KR20070112915A - 라케이즈를 이용한 옻나무의 알러지 제거방법 및 그 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 옻나무에서 알러지를 유발하는 것으로 알려진 우루시올을 제거함에 있어 매우 온화한 조건에서 옻나무 내에 존재하는 것으로 알려진 락케이즈(laccase)를 첨가하여 우루시올을 중합시켜 고분자화 하여 침전으로 제거하는 방법에 의하여 제거하고, 얻어진 여액을 농축하고 동결건조하여 옻나무 추출물 분말을 얻고 이를 면역기능을 증강시키는 용도로 사용하는 것을 특징으로 하는 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

우루시올, 옻나무, 라케이즈, 항산화, 동결건조

Description

라케이즈를 이용한 옻나무의 알러지 제거방법 및 그 조성물{Method of allergen removal and extract preparation of Rhus verniciflua using laccase and composition containing the extract}

도1은 알러지를 유발시키는 것으로 알려진 우루시올의 화학구조이며,

도2는 플라보노이드 중 푸스틴의 화학구조이며,

도3은 플라보노이드 중 피세틴의 화학구조이며,

도4는 알데히드류의 2,4-dihydroxybenzaldehyde의 화학구조이며

도5는 알데히드류의 sinapyl aldehyde의 화학구조이다.

지금까지의 기술을 살펴보면,

김중배는 특허공개 2002-0023439에서 열풍건조 공정 및 용매추출공정에 의하여 독성을 제거하는 것을 제시하고 있으며, 천진수는 특허공개 2001-0035052에서 오리나무를 첨가하여 옻나무 건강음료를 제조하는 방법을 제시하고 있으며, 한종수 등은 특허공개 2001-0070556에서 물로 추출하면서 환류시키는 공정에 의하여 알러지 유발 성질을 제거하는 기술을 제시하고 있으며, 주낙균은 특허공개 1995- 0023317에서 옻나무를 솔잎, 상백피, 공사인 등과 같이 물에 넣어 끓이는 공정에 의하여 식품을 제조하는 공정을 제시하고 있으며, 정형진 등은 특허공개 2002-0002096에서 분획에 의하여 알러지 유발성질을 제거하는 공정을 제시하고 있으며, 최원철 등은 대한민국 특허 10-0394089-0000에서 열처리에 의한 알러지 유발성질의 제거방법을 제시하고 있다.

이들 공정은 대부분이 옻나무의 알러지 유발 성질을 제거하기 위하여 고온(100℃ 이상)을 요하거나 기타의 별도 첨가물과 같이 열처리하거나 추출하는 조건을 택하고 있어, 다양한 약리작용을 가진 옻나무의 효능을 열처리 후에도 유지하기가 불리 할 뿐 아니라 처리조건이 가혹하고 다른 재료와 같이 처리해야 하는 등의 불편한 점이 있었다.

라케이즈(laccase)는 구리를 함유한 폴리페놀 산화효소(polyphenol oxidase)로서 산소분자가 물분자로 환원될 때 폴리페놀, 메톡시 치환 모노페놀, 방향족 아민 등의 방향족 화합물의 전자를 유리시켜 페녹시 라디칼을 형성시킨다. 따라서 라케이즈는 페놀 화합물의 수산기로 부터 전자를 유리시켜 방향족화합물을 산화시키는 다중구리 청색산화제라고 할 수 있다. 이러한 라케이즈는 최근 미생물로 부터 생산이 보고되고 있는데 세균으로서 Azospirillum lipoferum이 알려져 있으며(Microbiology, 140, 19-26, 1994), 대부분은 목재부후에 관여하는 백색부후균에 광범위하게 존재한다. 즉, Agaricus bisporus, Pholiota aegerita, Podospora anserina, Trametes versicolor, Pleurotus ostreatus 등의 백색부후균과 Rhus verniciflua와 같은 옻나무에도 존재하는 것으로 알려져 있으며 각기 분자량과 구 리함량 및 기질선택성이 다른 것으로 보고되었다(J. Gen. Appl. Microbiol., 32, 185-191, 1986). Hiroshi Uyama등은 J. Molecular Catalysis B: Enzymatic 19-20(2002) 117-127에서 효소를 이용한 중합으로 인공 칠액(urushi)의 제조에 리파아제(lipase) 및 라케이즈(laccase)를 사용하는 기술을 보고하고 있다. 그러나 이들은 본 발명의 목표물이 알러지를 유발하지 않는 옻나무 추출물인 것과 비교할 때 그 목표물에 있어 완전히 상이하다.

옻나무(Rhus verniciflua STOKES)는 옻나무과에 속하는 낙엽교목으로서 중국이 원산지이며, 한국, 일본 및 중국 등의 동남아시아 지역에서 주로 재배되고 있다. 구체적으로 옻은 내구성의 특성이 있어 천연도료 등으로 이용되었고, 내약품성이 있어 비행기, 선박 및 해저 광케이블 등에 사용되는 특수 외장 도료로서 활용 될 수 있다. 더욱이 동양에서는 예로부터 약용으로 사용되어 왔고, 한의약에서는 내과종양치료제 및 여성의 생리기 이상, 위장약, 구충제, 혈액순환 및 노화방지의 민간요법 등에 이를 이용하는 처방이 전래되고 있다(Hota, M. 1989. 세계유용식물사전. 평범사. 910-2). 특히 우리나라에서는 몸 보신용 또는 약용으로 옻나무를 옻닭, 옻오리 등에 이용하여 왔다. 옻에 대한 감수성이 예민한 사람에게는 아주 적은 옻과의 접촉에 의하여 피부염, 가려움증을 일으키는 경우가 있어 대부분의 사람들이 옻에 대한 접촉을 꺼리는 경향이 있으며 실제 옻에 예민한 반응을 보이지 않는 사람은 10명 중 3~4명 정도이다.

옻나무 수액(옻칠)의 주요성분은 우루시올(Urushiol)이며, 주용도는 칠공예 에 사용되며 성상은 진갈색 액체로서 유기용매에 잘 용해된다. 화학적 구조는 도1에 나타낸 바와 같이 곁사슬의 탄소수가 15~17개가 주종을 이루며 불포화 결합이 다수 존재한다. 옻의 주된 약리작용은 항암, 항산화, 숙취해소 작용 등이 알려져 있으며(식품과학회지, 31, 1997, 238-245), 위장병, 심장병, 관절염, 고혈압, 당뇨, 중풍, 관절염, 만성피로 등에 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 다양한 약리작용이 있음에도 불구하고 아직까지 상용화되지 못한 것은 인체에 대한 알러지 유발 성질때문인 것으로 알려져 있다. 따라서 옻나무가 가진 약리적 효능을 극대화하고, 이를 상업화 하기 위하여 옻나무 또는 그 추출액의 섭취 시 발생하는 알러지를 최소화 할 수 있는 방법의 고안이 절실히 필요하다.

본 발명의 옻나무 추출물은 인체 내 면역기능을 증강시키기 위한 것으로 지금까지 항암, 기억력개선, 치매예방 등 다양한 옻나무 추출물의 응용예가 보고되었으나 면역기능 증강에 대한 보고는 없었다.

지금까지 다수의 특허에서 옻나무의 독성을 제거하는 방법이 제시되고 있으나, 본 발명에서는 알러지를 유발하는 물질인 우루시올의 화학적 특성을 고려하여라케이즈(laccase)를 첨가하고, 중합반응시켜 고분자화 하고 이를 제거하는 방법에 의한 알러지 유발물질을 제거하므로써 알러지를 유발하지 않는 옻나무 추출물을 제조하고, 이를 면역기능을 강화하는 효능을 가진 조성물로서 제공하고자 한다.

본 발명은 우루시올을 제거하기 위하여 옻나무 추출액을 제조함에 있어 옻나무에 추출용매로서 물을 무게 대비 5~20배수 가하고, 온도를 90~110℃에서 5~24시간동안 추출하여 추출액을 얻고, 이를 10~40℃로 냉각하고, 여기에 우루시올을 중합하는 기능을 가진 라케이즈(laccase)를 첨가하고, 1~5시간동안 반응시켜 중합반응을 유도하고, 이를 기공의 크기가 10마이크론인 필터로 미세여과하여 고형분을 제거하고, 얻어진 여액을 70℃에서 30분간 처리 후 진공농축하여 고형분 함량이 20~50%(w/w)이 되도록 한 후, 이를 동결건조하여 황갈색의 건조분말을 얻는 것을 특징으로하는 옻나무 추출물의 제조방법 및 그 추출물이 인체 면역증강기능을 가지는 것을 특징으로하는 조성물을 제공함으로써 본 발명을 완성한다.

먼저 알러지 유발물질을 제거하기 위하여 효소가 작용할 수 있는 추출물을 제조하여야 한다. 이를 위하여 본 발명에서는 효소의 작용이 가능한 용매로 물을 사용하였으며 그 외의 에탄올 등의 유기용매는 효소단백질의 변형을 초래하므로 사용이 불가능하다. 물을 옻나무 무게의 5~20배수 가하고, 온도를 90~110℃에서 5~24시간 동안 추출하여 추출액을 얻는다. 가해주는 물의 부피는 옻나무 추출물의 수율에 따라 결정할 사항으로 추출수율을 높이기 위해서는 다량의 물로 여러차례 추출하는 것이 필요하다. 다만, 본 발명에서는 통상적인 수율의 범위로 5~20배수를 결정하였으며, 경우에 따라서는 추출횟수를 2~3회로 하여도 무방하다. 추출온도는 약리성분이 소실되지 않으면서 추출되는 온도를 설정한 것으로 90℃ 보다 낮을 경우에도 추출물을 얻는 데는 문제가 없으나, 수율저하로 추출물의 제조원가가 상승하게 된다. 또한 110℃보다 높을 경우 과도한 가열로 유효성분의 소실이 발생하게 된 다. 추출시간은 5~24시간으로 첨가하는 용매의 양에 따라 적절하게 조절가능한 것으로 본 발명의 경우 통상적으로 8시간이 경과하면 24시간까지 추가적인 수율의 증가는 미미하였다. 다만, 조업시간을 고려하여 최대 24시간까지로 설정하였다. 추출이 끝나고 박을 제거하면 얻어지는 추출액은 고온으로 효소반응에 적합하지 않으므로 이를 효소반응에 적합한 온도인 10~40℃로 냉각하고, 여기에 미리 준비한 라케이즈(laccase)를 첨가하여 중합반응을 진행시킨다. 라케이즈(laccase)는 생산균주에 따라 여러가지가 사용될 수 있는데 본 발명에서는 대표적인 효소제조사인 노보사의 제품과 Trametes versicolor CJ-105균주를 한국종균협회로 부터 분양받아 이를 배양하여 라케이즈(laccase)를 생산하여 반응에 적용하였다. 반응온도는 효소의 근원에 따라 달라질 수 있으나 일반적으로 10~40℃에서 반응시키며 온도가 높을 수록 반응은 빠르게 진행되며 더욱 좋게는 30℃에서 3시간이 반응시키는 것이다. 반응시간은 1~5시간으로 가장 좋게는 3시간 이상이 좋다. 3시간 보다 짧을 경우 추출에 사용한 옻나무에 따라 과량의 우루시올이 존재할 경우 반응이 완전하게 진행되지 않을 수 있기 때문이다. 일반적으로 5시간이면 반응이 100% 진행되기에 충분하다. 반응이 완료되면 효소의 실활을 위해 70℃에서 2시간동안 처리하고, 기공의 크기가 10마이크론이 마이크로 필터를 사용하여 불용성 물질을 여과하여 제거하고 청징한 추출여액을 얻었다. 이를 진공하에서 50℃ 이하에서 농축하여 고형분 함량 20~50%(w/w)가 되도록 하고 이를 동결건조하여 진갈색의 분말을 얻는다. 얻어진 옻나무 추출액은 그 조성에 있어 알러지를 유발하는 우루시올을 전혀 함유하지 않으며 약리성분으로 알려진 대표적인 플라보노이드인 푸스틴, 피세틴, 설푸레틴 등을 함유하고 있으며, 알데히드류의 물질의 함량은 상대적으로 줄어들었다. 이는 플라보노이드의 경우 그 함량이 효소반응에 의하여 영향을 받지 않으나, 화학적 활성이 강한 알데히드류의 경우 중합반응 중 생겨나는 라디칼 들과 반응하여 다른 물질로 전환될 가능성이 많기 때문으로 여겨진다. 따라서 본 발명의 추출물은 기존의 발명의 추출물에 비하여 플라보노이드의 함량은 동등한 수준을 유지하면서 알데히드류의 농도는 현저하게 저하된 조성을 보였다. 알데히드류는 30~90% 저하되었다.

이 조성물은 인체에 흡수되어 면역강화 효능을 가지는 것을 확인하고자 면역강화 기준으로 주로 사용하는 대식세포 증가효과를 확인하였다. 대식세포증식능은 첨가한 옻나무 추출물의 농도에 따라 약 10~70%의 범위 내에서 증가된 결과를 보였다.

이하 본 발명을 다음의 실시예로 상세히 설명하고자 한다. 다만, 하기의 실시예가 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예 1. 라케이즈의 준비

라케이즈는 노보사에서 판매하는 Denilite(TM) II S로 부터 분리정제하거나 균주를 배양하여 분리 후 사용하였다. Denilite(TM) II S 500g을 2L 증류수에 녹이고, 4℃에서 1일간 방치 후 원심분리하고 상등액을 취했다. 이를 한외여과막으로 농축하고(Amicon Inc. 8400, PM100 membrane), 농축액을 55% cold acetone으로 단백질을 침전시키고 다시 원심분리하여 고형분을 회수하였다. 이를 0.01M patassium phosphate buffer(pH 6.5)로 용해시켜 1일 투석하였다. 이를 DEAE-sepharose column에 20ml loading 하고 0.3N NaCL로 탈착하여 회수하였다. 그 결과 SDS-PAGE 에서 약 80KDa에서 단일성의 라케이즈 밴드를 얻을 수 있었다.

세포배양의 경우 Trametes versicolor CJ-105 균주를 종균협회로 부터 분양 받아 YMPG 배지를 이용하여 2주마다 계대배양하였고, 이를 Plate에서 30℃에서 일주일간 정치배양 후 4℃로 보관하면서 액체배양을 시도하였다. 300ml 진탕배양기에서 200rpm으로 5일간 배양하고, 이를 호모게나이저로 균질화 한 후 원심분리(5,000rpm, 15분) 한 후 얻어진 균사체를 분리하고, 이를 추가 액체 배양하여 세포를 제외한 액을 사용하였다. 라케이즈의 활성은 1ml의 배양액을 취하여 4℃에서 10분간 원심분리하여 세포를 제거하고, 얻은 상등액을 반응액과 반응시킨 후 이를 분광광도계를 이용하여 420nm에서 흡광도를 측정하는 방법을 이용하였다. 효소반응액은 0.5M sodium acetate buffer(pH 5) 0.4ml, 상등액 0.5ml을 혼합한 후 5mM ABTS(2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) 0.1ml을 첨가하여 반응을 시작하고, 1분간 420nm에서 흡광도의 차이를 측정하였다(molar extinction coefficient=36,000/M/cm). 효소의 활성단위는 분당 1umol의 ABTS를 산화시키는 효소의 양을 1unit로 정하였다. 얻어진 배양액의 효소활성은 1,800unit/ml이었다.

실시예 2. 우루시올의 제거

건조된 옻나무 10Kg을 강원도 횡성 산지에서 구입하여 이를 미세 분쇄하여 크기 5mm이하로 하고, 이 중 1Kg에 물 10L를 가하고, 95℃에서 10시간 추출하였다. 여액을 분리하여 9.1L를 얻었고, 이를 30℃로 냉각하고, 여기에 실시예 1에서 노보사의 Denilite(TM) II S로 부터 분리한 라케이즈를 300unit/ml의 농도, 50ml을 가하고 30℃에서 100rpm으로 mixing하면서 3시간동안 반응시켰다. 그 결과 추출액 중 의 우루시올의 농도를 다음의 표1.에 보였다. 우루시올의 분석은 Korean J. Plant Res. 11(1), 40-46(1998)에 보고된 HPLC를 이용한 방법을 따랐다.

우루시올(ppm)	라케이즈 처리 전	처리 후
분자량 314	805	0.01
분자량 316	120	불검출
분자량 318	178	불검출
분자량 320	33	불검출

실시예 3. 성분의 분석 및 비교

실시예 2의 옻나무 1Kg을 동일하게 추출하고 라케이즈를 처리하지 않은 경우와 실시예2의 라케이즈를 처리한 옻나무 추출물의 성분함량을 분석 비교하였다. 함량은 플라보노이드와 알데히드류를 중심으로 비교하였다. 알데히드류로는 2,4-dihydroxybenzaldehyde 및 sinapyl aldehyde의 함량을 비교하였다. 플라보노이드는 푸스틴, 피세틴, 설푸레틴의 함량을 비교하였다. 그 결과를 표2에 보였다.

성분(ppm)	처리하지 않은 경우	라케이즈 처리한 경우
푸스틴	825	850
피세틴	234	241
설푸레틴	71	64
2,4-dihydroxybenzaldehyde	143	33
sinapyl aldehyde	122	19

플라보이드 류는 분석오차 범위에서 차이가 없었으나, 알데히드류는 2,4-dihydroxybenzaldehyde 및 sinapyl aldehyde의 합이 265ppm에서 52ppm으로 80.4% 감소하였다.

실시예 4. 면역증강 효과

본 발명의 옻나무 추출물의 면역증강효과를 확인하기 위하여 사이토카인의 생성을 비교하였다. 1*10⁷cells/ml의 마우스 비장세포를 여러가지 농도의 추출물이 함유된 24well 용기에 취하고 3일동안 이산화탄소 배양기에서 배양 후 상층액중의 인터루킨 1(IL-1), 인터페론 감마(INF-r), 인터루킨 2(IL-2) 를 측정한 결과를 다음의 표 3에 보였다.

	IL-1(U/ml)	IL-2(U/ml)	INF-r(U/ml)
비장세포	<0.01	<0.01	<0.01
비장세포+옻나무 추출물 0.2mg/ml	1.77	0.54	2.6
비장세포+옻나무 추출물 1mg/ml	3.11	0.76	4.0

그 결과 옻나무 추출물을 첨가하였을 경우 첨가농도에 의존하여 사이토카인의 생성이 증가됨을 확인할 수 있었다.

본 발명의 옻나무 추출물은 통상적인 옻나무 추출물에서 발생하는 알러지 유발물질을 효소를 사용하여 완벽하게 제거하므로써 옻나무가 가지는 약리효능을 부작용 없이 이용가능하게 하며 그 효능으로 면역증강 효과를 가짐을 확인하였다.

본 발명은 옻나무 추출물의 알러지를 제거하고 부작용 없이 약리적 효능을 취할 수 있게 한 것으로 면역증강 효과를 가지고 있어 암과 같은 질병으로 부터 국민의 건강을 회복하고 질병을 예방하는데 도움을 줄 수 있다.

Claims (4)

1. 옻나무에 무게 대비 5~20배수의 물을 가하고 90~110℃에서 5~24시간동안 추출하여 여액을 얻고, 이를 10~40℃로 냉각하고 여기에 효소를 첨가하여 1~5시간동안 반응시켜 우루시올을 중합시킨 후 이를 미세여과하여 제거하고, 여액을 농축하고 건조하여 얻어지는 알러지 유발물질이 제거된 옻나무 추출물의 제조방법 및 그 추출물.
2. 상기 청구항 1에서 첨가하는 효소가 라케이즈(laccase)인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 상기 청구항 1에서 얻어진 옻나무 추출물이 면역기능을 강화하는 것을 특징으로 하는 추출물.
4. 상기 청구항 1에서 효소반응에 의하여 제거되는 물질이 우루시올인 것을 특징으로 하는 방법.

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