상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 복분자(Rubus coreanus), 정향(Syzygium aromaticum) 및 황금(Scutellaria baicalensis) 혼합추출물을 함유하며, 눈의 산화적 손상을 예방하여 눈 건강의 유지 기능을 갖는 건강기능식품 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명은 항산화 활성을 갖는 것으로 알려진 생약재의 예측되는 활성보다 매우 우수한 항산화 상승작용 즉, 합성에 의해 제조되는 항산화제 부틸레이티드 하이드록시아니솔(butylated hydroxyanisole, BHA) 보다 우수한 항산화 활성을 갖는 생약조성물을 제공한다.
본 발명은 많은 문헌들 중에서 항산화 활성을 나타내는 것으로 기재된 생약 재를 검색하여 여러 문헌에서 언급되는 감초, 건강, 백겨자, 결명자, 계피, 고추, 구기자, 국화, 녹차, 당귀, 대추, 매실, 박하, 복분자, 오매, 적하수오, 전복, 정향, 진피, 포공영 및 황금 생약재를 탐색 대상으로 하였다. 상기 생약재 중에서 DPPH 활성, SOD 활성 및 Total Phenol 성분 검출 등 항산화 활성 정도를 측정하여 항산화 활성이 큰 것으로 측정된 생약재 녹차, 복분자, 황금, 정향, 결명자, 박하, 국화, 적하수오 및 백겨자를 선별하였다.
본 발명은 천연물 소재의 in vivo 시력 개선 효능 평가를 위한 전단계의 in vitro 시험으로 상기 탐색 대상 생약재인 녹차, 복분자, 황금, 정향, 결명자, 박하, 국화, 적하수오 및 백겨자에 대하여 눈의 산화적 손상을 예방 할 수 있는 항산화능을 측정하였다.
항산화능 평가를 위하여 FeCl3 로 유도된 각막 및 망막 균질액의 티오바비투릭산-반응물질(thiobarbituric acid-reactive substances, TBARS), 즉 말론디알데하이드(malondialdehyde, MDA)의 생성에 대한 억제효과를 측정하였으며, 항산화능 평가 결과, 상기 탐색 대상 생약재 중에서 복분자, 황금 및 정량 생약재가 100㎍/㎖에서 음성대조군 수준까지 MDA 생성을 억제함으로써 비교물질인 항산화제 부틸레이티드 하이드록시아니솔(butylated hydroxyanisole, BHA)과 유사한 결과를 나타내어 이들을 최종 후보물질로 선정하였다.
본 발명에 따른 항산화 활성은 각막 및 망막 균질액을 사용하여 FeCl3를 처리하여 말론디알데하이드(malondialdehyde, MDA)의 생성에 대한 억제효과를 측정하는 방법을 적용하였다. 이 방법은 시료의 혼탁도나 색깔에 의해 방해받지 않는 장점을 갖는다.
본 발명에 따른 시료는 음성대조군으로 각막 및 망막 균질액에 FeCl3를 넣지 않은 시료, Blank로는 각막 및 망막 균질액을 넣지 않고 FeCl3만을 가한 시료, 양성대조군으로는 시험물질 대신 용매를 넣은 시료를 사용하였고, 비교물질로는 부틸레이티드 하이드록시아니솔(butylated hydroxyanisole, BHA)를 사용하였다.
본 발명은 상기 복분자, 황금 및 정량 생약재들을 각각 또는 동량 혼합하여 70% 주정 10배량으로 1회 추출한 후 원심 분리하여 여과 한 뒤 40% 수분함량이 되도록 농축한 것을 사용하였으며, 본 발명에 따른 복분자, 정향 및 황금은 혼합비에 따른 항산화 활성의 차이는 크지 않다. 바람직하게는 동량 혼합하는 것이 좋다.
본 발명에 따른 생약조성물은 안구건조 증상 또는 눈의 피로감 등 눈의 산화적 손상을 억제하여 눈 건강의 유지기능을 갖기 위한 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명에 따른 생약조성물은 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등에 첨가하여 건강기능식품으로 개발할 수 있으며, 생약조성물을 직접 환제, 분말, 정제, 캡슐 제 등의 제형으로 제조하여 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명은 여러 가지 영양제, 비타민 및 첨가제 등을 추가로 함유함으로써 건강기능식품을 제조할 수 있다. 영양제 및 비타민으로는 홍삼농축물분말, 베타카로틴, 토코페롤, 글루콘산 아연 등을 예로 들 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 첨가제는 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자에게 적절히 선택되어 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
<실시예 1 내지 실시예 3 > 복분자, 정향 또는 황금 추출물의 제조
건조상태의 복분자, 정향 또는 황금 1㎏을 분쇄기로 분쇄하고 10배량의 70% 주정에 넣어 85℃에서 4시간동안 가열 추출하였다. 추출액을 원심분리하고 여과하여 40% 수분함량이 될 때까지 농축하여 복분자 추출물, 정향 추출물 또는 황금 추출물을 제조하여 각각 실시예 1 내지 실시예 3으로 하였다.
<실시예 4 > 복분자, 정향 및 황금 혼합추출물의 제조
건조상태의 복분자, 정향 또는 황금 각 1㎏ 씩 혼합한 후 실시예 1과 같이 복분자, 정향 및 황금 혼합추출물을 제조하였다.
<실험예 1> 실험실적 방법에 의한 항산화 효과 실험
1. 실험방법
실험실적 방법에 의한 항산화 효과는 일반적으로 전자공여능의 정도를 나타내는 DPPH활성과 SOD활성으로 표시된다.
복분자, 황금, 정향 추출 분말 0.5g을 70% 에탄올 25ml에 용해시킨시킨 후 원심분리 여과한 상징액을 분석용 시료로 사용하여 DPPH활성은 Blois의 방법으로 517 nm 흡광도를 측정하여 시료 1 mL가 1분 동안에 흡광도 값을 0.01 감소시키는 것을 1 unit로 나타내어 활성을 계산하였고, SOD 유사활성은 시료액 20 mL에 55 mM tris-cacodylic acid buffer(TCB, pH 8.2)를 가하여 균질화하고 원심분리하여 얻은 상징액을 pH 8.2로 조정한 후 TCB를 사용하여 50 mL로 정용한 후 시료액으로 사용하였다. 시료액 950 μL에 50 μL의 24 mM pyrogallol 용액을 첨가하여 420 nm에서 초기 2분간의 흡광도 증가율을 측정하고 시료액 무첨가 대조구와 비교하여 활성을 계산하여 표 1에 나타내었다.
2. 실험결과
복분자, 황금, 정향의 실험실적 방법에 의한 항산화 효과는 67.6, 62.8, 64.3 이었으며, 복합물은 91.5%로 나타났다. SOD 유사활성은 50.4, 42.1, 35.3, 이 었고, 복합물은 86.3으로 증가하였다.
복분자, 황금, 정향의 실험실적 방법에 의한 항산화 효과
시료 |
DPPH활성 |
SOD 유사활성 |
복분자 |
67.6 |
50.4 |
황금 |
62.8 |
42.1 |
정향 |
64.3 |
35.3 |
복합물 |
91.5 |
86.3 |
<실험예 2>
동물 실험을 통한 항산화 효과 조사
1. 실험물질
실험을 위하여 실시예의 각 추출물을 동결건조하여 각각을 동결건조분말로 제조하였다.(복분자추출분말, 정향추출분말, 황금추출분말, 복합생약추출분말)
2. 비교물질
항산화제로 알려져 있는 BHA(부틸히드록시아니솔)를 구입하여 별도로 준비하였다.
3. 실험동물
5주령의 수컷 SD 랫트를 대한바이오링크(주)에서 구입하였으며 1주일의 순화기간을 거쳐 조직채취에 사용하였다.
4. 실험방법
실험물질의 눈에 대한 항산화능을 평가하고자 염화제이철(FeCl3)로 유도된 각막 및 망막 균질액의 MDA(malondialdehyde) 생성에 대한 억제효과를 측정코자 하였다.
실험 전에 반응완충액(10mM sodium phosphate-buffered saline[PBS], pH 7.4), 염화제이철 용액(증류수에서 최종농도 50μM), 도데실황산나트륨(SDS) 용액(증류수에서 8.1%), 초산 용액(증류수에서 20%), 2-티오바르비투르산(TBA) 용액(증류수에서 0.75%, 50 ~ 60℃로 가온하면서 용해), 실험물질 용액(증류수 또는 메탄올에서 최종농도 10.0 ~ 31.6㎍/㎖) 및 비교물질 용액(증류수 또는 메탄올에서 최종농도 100㎍/㎖)을 제조하였다.
랫트를 에테르로 마취시킨 후 미세 가위로 안구를 적출하고 얼음 위에서 절제하여 렌즈와 초자액을 제거함으로써 각막과 망막 만을 취하였다. 적출한 조직을19배의 차가운 PBS에 넣고 얼음이 들어 있는 비커(beaker) 안에서 호모게나이저(homogenizer)를 이용하여 균질화하여 5% 균질액을 얻었다.
225㎕의 각막 및 망막 균질액에 12.5㎕의 실험물질 또는 비교물질을 넣고 잘 섞은 후 12.5㎕의 염화제이철을 넣고 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 동일 양(250㎕)의 SDS와 500㎕의 비타민 C 용액을 가하고 다시 250㎕의 TBA 용액을 넣고 마개를 한 후 100℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 얼음위에서 급속히 식힌 다음 13,000×g에서 10분간 원심분리를 하고 상등액을 취하여 532nm에서 흡광도를 측정하고 표준검량선으로부터 MDA 함량을 정량하여 표 2, 도1에 나타내었다.
이때 blank로는 각막 및 망막 균질액을 넣지 않고 염화제이철만 첨가한 시료를, 음성대조군으로는 각막 및 망막 균질액에 염화제이철를 첨가하지 않은 시료를, 그리고 양성대조군으로는 실험물질대신에 용매를 첨가한 시료를 사용하였으며 양성대조군의 MDA 함량을 최대값(100%)으로 하여 농도별 실험물질에 의한 MDA 생성 감소율을 표시하였다.
5. 실험결과
염화제이철을 처리하지 않은 각막 및 망막 균질액을 37℃에서 30분간 반응시킨 음성대조군의 경우 평균 1.65nM의 MDA가 생성되었다. 이에 비해 양성대조군으로서 50μM의 염화제이철을 첨가했을 때는 평균 2.85nM의 MDA가 생성되어 약 1.7배의 지질과산화반응 촉진 효과가 나타났다.
이러한 염화제이철 유도 지질과산화 반응에 대한 항산화 효과에 있어서 100㎍/ml의 BHA 첨가구에서는 평균 1.67nM의 MDA가 생성되어 음성대조군의 58.7% 이하로 낮아짐으로써 염화제이철에 의해 촉진된 지질과산화 반응을 완전하게 차단하였다.
실험물질을 염화제이철 유도 지질과산화 반응 용액에 10.0 - 31.6 ㎍/㎖의 농도로 적용한 결과, 31.6 ㎍/㎖의 농도에서 생약복합추출분말이 양성대조군의 56.2%로 억제하여 음성대조군의 MDA생성 수준 이하로서 가장 우수한 항산화능을 가지고 있음이 확인되었으며 그 다음으로 복분자추출분말, 정향추출분말, 황금추출분말은 74.4%, 67.1%, 64.6%로서 모두 비슷한 항산화능을 발휘하였다.
이와 같이 복합추출분말은 각각의 분말보다 현저하게 우수한 항산화능을 발휘하고 있어서 이는 상승효과에 의한 것이라 할 수 있을 것이고, 복합추출분말을 함유한 본 발명의 건강기능식품 조성물은 안구건조증의 개선에서도 가장 강력한 효과를 갖는다고 할 수 있다.
복분자, 황금, 정향 추출분말의 동물실험에 의한 항산화 효과
시료 |
농도 (㎍/ml) |
흡광도 (532nm) |
MDA농도 (nM) |
% of positive control |
음성대조구 |
- |
0.3540±0.0651 |
1.65±0.55 |
57.9±8.4 |
양성대조구 (positive control) |
FeCl3 (50uM) |
0.6185±0.1224 |
2.85±0.61 |
100±10.3 |
+ BHA |
100.0 |
0.3599±0.0559 |
1.67±0.25 |
58.7±8.9 |
복분자 |
10.0 |
0.5440±0.1680 |
2.51±0.76 |
88.0±26.8 |
|
31.6 |
0.4585±0.0868 |
2.12±0.39 |
74.4±13.8 |
황금 |
10.0 |
0.5467±0.1425 |
2.52±0.65 |
88.4±22.7 |
|
31.6 |
0.4131±0.0681 |
1.91±0.31 |
67.1±10.9 |
정향 |
10.0 |
0.4805±0.2446 |
2.22±1.22 |
77.9±39.0 |
|
31.6 |
0.3970±0.2321 |
1.84±1.05 |
64.6±37.0 |
복합물 |
10.0 |
0.4230±0.0724 |
1.96±0.33 |
68.7±11.5 |
|
31.6 |
0.3445±0.0681 |
1.60±0.31 |
56.2±10.9 |
<제조예> 연질캡슐의 제조
실시예 1-4의 복합추출물 50㎎
홍삼엑스분말 50㎎
베타카로틴 15㎎
금잔화추출물 40㎎
아연 2.5㎎
니코틴산아미드 2.0㎎
소맥배아유 290㎎
레시틴 10㎎
밀납 20㎎
상기의 성분을 통상의 연질캡슐제 제조방법에 따라 젤라틴 캡슐에 충전하여 연질캡슐제를 제조하였다.
상기 조성은 바람직한 제조예로서 혼합 조성한 것이며 당업자들로서는 본 발명의 건강식품조성물을 제외한 성분이나 배합 비는 필요에 따라 적의 가감이나 변경이 가능할 것이다.