KR20070121335A - 항암효과를 갖는 삼백초 추출물을 유효성분으로함유하는 조성물. - Google Patents

Abstract

본 발명은 항암효과를 갖는 삼백초의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 및 비극성 용매 가용 추출물을 함유하는 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 삼백초 추출물은 아폽토시스 (apoptosis)와 세포주기 저해활성을 유도하므로, 암 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

암, 삼백초 추출물, 약학 조성물, 건강기능식품

Description

항암효과를 갖는 삼백초 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물.{A composition comprising an extract of Saururus chinensis (Lour.) bail having anti-cancer activity as an effective ingredient}

도 1은 삼백초의 메탄올을 이용한 추출물을 물과 에테르(ether)를 이용하여 분획한 후, 여과, 감압 농축을 이용하여 클로로포름(CHCl₃), 에틸아세테이트(ethylacetate), 부탄올(BuOH) 및 물(dH₂O)로 극성에 따른 5개의 분획물의 수획율을 나타낸 도이고,

도 2는 삼백초의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 및 비극성용매 가용추출물들의 여러 가지 농도에 의존한 세포 생존률을 나타낸 도이며,

도 3은 삼백초의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 및 비극성용매 가용추출물들이 50%의 세포독성을 가지는 농도에서 세포주기를 저해함을 나타낸 도이고,

도 4는 A549 암세포가 세포독성 50%를 가지는 농도의 삼백초의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 및 비극성용매 가용 추출물에서 24시간 동안 배양된 후의 세포자살 분석 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 삼백초의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 및 비극성 용매 가용 추출물을 함유하는 조성물에 관한 것이다.

암은 여전히 심각한 임상적 문제이며, 인간의 건강관리 시스템에 있어 중대한 사회적 경제적 영향을 미치고 있다.

현대의학에 있어 진단, 예방,치료의 발달에도 불구하고 여전히 세계적으로 수백만 명의 환자가 발생하고 있는 실정이다(Cheng YL et al., Anti-proliferative activity of Bupleurum scrozonerifolium in A549 human lung cancer cells in vitro and in vivo. Cancer Letters, 222(2), pp.183-93, 2005). 이러한 암의 유발 인자인 발암물질로는 흡연, 자외선, 화학물질, 음식물, 기타 환경인자들이 있으나, 그 유발 원인이 다양하여 치료제의 개발이 어려울 뿐만 아니라 발생하는 부위에 따라 치료제의 효과 또한 각기 다르다. 현재 치료제로 사용되는 물질들은 상당한 독성을 지니고 있으며, 암 세포만을 선택적으로 제거하지 못하므로, 암의 발생 후 이의 치료뿐 아니라, 암의 발생을 예방하기 위한 독성이 적고 효과적인 항암제의 개발이 절실히 필요하다.

세계적으로 매년 1,010만 명의 새로운 암 환자가 발생하고 600만 명이 암으로 사망하며, 이는 전체 사망의 12% 정도를 차지하고 있다. 이러한 추세가 계속되면 2020년경에는 매년 1,570만 명의 암 환자가 발생하고 1,000만 명이 암으로 사망 할 것으로 추정된다. 우리나라 역시 1983년 이후로 한국인의 사망원인으로 암이 첫 번째 원인이 된 이후로 꾸준히 증가하고 있다.

화학 요법, 방사선 요법, 외과 요법, 유전자치료법 등 많은 방법들이 암 치료에 사용되지만 약물을 이용하는 화학 요법이 가장 많이 사용되고 있다. 그러나 화학 요법은 부작용이 크고 쉽게 완치되지 않아 암 치료를 위한 새로운 접근 방법이 필요하게 되었다. 크게 두 가지 접근 방법이 시도되고 있다. 첫째는 다양한 합성 방법을 통하여 기존의 항암제의 약효를 유지하는 한편 부작용은 현저히 줄어든 새로운 유도체를 합성, 개발하는 것이고 둘째는 암 발생 자체를 억제시키거나 암의 진행을 지연 혹은 역전시킴으로써 악성 암으로의 진행을 억제하는 화학적 암 예방(cancer chemoprevention)이다.

최근 선진 각국에서는 독성이 없고 효능이 뛰어난 화학적 암 예방제 및 항암제를 야채, 과일, 약용식물 등의 천연자원으로부터 개발하기 위해 많은 관심을 기울이고 있다(Kelloff et al., Annals New York Academy of Sciences, 889, pp.1-13, 1999).

화학적 암 예방은 외형상 건강한 사람을 대상으로 암 발생을 억제하기 위한 1차 예방, 양성암을 앓고 있는 사람을 대상으로 발암과정을 역전시키기 위한 2차 예방, 악성화, 전이, 합병증 등을 억제하고 암을 치료한 적이 있는 사람을 대상으로 재발을 예방하기 위한 3차 예방으로 단계적으로 적용할 수 있다. 따라서 암 예방 뿐만 아니라 치료제로서도 매우 유용하게 이용될 수 있다.

발암 과정은 크게 발암 물질이 생체 표적 세포의 DNA를 공격하여 돌연변이 를 유도하는 암 개시단계(initiation), 개시화된 세포가 빠르게 증식하여 양성암 상태로 전환되는 암 촉진단계(promotion), 그리고 양성암이 악성암으로 변형되는 암 진행단계(progression)로 구분될 수 있다.

암 개시단계는 발암물질의 활성화를 억제하거나 해독화를 촉진시키고, DNA 복구(repair)를 증가시키며, 활성화된 발암물질이나 활성산소종(ROS: reactive oxygen species)을 제거함으로써 억제할 수 있다.

또한, ROS 제거, 염증반응 억제, 암세포의 증식 억제 및 분화 촉진, 암화에 관여하는 유전자 혹은 단백질 발현의 변화 억제를 통해 암 촉진단계를 차단할 수 있다. 또한, 돌연변이가 발생한 암 개시세포의 아폽토시스(apoptosis)를 유도함으로써 암화를 억제할 수 있다는 것이 알려져 있다(Lotan, Journal of The National Cancer Institute, 87, pp.1655-1657, 1995).

세포사멸(apoptosis)은 세포 내부에 프로그램 된 신호를 따라 여러 유전자 및 단백질들의 발현과 활성이 조절되어 일어나는 능동적인 죽음을 말한다. 이 과정을 통해서 생성된 아포토소체(apoptosome)들은 주변의 세포들이나 대식세포(macrophage) 등의 식세포 작용에 의해 제거됨으로서, 염증을 유발하지 않는다.

세포사멸의 형태적, 생리적 특징으로는 세포질 축소(cytoplasm shrinkage), 세포막(membrane blebbing), 염색체의 응축(chromatin condensation), DNA의 분절(DNA fragmentation), 세포막을 이루는 지질인 포스파티딜세린(phosphatidylserine)의 세포 외부로의 노출, 아포토소체(apoptosome)의 형성 등이 보고되고 있다.

반면에 세포괴사는 외부적 환경의 변화에 의해 급격히 일어나는 수동적 죽음이며, 염색사의 다형태적 덩어리(irregular clumping)와 세포질의 팽창(swelling of cytoplasm) 과정을 거치게 되고, 최종적으로 세포들의 분해를 통해 세포 파편(cell debris)이 생성되고, 이들이 염증을 유발하게 된다.

세포사멸은 생명체의 다양한 생리작용을 정상적으로 유지하는데 중요한 역할을 할 뿐만 아니라, 여러 질병들의 발병과정에도 밀접한 관련이 있다(Hickman et al., Apoptosis induced by anticancer drugs. Cancer Metastasis Rev . 11, pp.121-129, 1992).

세포사멸 과정의 교란은 손상되거나 손상이 시작된 세포의 생존과 그들 세포의 성장을 유도하기 때문에 세포사멸의 억제는 암화과정에서 중요한 역할을 한다. 아울러 암 예방 효과가 있는 물질들은 이러한 비정상적인 세포의 세포사멸을 유도하며, 이들에 의한 세포사멸의 유발은 최소한 그들의 암 예방 활성과 연관되어 있음이 보고 되어왔다.(Fesus et al., Probing the molecular program of apoptosis by cancer chemopreventative agents. J Cell Biochem . 22, pp.151-161, 1995 )

삼백초는 한국의 전통의학에서 부종, 황달, 임질의 치료와 해열, 이뇨작용, 항 염증작용을 돕는 약재로 이용되어져 왔다. 이전의 화학적 연구에서 삼백초는 20가지 이상의 리그난(lignans)을 가지고 있으며 이중 몇 가지는 진정제와 간장 보호제의 효능을 지니고 있음을 보여주었다. (Hwang BY et al., Lignans from Saururus chinensis inhibiting the transcription factor NF-kB. Phytochemistry 64, pp.765771, 2003)

삼백초로부터 얻은 많은 성분의 다양한 약학적 활성에도 불구하고 폐암세포에 대한 항암활성은 충분히 연구되어 있지 않은 실정이다.

이에 본 발명자들은 삼백초의 항암활성을 연구하기 위하여 삼백초의 메탄올 추출물을 이용하여 극성에 따라 분리하고 세포주기 저해활성과 세포사멸에 관한 생물학적 활성을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 암 세포의 아폽토시스 (apoptosis)와 세포주기 저해활성을 유도하고, 암 질환에 대해 항암효과를 갖는 삼백초의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 및 비극성용매 가용 추출물을 함유하는 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 삼백초 조추출물, 극성용매 가용 추출물 및 비극성용매 가용 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

본원에서 정의되는 조추출물은 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 프로필렌글리콜, 초산에칠, 부틸렌글리콜, 에테르, 클로로포름으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 용매에 가용한 추출물을 포함한다.

또한 본원에서 정의되는 극성용매 가용 추출물은 물, 메탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매, 바람직하게는 부탄올에 가용된 추출물이고, 비극성용매 가용추출물은 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드 및 에틸아세테이트와 같은 비극성 용매에 가용한 추출물을 의미한다.

상기 암 질환은 일반적인 암 질환들을 포함하며, 바람직하게는 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 비소세포성폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구 내 흑색종, 자궁암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종, 가장 바람직하게는 폐암을 포함한다.

상세하게는, 본 발명의 삼백초는 암세포의 아폽토시스(apoptosis)를 유도하고, 암 유도 동물 모델에서 암전이 억제 효과를 갖는 삼백초를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 암 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물을 제공한다.

상기 삼백초 조추출물, 극성용매 가용 추출물 및 비극성용매 가용 추출물을 삼백초의 줄기, 잎, 뿌리, 바람직하게는 잎과 뿌리로부터 추출된 추출물을 포함한다.

상기 삼백초 조추출물은 물, 에탄올, 메탄올 등과 같은 C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매로부터 추출한 것을 포함한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 삼백초 조추출물은 하기와 같이 수득될 수 있다.

본 발명의 삼백초를 채집하여 동정을 마친 후, 잘게 마쇄하여 삼백초 시료 중량의 약 1 내지 40배, 바람직하게는 약 1 내지 30배에 달하는 부피의 물, 에탄올 및 메탄올 등과 같은 C₁ 내지 C₄의 저급알콜의 극성 용매 또는 이들의 약 1: 0.1 내지 1: 10의 혼합비를 갖는 혼합용매로, 바람직하게는 70 내지 100 %의 에탄올 및 메탄올로 약 0℃ 내지 120 ℃, 바람직하게는 실온에서 대기압 (1기압) 내지 2기압에서 약 1시간 내지 1일, 바람직하게는 3시간 내지 10시간 동안 냉침 추출법, 열수추출, 환류 순환 추출 또는 압력추출 등의 추출방법을 사용하여, 바람직하게는 냉침 추출법을 수행하여 감압여과, 농축 및 동결 건조하여 삼백초 조추출물을 수득할 수 있다.

또한 본 발명의 유효성분이 정제된 극성용매 및 비극성용매 가용추출물은 상기 조추출물을 물에 현탁한 수, 이를 현탁액의 0.5 내지 100배, 바람직하게는 1 내지 7배 부피의 비극성 용매를 가하여 수층과 비극성용매 가용층을 1회 내지 10회, 바람직하게는 2회 내지 5회 분획하여 수득할 수 있으며, 또한 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있다(Harborne J.B. Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis . 3rd Ed. pp.6-7, 1998).

이하 구체적으로 삼백초 극성용매 및 비극성용매 가용추출물의 분리공정을 설명하면,

예를 들어 삼백초를 분쇄하고 물, 메탄올 또는 에탄올과 같은 극성용매로 초음파추출한 후에 여과하고, 감압농축 및 동결 건조하여 극성용매에 가용한 조추출물을 수득하는 제 1단계;

상기 조추출물을 물에 현탁하여 순차적으로 헥산, 에틸아세테이트, 클로로포름, 에테르 등의 비극성용매로 녹여 현탁시킨 후, 분획 및 여과하여 에틸아세테이트 가용추출물 및 클로로포름 가용추출물을 수득하는 제 2단계;

이어서 순차적으로 수층을 부탄올, 물과 같은 극성 용매를 사용하여 분획 및 여과하고, 부탄올 가용추출물 및 물 가용추출물을 수득하는 제 3계;

상기의 에틸아세테이트 가용추출물, 클로로포름 가용추출물, 부탄올 가용추출물 및 물 가용추출물등을 감압농축하여 건조하는 제 4단계로 구성된 분리공정을 포함한다.

본 발명의 암 관련 질환 예방 및 치료용 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명은 상기의 제조공정으로 얻어진 삼백초 조추출물, 극성용매 가용 추출물 및 비극성용매 가용 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공한다.

삼백초 조추출물, 극성용매 가용 추출물 및 비극성용매 가용 추출물의 효능을 조사하기 위하여, 전자공여능, SOD 유사활성, 아질산염 소거능, DPPH 라디칼 소거능 및 크산틴 산화효소 저해능등에 대한 효과를 실험해본 결과, 본 발명의 삼백 초 추출물이 탁월한 항암효과를 나타냄을 확인하였다.

또한, 삼백초는 오랫동안 생약 및 식용으로 사용되어 오던 약재로서 이들로부터 추출된 본 발명의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 및 비극성용매 가용 추출물 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없으며, 피부 및 안점막자극시험에서 무자극 시료임이 입증되었으므로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨,말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름,에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 삼백초의 조추출물, 극성 용매 가용 추출물 및 비극성 용매 가용 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 암의 예방 효과를 나타내는 상기 삼백초 추출물, 극성용매 가용추출물 또는 비극성용매 가용추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.

또한, 암 질환의 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다.이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강 기능 식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 50 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제, 액제 등의 형태를 포함한다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한점이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 다.

상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 및 비극성용매 가용 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

그밖에 본 발명의 추출물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 참고예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 삼백초 메탄올 추출물의 제조

본 연구에 사용된 삼백초는 2003년 9월 김해시 가락에 위치한 대풍농산에서 재배한 것으로 음건한 잎 200g과 뿌리 200g을 잘게 썰어 5L 비이커에 99% 이상의 공업용 메탄올 4L를 넣고 상온에서 24시간 동안 교반한 후 추출하였다.

이와 같이 3회 반복하여 얻은 추출물을 0.4μm 필터로 여과한 후, 진공농축기(Buchi, Rotavapor R-205V)로 35-40℃에서 감압 농축시켜 메탄올 추출물을 얻었다.

실시예 2. 삼백초 극성 및 비극성 용매 가용 추출물의 제조

메탄올 추출물을 도 1과 같이 물과 에테르(ether)를 이용하여 분획한 후 여과, 감압 농축을 이용하여 클로로포름(CHCl₃), 에틸아세테이트(ethylacetate), 부탄올(BuOH) 및 물(dH₂O)로 극성에 따른 5개의 분획물을 얻었으며 그들의 수획율은 물 2.20%, 에테르 2.57%, 클로로포름 0.18%, 에틸아세테이트 0.04%, 부탄올 0.41% 이다. (도 1 참조)

제조된 5개의 분획 추출물 들은 DMSO에 용해시킨 후 -20℃에 보관하여 사용하였다. 그리고 모든 실험이 수행되기 전 샘플은 즉시 희석하여 사용하였으며 각 실험에서 DMSO의 최종농도가 0.5%를 초과되지 않도록 하였다.

참조예 1. 세포배양

본 실험에 사용된 RPMI-1640 배지, 우 태아 혈청(fetal bovine serum; FBS), 100% 페니실린(penicillin)/스트렙토마이신(streptomycin)은 Hyclone Laboratories (Logan, UT)에서 구입하였고, CCK-8은 Dojin Laboratories(Osaka, Japan)로부터 구입하였다.

본 실험에 사용된 암 세포주로 인간 폐암 세포(human lung adenocarcinoma cell) A549 세포는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 분양 받아 사용하였다. A549는 10% FBS와 1% 페니실린(penicillin)/스트렙토마이신(streptomycin)을 RPMI-1640 배지에 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기(incubator; Forma Co., U.S.A.)에서 배양하였다.

실험예 1. 세포독성 측정

상기 삼백초 추출물의 폐암세포에 대한 세포 독성을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법에 따라 하기와 같이 실험을 수행하였다. (Tominaga H, Ishiyama M, Ohseto F, et al. Water-soluble tetrazolium salt useful for colorimetric cell viability assay. Anal . Commun ., 36 , pp 47-50, 1999)

상기 참조예 1에서 얻은 5x10⁴ 세포/ml의 세포부유물을 96-웰(well) 바닥이 평평한 마이크로타이터 판( flat-bottom microtiter plates; Nalgen Nunc International, Tokyo)의 각 웰(well)에 100 μl씩 접종하고 24 시간 동안 배양시킨 후, 여러 가지의 농도로 만든 실시예 2의 시료들이 들어있는 각각 단계에 희석되어있는 새로운 배지로 교체한 후 다시 48 시간 배양시켰다.

그 후 살아있는 세포를 측정하기 위하여 수용성 테트라졸리움 염에 기초한 독성 분석(a water-soluble tetrazolium salt based cytotoxic assay)을 수행하였다.

10개의 세포 카운팅 키트 용액(Cell Counting Kit solution; WST-8)을 각각의 웰(well)에 첨가한 후 3시간 동안 37℃에서 배양하였다.

살아있는 세포의 경우 노란색을 나타내는 2-(2-메톡시(methoxy)-4-니트로페닐(nitrophenyl))-3-(4-니트로페닐(nitrophenyl))-5-(2,4-디설포페닐(disulfophenyl))-2H-테트라졸리움(tetrazolium) (WST-8)을 오렌지색의 포마쟌 다이(formazan dye)로 색을 변화시키며 이를 450 nm에서 멀티 마이크로플레이트 판독기(multi microplate reader; synergy HT, BIO-TEK)를 이용하여 흡광도를 측정한다.

A549 인간 폐암 세포를 상기 실시예 2에서 얻은 시료들로 처리한 후, CCK-8을 이용하여 WST-8의 흡광도를 측정하고, 대조군의 흡광도를 100%로 하여 각각의 농도에 대한 세포의 생존률을 측정한 결과, 도 2에서 보여지는 바와 같이, 농도에 의존하여 세포의 생존률을 감소시켰다.

부탄올분획과 물분획은 최고농도인 400μg/ml에서도 세포독성을 보이지 않았으며, 클로로포름 분획은 80μg/ml, 에테르 분획은 140μg/ml,에틸아세테이트 분획은 400μg/ml의 농도에서 50%의 세포생존을 저해하며 세포독성을 보였다. 결국 클로로포름 분획이 가장 강한 세포독성을 가짐을 확인하였다.

실험예 2. 세포주기분석

상기 삼백초 추출물의 폐암세포에 대한 세포 주기 분석을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법에 따라 하기와 같이 실험을 수행하였다. (A. Sandoval, V. Hocher. Flow cytometric analysis of the cell cycle in different coconut palm tissues cultured in vitro. Plant Cell Reports. , 22, pp 25-31, 2003)

상기 참조예 1에서 얻은 60 mm-디쉬(dish)에 5x10⁵ 개의 A549 세포를 24시간배양한 후 다양한 농도의 상기 실시예 2에서 얻은 시료들을 포함한 새로운 배지로 각각교체한 후 각기 다른 시간대에 트립신 처리(trypsinization)를 이용하여 세포를 모았다.

그리고 원심분리를 이용하여 세포 부유액을 차가운 PBS로3회 세척한 후 4℃에서 70% 에탄올(v/v)에 1시간 이상 고정되었다. 그 후 다시 차가운 PBS로 원심분리를 통하여 세척된 세포는 PI/RNase 염색 완충제(staining buffer; BD PharMingen)로 15분 동안 4℃에서 배양하였다.

이를 세포주기에 따른 DNA의 함량을 알아보기 위하여 FACScalibur (Becton Dickinson) 유세포분석 시스템(flow cytometry system)의 CellQuest 소프트웨어를 사용하여 20000개의 세포를 각각 측정하였다.

그리고 그 결과는 ModFit LT 2.0 소프트웨어(verity Software House, Topsham, ME, USA)를 이용하여 분석되었다.

상기 실시예 2에서 얻은 시료들로 처리된 A549 암세포주의 DNA를 프로리디움 요오드화물 (propidium iodide, PI)로 염색을 하여 유세포분석기(flow cytometry)로 확인, 분석하였다.

도 3은 상기 실시예 2에서 얻은 시료들이 50%의 세포독성을 가지는 농도에서 세포주기를 저해함을 보여주고 있다. 이 농도에서 24시간 인간 폐암세포 A549를 배양하였을 때 세포주기의 G1기가 대조군의 63.81%에서 에테르 분획물은 81.23%, 클로로포름 분획물은 80.04%, 에틸아세테이트 분획물은 79.71%로 눈에 뜨이게 증가하였다.

이 G1기의 증가는 S기와 G2기의 감소와 함께 발생하였다(도 3 A-D 참조).

우리는 또한 상기 실시예 2에서 얻은 시료들을 다양한 농도로 48시간 처리하였을때 G0/G1보다 적은 DNA량을 가진 세포수를 나타내는 피크를 확인하였다(도 3 E-G 안에 별표로 표시됨).

이 피크는 상기 실시예 2에서 얻은 시료들이 A549 세포의 세포자살 또한 유도할 수 있음을 확인하였다.

실험예 3. 아넥신 ( Annexin ) V와 PI 염색을 이용한 세포사멸( apoptosis ) 분석

상기 삼백초 추출물의 폐암세포에 대한 아넥신 V와 PI염색을 이용한 세포사멸 분석을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법에 따라 하기와 같이 실험을 수행하였다. (van Engeland et al., A novel assay to measure loss of plasma membrane asymmetry during apoptosis of adherent cells in culture. Cytometr., 24 , pp 131-139, 1996)

60 mm-디쉬(dish)에 2x10⁵ 세포/ml의 농도로 24시간 배양된 A549 세포에 상기 실시예 2에서 얻은 시료들이 50%의 세포독성을 가지는 농도를 포함한 새로운 배지로 교체한 후 각기 다른 시간대에 트립신 처리(trypsinization)를 이용하여 세포를 모았다.

그리고 원심분리를 이용하여 세포 부유액을 PBS로 세척한 후 세포 펠렛 (pellet)을 100 의 결합완충용액 (binding buffer)에 부유시킨 다음 5 의 annexin V-FITC (BDPharMingen)와 10 의 PI (50 /ml)를 가한 후 실온 (1525 °C)의 어두운 곳에서 15분간 염색한다. 그리고 이 세포들은 488 nm의 여기파장의 FACScalibur 유세포분석기(BD Instrument에서 제조)를 이용하여 측정하고 제조사에서 제공된 프로그램에 의하여 분석되었다.

세포자살에 관한 연구는 아넥신 V-FITC와 PI염색을 이용해 유세포 분석기로 분석하였다. 초기 세포자살의 지표인 세포막의 바깥쪽에 있는 포스파티딜세린(phosphatidylserine)은 FITC가 붙은 아넥신이라는 단백질에 의해 측정된다.

그리고 PI와의 결합에 의해 초기 세포자살과 후기 세포자살/세포사멸이 구분된다. 도 4는 A549 암세포가 세포독성 50%를 가지는 농도의 상기 실시예 2에서 얻은 시료에서 24시간 동안 배양된 후의 세포자살 분석 결과이다. 150μg/ml의 에테르 분획물의 경우 대조군과 비교시 초기 세포자살은 2.52%에서 5.28%로 그리고 후기 세포자살은 3.47%에서 11.31%로 현저히 증가하였다(도 4 A와 B). 100μg/ml의 클로로포름 분획물과 400μg/ml의 에틸아세테이트 분획물의 경우에서는 대조군과 큰 차이를 보이지 않았다(도 4 C와 4 D 참조).

실험예 4. 크산틴 산화효소 ( Xanthine oxidase ) 저해

상기 삼백초 추출물의 폐암세포에 대한 크산틴 산화효소 저해를 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법에 따라 하기와 같이 실험을 수행하였다. (A.J. Gomes et al., The antioxidant action of polypodium leucotomos extract and kojic acid: reactions with reactive oxygen species. Brazilian Journal of Medical and Biological Research ., 34, pp 1487-1494, 2001)

상기 실시예 1의 추출물 0.01 g을 95 % 메탄올 1 ㎖에 용해시켰으며 0.1 mM 인산 완충 용액 (phosphate buffer pH 7.4)로 각 농도에 따라 희석하였다.

농도에 따라 삼백초에 대한 크산틴 산화효소 저해 반응은 다음과 같이 측정하였다. 시료 100 ㎕에 40 ㎕의 크산틴 산화효소 (0.0741 units/㎖) 첨가된 크산틴 용액 100 ㎕ (1.286 mM)를 가하고 인산 완충 용액으로 2 ㎖이 되도록 가하였다. 크산틴 산화효소 활성은 3분간 크산틴에 반응하여 생성된 요산 (uric acid)을 295 nm에서 흡광도를 측정하였다. 크산틴 산화효소 저해 활성 (%)은 시료 무첨가구 (C), 시료 첨가구 (S)에 대한 흡광도 감소율을 백분율로 나타내었으며 3회 반복실험하였다.

삼백초 추출물의 크산틴산화효소 저해 효과는 표 2에 나타난 바와 같이 7개의 농도에 따라 측정하였다. 모든 시료에서 각각 다른 크산틴 산화 효소 저해 효과를 나타내었으며 크산틴의 요산 생성은 시료의 농도가 증가함에 따라 유의적으로 감소하였다. 삼백초의 크산틴 산화효소가 저해되는 EC₅₀는 282.75 ㎍/㎖로 분석되었다.

삼백초 추출물 농도 (㎍/㎖)	크산틴 산화효소 저해활성 (%)
0	0
25	5.38±5.92
50	15.14±5.16
125	35.02±12.82
250	45.64±6.49
500	62.94±3.73
750	72.32±8.11
EC50 (㎍/㎖)	282.75±68.76

상기의 실험 결과에 따라 삼백초 추출물은 크산틴 산화 효소 저해 효과가 있음을 확인하였다.

실험예 5. 일차피부자극시험

무게 1.75 내지 2.25 ㎏ 사이의 뉴질랜드 (New Zealand)계 웅성 토끼 16마리를 효창 사이언스 (대구 서구 비산동)에서 구입하여 각 추출물 당 4마리를 사용하여 실험하였다.

본 발명의 상기 추출물을 시험물질로 적용하기 전, 적용 부위인 토끼의 등쪽을 제모하였으며, 토끼의 좌우 각각 2부위를 주사침을 이용하여 표피만을 찰과하였다.

각 추출물을 50 ㎎/㎖ 농도로 증류수에 녹인 후, 찰과부위 (abraded part)와 비찰과부위 (intact part)에 각각 0.5 ㎖ 투여하고 비처치구는 0.5 ㎖의 증류수를 투여한 후 2 ㎝의 거즈로 덮었다. 적용 후 처치구와 비처치구는 비자극성 테이프로 잘 고정하고 24시간 경과 후 잔유물질을 제거하였다. 피부반응 적용시간은 24시간과 72시간 후에 패취를 제거하고 관찰하였다.

실험기간동안 사망한 실험동물은 없었으며 체중은 증가하였고 자극에 대한 뚜렷한 반응은 나타나지 않았다. 삼백초 추출물을 토끼에 실험한 후 도포된 피부는 엷은 갈색으로 염색되었으나 피부반응 실험에는 영향을 받지 않았다. 처치구와 비처치구의 피부 모두 어떠한 자극도 관찰되지 않았으며 홍반 (erythema), 부종 (edema), 가피 (eschar)도 나타나지 않았다 (표 3 참조).

상기의 실험 결과에 따라 삼백초 추출물은 피부에 어떠한 자극도 주지 않는 것으로 나타났다.

Site	처치구								비처치구
change	홍반 및 가피				부종				홍반 및 가피				부종
Phase (hrs)	비찰과부위		찰과부위		비찰과부위		찰과부위		비찰과부위		찰과부위		비찰과부위		찰과부위
	24	72	24	72	24	72	24	72	24	72	24	72	24	72	24	72
No.1	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
No.2	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
No.3	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
No.4	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
ΣMean	0				0				0				0
Total	0								0
P.I.I	0								0

실험예 6. 안점막 자극시험

무게 1.75 내지 2.25 ㎏ 사이의 뉴질랜드 (New Zealand)계 웅성 토끼 16마리를 효창 사이언스(대구 서구 비산동)에서 구입하여 각 추출물 당 4 마리를 사용하여 실험하였다.

각 추출물을 50 ㎎/㎖ 농도로 증류수에 녹인 후, 각 실험동물은 처치구로 좌측안구의 결막낭에 0.1 ㎖을 점안하였으며 비처치 대조군으로 우측안구의 결막낭에 0.1 ㎖의 증류수를 점안하였다. 눈 독성에 대한 반응 실험은 시험물질 투여 1, 2, 3, 4, 7일 후 관찰하였다.

토끼에 대한 안점막 자극시험 결과 모든 토끼는 정상으로 관찰되었다. 시료를 점안 후 7일간의 시험기간동안 눈물흘림 (누루), 충혈, 부종 및 고름과 같은 병적인 변화는 나타나지 않았다 (표 4 참조). 상기의 결과에 따라 삼백초는 안점막에 대한 어떠한 자극도 없는 것임을 확인하였다.

하기에 상기 조성물의 제제예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

실시예 1의 삼백초 추출물 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

실시예 1의 삼백초 추출물 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

실시예 1의 삼백초 추출물 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

실시예 1의 삼백초 추출물 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

실시예 1의 삼백초 추출물 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

실시예 1의 삼백초 추출물 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

실시예 1의 삼백초 추출물 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

발명의 삼백초 추출물은 항암효과를 갖는 삼백초의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 및 비극성 용매 가용 추출물을 함유하는 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 삼백초의 추출물은 아폽토시스 (apoptosis)와 세포주기 저해활성을 유도하므로, 암 질환의 예방 및 치료를 위한 유용한 약학조성물및 건강기능식품으로 유용하게 이용 될 수 있다.

Claims (8)

1. 삼백초 조추출물, 또는 비극성용매 가용 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 조추출물은 물, 에탄올, 메탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매에 가용한 추출물인 약학조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 비극성용매 가용 추출물은 물, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매에 가용한 추출물인 약학조성물.
4. 제 1항에 있어서, 상기 암 질환은 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 비소세포성폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구 내 흑색종, 자궁암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종인 약학조성물.
5. 삼백초 조추출물, 또는 비극성용매 가용 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
6. 제 5항에 있어서, 상기 조추출물은 물, 에탄올, 메탄올 또는 이들의

   혼합용매로부터 선택되어진 용매에 가용한 추출물인 건강기능식품.
7. 제 5항에 있어서, 상기 비극성용매 가용추출물은 에틸아세테이트 및 클로로포름으로부터 선택되어진 용매에 가용한 추출물인 건강기능식품.
8. 제 5항에 있어서, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 건강기능식품.

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