KR20080030889A

KR20080030889A - 돌연변이 ｄｎａ 중합효소들 및 그의 유전자들

Info

Publication number: KR20080030889A
Application number: KR1020060097450A
Authority: KR
Inventors: 이정현; 강성균; 김상진; 권개경; 이현숙; 김윤재; 배승섭; 임재규; 전정호; 조요나; 권석태
Original assignee: 한국해양연구원
Priority date: 2006-10-02
Filing date: 2006-10-02
Publication date: 2008-04-07
Also published as: EP2084283A4; EP2084283A1; US20110020896A1; WO2008041825A1; KR100844358B1; JP2010505410A

Abstract

본 발명은 돌연변이 DNA 중합효소들, 그의 유전자들 및 그들의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 써모코커스 속 NA1 (Thermococcus sp. NA1) 균주로부터 분리되고 특정 부위에 다중의 돌연변이화 (site-directed mutagenesis)를 유발시킨 DNA 중합효소들, 그의 아미노산 서열들, 상기 돌연변이 DNA 중합효소 유전자들, 그의 염기 서열들 및 이들을 중합효소 연쇄반응 (PCR) 등에 사용하는 용도에 관한 것이다. 본 발명의 돌연변이 DNA 중합효소는 기존 야생형 DNA 중합효소와 비교하여 프루프리딩 (proofreading) 활성저하와 이노신 감지 (inosine sensing) 기능을 효과적으로 변화시키어 보다 특이염기를 포함하는 프라이머를 이용한 중합연쇄반응이 신속하게 진행되게 하므로, PCR 을 포함한 다양한 분자유전학적 기술 등에 널리 응용될 수 있다.

돌연변이 DNA 중합효소, 써모코커스 속 NA1 균주, 다중 특정 부위 돌연변이화(site-directed mutagenesis), 엑소뉴클레아제(exonuclease), 이노신 감지(inosine sensing)

Description

돌연변이 ＤＮＡ 중합효소들 및 그의 유전자들 {Mutant DNA Polymerases and Their Genes}

도 1은 본 발명의 돌연변이 DNA 중합효소들을 전기영동한 결과를 나타낸 것이다. M, 표준 마커; W, 야생형; 1, 변이형 I; 2, 변이형 II; 3, 변이형 III

도 2는 본 발명의 돌연변이 DNA 중합효소들을 각각 이용하여 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 수행하고 그 결과를 나타낸 것이다. M, 표준 마커; W, 야생형; 1, 변이형 I; 2, 변이형 II; 3, 변이형 III

도 3은 본 발명의 돌연변이 DNA 중합효소들을 각각 이용하여 이노신을 함유한 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 수행하고 그 결과를 나타낸 것이다. M, 표준 마커; W, 야생형; 1, 변이형 I; 2, 변이형 II; 3, 변이형 III

도 4는 재조합 플라스미드 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.

본 발명은 돌연변이 DNA 중합효소들, 그의 유전자들 및 그들의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 써모코커스 속(Thermococcus sp.) 균주로부터 분리되고 특정 부위에 돌연변이화를 유발시킨 DNA 중합효소들, 그의 아미노산 서열들, 상기 돌연변이 DNA 중합효소를 암호화하는 유전자 및 이를 이용한 중합효소 연쇄반응 (PCR)에 관한 것이다.

최근 게놈 연구의 진보로 인하여 막대한 양의 유전자 서열 정보가 획득되어 왔다. 종래의 유전자 공학 및 게놈 연구 기술의 일반적인 조합과 함께, 몇몇의 고호열성 미생물의 게놈 서열은 생물공학 분야에서 열에 강한 효소라는 특성을 가지기 때문에 많은 관심을 받고 있으며, 다양한 열 안정적 효소가 생물공학적인 목적으로 개발되고 있다.

이러한 열 안정적인 호열성 DNA 중합효소와 이를 이용한 중합효소 연쇄반응 (PCR)은 단백질 및 유전자 연구에서 중요한 기여를 하고 있으며, 현재 생물학의 응용 분야에서 널리 사용되고 있다. 실제로 50개 이상의 DNA 중합효소 유전자들이 호열성 생물 및 고세균을 포함한 다양한 생물체로부터 클론되었으며, 최근에는 일반적인 Taq 중합효소 보다 프루프리딩 (proofreading) 활성도에 기초하여 PCR 에서 높은 충실도 (fidelity)를 가지는 고호열성 세균인 파이로코커스 속 (Pyrococcus sp.) 및 써모코커스 속 (Thermococcus sp.) 균주들로부터 B 패밀리 DNA 중합효소가 분리되어 널리 사용되었다. 그렇지만, 높은 충실도의 중합효소는 DNA 신장 능력 (elongation ability)에 있어 낮기 때문에 상기 장점에도 불구하고 많은 개선이 요구된다.

본 발명자들은 이미 PACMANUS 필드의 심해 열수 분출구 지역으로부터 새로운 고호열성 균주를 분리하고 16S rDNA 서열을 분석하여 써모코커스 속 (Thermococcus sp.) 균주로 동정한 다음, 이 균주로부터 열 안정적인 효소를 찾기 위하여 전체 게놈 (genome) 서열을 분석한 바 있었다. 상기 게놈 정보를 분석한 결과 상기 균주가 B 타입의 DNA 중합효소를 가지고 있는 것을 확인하고, 상기 균주로부터 DNA 중합효소에 해당하는 유전자를 클론하고 이 유전자를 대장균에서 발현시켰으며, 재조합 DNA 중합효소를 순수 분리하여 고-신장 능력 및 고-충실도를 가지는 DNA 중합효소에 대해 특허출원한 바 있었다 (대한민국 특허출원 제 2005-0094644호 참조).

그러나, 고-충실도 DNA 중합효소는 강한 엑소뉴클레아제 활성과 이노신 감지 (inosine sensing) 때문에 이노신을 포함하는 프라이머의 PCR에는 적당하지 않다. 따라서 대한민국 특허출원 2005-0094644호의 야생형 TNA1_pol DNA 중합효소를 이용하여 이노신을 포함하는 프라이머를 이용한 PCR 반응에 적합한 DNA 중합효소를 개발할 필요가 있었다.

이에 본 발명자들은 이노신을 포함하는 프라이머 사용에 적당한 DNA 중합효소를 개발하기 위하여 노력을 계속한 결과, 써모코커스 속 (Thermococcus sp.) 균주로부터 분리된 고호열성 DNA 중합효소를 이용하여 특정 부위에 돌연변이화를 유발시키고 엑소뉴클레아제 (exonuclease) 활성 및 이노신 감지 기능이 변화된 돌연변이 DNA 중합효소들을 선발하였고, 이들이 이노신을 포함하는 프라이머의 중합효소 연쇄반응에 유용하다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 돌연변이 DNA 중합효소들, 그 유전자들을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 목적을 위하여, 본 발명은 써모코커스 속 (Thermococcus sp.) 균주로부터 유래하고 대한민국 특허출원 2005-0094644호의 야생형 TNA1_pol DNA 중합효소 엑소뉴클레아제 (exonuclease) 활성 부위와 inosine 감지부위에 돌연변이화가 유발된 돌연변이 DNA 중합효소들을 제공한다.

상기 엑소뉴클레아제 활성 부위로는 Exo I 모티브, Exo II 모티브 및 Exo III 모티브 중에서 선택된 하나 이상인 것이 바람직하며 inosine-sensing 도메인에 돌연변이화가 하나 이상 동시에 유발된 돌연변이 DNA 중합효소를 제공한다.

본 발명의 제1의 양태는 서열번호 1의 91 내지 106의 아미노산 서열 및 205 내지 220의 아미노산 서열을 포함하는 DNA 중합효소를 제공한다. 보다 상세하게는 상기 DNA 중합효소가 서열번호 1의 91 내지 315의 아미노산 서열을 포함하는 DNA 중합효소를 제공한다. 보다 더 상세하게는 상기 DNA 중합효소가 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 DNA 중합효소를 제공한다. 또한 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 중합효소 유전자를 제공한다. 또한 DNA 중합효소 유전자를 포함하는 재조합벡터를 제공하고, 상기 재조합벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 제2의 양태는 서열번호 2의 91 내지 106의 아미노산 서열, 133 내지 148의 아미노산 서열, 205 내지 220의 아미노산 서열 및 300 내지 315의 아미노산 서열을 포함하는 DNA 중합효소를 제공한다. 보다 상세하게는 상기 DNA 중합효소가 서열번호 2의 91 내지 315의 아미노산 서열을 포함하는 DNA 중합효소이다. 보다 더 상세하게는 상기 DNA 중합효소가 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 DNA 중합효소이다. 또한 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 중합효소 유전자를 제공하며, 상기 DNA 중합효소 유전자를 포함하는 재조합벡터를 제공한다. 또한, 상기 재조합벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 제3의 양태는 서열번호 3의 91 내지 106의 아미노산 서열, 107 내지 122의 아미노산 서열, 133 내지 148의 아미노산 서열, 205 내지 220의 아미노산 서열 및 300 내지 315의 아미노산 서열을 포함하는 DNA 중합효소이다. 보다 상세하게는 상기 DNA 중합효소가 서열번호 3의 91 내지 315의 아미노산 서열을 포함하는 DNA 중합효소이다. 보다 더 상세하게는 상기 DNA 중합효소가 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 DNA 중합효소이다. 또한, 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호하는 DNA 중합효소 유전자를 제공하며, 상기 DNA 중합효소 유전자를 포함하는 재조합벡터를 제공한다. 또한, 상기 재조합벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 제4의 양태는 서열번호 DNA 중합효소 유전자를 포함하는 발현 플라스미드 및 이로 형질전환된 숙주생물을 이용하여 DNA 중합효소를 제조하는 방법을 제공한다. 보다 상세하게는 돌연변이 DNA 중합효소 유전자를 포함하는 발현 플라스미드로 형질전환된 미생물을 배양하고 재조합 단백질의 발현을 유도하여 돌연변이 중합효소 단백질을 분리하는 제조방법을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 "DNA 중합효소"는 상보적인 주형 DNA 가닥과 프라이머를 이용하여 뉴클레오타이드를 자라는 3'하이드록시 그룹에 연속적으로 첨가함으로써 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트로부터 5' -> 3'방향으로 DNA 를 합성하는 효소이다. 주형 가닥이 왓슨-크릭 염기쌍에 의해 첨가되어지는 뉴클레오타이드의 순서를 결정한다.

본 발명의 돌연변이 DNA 중합효소에는 그의 "기능적 동등물"도 포함될 수 있다. 여기서 기능적 동등물은 돌연변이 DNA 중합효소의 아미노산 서열들 중에서 일부 또는 전부가 치환되거나 아미노산의 일부가 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함된다. 이 때 아미노산의 치환은 보존적인 치환이 되는 것이 바람직하다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예를 들면 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황 함유 아미노산(Cys, Met). 또한, 이 때 아미노산의 결실은 DNA 중합효소의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치하는 것이 바람직하다.

본 발명은 돌연변이된 DNA 중합효소를 암호화하는 DNA 분절을 제공한다. 상기 "DNA 분절"에는 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 DNA 중합효소 및 그의 기능적 동등물 및 기능적 유도체를 코드하는 서열이 포함된다. 나아가, 본 발명은 상기 DNA 분절을 포함하는 각종 벡터, 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 파지미드, 파지, 바이러스 등의 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터를 만드는 방법은 당업계에 공지되어 있다.

본 발명에서 사용되는 벡터라는 용어는 또다른 핵산을 그것에 결합시켜 이송시킬 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 발현벡터란 용어는 상기 벡터에 의해 운반되는 각 재조합형 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 합성시킬 수 있는 플라스미드, 코스미드 또는 파아지를 포함한다. 바람직한 벡터는 그것이 결합된 핵산을 자기 복제 및 발현시킬 수 있는 벡터이다.

본 발명에서 사용되는 '형질전환'이란 용어는 외래 DNA 또는 RNA가 세포에 흡수되어 세포의 유전형이 변화되는 것을 말한다

숙주세포는 이에 제한 되는 것은 아니나, 원핵세포, 효모세포, 곤충세포를 포함한다. 바람직하기는 원핵세포 중에 대장균이 가장 바람직하다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

참고예 1. 야생형 중합효소 TNA1_pol 유전자의 클로닝 및 일차적 서열 분석

써모코커스 속 (Thermococcus sp.) NA1 균주는 파퓨아뉴기니 서태평양 영역의 심해 열수 분출구로부터 분리되었다. YPS 배지가 써모코커스 속 NA1 균주를 배양하여 DNA 조작하기 위하여 사용되었고, 써모코커스 속 NA1의 배양 및 균주 유지는 표준적인 방법에 의하여 행하여졌다. 써모코커스 속 NA1 종균 배양을 준비하기 위하여, 25 ml 혈청용기에 들어있는 YPS 배지에 파타겔 플레이트 (phytagel plate) 위에 형성된 단일 콜로니를 접종하였고, 20시간 동안 90℃에서 배양하였다. 종균 배양은 혐기적 단지 (jar)에서 YPS 배지 700 ml을 접종하는데 사용되었고, 20시간 동안 90℃에서 배양되었다.

참고예 2. 야생형 중합효소 TNA1_pol 유전자의 제조

써모코커스 속 (Thermococcus sp.) NA1 균주의 중합효소 TNA1_pol 유전자를 포함하는 플라스미드 증식 및 핵산 서열분석을 위해 대장균 E. coli DH5α균주가 사용되었다. 대장균 BL21-Codonplus(DE3)-RIL 세포 (스트라타진, 라졸라, 캘리포니아) 및 플라스미드 pET-24a(+) (노바겐, 메이디슨, 위스콘신)이 유전자 발현을 위해 사용되었다. 대장균 균주는 37℃에서 루리아-베르타니(Luria-Bertani) 배지를 사용하여 배양되었고, 카나마이신이 최종 농도 50㎍/ml이 되도록 배지에 첨가되었다.

또한, DNA 조작은 샘브록 및 러셀에 의해 기술된 바와 같이 표준적인 방법으로 행하여졌다. 써모코커스 속의 게놈 DNA 는 표준적인 방법으로 분리되었다. 제한효소 및 다른 변형 효소는 프로메가 (메이디슨, 위스콘신)로부터 구매하였다. 대장균 세포로부터 플라스미드 DNA의 적은 양의 제조는 플라스미드 미니 키트 (퀴아겐, 힐덴, 독일)을 이용하여 행하여졌다. DNA 서열분석은 빅다이 터미네이터 키트 (PE Applied Biosystems, 포스터 시, 캘리포니아)를 이용하여 자동 서열분석기 (AB3100)를 사용하여 행하여졌다.

게놈 서열을 분석한 결과, 1,308개의 아미노산으로 구성된 단백질을 암호화하는 오픈 리딩 프레임 (3,927 bp)이 발견되었고, B 패밀리 타입 DNA 중합효소와 매우 높은 유사성을 보였다. 유추되어진 아미노산 서열로부터 얻어진 단백질의 분자량은 151.9 kDa 이었고, 이것은 평균적인 열안정적 DNA 중합효소에 대하여 예측되는 크기보다 훨씬 컸다. 또한 서열 분석을 통하여 상기 DNA 중합효소 유전자가 추정의 3'-5'엑소뉴클레아제 도메인, α-유사 DNA 중합효소 도메인 및 진핵생물 및 고세균의 α-유사 DNA 중합효소 사이에 보존된 중간지역 (Pol III)에 위치한 1605 bp (535 아미노산)의 하나의 인프레임된 서열 (intervening sequence)을 포함하는 것을 확인하였다. 또한, 유추된 인테인 (intein)의 아미노산 서열은 다른 고세균 중합효소의 인테인과 매우 유사한 점도 보였고, pol_1 인테인 1 (Thermococcus sp. strain GE8로부터 유래한 DNA 중합효소 기원 537개 아미노산들, AJ25033)에 81.0%의 상동성, IVS-B (KOD DNA 중합효소 기원 537개 아미노산들, D29671)에 69.0% 상동성 및 인테인 (Deep vent DNA 중합효소 기원 537개 아미노산들, U00707)에 67.0%의 상동성을 보였다.

또한, 인테인의 스플라이싱 부위는 인테인의 N-말단에서의 Cys 또는 Ser 및 C-말단 스플라이스 연결부에서 His-Asn-Cys/Thr가 잘 보존되어 있어서 서열 분석에 의하여 예측될 수 있었다. 따라서, 인테인을 포함하지 않는 성숙한 형태의 중합효소 TNA1_pol 의 유전자가 예상되어질 수 있고, 이것은 773개 아미노산 잔기들로 구성된 단백질을 암호화하는 2,322 bp 일 것으로 판단되었다. 중합효소 TNA1_pol의 추정된 서열은 다른 DNA 중합효소의 것들과 비교되었다. 페어와이즈 어라인먼트에서, 유추되어진 성숙한 중합효소 TNA1_pol 아미노산 서열은 KOD DNA 중합효소 (gi:52696275)와 91.0% 상동성, 딥 벤트 DNA 중합효소(gi:436495)와 82.0% 상동성 및 pfu DNA 중합효소(gi:18892147)와 79.0% 상동성을 보였다. PCR 증폭에 있어서 중합효소 TNA1_pol의 성능을 확인하기 위하여, TNA1_pol DNA 는 상기 언급한 바와 같이 중합효소 전장 길이로부터 인테인을 제거하여 제조되었다.

인테인 (intein)을 포함하지 않는 DNA 중합효소의 성숙한 형태는 다음과 같이 제조되었다. 오버랩핑 서열을 포함하도록 디자인된 프라이머를 이용하여, TNA1-pol의 N-말단 부분 및 C-말단 부분을 각각 증폭하였다. 그 다음, 제한효소 NdeI 및 XhoI 부위에 의해 플랭크 (flank)된 성숙한 TNA1_pol 유전자의 전장 길이가 두 개의 프라이머 및 주형으로서 상기 N-말단 및 C-말단 부분 증폭된 PCR 분절의 혼합물을 이용하여 증폭되었다. 증폭된 서열은 제한효소 NdeI 및 XhoI으로 소화되었고, 제한효소 NdeI 및 XhoI 으로 소화된 플라스미드 벡터 pET-24a(+)에 연결되었다. 연결물 (ligate)은 대장균 DH5α에 형질전환되었다. 정확한 구조체를 가진 후보자들이 제한효소에 의하여 확인되었고, 클론의 DNA 서열을 분석하여 성숙된 DNA 중합효소의 유전자를 함유하는 것이 확인되었다.

실시예 1. 특정 부위 돌연변이화를 이용한 돌연변이 NA1 중합효소의 제조

본 발명은 돌연변이 NA1 중합효소를 제조하기 위하여, 기존의 프로토콜에 따라 각각의 특정 부위에 해당하는 다양한 합성 프라이머들을 사용하여 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 이용하여 특정 부위에 돌연변이화 (site-directed mutagenesis)를 유도하였다. 돌연변이에 사용된 프라이머 및 이에 의해 제조되어진 돌연변이된 DNA 중합효소를 표 1에 나타내었다.

<표1> DNA 중합효소 돌연변이화에 사용되어진 PCR 프라이머 서열

대상	포워드프라이머	백워드프라이머
서열번호 1의 DNA 중합효소	CACCCGCAGGACCAACCCGCAATCCGCGACAAGATAAGG (서열번호 4)	GCGGATTGCGGGTTGGTCCTGCGGGTGCTCGAAGTAG (서열번호 5)
서열번호 1의 DNA 중합효소	CTCATTACCTACGACGGCGACAACTTTGACTTTGCTTAC(서열번호 6)	AAAGTTGTCGCCGTCGTAGGTAATGAGAACATCAGGATC (서열번호 7)
서열번호 2의 DNA 중합효소	CACCCGCAGGACCAGCCCGCAATCCGCGACAAGATAAGG(서열번호 8)	GCGGATTGCGGGCTGGTCCTGCGGGTGCTCGAAGTAG (서열번호 9)
	ATGCTCGCCTTTGCCATCGAGACGCTCTACCACGAGGGC (서열번호 10)	GAGCGTCTCGATGGCAAAGGCGAGCATCTTCAGTTCTTC (서열번호 11)
	CTCATTACCTACGACGGCGACAACTTTGACTTTGCTTAC(서열번호 6)	AAAGTTGTCGCCGTCGTAGGTAATGAGAACATCAGGATC (서열번호 7)
	CGCGTTGCGCGCTTCTCTATGGAAGATGCAAAGGCAACC(서열번호 12)	ATCTTCCATAGAGAAGCGCGCAACGCGCTCAAGCCCCTC(서열번호 13)
	CACCCGCAGGACCAGCCCGCAATCCGCGACAAGATAAGG(서열번호 8)	GCGGATTGCGGGCTGGTCCTGCGGGTGCTCGAAGTAG (서열번호 9)
서열번호 3의 DNA 중합효소	ATGCTCGCCTTTGCCATCGAGACGCTCTACCACGAGGGC (서열번호 10)	GAGCGTCTCGATGGCAAAGGCGAGCATCTTCAGTTCTTC (서열번호 11)
	CTCATTACCTACGACGGCGACAACTTTGACTTTGCTTAC(서열번호 6)	AAAGTTGTCGCCGTCGTAGGTAATGAGAACATCAGGATC (서열번호 7)
	CGCGTTGCGCGCTTCTCTATGGAAGATGCAAAGGCAACC(서열번호 12)	ATCTTCCATAGAGAAGCGCGCAACGCGCTCAAGCCCCTC(서열번호 13)
	CGACATACCCCGCGCCAAGCGCTACCTC (서열번호 14)	GCGCTTGGCGCGGGGTATGTCGTACTCG (서열번호 15)

도 1은 본 발명의 돌연변이 DNA 중합효소들을 전기영동한 결과를 나타낸 것이다. M, 표준 마커; W, 야생형; 1, 변이형 I; 2, 변이형 II; 3, 변이형 III. 중합효소 연쇄반응은 95℃에서 5분 동안 단일의 변성단계 후에, 95℃에서 15초, 55℃에서 1초, 72℃에서 20초의 온도 프로파일로 15사이클 증폭시키고, 최종적으로 72℃에서 7분 연장시키는 과정으로 이루어졌다. 도 2는 본 발명의 돌연변이 DNA 중합효소들을 각각 이용하여 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 수행하고 그 결과를 나타낸 것이다. 도 3은 본 발명의 돌연변이 DNA 중합효소들을 각각 이용하여 이노신을 함유한 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 수행하고 그 결과를 나타낸 것이다.

실시예 2. 돌연변이 NA1 중합효소 유전자의 발현 및 단백질 분리

매우 강하고 엄격한 T7/lac 프로모터를 가진 pET 시스템은 대장균에서 외래 단백질의 클로닝 및 발현을 위해 개발된 가장 강력한 시스템 중의 하나이다. 상기 실시예 1 과정에서 분리된 돌연변이 NA1 중합효소 유전자들은 재조합 단백질의 과다 발현 및 His-태그 분리를 유도하기 위해 증폭된 플라스미드 벡터 pET-24a(+)의 제한효소 NdeI 및 XhoI 부위로 도입되었다(도 4). 상기 돌연변이 NA1 중합효소는 상기 재조합 발현 플라스미드로 대장균 BL21-codonPlus(DE3)-RIL 균주를 형질전환시켜 얻은 대장균 형질전환체의 세포질 내에 용해성 단백질 형태로 발현되었다

구체적으로 상기에서 얻어진 발현 플라스미드로부터 돌연변이 NA1 중합효소는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 중간 기하급수적 성장기에 첨가하고 37℃에서 3시간 동안 항온 배양하여 과량 발현이 유도되었다. 세포는 원심분리 (4℃에서 20분간 6,000 x g)를 통하여 얻어졌고, 0.1 M KCl 및 10% 글리세롤을 포함하는 50 mM 트리스-HCl 완충용액 (pH 8.0)에서 재현탁시켰다. 세포는 초음파에 의해서 분쇄되어 원심분리 (4℃에서 30분간 20,000 x g)되었고, 조효소 샘플은 20분간 동안 80℃에서 열처리되었다. 얻어진 상등액은 TALONT^M 금속 친화성 레진 (BD Bioscience Clontech, 파우로 알토, 캘리포니아)의 컬럼에 처리되고, 0.1 M KCl 및 10% 글리세롤을 포함하는 50 mM 트리스-HCl 완충용액 (pH 8.0)안의 10 mM 이미다졸 (시그마, 세이트 루이스, 미주리)로 세척되었다. 상기 돌연변이 NA1 중합효소는 완충용액 내의 300 mM 이미다졸으로 용출되었다. 모아진 분획은 50 mM 트리스-HCl (pH 7.5), 1 mM DTT, 1 mM EDTA 및 10% 글리세롤을 포함하는 저장 완충용액으로 투석되어졌다. 단백질 농도는 브래드포드의 비색분석 방법에 의해 결정되었다. 단백질의 정제도는 표준 방법으로 수행되어진 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 분석에 의해서 조사되었다(도 1).

열처리는 20분 동안 80℃에서 진행되어 몇 가지 대장균 단백질들이 효과적으로 제거될 수 있었다. 그러나, 일부 대장균 단백질들은 열처리 후에 안정된 형태로 남아 있었다. 열처리 풀 (pool)의 용해성 상등액은 TALONT^M 금속 친화성 레진의 컬럼 위에서 크로마토그래피 되었다. 정제되어진 단백질의 비활성 (specific activity)은 231.33 단위 mg-1로 결정되었고, 정제 수율은 대략 26.155% 이었다. SDS-PAGE는 분자량 80 kDa에서 주요한 단백질 밴드들을 나타내었다. 정제된 단백질은 반복적인 얼림과 녹임 과정으로 순환시키어 용해성으로 남아있었다.

<표 2> 대장균에서 중합효소 TNA1_pol1의 분리

정제단계	총단백질	총활성도	비활성도	회수율
정제단계	(mg)	(U)	(U/mg)	(%)
조추출물	46.6	2918.26	62.62	100
열 변성	19.7	2518.62	127.85	86.31
His-태그된 친화컬럼	3.3	763.37	231.33	26.15

실시예 3. 돌연변이 중합효소 NA1을 이용한 중합효소 연쇄반응 분석

열안정성 돌연변이 DNA 중합효소의 주된 용도는 DNA 분절의 시험관 내 증폭이다. 시험관 내 증폭에 대한 재조합 중합효소의 성능을 조사하기 위하여, 상기 재조합 효소를 PCR 반응에 적용해 보았다. 2.5 U의 여러가지 DNA 중합효소가 주형으로 써모코커스 속 NA1 로부터의 50 ng 게놈 DNA, 10 pmole의 각각의 프라이머, 200μM dNTP 및 PCR 반응 완충용액을 포함하는 50㎕의 반응 혼합액에 첨가되었다. 써모코커스 속 NA1 균주의 게놈 DNA 로부터 2 kb를 증폭하기 위한 프라이머가 디자인되었다. 제조자에 의해 공급되는 PCR 완충용액이 상업적 중합효소의 PCR 증폭에 사용되었고, 상기 중합효소의 PCR 증폭을 위하여 20 mM 트리스-HCl (pH 8.5), 30 mM (NH₄)₂SO₄, 60 mM KCl, 및 1 mM MgCl₂로 구성된 완충용액이 사용되었다. 95℃에서 단일의 변성 단계 후에, 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 2분의 온도 프로파일로 30 사이클하고, 72℃에서 최종의 7분 연장이 뒤따랐다. PCR 생산물은 0.8% 아가로즈 겔 전기영동으로 분석되었다. 긴 사슬의 DNA 증폭에서 재조합 중합효소의 성능을 시험하기 위하여, PCR 반응이 주형으로 50 ng의 써모코커스 속 NA1 균주의 게놈 DNA, 200μM dNTP 및 PCR 반응 완충용액를 포함하는 50㎕ 반응 혼합액에서 수행되었다. 본 발명의 돌연변이 DNA 중합효소들을 각각 이용하여 이노신을 함유한 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 수행하였다. 그 결과 본 발명에 따른 DNA 중합효소는 기존 야생형 DNA 중합효소와 비교하여 훨씬 고효율로 증폭이 되었다(도 3 참조).

상술한 바와 같이, 본 발명은 써모코커스 속 NA 1 (Thermococcus sp. NA 1) 균주로부터 분리되고 특정 부위에 돌연변이화를 유발시킨 DNA 중합효소들, 그의 아미노산 서열들, 상기 돌연변이 DNA 중합효소 유전자들, 그의 염기 서열들 및 그들의 제조방법 그리고 이들을 중합효소 연쇄반응 (PCR) 등에 사용하는 용도에 관한 것이다. 본 발명의 돌연변이 DNA 중합효소는 엑소뉴클레아제 (exonuclease) 및 이노신 감지 (inosine sensing) 기능을 동시에 변화시키어 이노신을 포함하는 프라이머의 PCR에 있어서 다양한 분자유전학적 기술 등에 널리 응용될 수 있다.

<110> Korea Ocean Research & Development Institute <120> Mutant DNA Polymerases and Their Genes <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 773 <212> PRT <213> Thermococcus sp. NA1 <400> 1 Met Ile Leu Asp Val Asp Tyr Ile Thr Glu Asp Gly Lys Pro Val Ile 1 5 10 15 Arg Ile Phe Lys Lys Glu Lys Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg 20 25 30 Asp Phe Glu Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile 35 40 45 Glu Glu Val Lys Lys Ile Thr Ala Glu Arg His Gly Lys Val Val Lys 50 55 60 Val Lys Arg Ala Glu Lys Val Asn Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Val 65 70 75 80 Glu Val Trp Lys Leu Tyr Phe Glu His Pro Gln Asp Gln Pro Ala Ile 85 90 95 Arg Asp Lys Ile Arg Ala His Pro Gly Val Ile Asp Ile Tyr Glu Tyr 100 105 110 Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Val Pro 115 120 125 Met Glu Gly Asp Glu Glu Leu Lys Met Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr 130 135 140 Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Gly Thr Gly Pro Ile Leu Met Ile 145 150 155 160 Ser Tyr Ala Asp Glu Asn Glu Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Lys Ile 165 170 175 Asp Leu Pro Tyr Val Asp Val Val Ser Thr Glu Lys Glu Met Ile Lys 180 185 190 Arg Phe Leu Arg Val Val Lys Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr 195 200 205 Tyr Asp Gly Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Cys Glu 210 215 220 Lys Leu Gly Ile Ser Phe Thr Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys 225 230 235 240 Ile His Arg Met Gly Asp Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile 245 250 255 His Phe Asp Leu Tyr Pro Val Ile Arg Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr 260 265 270 Tyr Thr Leu Glu Val Val Tyr Glu Ala Val Phe Gly Lys Pro Lys Glu 275 280 285 Lys Val Tyr Ala Glu Glu Ile Thr Leu Ala Trp Glu Ser Gly Glu Gly 290 295 300 Leu Glu Arg Val Ala Arg Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Ala Thr Tyr 305 310 315 320 Glu Leu Gly Arg Glu Phe Phe Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu 325 330 335 Ile Gly Gln Ser Leu Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu 340 345 350 Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala 355 360 365 Pro Asn Lys Pro Asp Glu Gly Glu Leu Ala Arg Arg Arg Asn Ser Tyr 370 375 380 Ala Gly Gly Tyr Val Lys Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Asp Asn Ile 385 390 395 400 Val Tyr Leu Asp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His 405 410 415 Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Lys Glu Tyr Asp 420 425 430 Val Ala Pro Gln Val Gly His Lys Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly Phe 435 440 445 Ile Pro Ser Leu Leu Gly Asn Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile Lys 450 455 460 Arg Lys Met Lys Ala Thr Ile Asp Pro Leu Glu Lys Lys Leu Leu Asp 465 470 475 480 Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Tyr Tyr Gly Tyr 485 490 495 Tyr Gly Tyr Pro Arg Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser 500 505 510 Val Thr Ala Trp Gly Arg Glu Tyr Ile Glu Met Thr Ile Arg Glu Ile 515 520 525 Glu Glu Lys Tyr Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ala Asp Thr Asp Gly Phe 530 535 540 Tyr Ala Thr Ile Pro Gly Ala Asp Ala Glu Thr Val Lys Lys Lys Ala 545 550 555 560 Lys Glu Phe Leu Lys Tyr Ile Asn Ala Lys Leu Pro Gly Leu Leu Glu 565 570 575 Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Lys Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys 580 585 590 Lys Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Val Thr Arg Gly Leu 595 600 605 Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Asp Ile Ala Lys Glu Thr Gln Ala 610 615 620 Arg Val Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asp Gly Asn Val Glu Lys Ala Val 625 630 635 640 Lys Ile Val Lys Glu Ile Thr Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Glu Ile Pro 645 650 655 Pro Glu Lys Leu Val Ile His Glu Gln Ile Thr Arg Glu Leu Lys Asp 660 665 670 Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala Ile Ala Lys Arg Leu Ala Ala 675 680 685 Arg Gly Ile Lys Val Arg Pro Gly Thr Ile Ile Ser Tyr Ile Val Leu 690 695 700 Lys Gly Ser Gly Arg Ile Gly Asp Arg Ala Ile Pro Phe Asp Glu Phe 705 710 715 720 Asp Pro Thr Lys His Lys Tyr Asp Ala Asp Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln 725 730 735 Val Leu Pro Ala Val Met Arg Ile Leu Glu Ala Phe Gly Tyr Lys Lys 740 745 750 Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Arg Gln Val Gly Leu Gly Ala Trp 755 760 765 Leu Lys Pro Lys Lys 770 <210> 2 <211> 773 <212> PRT <213> Thermococcus sp. NA1 <400> 2 Met Ile Leu Asp Val Asp Tyr Ile Thr Glu Asp Gly Lys Pro Val Ile 1 5 10 15 Arg Ile Phe Lys Lys Glu Lys Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg 20 25 30 Asp Phe Glu Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile 35 40 45 Glu Glu Val Lys Lys Ile Thr Ala Glu Arg His Gly Lys Val Val Lys 50 55 60 Val Lys Arg Ala Glu Lys Val Asn Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Val 65 70 75 80 Glu Val Trp Lys Leu Tyr Phe Glu His Pro Gln Asp Glu Pro Ala Ile 85 90 95 Arg Asp Lys Ile Arg Ala His Pro Gly Val Ile Asp Ile Tyr Glu Tyr 100 105 110 Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Val Pro 115 120 125 Met Glu Gly Asp Glu Glu Leu Lys Met Leu Ala Phe Ala Ile Glu Thr 130 135 140 Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Gly Thr Gly Pro Ile Leu Met Ile 145 150 155 160 Ser Tyr Ala Asp Glu Asn Glu Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Lys Ile 165 170 175 Asp Leu Pro Tyr Val Asp Val Val Ser Thr Glu Lys Glu Met Ile Lys 180 185 190 Arg Phe Leu Arg Val Val Lys Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr 195 200 205 Tyr Asp Gly Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Cys Glu 210 215 220 Lys Leu Gly Ile Ser Phe Thr Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys 225 230 235 240 Ile His Arg Met Gly Asp Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile 245 250 255 His Phe Asp Leu Tyr Pro Val Ile Arg Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr 260 265 270 Tyr Thr Leu Glu Val Val Tyr Glu Ala Val Phe Gly Lys Pro Lys Glu 275 280 285 Lys Val Tyr Ala Glu Glu Ile Thr Leu Ala Trp Glu Ser Gly Glu Gly 290 295 300 Leu Glu Arg Val Ala Arg Phe Ser Met Glu Asp Ala Lys Ala Thr Tyr 305 310 315 320 Glu Leu Gly Arg Glu Phe Phe Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu 325 330 335 Ile Gly Gln Ser Leu Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu 340 345 350 Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala 355 360 365 Pro Asn Lys Pro Asp Glu Gly Glu Leu Ala Arg Arg Arg Asn Ser Tyr 370 375 380 Ala Gly Gly Tyr Val Lys Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Asp Asn Ile 385 390 395 400 Val Tyr Leu Asp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His 405 410 415 Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Lys Glu Tyr Asp 420 425 430 Val Ala Pro Gln Val Gly His Lys Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly Phe 435 440 445 Ile Pro Ser Leu Leu Gly Asn Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile Lys 450 455 460 Arg Lys Met Lys Ala Thr Ile Asp Pro Leu Glu Lys Lys Leu Leu Asp 465 470 475 480 Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Tyr Tyr Gly Tyr 485 490 495 Tyr Gly Tyr Pro Arg Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser 500 505 510 Val Thr Ala Trp Gly Arg Glu Tyr Ile Glu Met Thr Ile Arg Glu Ile 515 520 525 Glu Glu Lys Tyr Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ala Asp Thr Asp Gly Phe 530 535 540 Tyr Ala Thr Ile Pro Gly Ala Asp Ala Glu Thr Val Lys Lys Lys Ala 545 550 555 560 Lys Glu Phe Leu Lys Tyr Ile Asn Ala Lys Leu Pro Gly Leu Leu Glu 565 570 575 Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Lys Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys 580 585 590 Lys Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Val Thr Arg Gly Leu 595 600 605 Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Asp Ile Ala Lys Glu Thr Gln Ala 610 615 620 Arg Val Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asp Gly Asn Val Glu Lys Ala Val 625 630 635 640 Lys Ile Val Lys Glu Ile Thr Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Glu Ile Pro 645 650 655 Pro Glu Lys Leu Val Ile His Glu Gln Ile Thr Arg Glu Leu Lys Asp 660 665 670 Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala Ile Ala Lys Arg Leu Ala Ala 675 680 685 Arg Gly Ile Lys Val Arg Pro Gly Thr Ile Ile Ser Tyr Ile Val Leu 690 695 700 Lys Gly Ser Gly Arg Ile Gly Asp Arg Ala Ile Pro Phe Asp Glu Phe 705 710 715 720 Asp Pro Thr Lys His Lys Tyr Asp Ala Asp Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln 725 730 735 Val Leu Pro Ala Val Met Arg Ile Leu Glu Ala Phe Gly Tyr Lys Lys 740 745 750 Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Arg Gln Val Gly Leu Gly Ala Trp 755 760 765 Leu Lys Pro Lys Lys 770 <210> 3 <211> 773 <212> PRT <213> Thermococcus sp. NA1 <400> 3 Met Ile Leu Asp Val Asp Tyr Ile Thr Glu Asp Gly Lys Pro Val Ile 1 5 10 15 Arg Ile Phe Lys Lys Glu Lys Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg 20 25 30 Asp Phe Glu Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile 35 40 45 Glu Glu Val Lys Lys Ile Thr Ala Glu Arg His Gly Lys Val Val Lys 50 55 60 Val Lys Arg Ala Glu Lys Val Asn Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Val 65 70 75 80 Glu Val Trp Lys Leu Tyr Phe Glu His Pro Gln Asp Glu Pro Ala Ile 85 90 95 Arg Asp Lys Ile Arg Ala His Pro Gly Val Ile Asp Ile Tyr Glu Tyr 100 105 110 Asp Ile Pro Arg Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Val Pro 115 120 125 Met Glu Gly Asp Glu Glu Leu Lys Met Leu Ala Phe Ala Ile Glu Thr 130 135 140 Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Gly Thr Gly Pro Ile Leu Met Ile 145 150 155 160 Ser Tyr Ala Asp Glu Asn Glu Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Lys Ile 165 170 175 Asp Leu Pro Tyr Val Asp Val Val Ser Thr Glu Lys Glu Met Ile Lys 180 185 190 Arg Phe Leu Arg Val Val Lys Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr 195 200 205 Tyr Asp Gly Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Cys Glu 210 215 220 Lys Leu Gly Ile Ser Phe Thr Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys 225 230 235 240 Ile His Arg Met Gly Asp Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile 245 250 255 His Phe Asp Leu Tyr Pro Val Ile Arg Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr 260 265 270 Tyr Thr Leu Glu Val Val Tyr Glu Ala Val Phe Gly Lys Pro Lys Glu 275 280 285 Lys Val Tyr Ala Glu Glu Ile Thr Leu Ala Trp Glu Ser Gly Glu Gly 290 295 300 Leu Glu Arg Val Ala Arg Phe Ser Met Glu Asp Ala Lys Ala Thr Tyr 305 310 315 320 Glu Leu Gly Arg Glu Phe Phe Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu 325 330 335 Ile Gly Gln Ser Leu Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu 340 345 350 Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala 355 360 365 Pro Asn Lys Pro Asp Glu Gly Glu Leu Ala Arg Arg Arg Asn Ser Tyr 370 375 380 Ala Gly Gly Tyr Val Lys Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Asp Asn Ile 385 390 395 400 Val Tyr Leu Asp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His 405 410 415 Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Lys Glu Tyr Asp 420 425 430 Val Ala Pro Gln Val Gly His Lys Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly Phe 435 440 445 Ile Pro Ser Leu Leu Gly Asn Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile Lys 450 455 460 Arg Lys Met Lys Ala Thr Ile Asp Pro Leu Glu Lys Lys Leu Leu Asp 465 470 475 480 Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Tyr Tyr Gly Tyr 485 490 495 Tyr Gly Tyr Pro Arg Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser 500 505 510 Val Thr Ala Trp Gly Arg Glu Tyr Ile Glu Met Thr Ile Arg Glu Ile 515 520 525 Glu Glu Lys Tyr Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ala Asp Thr Asp Gly Phe 530 535 540 Tyr Ala Thr Ile Pro Gly Ala Asp Ala Glu Thr Val Lys Lys Lys Ala 545 550 555 560 Lys Glu Phe Leu Lys Tyr Ile Asn Ala Lys Leu Pro Gly Leu Leu Glu 565 570 575 Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Lys Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys 580 585 590 Lys Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Val Thr Arg Gly Leu 595 600 605 Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Asp Ile Ala Lys Glu Thr Gln Ala 610 615 620 Arg Val Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asp Gly Asn Val Glu Lys Ala Val 625 630 635 640 Lys Ile Val Lys Glu Ile Thr Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Glu Ile Pro 645 650 655 Pro Glu Lys Leu Val Ile His Glu Gln Ile Thr Arg Glu Leu Lys Asp 660 665 670 Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala Ile Ala Lys Arg Leu Ala Ala 675 680 685 Arg Gly Ile Lys Val Arg Pro Gly Thr Ile Ile Ser Tyr Ile Val Leu 690 695 700 Lys Gly Ser Gly Arg Ile Gly Asp Arg Ala Ile Pro Phe Asp Glu Phe 705 710 715 720 Asp Pro Thr Lys His Lys Tyr Asp Ala Asp Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln 725 730 735 Val Leu Pro Ala Val Met Arg Ile Leu Glu Ala Phe Gly Tyr Lys Lys 740 745 750 Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Arg Gln Val Gly Leu Gly Ala Trp 755 760 765 Leu Lys Pro Lys Lys 770 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 93Q forward primer <400> 4 cacccgcagg accaacccgc aatccgcgac aagataagg 39 <210> 5 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 93Q Reverse primer <400> 5 gcggattgcg ggttggtcct gcgggtgctc gaagtag 37 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 210D Forward primer <400> 6 ctcattacct acgacggcga caactttgac tttgcttac 39 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 210D Reverse primer <400> 7 aaagttgtcg ccgtcgtagg taatgagaac atcaggatc 39 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 93E Forward primer <400> 8 cacccgcagg accagcccgc aatccgcgac aagataagg 39 <210> 9 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 93E Reverse primer <400> 9 gcggattgcg ggctggtcct gcgggtgctc gaagtag 37 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 141A Forward primer <400> 10 atgctcgcct ttgccatcga gacgctctac cacgagggc 39 <210> 11 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 141A Reverse primer <400> 11 gagcgtctcg atggcaaagg cgagcatctt cagttcttc 39 <210> 12 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 311F Forward primer <400> 12 cgcgttgcgc gcttctctat ggaagatgca aaggcaacc 39 <210> 13 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 311F Reverse primer <400> 13 atcttccata gagaagcgcg caacgcgctc aagcccctc 39 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 116R Forward primer <400> 14 cgacataccc cgcgccaagc gctacctc 28 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 116R Reverse primer <400> 15 gcgcttggcg cggggtatgt cgtactcg 28

Claims

서열번호 1의 91 내지 106의 아미노산 서열 및 205 내지 220의 아미노산 서열을 포함하는 DNA 중합효소.
제 1 항에 있어서, 상기 DNA 중합효소가 서열번호 1의 91 내지 315의 아미노산 서열을 포함하는 DNA 중합효소.
제 1 항에 있어서, 상기 DNA 중합효소가 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 DNA 중합효소.
서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 중합효소 유전자.
제 4 항의 DNA 중합효소 유전자를 포함하는 재조합벡터.
제 5 항의 재조합벡터로 형질전환된 숙주세포.
서열번호 2의 91 내지 106의 아미노산 서열, 133 내지 148의 아미노산 서열, 205 내지 220의 아미노산 서열 및 300 내지 315의 아미노산 서열을 포함하는 DNA 중합효소.
제 7 항에 있어서, 상기 DNA 중합효소가 서열번호 2의 91 내지 315의 아미노산 서열을 포함하는 DNA 중합효소.
제 7 항에 있어서, 상기 DNA 중합효소가 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 DNA 중합효소.
서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 중합효소 유전자.
제 10 항의 DNA 중합효소 유전자를 포함하는 재조합벡터.
제 11 항의 재조합벡터로 형질전환된 숙주세포.
서열번호 3의 91 내지 106의 아미노산 서열, 107 내지 122의 아미노산 서열, 133 내지 148의 아미노산 서열, 205 내지 220의 아미노산 서열 및 300 내지 315의 아미노산 서열을 포함하는 DNA 중합효소.
제 13 항에 있어서, 상기 DNA 중합효소가 서열번호 3의 91 내지 315의 아미노산 서열을 포함하는 DNA 중합효소.
제 13 항에 있어서, 상기 DNA 중합효소가 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 DNA 중합효소.
서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 중합효소 유전자.
제 16 항의 DNA 중합효소 유전자를 포함하는 재조합벡터.
제 17 항의 재조합벡터로 형질전환된 숙주세포.
제 6 항, 제 12 항 또는 제18항의 숙주세포를 배양하고 재조합 단백질의 발현을 유도하여 중합효소 단백질을 분리하는 것을 특징으로 하는 중합효소 제조방법