KR20080017209A - 비평면 형상의 고체 지지체를 이용하여 미생물로부터핵산을 분리하는 방법,상기 분리된 핵산을 주형으로 하여핵산을 증폭하는 방법 및 상기 고체 지지체를 포함하는핵산 분리 및 증폭 장치 - Google Patents

비평면 형상의 고체 지지체를 이용하여 미생물로부터핵산을 분리하는 방법,상기 분리된 핵산을 주형으로 하여핵산을 증폭하는 방법 및 상기 고체 지지체를 포함하는핵산 분리 및 증폭 장치 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비평면 형상의 고체 지지체와, 미생물을 포함하는 시료를 pH 3.0 내지 6.0의 범위에서 접촉시켜 상기 미생물을 상기 고체 지지체에 부착시키는 단계, 및 상기 고체 지지체에 부착된 상기 미생물을 파쇄하는 단계를 포함하는, 미생물로부터 핵산을 분리하는 방법을 제공한다.
비평면 형상, 고체 지지체, 핵산, 증폭

Description

비평면 형상의 고체 지지체를 이용하여 미생물로부터 핵산을 분리하는 방법,상기 분리된 핵산을 주형으로 하여 핵산을 증폭하는 방법 및 상기 고체 지지체를 포함하는 핵산 분리 및 증폭 장치{A method of isolating a DNA from a microorgansim cell using a nonplanar solid substrate, a method of amplifying a nucleic acid using the isolated nucleic acid as a template and a device for isolating and amplifying a nucleic acid comprising the nonplanar solid substrate}
도 1는 pH 12.0의 NaOH 용액 및 pH 7.0의 포스페이트 버퍼 중의 DNA 양과 흡광강도 사이의 상관관계를 나타내는 도면이다.
도 2는 DNA 시료를 기둥 어레이가 형성되어 있는 유동 장치를 통하여 흘려준 후 pH에 따른 DNA의 부착 정도를 나타낸 도면이다.
도 3은 세포 파쇄 후 파쇄물 중에 존재하는 DNA의 양과 세포의 농도 사이의 상관관계를 나타내는 표준 곡선이다.
도 4는 옥타데실디메틸 (3-트리메톡시실릴 프로필)암모늄 (OTC)가 코팅되어 있고 기둥 어레이가 형성되어 있는 표면을 갖는 챔버를 포함하는 유동 장치를 통하여 대장균 시료를 흘러주고, 세포를 파쇄한 다음 상기 파쇄물을 회수하여 DNA의 효율을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 대장균 시료를 유동 장치 중의 기둥 어레이가 형성된 표면을 갖는 챔버를 통하여 흘려 주고, 세포 파쇄, 세척 및 실시간 (real time) PCR 증폭한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 대장균 시료를 유동 장치 중의 기둥 어레이가 형성된 표면을 갖는 챔버를 통하여 흘려 주고, 세포 파쇄, 세척 및 실시간 (real time) PCR 증폭하여 얻어진 산물을 전기 영동하고, 그 농도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 대장균을 포함하는 뇨 시료를 유동 장치 중의 기둥 어레이가 형성된 표면을 갖는 챔버를 통하여 흘려 주고, 세포 파쇄, 세척 및 실시간 (real time) PCR 증폭한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 대장균을 포함하는 전혈 (whole blood) 시료를 유동 장치 중의 기둥 어레이가 형성된 표면을 갖는 챔버를 통하여 흘러주고, 세포 파쇄, DNA 용출 후 그것을 실시간 (real time) PCR 증폭한 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는 대장균을 포함하는 전혈 (whole blood) 시료를 유동 장치 중의 기둥 어레이가 형성된 표면을 갖는 챔버를 통하여 흘려 주고, 세포 파쇄, DNA 용출, 실시간 (real time) PCR 증폭한 산물을 전기영동한 결과를 나타내는 도면이다.
본 발명은 비평면 형상의 고체 지지체를 이용하여 미생물로부터 핵산을 분리하는 방법,상기 분리된 핵산을 주형으로 하여 핵산을 증폭하는 방법 및 상기 고체 지지체를 포함하는 핵산 분리 및 증폭 장치에 관한 것이다.
종래 고상 물질을 이용한 핵산의 정제 방법이 알려져 있었다. 예를 들면, 미국특허 제5,234,809호에는 핵산에 결합하는 고상물질을 이용한 핵산의 정제 방법이 개시되어 있다. 그러나, 상기 방법은 시간이 오래 소요되기 때문에 복잡하며, 랩온어 칩에 부적합하다. 또한, 상기 방법은 반드시 카오트로픽 물질을 사용하여야 하는 문제점이 있었다. 즉, 상기 카오트로픽 물질을 사용하지 않는 경우에는 고상 물질에 핵산이 결합하지 않는다.
또한, 미국특허 제6,291,166호에는 고상 매트릭스를 이용한 핵산의 집적 (archiving) 방법이 개시되어 있다. 상기 방법은 핵산이 고상 매트릭스에 비가역적으로 결합하기 때문에, 상기 핵산 고상 매트릭스 복합체를 보관한 후 나중에 분석 (delayed analysis)하거나 반복 분석 (repeated analysis)하는 것이 가능하다는 장점이 있다. 그러나, 이 방법에 의하면, 알루미나와 같은 표면에 양전하를 띠는 물질을 NaOH와 같은 염기성 물질로 활성화하여야 하고, 핵산은 이렇게 활성화된 알루미나에는 비가역적으로 결합하기 때문에 알루미나로부터 분리할 수 없게 된다.
미국 특허 제5,705,628호에는 DNA를 포함하는 용액을 염 및 폴리에틸렌 글리콜과 혼합하여 카르복실기로 코팅된 표면을 갖는 자성 마이크로입자를 결합시켜 가역적 및 비특이적으로 DNA를 결합시키는 방법이 기재되어 있다. 상기 방법은 DNA를 분리하기 위해 카르복실기 표면을 갖는 자성 입자, 염 및 폴리에틸렌 글리콜을 이용하고 있다.
상기한 바와 같은, 기존의 핵산의 분리 및 정제 방법은 DNA를 결합시키기 위 해 별도로 고농도의 시약을 첨가해야 하는데 이는 PCR과 같은 후속 공정에 영향을 줄 수 있으며, 또한 LOC 상에 적용하기 힘들다는 문제점이 있었다. 또한, 종래의 핵산 분리 및 정제 방법은 세포 또는 바이러스의 정제 또는 농축과는 별개의 독립된 단계로서 구성되어 있으며, 상기 세포 또는 바이러스의 정제 또는 농축과 정제 또는 농축된 세포 또는 바이러스로부터의 핵산을 분리하는 연속적인 공정에 의하여 핵산을 분리하는 방법은 알려진 바 없다.
따라서, 기판과 같은 고체 표면상에 미생물을 부착시켜 미생물을 분리 또는 농축할 수 있는 동시에, 핵산에 대한 친화성이 높아 상기 미생물로부터 유래하는 핵산을 정제 또는 농축할 수 있는 방법이 요구되고 있었다.
본 발명의 목적은 비평면 형상의 표면을 갖는 고체 지지체를 이용하여 세포 또는 바이러스를 분리하고 그로부터 핵산을 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의하여 분리된 핵산을 증폭하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 비평면 형상의 고체 지지체와, 미생물을 포함하는 시료를 pH 3.0 내지 6.0의 범위에서 접촉시켜 상기 미생물을 상기 고체 지지체에 부착시키는 단계,
상기 고체 지지체에 부착된 상기 미생물을 파쇄하는 단계를 포함하는, 미생물로부터 핵산을 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명의 미생물로부터 핵산을 분리하는 방법은, 비평면 형상의 고체 지지체와, 미생물을 포함하는 시료를 pH 3.0 내지 6.0의 범위에서 접촉시켜 상기 미생물을 상기 고체 지지체에 부착시키는 단계를 포함한다. 상기 접촉에 의하여 상기 미생물은 상기 고체 지지체에 부착하게 된다.
고체 지지체가 포함되어 있는 액체 매질 중에서, 미생물은 액체 매질 중에 존재하거나 고체 지지체에 부착할 수 있다. 이러한 액체 매질과 고체 지지체 사이의 분포는, 액체 매질의 표면 장력과 박테리아의 표면 장력의 차이에 의하여 결정되는 것으로 알려져 있다. 즉, 액체 매질의 표면 장력이 박테리아의 표면 장력보다 큰 경우, 상기 박테리아는 표면장력이 작은 고체 지지체, 즉 소수성 고체 지지체에 더 잘 부착하고, 박테리아의 표면 장력이 액체 매질의 표면 장력보다 큰 경우, 상기 박테리아는 표면장력이 큰 고체 지지체, 즉 친수성 고체 지지체에 더 잘 부착하고, 박테리아의 표면 장력이 액체 매질의 표면 장력과 동일한 경우에는, 박테리아 세포의 고체 지지체 부착에는 표면 장력의 영향이 없고 정전기적 상호작용과 같은 다른 상호작용이 영향을 미치는 것으로 보고된 바 있다 (Applied and Environmental Microbiology, July 1983, p.90-97). 또한, 상기의 표면 장력에 근거한 열역학적 접근을 통하여, 박테리아 세포가 부착할 뿐만 아니라 정전기적 인력 특성을 통하여서도 박테리아 세포가 표면에 부착할 수 있다는 것도 알려져 있다. 그러나, 이러한 현상들은 그 부착 속도가 매우 느리다는 문제점이 있었다.
이에 본 발명자들은 상기한 바와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하고자, 비평면 형상의 고체 지지체를 사용하는 동시에, 미생물을 포함하는 시료를 pH 3.0 내 지 6.0의 범위에서 상기 고체 지지체와 접촉시킴으로써, 높은 수율로 미생물을 분리할 수 있음을 확인하였다. 이는 고체 지지체의 표면적이 증가하는 동시에, pH 3.0 내지 6.0의 액체 매질을 사용함으로써 미생물의 세포막이 변성되어 용액에 대한 용해도가 저하되어 고체 표면에 부착하는 비율이 상대적으로 높아지는 것으로 여겨지나, 본 발명의 범위가 이러한 특정한 기작에 한정되는 것은 아니다.
상기 접촉 단계에 있어서, 상기 시료는 미생물을 포함하는 시료이면 어느 것이나 포함된다. 바람직하게는, 상기 미생물을 포함하는 생물학적 시료, 임상 시료 및 실험실 시료로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이다. 본 발명에 있어서, "생물학적 시료 (biological sample)"란 개체로부터 분리된 세포 또는 생물학적 액체와 같은, 세포 또는 조직물을 포함하거나 그들로 구성된 시료를 의미한다. 상기 개체는 사람을 포함한 동물일 수 있다. 생물학적 시료의 예에는, 타액, 가래, 혈액, 혈액 세포 (예, 백혈구, 적혈구), 양막액, 혈청, 정액, 골수, 조직 또는 미세 바늘 생검 시료, 뇨, 복막액, 늑막액 및 세포 배양물이 포함된다. 생물학적 시료에는 조직학적 목적을 위하여 취하여진 냉동 절편과 같은 조직 절편이 포함된다. 바람직하게는, 상기 생물학적 시료는, 인간 환자로부터 유래된 시료인 "임상 시료 (clinical sample)"이고, 더욱 바람직하게는, 상기 시료는 혈액, 뇨, 타액, 또는 가래이다.
본 발명에 있어서, 분리의 대상이 되는 미생물에는 박테리아 세포, 곰팡이 및 바이러스가 포함된다.
상기 접촉 단계에 있어서, 상기 시료는 상기 미생물을 낮은 pH에서 완충 역 할을 할 수 있는 용액 또는 버퍼에 의하여 희석될 수 있다. 바람직하게는, 상기 버퍼는 포스페이트 버퍼 (예, 소듐 포스페이트, pH 3.0 내지 6.0) 또는 아세테이트 버퍼 (소듐 아세테이트, pH 3.0 내지 6.0)로 희석된 것일 수 있다. 상기 희석의 정도는 특별히 한정되지는 않으나, 바람직하게는, 1:1 내지 1:1,000의 배율, 더욱 바람직하게는, 1:1 내지 1:10의 배율로 희석되는 것일 수 있다.
상기 접촉 단계에 있어서, 상기 시료는 10 mM 내지 500 mM, 바람직하게는, 50 mM 내지 300 mM의 염 농도를 갖는 것이다. 상기 시료는, 10 mM 내지 500 mM, 바람직하게는, 50 mM 내지 300 mM의 아세테이트 및 포스페이트로 구성된 군으로부터 선택된 이온 농도를 갖는 것이다
상기 접촉 단계에 있어서, 상기 고체 지지체는 비평면 형상을 가지고 있어, 표면적이 평면에 비하여 증가되어 있는 표면을 갖는 것이다. 상기 고체 지지체는 표면에 요철 구조가 형성되어 있는 것일 수 있다. 본 발명에 있어서, "요철 구조"란 표면이 부드럽지 않고 오목함과 볼록함이 있는 구조를 말한다. 이러한 요철 구조에는 복수 개의 기둥이 형성되어 있는 기둥 구조를 갖는 표면 또는 복수 개의 공극 (pore)이 형성되어 있는 망상 구조를 갖는 표면이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
상기 접촉 단계에 있어서, 상기 비평면 형상의 고체 지지체는 임의의 형상을 가질 수 있다. 예를 들면, 표면에 복수 개의 기둥 (pillar)이 형성되어 있는 기둥 구조를 갖는 고체 지지체, 비드 형상을 갖는 고체 지지체, 및 표면에 복수 개의 공극 (pore)이 형성되어 있는 체 (sieve) 구조를 갖는 고체 지지체로 이루어진 군으 로부터 선택되는 것일 있다. 상기 고제 지지체는, 단독으로 또는 복수 개의 상기 고체 지지체의 집합 (예를 들면, 관 또는 용기 내에 충진된 집합체)으로 사용될 수 있다.
상기 접촉 단계에 있어서, 상기 고체 지지체는 미세유동장치 내의 마이크로채널 또는 마이크로챔버의 내벽의 형태인 것일 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 입구 및 출구가 구비되어 있고, 상기 입구 및 출구가 채널 또는 마이크로채널을 통하여 연통되어 있는 유동 장치 (fluidic device) 또는 미세유동장치 (microfluidic device) 내에서 수행될 수 있다.
본 발명의 방법의 제1 구체예는, 본 발명의 방법에 있어서 상기 접촉 단계에 있어서, 상기 고체 지지체는 그 표면에 복수 개의 기둥이 형성되어 있는 기둥 구조를 갖는 것일 수 있다. 고체 지지체 상에 기둥 (pillar)을 제조하는 것은 당업계에 널리 알려져 있다. 예를 들면, 반도체 제조 공정에 사용되는 포토리소그래피 공정 등을 사용하여 미세 기둥을 높은 밀도로 형성시킬 수 있다. 상기 기둥은 어스팩 비 (aspect ratio)가 1:1 내지 20:1인 것이 바람직하나, 상기 범위에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, "어스팩 비 (aspect ratio)" 란 기둥의 단면 직경 대 높이의 비율을 의미한다. 상기 기둥 구조는 기둥 높이 대 기둥 사이의 거리의 비율이 1:1 내지 25:1인 것일 수 있다. 상기 기둥 구조는 기둥 사이의 거리가 5 ㎛ 내지 100 ㎛의 범위를 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서 상기 접촉 단계에 있어서, 상기 비평면 형상의 고체 지지체는 물 접촉각이 70°내지 95°인 소수성을 갖는 것일 수 있다. 상기 물 접촉각이 70°내지 95°인 소수성은 고체 지지체의 표면을 옥타데실디메틸(3-트리메톡시실릴 프로필)암모늄 (OTC) 및 트리데카플루오로테트라히드로옥틸트리메톡시실란 (DFS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물이 코팅되어, 부여되는 것일 수 있다. 상기 물 접촉각이 70°내지 95°인 표면은 바람직하게는, 고체 지지체의 SiO2 층에 옥타데실디메틸(3-트리메톡시실릴 프로필)암모늄 (OTC) 및 트리데카플루오로테트라히드로옥틸트리메톡시실란 (DFS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물이 자가조립단분자 (SAM) 코팅되어 있는 것일 수 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 접촉 단계에 있어서, 상기 비평면 형상의 고체 지지체는 표면에 아민계의 관능기를 하나 이상 갖는 것일 수 있다. 상기 아민계의 관능기를 하나 이상 갖는 표면은 상기 고체 지지체의 표면에 폴리에틸렌이민트리메톡시실란 (PEIM)이 코팅되어 있는 것일 수 있다. 상기 코팅된 표면은 바람직하게는, 고체 지지체의 SiO2 층에 폴리에틸렌이민트리메톡시실란 (PEIM)이 자기조립단분자 (SAM) 코팅되어 있는 것일 수 있다. 상기 아민계의 관능기는 pH 3.0 내지 6.0의 범위에서 양전하를 띤다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 접촉 단계에 있어서, 상기 고제 지지체는 상기한 바와 같은 물 접촉각 특성을 갖는 것 또는 그 표면에 하나 이상의 아민계 관능기를 갖는 것이면 어떠한 재질의 지지체도 포함된다. 예를 들면, 유리, 실리콘 웨이퍼, 및 플라스틱 물질 등이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 상기 물 접촉각이 70°내지 95°인 표면 또는 그 표면에 하나 이상의 아민계 관능기를 갖는 표면은, 상기 표면을 가진 고체 지지체에 미생물을 포함하는 시료가 접촉되는 경우, 미생물이 부착하는 것으로 여겨지나, 본 발명이 특정한 기작에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법은, 상기 접촉 단계 후에 상기 고체 지지체에 부착되지 않은 목적 미생물 이외의 물질을 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 세척에는 상기 고체 지지체 표면에 부착된 목적 미생물은 상기 고체 지지체로부터 이탈시키지 않으면서, 후속 공정에 악영향을 미칠 수 있는 불순물을 제거할 수 있는 임의의 용액이 사용될 수 있다. 예를 들면, 결합 버퍼로 사용된 아세테이트 버퍼 및 포스페이트 버퍼 등이 사용될 수 있다. 상기 세척 용액은 바람직하게는, pH 3.0 내지 6.0의 범위에 포함되는 pH를 갖는 버퍼이다.
본 발명에 있어서, "미생물의 분리"란 시료 중의 미생물을 순수 분리하는 것 뿐만 아니라 농축하는 것을 포함하는 것이다.
본 발명의 미생물로부터 핵산을 분리하는 방법은, 상기 고체 지지체에 부착된 상기 미생물을 파쇄하는 단계를 포함한다.
상기 미생물 세포 파쇄는 당업계에 알려진 임의의 파쇄 방법에 의하여 이루어지는 파쇄 방법일 수 있다. 예를 들면, 끓임 파쇄 (boiling lysis), 레이저 파쇄, 화학 물질을 이용한 파쇄 및 전기 화학적 파쇄 (예, 전기 분해)로 이루어진 군으로부터 선택된 파쇄법에 의하여 파쇄되는 것일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법의 제2 구체예는, 본 발명의 방법에 있어서, 상기 미생물 파 쇄 단계는 pH 3.0 내지 6.0의 범위에서 수행하여 상기 미생물 유래의 핵산을 상기 고체 지지체에 부착시키는 것이다. 상기 파쇄는 pH 3.0 내지 6.0의 범위에서 이루어지는 것이면, 어떠한 액체 매질 중에서 수행되는 것이어도 된다. 상기 파쇄는 포스페이트 버퍼 또는 아세테이트 버퍼 중에서 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 방법의 상기 제2 구체예에 있어서, 파쇄된 미생물로부터 유출된 핵산은 상기 고체 지지체에 부착하게 된다. 이렇게 부착된 핵산은, 상기 고체 지지체 표면에 부착되지 않은 핵산, 세포, 바이러스, 또는 상기 세포 또는 바이러스의 파편 등을 제거함으로써 분리될 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법의 상기 제2 구체예는, 상기 파쇄 단계 후에, 상기 고체 지지체를 세척하여 상기 고체 지지체에 부착되지 않은 물질을 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 세척 단계에 있어서, 상기 세척 용액은 상기 표면에 부착된 핵산은 이탈시키지 않으면서, 상기 고체 지지체에 부착되지 않은 핵산 등의 물질을 제거할 수 있는 특성을 갖는 것이면 어떠한 물질이어도 된다. 바람직하게는, 상기 세척 용액은 상기 특성을 가지면서, 후속 공정에 악영향을 미칠 수 있는 불순물을 제거할 수 있는 용액이다. 상기 세척 용액의 예에는, 결합 버퍼로 사용된 아세테이트 버퍼 및 포스페이트 버퍼 등이 포함된다. 상기 세척 용액은 바람직하게는, pH 3.0 내지 6.0의 범위에 포함되는 pH를 갖는 버퍼이다.
본 발명의 방법의 상기 제2 구체예에 있어서, 상기 고체 지지체에 부착된 핵산은, 그대로 사용되거나 용출될 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법의 제2 구체예는, 상기 고체 지지체에 부착된 핵산을 용출하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 용출 단계에 있어서, 용출에 사용되는 용액은 상기 고체 지지체에 부착된 핵산을 이탈시키는 특성을 갖는 것이면, 당업계에 알려진 임의의 용액이 사용될 수 있다. 예를 들면, pH 가 높은 용액을 사용할 수 있을 것이다. 높은 pH 를 갖는 용액은 하이드록사이드 이온 (OH-) 가 표면을 음이온화 (anionic) 하게 변화시켜, 음이온성 성질을 띄고 있는 DNA 를 이탈시키는데 도움을 주게 된다. 바람직하게는 pH11 이상의 용액으로써, 대표적으로 NaOH 용액이 사용될 수 있다.
본 발명의 방법의 제3 구체예에는, 본 발명의 방법에 있어서, 상기 미생물 파쇄 단계는 pH 11 내지 14의 범위에서 수행되는 것이다. 이렇게 함으로써 DNA 가 고체지지체에 부착하는 것을 최소화하여 DNA 용출을 용이하게 수행할 수 있다. 높은 pH를 갖는 용액은 하이드록사이드 이온 (OH-) 가 고체 지지체 표면을 음이온화 (anionic)하게 변화시켜, 음이온성 성질을 띄고 있는 파쇄후 나온 DNA 가 고체지지체에 부착하지 않게 한다. 즉, 고체지지체에서 미생물을 부착하고 그것으로부터 유래된 DNA를 용출하는 것을 목적으로 한다면, 높은 pH 에서 미생물 파쇄단계를 수행하고 동일한 높은 pH 용액을 통해 용출하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법의 제3 구체예에는, 상기 파쇄단계에서 얻어진 파쇄물로부터 핵산을 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다. 미생물 파쇄물로부터 핵산을 정제하는 방법은 당업계에 알려진 임의의 방법이 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기한 바와 같은 본 발명의 미생물로부터 핵산을 분리하는 방법에 의하여 분리된 핵산을 주형으로 하여 표적 핵산을 증폭시키는 단계를 포함하는, 핵산을 증폭시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 핵산을 증폭시키는 방법에 있어서, 상기 핵산 증폭에는 당업계에 알려진 임의의 증폭 방법이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 PCR에 의하여 수행되는 것이다. 미생물로부터 핵산을 분리하는 방법에 대하여는 상기한 바와 같다.
본 발명의 핵산을 증폭시키는 방법에 있어서, 상기 "핵산"에는 DNA 및 RNA가 포함된다. 바람직하게는, 상기 핵산은 DNA이다.
본 발명의 핵산을 증폭시키는 방법에 있어서, 상기 핵산 분리와 상기 핵산 증폭은 상기 고체 지지체를 포함하는 동일한 용기 내에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 용기는 예를 들면, 마이크로채널, 마이크로챔버 및 튜브 등이 될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 미세유동장치에 형성되어 있는, 마이크로챔버로서, PCR 장치가 구비되어 있는 것이다. 상기 PCR 장치는 히터 및 냉각기를 포함하는 것이다. 따라서, 본 발명의 핵산을 증폭시키는 방법의 일 구체예는, 상기 핵산 추출이 마이크로챔버에서 수행되고, 상기 핵산 증폭이 동일한 상기 마이크로챔버에서 수행되는 것이다.
본 발명의 핵산을 증폭시키는 방법에 있어서, 상기 핵산 분리와 상기 핵산 증폭은 서로 다른 용기 내에서 수행되는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 핵산 분리는 상기 고체 지지체를 포함하는 용기 내에서 수행되고, 상기 핵산 증폭은 상기 고체 지지체를 포함하는 용기와 연통되어 있는 다른 용기 또는 연통되어 있지 않은 다른 용기 내에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 용기는 예를 들면, 마이크로채널, 마이크로챔버 및 튜브 등이 될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 상기 핵산 분리는 미세유동장치의 마이크로채널 또는 마이크로챔버에서 수행되고, 상기 분리된 핵산은 다른 마이크로채널 또는 마이크로챔버로 이송되고 용출되어, 증폭반응에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 비평면 형상의 고체 지지체가 포함되어 있는 반응 챔버, 상기 챔버를 가열하기 위한 가열부, 상기 가열부가 상기 챔버를 가열하는 것을 조절하기 위한 온도 조절부를 포함하는, 핵산 분리 및 증폭 장치를 제공한다.
본 발명의 핵산 분리 및 증폭 장치에 있어서, 상기 고체 지지체는 비평면 형상을 가지고 있어, 표면적이 평면에 비하여 증가되어 있는 표면을 갖는 것이다. 상기 고체 지지체는 표면에 요철 구조가 형성되어 있는 것일 수 있다. 본 발명에 있어서, "요철 구조"란 표면이 부드럽지 않고 오목함과 볼록함이 있는 구조를 말한다. 이러한 요철 구조에는 복수 개의 기둥이 형성되어 있는 기둥 구조를 갖는 표면 또는 복수 개의 공극 (pore)이 형성되어 있는 망상 구조를 갖는 표면이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 핵산 분리 및 증폭 장치에 있어서, 상기 비평면 형상의 고체 지지체는 임의의 형상을 가질 수 있다. 예를 들면, 표면에 복수 개의 기둥 (pillar)이 형성되어 있는 기둥 구조를 갖는 고체 지지체, 비드 형상을 갖는 고체 지지체, 및 표면에 복수 개의 공극 (pore)이 형성되어 있는 체 (sieve) 구조를 갖는 고체 지지체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 있다. 상기 고제 지지체는, 단독으로 또는 복수 개의 상기 고체 지지체의 집합 (예를 들면, 관 또는 용기 내에 충진된 집 합체)으로 사용될 수 있다.
본 발명의 핵산 분리 및 증폭 장치에 있어서, 상기 고체 지지체는 미세유동장치 내의 마이크로채널 또는 마이크로챔버의 내벽의 형태인 것일 수 있다. 따라서, 본 발명의 핵산 분리 및 증폭 장치는, 하나 이상의 입구 및 출구가 구비되어 있고, 상기 입구 및 출구가 채널 또는 마이크로채널을 통하여 연통되어 있는 유동 장치 (fluidic device) 또는 미세유동장치 (microfluidic device)일 수 있다. 즉, 핵산의 분리와 PCR이 동일한 챔버에서 수행될 수 있는 유동 장치 (fluidic device) 또는 미세유동장치 (microfluidic device)일 수 있다.
본 발명의 핵산 분리 및 증폭 장치의 제1 구체예는, 본 발명의 장치에 있어서, 상기 고체 지지체는 그 표면에 복수 개의 기둥이 형성되어 있는 기둥 구조를 갖는 것일 수 있다. 고체 지지체 상에 기둥 (pillar)을 제조하는 것은 당업계에 널리 알려져 있다. 예를 들면, 반도체 제조 공정에 사용되는 포토리소그래피 공정 등을 사용하여 미세 기둥을 높은 밀도로 형성시킬 수 있다. 상기 기둥은 어스팩 비 (aspect ratio)가 1:1 내지 20:1인 것이 바람직하나, 상기 범위에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, "어스팩 비 (aspect ratio)" 란 기둥의 단면 직경 대 높이의 비율을 의미한다. 상기 기둥 구조는 기둥 높이 대 기둥 사이의 거리의 비율이 1:1 내지 25:1인 것일 수 있다. 상기 기둥 구조는 기둥 사이의 거리가 5 ㎛ 내지 100 ㎛의 범위를 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 핵산 분리 및 증폭 장치에 있어서, 상기 비평면 형상의 고체 지지체는 물 접촉각이 70°내지 95°인 소수성을 갖는 것일 수 있다. 상기 물 접촉각이 70°내지 95°인 소수성은 고체 지지체의 표면을 옥타데실디메틸(3-트리메톡시실릴 프로필)암모늄 (OTC) 및 트리데카플루오로테트라히드로옥틸트리메톡시실란 (DFS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물이 코팅되어, 부여되는 것일 수 있다. 상기 물 접촉각이 70°내지 95°인 표면은 바람직하게는, 고체 지지체의 SiO2 층에 옥타데실디메틸(3-트리메톡시실릴 프로필)암모늄 (OTC) 및 트리데카플루오로테트라히드로옥틸트리메톡시실란 (DFS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물이 자가조립단분자 (SAM) 코팅되어 있는 것일 수 있다.
본 발명의 핵산 분리 및 증폭 장치에 있어서, 상기 비평면 형상의 고체 지지체는 표면에 아민계의 관능기를 하나 이상 갖는 것일 수 있다. 상기 아민계의 관능기를 하나 이상 갖는 표면은 상기 고체 지지체의 표면에 폴리에틸렌이민트리메톡시실란 (PEIM)이 코팅되어 있는 것일 수 있다. 상기 코팅된 표면은 바람직하게는, 고체 지지체의 SiO2 층에 폴리에틸렌이민트리메톡시실란 (PEIM)이 자기조립단분자 (SAM) 코팅되어 있는 것일 수 있다. 상기 아민계의 관능기는 pH 3.0 내지 6.0의 범위에서 양전하를 띤다.
본 발명의 핵산 분리 및 증폭 장치에 있어서, 상기 가열부는 상기 챔버를 가열하기 위한 당업계에 알려진 임의의 장치일 수 있다. 상기 가열부에는 예를 들면, 히터 및 마이크로히터가 포함된다.
본 발명의 핵산 분리 및 증폭 장치에 있어서, 상기 온도 조절부는 상기 가열부가 상기 챔버를 가열하는 것을 조절하여 PCR에 사용되는 온도 사이클을 발생시키 는 당업계에 알려진 임의의 조절 수단이 사용될 수 있다. 상기 온도 조절부에는, 상기 챔버의 온도를 감지는 온도 센서 및 상기 가열부의 작동을 온/오프 시키는 수단이 포함될 수 있다.
실시예
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 기둥 구조를 갖는 고체 지지체의 DNA 결합 특성의 확인
본 실시예에서는 입구와 출구가 구비되어 있고, 크기 10 mm x 23 mm인 기판 상에 기둥의 어레이가 형성되어 있는 챔버를 갖는 유동 장치에 DNA 시료를 흘려주어 그 결합 특성을 확인하였다. 상기 기둥 어레이에 있어서, 기둥 사이의 거리가 12 ㎛이고, 기둥 높이가 100 ㎛이고, 각 기둥의 단면은 한 변의 길이가 25 ㎛이 정사각형이다.
상기 기둥 어레이가 형성된 영역의 표면은 각각 하나 이상의 아민계 관능기를 가진 PEIM 및 물 접촉각이 70°내지 95°의 범위에 포함되는 OTC (물 접촉각 80°)가 코팅된 표면을 가진다.
DNA 시료는 0.01N NaOH 중의 DNA (pH 12) 및 100 mM NaH2PO4 중의 DNA (pH 7.0)를 사용하였으며, 유속은 200 ㎕/분으로 200 ㎕를 흘려 주었다.
상기 유동 장치 내의 기둥 어레이에 결합된 DNA는 피코그린 키트 (Molecular Probes 사) 및 분광기를 이용하여 측정하였다. 실험은 제조사의 지침에 따라 수행하였다.
도 1는 pH 12.0의 NaOH 용액 및 pH 7.0의 포스페이트 버퍼 중의 DNA 양과 흡광강도 사이의 상관관계를 나타내는 도면이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, DNA 농도와 흡광강도 사이에는 비례관계가 있고, 도출된 비례식 (형광강도와 DNA 농도)을 통하여 DNA 정량이 가능하다는 것을 보여준다.
도 2는 DNA 시료를 기둥 어레이가 형성되어 있는 유동 장치를 통하여 흘려준 후 pH에 따른 DNA의 부착 정도를 나타낸 도면이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, pH 12.0의 NaOH 중의 DNA인 경우, 상기 기둥 어레이 영역의 표면의 성질에 상관없이 DNA 회수율은 95% 이상이었다. pH 7.0의 포스페이트 버퍼 중의 DNA인 경우, DNA 회수율은 약 40% 이하였다. 이는 높은 pH 의 범위(11~14)에서는 DNA 의 부착이 거의 발생하지 않으며, 상대적으로 낮은 pH 범위(3~8) 에서는 상기 고체 지지체에 DNA가 부착하는 효율이 높다는 것을 나타내는 것이다. 이러한 성질을 이용함으로써, 기둥어레이를 갖는 고체지지체에 DNA 의 부착, 용출을 용이할 수 있을 것이다. 즉, 고체지지체에 DNA 를 부착시키고자 한다면 낮은 pH 에서, 그리고 DNA 를 용출시키고자 한다면 높은 pH 에서 DNA 를 다루어야 할 것이다.
실시예 2: 유동 장치 내의 기둥 어레이가 형성되어 있는 고체 지지체에 세포를 결합, 세포 파쇄 및 DNA 의 용출
본 실시예에서는 입구와 출구가 구비되어 있고, 크기 10 mm x 23 mm인 기판 상에 기둥의 어레이가 형성되는 유동 장치에 세포 시료를 흘려주고, 세포를 파쇄한 다음, DNA를 용출하였다. 상기 기둥 어레이에 있어서, 기둥 사이의 거리가 12 ㎛이고, 기둥 높이가 100 ㎛이고, 각 기둥의 단면은 한 변의 길이가 25 ㎛이 정사각형이다.
상기 기둥 어레이가 형성된 영역의 표면은 물 접촉각이 70° 내지 95°의 범위에 포함되는 OTC (물 접촉각 80°)가 코팅된 표면을 가진다.
세포 시료는 LB 배지 중의 0.01 OD600의 대장균을 사용하였다. 상기 시료는 유속 200 ㎕/분으로 250 ㎕를 흘려 주었다.
다음으로, 상기 기둥 어레이가 형성된 영역의 표면에 결합되어 있는 대장균을 파쇄하였다. 세포 파쇄는 0.01N NaOH 50 ㎕ 용액을 25 ㎕/분의 유속으로 2분 동안 흘려주거나 (이하 0.01N NaOH_2라고도 한다), 0.01N NaOH 50 ㎕ 용액을 5 ㎕/분의 유속으로 10분 동안 흘려주거나 (이하 0.01N NaOH_10라고도 한다), 0.01N NaOH 3.5 ㎕ 용액을 챔버에 채운 후, 2 분 동안 끓이고, 0.01N NaOH 45 ㎕ 용액을 200 ㎕/분으로 흘려 주었다 (이하 0.01N NaOH/끓이기라고도 한다).
세포 파쇄 후 흘러나오는 파쇄액 40 ㎕를 회수하여, DNA의 농도를 피코그린키트 (Molecular Probes 사) 및 분광기를 이용하여 측정하였다. DNA 용출 효율은 (시료 형광량/100% 세포 파쇄시 예상되는 형광량)x100으로 계산하였다. DNA 표준 곡선은 동일한 농도의 NaOH를 이용하여 농도를 아는 대장균이 포함되어 있는 시료를 튜브 중에서 파쇄하여 세포 농도에 따른 형광 강도를 측정하여 구하였다.
100% 세포 파쇄시 예상되는 형광량은 다음과 같이 구할 수 있다. Input cells 량 = 10^7 cells/ml (1.O D600을 109 세포/ml로 가정) * 0.25ml = 2.5*10^6 cells, (binding efficiency = 100% 가정시). 그러므로 용출될 수 있는 DNA 량 = 2.5*10^6 cells * 5fg DNA / E.coli cell = 12.5 ng 이다. 이것을 용출에 사용된 총 NaOH 부피 약 50ul 의 부피로 나누면, 그 농도는 0.25 ng/ul 가 된다. 이것을 STD curve 에 대입하면, 100% 세포 파쇄시 예상되는 형광량 얻게 된다.
도 3은 세포 파쇄 후 파쇄물 중에 존재하는 DNA의 양과 세포의 농도 사이의 상관관계를 나타내는 표준 곡선이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 세포 농도와 세포 파쇄물 중의 DNA 농도 사이에는 비례관계가 있다.
도 4는 옥타데실디메틸 (3-트리메톡시실릴 프로필)암모늄 (OTC)가 코팅되어 있고 기둥 어레이가 형성되어 있는 표면을 갖는 챔버를 포함하는 유동 장치를 통하여 대장균 시료를 흘러주고, 세포를 파쇄한 다음 상기 파쇄물을 회수하여 DNA의 효율을 측정한 결과를 나타내는 도면이다. 도 4에 나타낸 바와 같이, NaOH를 사용하는 경우에는, 끓이는 방법과 병행하여 사용하는 방법이 가장 효율적이었다. 0.01N NaOH/끓이기의 경우, 1.O D600을 109 세포/ml로 가정하는 경우, DNA가 32% 회수되었다. 이상과 같은 결과를 고려하면, 세포 파쇄 후 DNA 회수율은, 세포 OD의 오차 (일반적으로 1.0 OD600은 5x108 내지 109 세포/ml임)를 감안하면, 30-60%인 것으로 여겨진다.
실시예 3: 유동 장치 내의 기둥 어레이가 형성되어 있는 고체 지지체에 세포 를 결합, 세포 파쇄, DNA 정제 및 증폭
본 실시예에서는 입구와 출구가 구비되어 있고, 크기 7.5 mm x 15 mm인 기판상에 기둥의 어레이가 형성되는 유동 장치에 세포 시료를 흘려주고, 세포를 파쇄하여 DNA를 기판상에 결합시키고, 결합되지 않은 물질을 세척하여 제거하고, 상기 기판상에 결합된 DNA를 주형으로 DNA를 증폭하였다. 상기 기둥 어레이에 있어서, 기둥 사이의 거리가 15 ㎛이고, 기둥 높이가 100 ㎛이고, 각 기둥의 단면은 한 변의 길이가 25 ㎛이 정사각형이다.
상기 기둥 어레이가 형성된 영역의 표면은 물 접촉각이 70° 내지 95°의 범위에 포함되는 OTC (물 접촉각 80 °)가 코팅된 표면을 가진다.
세포 시료는 LB 배지 중의 0.01 OD600의 대장균 시료를 사용하였다. 상기 시료는 100 mM 소듐 아세테이트 버퍼를 사용하여 pH 4.0으로 조정된 것을 사용하였으며, 유속 100 ㎕/분으로 입구로부터 상기 챔버를 통하여 출구로 5분 동안 흘려 주었다.
다음으로, 상기 기둥 어레이가 형성된 영역의 표면에 결합되어 있는 대장균을 파쇄하였다. 세포 파쇄는 100 mM 포스페이트 버퍼 (pH 4.0)를 상기 챔버에 채우고 95 ℃에서 2분 동안 처리한 다음 실온으로 냉각시키는 과정을 5회 반복함으로써 이루어졌다. 다음으로, 세포 파쇄 후 상기 기둥 어레이가 형성된 영역의 표면에 결합되지 않은 이물질을 100 mM 포스페이트 버퍼 (pH 4.0)를 사용하여 200 ㎕/분의 유속으로 200 ㎕를 흘려 주어 세척하였다.
다음으로, 상기 기둥 어레이가 형성된 영역의 표면에 결합되어 있는 DNA를 고체 지지체에 부착된 DNA를 주형으로 PCR을 수행하였다. PCR을 Taqman probe를 사용하여 수행하였다.
도 5는 대장균 시료를 유동 장치 중의 기둥 어레이가 형성된 표면을 갖는 챔버를 통하여 흘려 주고, 세포 파쇄, 세척 및 실시간 (real time) PCR 증폭한 결과를 나타낸 도면이다. 도 5에 있어서, 상기 시료는 다음 표 1에 나타낸 바와 같다.
표 1.
시료명 처리 Ct (분)
1 dPCR1 14.14
2 dPCR2 14.13
3 정제 PCR1 13.29
4 정제 dPCR2 14.63
5 0.01 OD 세포 25.72
6 음성 대조군 25.23
표 1에서, 정제 PCR은 파쇄/세척을 한 샘플 (아래 전기영동의 레인 3, 4)를 의마하고, dPCR은 그렇지 않은 샘플 (아래 전기영동의 레인 1,2)를 의미한다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 대장균 시료를 유동 장치 중의 기둥 어레이가 형성된 표면을 갖는 챔버를 통하여 흘려 주고, 세포 파쇄, 세척 및 실시간 (real time) PCR 증폭하는 경우, 0.01 OD 세포 표준 시료에 비하여 10 회 이상의 PCR 사이클 차이를 보인다 (DNA 농축률 1,000 배). 대장균 세포를 결합시키고, 세포 파쇄, 세척 및 PCR을 수행하는 경우와 대장균 세포를 결합시키고, 세포 파쇄없이 PCR을 수행하는 경우 사이에 Ct 값은 유의한 차이를 보이지 않았다. 이는 세포 수준에서의 농축 및 정제 효과가 크기 때문에, DNA 수준에서의 정제 효과는 크지 않은 것으로 여겨진다.
도 6은 대장균 시료를 유동 장치 중의 기둥 어레이가 형성된 표면을 갖는 챔버를 통하여 흘려 주고, 세포 파쇄, 세척 및 실시간 (real time) PCR 증폭하여 얻어진 산물을 전기 영동하고, 그 농도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다. 도 6에 있어서, 레인 1 및 2는 대장균을 결합시키고 세포 파쇄 없이 PCR을 수행한 결과를 나타내고, 레인 3 및 4는 대장균을 결합시키고 세포 파쇄 후 PCR을 수행한 결과를 나타내고, 레인 6은 0.01 OD 대장균 시료를 주형으로 PCR한 결과를 나타내는 도면이다. 측정된 최종 산물의 농도는 다음 표 2과 같다. 세포 파쇄 과정을 통하여 최종 산물의 농도가 70% 이상 증가한 것을 알 수 있다.
표 2.
세포결합/세포파쇄/세척/PCR 세포결합/PCR 0.01 OD 대장균 시료를 사용한 PCR
DNA 농도 (ng/㎕) 24.45 17.35 735
0.01 OD 대장균 시료를 사용한 PCR에대한 증가비율 226% 131% 1
실시예 4: 임상 모사 시료를 이용한 유동 장치 내의 기둥 어레이가 형성되어 있는 고체 지지체에 세포를 결합, 세포 파쇄, DNA 정제 및 증폭
본 실시예에서는 입구와 출구가 구비되어 있고, 크기 7.5 mm x 15 mm 인 기판상에 기둥의 어레이가 형성되는 유동 장치에 뇨 중에 대장균 세포를 포함하는 시료를 흘려주고, 세포를 파쇄하여 DNA를 기판상에 결합시키고, 결합되지 않은 물질을 세척하여 제거하고, 상기 기판상에 결합된 DNA를 주형으로 DNA를 증폭하였다. 상기 기둥 어레이에 있어서, 기둥 사이의 거리가 15 ㎛이고, 기둥 높이가 100 ㎛이고, 각 기둥의 단면은 한 변의 길이가 25 ㎛이 정사각형이다.
상기 기둥 어레이가 형성된 영역의 표면은 물 접촉각이 70° 내지 95°의 범위에 포함되는 OTC (물 접촉각 80 °)가 코팅된 표면을 가진다.
세포 시료는 소듐 아세테이트 버퍼 (pH 4.0)로 4:1로 희석된 뇨 중에 0.01 OD600의 대장균을 포함하는 시료를 사용하였으며, 유속 100 ㎕/분으로 입구로부터 상기 챔버를 통하여 출구로 5분 동안 흘려 주었다. 대조군 시료로는 0.01 OD 대장균 시료를 사용하였다 (pH 4).
다음으로, 상기 기둥 어레이가 형성된 영역의 표면에 결합되어 있는 대장균을 파쇄하였다. 세포 파쇄는 100 mM 포스페이트 버퍼 (pH 4.0)를 상기 챔버에 채우고 95 ℃에서 2분 동안 처리한 다음 실온으로 냉각시키는 과정을 5회 반복함으로써 이루어졌다. 다음으로, 세포 파쇄 후 상기 기둥 어레이가 형성된 영역의 표면에 결합되지 않은 이물질을 100 mM 포스페이트 버퍼 (pH 4.0)를 사용하여, 200 ㎕/분의 유속으로 200 ㎕를 흘려 주어 세척하였다. 다음으로, 상기 기둥 어레이가 형성된 영역의 표면에 결합되어 있는 DNA를 고체 지지체에 부착된 DNA를 주형으로 PCR을 수행하였다. PCR을 Sybr Green를 사용하여 수행하였다.
도 7은 대장균을 포함하는 뇨 시료를 유동 장치 중의 기둥 어레이가 형성된 표면을 갖는 챔버를 통하여 흘려 주고, 세포 파쇄, 세척 및 실시간 (real time) PCR 증폭한 결과를 나타낸 도면이다. 도 7에 있어서, 상기 시료는 다음 표 3과 같다.
표 3.
시료명 처리 Ct (분)
1 정제 PCR1 11.43
2 정제 PCR2 11.21
3 dPCR1 11.94
4 dPCR2 13.16
5 음성 대조군1 23.76
6 음성 대조군2 23.38
표 3에서, 정제 PCR은 파쇄/세척을 한 것이고, 나머지는 그 과정을 하지 않은 것이다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 대장균을 포함하는 뇨 시료를 유동 장치 중의 기둥 어레이가 형성된 표면을 갖는 챔버를 통하여 흘려 주고, 세포 파쇄, 세척 및 실시간 (real time) PCR 증폭하는 경우, 상기 뇨 시료를 유동 장치 중의 기둥 어레이가 형성된 표면을 갖는 챔버를 통하여 흘려 주고, 세포 파쇄 및 세척 없이 실시간 PCR 증폭한 경우에 비하여, Ct 값이 약 1 사이클 앞섰다.
실시예 4: 임상 모사 시료를 이용한 유동 장치 내의 기둥 어레이가 형성되어 있는 고체 지지체에 세포를 결합, 세포 파쇄, DNA 용출 및 증폭 - 상용 DNA 정제 키트와의 비교 실험
본 실시예에서는 입구와 출구가 구비되어 있고, 크기 10 mm x 23 mm 인 기판상에 기둥의 어레이가 형성되는 유동 장치에 전혈 (whole blood) 중에 대장균 세포를 포함하는 시료를 흘려주고, 세포를 파쇄하여 DNA를 기판에서 용출시키고, 용출된 DNA를 주형으로 DNA를 증폭하였다. 본 방법을 상용으로 널리 팔고 있는 Qiagen 사의 DNA 정제 키트와 비교평가 하였다.
상기 기둥 어레이에 있어서, 기둥 사이의 거리가 12 ㎛이고, 기둥 높이가 100 ㎛이고, 각 기둥의 단면은 한 변의 길이가 25 ㎛이 정사각형이다. 상기 기둥 어레이가 형성된 영역의 표면은 물 접촉각이 70° 내지 95°의 범위에 포함되는 OTC (물 접촉각 80 °)가 코팅된 표면을 가진다.
세포 시료는 전혈 1ml 에 10 ㎕의 1.0 OD600의 대장균을 넣어 0.01 OD600의 대장균을 갖는 임상모사 샘플을 제작하였다. 상기 샘플 200 ㎕를 소듐 아세테이트 버퍼 (pH 3.0, 100mM)로 1:1로 희석하여 200 ㎕/분으로 입구로부터 상기 챔버를 통하여 출구로 흘려 주었다. 다음으로, 상기 기둥 어레이가 형성된 영역의 표면에 결합되어 있는 대장균을 파쇄하였다. 세포 파쇄는 0.01N NaOH 5ul 를 주입하여, 2분간 끓이고 이것을 45 ㎕ NaOH 용액을 추가로 투입하여 200 ㎕/min의 유속으로 DNA를 용출하였다.
대조군 시료 (Qiagen 사 키트, Cat 13323, Blood & Cell Culture DNA Mini Kit)는 상기 임상모사샘플 200 ㎕를 Qiagen 사가 제공하는 프로토콜을 통하여 제작하였다.
다음으로, 위에서 얻어진 두 가지 샘플을 PCR (Sybr Green)을 수행하였다. 아래의 표 4와 같이 Ct 값이나 PCR 산물 농도에 있어서, 상용화된 키트와 유사한 결과를 보임을 알 수 있다. 즉, 발명된 방법을 통해 준비된 DNA가 추가적인 DNA 정제과정없이도 PCR 하기에 충분한 질(quality) 임을 알 수 있다. 두 가지 방법의 DNA 준비과정 시간은 차이가 많다. 본 발명의 경우는 10 분 이내로 소요되었으며, Qiagen 방법은 45분 정도 소요되었다. 또한 본 발명은 하나의 칩 (chip)에서 세포획득에서 DNA 용출까지가 가능하여, 자동화하기가 매우 유리하다. 그러므로, 향후 LOC 제작에 있어서 매우 유용할 것이다. 표 4에서, SAIT는 본 발명, 농도는 도 9의 전기영동 결과를 나타낸다.
표 4.
칩 CT 농도 (ng/㎕)
SAIT1 18.7 11.8
SAIT2 18.9 13.1
Qiagen1 18.4 13.0
Qiagen2 17.8 11.5
음성대조군 28.8 -
도 8은 대장균을 포함하는 전혈 (whole blood) 시료를 유동 장치 중의 기둥 어레이가 형성된 표면을 갖는 챔버를 통하여 흘러주고, 세포 파쇄, DNA 용출 후 그것을 실시간 (real time) PCR 증폭한 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는 대장균을 포함하는 전혈 (whole blood) 시료를 유동 장치 중의 기둥 어레이가 형성된 표면을 갖는 챔버를 통하여 흘려 주고, 세포 파쇄, DNA 용출, 실시간 (real time) PCR 증폭한 산물을 전기영동한 결과를 나타내는 도면이다.
본 발명에 따른 미생물로부터 핵산을 분리하는 방법에 의하면, 미생물 분리와 핵산 과정을 동시에 효율적으로 수행할 수 있다. 또한, 카오트로픽제와 같은 별도의 핵산 분리제를 사용하지 않고서도 핵산을 분리할 수 있어서 분리 공정이 단순하다. 또한, 본 발명의 방법은, 랩온어칩 (LOC)과 같은 소형화된 장치를 이용하여 유용하게 구현될 수 있다.
본 발명에 따른 DNA를 증폭시키는 방법에 의하면, 세포 분리와 핵산 분리를 연속적으로 수행할 수 있어서, 랩온어칩 (LOC)과 같은 소형화된 장치를 이용하여 효율적으로 핵산을 증폭할 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 분리 및 증폭 장치에 의하면, 미생물의 분리, 상기 미생물로부터의 핵산의 분리 및 상기 핵산을 주형으로 한 핵산 증폭 과정을 동일한 용기 또는 다른 용기에서 수행할 수 있다.

Claims (38)

  1. 비평면 형상의 고체 지지체와, 미생물을 포함하는 시료를 pH 3.0 내지 6.0의 범위에서 접촉시켜 상기 미생물을 상기 고체 지지체에 부착시키는 단계, 및
    상기 고체 지지체에 부착된 상기 미생물을 파쇄하는 단계를 포함하는, 미생물로부터 핵산을 분리하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 박테리아, 곰팡이 또는 바이러스인 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 시료는 생물학적 시료인 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 시료는 혈액, 뇨, 또는 타액인 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 시료는 포스페이트 버퍼 또는 아세테이트 버퍼로 희석된 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 희석은 1:1 내지 1:10의 비율로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 시료는 10 mM 내지 500 mM의 염 농도를 갖는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 시료는 50 mM 내지 300 mM의 염 농도를 갖는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 비평면 형상의 고체 지지체는 표면에 복수 개의 기둥 (pillar)이 형성되어 있는 기둥 구조를 갖는 고체 지지체, 비드 형상을 갖는 고체 지지체 및 표면에 복수 개의 공극이 형성되어 있는 체 (sieve) 구조를 갖는 고체 지지체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 기둥은 어스팩 비가 1:1 내지 20:1인 것인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 기둥 구조는 기둥 높이 대 기둥 사이의 거리의 비율이 1:1 내지 25:1인 것인 방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 기둥 구조는 기둥 사이의 거리가 5 ㎛ 내지 100 ㎛의 범위를 갖는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 비평면 형상의 고체 지지체는 물 접촉각이 70°내지 95°인 소수성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 소수성은 상기 고체 지지체의 표면을 옥타데실디메틸(3-트리메톡시실릴 프로필)암모늄 (OTC) 또는 트리데카플루오로테트라히드로옥틸트리메톡시실란 (DFS)의 화합물로 코팅하여 부여되는 성질인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 비평면 형상의 고체 지지체는 그 표면에 아민계의 관능기를 하나 이상 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 아민계의 관능기를 하나 이상 갖는 표면은 폴리에틸렌이민트리메톡시실란 (PEIM)으로 코팅되어 있는 것인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 접촉 단계 후에 상기 고체 지지체에 부착되지 않은 목적 미생물 이외의 물질을 세척하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 미생물 파쇄는 끓임 파쇄, 레이저 파쇄, 화학물질을 이용한 파쇄 및 전기화학적 파쇄로 이루어진 군으로부터 선택된 파쇄법에 의한 파쇄인 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 미생물 파쇄 단계는 pH 3.0 내지 8.0의 범위에서 수행하여 상기 미생물 유래의 핵산을 상기 고체 지지체에 부착시키는 단계인 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 파쇄 단계 후에, 상기 고체 지지체를 세척하여 상기 고체 지지체에 부착되지 않은 물질을 세척하는 단계를 더 포함하는 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 고체 지지체에 부착된 핵산을 용출하는 단계를 더 포함하는 방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기 미생물 파쇄 단계는 pH 11 내지 14의 범위에서 수행되는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 파쇄단계에서 얻어진 파쇄물로부터 핵산을 분리하는 단계를 더 포함하는 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따라 분리된 핵산을 주형으로 하여 표적 핵산을 증폭시키는 단계를 포함하는, 핵산을 증폭시키는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA인 방법.
  26. 제24항에 있어서, 상기 핵산 증폭은 비평면 형상의 고체 지지체를 포함하는 챔버와 동일한 챔버 내에서 또는 상기 챔버와 유동적으로 연결된 다른 챔 내에서 수행되는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 증폭은 PCR에 의하여 수행되는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 주형 핵산은, 추가의 핵산 분리 과정을 거치지 않은, 상기 미생물 파쇄물 중에 존재하는 핵산을 주형으로 사용하는 것인 방법.
  29. 비평면 형상의 고체 지지체가 포함되어 있는 챔버, 상기 챔버를 가열하기 위한 가열부, 상기 가열부가 상기 챔버를 가열하는 것을 조절하기 위한 온도 조절부를 포함하는, 핵산 분리 및 증폭 장치.
  30. 제29항에 있어서, 비평면 형상의 고체 지지체가 포함되어 있는 챔버와 유동적으로 연결된 핵산 증폭 챔버를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분리 및 증폭 장치.
  31. 제29항에 있어서, 상기 비평면 형상의 고체 지지체는 표면에 복수 개의 기둥 (pillar)이 형성되어 있는 기둥 구조를 갖는 고체 지지체, 비드 형상을 갖는 고체 지지체 및 표면에 복수 개의 공극이 형성되어 있는 체 (sieve) 구조를 갖는 고체 지지체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 장치.
  32. 제31항에 있어서, 상기 기둥은 어스팩 비가 1:1 내지 20:1인 것인 장치.
  33. 제31항에 있어서, 상기 기둥 구조는 기둥 높이 대 기둥 사이의 거리의 비율이 1:1 내지 25:1인 것인 장치.
  34. 제31항에 있어서, 상기 기둥 구조는 기둥 사이의 거리가 5 ㎛ 내지 100 ㎛의 범위를 갖는 것인 장치.
  35. 제29항에 있어서, 상기 비평면 형상의 고체 지지체는 물 접촉각이 70°내지 95°인 소수성을 갖는 것을 특징으로 하는 장치.
  36. 제35항에 있어서, 상기 소수성은 상기 고체 지지체의 표면을 옥타데실디메틸(3-트리메톡시실릴 프로필)암모늄 (OTC) 또는 트리데카플루오로테트라히드로옥틸트리메톡시실란 (DFS)의 화합물로 코팅하여 부여되는 성질인 것을 특징으로 하는 장치.
  37. 제29항에 있어서, 상기 비평면 형상의 고체 지지체는 그 표면에 아민계의 관 능기를 하나 이상 갖는 것을 특징으로 하는 장치.
  38. 제37항에 있어서, 상기 아민계의 관능기를 하나 이상 갖는 표면은 폴리에틸렌이민트리메톡시실란 (PEIM)으로 코팅되어 있는 것인 장치.
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