KR20070116614A - 미생물 검출 기법 - Google Patents

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KR20070116614A
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존 가빈 맥 도날드
리차드 에이. 보더스
Original Assignee
킴벌리-클라크 월드와이드, 인크.
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
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Abstract

본 발명은 간단하고, 신속하며, 유효한 방식으로 미생물의 존재를 검출하는 기법을 제공한다. 더욱 특히, 본 기법은 관심의 대상이 되는 특정 미생물과 관련된 하나 이상의 휘발성 화합물을 확인하는 것을 포함한다. 휘발성 화합물은 기체 크로마토그래피/질량 분석법 ("GC/MS")의 분석 방법과 함께 고체상 미량추출법을 사용하여 확인할 수 있다. 일단 확인된 후에는, 확인된 휘발성 화합물(들)의 존재하에서 검출가능한 색 변화가 일어날 수 있도록 구성되는 지시제를 선택할 수 있다. 원하는 경우, 매우 다양한 적용에 사용하기 위한 지시제 스트립을 형성하도록 지시제를 기재상에 제공할 수 있다. 이러한 방식으로, 간단하게 지시제 스트립상의 색 변화를 관찰함으로써 미생물의 존재를 신속하게 검출할 수 있다.

Description

미생물 검출 기법 {TECHNIQUE FOR DETECTING MICROORGANISMS}
매우 다양한 산업 분야에 있어서 미생물을 신속하게 검출할 수 있는 능력이 증가 추세에 있는 문제가 되고 있다. 예를 들면, 식품 (예로서, 식육품)은 보통 확립 개시 이전, 그 당시, 또는 그 이후에 분석되어 진다. 그러나, 일반적으로 식품이 소비되기 이전에는 추가 시험은 없기 때문에, 예로서, 살모넬라(Salmonella) 및 리스테리아(Listeria)와 같은 미검출 식품-매개성 병원체에는 제품이 포장, 수송 및 진열되는 동안 바람직하지 못한 수준까지 증식될 수 있는 가능성이 남아있다. 예를 들면, 3℃ 미만의 온도 증가는 음식물의 저장 기간을 50％까지 단축시킬 수 있고, 시간이 경과함에 따라 세균의 성장을 현저하게 증가시킬 수 있다. 실제로, 식품상의 전체 병원성 및 비-병원성 세균 적재량이 1그램당 103 집락 형성 단위 ("cfu")인 것에 기초하면, 음식물은 37℃에서 몇시간만에도 부패할 수 있다. 식품 안전청장은 상기 수준이 식육품에 대한 최대 허용가능한 한계치라는 것을 확인하게 되었다.
시간-온도 지시계를 비롯한, 세균 적재량 또는 음식물의 신선도를 반영하는 진단 시험을 제공하는 다수의 장치가 공지되어 있다. 현재까지는 적용되는 기법에 기인하여 상기 장치들중 어떠한 것도 광범위하게 허용되고 있지 않다. 예를 들면, 포장용 필름 장치에서는 전형적으로 세균과의 실질적인 접촉이 불가피하다. 그러나, 세균이 외부의 음식물 표면에 대하여 내재한다면, 음식물상의 내재된 고도의 세균 적재량은 센서를 활성화시키지 못한다. 암모니아 센서 또한 개발되었지만, 이는 단백질을 분해하는 세균만을 검출할 수 있다. 세균은 초기에 당질을 사용하기 때문에 다수의 적용에 있어서 이들 센서의 감도는 낮다.
이러한 문제들중 몇몇을 극복하기 위한 시도로 수개의 장치가 개발되었다. 예를 들면, 미국 특허 출원 공개번호 제 2004/0265440호 (모리스( Morris ) 등)에는 부패하기 쉬운 식품에서 세균을 검출하기 위한 센서가 기재되어 있다. 상기 센서는, 식품 또는 포장 표면과 이격된 관계를 갖도록 배치시키기 위한 하우징에 의해 운반되는 pH 지시제를 포함하는 기체-투과성 물질을 포함한다. 지시제는, 세균 성장을 표시하는 세균성 기체 대사 산물의 농도 변화를 검출하는데, 여기에서, pH 변화는 대사 산물의 존재에 영향을 받는다. 예를 들면, pH 지시제를 통해 확산되고, 수소 이온 농도를 저하시킴으로써 pH를 강하시키는 이산화탄소 기체의 수준이 증가된 경우, pH 지시제 (예로서, 브로모티몰 블루 및 메틸 오렌지의 혼합물)에서는 녹색으로부터 오렌지 색으로의 시각적 색 변화가 일어날 것이다.
불행하게도, 그러한 pH 지시제에는 여전히 문제가 남아있다. 예를 들면, 오직 강하된 pH 검출만이 몇몇 세균이 존재할 수 있음을 지시한다. 그러나, 강하된 pH는 존재하는 세균 유형에 관하여는 어떤 지시도 제공하지 못한다. 세균 유형을 선택적으로 확인하는 것에 대한 필요성은 다양한 이유에서 중요하다. 예를 들면, 몇몇 유형의 세균들은 유해하지 않은 것으로 여겨질 수 있다. 또한, 존재하는 세 균 유형에 대한 지식을 통해서도 특정 오염원을 확인할 수 있을 것이다.
따라서, 현재는 신속하게 간단하게 미생물의 존재를 검출하고, 검출된 미생물중 특정 유형을 확인하기 위한 기법이 요구되고 있다.
발명의 요약
본 발명의 하나의 실시태양에 따라, 미생물의 존재를 검출하는 방법을 개시한다. 본 방법은 미생물 배양에 의해 생성된 헤드스페이스 기체를 추출하고, 추출된 헤드스페이스 기체를 분석하고, 미생물 배양과 관련된 휘발성 화합물을 확인하고, 확인된 휘발성 화합물의 존재하에서 검출가능한 색 변화가 일어나는 지시제를 선택하는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 실시태양에 따라, 미생물의 존재를 검출하는 방법을 개시한다. 본 방법은 미생물 배양과 관련된 휘발성 화합물을 확인하고; 확인된 휘발성 화합물의 존재하에서 검출가능한 색 변화가 일어나는 지시제를 선택하고; 지시제를 기재 표면에 적용시키는 것을 포함한다.
본 발명의 추가의 또다른 실시태양에 따라, 다수의 미생물의 존재를 검출하기 위한 기재를 개시한다. 본 기재는 적어도 제1 및 제2 지시제 구역을 포함한다. 제1 지시제는 제1 미생물에 의해 생성된 제1 휘발성 화합물과의 접촉시 검출가능한 색 변화를 일으키는데 유효한 양으로 제1 지시제 구역내에 포함된다. 제2 지시제는 제2 미생물에 의해 생성된 제2 휘발성 화합물과의 접촉시 검출가능한 색 변화를 일으키는데 유효한 양으로 제2 지시제 구역내에 포함된다.
본 발명의 다른 특징 및 측면은 하기에서 더욱 상세히 논의된다.
본 발명의 최상의 양식을 비롯하여, 당업자들을 위한 본 발명의 충분하고 실시가능한 개시는 첨부된 도면을 참조로 하여 본 명세서의 나머지 부분에 더욱 구체적으로 상술되어 있다.
도 1은 본 발명의 하나의 실시태양에 따라 사용될 수 있는 고체상 미량추출법 "SPME" 어셈블리의 개략적 도해이고;
도 2는 휘발성 화합물의 존재비를 정체 시간에 대해 플롯팅한, 실시예 1에서 P. 애루지노사(P. aeruginosa)에 대해 수득한 총이온 크로마토그램이며;
도 3은 휘발성 화합물의 존재비를 정체 시간에 대해 플롯팅한, 실시예 2에서 S. 아우레우스(S. aureus)에 대해 수득한 총이온 크로마토그램이고;
도 4는 휘발성 화합물의 존재비를 정체 시간에 대해 플롯팅한, 실시예 3에서 E. 콜라이(E. coli)에 대해 수득한 총이온 크로마토그램이고;
도 5는 휘발성 화합물의 존재비를 정체 시간에 대해 플롯팅한, 실시예 4에서 C. 알비칸스(C. albicans)에 대해 수득한 총이온 크로마토그램이며;
도 6은 휘발성 화합물의 존재비를 정체 시간에 대해 플롯팅한, 실시예 5에서 살모넬라에 대해 수득한 총이온 크로마토그램이고;
도 7은 도 6중에서 몇몇 차이가 관찰되는 영역에 대한 확대도를 나타낸다.
대표적인 실시태양의 상세한 설명
이에, 본 발명의 다양한 실시태양에 관하여 상세히 언급할 것이며, 상기에 대한 하나 이상의 일례를 하기에 설명한다. 각각의 일례는 본 발명을 설명하기 위해 제공되는 것이며, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 사실상, 본 발명의 범주 또는 정신으로부터 벗어남 없이 본 발명에서 다양한 변형 및 변경이 수행될 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 예를 들면, 하나의 실시태양의 일부분으로서 설명되거나 기술되는 특징들은 그외의 추가적인 실시태양을 얻기 위해 또다른 실시태양상에서 사용될 수 있다. 따라서, 상기 변형 및 변경이 첨부되는 청구범위 및 그의 등가물의 범주내 포함되는 것과 같이 본 발명은 그러한 변형 및 변경도 포함시키고자 한다.
본 발명은 간단하고, 신속하며, 효율적인 방식으로 미생물의 존재를 검출하는 기법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 기법은 관심의 대상이 되는 특정의 미생물과 관련된, 하나 이상의 휘발성 화합물을 확인하는 것을 포함한다. 휘발성 화합물은 예를 들면, 기체 크로마토그래피/질량 분석법 ("GC/MS")의 분석 방법과 함께 고체상 미량추출법을 사용하여 확인할 수 있다. 일단 확인된 후에는, 확인된 휘발성 화합물(들)의 존재하에서 검출가능하게 색 변화가 일어날 수 있도록 배치되는 지시제를 선택할 수 있다. 원하는 경우, 매우 다양한 적용에 사용하기 위한 지시제 스트립을 형성하도록 지시제를 기재상에 제공할 수 있다. 이러한 방식으로, 간단하게 지시제 스트립상의 색 변화를 관찰함으로써 미생물의 존재를 신속하게 검출할 수 있다.
미생물, 예로서, 세균, 효모, 진균, 곰팡이, 원생동물, 바이러스 등은 특정 특징들에 따라 다양한 군으로 분류된다. 예를 들면, 세균은 일반적으로 그의 형 태, 염색상의 특징, 환경적 요건, 및 대사적 특징 등에 준하여 분류된다. 의학적으로 유의적인 수개의 세균 군은 예를 들면, 그람 음성 간균 (예로서, 장내세균); 그람 음성 곡선형 간균 (예로서, 비브리오, 헬리코박터(Helicobacter), 캄필로박터(Campylobacter) 등); 그람 음성 구균 (예로서, 네이세리아(Neisseria)); 그람 양성 간균 (예로서, 바실러스(Bacillus), 클로스트리디움(Clostridium) 등); 그람 양성 구균 (예로서, 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus) 등); 편성 세포내 기생충 (예로서, 리케차(Rickettsia) 및 클라미디아(Chlamydia)); 항산성 간균 (예로서, 미오박테리움(Myobacterium), 노카르디아(Nocardia) 등); 스피로케테스 (예로서, 트레포네마(Treponema), 볼레리아(Borellia) 등); 및 미코플라스마 (즉, 세포벽이 없는 미소 세균)을 포함한다. 특히 관련된 세균으로는 E. 콜라이 (그람 음성 간균), 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia) (그람 음성 간균), 스트렙토코커스 (그람 양성 구균), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella choleraesuis) (그람 음성 간균), 스타필로코커스 아우레우스(Staphyloccus aureus) (그람 양성 구균), 및 P. 애루지노사 (그람 음성 간균)를 포함한다.
특정 조건하에서 미생물은 성장하고 증식한다. 성장을 위한 요건으로는 적합한 영양분의 공급, 에너지원 (예로서, 광합성 또는 무기영양), 물, 적절한 온도, 적절한 pH, 적절한 수준의 산소 (예로서, 혐기성 또는 호기성) 등을 포함할 수 있다. 예를 들면, 세균은 영양분으로서 광범위한 화합물, 예로서, 당 및 당질, 아미노산, 스테롤, 알코올, 탄화수소, 메탄, 무기염, 및 이산화탄소를 사용할 수 있다. 성장은 특정 세균에 대한 최적의 성장 온도에서 가장 신속하게 진행된다 (그리고, 상기 최적 온도로부터 온도가 상승하거나 하강함에 따라 이는 감소하게 된다). 임의의 세균의 경우, 그를 넘어선 온도에서는 성장이 유지되지 못하는 최소 및 최대 온도가 존재한다. 고온균의 최적의 성장 온도는 45℃ 초과이고, 중온균의 최적의 성장 온도는 15 내지 45℃ 사이이며 (예로서, 인간 병원균), 저온균의 최적의 성장 온도는 15℃ 미만이다.
의학적으로 유의적인 인간 병원체를 비롯한 다수 유형의 미생물은 성장하는 동안 그리고 증식하는 동안 휘발성 화합물을 생산한다. 본 발명자들은, 하나 이상의 이러한 휘발성 화합물이 특정의 미생물 군, 미생물 속, 미생물 종 및/또는 미생물 아종에 대하여 특유한 것이라는 것을 발견하게 되었다. 확인된 휘발성 화합물에 대하여 특이적인 기법을 개발하기 위해 휘발성 화합물은 그 자체로서 분석되고 확인될 수 있다. 휘발성 화합물은 관심의 대상이 되는 적용에 대한 한계치 안전 수준인 적재량으로 또는 대략 적재량 수준으로 분석될 수 있다. 예를 들면, 저장액 1ml당 1 x 103 집락 형성 단위 ("cfu")의 세균 적재량이 음식물-기제 적용에서 한계치 안전 수준으로서 허용된다. 따라서, 몇몇 실시태양에서, 저장액 1ml당 적어도 1 x 103 cfu의 적재량으로 분석을 수행할 수 있다. 그러나, 시험을 위해 선택된 적재량은 허용되는 한계치 수준과 동일할 수도 있고, 또는 동일하지 않을 수도 있다는 것을 이해하여야 한다. 즉, 적어도 하나 이상의 휘발성 화합물이 확인될 수 있는 한, 더욱 소량의 적재량도 시험될 수 있다.
미생물에 의해 생성된 휘발성 화합물은 다양하게 상이한 기법을 사용하여 본 발명에 따라 분석될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 예로서, 속슬레(Soxhlet) 추출, 액체-액체 추출, 가속 용매 추출, 극초단파를 이용한 용매 추출, 고체상 추출, 초임계 유체 추출 등과 같은 추출법이 사용된다. 하나의 특히 바람직한 추출 기법은 "고체상 미량추출법" ("SPME")으로서, 이는 샘플 추출 및 사전-농축을 단일 단계로 실시할 수 있도록 한다. SPME에서 고체 융합된 섬유의 외면은 선택적 고정상으로 코팅된다. 신속하게 용질을 확산시킬 수 있는, 열적으로 안정적인 중합체 물질이 통상 고정상으로서 사용된다. 코팅된 섬유 단부를 샘플의 헤드스페이스내로 침지시키고, 안정적으로 평형이 되도록 함으로써 추출 작업을 수행한다.
도 1을 참고로 하여, 예를 들면, 고체상 미량추출법을 수행하기 위한, 주사기(4)를 사용하는 장치(2)의 실시태양을 나타낸다. 주사기(4)는 배럴(8)내 슬라이딩형의 플런저(10)을 포함하는 배럴(8)로부터 형성된다. 플런저(10)은 배럴(8)의 한쪽 단부(14)로부터 확장된 핸들(12)를 갖는다. 니들(18)은 이음구(20)에 의해 배럴(8)의 반대쪽 단부(16)으로 연결된다. 장치(2)는 또한 섬유(6)을 포함하는데, 이는 니들(18)로부터 배럴(8)을 통해 단부(14) 밖으로 확장된 고체 실형(thread-like) 물질이다. 핸들(12)에 인접하게 위치하는 섬유(6) 단부 (나타내지 않음)는 그 위에 위치하는 유지 수단(22)를 갖고, 이로써, 플런저(10)이 배럴(8)내에서 슬라이딩함에 따라 섬유는 수직으로 움직일 것이다. 유지 수단은 간단하게, 핸들(8)에 근접한 섬유(6)의 단부상에 배치된 에폭시 소적일 수 있다. 섬유(6)은 부분적으로, 플런저(10), 배럴(8) 및 니들(18)의 일부분내 섬유(6)의 일부를 둘러싸는 금 속 슬리브(24)에 내장되어 있다. 금속 슬리브(24)의 하나의 용도는 섬유(6)이 손상되지 못하도록 보호하는 것이며, 장치 작동시 충분하게 밀봉시켜주는 것이다. 섬유(6)으로의 대체 접근을 허용하는 임의의 주입구(26)은 이음구(20)으로부터 확장된다. 예를 들면, 섬유(6)이 니들(18)내 포함되어 있을 때, 유체는 주입구(26)으로 유입되고 니들(18)의 유리 단부(28)로부터 유출됨으로써 유체는 섬유(6)과 접촉할 수 있다. 주입구(26)은 또한 섬유(6)과 활성화 용매를 접촉시키기 위하여 사용될 수 있다.
고체상 미량추출법과 추후의 분석법을 실시하기 위해 사용자는 간단하게, 관련 미생물 배양을 포함하는 용기, 병, 접시, 아가 플레이트, 또는 임의의 다른 샘플 홀더내로 플런저(10) 및 노출된 섬유(6)을 내리누를 수 있다. 예를 들면, 섬유는 액상으로 코팅된 융합 실리카 (폴리디메틸실록산, 스티렌 디비닐벤젠 다공성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜, 탄소 분자체 흡착제, 그의 조합물 등)일 수 있다. 배양 기간동안 미생물은 성장하고, 관련 휘발성 화합물을 생산한다. 그 자체로서, 샘플 홀더의 헤드스페이스는 휘발성 화합물로 충진된다. 충분한 기간 (예로서, 약 2 내지 약 30분)이 경과한 후, 헤드스페이스 성분들은 섬유(6)상에 흡착된다. 이후, 섬유(6)을 니들(8)쪽으로 잡아당기기 위해여 플런저(10)을 철회 위치(withdrawn position)로 이동시킨 후, 니들(8)을 샘플 홀더로부터 제거한다. 이어서, 흡착된 헤드스페이스 성분은 추후의 분석을 위해 가열시킴으로써 섬유 액상으로부터 탈착시킨다. 본 발명에 사용하기 적합한 하나의 SPME 어셈블리는 미주리주 세인트 루이스에 소재하는 시그마-알드리치 인코포레이티드(Sigma-Aldrich, Inc.)로부터 상 품명 "수펠코(Supelco)"하에 상업적으로 구입가능하다. "수펠코" 시스템은 수동 섬유 홀더 (카탈로그 번호 57330-U) 및 85-㎛ 카르복센(Carboxen)™/폴리디메틸실리콘으로 코팅된 스테이블플렉스(StableFlex)™ 섬유 (카탈로그 번호 57334-U)를 사용한다. 상기 섬유는 기체 및 저분자 화합물에 대하여 권고된다. 또한, 본 발명에서는 다양한 다른 추출 기법, 예로서, 미국 특허번호 제5,691,206호 (파울리진( Pawliszy )); 제6,537,827호 (파울리진); 제6,759,126호 (말리크( Malik ) 등): 및 제6,780,314호 (진노( Jinno ) 등) (상기 모두는 그 전체가 본 원에서 모든 목적으로 참고문헌으로서 인용된다)에 기재되어 있는 기법 또한 사용될 수 있다.
추출한 다음에는 보통 크로마토그래피 분석으로 이어지고, 여기에서 추출된 화합물은 크로마토그래피 칼럼으로 도입시키기 위한 주입부(injection port)에서 탈착된다. 예를 들면, 하나의 실시태양에서, 기체 크로마토그래프 ("GC")가 본 발명에서의 이용을 위해 사용된다. 기체 크로마토그래프 ("GC")는 기체 상태의 샘플을 취하고 상기 샘플을 개개의 화합물로 분리시켜 상기 화합물을 확인하고 정량화할 수 있도록 하는 분석기이다. 전형적인 기체 크로마토그래프는, 샘플 성분을 기체로 전환시키고 상기 기체를 협대역의 분리 칼럼 상부로 이동시키는 주입기, 및 불활성 운반 기체에 의해 칼럼을 통해 퍼짐에 따라 샘플 혼합물을 그의 개개의 성분들로 분리시키는 분리 칼럼 (예로서, 긴 코일형 튜브)을 포함한다. 분리는 성분과, 칼럼내의 고정된 액체 또는 고체 물질 사이의 차별적 상호작용에 기초한다. 예를 들면, 본 발명에서 사용될 때, 추출된 헤드스페이스 기체는 기체 크로마토그래프의 주입구로 유입된다. 이어서, 기체는 분자를 분리시키는 칼럼을 통해 이동 하게 된다. 상이한 샘플 성분은 칼럼내에서 상이한 시간동안 유지되고, 특유의 정체 시간에 도착하게 된다. 이들 "정체 시간"은 특정 샘플 성분을 확인하는데 사용될 수 있으며, 칼럼내 흡착성 물질의 유형 및 양, 칼럼 길이 및 직경, 운반 기체 유형 및 흐름 속도, 및 칼럼 온도의 함수이다.
재현가능한 정체 시간을 얻는데 도움이 되도록 기체 크로마토그래프는 일반적으로 제어가능하게 가열되거나 냉각된다. 예를 들면, 다양한 코팅 (예로서, 폴리실록산 기재 코팅)으로 코팅된 폴리이미드 또는 금속 클래드 융합 실리카를 가열하는 오븐이 사용될 수 있다. 오븐은 저항 가열원, 및 오븐에서 가열된 공기를 순환시키는 팬을 사용할 수 있다. 유사하게, 오븐에서 배출구를 열거하, 저항 가열원의 전원을 끄거나, 주변 대기 또는 극저온 냉각제, 예로서, 액상 이산화탄소 또는 액상 질소를 사용하여 칼럼의 송기 냉각을 사용하여 칼럼을 냉각시킬 수 있다. 별법으로, 금속 외장을 사용하여 모세관 GC 칼럼을 가열시킬 수 있다. 이러한 경우, 칼럼을 금속 외장으로 쓰레드(thread)한 후, 크로마토그래프 공정시 외장을 저항적으로 가열한다.
원하는 경우, GC 분석법은 또한 보다 정확한 결과를 얻기 위하여, 질량 분석법 ("MS")을 비롯한 다른 확인 기법과 결부될 수 있다. 질량 분석법은 일반적으로 물질 및 물질의 혼합물의 정량 분석 및 정량적 화학 분석을 위해 사용되는 분석 방법론이다. 질량 분석법에서, 샘플 (즉, GC 공정에 의해 분리된 것)은 이온화 발생원에서 그의 구성부의 대전된 입자로 붕괴된다. 일단 생산된 후에 입자는 그 개개의 질량 대 전하비에 기초하여 분석계에 의해 추가로 분리된다. 이어서, 이온은 검출되고, 물질의 질량 스펙트럼이 형성된다. 용출 분자의 이온 강도에 대한 정보를 제공한다는 점에서 질량 스펙트럼은 분석하는 샘플 물질의 핑커프린트와과 유사하다. 특히, 질량 분석법은 샘플의 분자 및 분자 단편의 분자량을 측정하는데 사용될 수 있다. 질량 분석계는 일반적으로 샘플로부터 이온을 생성하는 이온화 발생원을 포함한다. 예를 들면, 사용될 수 있는 이온화 발생원중 하나의 유형은 전자 이온화 (EI) 챔버이다. 질량 분석계는 또한 전형적으로 그의 질량-대-전하비 (m/z)에 따라 이온을 분리시키는 적어도 하나의 분석기 또는 필터, 및 이온의 존재비를 측정하는 검출기를 포함한다. 검출기는 샘플의 질량 스펙트럼을 형성하는 데이타 처리 시스템에 출력 신호를 제공한다.
GC/MS 시스템의 GC 및 MS 부품은 분리형이거나 통합형일 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 사용하기에 적합한 하나의 통합형 GC/MS 시스템은 콜로라도주 러브랜드에 소재하는 애질런트 테크놀로지스, 인코포레이티드(Agilent Technologies, Inc.)로부터 상품명 "5973N"하에 상업적으로 구입가능하다. 다양한 다른 기체 크로마토그래프 및/또는 질량 분석법 시스템은 또한 제5,846,292호 (오버톤( Overton )); 제6,691,053호 (큄비 ( Quimby ) 등); 제6,607,580호 (해스팅스( Hastings ) 등): 제6,646,256호 (고리( Gourley ) 등); 및 제6,849,847호 (바이( Bai ) 등) (상기 모두는 그 전체가 본 원에서 모든 목적으로 참고문헌으로서 인용된다)에 기재되어 있다.
사용되는 특정 확인 기법과는 상관없이, 보통 특정의 미생물 속, 미생물 종 및/또는 미생물 아종에 대하여 특유한 휘발성 화합물을 확인하는 것이 바람직하다. 이러한 방식으로, 확인된 휘발성 화합물에 대하여 특이적인 지시제가 선택될 수 있다. 그러나, 실제로는 확인된 휘발성 화합물이 사실대로 특유한 것인지 여부를 용이하게 측정한다는 것은 어려울 수 있다. 따라서, 사용시 지시제가 봉착할 수 있는 미생물의 유형에 기초하여 특유한 휘발성 화합물이 확인될 수 있다. 예를 들면, 음식물-기제 적용에서 관련성을 갖는 것으로 여겨지는 몇몇 세균 유형으로는 E. 콜라이, S. 콜레라수이스(S. choleraesuis), S. 아우레우스, 및 P. 애루지노사를 포함한다. 유사하게, 지시제를 광범위한 용도로 사용하고자 하는 경우, 더욱 많은 세균 유형을 시험할 수 있다. 추가의 다른 경우에는, 특정의 미생물 유형에 대하여 특유한 휘발성 화합물을 확인하는 것이 불필요하거나 바람직하지 않을 수도 있다. 예를 들면, 또다른 미생물 유형에 의해서도 생산되는 하나 이상의 휘발성 화합물이 하나의 미생물 유형에 대하여 확인될 수 있다. 상기와 같은 경우에는, 지시제는 하나 이상의 미생물 유형의 존재를 확인하게 될 것이다.
일반적으로, 지시제는 확인된 휘발성 화합물의 존재를 용이하게 알려줄 수 있다. 하나의 실시태양에서, 지시제는 휘발성 화합물과의 접촉시, 육안으로 또는 기구를 통해 검출가능한 색 변화를 나타내는 염료이다. 예를 들면, 휘발성 화합물과의 접촉, 그 이전에 지시제 염료는 무색일 수 있거나, 특정의 색상을 가질 수 있다. 그러나, 휘발성 화합물과의 접촉, 그 이후에 염료는 초기 색상과는 상이한 색 변화를 나타낸다. 즉, 염료는 제1 색상으로부터 제2 색상으로, 무색으로부터 유색으로, 또는 유색으로부터 무색으로 색상이 변할 수 있다. 필요하지는 않지만, 최대 흡착값이 스펙트럼의 적색 말단쪽으로 이동 ("적색 이동") 또는 스펙트럼의 청 색 말단쪽으로 이동 ("청색 이동")하는 것을 유도하는 염료 분자에 관능기 (예로서, OH, NH2 등)를 가함으로써 검출가능한 색 변화가 일어날 수 있다. 흡착값 이동에 대한 유형은 염료 분자의 성질 및 관능기가 전자 수용체 (산화제)로서 작용하는지 여부 (여기에서는 청색 이동이 일어난다), 또는 관능기가 전자 공여체 (환원제)로서 작용하는지 여부 (여기에서는 적색 이동이 일어난다)에 따라 달라진다. 상기와 무관하게, 흡착값 이동은 검출가능한 색상 차이를 제공할 수 있다.
다양한 공지 지시제중 임의의 것을 본 발명에 사용할 수 있다. 예를 들면, 그러한 지시제는 4-디메틸아미노신남알데히드로서, 이는 하기의 구조식을 갖는 에틸렌계 불포화 아민 염기이다:
Figure 112007069912356-PCT00001
4-디메틸아미노신남알데히드에서는 일반적으로 하기 구조식을 갖는 인돌의 존재하에서 색 변화가 일어날 수 있다:
Figure 112007069912356-PCT00002
또다른 적합한 지시제는 하기 구조식을 갖는 과망간산칼륨이다:
Figure 112007069912356-PCT00003
과망간산칼륨은 강한 산화제이고, 용이하게 산화될 수 있는 화합물, 예로서, 알코올, 알데히드, 불포화 탄화수소 등의 존재하에서 색 변화가 일어날 수 있다. 상기 용이하게 산화될 수 있는 화합물의 일례로는 하기 구조식을 갖는 메틸 2-메틸-2-부테노에이트이다:
Figure 112007069912356-PCT00004
과망간산칼륨에서 색 변화를 개시할 수 있는 화합물의 또다른 일례로는 하기 구조식을 갖는 2,5-디메틸피라진이다:
Figure 112007069912356-PCT00005
추가의 또다른 적합한 지시제는 하기 구조식을 갖는 중크롬산암모늄이다:
Figure 112007069912356-PCT00006
중크롬산암모늄은 또한 강한 산화제이고, 예로서, 식 (CH3)2CHCH2CH2OH를 갖 는 이소-아밀 알코올과 같은 알코올의 존재하에 색 변화가 일어날 수 있다.
추가로, 2,4-디니트로페닐히드라진 ("DPNH") 또한 탄소-산소 이중 결합을 갖는 화합물 (예로서, 알데히드 및 케톤)에 대한 적합한 지시제로서, 하기 구조식을 갖는다:
Figure 112007069912356-PCT00007
예를 들면, DPNH ("브래디 시약(Brady's reagent)"으로도 공지되어 있음)는 하기 구조식을 갖는 2-아세틸 티아졸의 존재하에서 색 변화가 일어날 수 있다.
Figure 112007069912356-PCT00008
상기 언급한 지시제 이외에도, 몇몇 다른 통상의 지시제 및 그와 관련된 표적 화합물을 하기에 기재한다.
지시제 표적 화합물
암모니아 테트라사이클린
질산암모늄세륨(Ⅳ) 폴리알코올
아닐린/인산 당
p-아니스알데히드 환원당
p-아니시딘 프탈레이트 환원당
안트론 케토오스
비스무스 클로라이드 스테롤
브로모크레졸 그린 유기산 및 무기산
브로모크레졸 퍼플 디카르복실산, 할로겐 이온
카민 다당류
크로모황산 유기 화합물
염화코발트(II) 유기 포스페이트 에스테르
코발트티오시아네이트(II) 알칼로이드, 아민
알파-사이클로덱스트린 직쇄 지질
o-디아니시딘 알데히드, 케톤
2,6-디브로모퀴논 클로르이미드 페놀
2',7'-디클로로플루오레세인 포화 및 불포화 지질
2,6-디클로로페놀인도페놀 유기산, 케토산
디코발트 옥타카보닐 아세틸렌 화합물
디에틸 말로네이트 3,5-디니트로벤조산 에스테르
3,5-디니트로벤조산 환원당
2,4-디니트로플루오로벤젠 아미노산
3,5-디니트로살리실산 환원당
디페닐아민 당지질
디페닐카르바존 양이온
4,4'-디티오디아닐 티올
에틸렌디아민 카테콜 아민
페스트 블루 염 B 페놀, 커플링 아민
플루오레세인 지질
글리옥살비스(2-하이드록시아닐) 양이온
히드라진 설페이트 피페로날, 바닐린, 에틸 바닐린
염산 글리칼
과산화수소 방향산
철티오시아네이트(II) 과산화물
납아세테이트(IV) 1,2-디올기
마그네슘 아세테이트 안트라퀴논 글리코시드
메틸움벨리페론 헤테로사이클릭 화합물
1-나프톨/하이포브로마이트 구아니딘 유도체
닌히드린 아미노산, 아민, 아미노-당,
팔라듐클로라이드(II) 티오포스페이트 에스테르
페놀/황산 당
m-페닐렌디아민 환원당
페닐플루오론 게르마늄
페닐히드라진 디하이드로아스코르브산
퀴날리자린 양이온
p-퀴논 에탄올아민
로다닌 카로테노이드 알데히드
질산은 페놀
소듐 메타-페리오데이트 하이드록시아미노산, 세린, 트레오닌
니트로프루시드나트륨 설프하이드릴기를 갖는 화합물
테트라시아노에틸렌 방향족 탄화수소, 페놀
테트라졸륨 블루 환원성 화합물
티오바르비투르산 소르브산
티몰 블루 디메틸아미노산
염화주석(IV) 트리터펜, 페놀, 폴리페놀
톨루이딘 블루 산성 다당류
잔티드롤 트립토판, 인돌 유도체
선택된 지시제는 일반적으로 특정 미생물의 존재하에서 검출가능한 색 변화를 일으킬 수 있는 유효량으로 사용된다. 원하는 색 변화를 일으킬 수 있는 지시제의 능력은 지시제와 미생물에 의해 생성된 기체의 접촉을 증가시킴으로써 증진시킬 수 있다. 그로써, 원하는 색 변화를 일으키기 위해 필요한 지시제의 양은 감소될 수 있다. 그러한 방식으로 표면적을 증가시키기 위한 하나의 기법은 지시제를 기재에 적용시키는 것이다. 사용시, 하나 이상의 지시제를 기재에 적용시켜 하나 또는 다수의 미생물 유형의 존재를 검출하기 위해 배치된 지시제 스트립을 형성할 수 있다. 예를 들면, 하나의 실시태양에서, 지시제 스트립은 E. 콜라이, S. 콜레 라수이스, S. 아우레우스, 및 P. 애루지노사의 존재를 검출하기 위해 디자인될 수 있다. 1개의 지시제 또는 다수의 지시제 (예로서, 4개)를 사용함으로써 수행될 수 있다. 기재는 또한 다른 목적, 예로서, 물 흡착, 포장 등의 역할을 할 수 있다.
본 발명에 따라 임의의 여러 상이한 기재가 지시제와 함께 혼입될 수 있다. 예를 들면, 부직포, 직물, 면, 편물, 습강지, 필름, 포움 등이 지시제와 함께 적용될 수 있다. 사용시, 부직포는 제한하는 것은 아니지만, 스펀본드 웹 (천공형 또는 비천공형), 멜트블로운 웹, 본디드 카디드 웹, 에어-레이드 웹, 코포움 웹, 수력 엉킴 웹 등을 포함할 수 있다. 매우 다양한 열가소성 물질을 사용하여 부직포 웹을 제작할 수 있고, 제한없이 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리올레핀, 에틸렌 및 프로필렌의 공중합체, 에틸렌 또는 프로필렌과 C4-C2O 알파-올레핀과의 공중합체, 에틸렌과 프로필렌 및 C4-C2O 알파-올레핀과의 공중합체, 에틸렌 비닐 아세테이트 공중합체, 프로필렌 비닐 아세테이트 공중합체, 스티렌-폴리(에틸렌-알파-올레핀) 엘라스토머, 폴리우레탄, A-B 블록 공중합체 (여기에서, A는 폴리(비닐 아렌) 부위, 예로서, 폴리스티렌으로 형성되고, B는 엘라스토머 미드블록, 예로서, 접합된 디엔 또는 저급 알켄이다), 폴리에테르, 폴리에테르 에스테르, 폴리아크릴레이트, 에틸렌 알킬 아크릴레이트, 폴리이소부틸렌, 폴리-1-부텐, 에틸렌-1-부텐 공중합체를 비롯한 폴리-1-부텐의 공중합체, 폴리부탄디엔, 이소부틸렌-이소프렌 공중합체, 및 상기중 임의의 것의 조합을 포함한다.
또다른 유형의 적절한 부직포 웹은 코포움 물질로서, 이는 전형적으로 셀룰 로오스 섬유와 멜트블로운 섬유의 혼화물이다. 용어 "코포움"은 일반적으로 열가소성 섬유 및 제2 비-열가소성 물질의 혼합물 또는 안정화된 매트릭스를 포함하는 복합재를 언급한다. 일례로, 코포움 물질은 웹이 형성되는 동안, 다른 물질을 웹에 첨가하는, 적어도 하나의 멜트블로운 다이 헤드를 슈트(chute) 근방에 배열하는 공정에 의해 제조될 수 있다. 그러한 다른 물질은, 제한하는 것은 아니지만, 섬유성 유기 물질, 예로서, 목재 또는 비-목재 펄프, 예로서, 면, 레이온, 재생 종이, 펄프 플러프 및 또한 초흡수성 입자, 무기 흡수성 물질, 처리된 중합성 스테이플 섬유 등을 포함할 수 있다. 그러한 코포움 물질의 몇몇 일례는 미국 특허번호 제4,100,324호 (앤더슨( Anderson ) 등); 제5,284,703호 (에버하트( Everhart ) 등); 및 제5,350,624호 (조저 ( Georger ) 등) (상기 모두는 그 전체가 본 원에서 모든 목적으로 참고문헌으로서 인용된다)에 개시되어 있다.
지시제는 또한 하나 이상의 종이 웹, 예로서, 미용 티슈, 목욕 티슈, 종이 타올, 냅킨 등을 포함하는 종이 제품에서 사용될 수 있다. 종이 제품은 제품을 형성하는 웹이 단일층을 포함하거나 층화되어 있는 (즉, 다중 층을 포함하는) 단층일 수 있거나, 제품을 형성하는 웹이 그들 자체이거나 단일 또는 다중층화된 것일 수 있는 다중층일 수 있다. 임의의 다양한 물질 또한 종이 웹을 형성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 종이 웹은 다양한 펄프화 공정, 예로서, 크라프트 펄프화법, 아황산 펄프화법, 열기계 펄프화법 등에 의해 형성된 섬유를 포함할 수 있다.
추가로, 기재는 또한 필름을 포함할 수 있다. 필름을 형성하기 위해 다양한 물질이 사용될 수 있다. 예를 들면, 필름 제작에 사용되는 몇몇 적합한 열가소성 중합체는 제한하는 것은 아니지만, 공중합체, 삼량체 및 그의 혼화물를 비롯한 폴리올레핀 (예로서, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 등); 에틸렌 비닐 아세테이트; 에틸렌 에틸 아크릴레이트; 에틸렌 아크릴산; 에틸렌 메틸 아크릴레이트; 에틸렌 노르말 부틸 아크릴레이트; 폴리우레탄; 폴리(에테르-에스테르); 폴리(아미드-에테르) 블록 공중합체 등을 포함할 수 있다.
필름, 부직포 웹 등을 포함하는지와는 상관없이, 본 발명에 사용되는 기재의 투과성 또한 특정 적용에 대하여 다양할 수 있다. 예를 들면, 몇몇 실시태양에서, 기재는 액체에 대하여 투과성일 수 있다. 그러한 기재는 예를 들면, 다양한 유형의 유체 흡착 및 여과 적용에서 유용할 수 있다. 다른 실시태양에서, 기재, 예로서, 폴리프로필렌 또는 폴리에틸렌으로부터 형성된 필름은 액체, 기체 및 수증기에 대하여 불투과성일 수 있다. 추가의 다른 실시태양에서, 기재는 액체에 대하여 불투과성이지만, 기체 및 수증기에는 투과성일 수 있다 (즉, 통기성). 물질의 "통기성"은 수증기 투과율 (WVTR)로 측정되며, 값이 더욱 높을수록 증기-투과성이 더욱 높은 물질을 나타내고, 값이 더욱 낮을수록 증기-투과성이 더욱 낮은 물질을 나타낸다. 통기성 물질의 수증기 투과율 (WVTR)은 예를 들면, 24시간당 1 평방미터당 적어도 약 100그램 (g/㎡/24시간), 몇몇 실시태양에서, 약 500 내지 약 20,000g/㎡/24시간, 및 몇몇 실시태양에서, 약 1,000 내지 약 15,000g/㎡/24시간일 수 있다. 통기성 물질은 일반적으로 당업계에 잘 공지되어 있는 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 예를 들면, 통기성 물질은 통기성 필름, 예로서, 미세다공성 또는 모놀리식 필름을 포함할 수 있다.
임의의 잘 공지된 다양한 적용 기법을 사용하여 지시제를 기재에 적용시킬 수 있다. 적합한 적용 기법은 프린팅, 디핑, 분무, 용융 압출, 용매 코팅, 분말 코팅 등을 포함한다. 지시제는 기재의 매트릭스내 혼입되고/거나 그의 표면상에 포함될 수 있다. 예를 들면, 하나의 실시태양에서, 지시제가 기재의 하나 이상의 표면상에 코팅된다. 하나의 특정 실시태양에서, 지시제 코팅은 프린팅 기법, 예로서, 플렉소 프린팅, 그라비어 프린팅, 스크린 프린팅, 또는 잉크젯 프린팅을 사용하여 기재상에 프린트된다. 그러한 프린팅 기법의 다양한 일례는 미국 특허번호 제5,853,859호 (류( Lew ) 등) 및 미국 특허 출원 공개번호 제2004/0120904호 (라이( Lye ) 등) (상기 모두는 그 전체가 본 원에서 모든 목적으로 참고문헌으로서 인용된다)에 기재되어 있다.
원하는 경우, 사용자는 특정 미생물의 존재를 보다 잘 측정할 수 있도록 하기 위해 지시제를 하나 이상의 별개 구역의 기재에 적용시킬 수 있다. 예를 들면, 2개 이상의 미생물의 존재를 검출하기 위해 2개 이상의 별개의 지시제 구역 (예로서, 선, 점 등)을 사용할 수 있다. 하나의 특정 실시태양에서, E. 콜라이, S. 콜레라수이스, S. 아우레우스, 및 P. 애루지노사의 존재를 검출하기 위하여 4개의 상이한 지시제 구역을 사용한다. 이러한 방식으로, 사용자는 간단하게 어떤 미생물이 존재하는지를 측정하기 위하여 상이한 구역을 관찰할 수 있다. 지시제 구역은 일반적으로 임의의 기재 표면에 적용될 수 있지만, 전형적으로는 사용시 미생물에 의해 생성된 휘발성 화합물과 접촉할 수 있는 적어도 하나의 표면상에 존재한다.
기재상에 존재하는 지시제의 양은 기재의 성질 및 그의 적용 목적, 지시제 및 휘발성 화합물의 성질 등에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, 함침량(add-on) 수준이 낮을수록 최적의 기재 관능성을 제공할 수 있는 반면, 함침량 수준이 높을수록 최적의 검출 감도를 제공할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 지시제의 범위는 일반적으로 기재의 약 0.001wt％ 내지 약 10wt％, 몇몇 실시태양에서 약 0.01wt％ 내지 약 5wt％, 및 몇몇 실시태양에서, 약 0.05wt％ 내지 약 2wt％일 것이다. 유사하게, 기재의 표면상에 적용되는 지시제의 적용 범위율(％)은 선택적으로 다양할 수 있다. 전형적으로, 적용 범위율(％)은 지정 표면적의 100％ 미만, 몇몇 실시태양에서, 약 90％ 미만, 및 몇몇 실시태양에서, 약 5％ 내지 약 50％이다.
몇몇 경우에서, 기재의 유효 표면을 증가시킴으로써 지시제와 휘발성 화합물 사이의 접촉을 개선시키기 위해 고표면적을 갖는 입자 또한 사용할 수 있다. 일반적으로, 고표면적을 갖는 입자의 표면적은 1그램당 약 50 평방미터 (㎡/g) 내지 약 1000㎡/g, 몇몇 실시태양에서 약 100㎡/g 내지 약 600㎡/g, 및 몇몇 실시태양에서, 약 180㎡/g 내지 약 240㎡/g이다. 표면적은 질소를 흡착 기체로 하여 [Bruanauer, E㎜et, and Teller, Journal of American Chemical Society, Vol. 60, 1938, p.309]의 물리적 기체 흡착 (B.E.T.) 방법에 의해 측정할 수 있다. 고표면적을 갖는 입자는 또한 원하는 결과에 따라 다양한 형태, 형상, 및 크기를 지닐 수 있다. 예를 들면, 입자는 구, 결정, 막대, 디스크, 튜브, 끈 등의 형상일 수 있다. 입자의 평균 크기는 일반적으로 약 100 마이크론 미만이고, 몇몇 실시태양에서는 약 50 마이크론 미만이고, 몇몇 실시태양에서는 약 1 내지 약 50 나노미터이고, 몇몇 실시태양에서는 약 2 내지 약 50 나노미터이고, 몇몇 실시태양에서는 약 4 내지 약 20 나노미터이다. 본 원에서 사용되는 바, 입자의 평균 크기는 그의 평균 길이, 폭, 높이 및/또는 직경을 언급한다. 추가로, 입자는 또한 비교적 비공질이거나 고체일 수 있다. 즉, 입자의 공극 부피가 1그램당 약 0.5 밀리리터 (㎖/g) 미만일 수 있고, 몇몇 실시태양에서는 1그램당 약 0.4 밀리리터 미만이고, 몇몇 실시태양에서는 1그램당 약 0.3 밀리리터 미만이며, 몇몇 실시태양에서는 약 0.2㎖/g 내지 약 0.3㎖/g이다.
고표면적을 갖는 입자는 제한하는 것은 아니지만, 실리카, 알루미나, 지르코니아, 산화마그네슘, 이산화티탄, 산화철, 산화아연, 산화구리, 유기 화합물, 예로서, 폴리스티렌, 및 그의 조합을 비롯한 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 예를 들면, 알루미나 나노입자를 사용할 수 있다. 몇몇 적합한 알루미나 나노입자는 미국 특허번호 제5,407,600호 (안도( Ando ) 등) (상기는 그 전체가 본 원에서 모든 목적으로 참고문헌으로서 인용된다)에 기재되어 있다. 추가로, 상업적으로 구입가능한 알루미나 나노입자의 일례로는 예를 들면, 닛산 가가쿠 고교 가부시키 가이샤(Nissan Chemical Industries Ltd)으로부터 구입가능한 알루미나졸(Aluminasol) 100, 알루미나졸 200, 및 알루미나졸 520을 포함한다. 별법으로, 실리카 나노입자, 예로서, 닛산 가가쿠(Nissan Chemical)로부터 구입가능한 예로서, 스노우텍스(Snowtex)-C, 스노우텍스-O, 스노우텍스-PS, 및 스노우텍스-OXS를 사용할 수 있다. 스노우텍스-OXS 입자의 입자 크기는 예를 들면, 4 내지 6 나노미터이고, 스노우텍스-OXS 입자는 1그램당 대략 509 평방미터의 표면적을 갖는 분말로 분쇄될 수 있다. 또한, 알루미나로 코팅된 실리카 입자, 예로서, 닛산 가가쿠로부터 구입가 능한 스노우텍스-AK를 사용할 수 있다.
예로서, 상기 언급한 것과 같은 고표면적을 갖는 입자는 함께 연결될 수 있거나 연결될 수 없는 단위를 포함한다. 이같은 단위들이 연결되는지의 여부는 일반적으로 중합 조건에 따라 달라진다. 예를 들면, 실리카 나노입자 형성시, 실리케이트 용액의 산성화로 Si(OH)4가 수득될 수 있다. 이러한 용액의 pH가 7 미만으로 감소되거나 염이 첨가될 경우, 단위들이 쇄로 서로 융합하여 "실리카 겔"을 형성하는 경향이 있을 수 있다. 반면에, pH가 중성 pH이거나 7 초과로 유지되면, 단위들이 분리되고 점진적으로 성장하여 "실리카 졸"을 형성하는 경향이 있을 수 있다. 그러한 콜로이드성 실리카 입자는 일반적으로 당업계에 잘 공지되어 있는 임의의 다양한 기법, 예로서, 투석, 전기투석, 해교, 산 중성화, 및 이온 교환에 따라 형성될 수 있다. 그러한 기술의 몇몇 일례는 예를 들면, 미국 특허 제5,100,581호 (와타나베( Watanabe ) 등); 제5,196,177호 (와타나베 등): 제5,230,953호 (츠게노 ( Tsugeno ) 등) 및 제5,985,229호 (야마다( Yamada ) 등) (상기 모두는 그 전체가 본 원에서 모든 목적으로 참고문헌으로서 인용된다)에 기재되어 있다.
하나의 특정 실시태양에서, 실리카 나노입자 졸은 이온-교환 기법을 사용하여 형성된다. 예시의 목적으로만, 이에 하나의 그러한 이온-교환 기법을 더욱 상세히 설명할 것이다. 먼저, 규소 (SiO2) 대 알칼리 금속 (M2O)의 몰비가 약 0.5 내지 약 4.5인 알칼리 금속 실리케이트를 제공한다. 예를 들면, 몰비가 약 2 내지 약 4인 나트륨 물유리를 사용할 수 있다. 예를 들면, 약 2 중량％ 내지 약 6 중량 ％ 농도로 물에 용해시킴으로써 알칼리 금속 실리케이트의 수용액을 수득한다. 이어서, 알칼리 금속 실리케이트를 함유하는 수용액을 하나 이상의 이온-교환 수지와 접촉시킬 수 있다. 예를 들면, 용액을 먼저 강산과 접촉시켜 수용액 내의 모든 금속 이온을 이온-교환시킬 수 있다. 그러한 강산의 일례로, 제한하는 것은 아니지만, 염산, 질산, 황산 등을 포함한다. 수용액을 약 0℃ 내지 약 6O℃, 몇몇 실시태양에서는, 약 5℃ 내지 약 50℃의 온도에서 강산이 충진된 칼럼에 통과시킴으로써 접촉시킬 수 있다. 칼럼을 통해 통과시킨 후, 생성된 규산-함유 수용액의 pH 값은 약 2 내지 약 4일 수 있다. 원하는 경우, 또다른 강산을 규산-함유 수용액체 첨가하여, 불순물 금속 성분을 해리된 이온으로 전환시킬 수 있다. 이러한 추가의 강산은 생성된 용액의 pH를 약 2 미만, 몇몇 실시태양에서는, 약 0.5 내지 약 1.8로 강하시킬 수 있다.
강산으로부터의 음이온 및 금속 이온은 강산 (즉, 양이온-교환 수지) 및 강염기 (음이온-교환 수지)의 연속 적용에 의해 용액으로부터 제거될 수 있다. 적합한 강염기의 일례로, 제한하는 것은 아니지만, 수산화나트륨, 수산화칼륨 등을 포함한다. 이러한 연속 적용의 결과로, 규산-함유 수용액의 pH 값은 약 2 내지 약 5일 수 있다. 이어서, 이러한 산성 수용액을 하나 이상의 추가적인 강염기와 접촉시켜 용액을 약 7 내지 약 9의 pH 값에서 안정화시킬 수 있다.
이어서, 안정화된 규산-함유 수용액을 액체 온도가 약 70°C 내지 약 100℃로 유지되는 용기 내로 공급한다. 이러한 공정으로 실리카의 농도가 약 30 중량％ 내지 약 50 중량％로 증가된다. 이어서, 생성된 수성 실리카 졸에 실리카 이외의 다가 금속 산화물이 실질적으로 존재하지 않도록, 안정적인 수성 실리카 졸이 상기 기술된 바와 같이 강산 및 강염기와 연속적으로 접촉될 수 있다. 최종적으로, 암모니아가 수성 졸에 첨가되어, 이의 pH 값을 약 8 내지 약 10.5로 증가시킴으로써, 실리카 농도가 약 30 중량％ 내지 약 50 중량％이고, 평균 입자 크기가 약 10 내지 약 30 나노미터이며, 실리카 이외의 다가 금속 산화물이 실질적으로 존재하지 않는 안정적인 실리카 졸이 형성될 수 있다.
입자의 양은 일반적으로 기재의 성질 및 그의 적용 목적에 따라 달라질 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 예를 들면, 건식의 함침량 수준은 약 0.001 ％ 내지 약 20％, 몇몇 실시태양에서 약 0.01 ％ 내지 약 10％, 및 몇몇 실시태양에서, 약 0.1 ％ 내지 약 4％이다. "고체 함침량 수준"은 비처리 기재의 중량을 처리된 기재 (건조시킨 후)의 중량으로부터 감산하고, 산출된 비처리 기재의 중량으로 제산(divide)한 후, 100％을 승산함으로써 측정한다. 함침량 수준이 낮을수록 최적의 기재 관능성을 제공할 수 있는 반면, 함침량 수준이 높을수록 최적의 검출 감도를 제공할 수 있다.
본 발명에 따라, 지시제 스트립의 색 변화가 미생물 존재에 대한 간단하고 신속한 신호로서의 역할을 한다. 이는 음식물의 안전성, 감염성, 악취 등의 평가를 비롯한 다양한 적용에 유용할 수 있다. 예를 들면, 지시제 스트립은 상처 치료용 드레싱; 음식물 패키징; 냉장고; 장난감; 음식물 조리실; 병원 구역; 욕실 구역; 전화기, 컴퓨터 장치; 여성용 패드; 기저귀 등으로서, 그와 함께 사용될 수 있다. 원하는 경우, 지시제 스트립은 또한 원하는 표면에 스트립을 부착시키기 위한 접착제 (예로서, 감압 접착제, 멜트 접착제)를 포함할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예를 참고로 하여 보다 잘 이해될 수 있다.
실시예 1
특정 유형의 세균과 관련된 하나 이상의 휘발성 화합물을 확인할 수 있는 능력을 입증하였다. 본 특정 실시예에서, P. 애루지노사 (ATCC #9027)를 시험하였다. 트리티카제 소이 브로쓰 ("TSB") 용액을 사용하여 1ml당 1 x 108 집락 형성 단위 ("cfu")의 미생물 저장액을 1 x 105 cfu/ml의 농도로 희석시켜 P. 애루지노사의 현탁액을 제조하였다. 1ml의 현탁액을 덱스트로스 사브로(Dextrose Sabouraud) 아가 플레이트에 적용시키고, 4시간동안 35℃에서 성장시켰다. P. 애루지노사 현탁액을 250-ml의 셉타-자(septa-jar)에 넣고, 이를 알루미늄 호일선 처리된(foil-lined) 테플론(Teflon)/실리콘 캡으로 밀봉하여 샘플을 제조하였다. 대조군 용도로 영양분 블랭크 또한 제조하였다.
시험 샘플 및 대조군 샘플을 약 30분동안 85-㎛ 카르복센™/폴리디메틸실리콘 "고체상 미량추출법" (SPME) 어셈블리에 노출시키고, 분석을 위해 휘발성 물질을 수거하였다. (수펠코 카탈로그 번호 57330-U 수동 섬유 홀더 및 스테이블플렉스 섬유상의 57334-U 85-㎛ 카르복센™/폴리디메틸실리콘, 이는 기체 및 저분자 화합물에 대하여 권고된다). 기체 크로마토그래피 및 질량 분석법 (GC/MS) 분석은 콜로라도주 러브랜드에 소재하는 애질런트 테크놀로지스, 인코포레이티드로부터 상 품명 "5973N"을 사용하여 수행하였다. 헬륨을 운반 기체로서 사용하였다 (주입부 압력: 12.7psig; 공급 라인 압력: 60psig). 길이가 60m이고, 내부 직경이 0.25mm인 DB-5MS 칼럼을 사용하였다. 상기 칼럼은 캘리포니아주 폴섬에 소재하는 (J&W Scientific, Inc.)으로부터 구입가능하다. GC/MS 시스템에 사용된 오븐 및 작동 파라미터를 표 1 및 2에 나타낸다:
표 1: GC / MS 시스템을 위한 오븐 파라미터
수준 속도(℃/분) 최종 온도(℃) 최종 시간(분)
초기 -20 4.00
1 10 200 0.00
2 15 250 0.00
표 2: GC / MS 시스템을 위한 작동 파라미터
파라미터 값
운반 기체 일정 유속(1.9㎖/분)의 헬륨
주입기 분할율 5:1
온도 225℃
검출기 소스 온도 230℃
쿼드 온도 150℃
경계면 260℃
EM 1906V
HED 온(on)
스캔 범위 12-350 달톤
한계치 100
A/D 샘플 8
용매 지연 0.0분
SPME 추출물을 열적으로 탈착시키고, 분리물을 GC/MS에 의해 분석하였다. P. 애루지노사에 대하여 수득한 총이온 크로마토그램은 도 2에 도시한다. 스펙트럼에서의 질량-대-전하비 및 그의 상대적인 존재비를 사용하여 스펙트럼의 피크를 상응하는 화합물에 매치시켰다. 스펙트럼 분석 결과는 하기 표 3에 나타낸다.
표 3: P. 애루지노사에 대한 스펙트럼 분석
시간 CAS 번호 화합물
12.85 1534-08-3 에탄산 (S-메틸 에스테르)
14.22 97-62-1 2-메틸-프로판산 (에틸 에스테르)
14.60 556-24-1 3-메틸-부타논산 (메틸 에스테르)
15.06 1679-08-9 2,2-디메틸-1-프로판티올
16.08 7452-79-1 2-메틸부타논산 (에틸 에스테르)
16.16 108-64-5 3-메틸부타논산 (에틸 에스테르)
16.40 6622-76-0 메틸 티글레이트 (2-메틸-2-부테논산, 메틸 에스테르)
16.94 32665-23-9 3-메틸 부타논산 (이소프로필 에스테르)
17.77 5837-78-5 에틸 티글레이트 (2-에틸-2-부테논산, 에틸 에스테르)
17.88 23747-45-7 S-메틸-3-메틸 부탄티오에이트
17.98 141-06-0 프로필 펜타노에이트
18.01 13678-59-6 2-메틸-5-(메틸티오)푸란
18.38 1733-25-1 이소프로필 티글레이트 (2-이소프로필-2-부테논산, 이소프로필 에스테르)
19.47 61692-83-9 프로필 티글레이트 (2-프로필-2-부테논산, 프로필 에스테르)
19.83 - -
20.37 - -
20.44 821-95-4 1-운데센
나타낸 바와 같이, 알킬 에스테르, 황-함유 화합물, 및 알켄을 비롯한 수개의 휘발성 화합물이 P. 애루지노사와 관련이 있는 것으로 확인되었다.
실시예 2
실시예 1의 방법을 사용하여 S. 아우레우스 (ATCC #6538)에 의해 생산된 휘발성 화합물을 확인하였다. S. 아우레우스에 대하여 수득한 총이온 크로마토그램은 도 3에 도시한다. 스펙트럼에서의 질량-대-전하비 및 그의 상대적인 존재비를 사용하여 스펙트럼의 피크를 상응하는 화합물에 매치시켰다. 단지 2개의 화합물만 이 영양분 블랭크보다 실질적으로 높은 농도의 피크를 나타내었다. 이들 2개의 화합물은 하기 표 4에서 확인된다.
표 4: S. 아우레우스에 대한 스펙트럼 분석
시간 CAS 번호 화합물
19.31 24295-03-2 2-아세틸티아졸
20.44 821-95-4 1-우데센
나타낸 바와 같이, S. 아우레우스와 관련이 있는 것으로 확인된 휘발성 화합물로는 티아졸 및 알켄을 포함한다.
실시예 3
실시예 1의 방법을 사용하여 E. 콜라이 (ATCC #8739)에 의해 생산된 휘발성 화합물을 확인하였다. E. 콜라이에 대하여 수득한 총이온 크로마토그램은 도 4에 도시한다. 스펙트럼에서의 질량-대-전하비 및 그의 상대적인 존재비를 사용하여 스펙트럼의 피크를 상응하는 화합물에 매치시켰다. 단지 3개의 화합물만이 영양분 블랭크보다 실질적으로 높은 농도의 피크를 나타내었다. 이들 3개의 화합물은 하기 표 5에서 확인된다.
표 5: E. 콜라이에 대한 스펙트럼 분석
시간 CAS 번호 화합물
13.75 123-51-3 3-메틸-1-부탄올
20.44 821-95-4 1-우데센
23.72 120-72-9 인돌
나타낸 바와 같이, E. 콜라이와 관련이 있는 것으로 확인된 휘발성 화합물로는 알코올, 알켄, 및 융합된 헤테로사이클릭 화합물을 포함한다.
실시예 4
실시예 1의 방법을 사용하여 C. 알비칸스 (ATCC# 10231)에 의해 생산된 휘발성 화합물을 확인하였다. C. 알비칸스에 대하여 수득한 총이온 크로마토그램은 도 5에 도시한다. 스펙트럼에서의 질량-대-전하비 및 그의 상대적인 존재비를 사용하여 스펙트럼의 피크를 상응하는 화합물에 매치시켰다. 화합물은 하기 표 6에서 확인된다.
표 6: C. 알비칸스에 대한 스펙트럼 분석
시간 면적 총면적의 비율(％) 화합물
4.8 2,363,467 1.9％ 아세트알데히드
6.3 53,364,422 43.2％ 에탄올
7.5 4,404,313 3.6％ 아세톤
13.7 32,245,674 26.1％ 이소아밀 알코올
13.8 3,449,096 2.8％ 2-메틸-1-부탄올
13.9 2,663,331 2.2％ 디메틸디설파이드
17.0 1,016,473 0.8％ 스티렌
17.3 6,199,544 5.0％ 2,5-디메틸 피라진
18.3 2,572,152 2.1％ 벤즈알데히드
19.5 15,040,131 12.2％ 리모넨
20.9 336,969 0.3％ 페네틸 알코올
나타낸 바와 같이, C. 알비칸스와 관련이 있는 것으로 확인된 휘발성 화합물로는 알데히드, 알코올, 헤테로사이클릭 화합물, 황-함유 화합물을 포함한다.
실시예 5
실시예 1의 방법을 사용하여 살모넬라 콜레라수이스에 의해 생산된 휘발성 화합물을 확인하였다. S. 콜레라수이스에 대하여 수득한 총이온 크로마토그램은 도 6 및 7에 도시한다. C. 알비칸스에 대하여 수득한 총이온 크로마토그램은 도 5에 도시한다. 스펙트럼에서의 질량-대-전하비 및 그의 상대적인 존재비를 사용하 여 스펙트럼의 피크를 상응하는 화합물에 매치시켰다. 화합물은 하기 표 7에서 확인된다.
표 7: S. 콜레라수이스에 대한 스펙트럼 분석
시간 면적 총면적의 비율(％) 화합물
7.48 4,997,820 4.6％ 에탄올
7.52 81,647,036 75.2％ 이소프로판올
11.9 3,840,226 3.5％ 비공지
12.9 1,594,995 1.5％ 비공지
13.8 1,594,995 4.1％ 비공지
17.3 4,434,046 11.1％ 2,5-디메틸피라진
나타낸 바와 같이, S. 콜레라수이스와 관련이 있는 것으로 확인된 휘발성 화합물로는 알코올 및 헤테로사이클릭 화합물을 포함한다.
실시예 6
실시예 1-5에서 수득한 결과를 분석함으로써 P. 애루지노사 (그람 음성), E. 콜라이(그람 음성), S. 아우레우스 (그람 양성), C. 알비칸스 (효모), 및 S. 콜레라수이스 (그람 음성)와 관련된 하나 이상의 휘발성 화합물을 확인하였다. P. 애루지노사, E. 콜라이, 및 S. 아우레우스는 1-운데센을 생산하였다. 그러나, 이들 세균의 나머지 휘발성 프로파일은 현저히 상이하였다. P. 애루지노사는 일련의 티글산 에스테르, 황 화합물, 및 저 분지산(small branched acids)의 에스테르를 생산하였다. S. 아우레우스는 보다 간단한 휘발성 프로파일을 가졌고, 단지 2개의 화합물만을 영양분 블랭크보다 현저히 높은 농도로 가졌다. 가장 두드러진 피크는 2-아세틸티아졸이었다. 또한, E. 콜라이 휘발성 물질은 영양분 블랭크보다 현저히 높은 농도로 단지 3개의 화합물만을 포함하였다. 인돌이 두드러진 피크였다. C. 알비칸스에 대한 휘발성 프로파일은 P. 애루지노사, S. 아우레우스, 및 E. 콜라이로부터 발견된 휘발성 물질과는 현저히 상이하였다. 수송 대조군 및 배지 대조군 양자 모두에서 다수의 불순물 피크가 존재하였기 때문에 어떤 화합물이 실제로 두드러지게 S. 콜레라수이스의 오프가스에 기인하는지를 측정하기는 어려웠다. 그러나, S. 콜레라수이스 배양물에서 두드러지게 관찰된 몇몇 화합물로는 이소프로파놀, 2,5-디메틸 피라진, 에탄올, 및 가능하게는 3-메틸-1-부탄올 및 사이클로헥산을 포함하였다. 상기에 기초하여 하기와 같은 휘발성 화합물이 확인되었다:
미생물 휘발성 화합물
E. 콜라이 인돌
S. 아우레우스 2-아세틸 티아졸
P. 애루지노사 메틸 2-메틸-2-부테노에이트
C. 알비칸스 이소-아밀 알코올
S. 콜레라수이스 2,5-디메틸피라진
다음 단계에서는 미생물의 존재에 대한 시각적 지시제를 생산하는 수단으로서 미생물의 휘발성 물질에 대하여 감수성인 염료의 색 변화를 확인하였다. 표 8에 극도로 낮은 농도의 표적 화합물에 노출시켰을 때에도 색 변화를 나타내는, 특이 휘발성 화합물에 대하여 감수성인 염료를 열거한다.
표 8: 휘발성 화합물에 대하여 확인되는 색 변화 염료
미생물 휘발성 화합물 색 변화 염료
E. 콜라이 인돌 디메틸아미노신남알데히드
S. 아우레우스 2-아세틸 티아졸 2,4-디니트로페닐히드라진
P. 애루지노사 메틸 2-메틸-2-부테노에이트 과망간산칼륨
C. 알비칸스 이소-아밀 알코올 중크롬산암모늄
S. 콜레라수이스 2,5-디메틸피라진 과망간산칼륨
선택된 염료는 휘발성 화합물에 노출되었을 때 용액상에서 신속하게 색 변화 가 일으켰다. 표 9에는 염료를 모델 화합물과 반응시켰을 때 관찰되는 색 변화를 열거한다.
표 9: 휘발성 화합물에 의해 유발되는 시각적 색 변화
미생물 휘발성 화합물 초기 색상 최종 색상
E. 콜라이 인돌 옅은 분홍색 진한 보라색
S. 아우레우스 2-아세틸 티아졸 옅은 황색 오렌지색
C. 알비칸스 이소-아밀 알코올 오렌지색 녹색
S. 콜레라수이스 2,5-디메틸피라진 옅은 분홍색 진한 보라색
P. 애루지노사 메틸 2-메틸-2-부테노에이트 보라색 갈색
나타낸 바와 같이, 염료는 확인된 휘발성 화합물에 대한 유효한 지시제로서의 역할을 하였다.
실시예 7
실시예 6에서 선택된 염료가 기체상에 존재할 때 개개의 휘발성 화합물과 반응할 수 있는 능력에 대하여 입증하였다. 구체적으로, 각 염료 용액 (10ml의 아세톤 또는 물중에 용해돈 40mg의 염료)을 패스취(Pasture) 점적기에 의해 분배되는 분취량을 통해 작은 스트립의 기재에 코팅시켰다. 각 기재는 스노우텍스™ OXS 실리카 나노입자로 전-처리하고, 대기건조시켰다. 실리카 나노입자는 스트립의 표면적으로 증가시킴으로써, 염료의 휘발성 화합물에 대한 노출을 증가시켰다. 표 10은 사용된 특정 용매 및 기재를 나타낸다.
표 10: 사용된 용매 및 기재
염료 용매 스트립 기재
과망간산칼륨 물 폴리프로필렌(PP) 부직포
디메틸아미노신남알데히드 아세톤 면
중크롬산암모늄 물 PP 부직포
디니트로페닐히드라진 에탄올 면 또는 PP 부직포
각 미생물에 대하여 특유한 휘발성 화합물에 대한 헤드스페이스에 염료-코팅된 스트립을 노출시켜 시험을 수행하였다. 구체적으로, 염료-코팅된 스트립을 바이알에 현탁시켜 바이알 바닥의 액체에는 접하지 못하도록 하였다. 각각의 경우에서, 휘발성 화합물에 노출시킨 후 1분 이내에 색 변화가 관찰되었다. 생 E. 콜라이 세균의 현탁액을 사용하여 "현실 세계 시험"도 수행하였다. 생육가능한 세균 현탁액 (100㎕)을 섬광 바이알에 놓고, 염료-코팅된 면직물 스트립을 바이알의 상부로부터 현탁시켰다. 뚜껑을 돌려 덮은 후 1분 이내에 색 변화가 관찰되었다. 성장 배지만을 사용하여 동일한 실험을 반복하였을 때에는 어떤 색 변화도 없었다. 따라서, 지시제 염료는 명확하게 E. 콜라이의 존재를 확인시켜 줄 수 있었다.
본 발명이 그의 특정 실시태양과 관련하여 상세히 설명되는 동안, 당업자는 상기를 이해함과 동시에, 이들 실시태양의 변화, 변형, 및 등가물을 용이하게 이해할 수 있을 것이라고 인지된다. 따라서, 본 발명의 범주는 첨부되는 청구범위 및 그의 임의의 등가물의 것으로서 평가되어야 한다.

Claims (21)

  1. 미생물 배양에 의해 생성된 헤드스페이스 기체를 추출하고;
    추출된 헤드스페이스 기체를 분석하고, 미생물 배양과 관련된 휘발성 화합물을 확인하고;
    확인된 휘발성 화합물의 존재하에서 검출가능한 색 변화가 일어날 수 있는 지시제를 선택하는 것을 포함하는, 미생물의 존재를 검출하는 방법.
  2. 미생물 배양과 관련된 휘발성 화합물을 확인하고;
    확인된 휘발성 화합물의 존재하에서 검출가능한 색 변화가 일어날 수 있는 지시제를 선택하고;
    지시제를 기재 표면에 적용시키는 것을 포함하는, 미생물의 존재를 검출하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 추가의 미생물 배양과 관련된 추가의 휘발성 화합물의 존재하에서 검출가능한 색 변화가 일어날 수 있는 추가의 지시제를 기재 표면에 적용시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 기재 표면을 미생물에 의해 생성된 휘발성 화합물과 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  5. 제2항, 제3항 또는 제4항에 있어서, 휘발성 화합물은 미생물 배양에 의해 생성된 헤드스페이스 기체를 추출하고, 추출된 헤드스페이스 기체를 분석함으로써 확인되는 방법.
  6. 제1항 또는 제5항에 있어서, 헤드스페이스 기체가 고체상 미량추출법을 사용하여 추출되는 방법.
  7. 제1항, 제5항 또는 제6항에 있어서, 추출된 헤드스페이스 기체를 기체 크로마토그래피의 크로마토그래피 칼럼과 접촉시켜 헤드스페이스 기체중 하나 이상의 성분을 분리시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  8. 제1항, 제5항, 제6항 또는 제7항에 있어서, 헤드스페이스 기체의 분리된 성분을 질량 분석법에 가하여 질량 스펙트럼을 수득하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 세균인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 미생물이 P. 애루지노사(P. aeruginosa), E. 콜라이(E. coli), S. 아우레우스(S. aureus), C. 알비칸스(C. albicans), 또는 S. 콜레라수이스(S. choleraesuis)인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 미생물이 P. 애루지노사이고, 확인된 휘발성 화합물은 메틸 2-메틸-2-부테노에이트인 방법.
  12. 제9항에 있어서, 미생물이 E. 콜라이이고, 확인된 휘발성 화합물은 인돌인 방법.
  13. 제9항에 있어서, 미생물이 S. 아우레우스이고, 확인된 휘발성 화합물은 2-아세틸 티아졸인 방법.
  14. 제9항에 있어서, 미생물이 C. 알비칸스이고, 확인된 휘발성 화합물은 이소-아밀 알코올인 방법.
  15. 제9항에 있어서, 미생물이 S. 콜레라수이스이고, 확인된 휘발성 화합물이 2,5-디메틸피라진인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항중 어느 한 항에 있어서, 지시제가 과망간산칼륨, 디메틸아미노신남알데히드, 2,4-디니트로페닐히드라진, 또는 중크롬산암모늄인 방법.
  17. 적어도 제1 및 제2 지시제 구역을 포함하되, 여기에서, 제1 지시제는 제1 미 생물에 의해 생성된 제1 휘발성 화합물과의 접촉시 검출가능한 색 변화를 일으키는데 유효한 양으로 제1 지시제 구역내에 포함되어 있고, 여기에서, 제2 지시제는 제2 미생물에 의해 생성된 제2 휘발성 화합물과의 접촉시 검출가능한 색 변화를 일으키는데 유효한 양으로 제2 지시제 구역내에 포함되어 있는, 다수의 미생물의 존재를 검출하기 위한 기재.
  18. 제17항에 있어서, 제1 및 제2 휘발성 화합물이 메틸 2-메틸-2-부테노에이트, 인돌, 2-아세틸 티아졸, 이소-아밀 알코올, 및 2,5-디메틸피라진으로 구성된 군으로부터 선택되는 기재.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 제1 및 제2 지시제가 과망간산칼륨, 디메틸아미노신남알데히드, 2,4-디니트로페닐히드라진, 및 중크롬산암모늄으로 구성된 군으로부터 선택되는 기재.
  20. 제17항 내지 제19항중 어느 한 항에 있어서, 각 지시제가 기재의 약 0.001wt％ 내지 약 10wt％의 양으로 존재하는 기재.
  21. 제17항 내지 제20항중 어느 한 항에 있어서, 기재가 추가로 고표면적을 갖는 입자를 포함하는 기재.
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