KR100456284B1

KR100456284B1 - 미생물로부터의 신속한 핵산의 분리방법

Info

Publication number: KR100456284B1
Application number: KR10-2002-0039837A
Authority: KR
Inventors: 소재성; 오은택
Original assignee: 학교법인 인하학원
Priority date: 2002-07-09
Filing date: 2002-07-09
Publication date: 2004-11-09
Also published as: KR20040005332A

Abstract

본 발명은 미생물로부터 핵산을 분리하는 방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 미생물로부터 핵산을 분리하는 방법에 있어서, 글래스 비드를 이용하여 미생물의 세포벽을 파괴하는 단계, 페놀 또는 클로로포름을 처리하여 단백질을 제거하는 단계 및 알코올 공침을 통해 핵산을 침전시켜 핵산을 수득하는 단계를 통하여 핵산을 분리하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 미생물로부터 핵산을 분리하는 방법은 글래스 비드를 사용하여 미생물의 세포벽을 단시간에 용이하게 파괴할 수 있고, 순도가 높은 핵산을 분리할 수 있기 때문에, 핵산을 분리하는데 드는 시간을 단축하고, 핵산 분리에 사용되는 비용을 절감할 수 있어, 미생물에서 핵산을 분리하는데 유용하게 사용할 수 있다.

Description

미생물로부터의 신속한 핵산의 분리방법{Rapid method for nucleic acid preparation from microorganism}

본 발명은 미생물로부터 핵산을 분리하는 방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 미생물로부터 핵산을 분리하는 방법에 있어서, 글래스 비드(glass bead)를 이용하여 미생물의 세포벽을 파괴하는 단계, 페놀 또는 클로로포름을 처리하여 단백질을 제거하는 단계, 알코올 공침을 통해 핵산을 침전시켜 핵산을 수득하는 단계를 통하여 핵산을 분리하는 것이다.

핵산을 분리하는 방법으로는 페놀/클로로포름을 사용하는 방법, 염석하는 방법, 카오트로픽 염 및 실리카 수지를 사용하는 방법, 친화성 수지를 사용하는 방법, 이온 교환 수지 크로마토그래피법 및 자기성 비드를 사용하는 방법 등이 있다. 상기와 같은 방법은 미국 특허 제5057426호, 제4923978호, EP 특허 제0515484B호, WO 제95/13368호, WO 제97/10331호 및 WO 제96/18731호 등에 기술되어 있다.

상기의 핵산 분리 방법 중에서 페놀/클로로포름을 사용하는 방법은 대부분의 조직과 세포주로부터 핵산을 분리하는데 널리 이용되는 방법으로, 구체적으로 설명하면 계면활성제 및 단백질 분해효소를 사용하여 조직과 세포주를 용해시킨 후, 유기용매, 예를 들어 페놀 또는 클로로포름으로 수회 추출하여 핵산 이외의 단백질과 같은 물질들을 제거하고, 에탄올로 핵산만을 침전시키는 과정을 통해 핵산을 분리하는 것이다.

그러나, 식물, 그람 양성균, 효모 또는 곰팡이는 페놀/클로로포름을 사용하여 핵산을 분리하는데 힘든 점이 많았다. 이중에서 그람 양성균과 같이 세포벽이 견고한 미생물의 경우 상기의 페놀/클로로포름을 사용하여 핵산을 분리하는 방법으로는 세포벽이 파괴되지 않아 핵산의 분리가 힘들었다. 따라서, 그람 양성균으로부터 핵산을 분리하는데 있어 세포벽을 파괴하는 방법의 개발이 필요한 실정이다.

그람 양성의 특징을 가지는 미생물로는 유산간균이 있다. 유산간균은 건강한 여성의 질내에 존재하는 정상 세균총으로 여러 병원성 미생물의 성장을 억제하는 항균물질을 생산하는 것으로 알려져 있다. 상기의 항균물질에는 과산화수소(H₂O₂)와 글리코겐의 발효에 의해 생산된 산이 있다. 유산간균이 상기의 작용기작으로 생산하는 산은 질내부를 산성화하면서 우점균으로 존재하여 기회성 감염을 억제하게 된다(Bruce, A. W., et al.,Can. J. Microbiol.,34, 339-343, 1998).

본 발명의 발명자들은 유산간균이 생산하는 항균물질이 질염치료용 생균제제로 사용될 수 있기 때문에 이를 목적으로 수년간 유산간균을 건강한 여성의 질 내에서 분리(Chang, C. E., et al.,J. Microbiol. Biotechnol.,2002, in press), 및 분리균주 중 질 내에서 항균 활성이 우수한 유산간균 크리스파투스(L. crispatus) KLB46를 동정하여 보고한 바가 있다(특허 제 10-2000-0053780).

미생물로부터 핵산을 분리하는 것은 미생물 균주의 분리 및 동정에 필요하다.

미생물 균주를 분리, 동정하기 위해서 실시되는 방법으로는 미생물이 가지는 형태학적 특성, 배양적 특성, 생리학적 특성, 화학분류학적 특성을 고려한다. 미생물의 형태학적 특성으로는 세포의 형태, 크기 및 운동성의 유무 등이 있고, 배양적 특성으로는 배양하는 배지의 종류나 생육의 모양, 색, 광택 등 생육되는 동안 관찰할 수 있는 특징 등이 있고, 생리학적 특성으로는 pH, 온도와 같은 생육 조건, 산소에 대한 반응성, 분해 산물의 종류, 미생물의 특징을 이용한 여러 가지 염색법 등이 있다. 그리고 마지막으로 화학분류학적 특성으로는 DNA의 염기 조성이나 세포 구성 물질들의 아미노산 조성 등이 있다. 기존에는 미생물을 분리, 동정하기 위해 주로 미생물의 형태학적, 배양적, 생리학적 특성으로 유사종과 비교하였으나 이러한 특징을 판단하는데 기준이 명확하지 않고 또한 이런 방법을 수행하기 위해서는 많은 시간과 노동력이 필요하였다. 따라서 이러한 점들을 보완하기 위해 최근에는 DNA의 염기 조성이나 아미노산 조성 등을 조사함으로써 유사종과의 공통점과 차이를 정확하게 확인할 수 있어 미생물의 분류와 동정에 많이 이용되고 있다.

미생물을 분류하고 동정하기 위해 DNA의 염기 조성이나 아미노산 조성을 조사하는 방법은 미생물의 핵산 중에서 16S rDNA의 분석으로 이루어진다. 대부분의 미생물에서 16S rDNA는 매우 보존된 부분을 가지고 있다. 그래서 이 보존된 부분을 증폭할 수 있는 상보적인 염기서열을 가진 프라이머를 이용해 PCR을 수행함으로써 기존의 미생물의 16S rDNA와 비교하여 미생물을 분류하고 동정한다. 상기의 방법으로 미생물을 동정하는 것은 기존의 방법보다 정확하고 쉬워 최근의 미생물 동정을 위해 주로 이용하는 방법이다.

상기의 DNA 분석을 위해서 제노믹 DNA의 분리는 필수적이다. 이전 연구에서 본 발명자들은 유산간균의 제노믹 DNA 분리에 관하여 보고한 바 있다(Suk-Yong Lee., et al.,Korean J. Biotechnol. Bioeng.,15, 411-413, 2000). 그러나 균주 동정을 하기 위해서는 많은 수의 균주로부터 제노믹 DNA를 분리하여야 하는데 종래의 방법으로는 시간이 많이 소요되어 시료의 수량이 많을 경우에 적당치 않음을 알 수 있었다. 따라서 보다 간단하고 단시간에 경제적으로 제노믹 DNA를 분리하는 방법의 개발이 시급한 실정이다.

미생물로부터 RNA를 분리하는 것은 미생물에 대한 연구나 미생물을 이용한 유전자 조작을 위해 반드시 필요하다. 미생물로부터 RNA를 분리하는 방법으로는 고온 페놀 RNA 분리 방법이 널리 알려진 방법이다(Laodie, B. M.,EMBO J., 9, 999-1005, 1990). 그러나 상기의 RNA 분리 방법으로는 세포벽이 견고한 유산간균으로부터 RNA를 분리하기가 쉽지 않으며, 시간도 많이 소요되어 특수한 조건에 의해 전사되거나 반감기가 짧은 mRNA를 연구하는데는 실험 시료로 사용하기 힘든 경우가 많았다. 따라서 상기의 RNA 분리 방법의 문제점을 개선하기 위해 세포벽을 파괴할 수 있는 방법과 단시간에 RNA를 분리할 수 있는 방법의 개발이 필요하다.

이에, 본 발명자들은 종래의 핵산분리 방법이 세포벽 파괴의 어려움으로 인하여 핵산을 분리하는데 시간이 많이 들고 핵산의 분리가 제대로 되지 않는 점을 해결하기 위해 글래스 비드를 사용하여 세포벽을 파괴해 핵산을 분리함으로써 종래의 방법보다 신속하면서도 경제적으로 핵산을 분리하는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 세포벽 파괴의 어려움으로 인하여 핵산을 분리하는데 시간이 많이 들고 핵산의 분리가 제대로 되지 않는 점을 해결하기 위해 글래스 비드를 사용하여 세포벽을 파괴해 핵산을 분리함으로써 신속하면서도 경제적으로 핵산을 분리하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 방법에 의해 분리된 제노믹 DNA를Pst Ⅰ으로 절단하여 아가로즈 젤에서 전기영동한 사진이고,

레인 M ; λ/Hind ⅢDNA 사이즈 마커,

레인 1 ; 대조군,

레인 2 ; 0.4 g의 글래스 비드를 첨가하고, 1분 동안 강하게 흔들어 준 것,

레인 3 ; 0.4 g의 글래스 비드를 첨가하고, 3분 동안 강하게 흔들어 준 것,

레인 4 ; 0.4 g의 글래스 비드를 첨가하고, 7분 동안 강하게 흔들어 준 것,

레인 5 ; 0.8 g의 글래스 비드를 첨가하고, 1분 동안 강하게 흔들어 준 것,

레인 6 ; 0.8 g의 글래스 비드를 첨가하고, 3분 동안 강하게 흔들어 준 것,

레인 7 ; 0.8 g의 글래스 비드를 첨가하고, 7분 동안 강하게 흔들어 준 것

도 2는 본 발명의 방법에 의해 분리된 전체 RNA를 포름알데하이드 아가로즈 젤에서 전기영동한 사진이다.

레인 1 ; 글래스 비드를 첨가해 1분 동안 강하게 흔들어 준 것,

레인 2 ; 글래스 비드를 첨가해 3분 동안 강하게 흔들어 준 것

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1) 글래스 비드를 이용하여 미생물의 세포벽을 파괴하는 단계, 2) 페놀 또는 클로로포름을 처리하여 단백질을 제거하는 단계 및 3) 알코올 공침을 통해 핵산을 침전시켜 핵산을 수득하는 단계를 포함하는 핵산을 분리하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 방법은 기존의 핵산 분리 방법으로는 핵산의 분리가 힘든 미생물로부터 신속, 간단하게 핵산을 분리하기 위해 기존의 핵산 분리 방법을 개선한 핵산 분리 방법이다.

종래에 미생물로부터 핵산을 분리할 때 가장 큰 문제점은 세포벽의 파괴가 힘들다는 것이다. 세포벽이 단단한 그람양성균에서 핵산을 분리하기 위해서 기존의 방법에서는 1) 라이소자임과 프로티네이즈 K를 처리하여 세포벽을 파괴하고, 2)페놀/클로로포름을 사용해 단백질을 제거하고, 3) 알코올 공침을 통해 핵산을 수득하는 과정을 통해 핵산을 추출하였다. 그러나 상기에서 그람양성균의 세포벽을 파괴하기 위해 라이소자임과 프로티네이즈 K를 처리하는 과정은 시간과 비용이 많이 들고 세포벽이 완벽하게 파괴되지 않는 단점이 있다.

본 발명의 핵산 분리 방법은 라이소자임과 프로티네이즈 K를 처리하는 과정 대신 글래스 비드를 이용하여 미생물의 세포벽을 용이하게 파괴함으로써, 핵산을 분리하는 시간을 단축하고 비용을 절감할 수 있다.

본 발명에서 글래스 비드를 이용하여 미생물의 세포벽을 파괴하는 방법은 세포 배양액에 글래스 비드를 첨가하여 강하게 흔들어 주면 되고, 글래스 비드를 첨가하는 양 및 흔들어 주는 것은 미생물의 종류와 배양액의 양에 따라 적절히 조절할 수 있다.

본 발명에 사용한 글래스 비드의 직경은 212 내지 1,180 ㎛인 것이 바람직하고, 212 내지 625 ㎛인 것이 더욱 바람직하고, 425 내지 600 ㎛ 인 것이 가장 바람직하다. 본 발명에서 글래스 비드를 넣어 강하게 흔들어 주는 것은 1분당 1,800회 내지 1분당 2,500회의 회전수로 3 내지 5 분 동안 흔들어 주는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법은 모든 미생물로부터 핵산을 분리할 수 있고, 그람 양성균으로부터 핵산을 분리하는 것이 바람직하고, 유산간균으로부터 핵산을 분리하는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명의 방법에 의해 분리되는 핵산은 DNA 또는 RNA이고, 제노믹 DNA 또는 전체 RNA 인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명은 제노믹 DNA의 분리방법을 제공한다.

기존의 제노믹 DNA 분리 방법에 의해 제노믹 DNA을 분리할 때 가장 큰 문제점은 세포벽의 파괴가 힘들다는 것이다. 이를 해결하기 위해 본 발명에서는 세포벽이 단단한 그람 양성균을 배양하여 세포를 수거한 후 완충용액에 현탁하여 글래스 비드를 첨가하고 강하게 흔들어줌으로써 세포벽을 파괴하였다. 세포벽이 파괴된 상기의 세포현탁액은 페놀:클로로포름:아이소아밀알콜로 처리하고, 클로로포름을 처리해 분리한 상등액의 DNA를 침전시켰다. 상기의 침전된 DNA를 건조해 완충용액에 녹인 후 DNA를 4℃에 보관하여 사용한다.

또한 본 발명은 라이소자임 및 프로티네이즈 K를 처리하는 대신에 글래스 비드를 사용하기 때문에 상기의 효소를 사용하지 않음으로 인해 비용을 절감할 수 있고, 글래스 비드를 처리하는 시간은 효소를 처리하는데 드는 시간에 비해 상당히 적기 때문에 시간의 단축 효과도 얻을 수 있다.

상기에서 보는 바와 같이 본 발명의 방법은 종래 기술에 비해 시간적, 경제적으로 유용하다. 본 발명의 방법에 의해 분리된 제노믹 DNA가 유전자 조작이나다른 실험의 용도로 사용하기에 적합한 수준인지 확인해야 할 필요가 있다. 이에, 본 발명에서는 제노믹 DNA가 유전자 조작이나 다른 실험의 용도로 사용하기 위해 적합한 상태 및 순도를 가지는지 확인하기 위해 제한효소로 절단하고, PCR 및 흡광도를 측정하였다.

제노믹 DNA의 상태를 확인하는 첫 번째 방법으로 제노믹 DNA를 제한 효소로 절단하는 방법이 있다.

제노믹 DNA는 길이가 상당히 길어서 제노믹 DNA를 분리하는 과정이 잘못되거나 외부물질로 오염이 될 경우 절단되게 된다. 제노믹 DNA를 이용해 유전자 분석을 하는 것은 제노믹 DNA상의 특정 염기서열을 인식하기 때문에 상기의 이유로 제노믹 DNA상에서 원치 않는 부분에서 절단되게 되면 유전자 분석이 제대로 이루어지지 않거나 잘못된 결과를 도출하게 된다. 상기의 이유로 제노믹 DNA를 이용하여 유전자 분석을 하기 위해서는 절단되지 않은 완전한 길이의 제노믹 DNA가 반드시 필요하다.

상기의 이유로 제노믹 DNA의 상태를 확인하기 위해 일반적으로 이용되는 방법으로는 제한효소로 절단하는 방법이 있다. 제노믹 DNA상에는 특정 제한효소로 절단되는 염기 서열이 불특정한 위치에 존재한다. 상기의 특징을 이용해 특정 제한 효소로 제노믹 DNA를 절단하게 되면 여러 크기의 단편이 만들어지게 된다. 상기의 단편을 전기영동을 수행하여 확인해 보면 균일하게 끌리는 현상을 볼 수 있다. 그러나 제노믹 DNA가 제한효소로 절단되기 전에 외부의 원인으로 절단되거나오염이 될 경우, 제노믹 DNA를 제한효소로 절단하면 원치 않는 크기의 단편이 생기게 되거나 절단이 제대로 이루어지지 않게 된다. 상기의 이유로 상태가 좋지 않은 제노믹 DNA를 제한 효소로 절단하여 전기영동을 수행하여 확인해 보면 균일하게 끌리지 않고 특정 부위에 뭉치는 현상을 관찰할 수 있다. 이에 본 발명의 방법에 의해 분리된 제노믹 DNA를 제한효소로 절단하여 전기영동하여 본 결과 균일하게 끌리는 현상을 관찰할 수 있었다(도 1참조). 상기의 결과로 본 발명의 방법에 의해 분리된 제노믹 DNA의 상태는 유전자 조작에 사용할 수 있을 정도로 양호함을 알 수 있다.

제노믹 DNA의 상태를 확인하기 위한 두 번째 방법으로 16S rDNA를 증폭하는 PCR을 수행하는 방법이 있다.

대부분의 미생물은 rDNA에 매우 보존된 부분이 존재한다. 상기의 특징을 이용해 16S rDNA의 보존된 부분에 상보적인 염기서열을 PCR을 수행해 증폭할 수 있다. 제노믹 DNA의 상태가 양호하면 16S rDNA의 보존된 부분이 완벽하게 증폭이 되나 제노믹 DNA의 상태가 양호하지 않으면 증폭이 일어나지 않거나 원치 않는 결과를 얻게 된다. 이에 본 발명의 방법에 의해 분리된 제노믹 DNA와 이전 연구방법에 의해 분리한 제노믹 DNA를 이용해 16S rDNA를 증폭하는 PCR을 수행해 본 결과 증폭에 차이가 없음을 알 수 있었다. 상기의 결과로 본 발명의 방법에 의해 분리한 제노믹 DNA는 유전자 조작을 하기에 양호한 상태임을 알 수 있다.

제노믹 DNA의 순도를 확인하는 방법으로 흡광도를 측정하는 방법이 있다.

일반적으로 핵산의 순도를 확인하기 위해 흡광도를 측정하는 방법을 주로 사용한다. 핵산은 특정 구조로 인해 빛의 파장 중 260 ㎚의 파장을 주로 흡광하는 성질이 있고, 단백질은 특정 구조로 인해 빛의 파장 중 280 ㎚의 파장을 주로 흡광하는 성질이 있다. 이에 핵산이 순수하게 분리되었는지 확인하기 위해 분리한 핵산의 시료를 260 ㎚ 및 280 ㎚의 파장으로 흡광도를 측정해 A₂₆₀/A₂₈₀의 계산식을 통해 나오는 결과를 통해 핵산의 순도를 측정한다. A₂₆₀/A₂₈₀의 값이 낮게 나타날수록 단백질의 오염이 많다는 증거이기 때문에 A₂₆₀/A₂₈₀의 값이 높은 것이 순도가 높다고 판단한다. A₂₆₀/A₂₈₀의 값이 1.6 이상 2.2 이하의 범위이면 유전자 조작이나 다른 용도의 실험용도로 사용하기에 적합한 시료라고 판단한다. 이에 본 발명의 방법에 의해 분리된 제노믹 DNA의 흡광도를 측정하여 본 결과 시료의 순도(A₂₆₀/A₂₈₀)는 약 1.75로써 본 발명의 방법에 의해 분리된 제노믹 DNA의 순도는 유전자 조작이나 다른 실험 용도로 사용하기에 적합한 정도임을 알 수 있다.

본 발명은 RNA의 분리방법을 제공한다.

RNA를 분리하기 위해 주로 이용하는 방법으로는 페놀을 이용하는 방법이 있다. 본 발명은 기존의 고온 페놀 RNA 분리방법(Laodie, B. M.,EMBO J., 9, 999-1005, 1990)으로 그람 양성균인 유산간균으로부터 RNA를 분리하고자 하였다. 하지만 상기의 방법에서는 유산간균의 세포벽을 파괴하기 위해 라이소자임과 프로티네이즈 K를 처리하게 되는데 상기의 효소처리 과정은 1 내지 2시간 정도 소요되었다. RNA는 상당히 불안정한 물질이기 때문에 RNA를 분리하는데 시간이 많이 들게 되면 RNA가 급속히 분해된다. 이에 RNA를 분리하는데 가장 중요한 요소는 RNA를 빠른 시간에 분리하는 것이다. 상기의 효소처리과정을 통한 RNA의 분리에는 많은 시간이 소요되기 때문에 RNA를 이용한 연구, 특히 특수한 조건에 의해 전사되거나 반감기가 짧은 mRNA의 연구에는 유용하지 않은 방법임을 알 수 있었다. 상기의 이유로 유산간균으로부터 RNA를 분리하기 위해 기존의 고온 페놀 RNA 분리방법을 개선할 필요가 있다.

이에 본 발명은 유산간균 세포를 배양해 세포를 수거하여 용해용액에 현탁한다. 세포벽을 파괴하기 위해 상기의 용해된 세포현탁액에 글래스 비드를 첨가하여 강하게 흔들어 준다. 상기의 시료를 원심분리 후 상등액을 취해 포화된 페놀을 혼합해 섞어준 후 원심분리하여 취한 상등액으로부터 RNA를 침전시킨다. 침전된 RNA를 원심분리한 후 RNA 용해 용액에 녹여 4℃에 보관한다.

본 발명은 글래스 비드를 이용함으로써 유산간균의 세포벽을 용이하게 파괴할 수 있다. 기본 발명의 방법에 의해 RNA를 분리하는데 드는 시간은 1.5 내지 2시간으로, 기존의 방법으로 RNA를 분리하는데 3.5 내지 4시간이 소요된 것에 비해 상당히 단축됨을 알 수 있다.

본 발명의 방법은 RNA를 분리하는데 있어서 시간적, 경제적인 장점이 있다.또한 본 발명의 분리 방법에 의해 분리된 RNA가 다른 연구를 수행하기에 적합한 순도를 가지는지 확인하기 위하여 RNA를 포름알데하이드 아가로즈 젤에 전기영동하였다. 생물에서 대부분의 RNA를 구성하는 것은 23S rRNA, 16S rRNA 및 5S rRNA로 상기의 구성요소들은 크기에 따라 명명한 것이다. 상기의 다양한 크기를 갖는 RNA를 전기영동하면 크기에 따라 이동하는 속도가 달라지게 되어 각 구성요소들은 밴드의 형태를 나타내게 된다. 상기의 이유로 RNA를 전기영동하여 RNA를 구성하고 있는 23S rRNA, 16S rRNA 및 5S rRNA의 밴드의 유무와 두께를 육안으로 확인하여 RNA의 상태를 확인할 수 있다. 이에 본 발명의 방법에 의해 분리된 RNA를 전기영동하여 확인해본 결과 미생물의 RNA 구성요소인 23S rRNA, 16S rRNA 및 5S rRNA가 확실히 존재하고 RNA의 상태가 양호함을 확인할 수 있었다(도 2참조). 상기의 결과로 본 발명의 방법은 미생물로부터 RNA를 분리하는데 적합한 방법임을 알 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 제노믹 DNA의 분리

본 발명자들은 유산간균으로부터 제노믹 DNA를 분리하기 위하여 글래스 비드를 이용하였다.

구체적으로, 유산간균 크리스파투스(L. crispatus)에 속하는 KLB46 균주를50 ㎖ MRS 배지(암모늄 시트레이트 2 g/ℓ, L-시스테인 하이드로클로라이드 0.3 g/ℓ, 락토스 10 g/ℓ, 황산철 35 mg/ℓ, 황산마그네슘 575 mg/ℓ, 황산망간 120 mg/ℓ, 인산칼륨 3 g/ℓ, 트립토스 10 g/ℓ, 트윈-80 1 g/ℓ, 효모 추출물 5 g/ℓ, pH 7.0)(De Man, J. C.,J. Appl. Bacteriol.23, 130-135, 1960)에 접종한 후 8시간 동안 배양하였다. 각 5 ㎖의 상기 세포배양액을 5분 동안 15,000 rpm에서 원심분리하여 세포를 수거하였다. 상기의 수거한 세포를 TE 완충용액(10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA) 800 ㎕에 현탁한 후 1.5 ㎖의 마이크로튜브로 옮겼다. 상기의 세포 현탁액에 글래스 비드(425∼600 ㎛, Sigma Chemical Co., USA) 0.4 및 0.8 g을 각각 첨가하여 시간간격(1, 3 및 5분)을 두고 강하게 흔들어주어 세포벽의 파괴에 따른 제노믹 DNA 분리의 최적화를 수행하였다. 상기의 세포벽이 파괴된 세포현탁액은 상온에서 5분 동안 15,000 rpm에서 원심분리하였다. 상기 원심분리한 시료들의 상등액 600 ㎕를 취하여 같은 부피의 페놀:클로로포름:아이소아밀알콜 (25:24:1)(Sigma)과 혼합한 후 5분 동안 15,000 rpm에서 원심분리하였다. 상기의 원심분리로 층분리가 이루어진 시료들의 상층부를 550 ㎕ 취하여 같은 부피의 클로로포름을 첨가하여 혼합한 후 5분 동안 15,000 rpm에서 원심분리하였다. 상기의 원심분리로 층분리가 이루어진 시료들의 상층부를 500 ㎕ 취한 후 1/10 부피인 3 M 소듐 아세테이트 50 ㎕와 두 배 부피의 100% 알콜을 첨가하여 -20℃에서 10분간 제노믹 DNA를 침전시켰다. 상기의 각 시료를 10분간 15,000 rpm에서 원심분리한 후 제노믹 DNA를 진공건조기에서 건조시켜 10 ㎕의 RNase(10 mg/㎖ 농축 용액)와 50 ㎕ TE 완충용액에 현탁하였다. 상기의 각 시료는 37℃에서 1 시간 보관 후 4℃에서 보관하였다.

<실시예2> 분리한 제노믹 DNA의 확인

본 발명자들은 상기 실시예 1에서 분리한 제노믹 DNA의 상태를 확인하기 위해 전기영동을 하였다.

상기 실시예 1에서 분리한 제노믹 DNA를 전기영동하여 젤 포토그래피(gel photography)를 통해 판독해 본 결과 분리된 제노믹 DNA는 부서진 것과 같은 끌림 현상을 확인할 수 있었다. 이에 본 발명자들은 상기 실시예 1에서 제노믹 DNA가 기존의 방법(Suk-Yong Lee., et al.,Korean J. Biotechnol. Bioeng.,15, 411-413, 2000)으로 분리한 제노믹 DNA와 비교하여 문제가 없는지 확인하기 위해 PCR과 제한효소에 의한 절단을 수행하였다.

<2-1> 분리한 제노믹 DNA의 PCR비교

PCR을 위해 16S rDNA의 유니버셜 프라이머인서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가지는 프라이머와서열번호 2로 기재되는 염기서열을 가지는 프라이머를 이용하였다. 상기 프라이머는 대부분의 미생물에서 16S rDNA의 보전적인 부분에 상보적인 염기서열을 가지고 있는 것으로 거의 모든 박테리아의 16S rDNA의 증폭에 이용 가능하다(Weisburg, W. G., et al.,J. Bacteriol.,173, 697-703, 1991). PCR은 94℃에서 5분 동안 열전처리하고, 94℃에서 1분 동안 열변성 반응, 56℃에서 30초 동안 프라이머 결합 반응, 72℃에서 2분 동안 중합효소 반응을 하는 조건으로35회 반응을 수행하고 72℃에서 5분 동안 마지막 연장 반응을 하였다.

그 결과, 본 발명을 통해 분리한 제노믹 DNA와 이전 연구방법에 의해 분리한 DNA를 PCR 해본 결과 PCR 정도는 크게 차이가 없음을 확인하였다.

<2-2> 분리한 제노믹 DNA의 제한효소 절단

본 발명자들은 상기 실시예 1에서 분리한 제노믹 DNA가 RNA나 단백질 등에 오염되어 있는지를 확인하기 위해 제한효소로 절단을 해 보았다. 구체적으로, 상기 실시예 1에서 분리한 제노믹 DNA를 제한효소PstⅠ으로 절단하여 아가로즈 젤에 전기영동하였다.

그 결과 균일하게 끌리는 현상을 보여 본 발명의 방법이 문제가 없음을 확인하였다. 또한 글래스 비드의 양을 달리하고 처리시간을 달리하여 분리한 제노믹 DNA를Pst Ⅰ으로 절단하고 아가로즈 젤에 전기영동하여 확인하여 글래스 비드의 처리 조건의 최적화를 결정하였다(도 1참조).

상기 결과로부터 배양액 5 ㎖에 대해서 글래스 비드는 0.8 g을 첨가하고 3분 이상 강하게 흔들어주는 것이 가장 바람직함을 알 수 있었다.

<2-3> 분리한 제노믹 DNA의 순도

본 발명자들은 제노믹 DNA의 순도를 확인하기 위해 흡광도를 측정해 보았다. 구체적으로, 상기 실시예 1에서 분리한 제노믹 DNA를 핵산의 흡광 파장범위 260 ㎚와 단백질의 흡광 파장범위 280 ㎚에서 각각 측정하여 260 nm의 흡광도를 280 nm의흡광도로 나누어 순도를 계산하였다.

그 결과 실시예 1에서 분리한 제노믹 DNA의 A₂₆₀/A₂₈₀은 약 1.75로써 기존의 방법에 의한 시료 순도 1.7에 비해 크게 떨어지지 않는 것으로 확인하였다. 또한 시료의 순도를 높이기 위해서 실험 절차의 마지막 부분에서 처리한 RNase를 제거함으로서 가능하였다.

<실시예 3> RNA의 분리

본 발명자들은 유산간균으로부터 RNA를 분리하기 위하여 글래스 비드를 이용하였다.

구체적으로, 유산간균 크리스파투스(L. crispatus)에 속하는 KLB46 균주를 5 ㎖ MRS 배지에 접종한 후 8시간동안 배양하였다. 상기 세포배양액을 5분 동안 15,000 rpm에서 원심분리하여 세포를 수거하였다. 상기의 수거한 세포를 용해용액(소듐 아세테이트 2.7 g/ℓ, SDS 5 g/ℓ, EDTA 0.34 g/ℓ, pH 5.5) 800 ㎕에 현탁하여 DNA의 분해를 유도한 후 1.5 ㎖의 마이크로튜브로 옮겼다. 상기의 세포 현탁액에 425 내지 600 ㎛의 직경을 갖는 글래스 비드(Sigma Chemical Co., USA) 0.4 g 및 0.8 g을 세포 현탁액에 첨가하여 3분 동안 강하게 흔들어주어 세포벽을 파괴하였다. 상기의 세포벽이 파괴된 세포현탁액은 상온에서 5분 동안 15,000 rpm에서 원심분리하였다. 상기의 원심분리한 시료들의 상등액 500 ㎕를 취하여 같은 부피의 68℃에 보관되어 있던 포화된 페놀(pH 5.5)과 혼합한 후 68℃를 유지하며 5분간천천히 섞어 주고 시료를 5분 동안 15,000 rpm에서 원심분리하였다. 상기의 원심분리로 층분리가 이루어진 시료들의 상등액 450 ㎕를 취하여 같은 부피의 클로로포름을 첨가하여 혼합한 후 20초간 강하게 흔들어준 후 상온에서 5분 동안 15,000 rpm에서 원심분리하였다. 상기의 원심분리로 층분리가 이루어진 시료들의 상등액 400 ㎕를 취한 후 1/10 부피인 3 M 소듐 아세테이트 40 ㎕와 두 배 부피의 100% 알콜 800 ㎕를 첨가하여 잘 섞어준 후 -20℃에서 10분간 RNA를 침전시켰다. 상기의 침전된 RNA를 상온에서 5분간 15,000 rpm에서 원심분리한 후 RNA를 진공건조기에서 건조시켰다. 상기의 건조시킨 RNA는 5.5 ㎕의 증류수에 현탁 후 RNA 변성 혼합액( 10×MOPS[3-N-Morpholino propanesulfonic acid : 0.2 M MOPS, 50 mM 소듐 아세테이트, and 10 mM EDTA] 50 ㎕, 포름아마이드 250 ㎕ , 포름알데하이드 90 ㎕ )(Sigma) 19.5 ㎕와 혼합하여 4℃에 보관하였다. 상기의 RNA를 분리하기 위한 모든 용액은 다이에틸파이로카보네이트(DEPC)(sigma)처리를 하여 RNase의 활성을 제거하였다.

<실시예 4> 분리된 RNA의 확인

본 발명자들은 RNA의 상태를 확인하기 위해 상기 실시예 3에서 분리한 RNA를 포름알데하이드 아가로즈 젤에서 전기영동 하였다.

구체적으로, 포름알데하이드 아가로즈 젤은 1.5 g의 아가로즈를 108 ㎖의 증류수에 녹인 후 15 ㎖의 10×MOPS 용액과 27 ㎖의 포름알데하이드와 혼합하여 젤판에 부어 만들었다. 또한 10×MOPS를 증류수로 희석하여 1×MOPS를 만든 후 이를전기영동 완충액으로하여 본 발명에 의해 분리한 RNA를 상기의 아가로즈 젤에서 전기영동 하였다.

그 결과도 2에서 보는 바와 같이 본 발명에서 분리한 RNA의 상태는 양호함을 알 수 있었다. 또한 0.8 g의 글래스 비드를 첨가해 3분 이상 강하게 흔들어준 것이 더 바람직함을 알 수 있었다.

상기에서 살펴본 바와 같이 본 발명은 1) 글래스 비드(glass bead)를 이용하여 세포벽을 파괴하는 단계, 2) 페놀 또는 클로로포름을 처리하여 단백질을 제거하는 단계, 3) 알코올 공침을 통해 핵산을 침전시켜 핵산을 수득하는 과정을 통해 핵산을 단시간에 경제적으로 분리하는 방법을 제공하고, 본 발명의 방법은 질염치료용 생균제제 생산을 위한 유산간균의 균주동정에 유용하게 이용할 수 있고, 특수한 조건에 의해 전사되거나 반감기가 짧은 mRNA를 연구하는데 유용하게 이용할 수 있다.

<110> INHA UNIVERSITY <120> Rapid method for nucleic acid preparation from microorganism. <130> 2p-06-61 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UNI1 primer <400> 1 cccaagctta gagtttgatc ctggctcag 29 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UNI2 primer <400> 2 acgcgtcgac aaggaggtga tccagcc 27

Claims

그람양성균(Gram-positive bacteria)으로부터 RNA를 분리하는 방법에 있어서,

1) 배양액에, 직경 212 내지 625 ㎛인 글래스 비드를 첨가하여 회전시킴으로써 그람양성균의 세포벽을 파괴하는 단계;

2) 페놀 또는 클로로포름을 처리하여 단백질을 제거하는 단계; 및

3) 알코올 공침을 통해 핵산을 침전시켜 핵산을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 신속하고 안전한 RNA의 분리방법
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제 1항에 있어서, 상기 글래스 비드의 직경은 425 내지 600 ㎛ 인 것을 특징으로 하는 RNA의 분리방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계1)의 회전수는 1,800 내지 2,500 rpm인 것을 특징으로 하는 RNA의 분리방법.
제 1항에 있어서, 상기 그람양성균은 유산간균(Lactobacillusspp.)인 것을 특징으로 하는 RNA의 분리방법.
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제 1항에 있어서, 상기 RNA는 mRNA인 것을 특징으로 하는 RNA의 분리방법.