완충액 중 특정 또는 폴리(Glu4-Tyr) 펩티드 (5-500 μM 또는 0.01 ㎎/㎖) 및 키나제 완충액 (50 μM; 5 ㎕)을 얼음에서 에펜도르프 내에서 혼합하였다. Mg/ATP 믹스 (10 ㎕; 67.5 (또는 33.75) mM MgCl2, 450 (또는 225) μM ATP 및 1 μCi/㎕[γ-32P]-ATP (3000 Ci/m㏖))를 첨가하고, 반응물을 약 30℃에서 약 10분 동안 인큐베이션시켰다. 2 ㎝ × 2 ㎝ P81 (포스포셀룰로스, 양성 전하를 띠는 펩티드 기질용) 또는 와트먼 1호(Whatman No.1) (폴리(Glu4-Tyr)펩티드 기질용) 페이퍼 스퀘어 위에 반응 혼합물을 스포팅 (20 ㎕)하였다. 검정용 스퀘어를 0.75％ 인산으로 각 5분씩 4회 세척하고, 아세톤으로 5분 동안 1회 세척하였다. 검정용 스퀘어를 섬광 바이알로 옮기고, 섬광 칵테일 5 ㎖를 첨가하고, 펩티드 기질에 대한 32P 혼입 (cpm)을 베크먼 섬광 계수기로 정량화하였다. 억제 백분율을 각 반응에 대하여 계산하였다.
유리 형태 또는 제약상 허용가능한 염 형태의 화학식 I의 화합물은, 예를 들어, 본 출원에 기재한 시험관 내 시험에 의해 나타낸 바와 같은 유용한 약리 특성을 나타내었다. 예를 들어, 화학식 I의 화합물은 바람직하게는 1×10-10 내지 1×10-5 M 범위, 바람직하게는 1 μM 미만, 더욱 바람직하게는 250 nM 미만, 더욱 바람직하게는 100 nM 미만의 IC50을 나타내었다. 바람직하게는 10 μM 농도에서의 화학식 I의 화합물은 바람직하게는 Abl, Aurora-A, Bcr-Abl, Bmx, CDK1/cyclinB, CHK2, Fes, FGFR3, Flt3, GSK3β, JNK1α1, Lck, MKK4 및 TrkB 키나제에 대하여 50％ 초과, 바람직하게는 약 80％ 초과의 억제 백분율을 나타내었다.
본원에 기재한 실시예 및 실시양태는 단지 예시를 위한 것이며, 그것으로 미루어보아 다양한 변경 또는 변화가 당업자에게 제안될 것이고, 그것이 본 출원의 취지 및 범위 그리고 첨부한 청구의 범위의 범주 내에 속하게 될 것임은 물론이다. 본원에서 언급한 모든 공보, 특허, 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다.

Claims (8)

  1. 하기 화학식 I의 화합물, 또는 그의 제약상 허용가능한 염, 수화물, 용매화물 또는 이성질체.
    [화학식 I]
    Figure 112008015051082-PCT00039
    식 중,
    n은 0, 1, 2 및 3으로부터 선택되고;
    m은 0 및 1로부터 선택되고;
    R1은 할로, 시아노, 히드록시, 니트로, C1 - 6알킬, C1 - 6알콕시, 할로-치환-C1 - 6알킬, 할로-치환-C1 - 6알콕시, -S(O)0-2R5, -NR5R5, -C(O)NR5R6, -C(O)NR5R6, -C(O)NR5XOR5, -C(O)NR5XNR5R5, -OR6, -C(O)OR5, -NR5C(O)R6로부터 선택되며; 여기서 각 R5는 수소 및 C1 - 6알킬로부터 독립적으로 선택되고; R6는 C6 - 10아릴-C0 - 4알킬, C1 - 10헤테로아릴-C0 - 4알킬, C3 - 12시클로알킬-C0 - 4알킬 및 C3 - 8헤테로시클로알킬-C0 - 4알킬로부터 선택되거나; 또는 n이 2인 경우에는, 인접한 두 R1 라디칼이, 그들 모두가 결합되어 있는 원자와 함께, 페닐을 형성하고;
    R2는 수소 및 메틸이고;
    R3는 할로이고;
    R4는 수소, 할로겐 및 C1 - 6알킬로부터 선택되거나; 또는 R3 및 R4는, R3 및 R4가 결합되어 있는 원자와 함께, 페닐을 형성하며; 고리 A는 임의로 3개 이하의 =C- 기가 =N-으로 대체될 수 있다.
  2. 제1항에 있어서, 고리 A가 페닐, 피리디닐 및 나프틸로부터 선택되고; m이 0이고; R3가 할로이며; R4가 수소인 화합물.
  3. 제2항에 있어서, R1이 메틸, 히드록시, 메톡시, 클로로, 플루오로, 브로모, 카르복시, 아미노, 시아노, 니트로, 메틸-술파닐, 트리플루오로메톡시, 트리플루오로메틸, 메틸-카르보닐, 에톡시-카르보닐, -C(O)NHR6, -C(O)NH(CH2)2OCH3, -C(O)NHCH(CH3)CH2OCH3, -C(O)N(CH3)(CH2)2OCH3, -C(O)NH(CH2)2OH, -C(O)NH(CH2)2N(CH3)2, -C(O)NH(CH2)2N(C2H5)2, -C(O)NHCH3, -NHC(O)R6, -NHC(O)CH3 및 -OR6로부터 선택되며; 여기서 R6는 페닐, 모르폴리노-에틸, 피리디닐 및 피롤리디닐-에틸로부터 선택되는 것인 화합물.
  4. 제1항에 있어서, (5-브로모-티아졸-2-일)-p-톨릴-아민; 4-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-페놀; (5-브로모-티아졸-2-일)-(4-메톡시-페닐)-아민; 4-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-벤조산; 4-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-N-(2-모르폴린-4-일-에틸)-벤즈아미드; 4-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-N-(2-메톡시-에틸)-벤즈아미드; (5-브로모-티아졸-2-일)-[4-(1-메틸아미노-비닐)-페닐]-아민; 3-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-벤조산; N-[4-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-페닐]-벤즈아미드; N-[4-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-페닐]-아세트아미드; 3-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-N-(2-메톡시-에틸)-벤즈아미드; 3-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-N-메틸-벤즈아미드; (5-브로모-티아졸-2-일)-[4-(피리딘-4-일옥시)-페닐]-아민; (5-브로모-티아졸-2-일)-(4-클로로-페닐)-아민; 벤조티아졸-2-일-(4-플루오로-페닐)-아민; 4-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-N-(2-히드록시-에틸)-벤즈아미드; 4-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-N-(2-디메틸아미노-에틸)-벤즈아미드; 4-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-N-(2-디에틸아미노-에틸)-벤즈아미드; N-(5-브로모-티아졸-2-일)-벤즈아미드; (5-브로모-티아졸-2-일)-(3-플루오로-페닐)-아민; (5-브로모-티아졸-2-일)-(3-트리플루오로메틸-페닐)-아민; (5-브로모-티아졸-2-일)-(3-메톡시-페닐)-아민; (5-브로모-티아졸-2-일)-m-톨릴-아민; (5-브로모-티아졸-2-일)-피리딘-2-일-아민; N-(5-브로모-티아졸-2-일)-벤젠-1,4-디아민; 1-[4-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-페닐]-에탄온; 4-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-벤조산 에틸 에스테르; (5-브로모-티아졸-2-일)-피리딘-4-일-아민; (5-브로모-티아졸-2-일)-피리딘-3-일-아민; N-(5-브로모-티아졸-2-일)-벤즈아미드; (5-브로모-티아졸-2-일)-(4-트리플루오로메틸-페 닐)-아민; 3-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-벤조산 에틸 에스테르; (5-브로모-티아졸-2-일)-페닐-아민; (5-브로모-티아졸-2-일)-(2-메톡시-페닐)-아민; (5-브로모-티아졸-2-일)-(4-플루오로-페닐)-아민; (5-클로로-티아졸-2-일)-(4-플루오로-페닐)-아민; (4-플루오로-페닐)-(5-요오도-티아졸-2-일)-아민; 4-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-벤조니트릴; (5-브로모-티아졸-2-일)-o-톨릴-아민; (5-브로모-티아졸-2-일)-나프탈렌-1-일-아민; (5-브로모-티아졸-2-일)-(2-플루오로-페닐)-아민; 3-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-벤조니트릴; (5-브로모-티아졸-2-일)-(3-메틸술파닐-페닐)-아민; (4-브로모-페닐)-(5-브로모-티아졸-2-일)-아민; (5-브로모-티아졸-2-일)-(4-페녹시-페닐)-아민; (5-브로모-티아졸-2-일)-(4-니트로-페닐)-아민; 4-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-N-(2-피롤리딘-1-일-에틸)-벤즈아미드; 4-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-N-(2-메톡시-1-메틸-에틸)-벤즈아미드; 및 4-(5-브로모-티아졸-2-일아미노)-N-(2-메톡시-에틸)-N-메틸-벤즈아미드로부터 선택되는 화합물.
  5. 치료 유효량의 제1항의 화합물을 제약상 허용가능한 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물.
  6. 치료 유효량의 제1항의 화합물을 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 키나제 활성의 억제가 질환의 병리상태 및/또는 증상을 예방, 억제 또는 완화시킬 수 있는 동물에서의 질환을 치료하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 키나제가 Abl, Aurora-A, Bcr-Abl, Bmx, CDK1/cyclinB, CHK2, Fes, FGFR3, Flt3, GSK3β, JNK1α1, Lck, MKK4 및 TrkB로부터 선택되는 것인 방법.
  8. Abl, Aurora-A, Bcr-Abl, Bmx, CDK1/cyclinB, CHK2, Fes, FGFR3, Flt3, GSK3β, JNK1α1, Lck, MKK4 및 TrkB의 키나제 활성이 질환의 병리상태 및/또는 증상의 원인이 되는 동물에서의 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에서 제1항의 화합물의 용도.
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